Bedeutung von Tumorantigenen bei Hauttumorpatienten · Für die freundliche und kompetente Unterstützung hinsichtlich Multiplex-Serologie und Auswertung derselben danke ich Dr. Tim

Bedeutung von Tumorantigenen bei

Hauttumorpatienten

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Fakultät Naturwissenschaften

Universität Hohenheim

Institut für Ernährungsmedizin, Fachgebiet Ernährungsphysiologie und Genderforschung

Klinische Kooperationseinheit für Dermato-Onkologie, Deutsches Krebsforschungszentrum

vorgelegt von

Nicole Wiedemann geb. Gottstein

aus Pforzheim

2008

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Heinz Breer

1. berichtende Person: Prof. Dr. rer. nat. Stefan Eichmüller

2. berichtende Person: Prof. Dr. rer. nat. Christiane Bode

Eingereicht am: 25.06.2008

Mündliche Prüfung am: 27.11.2008

Die vorliegende Arbeit wurde am 23.09.2008 von der Fakultät Naturwissenschaften der

Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der

Naturwissenschaften“ angenommen.

Was lange währt, wird endlich gut

Die vorliegende Arbeit wurde am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) Heidelberg in

der Abteilung „Klinische Kooperationseinheit für Dermato-Onkologie“ von Prof. Dr. med. Dirk

Schadendorf in der Arbeitsgruppe Tumorantigene unter der Betreuung von Prof. Dr. rer. nat.

Stefan Eichmüller angefertigt.

DANKSAGUNG

An dieser Stelle möchte ich mich von Herzen bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben:

Herrn Prof. Dr. Stefan Eichmüller möchte ich sehr für die Überlassung des interessanten Themas, die hervorragende Betreuung dieser Arbeit, die vielen hilfreichen Diskussionen und die optimalen Arbeitsbedingungen danken. Ich habe mich in seiner Arbeitsgruppe sehr wohl gefühlt und viele hilfreiche Anregungen erhalten. Im Besonderen schätze ich seinen Einsatz für seine Mitarbeiter, der mir die Teilnahme an einem internationalen Immuntherapie Workshop sowie an verschiedenen nationalen und internationalen Kongressen ermöglichte.

Bei Frau Prof. Dr. Christiane Bode möchte ich mich herzlich für die Betreuung dieser Arbeit von Seiten der Universität Hohenheim bedanken sowie für ihr immerwährendes Interesse an diesem Thema. Ihre jährlichen Besuche am DKFZ in Verbindung mit unseren Treffen sowie die Möglichkeit, in ihrer Arbeitsgruppe meine Fortschritte vorstellen zu können, stellten wichtige Elemente der Entstehung dieser Arbeit dar.

Herrn Prof. Dr. Dirk Schadendorf danke ich für die freundliche Aufnahme in die Abteilung sowie die hilfreichen Diskussionen und die Möglichkeit der Vorstellung der Ergebnisse meiner Arbeit.

Mein besonderer Dank gilt weiterhin Dr. Friederike Fellenberg für die Einführung in die Methoden zu Beginn der Arbeit sowie die herzliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe und Dr. Sascha Bazhin für die Weitergabe seines immensen Wissens hinsichtlich Proteinaufreinigung, seiner kontinuierlichen fachlichen Unterstützung und der Durchsicht des Manuskripts.

Für die freundliche und kompetente Unterstützung hinsichtlich Multiplex-Serologie und Auswertung derselben danke ich Dr. Tim Waterboer, Dr. Peter Sehr und Dr. Michael Pawlita. Des Weiteren gilt mein Dank Fr. Dr. Kopp-Schneider für die kompetente Beratung bei der statistischen Auswertung der Ergebnisse. Für die Bereitstellung der HPLC-Anlage und Anleitung bei der Proteinaufreinigung danke ich Jürgen Kretschmer und Prof. Dr. Ponstingl.

Ein großer Dank gebührt ebenfalls allen Blut- und Gewebespendern.

Dem gesamten Dermato-Onkologie-Team danke ich für eine sehr schöne und lustige Zeit sowie die angenehme und hilfsbereite Atmosphäre. Während dieser abwechslungsreichen Zeit durfte ich viele motivierende Kaffeepausen und Kochabende erleben. Elke Dickes, Anita Dahlke und Judith Bartels möchte ich für die tatkräftige Unterstützung im Labor und viel Humor danken. Dr. Tanja Hartmann, Dr. Claudia Kistler und Dr. Mieun Lee danke ich für hilfreiche Diskussionen und Anregungen sowie kurzweilige Arbeitstage. Bei Dr. Hanno Ehlken, Eva Mattern, Dr. Dirk Usener, Nadine Willner, Andreas Lange und Brigitte Geschwendt bedanke ich mich für eine schöne gemeinsame Zeit.

Nicht vergessen werde ich die liebe- und verständnisvolle Unterstützung meiner Eltern, meiner gesamten Familie und all meiner Freunde während der Anfertigung dieser Arbeit. Ohne die Ermöglichung des Studiums der Ernähungswissenschaften durch meine Eltern und ihren Rückhalt wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen.

Mein innigster Dank geht an meinen Mann Frank, der während dieser schönen und stürmischen Zeit immer mit viel Geduld, Motivation und Liebe an meiner Seite stand und mich stets ertragen und unterstützt hat.

PUBLIKATIONEN

Artikel

Hartmann TB, Mattern E, Wiedemann N, van Doorn R, Willemze R, Niikura T, Hildenbrand R, Schadendorf D, Eichmüller SB. 2008. Identification of selectively expressed genes and antigens in CTCL. Exp Dermatol, 17(4):324-34.

Bazhin A, Wiedemann N, Schnölzer M, Schadendorf D, Eichmüller SB. 2006. Expression of GAGE family proteins in malignant melanoma. Cancer Letters 251(2):258-67.

Devitt G, Meyer C, Wiedemann N, Eichmüller S, Kopp-Schneider A, Haferkamp A, Hautmann R, Zöller M. 2005. Serological analysis of human renal cell carcinoma. Int J Cancer, 118(9):2210-9.

Gottstein N, Ewins BA, Eccleston C, Hubbard GP, Kavanagh IC, Minihane AM, Weinberg PD, Rimbach G. 2003. Effect of genistein and daidzein on platelet aggregation and monocyte and endothelial function. Br J Nutr 89:607-615.

Bingham M, Gibson G, Gottstein N, de Pascual-Teresa S, Minihane AM, Rimbach GH. 2003. Gut metabolism and cardioprotective effects of dietary isoflavones. Curr Top Nutraceut Res 1(1):31-48.

Tagungsbeiträge

Wiedemann N, Bazhin AV, Schadendorf D, Eichmüller SB. 2005. GAGE protein expression in malignant melanoma. The 6th World Congress on Melanoma 2005:200.

Wiedemann N, Bazhin AV, Schadendorf D, Eichmüller SB. 2005. A new polyclonal antibody reveals GAGE protein expression in malignant melanoma CIMT 2005.

Wiedemann N, van Doorn R, Willemze R, Schadendorf D, Eichmüller SB. 2005. SADA - a serum antibody detection array for analyzing the humoral immune response against tumor antigens. International Symposium on the Biology and Immunology of Cutaneous Lymphoma 2005.

Gottstein N, van Doorn R, Willemze R, Schadendorf D, Eichmüller S. 2004. Analyse der humoralen Immunantwort gegen Tumorantigene mittels Serum-Antikörper Detektions Arrays. Akt Dermatol 08/09:368.

Gottstein N, Schadendorf D, Eichmüller S. 2004. The humoral immune response against tumor antigens analyzed by serum antibody detection arrays. DKFZ Graduate Forum 2004; unpublished.

VERZEICHNISSE i

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS........................................................................................................... I

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................... VI

TABELLENVERZEICHNIS ................................................................................................. VIII

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS.............................................................................................. IX

1 EINLEITUNG ..........................................................................................................1

1.1 IMMUNÜBERWACHUNG IN DER HAUT ..........................................................................1

1.2 IMMUNÜBERWACHUNG VON TUMOREN.......................................................................2

1.3 DAS KUTANE T-ZELL LYMPHOM .................................................................................4

1.3.1 Klassifikation...............................................................................................................5

Mycosis fungoides ...................................................................................................................5

Sézary Syndrom.......................................................................................................................6

1.3.2 Stadieneinteilung.........................................................................................................6

1.3.3 Pathogenese ................................................................................................................7

1.3.4 Epidermotropismus .....................................................................................................8

1.3.5 Diagnose und Prognose ..............................................................................................9

1.3.6 Therapieformen .........................................................................................................10

1.4 DAS MALIGNE MELANOM..........................................................................................12

1.4.1 Stadieneinteilung.......................................................................................................13

1.4.2 Pathogenese ..............................................................................................................14

1.4.3 Diagnose und Prognose ............................................................................................16

1.4.4 Therapie ....................................................................................................................18

1.5 TUMORANTIGENE......................................................................................................19

1.5.1 Klassen von Tumorantigenen ....................................................................................20

1.5.2 Identifizierung von Tumorantigenen .........................................................................24

1.6 ZIEL DIESER ARBEIT..................................................................................................26

2 MATERIAL UND METHODEN .........................................................................27

MATERIAL ..............................................................................................................................27

2.1 CHEMIKALIEN ...........................................................................................................27

2.2 GERÄTE, VERBRAUCHSMATERIALIEN UND FERTIGE KITS..........................................30

2.3 PUFFER UND LÖSUNGEN............................................................................................33

2.3.1 Bakterienstämme .......................................................................................................35

2.3.2 Agar und Medien.......................................................................................................35

VERZEICHNISSE ii

2.3.3 Vektoren ....................................................................................................................36

2.3.4 Plasmide....................................................................................................................36

2.3.5 Seren..........................................................................................................................36

2.3.6 Antikörper..................................................................................................................37

2.3.7 Zelllinien....................................................................................................................38

2.4 SOFTWARE ................................................................................................................38

METHODEN ............................................................................................................................39

2.5 SADA.......................................................................................................................39

2.5.1 Auswahl der Antigene................................................................................................39

2.5.2 Präabsorption der Patientenseren ............................................................................40

2.5.3 Transduktion..............................................................................................................43

2.5.4 Blotting und immunologischer Screen ......................................................................44

2.5.5 In vivo Exzision .........................................................................................................46

2.5.6 Plasmid-DNA-Isolierung...........................................................................................47

2.5.7 Spaltung der Phagemide ...........................................................................................47

2.5.8 Agarose-Gelelektrophorese.......................................................................................47

2.6 ELISA UND MULTIPLEX-SEROLOGIE........................................................................48

2.6.1 DNA-Klonierungen....................................................................................................48

2.6.2 Proteinexpression der Antigene in E. coli.................................................................53

2.6.3 SDS-PAGE und Western Blot....................................................................................54

2.6.4 Antigen-Titration im GST-X-tag-ELISA....................................................................56

2.6.5 Methodik der Multiplex-Serologie ............................................................................57

2.7 EXPRESSIONSANALYSE VON GAGE-7B AUF RNA- UND PROTEINEBENE..................60

2.7.1 Isolierung von RNA ...................................................................................................60

2.7.2 RNA-Gelelektrophorese ............................................................................................60

2.7.3 Herstellung von cDNA ..............................................................................................61

2.7.4 RT-PCR .....................................................................................................................62

2.7.5 RNA-Proben ..............................................................................................................63

2.7.6 Herstellung von Dialyseschläuchen ..........................................................................63

2.7.7 Rekombinante Expression von GAGE-7b als GST-Fusionsprotein ..........................63

2.7.8 Aufschluss der Bakterien...........................................................................................63

2.7.9 Aufreinigung eines GST-Fusionsproteins an Glutathion Sepharose-Beads .............64

2.7.10 Abspaltung des GST vom Fusionsprotein .................................................................65

2.7.11 Ionenaustauschchromatographie ..............................................................................65

2.7.12 Umpufferung von Proteinlösungen ...........................................................................66

VERZEICHNISSE iii

2.7.13 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of Flight (MALDI-TOF) ..........67

2.7.14 Immunisierung von Kaninchen..................................................................................67

2.7.15 ELISA ........................................................................................................................68

2.7.16 Aufreinigung von Antikörpern aus Kaninchenantiserum..........................................69

2.7.17 Bestimmung von Antikörpern in Serum mittels Western Blot ...................................70

2.7.18 Western Blot ..............................................................................................................71

2.7.19 Immunhistologie ........................................................................................................71

2.7.20 Zellkultur ...................................................................................................................72

3 ERGEBNISSE ........................................................................................................74

3.1 SADA.......................................................................................................................75

3.1.1 Aufbau des SADA ......................................................................................................75

3.1.2 Eigenschaften der ausgewählten Antigene................................................................75

3.1.3 Validierung des SADA: Phagenmobilität und Monoklonalität .................................81

3.1.4 Validierung des SADA: Sensitivität...........................................................................82

3.1.5 Validierung des SADA: Reproduzierbarkeit .............................................................83

3.1.6 Seroreaktivitäten aller SADA-Antigene gegen CTCL-, MM-Patienten und

Kontrollpersonen......................................................................................................84

3.2 ELISA UND MULTIPLEX-SEROLOGIE........................................................................88

3.2.1 Die Grundlage der Multiplex-Serologie ...................................................................88

3.2.2 Verwendete Antigene in der Multiplex-Serologie .....................................................90

3.2.3 Qualitätskontrolle der Antigene und der Multiplex-Analyse ....................................91

3.2.4 Festlegung der Cut-off-Werte und statistische Auswertung......................................93

3.2.5 Untersuchung der Serumantikörperantwort gegen die verwendeten Antigene in

einem MM-Kollektiv.................................................................................................95

3.2.6 Untersuchung der Serumantikörperantwort gegen die verwendeten Antigene in

einem CTCL-Kollektiv............................................................................................107

3.2.7 Monitoring der Serumantikörperantwort in immunbehandelten CTCL-Patienten.119

3.3 EXPRESSIONSANALYSE DES CANCER TESTIS ANTIGENS GAGE-7B ........................125

3.3.1 Identifizierung von GAGE-7b und Homologie der GAGE-Familie ........................125

3.3.2 Expressionsanalyse von GAGE-7b mRNA ..............................................................125

3.3.3 Antikörper-Herstellung mittels GST-GAGE-7b-tag-Fusionsprotein ......................127

3.3.4 Evaluierung der optimalen Expressions- und Aufreinigungsbedingungen für das

rekombinante GST-GAGE-7b-tag-Protein.............................................................128

VERZEICHNISSE iv

3.3.5 Aufreinigung des GST-GAGE-7b-tag-Proteins an Glutathion Sepharose und

Abspaltung des GST-Fusionspartners mittels Thrombin.......................................130

3.3.6 Zusätzliche Aufreinigung des GAGE-7b-tag-Proteins mittels Anionenaus-

tauschchromatographie (MonoQ) und Identifizierung von GAGE-7b mittels

MALDI-TOF...........................................................................................................131

3.3.7 Immunisierung eines Kaninchens mit aufgereinigtem GAGE-7b-tag-Protein .......134

3.3.8 Isolierung der spezifischen GAGE-7b-Antikörper aus dem Antiserum ..................135

3.3.9 Spezifität des GAGE-7b-Antikörpers ......................................................................137

Western Blot ........................................................................................................................137

Immunzytologie ...................................................................................................................138

Multiplex-Serologie.............................................................................................................139

3.3.10 Expressionsanalyse des Proteins GAGE-7b ...........................................................140

Expression in Kontrollgewebe ............................................................................................140

Expression in Zelllinien und Tumorgewebe........................................................................141

Zelluläre Lokalisation von GAGE-7b .................................................................................143

3.3.11 Serumantikörperantworten gegen GAGE-7b ..........................................................146

4 DISKUSSION .......................................................................................................147

4.1 VERWENDUNG VON TUMORANTIGENEN..................................................................147

4.1.1 Prognose und Diagnose ..........................................................................................148

4.1.2 Immuntherapie ........................................................................................................148

4.2 SADA.....................................................................................................................151

4.2.1 Validierung des SADA.............................................................................................152

4.2.2 Untersuchung von humoralen Immunantworten mittels SADA ..............................153

Serumantikörperantworten in CTCL-Patienten..................................................................155

HD-MM-48..........................................................................................................................155

HD-CL-02............................................................................................................................156

Serumantikörperantworten in MM-Patienten .....................................................................156

GBP-5a und GBP-5ta..........................................................................................................157

HD-MM-19..........................................................................................................................157

4.2.3 SADA als Methode zur Bestimmung der Antikörperantwort ..................................158

4.2.4 Vergleich von SADA und SEREX............................................................................159

4.2.5 SADA - Fazit und Ausblick......................................................................................160

4.3 MULTIPLEX-SEROLOGIE..........................................................................................161

4.3.1 Qualitätskontrolle und statistische Auswertung......................................................162

VERZEICHNISSE v

4.3.2 Humorale Immunantworten von MM-Patienten .....................................................164

4.3.3 Humorale Immunantworten von CTCL-Patienten ..................................................168

4.3.4 Humorale Immunantworten von immunbehandelten CTCL-Patienten...................172

4.3.5 Vergleich von Multiplex-Serologie und SADA/SEREX...........................................174

4.3.6 Multiplex-Serologie im Vergleich zu ELISA in der Krebsdiagnostik......................178

4.3.7 Multiplex-Serologie – Fazit und Ausblick...............................................................180

4.4 DAS CANCER TESTIS ANTIGEN GAGE-7B ..............................................................181

4.4.1 Spezifität des Antikörpers........................................................................................182

4.4.2 Expressionsanalyse von GAGE-7b..........................................................................183

4.4.3 Serologische Untersuchung von GAGE-7b.............................................................187

4.4.4 GAGE-7b als Ziel einer Immuntherapie .................................................................188

4.4.5 GAGE-7b – Fazit und Ausblick...............................................................................189

4.5 CTA UND TAA IN DER KREBSTHERAPIE.................................................................190

4.6 CTA UND TAA IN DER KREBSDIAGNOSTIK UND -PROGNOSTIK...............................192

5 ZUSAMMENFASSUNG .....................................................................................195

6 SUMMARY...........................................................................................................196

7 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................197

8 ANHANG ..............................................................................................................229

LEBENSLAUF ..........................................................................................................................232

EIDESTATTLICHE ERKLÄRUNG ......................................................................................233

VERZEICHNISSE vi

ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abbildung 1-1: Die Schichten der Haut mit der Angabe der Schichtenfolge (Gratzl 2002)....1

Abbildung 1-2: Integrierte Immunantwort gegen Tumorantigene (modifiziert nach Sahin et al. 1999 und Banchereau et al. 2000) .............................................................3

Abbildung 1-3: Lokalisation von GAGE-7b (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) ............23

Abbildung 1-4: SEREX-Methode...........................................................................................25

Abbildung 2-1: Schema der SADA-Methode.........................................................................46

Abbildung 2-2: Programm der Klonierungs-PCR ..................................................................50

Abbildung 2-3: Programm der Sequenzier-PCR ....................................................................52

Abbildung 2-4: Programm der cDNA-Synthese.....................................................................61

Abbildung 2-5: Programm der GAPDH-PCR ........................................................................62

Abbildung 3-1: Gelelektrophoretische Auftrennung der mit Restriktionsenzymen ge-spaltenen Plasmide von vier SADA-Klonen nach einer in vivo Exzision ...82

Abbildung 3-2: Entwickelte SADA-Membranen verschiedener Serumverdünnungen..........83

Abbildung 3-3: Repräsentative SADA-Membranen verschiedener Seren .............................85

Abbildung 3-4: Schematische Darstellung von „GST-capture-ELISA“ (A) und Multiplex-Serologie (B) ................................................................................................89

Abbildung 3-5: Schematische Darstellung des Luminex-Analysegeräts ...............................90

Abbildung 3-6: Titration der Antigene für die Multiplex-Serologie im GST-X-tag-ELISA .92

Abbildung 3-7: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und MM-Kollektivs für MAGE-A1, A3 und A9 ..........................................................................97

Abbildung 3-8: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und MM-Kollektivs für LAGE-1a, GAGE-7b und CAMEL........................................................98

Abbildung 3-9: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und MM-Kollektivs für se70-2, se57-2 und GBP-5ta...................................................................99

Abbildung 3-10: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und MM-Kollektivs für cTAGE-5a N- und C-terminal sowie p53.............................................100

Abbildung 3-11: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und MM-Kollektivs für p16 ........................................................................................................101

Abbildung 3-12: Vergleich der prozentualen Seroreaktivität der Kontrollen mit allen MM-Patienten (A) und den verschiedenen MM-Stadiengruppen (B)................103

Abbildung 3-13: Monitoring der Serumantikörperantwort von acht MM-Patienten .............106

Abbildung 3-14: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und des CTCL-Kollektivs für MAGE-A1, A3 und A9.......................................................110

Abbildung 3-15: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und des CTCL-Kollektivs für LAGE-1a, GAGE-7b und CAMEL ....................................111

Abbildung 3-16: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und des CTCL-Kollektivs für se70-2, se57-1 und GBP-5ta ...............................................112

Abbildung 3-17: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und des CTCL-Kollektivs für cTAGE-5a N- und C-terminal sowie p53...........................113

VERZEICHNISSE vii

Abbildung 3-18: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und des CTCL-Kollektivs für p16.......................................................................................114

Abbildung 3-19: Vergleich der prozentualen Seroreaktivität der Kontrollen mit allen CTCL-Patienten (A) und den verschiedenen CTCL-Stadiengruppen (B).............115

Abbildung 3-20: Monitoring der Serumantikörperantwort von zwölf CTCL-Patienten........117

Abbildung 3-21: Darstellung der Serumantikörperantwort der 19 immunbehandelten CTCL-Patienten im Verlauf der Therapie .............................................................121

Abbildung 3-22: Darstellung der Serumantikörperantwort der fünf mit einem Masernimpfstoff behandelten CTCL-Patienten im Verlauf der Therapie .............................123

Abbildung 3-23: Multiples Alignment der GAGE-Proteine...................................................126

Abbildung 3-24: Repräsentative RT-PCR mit beiden GAGE-Primerpaaren .........................126

Abbildung 3-25: Analyse der Antikörper K5101 und K5102 im Western Blot .....................128

Abbildung 3-26: Coomassie-Gel zur Bestimmung der optimalen Expressionsbedingungen für GST-GAGE-7b-tag ....................................................................................129

Abbildung 3-27: Coomassie-Gel zum Vergleich der Lyse von GST-tag-Protein in der French Press gegenüber Sonifizierung und Homogenisieren (A) und zur Bestimmung des optimalen pH-Werts während der Bindung von GST-GAGE-7b-tag-Protein an Glutathion Sepharose (B)..................................130

Abbildung 3-28: Coomassie-Gel zur Aufreinigung von GST-GAGE-7b-tag und Abspaltung des GST-Fusionspartners ...........................................................................131

Abbildung 3-29: Chromatogramm der Ionenaustauschchromatographie für GAGE-7b-tag .132

Abbildung 3-30: Coomassie-Gele der Proben und Fraktionen der Ionenaustausch-chromatographie.........................................................................................133

Abbildung 3-31: Titration der Kaninchenseren vor und nach Immunisierung im ELISA .....135

Abbildung 3-32: Titration des Antiserums und der isolierten Antikörper nach den unterschiedlichen Aufreinigungsschritten..................................................136

Abbildung 3-33: Western Blot an verschiedenen GST-Fusionsproteinen unter Verwendung des monospezifischen GAGE-7b-Antikörpers...........................................138

Abbildung 3-34: Überprüfung der Spezifität des GAGE-7b-Antikörpers mittels Immunzytologie .........................................................................................139

Abbildung 3-35: Western Blot an Kontrollgewebe mit GAGE-7b-Antikörper .....................141

Abbildung 3-36: Western Blot an verschiedenen Zelllinien mit GAGE-7b-Antikörper........142

Abbildung 3-37: Western Blot an MM-Tumorgewebe mit GAGE-7b-Antikörper................143

Abbildung 3-38: Immunzytologische und –histologische Untersuchungen mit GAGE-7b-Antikörper ..................................................................................................145

Abbildung 3-39: Serumantikörperantworten gegen GAGE-7b ermittelt mit Western Blot und DAB (A) sowie Chemilumineszenz (B).....................................................146

VERZEICHNISSE viii

TABELLENVERZEICHNIS

Tabelle 1-1: TNM-Stadieneinteilung für kutane Lymphome......................................................7

Tabelle 1-2: Stadiengruppierung der TNM-Einteilung ...............................................................7

Tabelle 1-3: Melanom TNM-Klassifikation..............................................................................13

Tabelle 1-4: Überarbeitete „American Joint Committee on Cancer“ (AJCC) klinische Stadieneinteilung des Melanoms...........................................................................13

Tabelle 2-1: Ausgewählte Antigene für die SADA-Methode ...................................................39

Tabelle 2-2: E. coli-Lysis-Ansatz zur Herstellung der lytischen Säulen...................................42

Tabelle 2-3: Zusammensetzung des Transduktionsansatzes .....................................................43

Tabelle 2-4: Anordnung der Phagen auf den SADA-Membranen 1 und 2 ...............................45

Tabelle 2-5: Primer für die Klonierung in den pGEX-4T-3tag-Vektor.....................................49

Tabelle 2-6: Klonierungs-PCR-Materialien und Pipettierschema.............................................50

Tabelle 2-7: Verwendete Primer in der Sequenzier-PCR..........................................................52

Tabelle 2-8: Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel für die SDS-PAGE ....................55

Tabelle 2-9: Pipettierschema für den cDNA-Synthese-Ansatz .................................................61

Tabelle 2-10: Reaktionsansatz für die RT-PCR ..........................................................................62

Tabelle 2-11: In der RT-PCR verwendete Primer .......................................................................63

Tabelle 2-12: Immunisierungsschema der Firma Biogenes ........................................................67

Tabelle 2-13: Im Zentralen Tierlabor des DKZF verwendetes Immunisierungsschema ............68

Tabelle 3-1: mRNA Expression und Eigenschaften der SADA-Antigene...............................76

Tabelle 3-2: Seroreaktivitäten aller SADA-Antigene, statistische Auswertung und Ergebnisse im sekundären SEREX..........................................................................................86

Tabelle 3-3: Übersicht über die verwendeten humanen Tumorantigene...................................91

Tabelle 3-4: Cut-off-Werte für alle Antigene...........................................................................94

Tabelle 3-5: Veränderung der Serumantikörperantwort gegen alle Antigene in 19 immunbehandelten CTCL-Patienten im Verlauf der Therapie ...........................120

Tabelle 3-6: Veränderung der Serumantikörperantwort gegen alle Antigene in fünf immunbehandelten CTCL-Patienten im Verlauf der Therapie ...........................122

Tabelle 3-7: Expressionsanalyse der beiden GAGE-Gruppen in Zelllinien und Geweben.....127

Tabelle 3-8: Verwendung des GAGE-7b-Antikörpers in der Multiplex-Serologie ................140

Tabelle 3-9: Zusammenfassung der Ergebnisse der Expressionsanalyse von GAGE-7b .......144

Tabelle 4-1 Vergleich der Seroreaktivitäten von Ctrl, MM- und CTCL-Patienten in der Multiplex-Serologie, im SADA und SEREX......................................................176

VERZEICHNISSE ix

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABCDE-Regel Asymmetrie, Begrenzung, Colorit, Durchmesser, Erhabenheit-Regel ADCC Antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (“antibody-dependent cell –

mediated cytotoxicity“) ADP Adenosindiphosphat AFP Alpha-1-Fetoprotein AG Arbeitsgruppe AJCC „American Joint Committee on Cancer“ ALM Akrolentiginöses Melanom Amp Ampicillin AP Alkalische Phosphatase AP-1 Aktivierungsprotein-1 („activator protein-1“) APC Antigen-präsentierende Zellen („antigen presenting cells“) APS Ammoniumperoxidsulfat ART Adenosindiphosphat-Ribosyltransferase AS Aminosäure ATCC „American Tissue and Culture Collection“ ATP Adenosintriphosphat mAU Milli Absorptionseinheiten („milli absorption units“) BAX B-Zell Leukämie/Lymphom 2 (BCL2)-assoziiertes X Protein BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat BF-1 „Brain factor 1“ bp Basenpaare BPB Bromphenolblau BRCA1 Brustkrebs 1 („Breast Cancer 1“) BSA Rinderserumalbumin (“bovine serum albumin”) CaCl2 Calciumchlorid CBCL Kutanes B-Zell Lymphom CBS-K Siperchemiclock CD Differenzierungscluster (“clusters of differentiation”) CDA Zellteilung Autoantigen (“cell division autoantigen”) CDK4 Zyklin-abhängige Kinase 4 („cyclin-dependent kinase 4“) CDKN2A Zyklin-abhängiger Kinaseinhibitor 2A (“cyclin-dependent kinase inhibitor

2A”) CEA Karzinoembryonales Antigen („carcinoembryonic antigen“) CGH “Comparative Genomic Hybridization“ CIAP “Calf Intestine Alkaline Phosphatase” CKAP2 “Cytoskeletton-associated protein 2” CMV Zytomegalo Virus (“cytomegalo virus”) CRP C-reaktives Protein CTA Cancer Testis Antigen CTCL Kutanes T-Zell Lymphom („cutaneous T cell lymphoma“) CTL Zytotoxische T-Zellen („cytotoxic T cells“) CTLA Kutanes T-Lymphozyten Antigen („cutaneous T lymphocyte antigen“) Ctrl Kontrolle(n) D Differentiell Da Dalton DAB 3,3`-Diaminobenzidin DC Dendritische Zellen („dendritic cells“) DDRT-PCR „Differential Display RT-PCR“ DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum

VERZEICHNISSE x

DMF N,N-Dimethylformamid DMPC Dimethylpyrocarbonat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure (“deoxyribonucleic acid”) cDNA “Copy DNA” DNEL2 “Dynein heavy chain” DPK “Dendritic cell derived protein kinase” DTT Dithiothreitol EBV Epstein Barr Virus EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EEF1A1 Eukaryotischer Translations-Elongationsfaktor 1 alpha 1 ELISA “Enzyme-linked immunosorbent assay” EORTC „European Organization for Research and Treatment of Cancer“ ERK Extrazelluläre regulatorische Proteinkinase EST „Expressed sequence tag“ EtOH Ethanol FCS Fötales Kälberserum („fetal calf serum“) bFGF “Basic fibroblast growth factor” FHL2 Vier-und-ein-halb LIM Protein 2 GAPDH Glycerin-Aldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase GBP Guanylat-bindendes Protein GC Glutathion-Casein GCC2 “GRIP and coiled-coil domain-containing 2” GDP Guanosindiphosphat GMP Guanosinmonophosphat GOLGA Golgi Autoantigen GRIP Glutamat-Rezeptor-interagierendes Protein GST Glutathion-S-Transferase GTP Guanosintriphosphat h Stunde HCl Salzsäure HDM2 „Human double minute 2“ HERV-K10 Humanes endogenes Retrovirus Antigen K10 HEXIM-1 Hexamethylen-bis-acetamid-induzierbar 1 HHV-8 Humanes Herpesvirus-8 HIV-1 Humanes Immundefizienz Virus Typ 1 HLA Humanes Leukozyten Antigen (“human leukocyte antigen”) HMB-45 „Human melanoma black-45“ H2O2 Wasserstoffperoxid ddH2O bidestilliertes Wasser HPLC Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (“High pressure liquid

chromatography”) HPV Humanes Papillomavirus HRP Meerrettich Peroxidase (“horseradish peroxidase”) H2SO4 Schwefelsäure Hsp Hitze Schock Protein HTLV-1 Humanes T-Zell-lymphotropes Virus Typ 1 HYREX „DNA hybridization analysis of recombinantly expressed cDNA libraries“ IFN-α Interferon-α IgE Immunglobulin E sIL-2R Löslicher IL-2 Rezeptor („soluble IL-2 receptor“) IL-10 Interleukin-10

VERZEICHNISSE xi

IMP1 Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 2 mRNA Bindungsprotein 1 IP-10 IFN-γ-induziertes Protein-10 IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactosid JNK c-Jun N-terminale Kinase k kilo KCl Kaliumchlorid KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat KRAB Krüppel-assoziierte Box LAR „Leukocyte antigen-related“ LB Luria Bertani Lck Lymphozytenprotein Tyrosinkinase LDH Laktatdehydrogenase LMM Lentigo-maligna-Melanom M Marker m Männlich MAGE Melanom Antigen MALDI-TOF „Matrix assisted laser desorption/ionisation-time of flight“ MAP2 Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 MAPK6 Mitogen-aktivierte Proteinkinase 6 MART-1 „Melanoma antigen recognized by T cells 1“ MC1R Melanocortin-1 Rezeptorgen MF Mycosis fungoides MFI Median Fluoreszenz-Intensität („mean fluorescence intensity“) MgCl2 Magnesiumchlorid MgSO4 Magnesiumsulfat MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (“major histocompatibility complex”) MHD MAGE Homologie Domäne MIA „Melanoma inhibitory activity“ min Minuten MM Malignes Melanom 8-MOP 8-Methoxypsoralen MOPS „3-[N-morpholino]2-hydroxypropansulfonic acid“ α-MSH α-Melanozyten-stimulierendes Hormon MUM-1 Melanom-assoziiertes Antigen (mutiert) („melanoma ubiquitous mutated“) n Anzahl NaAc Natriumacetat NaCl Natriumchlorid Na2CO3 Natriumcarbonat NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat Na3N Natriumazid NaOH Natriumhydroxid NBT Nitrobluetetrazolium NFATC3 Nukleärer Faktor von aktivierten T-Zellen 3 NFκB Nukleärer Faktor kappa B NHL Non-Hodgkin Lymphome NHS N-hydroxysuccinimid (NH4)2SO4 Ammoniumsulfat NK-Zellen Natürliche Killerzellen NMM Noduläres malignes Melanom NP Nukleäres Protein

VERZEICHNISSE xii

dNTP desoxy-Nukleosidtriphosphat NUDC “Nuclear distribution gene C homolog” OPA-Puffer “One Phor All”-Puffer ORF Offener Leserahmen PAMP Pathogen-assoziierte molekulare Muster („pathogen-associated molecular

patterns”) PARD3ta “Partitioning defective 3 homolog” PARP Poly-ADP-Ribose-Polymerase PAX9 “Paired Box 9” PBL Periphere Blut Lymphozyten PBMC Periphere Blut mononukleäre Zellen PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PBS-T PBS-Tween PCR Polymerasekettenreaktion Pfu „Plaque forming units“ PMNC Periphere mononukleäre Zellen PRR Mustererkennungsrezeptoren („pattern recognition receptors“) PSID „Putative S1 RNA-binding domain protein“ P-TEPb Positiver transkriptioneller Elongationsfaktor b PTP4A2 Protein Tyrosin Phosphatase IVA2 PUVA Psoralen plus ultraviolettes Licht RAP140 Retinoblastom-assoziiertes Protein 140 RAYS Rekombinant exprimierte Antigene auf Hefeoberfläche pRB Retinoblastom Rbbp2h1a Retinoblastom-bindendes Protein 2 Homolog 1a RCC Nierenzellkarzinom („renal cell carcinoma“) RDA „Representational Difference Analysis“ RIF1 Rezeptor-interagierender Faktor 1 RNA Ribonukleinsäure mRNA Boten-RNA („messenger“ RNA) siRNA „small interfering“ RNA RSV „Respiratory syncytial virus“ Rt Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion SADA Serumantikörper-Detektionsarray SAF T-Zell-Aktivierungsfaktor SAGE „Serial Analysis of Gene Expression“ SAPK Stress-aktivierte Proteinkinase SART3 „Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3“ SCP-1 „Synaptonemal complex protein 1“ retSDR2 Retinale kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (“sodium dodecyl

sulphate polyacrylamide gel electrophoresis”) sek Sekunde SEREX „Serological analysis of recombinantly expressed cDNA clones“ SKIP SKI-interagierendes Protein SMARTA „Serological mini-arrays of recombinant tumor antigens“ SS Sézary Syndrom SSM Superfiziell spreitendes Melanom STAT5 „Signal Transducer and Activator of Transcription 5“ STK17b Serin/Threonin Kinase 17b SV Säulenvolumen

VERZEICHNISSE xiii

cTAGE-1 Kutanes T-Zell Lymphom Antigen 1 („Cutaneous T-cell lymphoma antigen 1“)

Strep-PE Streptavidin-R-Phycoerythrin TAA Tumor-assoziiertes Antigen TBS-T TBS-Tween TCR T-Zell-Rezeptor („T cell receptor“) TEMED N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin TH-Zellen T-Helferzellen TIL Tumor-infiltrierende Lymphozyten TMB Tetramethylbenzidin TNF-α Tumor Nekrosis Faktor-α TRP-1 „Tyrosin Related Protein 1“ TRIP4 Thyroidhormon Rezeptor-interagierendes Protein 4 TSEB „Total skin electron beam radiation“ U Unit Ub Ubiquitär UACA UVEAL Autoantigen UBE3A Ubiquitin Protein Ligase E3A ÜN Über Nacht UICC Internationale Union gegen den Krebs („Unio internationalis contra

cancrum“) UPM Umdrehungen pro Minute UTR “Untranslated regions” UVA Ultraviolettes Licht A WHO Weltgesundheitsorganisation („World Health Organisation“) w Weiblich wo Woche X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid ZNF Zink Finger Protein ZNS Zentrales Nervensytem

EINLEITUNG 1

1 EINLEITUNG

Die Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers. Sie begrenzt das Körperinnere gegen

die Umwelt und ist aus 3 Schichten aufgebaut: der Epidermis (Oberhaut), dem Korium (Dermis,

Lederhaut) und der Subcutis (Unterhaut). Ein gefäßloses, mehrschichtiges, verhornendes

Plattenepithel bildet die Epidermis, die zum größten Teil aus Keratinozyten aufgebaut ist. Zudem

sind dort unter anderem die pigmentbildenden Zellen der Haut (Melanozyten) und Zellen des

Immunsystems (Antigen-präsentierende Langerhans-Zellen) lokalisiert. Die Dermis enthält als

festes, unterstützendes Gewebe Gefäße, Schweißdrüsen, Haarfollikel, Kollagen und Elastin-

Fasern. Die Subcutis schließlich besteht im wesentlichen aus Binde- und Fettgewebe (Abbildung

1-1) (Thews et al. 1999). Sowohl beim kutanen T-Zell Lymphom (CTCL) als auch beim

malignen Melanom (MM) ist die Haut das primär betroffene Organ.

Abbildung 1-1: Die Schichten der Haut mit der Angabe der Schichtenfolge (Gratzl 2002)

Die Haut ist aus drei Schichten aufgebaut: der Epidermis, der Dermis und der Subcutis.

1.1 Immunüberwachung in der Haut

Die Haut stellt die primäre Grenzfläche zwischen dem Körper und der Umwelt dar und ist

deshalb nicht nur eine physikalische Barriere, sondern enthält ebenfalls eine Reihe aktiver

Verteidigungsmechanismen gegen biologische, chemische und physikalische Angriffe von

außen. Um diese Angriffe abzuwehren, wird sowohl das angeborene als auch das adaptive

Immunsystem der Haut aktiviert (Kupper and Fuhlbrigge 2004). Bei einer Epithelverletzung

oder dem Eindringen von Pathogenen werden zunächst Komponenten des angeborenen

Stratum corneum

Stratum lucidumStratum granulosumStratum spinosum

Stratum basale

Stratum papillare

Stratum reticulare

Knäuel(Schweiß)drüse

Subcutis

Dermis

Stratum corneum

Stratum lucidumStratum granulosumStratum spinosum

Stratum basale

Stratum papillare

Stratum reticulare

Knäuel(Schweiß)drüse

Subcutis

Dermis

EINLEITUNG 2

Immunsystems, die Hautzellen (Keratinozyten und Fibroblasten) sowie Immunzellen

(Langerhans-Zellen, dermale dendritische Zellen (DC) und Mastzellen), aktiviert, die

antimikrobielle Peptide, chemotaktische Proteine und Zytokine freisetzen (Yang et al. 2001).

Dies resultiert unter anderem in der Rekrutierung von Immunzellen aus dem Blut. Die

Mechanismen der angeborenen Immunantwort führen zudem dazu, dass das adaptive

Immunsystem, das auf T- und B-Zellen basiert, die Antigen-spezifische Rezeptoren exprimieren,

aktiviert wird. Dieses System stellt sicher, dass jede T-Zelle ihr passendes Antigen zur richtigen

Zeit am richtigen Ort findet. Im ersten Schritt treffen Antigen-präsentierende Zellen (APC), die

das in der Haut lokalisierte Antigen aufgenommen haben, in Lymphknoten der Haut mit naiven

T-Zellen zusammen. T-Zellen mit passendem Rezeptor binden das von APC präsentierte

Antigen und werden zusätzlich über kostimulatorische Signale der DC aktiviert. Das B7-Protein

der APC bindet an das Differenzierungscluster 28 (CD28)-Protein der T-Zelle. Zumeist trägt nur

ein T-Zellklon den passenden T-Zell-Rezeptor (TCR) für ein Antigen. Nach der

Antigenerkennung erfolgt die selektive Proliferation (klonale Selektion) des spezifischen T-

Zellklons, um die Erkennung des Antigens durch zahlreiche aktivierte T-Zellen sicherzustellen.

Im zweiten Schritt werden Antigen-spezifische Effektor-Gedächtnis T-Zellen produziert, die

„Homing“ Rezeptoren exprimieren, mit deren Hilfe sie an den Ort der Antigenlokalisation, der

Haut, gelangen können. Im letzten Schritt werden zentrale Gedächtnis- und Effektorzellen

gebildet, die andere Gewebe des Körpers als die Haut auf die Antigenexpression hin untersuchen

(Kupper and Fuhlbrigge 2004). Dies gewährleistet die Ausbildung einer langlebigen, erworbenen

Immunantwort.

1.2 Immunüberwachung von Tumoren

Krebs ist die gängige Bezeichnung für einen bösartigen Tumor, der alle Organe des Körpers,

Epithelgewebe, das blutbildende oder das Immunsystem befallen kann. Zu Grunde liegt eine

Funktionsstörung in den Regulationsmechanismen der Zelle, die zu unkontrolliertem Wachstum

und Replikation der Zelle führt. Körpereigenes Gewebe wächst autonom und irreversibel, so

dass es zu ausgeprägtem Verlust verschiedener spezifischer Zell- und Gewebefunktionen

kommen kann (Pschyrembel 1998). In Deutschland sind Tumorerkrankungen (25%) die

zweithäufigste Todesursache nach den Herzkreislauferkrankungen (46%) (Statistisches

Bundesamt Deutschland 2003).

Das Immunsystem besitzt das Potenzial, neoplastische Zellen zu töten. Für verschiedene

Tumorerkrankungen (vor allem MM und Nierenzellkarzinom (RCC)) wurden bereits spontane

Regressionen berichtet (Bastian, 2003; Hammad et al. 2003). Hinweise für sowohl T-Zell- als

EINLEITUNG 3

Tumorzelle PAMP

PRR

Makro-phage

NK-Zelle

NK-T-Zelle

Vorläufer DC

Unreife DC

Reife DCAPC

Tumorzell-körper

Tumor-antigen

Angeborene Immunität

CD4+TH

CD8+CTL

B-Zelle

Erworbene Immunität

TCR

MHC I

CD8CD4

TCR

MHC II

Kostimulato-rische Signale

CD4

TCR

Hilfe durch Zytokin-

freisetzung

Antikörper-mediierte Tumorzelllyse

Erkennung

Tumorzelllyse

MHC II

Aufnahme von Tumorantigen

und Tumorzell-körper

Freisetzung von IFN-α

Direkte Tumor-zelllyse

Tumorzelle PAMP

PRR

Makro-phage

NK-Zelle

NK-T-Zelle

Vorläufer DC

Unreife DC

Reife DCAPC

Tumorzell-körper

Tumor-antigen

Angeborene Immunität

CD4+TH

CD8+CTL

B-Zelle

Erworbene Immunität

TCR

MHC I

CD8CD4

TCR

MHC II

Kostimulato-rische Signale

CD4

TCR

Hilfe durch Zytokin-

freisetzung

Antikörper-mediierte Tumorzelllyse

Erkennung

Tumorzelllyse

MHC II

Aufnahme von Tumorantigen

und Tumorzell-körper

Freisetzung von IFN-α

Direkte Tumor-zelllyse

auch humorale Immunogenität vieler Tumorerkrankungen wurden beschrieben (Pfreundschuh et

al. 1978; Sahin et al. 1995). Bei der Erkennung von Tumoren aktiviert das Immunsystem zwei

verschiedene Komponenten: das angeborene und das erworbene Immunsystem. Tumorimmunität

wird durch die Effektormechanismen des angeborenen Immunsystems initiiert und durch die

Zellen des erworbenen Immunsystems weitergeführt, wobei DC eine zentrale regulatorische

Rolle spielen (Abbildung 1-2) (Banchereau et al. 2000).

Abbildung 1-2: Integrierte Immunantwort gegen Tumorantigene (modifiziert nach Sahin

et al. 1999 und Banchereau et al. 2000)

Vorläufer dendritische Zellen (DC) erkennen Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) der Tumorzelle durch Mustererkennungsrezeptoren (PRR). Dies führt zu einer Interferon-α (IFN-α)-Freisetzung durch die DC, welche Makrophagen, Natürliche Killer (NK)-T-Zellen und NK-Zellen aktiviert. Die aktivierten Zellen töten die Tumorzellen ab, und Tumorzellkörper werden freigesetzt. Die Zellkörper und freigesetzte Tumorantigene werden von unreifen DC aufgenommen, die zu reifen DC differenzieren und Tumorantigene zur Selektion von tumorspezifischen Lymphozyten präsentieren. Differenzierungscluster 8+ (CD8+) T-Zellen lysieren Tumorzellen unmittelbar, wohingegen ausgewählte CD4+ T-Helferzellen (TH) Zytokine freisetzen, um CD8+ T-Zellen und B-Zellen zu stimulieren. Von Tumoren sezernierte oder durch Tumorzelllyse freigesetzte Tumorantigene werden durch spezifische B-Zellen über deren membrangebundenes Immunglobulin (Ig) aufgenommen. B-Zellen, die Tumorantigene

EINLEITUNG 4

aufgenommen haben, werden durch TH–Zellen stimuliert, um signifikante Titer spezifischer Immunglobuline der IgG-Klasse sezernieren zu können. APC: Antigen-präsentierende Zelle, MHC: Haupthistokompatibilitätskomplex, TCR: T-Zell-Rezeptor, CTL: Zytotoxische T-Zelle.

Zunächst werden Tumormoleküle („pathogen-associated molecular patterns“, PAMP) von

Vorläufer-DC erkannt. Die DC setzen Interferon-α (IFN-α) frei, welches Natürliche Killer

(NK)-T-Zellen, NK-Zellen und Makrophagen aktiviert. Dies führt zu einer direkten oder durch

IFN-γ-vermittelten Abtötung der Tumorzelle. Um die erworbene Immunität zu aktivieren,

nehmen unreife DC Tumorzellkörper und Tumorproteine von Tumorzellen auf, die zuvor von

Zellen der angeborenen Immunantwort abgetötet wurden. Die Tumorproteine werden prozessiert

und cross-präsentiert. Das heißt, dass die gebildeten Peptide sowohl von CD8+ T-Zellen über

den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I Weg als auch von CD4+ T-Zellen über

den MHC Klasse II Weg erkannt werden können. Im Anschluss differenzieren CD8+ T-Zellen

zu zytotoxischen T-Zellen (CTL). Diese lysieren Tumorzellen, die das entsprechende antigene

Protein über MHC Klasse I Moleküle präsentieren, unmittelbar. CD4+ T-Helferzellen (TH-

Zellen) stimulieren CD8+ T-Zellen und naive B-Zellen durch die Freisetzung von Zytokinen.

Spezifische B-Zellen können Tumorproteine über membranständiges Immunglobulin (Ig)

aufnehmen und werden von CD4+ T-Zellen zur antigenspezifischen Differenzierung angeregt.

Die ausdifferenzierten, reifen Plasma-B-Zellen sezernieren spezifische Antikörper. Damit findet

neben der Zell-vermittelten Lyse durch CD8+ T-Zellen die Antikörper-vermittelte Lyse der

Tumorzellen durch Plasma-B-Zellen statt (Abbildung 1-2) (Sahin et al. 1999; Banchereau et al.

2000). Diese antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) besteht in der

Zerstörung von Tumorzellen, die durch von B-Zellen sezernierte Antikörper bedeckt sind, durch

NK-Zellen. Somit wird deutlich, dass Tumorproteine essentiell für die Ausbildung einer

erworbenen Immunität gegen den Tumor sind. Im folgenden sollen nun zunächst die beiden

Tumorerkrankungen, das CTCL und das MM, und anschließend die Tumorantigene dargestellt

werden.

1.3 Das kutane T-Zell Lymphom

Kutane Lymphome stellen Neoplasien mit dermatotropem Ursprung dar, die durch die autonome

Proliferation einzelner T- oder B-Lymphozyten entstehen. Sie unterscheiden sich stark in ihrer

Morphologie sowie klinischen Ausprägung und Prognose (Burg et al. 1984; Sterry et al. 1997).

Sowohl das CTCL als auch das kutane B-Zell Lymphom (CBCL) zählen zu den primär kutanen

Lymphomen, die klinisch und biologisch eine heterogene Gruppe der Non-Hodgkin Lymphome

(NHL) bilden (Querfeld et al. 2005). Ein Viertel aller NHL werden jährlich als primär kutane

Lymphome diagnostiziert. Die Inzidenz dieser sehr seltenen Erkrankung ist 0,5-1/100.000

EINLEITUNG 5

(Willemze et al. 1997; Groves et al. 2000). Ungefähr 75% der primär kutanen Lymphome sind

CTCL, wohingegen ca. 25% der Fälle CBCL darstellen (Willemze et al. 2005). Kutane

Lymphome betreffen zumeist Patienten im höheren Lebensalter, und treten bei Männern

zweimal häufiger auf als bei Frauen (Kim et al. 2003). Eine Metastasierung in Lymphknoten und

innere Organe wird für fortgeschrittene Stadien berichtet. Im Weiteren werden die in ihrem

klinischen Verlauf zumeist als aggressive beschriebenen CTCL besprochen.

1.3.1 Klassifikation

Das CTCL beschreibt eine klinisch und histologisch sehr heterogene Gruppe von Neoplasien,

deren Gemeinsamkeit zumeist in der malignen Proliferation von CD4+ TH2-Zellen liegt

(Dummer et al. 1996a). Zu dieser Gruppe zählen laut WHO-EORTC-Klassifikation (Willemze et

al. 2005), die sich auf klinisch, histo- und zytomorphologische, phäno- und genotypische

Kriterien stützt, die Mycosis fungoides (MF) und ihre Varianten (follikulotropische MF,

pagetoide Retikulose, elastolytisches Lymphom („granulomatous slack skin“)), das Sézary

Syndrom (SS), das adulte CTCL, die primär kutanen CD30+ lymphoproliferativen Erkrankungen

(anaplastisches großzelliges CTCL, lymphomatoide Papulose), das subkutane Pannikulitis-artige

CTCL, die extranodalen NK/T-Zell Lymphome und die primär kutanen peripheren CTCL

(aggressives epidermotrophes CD8+ CTCL, kutanes γδ CTCL, kutanes CD4+ klein- und

mittelzelliges pleomorphes CTCL). Hierbei gelten das SS und die primär kutanen peripheren

CTCL als besonders aggressiv mit Überlebenszeiten unter 5 Jahren. Im folgenden sollen nun die

beiden häufigsten Formen, die MF und das SS, genauer beschrieben werden.

Mycosis fungoides

Die MF ist mit 50% aller primär kutanen Lymphome die häufigste Entität und macht ca. 1% aller

NHL aus (Kim et al. 2003; Willemze et al. 2005). Aufgrund ihres indolenten Verlaufs stellt sie

eine niedrig maligne Erkrankung dar, die eine langsame Progression über Jahre und teilweise

Jahrzehnte aufweist (Weinstock and Horm 1988). Für Patienten mit begrenzter Erkrankung

(<10% der Körperoberfläche) wurden ähnliche Überlebenszeiten wie für Kontrollpersonen

nachgewiesen (Kim et al. 2003). Die Überlebenszeiten sinken mit zunehmendem Stadium, und

bei 10% aller Patienten schreitet die Krankheit in höhere Stadien fort (Kim et al. 2003). Der

Phänotyp der MF-Tumorzellen kann meist als CD4+, CDw29+, CD2+, CD3+, CD45RO+ und

CD30- beschrieben werden, der demjenigen reifer T-Gedächtnis-Zellen entspricht. Die Zellen

besitzen eine charakteristische zerebriforme Morphologie (Slater, 1991; Burg et al., 1997; Sterry

et al., 1997). Ein charakteristisches Merkmal der MF sind Pautrier’sche Mikroabszesse, die eine

Ansammlung von atypischen Lymphozyten in der Epidermis darstellen (Nickoloff 1988).

EINLEITUNG 6

Sézary Syndrom

Das SS wird als leukämische Variante der MF verstanden, ist eine seltene, nur bei Erwachsenen

auftretende Erkrankung und hat eine deutlich schlechtere Prognose als die MF. Die mittlere

Überlebenszeit beträgt 2-4 Jahre (Willemze et al. 1997; Scarisbrick et al. 2001). Nach zunächst

mildem Verlauf kommt es schnell zu Knotenbildung mit Übergang in ein hochmalignes,

immunoblastisches T-Zell Lymphom. Das SS ist durch Erythrodermie, typischerweise mit Befall

der Handflächen und Fußsohlen, und generalisierter Lymphadenopathie gekennzeichnet. Oft

findet man im Blut, den Lymphknoten und der Haut die sogenannten Sézary- oder Lutzner-

Zellen. Diese malignen T-Lymphozyten exprimieren den IFN-γ-Rezeptor AP-1.

Immunhistochemisch sind Sézary-Zellen CD3+, CD4+, CD45RO-, CD8- und CD30-.

Zirkulierende Zellen sind durch einen Verlust der Oberflächenmarker CD7 und CD26

charakterisiert (Willemze et al. 1997; Willemze et al. 2005).

1.3.2 Stadieneinteilung

Die Stadieneinteilung der CTCL erfolgt mittels TNMB-Klassifikation. Diese wurde jedoch vor

allem für die MF und das SS entwickelt, und ist somit nur bedingt für andere CTCL-Formen

gültig (Kerl H 1987; UICC 1993). T steht für Primärtumor, N für Lymphknoten, M für

Fernmetastasen und B für Blut (Tabelle 1-1). In Anlehnung an die TNM-Einteilung in Tabelle

1-1 kann eine Stadiengruppierung der Patienten vorgenommen werden. Das klinische Bild eines

CTCL-Patienten in Stadium IIIB weist beispielsweise eine generalisierte Erythrodermie (T4),

anormale regionäre Lymphknoten ohne histologisch erkennbaren Befall (N1) und keine

Fernmetastasen (M0) auf. Patienten in frühen Stadien (IA-IIA) haben in der Regel eine sehr gute

Prognose mit Überlebenszeiten von 10-20 Jahren, wohingegen in späten Stadien (III, SS)

ungünstige Prognosen mit Überlebenszeiten von unter 5 Jahren vorherrschen (Tabelle 1-2).

EINLEITUNG 7

Tabelle 1-1: TNM-Stadieneinteilung für kutane Lymphome

In dieser Tabelle ist die TNMB-Stadieneinteilung für kutane Lymphome nach (Kim et al. 2005) wiedergegeben. Die Abkürzung TNMB steht für Primärtumor (T), Lymphknoten (N), Fernmetastasen (M) und Blut (B).

Kategorie Definition T: Haut (Primärtumor) T1 T2 T3 T4

Begrenzte Plaques, Papeln oder ekzematöse Herde, <10% Körperoberfläche Disseminierte Plaques, Papeln oder erythematöse Herde, ≥10% Körperoberfläche Tumoren (einer oder mehrere) Generalisierte Erythrodermie

N: Lymphknoten N0 N1 N2 N3

Regionäre Lymphknoten klinisch nicht befallen Regionäre Lymphknoten klinisch anormal, histologisch nicht befallen Regionäre Lymphknoten klinisch nicht befallen, histologisch befallen Regionäre Lymphknoten klinisch anormal, histologisch befallen

M: Nicht-regionärer extrakutaner Befall („Fernmetastasen“) M0 M1

Kein nicht-regionärer extrakutaner Befall Nicht-regionärer extrakutaner Befall

B: Blut B0 B1

Keine zirkulierende atypische (Sézary) Zellen Zirkulierende atypische (Sézary) Zellen vorhanden

Tabelle 1-2: Stadiengruppierung der TNM-Einteilung

In dieser Tabelle ist die Einteilung der Stadien des CTCL nach Kim et al. 2005 dargestellt.

Stadium T N M 5-Jahres-Überlebensrate [Jahre] IA IB IIA IIB IIIA IIIB IVA IVB

1 2

1,2 3 4 4

1,2,3,4 1,2,3,4

0 0 1

0,1 0 1

2,3 0,1,2,3

0 0 0 0 0 0 0 1

96 73 73 44 44 44 27 27

1.3.3 Pathogenese

Die Ätiologie der Entstehung von CTCL ist unbekannt. Viele verschiedene Gründe wurden

bislang diskutiert, die von Infektionen über Onkogene, Zytokine und Rauchen bis hin zu

Umweltfaktoren (z.B. ultraviolettes Licht) reichen. Hintergrund scheint eine chronische

Antigenstimulation zu sein, die durch chromosomale Alteration (Mao et al. 2002), bakterielle

(Abrams et al. 1999) oder virale Infektion (Herne et al. 2003) hervorgerufen wird.

Viele Chromosomen können klonale Alterationen aufweisen (Thangavelu et al. 1997), die

Onkogene, Tumorsuppressorgene und Zellzyklus-regulierende Gene verändern. Insbesondere

EINLEITUNG 8

das Chromosom 1 ist häufig betroffen, so dass die Region zwischen 1p22 und 1p36 ein Gen

enthalten könnte, das entweder in der malignen Transformation oder Progression von MF und SS

eine wichtige Rolle spielt (Thangavelu et al. 1997). Zudem treten Alterationen häufig mit

Genverlusten auf 1p, 17p, 10q und 19 sowie mit Gengewinnen auf 4q, 18 und 17q auf (Mao et

al. 2002). In frühen Stadien werden nur wenige proliferierende Zellen in malignen Läsionen

gefunden, die durch Überexpression von bcl-2 der Apoptose entgehen (Dummer et al. 1995). In

späten Stadien jedoch können Mutationen in Genen wie ras, c-myc, tal-1, p53 und p16 auftreten,

die die onkogene Transformation vermitteln (Kanavaros et al. 1994; Neri et al. 1995; McGregor

et al. 1999; Navas et al. 2002).

Ein stimulierender Effekt des Chlamydia Pneumoniae-assoziierten Sézary T-Zell-Aktivierungs-

faktor (SAF) wurde bei SS-Zellen entdeckt (Abrams et al. 1999). In einigen malignen

Lymphomgeweben konnten virale Sequenzen nachgewiesen werden: das Retrovirus humanes T-

Zell-lymphotropes Virus Typ 1 (HTLV-1), welches in der Ätiologie der adulten T-Zell

Leukämie eine große Rolle spielt (Hall et al. 1991; Pancake et al. 1995; Kikuchi et al. 1997), das

humane Herpesvirus-8 (HHV-8) (Pawson et al. 1996; Sander et al. 1996) und das Epstein Barr

Virus (EBV) (Shimakage et al. 2001).

Frühe Stadien der MF besitzen häufig ein TH1 Zytokinprofil, wohingegen es in späten Stadien zu

einer Verschiebung des Profils nach TH2 kommt. Hier ist die Interleukin-10 (IL-10) Produktion

erhöht und IFN-γ erniedrigt (Asadullah et al. 1996; Dummer et al. 1996b). SS-Zellen

proliferieren nach einer Induktion mit IL-7, IL-2 und IL-15 und sezernieren IL-7 und IL-15 (Foss

et al. 1994; Dobbeling et al. 1998). Dies impliziert einen autokrinen Wachstumsmechanismus in

der Pathogenese von SS. Zudem regulieren IL-7 und IL-15 die Expression des Protoonkogens c-

myb und des Transkriptionsfaktors „Signal Transducer and Activator of Transcription“ 5

(STAT5), die wiederum die Expression von bcl-2 erhöhen und damit die Apoptose der SS-

Zelllinie SeAx verhindern (Qin et al. 2001).

1.3.4 Epidermotropismus

Die Wanderung von zytologisch atypischen T-Lymphozyten in die Epidermis wird als

Epidermotropismus bezeichnet. Der Epidermotropismus unterscheidet kutane Lymphome

(CTCL und CBCL) von allen anderen NHL. Der molekulare Mechanismus für dieses Phänomen

ist äußerst komplex. Zahlreiche Faktoren sind vermutlich beteiligt. Das kutane Lymphozyten

Antigen (CTLA), ein Haut-Homing-Rezeptor, wird im allgemeinen nicht auf T-Lymphozyten

der entzündlich veränderten Haut exprimiert, jedoch auf allen CTCL-Zellen (Rook und Heald

1995). CTLA ermöglicht CTCL-Zellen durch die Interaktion mit E-Selektin, einem

EINLEITUNG 9

Adhäsionsmolekül auf Endothelzellen der kutanen Gefäße, das Einwandern in die Haut. Das

IFN-γ-induzierte Protein-10 (IP-10), welches in MF- und SS-Läsionen überexprimiert ist und

chemotaktisch auf CD4+ T-Zellen wirkt, spielt vermutlich ebenfalls eine Rolle bei der

Entstehung des Epidermotropismus (Sarris et al. 1995; Tensen et al. 1998). Darüber hinaus

wurden Veränderungen des Immunsystems in MF und SS nachgewiesen: die Abnahme an NK-

Zellen und Eosinophilen, die verringerte T-Zell-Antwort auf Antigene und die Zunahme von

IgE- und IgA-Titern (Rook und Heald 1995).

1.3.5 Diagnose und Prognose

Die Diagnosestellung erfolgt primär nach klinischen und histo- sowie immunhistologischen

Kriterien, wobei die Abgrenzung zu anderen chronisch entzündlichen Dermatosen schwierig ist.

Auch Routine-Laborparameter werden überprüft wie Laktatdehydrogenase (LDH) (Whittaker et

al. 2003), da LDH und das T-Stadium nach klinischen Gesichtspunkten wichtige prognostische

Faktoren darstellen (Marti et al. 1991). Histopathologisch wird ein bandartiges Infiltrat von

kleinen bis mittelgroßen hyperchromatischen, zerebriformen Zellen in der papillären Dermis

nachgewiesen. Spezifisch sind Pautrier‘sche Mikroabszesse, die in fortgeschrittenen

Krankheitsstadien auftreten. Im Blut können stadienunabhängig maligne Zellen auftreten, und

besonders beim SS sind Sézary-Zellen im Blut ein entscheidendes Kriterium (Muche et al.

1997). Die Menge an zirkulierenden malignen Zellen korreliert invers mit der Prognose des

Patienten (Muche et al. 1997), und ein Verlust des Oberflächenmarkers CD7 korreliert häufig

mit einer schlechten Prognose (Bernengo et al. 1998). Der Verlust der pan-T-Zell-Marker CD2,

CD3 und CD5 wird häufig, gerade in fortgeschrittenen Stadien, berichtet und ist in der Diagnose

von MF hilfreich (Ralfkiaer 1994). Mittlerweile umfasst die Routinediagnostik auch

molekularbiologische Analysen wie die TCR-Genumstellung („TCR gene rearrangement“), um

die klonale Population an malignen Zellen zu definieren. Hierfür werden der Southern Blot, mit

einer Sensitivität von 90-95%, und die Polymerasekettenreaktion (PCR) mit einer Sensitivität

von 100% verwendet (Guitart und Kaul 1999; Russell-Jones und Whittaker 1999). Die

Sensitivität der Detektion kann durch die Verwendung von Mikrodissektion erhöht werden

(Yazdi et al. 2003). Eine hohe Konzentration an löslichem IL-2 Rezeptor (sIL-2R) ist mit einer

schlechten Prognose und eine hohe Expression an p53 ist mit fortgeschrittenem CTCL-Stadium

assoziiert (Lauritzen et al. 1995; Wasik et al. 1996). Hohe Mengen an CD8+ T-Zellen in

Hautbiopsien korrelieren mit einer besseren Überlebenschance (Hoppe et al. 1995).

Serumkonzentrationen von Neopterin, β2-Mikroglobulin und sIL-2R sind in SS-Patienten

signifikant erhöht. Zudem stellt Neopterin einen prognostischen Parameter für nicht-leukämische

EINLEITUNG 10

CTCL dar (Hassel et al. 2004). Schließlich ist die TNM-Klassifikation ein wichtiges Kriterium

neben Patientenalter, LDH-Konzentration und T-Zellklonalität, da der Befall der Haut (T-

Stadium) und die extrakutane Erkrankung (N-Stadium, Lymphknoten oder viszerale Organe) mit

der Prognose des Patienten korreliert (Querfeld et al. 2005).

1.3.6 Therapieformen

Das Ziel der derzeit angewandten Therapieformen besteht darin, Symptome, kosmetisches

Erscheinungsbild und regressionsfreie Überlebenszeit zu verbessern, da CTCL im

fortgeschrittenen Stadium kaum Heilungschancen besitzen. Das Stadium der Erkrankung bedingt

die Behandlung, so dass topische (örtliche) Therapien vor allem in frühen Stadien und

systemische Therapien in späten Stadien Anwendung finden (Dummer et al. 1996a).

Die Psoralen plus ultraviolettes Licht (PUVA)-Therapie basiert auf der Hemmung der

Desoxyribonukleinsäure (DNA)- und Ribonukleinsäure (RNA)-Synthese durch die Aufnahme

von 8-Methoxypsoralen (8-MOP), welches photosensibilisierend wirkt. Nach UV-Bestrahlung

(330 – 430nm) interkaliert 8-MOP mit der DNA und bildet Vernetzungen zwischen

verschiedenen DNA-Strängen aus. Es entstehen mono- oder bifunktionale Thymine,

Genmutationen oder Schwesterchromatiden-Austausche. Die DNA-Synthese wird gehemmt. Vor

allem in frühen Stadien angewandt erzielt die PUVA-Therapie Remissionsraten von ca. 60%

(Molin et al. 1981; Herrmann et al. 1995). Insbesondere für die Therapie des SS ist die

extrakorporelle Photophorese geeignet. Die peripheren mononukleären Zellen (PMNC) werden

aus dem Blut isoliert, in Gegenwart von 8-MOP mit UVA bestrahlt und reinjiziert.

Ansprechraten von 73% werden berichtet (Edelson et al. 1991). Strahlentherapie in Form von

UVB wird erfolgreich in frühen Stadien der Erkrankung eingesetzt und erzielt Remissionsraten

von 83% (Ramsay et al. 1992).

Da CTCL-Zellen radiosensitiv sind, wird die Radiotherapie vor allem unter Verwendung von

Elektronenstrahlung („total skin electron beam radiation“) mit begrenzter Eindringtiefe für die

gesamte Haut eingesetzt. Eine hohe Effizienz insbesondere in frühen Stadien mit begrenzter

Plaquebildung wird berichtet (Hoppe 1991; Quiros et al. 1997).

Die Anwendung der topischen Therapie, vor allem in frühen Stadien, erfolgt lokal auf die

Hautoberfläche. Mechlorethamin, ein Stickstoff-Lost-Zytostatikum, besitzt alkylierende

Wirkung in der Mitose-Phase der Zelle. Ansprechraten von bis zu 70% werden je nach Stadium

erzielt (Ramsay et al. 1988; Vonderheid et al. 1989). Carmustin, ein Nitrosoharnstoffderivat,

verwendet denselben Wirkmechanismus und führt zu stadienabhängigen Ansprechraten von 60-

EINLEITUNG 11

90% (Zackheim 1994). Kortikosteroide stellen eine effiziente Therapie im Ekzemstadium der

MF dar (Zackheim et al., 1998).

Die systemische Chemotherapie dient vor allem der palliativen Behandlung von Patienten mit

wiederauftretender oder fortgeschrittener Erkrankung, jedoch ohne anhaltenden Erfolg. Unter

anderem werden Methotrexat, Stickstoff-Lost-Derivate, Cisplatin, Doxorubicin und Vindesin

verwendet. Patienten im fortgeschrittenen Stadium können ebenso mit einer

Kombinationstherapie aus alkylierenden Substanzen und Doxorubicin oder Vinca Alkaloiden

behandelt werden (Rosen und Foss 1995).

Retinoide, Derivate des Vitamins A, wirken antiproliferativ und werden systemisch in frühen

Tumorstadien eingesetzt. Auch Kombinationstherapien von niedrigen Dosen mit IFN-α, PUVA

oder Chemotherapie finden Anwendung (Kessler et al. 1987; Molin et al. 1987; Dreno et al.

1991). Das neue Retinoid Bexaroten erzielte Therapieerfolge in der Hälfte der behandelten

Patienten in fortgeschrittenen Stadien (Duvic et al. 2001).

Interferone, insbesondere IFN-α, werden erfolgreich in der CTCL-Therapie eingesetzt. Ihr

Effektormechanismus ist komplex. IFN-α wirkt proliferativ auf Keratinozyten und

immunregulatorisch auf Makrophagen und NK-Zellen (Nickoloff et al. 1984; Saiki et al. 1986).

In vorbehandelten Patienten wurden Ansprechraten von 45-64% mit Remissionen von 2-jähriger

Dauer erreicht (Bunn et al. 1986; Olsen et al. 1989).

Der Einsatz von Interleukinen in der CTCL-Therapie ist möglich. IL-2 induziert die T-Zell-

Aktivierung und Proliferation sowie die CD8+- und NK-Zell-Toxizität. IL-12 stimuliert die IFN-

γ Produktion (Rook et al. 2001). Durch die Aktivierung von TH1-Zellen haben IL-2 und IL-12

einen günstigen Effekt auf das CTCL als Neoplasie der TH2-Zellen. Für IL-2 werden

Ansprechraten von 67% berichtet, und für IL-12 ergeben sich in frühen Stadien Ansprechraten

von 50% (Marolleau et al. 1995; Rook et al. 1999).

Denileukin diftitox (DAB389IL-2, Ontak) ist ein rekombinantes Fusionsprotein, das die

membrantranslozierenden und katalytischen Domänen des Diphtherietoxins und humanes IL-2

kombiniert. Da bei Lymphompatienten eine hohe Expression an IL-2-Rezeptoren vorherrscht

(59%), kann durch Denileukin diftitox die Proteinsynthese maligner Zellen gehemmt und

Ansprechraten um 40% erzielt werden (Saleh et al. 1998).

Monoklonale Antikörper zählen mittlerweile zum Behandlungsspektrum von CTCL. Sieben von

acht MF-Patienten sprachen auf den chimären CD4-Antikörper an (Knox et al. 1996). Die Hälfte

aller MF-Patienten sprachen auf CAMPATH-1H an, einen CD52-Antikörper (Lundin et al.

1998). Neue Therapieansätze wie Vakzinierungen mit DC, die mit Tumorlysat, Peptiden, DNA

EINLEITUNG 12

oder RNA beladen sind (Maier et al. 2003), und Histondeacetylase Inhibitoren, die die

Expression von Tumorsuppressorgenen wiederherstellen können, werden angewendet (Duvic et

al. 2003; Piekarz et al. 2004).

1.4 Das maligne Melanom

Das MM ist ein bösartiger Tumor, der von den pigmentbildenden Zellen, den Melanozyten,

ausgeht. Dieser stark immunogene, neuroektodermale Tumor tritt vor allem an der Haut, aber

auch an den Schleimhäuten, der Aderhaut oder den Hirnhäuten auf. Das MM ist für etwa 90%

der Mortalität an Hautkrebs verantwortlich, da eine frühe Tendenz zur aggressiven,

lymphogenen und hämatogenen Metastasierung besteht (Pschyrembel 1998). Die MM-Inzidenz

in der weißen Bevölkerung nimmt weltweit seit 25 Jahren zu und korreliert mit der Helle der

Hautfarbe und der Nähe zum Äquator. In Mitteleuropa treten 10-12 Fälle pro 100.000 Einwohner

und Jahr auf, wohingegen die höchste Inzidenz (50-60/100.000) in Australien auftritt (Garbe und

Blum 2001; Stang und Jockel 2003). In stärker pigmentierten Bevölkerungsgruppen ist das hier

seltene MM vor allem auf die Schleimhaut, Handflächen und Fußsohlen beschränkt (Garbe

1997a). MM treten zu 5-10% familiär (Greene et al. 1985), bei Frauen häufiger an den unteren

Extremitäten (35%) und bei Männern häufiger am Stamm (57%) auf (Volkenandt et al. 1999).

Klinisch und histologisch lassen sich vier MM-Haupttypen unterscheiden (Clark et al. 1969):

Das superfiziell spreitende Melanom (SSM) ist mit 60% der häufigste MM-Typ. Es ist häufig am

Rumpf lokalisiert.

Das noduläre maligne Melanom (NMM) betrifft 20% der Patienten. Da dieser MM-Typ primär

ein vertikales Wachstum besitzt und oft amelanotisch ist, ergibt sich häufig eine schlechte

Prognose.

Am Lentigo-maligna-Melanom (LMM) erkranken etwa 10%. Besonders bei älteren Menschen

tritt dieser Tumor auf dem Boden einer Lentigo maligna (Pigmentläsion) in lichtexponierten

Körperregionen (Gesicht, Kopf) auf.

Das akrolentiginöse Melanom (ALM) wird in Deutschland nur in etwa 5% diagnostiziert. Diese

in Afrika und Asien häufigste Form ist an Hand-, Fußflächen und im Nagelbereich lokalisiert.

5% aller Melanomfälle sind seltene MM-Varianten, zu denen unter anderem MM der

Schleimhäute, amelanotische MM und desmoplastische MM zählen.

EINLEITUNG 13

1.4.1 Stadieneinteilung

Die Stadieneinteilung des MM erfolgt nach der TNM-Klassifikation in 4 Stadien. Die

entscheidenden prognostischen Kriterien sind die Tumordicke des Primärmelanoms, der

Lymphknotenbefall und die Fernmetastasierung (Tabelle 1-3) (Balch et al. 2001).

Tabelle 1-3: Melanom TNM-Klassifikation

Die Tabelle verdeutlicht die TNM-Klassifikation des MM nach Balch et al. 2001. LDH: Laktatdehydrogenase.

T-Kriterium Dicke Ulzeration (U) T1 T2 T3 T4

≤ 1,0mm 1,01-2,0mm 2,01-4,0mm > 4,0mm

a: ohne U, Clark level II/III; b: mit U, Clark level IV/V a: ohne U; b: mit U a: ohne U; b: mit U a: ohne U; b: mit U

N-Kriterium Anzahl metastatischer Lymphknoten

Art

N1 N2 N3

1 2-3 4 und mehr

a: Mikrometastasen; b: Makrometastasen a: Mikrometastasen; b: Makrometastasen; c: In-transit Metastasen/Satelliten-Metastasen ohne metastatische Lymphknoten

M-Kriterium Lokalisation Serum LDH M1a M1b M1c

Subkutan, nodulär Lunge Alle anderen viszeralen Metastasen Alle Fernmetastasen

Normal Normal Normal Erhöht

Das Stadium I besitzt eine sehr gute Prognose (90-95% 5-Jahres-Überlebensrate). Diese

verschlechtert sich mit dem Auftreten von Satelliten-Metastasen (50-70%), regionären

Lymphknotenmetastasen (20-50%) und Fernmetastasen (10-20%) kontinuierlich (Tabelle 1-4)

(Rogers und Braun 2002).

Tabelle 1-4: Überarbeitete „American Joint Committee on Cancer“ (AJCC) klinische

Stadieneinteilung des Melanoms

Dieses System der Stadieneinteilung entspricht der aktuellen Klassifikation durch das „American Joint Committee on Cancer“ von 2002 und wurde verändert nach Rogers und Braun 2002. Ein Melanoma in situ (Tis) ist definitionsgemäß nur auf die Epidermis oberhalb der Basalmembran ausgedehnt und damit nicht in der Lage zu metastasieren.

Stadium T N M 5-Jahres-Überlebensrate [Jahre] 0 IA IB IIA IIB IIC III IV

Tis 1a

1b oder 2a 2b oder 3a 3b oder 4a

4b jedes jedes

0 0 0 0 0 0

1-3 jedes

0 0 0 0 0 0 0

1a-c

100 95,3

89,0-90,9 77,4-78,7 63,0-67,4

45,1 26,7-69,5 6,7-18,8

EINLEITUNG 14

1.4.2 Pathogenese

In der Pathogenese des MM spielt eine Kombination von verschiedenen genetischen (somatische

und hereditäre) und epigenetischen Veränderungen wie Promotor-Methylierung sowie

Umweltfaktoren, die somatische Mutationen auslösen können, eine wichtige Rolle. Im folgenden

werden die häufigsten pathogenetischen Faktoren dargestellt.

Signifikante Risikofaktoren für die Entstehung eines MM sind insbesondere die Anzahl

gewöhnlicher melanozytärer Nävi, das Vorhandensein atypischer, dysplastischer melanozytärer

Nävi, die Anzahl aktinischer Lentigines, die Haarfarbe und der Hauttyp (Garbe 1997b). Der

Nävuszellnävus, das Muttermal, ist eine gutartige Ansammlung von Nävuszellen, die seit der

Geburt vorhanden oder im Lauf des Lebens neu aufgetreten sind. Ihre Gesamtanzahl sowie ihre

Art erhöhen das MM-Risiko (Bauer und Garbe 2003). Die UV-Exposition korreliert bei allen

Altersgruppen mit der Nävusanzahl. Sonnenschutz führt bei Kindern und Jugendlichen zu

verminderter Nävusneubildung (Darlington et al. 2002; Milne et al. 2002). Die Mehrheit

epidemiologischer Studien identifiziert Hellhäutigkeit (Hautfarbe Typ I) als Risikofaktor für die

MM-Entstehung (Tucker und Goldstein 2003). In Bezug auf die Pigmentierung von Individuen

spielt ebenfalls die Haarfarbe eine entscheidende Rolle. Rothaarige weisen ein doppeltes MM-

Risiko auf im Vergleich zu Schwarzhaarigen (Bliss et al. 1995). Verschiedene Allele des

Melanocortin-1 Rezeptorgens (MC1R) werden in Zusammenhang mit dem Phänotyp helle Haut

und rote Haare gebracht (Valverde et al. 1995). MC1R kodiert für den G-Protein gekoppelten

Rezeptor des α-Melanozyten-stimulierenden Hormons (α-MSH). Bei der Bindung von α-MSH

an MC1R wird die Produktion von rot/gelbem Pheomelanin-Pigment auf braun/schwarzes

Eumelanin umgestellt (Sturm et al. 1998). MC1R-Varianten weisen eine geringere Kapazität auf,

diesen Wechsel in der Melanin-Produktion zu bewirken. Das MC1R-Gen ist mit dem Auftreten

von Sommersprossen und einem erhöhten Risiko der MM-Entstehung assoziiert (Valverde et al.

1996; Palmer et al. 2000). Schließlich stellen familiäre MM, die zwei oder mehr MM-Fälle bei

Familienmitgliedern ersten Grades voraussetzen, einen bedeutenden pathogenetischen Faktor

dar. Diese Patientengruppe entwickelt MM häufig in jüngeren Lebensjahren. Es treten dünnere

und multiple Primärmelanome auf (Barnhill et al. 1992).

Durch ihre DNA-schädigende Wirkung gilt die UV-Strahlung als bedeutendster umweltbedingter

Risikofaktor in der MM-Pathogenese. Sowohl UVA als auch UVB können an der malignen

Transformation von Melanozyten beteiligt sein (Ley 1997; Atillasoy et al. 1998). Vor allem hohe

UV-Exposition mit Entstehung von Sonnenbrand in der Kindheit und intensive periodische UV-

Exposition (Freizeit und Urlaub) in jungen Jahren stellen ein großes Risiko dar (Autier und Dore

1998; Whiteman et al. 2001). Sonnenbrand ist jedoch auch im Erwachsenenalter ein Risikofaktor

EINLEITUNG 15

(Elwood und Jopson 1997). Studien über Einwanderer in Regionen mit hoher

Sonneneinstrahlung belegen die Bedeutung der UV-Strahlung in Zusammenhang mit der MM-

Entstehung (Armstrong und Kricker 2001).

Keimbahnmutationen als Risikofaktoren für das MM wurden vor allem bei

Tumorsuppressorgenen und Onkogenen im familiären MM identifiziert. Die entsprechenden

Proteine spielen eine zentrale Rolle im Zellwachstum, der Zellzyklusregulation und der DNA-

Reparatur. Mutationen werden am häufigsten für das Tumorsuppressorgen „Cyclin-dependent

kinase inhibitor 2A“ (CDKN2A) (Kamb et al. 1994) und die Onkogene Zyklin-abhängige Kinase

4 (CDK4) (Zuo et al. 1996) und N-ras (Demunter et al. 2001) nachgewiesen. CDKN2A kodiert

für 2 Proteine, deren inaktivierte Signalwege stark mit der MM-Entstehung assoziiert sind.

p16INK4A kontrolliert CDK4 und CDK6, blockiert die Retinoblastom (pRB)-Phosphorylierung

und arretiert somit Zellen in der G1 Phase (Serrano et al. 1993). p14ARF interagiert mit „Human

double minute 2“ (HDM2) und stabilisiert p53 durch die Verhinderung der HDM2-vermittelten

p53-Degradation (Stott et al. 1998). 25-50% aller familiärer MM besitzen eine

Keimbahnmutation in CDKN2A (Hussussian et al. 1994; Kamb et al. 1994). HDM2 ist im MM

häufig überexprimiert, jedoch vermutlich kein Onkogen, da die Überexpression mit verbessertem

klinischem Ergebnis korreliert (Polsky et al. 2001; Polsky et al. 2002). Der Cyclin D1/CDK4-

Komplex vermittelt die pRB-Phosphorylierung, die durch die Bindung des Komplexes an

p16INK4A verhindert wird. Tritt eine Punktmutation im CDK4-Gen wie bei drei Familien mit

familiärem MM auf, stört dies die Bindung von CDK4 an p16INK4A, nicht aber an Cyclin D1

(Zuo et al. 1996). Cyclin D1 ist im ALM durch eine Gen-Amplifizierung überexprimiert. Eine

onkogene Rolle dieses Gens wurde in Tierversuchen mit Antisense-Behandlung nachgewiesen,

die zu Apoptose und Tumorverkleinerung führen (Sauter et al. 2002). p53-Mutationen sind eher

selten im MM. Mutationshäufigkeiten liegen bei 10-25% (Sparrow et al. 1995; Zerp et al. 1999).

Eine Korrelation zwischen Mutation und schlechter Prognose wird vermutet (Daniotti et al.

2004). Ras-Proteine sind Guanosintriphosphat (GTP)-bindende Proteine, die durch MM-

assoziierte Mutationen ihre GTPase Aktivität verlieren und stets in aktiver, GTP-gebundener

Form in der unkontrolliert proliferierenden Zelle vorliegen (Macaluso et al. 2002). Aktivierende

N-ras-Mutationen kommen im MM mit bis zu 30% vor (Demunter et al. 2001). 70% der MM

besitzen eine mutierte Serin/Threonin Kinase BRAF (Davies et al. 2002). Die häufigste Mutation

führt zu einem ständig aktiven Protein, das eine erhöhte extrazelluläre regulatorische

Proteinkinase (ERK) 1/2-Aktivierung bedingt. Da BRAF-Mutationen selten in mukosalen MM

aber häufig in Nävi detektiert werden, stellen sie vermutlich ein frühes neoplastisches Ereignis in

der MM-Entwicklung dar, das allerdings noch von zusätzlichen Faktoren abhängig ist (Pollock et

EINLEITUNG 16

al. 2003; Edwards et al. 2004). Das erste, die Apoptose hemmende Onkogen ist bcl-2. Es zählt zu

einer Familie intrazellulärer Proteine, die im Zuge der Regulierung der Caspase-Aktivierung

DNA-Fragmentierung und Apoptose einleiten (Cory und Adams 2002). In primären und

metastatischen MM ist bcl-2 überexprimiert und mit Tumorprogression assoziiert (Leiter et al.

2000).

Der wichtigste autokrine Wachstumsfaktor für die maligne Transformation von Melanozyten ist

der „basic fibroblast growth factor“ (bFGF). Um zu überleben, müssen Melanozyten über den

bFGF-Rezeptor kommunizieren. In normalen Melanozyten wird bFGF nicht exprimiert. Die

Expression ist jedoch mäßig bis hoch in dysplastischen Naevi und im MM (Halaban 1991).

1.4.3 Diagnose und Prognose

Zur Abgrenzung einer Pigmentläsion von einem MM wird zunächst die ABCDE-Regel

angewandt, die sich auf 5 Kriterien stützt: A für Asymmetrie, B für unregelmäßige Begrenzung,

C für uneinheitliche Farbe (Colorit), D für einen Durchmesser größer als 5mm und E für

Erhabenheit (AWMF 2005). Zusätzlich wird zur differentialdiagnostischen Abklärung die

Dermatoskopie eingesetzt (Kittler et al. 2002). Nach der Exzision eines Primärmelanoms ist eine

histologische Beurteilung unerlässlich, die insbesondere den Tumortyp, die Tumordicke nach

Breslow und die Eindringtiefe nach Clark erfassen muss. Zudem kann eine immunhistologische

Charakterisierung der Läsion unter Verwendung von Antikörpern gegen

Differenzierungsantigene wie S100, „human melanoma black-45“ (HMB-45), MelanA und

Tyrosinase durchgeführt werden (Busam und Jungbluth 1999; Orchard 2000). Allerdings ist bis

heute kein histologischer Marker bekannt, der spezifisch und zugleich sensitiv ist (de Wit et al.

2004). S100 zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität aus, erreicht jedoch nur eine geringe

Spezifität. S100 wird auch in nicht malignen Zellen exprimiert. HMB-45 weist eine hohe

Spezifität auf, wird allerdings nur in 80% der Melanomzellen detektiert (Cochran et al. 2001).

MelanA und Tyrosinase haben ebenfalls eine hohe Spezifität aber eine geringe Sensitivität.

Deshalb wird S100 häufig in Kombination mit einem oder mehreren Differenzierungsantigenen

für die Immunhistologie verwendet. „Melanoma ubiquitous mutated“ (MUM-1) wurde kürzlich

als neuer Marker für primäre und metastasierende MM identifiziert und ist sensitiver als MelanA

und spezifischer als S100 (Sundram et al. 2003). Zum Nachweis der exprimierten Gene wird

neben der Immunhistologie auch die Reverse Transkriptase (RT)-PCR herangezogen. Diese kann

zum Nachweis von Tumorzell-RNA in Lymphknoten, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten

angewandt werden. Da bei gesunden Menschen keine Melanozyten im Blut zirkulieren, ist der

Nachweis von MelanA und Tyrosinase im Blut mittels RT-PCR relativ sensitiv (Georgieva et al.

EINLEITUNG 17

2002). Andere angebrachte Marker, die in der RT-PCR seit kurzem Anwendung finden, sind

„Cancer Testis Antigene“ (CTA), insbesondere der Melanom Antigen (MAGE)-A-Familie

(Miyashiro et al. 2001; Reynolds et al. 2003).

Serologische Marker sind für das MM bereits bekannt, allerdings fehlt auch hier ein Marker, der

sowohl in der Diagnostik, Prognostik als auch der Verlaufskontrolle gleichermaßen einsetzbar ist.

S100β ist gegenwärtig der am besten geeignete Serummarker des MM, dessen Einsatz in der

Diagnose und Früherkennung limitiert ist, aber einen hohen prognostischen Wert im

fortgeschrittenen Krankheitsstadium besitzt (Bottoni et al. 2003). In 55% der Patienten, die auf

eine Chemotherapie ansprachen, normalisierte sich der S100β Wert. In nur 5% der Patienten, die

eine Progression aufwiesen, normalisierte sich der S100β Wert (Hamberg et al. 2003). Obwohl ein

erhöhter LDH-Serumspiegel als Klassifikationsparameter in die aktuelle Stadieneinteilung der

AJCC aufgenommen wurde, konnte der Zusammenhang eines erhöhten LDH-Serumspiegels mit

einer schlechten Prognose für Stadium IV Patienten in einigen Studien nicht bestätigt werden

(Hauschild et al. 1999; Hamberg et al. 2003). Desweiteren stellte sich die Serumkonzentration an

C-reaktivem Protein (CRP) als spezifischer als LDH in der Erkennung einer Progression von

StadiumI/II nach Stadium IV dar (Deichmann et al. 2004). Im klinischen Alltag wird neben S100β

und LDH „melanoma inhibitory activity“ (MIA) als Serummarker verwendet. MIA ist deutlich

stabiler als S100β (Djukanovic et al. 2001). Die MIA-Serumkonzentration korreliert eindeutig mit

dem Erkrankungsstadium (Bosserhoff und Buettner 2002). Allerdings ist S100β als prognostischer

Indikator MIA überlegen (Deichmann et al. 1999; Stahlecker et al. 2000). Wie erläutert werden

heute einige serologische Marker für die Prognose und Verlaufskontrolle angewandt. Jedoch fehlt

es an diagnostischen Markern zur Früherkennung des MM

Der wohl wichtigste prognostische Faktor ist die Tumordicke. Weitere wichtige Kriterien sind die

Tumorlokalisation, das Alter und das Geschlecht des Patienten. Bei einer gegebenen Eindringtiefe

des Tumors haben Patienten mit Tumoren an den Extremitäten, jünger als 60 Jahre und Frauen

eine bessere Prognose (Schuchter et al. 1996). In primären MM ist HDM2 ein unabhängiger

Überlebensmarker und seine Überexpression ist mit verbessertem klinischen Ergebnis korreliert

(Polsky et al. 2001). Laut Healy et al. 1998 ist p53 Überexpression signifikant mit verbesserten

Überlebenschancen assoziiert. Metallothionein scheint ein weiterer guter prognostischer Marker zu

sein, da seine Überexpression mit einem erhöhten Progressionsrisiko einhergeht (Weinlich et al.

2003). In der vertikalen Wachstumsphase ist CD40 Expression mit einer signifikant kürzeren,

tumorfreien Überlebenszeit assoziiert (van den Oord et al. 1996). Zudem ist der Verlust an

Melastatin „messenger“ RNA (mRNA) Expression in MM mit einem erhöhten

Metastasierungsrisiko assoziiert. Der Melastatin Status korreliert mit der tumorfreien

EINLEITUNG 18

Überlebenszeit unabhängig von der Tumordicke (Duncan et al. 1998; Duncan et al. 2001).

Schließlich wird den CTA eine Rolle als prognostische Marker zugeschrieben, die jedoch bisher

nur durch eine Assoziation zwischen MAGE Expression und tumor-infiltrierenden Lymphozyten

unterstützt wird (Busam et al. 2000). Hierbei besitzen tumor-infiltrierende Lymphozyten einen

prognostischen Wert in primären MM (Clemente et al. 1996).

1.4.4 Therapie

Während MM-Patienten im Stadium I und II relativ gute Chancen auf vollständige Heilung

haben, ist die Therapie im Stadium III und IV häufig palliativer Natur, da sich das MM hier als

sehr strahlen- und äußerst chemoresistent erweist.

MM-Patienten im Stadium I können durch chirurgische Entfernung des Primärtumors mit

ausreichendem Sicherheitsabstand geheilt werden (Balch et al. 1993). Neben der Exzision des

Primärtumors wird bei Stadium IB und II zusätzlich eine Wächter („Sentinel“)-

Lymphadenektomie durchgeführt (Morton et al. 1993). Durch Resektion der betroffenen

Lymphknoten und adjuvanter (vorbeugender) Behandlung können Patienten mit Melanomen der

Stadien II und III behandelt werden. Adjuvante Therapien haben nach der Exzision des

Primärtumors das Ziel, die Chancen einer anhaltenden Tumorfreiheit unter Verwendung von

Chemotherapeutika und Immunmodulatoren wie IL-2 und IFN-α-2a oder –2b zu erhöhen. Eine

Meta-Analyse identifizierte IFN-α als wirksamste Substanz bei der Senkung des Sterbe- und

Rezidivrisikos (Wheatley et al. 2002). Die Strahlentherapie und teilweise auch die

Thermoradiotherapie werden bei der Bekämpfung von vor allem Knochen- und Hirnmetastasen

eingesetzt, die sich der chirurgischen Therapie entziehen (AWMF 2005).

Für Stadium IV Patienten ist die Prognose mit einer Überlebenszeit von 6-9 Monaten infaust

(AWMF 2005). Obwohl der Nutzen einer systemischen Chemotherapie hinsichtlich

Verlängerung des Überlebens und Verbesserung der Lebensqualität im Allgemeinen limitiert ist,

kann sie im fortgeschrittenen MM-Stadium unter palliativen Gesichtspunkten eingesetzt werden.

Zumeist wird heute Dacarbazin als Monotherapeutikum oder in einer Polychemotherapie

verwendet. Bei Metastasen im zentralen Nervensystem (ZNS) wird häufig das ZNS-gängige

Temozolamid benutzt.

Da Chemotherapien im metastasierten Stadium insgesamt wenig erfolgreich sind (Ansprechraten

15-20%) (Middleton et al. 2000; Young et al. 2001), finden experimentelle Immuntherapien

Anwendung und erzielten erste Erfolge. Verschiedene Formen der Immunisierung unter anderem

mit Peptiden von Differenzierungsantigenen (Wang et al. 1999a) mit und ohne Adjuvantien, mit

DC beladen mit Tumorantigenen oder Tumorzellen (Nestle et al. 1998), mit adoptivem Transfer

EINLEITUNG 19

von T-Zellen (Rosenberg et al. 1988) und mit viralen Transfektionssystemen (Overwijk et al.

1999) wurden verwendet. In einer ersten Phase III Studie wurden MM-Patienten im Stadium IV

mit autologen Peptid-beladenen DC immunisiert oder mit Dacarbazin Chemotherapie behandelt

(Schadendorf et al. 2006). Peptide verschiedener, bekannter Tumorantigene (z.B. MAGE-A1,

Tyrosinase) wurden zur Beladung der DC ausgewählt. Obgleich kein statistisch signifikanter

Unterschied in der Effektivität der Immuntherapie gegenüber der Chemotherapie nachgewiesen

wurde, konnten vergleichbare Ansprechraten (niedrig, < 6%) in beiden Studienarmen berechnet

werden (Schadendorf et al. 2006). In Zusammenhang mit Immuntherapien wurden bereits viele

Tumorantigene, vor allem aus der Gruppe der CTA, eingesetzt. Aufgrund des Nachweises von

spontanen jedoch seltenen Regressionen wird vermutet, dass Krebszellen Autoantigene

exprimieren, die vom Immunsystem erkannt werden. Die Immunantwort, die gegen die

Krebszellen gebildet wird, ist allerdings zu schwach, um das Tumorwachstum und die

Metastasierung zu verhindern. Deshalb versuchen viele Therapien mittlerweile die vorhandene

Immunantwort zu verstärken (Overwijk und Restifo 2000).

1.5 Tumorantigene

In Tumorzellen werden wesentliche biologische Unterschiede hinsichtlich der Proteinexpression

im Vergleich zu den nicht-malignen Ursprungszellen berichtet. Zum einen können Gene von

molekularen Alterationen betroffen sein, die nur in Tumoren und einzelnen Geweben oder in

einer bestimmten Entwicklungsphase exprimiert werden. Zum anderen können Veränderungen

der molekularen Struktur auftreten, die durch Punktmutationen, Spleißvarianten, chromosomale

Translokationen, posttranslationale Modifikationen oder Translation alternativer Leserahmen

bedingt sind (Gilboa 1999). Zusätzlich werden Tumor-spezifische Antigene, die nur auf

Tumorzellen lokalisiert sind, und die häufigeren Tumor-assoziierten Antigene unterschieden, die

sowohl auf Tumorzellen als auch auf normalen Zellen exprimiert werden. Bei Erkennung dieser

Tumor-assoziierten Strukturen durch das spezifische Immunsystem des Tumorpatienten spricht

man von Tumorantigenen (Sahin et al. 1999). Die Erkennung von Antigenen auf neoplastischen

Zellen durch das Immunsystem kann zur Initiierung von zytotoxischen Effektormechanismen

führen und die Zerstörung der Krebszellen bewirken (Shankaran et al. 2001). Insbesondere

Fremdantigene, die durch bakterielle und virale Infektionen in den Körper gelangen, können eine

starke Immunantwort induzieren (Cooper et al. 1999; Gilboa 1999). Im Gegensatz dazu ist die

Immunantwort gegen körpereigene Antigene eher schwach, da häufig eine immunologische

Toleranz aufgrund von klonaler Deletion (Herndon et al. 2005) oder Anergie (Pape et al. 1998;

Lee et al. 1999) der T-Zellen vorliegt. Um eine Immunabwehr gegen den Tumor aufzubauen,

muss die immunologische Toleranzschwelle gegenüber den körpereigenen Antigenen

EINLEITUNG 20

überwunden werden wie beispielsweise durch die Aktivierung oder Erhöhung von spezifischen

CTL oder reaktiven Antikörpern (van der Bruggen et al. 1991; Sahin et al. 1995). Heute finden

Tumorantigene Anwendung in der Diagnose sowie dem Monitoring von Tumorerkrankungen

und der Therapie von Tumorpatienten in Form von Vakzinierungstherapien.

1.5.1 Klassen von Tumorantigenen

Tumorantigene können aufgrund ihrer Immunogenität, ihres Expressionsprofils und ihrer

molekularen Strukturveränderungen in fünf unterschiedliche Gruppen eingeteilt werden.

Onkofetale Antigene

Im Embryo exprimierte Proteine, die in gesunden adulten Zellen nicht, jedoch in malignen

Zellen re-exprimiert werden, werden als onkofetale Antigene bezeichnet. Die beiden

bedeutensten Vertreter dieser Antigengruppe sind das karzinoembryonale Antigen (CEA) und

Alpha-1-Fetoprotein (AFP). CEA ist ein Tumormarker für alle gastrointestinalen Tumore sowie

zahlreiche andere Tumorarten (Mulcahy und Benson 1999). AFP wird zur Diagnose von

Leberkarzinomen verwendet und tritt bei Testis- und Gebärmuttertumoren auf (Lamerz 1997;

Yuen und Lai 2005).

Virale Antigene

Einige Erkrankungen sind mit einer definierten viralen Infektion assoziiert. Zelluläre

Transformationen werden berichtet. Dies deutet auf Virus-assoziierte-Antigene in der

Tumorentstehung hin. Das EBV scheint eine Rolle im Burkitt Lymphom zu spielen (Murray et

al. 1992). In Krebspatienten wurden bereits reaktive Antikörper gegen die EBV-

Membranproteine LMP2A und 2B nachgewiesen (Lennette et al. 1995). Im Zusammenhang mit

Leukämie wurde das humane endogene Retrovirus Antigen (HERV-K10) beschrieben (Depil et

al. 2002). Die Onkoproteine E6 und E7 werden von humanen Papillomaviren (HPV) kodiert

(Steinwaerder et al. 2001). Durch die Bindung von E7 an pRB und E6 an p53 werden beide

Tumorsuppressorgene inaktiviert (Munger et al. 1992). Insbesondere die HPV-Subtypen HPV-16

und –18 sind ursächlich an der Zervixkarzinom-Entstehung beteiligt (Meschede et al. 1998).

Schließlich spielen das Hepatitis B Virus und das Hepatitis C Virus eine entscheidende Rolle in

der Entstehung von Leberzellkarzinomen (Gentilini et al. 1997).

Antigene durch molekulare Veränderungen

Eine durch Punktmutation oder strukturelle Alteration veränderte Gensequenz kann zu einer

veränderten Aminosäure (AS)-sequenz des kodierten Proteins und somit zu einem einzigartigen

Protein führen. Dies kann die Entstehung neuer antigener Epitope und einer Immunantwort

EINLEITUNG 21

gegen zuvor „normale“, immuntolerante Proteine zur Folge haben (Lurquin et al. 1989). Im p53

Gen werden häufig Mutationen berichtet, die unter anderem im Ovarialkarzinom zu

Antikörperantworten führen (Hogdall et al. 2002). Das ras-Onkogen weist ebenfalls häufig

Mutationen auf zum Beispiel bei 90% aller Pankreaskarzinome (Aguirre et al. 2003). Mutationen

von CDK4 und des β-Catenin Gens treten geringfügig häufiger auf (Wolfel et al. 1995;

Rubinfeld et al. 1997).

Durch Translokation können neue Fusionsproteine entstehen, die Antigene kodieren wie

beispielsweise das sogenannte Philadelphia Chromosom. Das Fusionsprotein wird durch die

Translokation des Abl-Gens von Chromosom 9 auf das bcr-Gen von Chromosom 22 gebildet.

Dieses stark immunogene Antigen ist charakteristisch für die chronisch myeloische Leukämie

(Bocchia et al. 1996; Berke et al. 2000). Nach der Identifizierung von „human leukocyte

antigen“ (HLA)-abhängigen Epitopen des Bcr/Abl-Gens konnten CTLs generiert werden (Berke

et al. 2000).

Kürzlich konnte ebenfalls nachgewiesen werden, dass das Immunsystem alternative

Spleißprodukte, neue offene Leserahmen (ORF), Pseudogene und sogar Produkte des antisense

Strangs der DNA erkennen kann (Van Den Eynde et al. 1999; Moreau-Aubry et al. 2000).

Beispielsweise sind reaktive Antikörper gegen das Spleißprodukt des Restins in Kontrollseren

und Seren von Krebspatienten zu finden (Bilbe et al. 1992).

Überexprimierte Tumorantigene

Die Überexpression eines ubiquitär vorhandenen Antigens durch verstärkte Transkription oder

erhöhte Proteinstabilität kann zu einer Überschreitung der Toleranzschwelle und somit zu einer

Immunantwort führen. Dieses Phänomen konnte unter anderem für die Carbon-Anhydrase XII

bei RCC (Tureci et al. 1998) und das EphA3 Gen bei MM, Lungenkarzinomen und Sarkomen

(Chiari et al. 2000) bestätigt werden. Bekanntester Vertreter dieser Tumorantigengruppe ist das

Her-2/neu Gen (Disis et al. 1994), welches sich als membranständiges Antigen für eine Therapie

mit monoklonalen Antikörpern (Herceptin) eignet. Herceptin ist bereits seit 2000 in Deutschland

für die Therapie bei Brustkrebs zugelassen (Hehl 2001).

Differenzierungsantigene

Differenzierungsantigene stellen eine Gruppe von Zelltyp-spezifischen Proteinen dar, die sowohl

in Tumorzellen (Melanomzellen) als auch im differenzierten Normalgewebe (ausschließlich in

Melanozyten) vor der Tumorentstehung exprimiert werden. Hierzu zählen die am

Melaninstoffwechsel beteiligte Tyrosinase (Brichard et al. 1993), gp100 (Bakker et al. 1994), die

„Tyrosinase Related Proteins“ 1 und 2 (TRP1/gp75; TRP2) (Wang et al. 1995; Wang et al. 1996)

EINLEITUNG 22

und das „Melanoma antigen recognized by T-cells 1“ (MART-1)/MelanA (Coulie et al. 1994).

Ein Zeichen für eine Immunantwort gegen diese Antigene ist eine Vitiligo (Overwijk und Restifo

2000). Bei Progression des MM tendieren Melanomzellen zur Dedifferenzierung und zum

Verlust dieser Antigene (Sahin et al. 1999).

Differentiell exprimierte Antigene treten ebenfalls bei anderen Tumorerkrankungen auf wie

beispielsweise Galektin 4 beim Kolonkarzinom (Scanlan et al. 1998) und „Renal cell carcinoma

associated antigen“ (RAGE) beim RCC (Gaugler et al. 1996).

Cancer Testis Antigene

Die CTA sind durch ihr charakteristisches Expressionsmuster gekennzeichnet. Neben ihrer

Expression in zahlreichen humanen Tumorentitäten werden sie lediglich in den Spermatogonien

der Testis, im Trophoblast, im Ovar und in der Plazenta exprimiert (Scanlan et al. 2004).

Dementsprechend sind CTA tumorspezifische Antigene, da die genannten Keimbahngewebe

durch ihre fehlende HLA-Expression immunprivilegierte Gewebe darstellen (Fiszer und Kurpisz

1998). Dies führte zu der Theorie, dass anomale Expression von CTA in Krebsgeweben die (Re)

Transkription von einem Zellprogramm, das nach der Ausdifferenzierung der Keimbahn- zur

somatischen Zelle stillgelegt wurde, reflektiert (Old 2001). Der wichtigste bisher bekannte

Mechanismus, der zur Entstehung der ektopischen Expression der CTA in Tumoren und

Keimbahnzellen führt, ist die genomweite Demethylierung der CpG-Inseln. Sie ist für die

Aktivierung von in tumorfreien Geweben nicht exprimierten Genen verantwortlich. Diese

Promoter-Demethylierung konnte für einige CTA in direktem Zusammenhang mit der

Aktivierung von Tumorzellen (De Smet et al. 1996) sowie in Testisgewebe (Choi und Chae

1993) beschrieben werden. Auch wenn es sich bei dieser Gruppe von Antigenen um Selbst-

Antigene handelt, besitzen einzelne CTA ein hohes immunogenes Potential.

Viele CTA sind in Multigenfamilien organisiert und häufig auf dem X-Chromosom, das oft ein

Ort für Störungen in der Methylierung ist, lokalisiert. Ausnahmen sind beispielsweise das

„Synaptonemal complex protein 1“ (SCP-1) (Kondoh et al. 1997) und „cutaneous T-cell

lymphoma antigen 1“ (cTAGE-1) (Usener et al. 2003b). Anfang der 90er Jahre wurde das erste

CTA mittels der genetischen Methode identifiziert: MAGE-1, welches später in MAGE-A1

umbenannt wurde (van der Bruggen et al. 1991). Bisher konnten 44 CTA-Genfamilien

identifiziert und näher charakterisiert werden (Scanlan et al. 2004). Charakteristisch für CTA ist,

dass nur wenige Tumorzellen eine Expression aufweisen. Dies weist auf eine inhomogene

Verteilung der CTA im Tumor hin. Häufig werden mehrere CTA in einem Tumor exprimiert. In

EINLEITUNG 23

40% Brusttumoren und 65% MM wurde die Expression von drei oder mehr CTA detektiert

(Sahin et al. 1998).

Heute sind 12 Mitglieder der MAGE-A-Familie bekannt. Daneben wurden die MAGE-B- und -

C-Familien identifiziert (Chomez et al. 2001). Andere MAGE-Familien (D und L) sind ubiquitär

exprimiert und zählen nicht zu den CTA. Alle Gene der MAGE-A Familie sind auf dem langen

Arm des X Chromosoms, der Region Xq28, lokalisiert. Zumeist wurde bisher die Expression der

CTA MAGE-A1 bis -A4, -A6 und A-12 analysiert. Seit kurzem wird die Expression der anderen

MAGE-A Mitglieder untersucht. Für das Pseudogen MAGE-A7 konnte keine Expression

nachgewiesen werden. MAGE-A9 wurde in knapp 30% der CTCL Tumorgewebe detektiert

(Eichmuller et al. 2003). Der vollständige ORF all dieser Gene ist im letzten Exon kodiert. Die

MAGE Homologie Domäne (MHD) ist eine Konsensusregion von 170 AS mit zentraler Lage im

abgeleiteten Protein jedes Familienmitgliedes. Aufgrund der zentralen Anordnung der MHD

wird eine konservierte Funktion vermutet.

Eine weitere Multigenfamilie stellt GAGE mit vormals 9 Mitgliedern (GAGE-1 bis –7, -7b und –

8) (Van den Eynde et al. 1995; De Backer et al. 1999) dar. Zwischenzeitlich wurden insgesamt

16 Familienmitglieder auf dem Chromosom Xp11.23 mittels BLAST-Untersuchung identifziert

und eine neue Nomenklatur festgelegt (Gjerstorff und Ditzel, 2008). In dieser Arbeit wird jedoch

die alte Nomenklatur, GAGE-7b, für GAGE-12I verwendet. Mit Ausnahme von GAGE-1

unterscheiden sich alle Familienmitglieder der GAGE-Familie in einzelnen

Nukleotidsubstitutionen. GAGE-1 weist eine Insertion von 143 Basenpaaren auf. In Abbildung

1-3 ist die Lokalisation der Familienmitglieder auf Xp11.2 – p11.4 dargestellt.

Abbildung 1-3: Lokalisation von GAGE-7b (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)

GAGE-7b (GAGE-12I) ist auf dem Chromosom Xp11.23 lokalisiert und teilt ein Gen mit GAGE-4, -5 und –7. Die verschiedenen GAGE-Familienmitglieder unterscheiden sich nur in einzelnen Nukleotidsubstitutionen.

Bisher wurde die Expression verschiedener GAGE-Gene auf mRNA-Ebene in über 30%

humaner Tumore, die auch MM und Lungenzellkarzinom beinhalten, beschrieben. Desweiteren

war die GAGE-Expression mit einer schlechten Prognose in MM und metastasiertem

Neuroblastom korreliert (Cheung et al. 1999; Cheung et al. 2000). Jedoch wurde eine geringe

EINLEITUNG 24

GAGE-Expression auch in peripheren Blutproben von gesunden Kontrollen gemessen (Oltra et

al. 2004).

Die Aufklärung der biologischen Funktion von CTA sowohl in der Gametogenese als auch in

Tumoren steht bisher am Anfang. Das SCP-1 Protein spielt eine Rolle bei der korrekten Paarung

der homologen Chromosomen während der Meiose (Schmekel et al. 1996). MAGE-A1 wurde

als autonomer Hemmstoff der Transkription durch seine Bindung mit dem SKI-interagierenden

Protein (SKIP) beschrieben (Laduron et al. 2004). Im NOTCH1 Signaltransduktionsweg bindet

MAGE-A1 an SKIP und rekrutiert Histondeacetylase, wodurch der NOTCH1 Weg gestört wird.

Der C-Terminus von MAGE-A4, der ebenfalls an SKIP binden kann, wurde als ein

Bindungspartner des Onkoproteins Gankyrin identifiziert und unterdrückt durch diese Bindung

die onkogene Aktivität von Gankyrin (Nagao et al. 2003). Da zudem Necdin, ein weiteres

Mitglied der MAGE-Familie, die Zellproliferation unterbinden kann (Taniura et al. 1999),

könnten die MAGE Gene multifunktionelle Regulatormoleküle darstellen.

1.5.2 Identifizierung von Tumorantigenen

Zwei klassische Strategien zur Identifizierung von Tumorantigenen unter Verwendung von

Tumor-reaktiven CTL sind bekannt: die „genetische“ (De Plaen et al. 1997) und die

„biochemische“ Methode (Falk et al. 1991). Für die genetische Methode wird eine Tumor

„copy“ DNA (cDNA)-Bank in Zielzellen exprimiert und mit CTL, die aus Tumor-infiltrierenden

Lymphozyten (TILs) oder peripheren Blut Lymphozyten (PBLs) von Krebspatienten generiert

wurden, durchsucht (Rosenberg 1996). Diese Methode diente bislang der Charakterisierung einer

Vielzahl von Tumorantigenen, die sowohl von CD8+ (van der Bruggen et al. 1991; Bakker et al.

1994) als auch CD4+ T-Zellen (Wang et al. 1999b; Wang et al. 1999c) erkannt werden. Die

biochemische Methode nutzt von MHC-Molekülen eluierte Peptide, die zunächst mittels

Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) und anschließender Massenspektrometrie

identifiziert und auf ihre Reaktivität mit CTL getestet werden (Hunt et al. 1992; Cox et al. 1994).

Neben der zellulären Immunantwort wird auch der humorale Arm des Immunsystems zur

Detektion von Tumorantigenen herangezogen. „Serological analysis of recombinantly expressed

cDNA clones“ (SEREX) stellt eine systematische molekularbiologische Methode zur

Identifizierung von Tumorantigenen dar, die das Antikörperrepertoire von Tumorpatienten zur

Durchsuchung von Tumor-cDNA-Banken nach antigenen Strukturen verwendet (Abbildung 1-4)

(Sahin et al. 1995; Eichmuller et al. 2001).

EINLEITUNG 25

mRNA

Phagenbank

(cDNA-Bank)

Isolierung des positiven Klons

Molekularbiologische Analysen

Patientenserum

Farbreaktion

Alkalische Phosphatase-gekoppelter anti-humanes IgG Antikörper

Antikörper aus Patientenserum

Testis

Tumor-gewebe

5’AAAAcap

3’

Nitrozellulose-membran

Transduktion von E. coli

Blotten der Proteine

Inkubation mit Patientenserum

Antigen

Präabsorbtion gegen Phagen- und E. coli-

Proteine

mRNA

Phagenbank

(cDNA-Bank)

Isolierung des positiven Klons

Molekularbiologische Analysen

Patientenserum

Patientenserum

Farbreaktion

Alkalische Phosphatase-gekoppelter anti-humanes IgG Antikörper

Antikörper aus Patientenserum

Testis

Tumor-gewebe

TestisTestis

Tumor-gewebeTumor-gewebe

5’AAAAcap

3’5’AAAAcap

3’



Transduktion von E. coli

Blotten der Proteine

Inkubation mit Patientenserum

Antigen

Präabsorbtion gegen Phagen- und E. coli-

Proteine

Abbildung 1-4: SEREX-Methode

Aus „messenger“ RNA (mRNA) von Testis- oder Tumor-Gewebe wird eine Phagenbank hergestellt. Die Elemente einer Lambda-ZAP Phagenbank (sogenannte Phagemide) beinhalten einen Phagenanteil und ein vollständiges Plasmid (pBluescript) mit „copy“ DNA (cDNA) Insert. Mit Phagemiden transduzierte Bakterien exprimieren Phagenproteine und im Insert kodiertes Protein und werden anschließend von Phagen lysiert. Exprimierte Proteine werden geblottet und auf Reaktionen mit Patientenserum überprüft. Dieses ist durch Präabsorption gegen E. coli- und Phagenproteine gereinigt und final 1:100 verdünnt. Sichtbar wird die Protein (Antigen)-Antikörper-Bindung durch eine Farbreaktion mittels eines zweiten anti-humanen Immunglobulin G (IgG) spezifischen Antikörpers, an den eine alkalische Phosphatase gekoppelt ist. Ein positiver Klon wird schließlich von der Agarplatte isoliert, das Plasmid aus dem Phagemiden ausgeschnitten und dessen Insert sequenziert und somit identifiziert.

Bisher konnten weit über 2000 körpereigene Antigene bei verschiedenen Tumorarten

beschrieben werden (Old und Chen 1998; Scanlan et al. 1998). Zudem konnten bereits bekannte

T-Zell-Tumorantigene mittels SEREX als B-Zell-Tumorantigene bestätigt werden und

umgekehrt (Sahin et al. 1995; Jager et al. 2000b). Allerdings werden vor allem Antigene, die

hochtitrige IgG-Immunantworten hervorrufen und zytoplasmatisch lokalisiert sind, identifiziert.

Eine Weiterentwicklung der SEREX-Methode ist die „DNA hybridization analysis of

recombinantly expressed cDNA libraries“ (HYREX)-Methode, die der Identifizierung und

Isolierung homologer cDNAs in einer Phagen-Plasmidbank dient. Dies ermöglicht die Suche

nach verwandten Sequenzen und Familienmitgliedern eines Gens.

Die systematische Genanalyse unter Verwendung von DNA-Datenbanken zählt ebenfalls zum

Methodenspektrum in der Tumorantigen-Identifizierung. Sie identifiziert potentielle

Zielstrukturen, deren immunogene Wirkung gegenüber CTL oder IgG-Antikörper von

Krebspatienten im Nachhinein überprüft wird. Wichtige Techniken im Zusammenhang mit

differentiellem Screening und subtraktiver Hybridisierung stellen die „Comparative Genomic

Hybridization“ (CGH) (Forus et al. 1998), die „Differential Display RT-PCR“ (DDRT-PCR)

EINLEITUNG 26

(Musholt et al. 1997), die „Representational Difference Analysis“ (RDA) (Gure et al. 2000), die

„Suppression Subtractive Hybridization“ (SSH) (Hufton et al. 1999) und die „Serial Analysis of

Gene Expression“ (SAGE) (Matsuzaki et al. 2005) dar. Inzwischen werden häufig Gen Chips

(Microarrays) für die Analyse der Genexpression herangezogen.

1.6 Ziel dieser Arbeit

Das Ziel dieser Arbeit ist es, Antikörperantworten gegen ausgewählte Tumorantigene des CTCL

und des MM, die mittels SEREX und HYREX an verschiedenen Phagenbanken identifiziert

wurden, auf ihren Wert in Diagnose, Monitoring und Prognose des CTCL und MM zu

untersuchen. Hierbei werden Häufigkeiten von Antikörperantworten von CTCL- und MM-

Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen evaluiert. Dies soll mittels zweier serologischer

Methoden erfolgen: dem Serumantikörper-Detektionsarray (SADA), einer abgewandelten Form

des SEREX, die etabliert wird, und der Multiplex-Serologie.

Das CTA GAGE-7b soll auf RNA- und Proteinebene auf seine Expression im CTCL und MM

analysiert werden, um eine Aussage über eine mögliche Verwendung dieses CTA in der

Therapie der beiden Krebserkrankungen treffen zu können. Hierfür wird zunächst rekombinantes

Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsprotein hergestellt, das entsprechende Protein von

seinem GST-Partner abgespalten und aufgereinigt. Das somit erhaltene Protein wird zur

Generierung von polyklonalen Antikörpern verwendet, die im Western Blot und in der

Immunzytologie und -histologie eingesetzt werden.

MATERIAL UND METHODEN 27

2 MATERIAL UND METHODEN

In diesem Kapitel sind alle verwendeten Materialien und Methoden beschrieben. Die

Zusammensetzung der Lösungen, die Materialien, die benutzten Geräte und deren Hersteller sind

nachfolgend aufgeführt.

Die in dieser Arbeit untersuchten Antigene wurden mit der „serological analysis of

recombinantly expressed copy deoxyribonucleic acid (cDNA) clones“ (SEREX)- oder

„hybridization analysis of recombinantly expressed cDNA clones“ (HYREX)-Methode an einer

Testis-, Lymphom-, malignes Melanom (MM)- und einer Zelllinien (MyLa)-Bank identifiziert

(Eichmuller et al. 2001; Usener et al. 2003a; Usener et al. 2003b; Ehlken et al. 2004; Fellenberg

et al. 2004; Gerhardt et al. 2004; Hartmann et al. 2004) oder lagen als IMAG-Klon vor.

MATERIAL

Materialien werden entweder unter der Rubrik „Allgemein“ bei einer Verwendung in mehreren

Methoden aufgeführt oder in Verbindung mit der jeweiligen Methode.

2.1 Chemikalien

Allgemein

• Agar Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Agarose Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Antibiotika: Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Ampicillin (Amp), Kanamycin, Tetrazyklin • Aqua ad iniectabilia Braun B.Braun Melsungen AG, Melsungen, D • Bromphenolblau Natriumsalz (BPB) Merck, Darmstadt, D • Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt, D • 1kbp DNA-Leiter GeneCraft, Lüdinghausen, D • Essigsäure, 100% J.T. Baker, Devener, NL • Ethanol (EtOH), 98% Riedel-de-Haen, Seelze, D • Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe, D • Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Acros Organics, Geel, B • Formaldehyd (37%) Roth, Karlsruhe, D • Glycerol J.T. Baker, Deventer, NL • Glycin Gerbu, Gaiberg, D • Hefeextrakt Gerbu, Gaiberg, D • Isopropanol Riedel-de-Haen, Seelze, D • Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) AppliChem, Darmstadt, D • Magermilchpulver Roth, Karlsruhe, D • Magnesiumsulfat (MgSO4) Neolab, Heidelberg, D • Natriumacetat (NaAc) Roth, Karlsruhe, D • Natriumazid (Na3N) AppliChem, Darmstadt, D • Natriumchlorid (NaCl) J.T. Baker, Deventer, NL


• Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) AppliChem, Darmstadt, D • Natriumhydroxid (NaOH) J.T. Baker, Deventer, NL • Nukleotid (dNTP)-Mix “long range” Peqlab, Erlangen, D • One Phor All Buffer Plus (OPA-Puffer) Amersham Pharmacia, Piscataway, USA • Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) w/o Biochrom KG, Berlin, D

Ca2+, Mg2+ • Protease Inhibitor Tabletten, EDTA-frei Roche, Mannheim, D • Salzsäure (HCl) J.T. Baker, Deventer, NL • Trizma Base Roth, Karlsruhe, D • Trypton AppliChem, Darmstadt, D • Tween 20 Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Serumantikörper-Detektionsarray (SADA)

• Affinitätsadsorbens Roche, Mannheim, D (aktivierte Glutardialdehyd-Matrix)

• 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-d-galakto- Sigma-Aldrich, Steinheim, D pyranosid (X-Gal)

• 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) Sigma-Aldrich, Steinheim, D • N,N-Dimethylformamid (DMF) Merck, Darmstadt, D • Gelatine Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Magnesiumchlorid (MgCl2 x 6H2O) Merck, Darmstadt, D • Maltose AppliChem, Darmstadt, D • Nitrobluetetrazolium (NBT) Sigma-Aldrich, Steinheim, D • NZ-Amin A Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Restriktionsenzyme: KpnI, SmaI Amersham Biosciences, Braunschweig, D

Klonierung

• Calciumchlorid (CaCl2) Merck, Darmstadt, D • Calf Intestine Alkaline Phosphatase (CIAP) Amersham Biosciences, Braunschweig, D • 10x CIAP Reaktionspuffer Amersham Biosciences, Braunschweig, D • T4-DNA-Ligase Amersham Biosciences, Braunschweig, D • 5x DNA-Ligase-Puffer Amersham Biosciences, Braunschweig, D • High Dye Formamid Applied Biosystems, Darmstadt, D • Lambda-Marker MBI Fermentas, St. Leon-Rot, D • PWO-Polymerase Peqlab, Erlangen, D • PWO-Polymerase Reaktionspuffer komplett Peqlab, Erlangen, D • Restriktionsenzyme: BamHI, EcoRI, SalI Amersham Biosciences, Braunschweig, D

XmaI New England BioLabs, Frankfurt a. Main, D

Proteinexpression

• Antibiotikum: Chloramphenicol Roche, Mannheim, D • BioRad Protein Assay (Bradford Reagenz) BioRad, München, D • Rinderserumalabumin (BSA, Pentax Fr. V) Serva, Heidelberg, D

Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western Blot

• Ammoniumperoxidsulfat (APS) Roth, Karlsruhe, D • Coomassie Brillant Blau G-250 Roth, Karlsruhe, D • Coomassie Brillant Blue R Gerbu, Gaiberg, D


• ECL Plus Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK • β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Methanol Fluka, Deisenhofen, D • Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyls., SDS) Gerbu, Gaiberg, D • 37,5% Polyacrylamid BioRad, München, D • Ponceau S AppliChem, Darmstadt. D • Precision Plus Protein Standard Dual Color BioRad, München, D • Saccharose J.T. Baker, Deventer, NL • N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin p.A. Roth, Karlsruhe, D

(TEMED)

„Enzyme-linked immunosorbent assay“ (ELISA) und Multiplex-Serologie

• Casein Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Glutathion-Casein (GC) P. Sehr, DKFZ, Heidelberg, D • Kaliumchlorid (KCl) p.A. Merck, Darmstadt, D • Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck, Darmstadt, D • Natriumcarbonat (Na2CO3) Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Polyvinylalkohol (mittleres Molekular- Sigma-Aldrich, Schnelldorf, D

gewicht 30-70 kilo Dalton (kDa)) • Polyvinylpyrrolidon (mittleres Molekular- Sigma-Aldrich, Schnelldorf, D

gewicht 360kDa) • Schwefelsäure (H2SO4) Neolab, Heidelberg, D • Streptavidin-R-Phycoerythrin (Strep-PE) Molecular Probes, Eugene, USA • Superchemiclock (CBS-K) Chemicon, Temecula, USA • Tetramethylbenzidin (TMB) Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Wasserstoffperoxid (H2O2) J.T. Baker, Deventer, NL

Ribonukleinsäure (RNA), cDNA und Reverse Transkriptase (RT)-Polymerase-kettenreaktion (PCR)

• 10x Biotherm Reaktionspuffer NatuTec, Frankfurt am Main, D • Biotherm Taq Polymerase NatuTec, Frankfurt am Main, D • Dimethylpyrocarbonat (DMPC) Sigma-Aldrich, Steinheim, D • DNase I, RNase-frei Roche, Mannheim, D • Formamid Roth, Karlsruhe, D • Ionenaustauscherharz, AG 501-X8 Resin BioRad, München, D • 3-[N-morpholino]2-hydroxypropansulfonic Sigma-Aldrich, Steinheim, D

acid (MOPS)

Proteinexpression und Aufreinigung

• 1,4-Dithiotreitol (DTT) Roth, Karlsruhe, D • L-Glutathion, reduziert Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Glutathion Sepharose 4B Amersham Biosciences, Uppsala, SE • Guanidiumhydrochlorid Roth, Karlsruhe, D • Lysozym Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Thrombin Amersham Biosciences, Piscataway, USA • Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Steinheim, D


Immunisierung von Kaninchen, ELISA und Aufreinigung von Antikörpern

• Ethanolamin Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Freund’sches Adjuvans inkomplett Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Freund’sches Adjuvans komplett Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Western Blot und Immunhistologie

• Aceton J.T. Baker, Deventer, NL • 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Biomol, Hamburg, D • Eindeckmedium: VectaShield Mounting Med. Vector Laboratories, Burlingame, USA • Levamisol Vector Laboratories, Burlingame, USA • Mayer’s Hämalaun Lösung AppliChem, Darmstadt, D • Natriumcitrat-Dihydrat Roth, Karlsruhe, D • Tris-HCl, pH 8,5 Linaris, Wertheim, D • Ziegenserum, normal Vector Laboratories, Burlingame, USA

2.2 Geräte, Verbrauchsmaterialien und fertige Kits

Allgemein

• Biophotometer Eppendorf, Hamburg, D • Brutschränke Kendro, Langenselbold, D • Bunsenbrenner und Vierfuß Buddeberg, Mannheim, D • Dewa-Stickstoffbehälter KGW Isotherm, Karlsruhe, D • Feinwaage AG245 Mettler-Toledo, Greifensee, CH • Geldokumentationssystem E.A.S.Y. 429 K Herolab, Wiesloch, D • Gelelektrophoresekammer (Wide mini sub- BioRad, München, D

cell GT), Schlitten, Kämme • Inkubationsschüttler G25 New Brunswick Scientific, Nürtingen, D • Inkubator/Trockenschrank Heraeus, Hanau, D • Kühlschränke (4°C, -20°C, -80°C) Liebherr, Ochsenhausen, D • Magnetrührer MR 3002 Heidolph, Schwabach, D • Mikrowelle Micromat AEG, Nürnberg, D • Millipore-Anlage Millipore, Schwalbach, D • pH-Meter 220 Mettler-Toledo, Schwerzenbach, CH • PCR-Maschine MJ Research/BioRad, München, D • Pipetten Eppendorf, Hamburg, D

Gilson, Middleton, USA • Pipettierhilfe accu-jet BRAND, Wertheim, D • PowerPac 300 Power Supply BioRad, München, D • Sonifikator Hielscher, Teltow, D • Stickstofftank Chronos Messer Griesheim, Krefeld, D • Thermoblock Eppendorf, Harmburg, D • Vortexer Reax 2000 Heidolph, Schwabach, D • Waage Sartorius, Göttingen, D • Wasserbäder Köttermann Labortechnik, Uetze, D

Julabo Labortechnik, Seelbach, D • Zentrifuge Avanti-J27 Beckman Coulter, Krefeld, D • Zentrifuge Biofuge fresco/pico Hereaus, Hanau, D • Zentrifuge Minifuge GL Heraeus, Hanau, D


• Bechergläser (50,100,250,500,1000mL) Fisher Scientific, Schwerte, D • Eppendorf Tubes (0,2;0,5;1,5;2mL) Eppendorf, Hamburg, D • Erlenmeyerkolben mit/ohne Schikanen Schott, Mainz, D

(250mL, 1L) • Falconröhrchen (15,50mL) Becton Dickinson, Heidelberg, D • Faltenfilter Filtrak, Bärenstein, D • Filter (0,2µm) Sartorius, Göttingen, D • Glaspipetten (1,2,5,10,20mL) mit Pipettierhilfe BioRad, München, D • Küvetten (UVette ultraviolett (UV)/VIS) Eppendorf, Hamburg, D • Messzylinder (25,50,100,250,1000mL) Hirschmann, Eberstadt, D • Pasteur Capillary Pipettes WU, Mainz, D • Pipettenspitzen (1000er, 100er, 10er) Gilson, Middleton, USA

Eppendorf, Hamburg, D • Plastik-Petrischalen (80/150mm) Greiner, Kremsmünster, A • Plastikpipetten Sarsted, Nürnbrecht, D • Schlauchklemme (1cm) Roth, Karlsruhe, D • Schraubflaschen (250,500,1000mL) Schott, Mainz, D • Serum-Monovetten Sarstedt, Nürnbrecht, D • Skalpell Feather, Osaka, JP • Spritzen (1,5,10,20,50mL) Henke Sass Wolf, Tuttlingen, D

SADA

• Rotationsschüttler Unimax 2010 Heidolph, Schwabach, D • Schüttler Promax 2020 Heidolph, Schwabach, D • Überkopfrotor Snijders, Tilburg, NL • Überkopfrotor Reax 2 Heidolph, Schwabach, D • Glas-Petrischalen Greiner, Frickenhausen, D • Nitrozellulose Blotting Membran Sartorius, Göttingen, D • Nunc 9mL Tubes mit Schraubkappe Nunc, Wiesbaden, D • Nunclon 96 Lochplatte (steril) Nunc, Wiesbaden, D • OmniTray Nunc, Wiesbaden, D • Protran Nitrozellulose Transfer Membran Schleicher & Schüll, Dassel, D • TSP Screening Stempel Nunc, Wiesbaden, D

Klonierung

• ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer Applied Biosystems, Darmstadt, D • UV-Tisch Konrad Benda Laborgeräte, Wiesloch, D

Proteinexpression

• Hochdruckhomogenisator, Emulsiflex C-5 Avestin, Ottawa, CA

SDS-PAGE und Western Blot

• Entwicklergerät Agfa Curix 60 Agfa, Köln, D • Folienschweißgerät Serverin, Sundern, D • Geltrocknungsrahmen (Gel drying frames) Sigma-Aldrich, Steinheim, D • Mini-Protean II/III Electrophoresis Cell BioRad, München, D • Mini Trans Blot Electrophoretic Transfer BioRad, München, D

Cell


• Röntgenfilmexpositionskassette Dr. Goos-Suprema, Heidelberg, D • Celluphanfolien Sigma-Aldrich, Steinheim, D • HyperfilmTM ECL Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK • Standardprospekthülle Esselte Leitz, Stuttgart, D • Whatman Filterpapier 3MM Whatman, Maidstone, UK

ELISA und Multiplex-Serologie

• ELISA-Reader µ-Quant Deelux Labortechnik, Gödenstorf, D • Luminex 100 (Analyzer) Luminex Corp., Austin, USA • Luminex SD (Puffer-Reservoir) Luminex Corp., Austin, USA • Luminex XYP (xy-Rastertisch für Waschpl.) Luminex Corp., Austin, USA • Mehrkanalpipette Precision, elektrisch Biozym, Hamburg, D • Ultraschallbad Bandelin Sonorex, Berlin, D • Vakuum-Absaug-Einrichtung f. Waschplatten Millipore, Eschborn, D • 96 Lochplatten, polysorb Nunc, Wiesbaden, D • MultiScreen BV Filtrationsplatten (Waschpl.) Millipore, Eschborn, D • SeroMap Microspheres Luminex Corp., Austin, USA

RNA, cDNA und RT-PCR

• Mahlbecher aus Teflon Retsch, Haan, D • Mahlkugeln aus Wolfram/Stahl Retsch, Haan, D • Rotationsschüttler Unimax 2010 Heidolph, Schwabach, D • Schwingmühle MM301 Retsch, Haan, D


• Äkta-Purifier 10/100 mit Box 900, Monitor Amersham Pharmacia, San Francisco, USA pH/C 900, Monitor UV-900, Pump-900, Fraction Collector-900

• Dounce-Homogenisator Wheaton Science Products, Millville, USA • Kühlkabine Minicoldlab 2023 LKB Bromma, Stockholm, SE • Vakuumzentrifuge: Speed Vac Concentrator Savant/Thermoquest, Egelsbach, D • Dialysierschlauch Neolab, Heidelberg, D • MonoQ HR 5/5 Amersham Pharmacia, Uppsala, SE • NAPTM 5 Säule Amersham Biosciences, Uppsala, SE • Plastiksäule, leer, aus QIAprep Midi Spin Kit Qiagen, Hilden, D • Rotilab-Spritzenfilter 0,8µm Roth, Karlsruhe, D


• Gammacell 1000 D (Cäsium-137) Atomic energy of Canada lim., Ottawa, CA • Chinchilla Bastard Kaninchen Ivanovas, Kisslegg,

Biogenes, Berlin, D • Kanüle MicrolanceTM 3 Becton Dickinson, Drogheda, IR • N-hydroxysuccinimid (NHS)-aktivierte Amersham Biosciences, Uppsala, SE

Sepharose 4 Fast Flow

Western Blot und Immunhistologie

• DakoCytomation Stift (Fettstift) DakoCytomation, Glostrup, DK • Digitalkamera


• Mikroskop DMLS Leica, Bensheim, D • Zytospin-Zentrifuge Cytospin 2 Shandon/Thermo, Dreieich, D • COSTAR 1,2mL Cluster Tubes Corning, Wiesbaden, D • COSTAR, Cluster Tube, 8-cap strip Corning, Wiesbaden, D • Objektträger und Deckgläser R. Langenbrinck, Emmendingen, D

Zellkultur

• Brutschrank Function Line/Hera cell Heraeus, Hanau, D • Casy 1 Modell TT Schärfe System, Reutlingen, D • Mikroskop DMIL Leica, Bensheim, D • Wasserbad Köttermann Labortechnik, Uetze, D • Zentrifuge RT7 Kendro/Sorvall, Langenselbold, D • Gewebekulturflaschen Greiner, Frickenhausen, D • Kryoröhrchen Greiner, Frickenhausen, D

Fertige Kits

• ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Applied Biosystems, Darmstadt, D Sequencing Ready Reaction Kit

• Alkaline Phosphatase Rabbit IgG ABC Kit Linaris, Wertheim, D • AP Substrat Kit Linaris, Wertheim, D • Avidin/Biotin Blocking Kit Linaris, Wertheim, D • iScript cDNA Synthesis Kit BioRad, München, D • QIAprep Spin Mini Prep Kit Qiagen, Hilden, D • QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden, D • Rneasy Mini Kit Qiagen, Hilden, D

2.3 Puffer und Lösungen

Alle Puffer wurden in bidestilliertem Wasser (ddH2O) angesetzt, wenn nicht anders vermerkt. Alle Prozentangaben sind in Gewichtsprozent (w/v) angegeben.

Allgemein

5x DNA-Ladepuffer: 0,1M EDTA pH 8,0, 0,1% BPB, 1% SDS, 50% Glycerin IPTG-Stammlösung: 0,5M IPTG, sterilfiltrieren, in Aliquots bei –20°C lagern 50x TAE-Puffer: 40mM Trizma Base pH 7,8 (pH mit Essigsäure einstellen),

10mM NaAc, 1mM EDTA

SADA

BCIP-Lösung: 50mg BCIP/mL DMF, bei –20°C lagern Blockierungslösung: 5% Milchpulver in 1x TBS 10x CDS-Puffer: 0,1M Trizma Base pH 9,5, 5mM MgCl2 x 6H2O, 0,1M NaCl X-Gal-Stammlösung: 250mg X-Gal/mL DMF, in Aliquots bei –20°C lagern Entwicklungslösung: 0,2% NBT-Lösung, 0,1% BCIP-Lösung in 1x CDS, frisch

ansetzen Maltose-Stammlösung: 10% Maltose, autoklavieren MgSO4-Stammlösung: 0,2M MgSO4 x 7H2O, autoklavieren NBT-Lösung: 50mg NBT/mL 70% DMF, bei 4°C lagern 10x Serumverdünnungslösung: 2% Magermilchpulver, 0,25% Na3N


SM-Puffer: 0,58% NaCl, 0,2% MgSO4 x 7H2O, 0,05M Tris-HCl, 0,01% Gelatine, autoklavieren

10x TBS-Puffer: 0,5M Trizma Base pH7,5, 8,78% NaCl 10x TBS-Tween (TBS-T): 10x TBS, 0,5% Tween

SDS-PAGE und Western Blot

Blockierungslösung: 5% Milchpulver in PBS-T Coomassie Brillant Blue-Lösung: 4 Coomassie Brillant Blue R Tabletten (= 200mg

Coomassie), 10% Essigsäure, 40% Methanol Entfärber-Lösung: 10% Methanol, 5% Essigsäure Färbelösung (koll. Coomassie): 80% Färbestammlösung, 20% Methanol, frisch ansetzen Färbestammlösung (kolloidales Lösung A: 2% Phosphorsäure, 10% (NH4)2SO4 add 1L Coomassie): ddH2O; Lösung B: 1g Coomassie Brillant Blue G-250 in

20mL ddH2O; Lösung A in B lösen Fixierungslösung: 40% Methanol, 10% Essigsäure 4x Lower Buffer: 1,5M Trizma Base pH 8,8, 0,4% SDS PBS-Tween (PBS-T): 1x PBS pH 7,4, 0,05% Tween Ponceau S-Lösung: 0,2% Ponceau S, 1% Essigsäure 10x Running Buffer: 0,25M Trizma Base pH 8,3, 1% SDS, 1,92M Glycin 5x SDS-PAGE-Probenpuffer: 0,0625M Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% Saccharose,

0,001% BPB, 5% β-Mercaptoethanol, in Aliquots bei -20°C lagern

Stripping-Lösung: 0,0625M Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 0,7% β-Mercaptoethanol

1x Transferpuffer: 10% 10x Transferpuffer, 20% Methanol 10x Transferpuffer: 25mM Trizma Base pH 8,8, 0,19M Glycin, 0,037% SDS 4x Upper Buffer: 0,5M Trizma Base pH 6,8, 0,4% SDS

ELISA und Multiplex-Serologie

Casein-Blockpuffer: 0,2% Casein in PBS-T, frisch ansetzen Casein-Blockpuffer (Luminex): 0,1% Casein in 1xPBS, frisch ansetzen Coating-Puffer: 50mM Carbonatpuffer pH 9,6, 1 Teil 50mM Na2CO3 mit 4

Teilen 50mM NaHCO3 mischen, pH einstellen, bei 4°C lagern

Lagerungspuffer: Casein-Blockpuffer (Luminex), 0,05% NaN3 PBS (für ELISA): 137mM NaCl, 3mM KCl, 1,5mM KH2PO4, 8mM Na2HPO4,

Herstellung als 10x Lösung, zum Gebrauch mit ddH2O auf 1x verdünnt

Serumvorinkubationspuffer: 1x PBS, 0,1% Casein, 2mg/mL Lysat von Glutathion-S-Transferase (GST)-tag exprimierenden Bakterien, 0,5% Polyvinylalkohol, 0,8% Polyvinylpyrrolidon, 2,5% CBS-K

Substratpuffer: 100mM NaAc pH 6,0 (pH mit Essigsäure einstellen), bei 4°C lagern

TMB-Stammlösung: 10mg TMB/mL DMSO, bei –20°C lagern, lichtempfindlich Waschpuffer (PBS-T): 1x PBS (für ELISA), 0,05% Tween 20

RNA, cDNA und RT-PCR

DMPC-H2O: 0,1% DMPC, 30min bei Rt inkubieren, DMPC durch Auto-klavieren inaktivieren

10x DNase-Testpuffer: 1M NaAc pH 5,0, 50M MgSO4, autoklavieren


Formamid, deionisiert: 500mL Formamid, 50g Ionenaustauscherharz, 30min rühren, Harz mit Faltenfilter entfernen

10x MOPS-Puffer: 400mM MOPS, 100mM NaAc, 10mM EDTA pH 8,0, pH 7,0 einstellen, autoklavieren, lichtgeschützt aufbewahren

RNA-Ladepuffer: 50% Glycerol, 1mM EDTA, 0,4% BPB, 0,0004% Ethidiumbromid

RNA-Laufpuffer: 50% deionisiertes Formamid, 7,4% Formaldehyd, 1x MOPS in DMPC- H2O


Buffer high: 0,1M Tris-HCl pH 8,5, 0,5M NaCl Buffer low: 0,1M NaAc pH 4,5, 0,5M NaCl Elutionspuffer: 50mM Tris-HCl, 10mM reduziertes Glutathion, pH 8,0 Puffer A: 50mM Tris-HCl pH 7,5 Puffer B: 50mM Tris-HCl pH 7,5, 1M NaCl


Bindungspuffer: 0,02M Tris-HCl, pH 8,0 Kopplungspuffer: 0,2M NaHCO3, 0,15M NaCl, pH 8,2 NHS-Elutionspuffer: 0,2M Glycin, 0,15M NaCl, pH 2,5 NHS-Puffer A: 0,5M Ethanolamin, 0,5M NaCl, pH 8,3 NHS-Puffer B: 0,1M NaAc, 0,5M NaCl, pH 4,0 NHS-Waschpuffer: 0,3M NaCl

2.3.1 Bakterienstämme

E. coli BL21 Novagen/Merck Biosciences, Bad Soden, D E. coli BL21 Rosetta D3 Novagen/Merck Biosciences, Bad Soden, D, freundlicherweise von Dr. Pawlita zur Verfügung gestellt E. coli SOLR Stratagene, La Jolla, USA E. coli TOP10 OneShotTM Invitrogen, Karlsruhe, D E. coli XL1 Blue (MRF) Stratagene, La Jolla, USA

2.3.2 Agar und Medien

Allgemein LB-Medium: 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl, pH 7,4, autoklavieren Luria Bertani (LB)-Agar: LB-Medium, 1,5% Agar, autoklavieren, Zugabe von Antibiotikum nach dem Abkühlen des Mediums auf ca. 55°C, Gießen der Platten

SADA LB-Komplettmedium: LB-Medium, 0,01M MgSO4, 0,2% Maltose NZY-Agar: NZY-Medium, 1,5% Agar, autoklavieren, Gießen der Platten NZY-Medium: 0,5% NaCl, 0,5% Hefeextrakt, 0,2% MgSO4, 1% NZ-Amin, pH 7,5, autoklavieren NZY-Top-Agar: NZY-Medium, 0,7% Agarose, autoklavieren

Zellkultur

Dulbecco’s modified Eagle Medium (DMEM) PAA Laboratories, Cölbe, D Fötales Kälberserum (FCS) Pan Biotecs, Aidenbach, D


L-Glutamin Biochrom, Berlin, D Melanocyte Growth Medium Promocell, Heidelberg, D PBS w/o Ca2+, Mg2+ (1x) PAA Laboratories, Pasching, A Penicillin/Streptomycin PAA Laboratories, Pasching, A RPMI 1640 Biochrom, Berlin, D SupplementMix Promocell, Heidelberg, D Trypsin/EDTA (1x) PAA Laboratories, Pasching, A

2.3.3 Vektoren

pBluescript SK Stratagene pGEX-4T3-tag (Sehr et al. 2001), freundlicherweise von Dr. Pawlita zur Verfügung gestellt

2.3.4 Plasmide

IMAGp998M145158.1 Deutsches Resourcenzentrum für Genomforschung, Berlin, D

2.3.5 Seren

Seren Tumorart Typ

Anzahl Seren Geschlecht Alter Herkunft

MM Stadium I-IV

Insgesamt 209 SADA: 18 Luminex: 191 (je Stadium ca. 47-49 Patienten)

w: 7

m: 11

w: 88 m: 112

-

21-92

Klinikum Mannheim, klinische Kooperationseinheit für Dermato-Onkologie, Mannheim, D

CTCL Adenovirus 67 (20 Patienten mit je 1-10 Seren)

- - Dummer, Zürich, CH

CTCL Masern-impfstoff

45 (5 Patienten mit je 5-12 Seren)

m: 5 53-64 Dummer, Zürich, CH

CTCL MF 65 (52 Patienten mit je 1-4 Seren)

w: 17 m:35

35-92 Willemze, Leiden, NL

CTCL MF, SS 26 w: 10 m: 17

20-93 Dippel, Mannheim, D

CTCL MF, SS 43 (41 Patienten mit 1-2 Seren)

w: 18 m:22

35-92 Dummer, Zürich, CH

Ctrl -

Insgesamt 200 100 100

-

w: 42 m:58

19-66

21-67

Blutbank, Mannheim, D

MM: Malignes Melanom, CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, MF: Mycosis fungoides, SS: Sézary Syndrom, Ctrl: Kontrollen, w: Weiblich, m: Männlich.


2.3.6 Antikörper

Art Spezifität Verdünnung Hersteller Anwendung Goat anti-GST (polyklonal)

1:50.000 1:5000

Amersham Biosciences, Freiburg, D

WB, ELISA

Mouse anti-Aktin (monoklonal)

1:5000 ICN, Ohio, USA WB

Mouse anti-tag (monoklonal)

1:10.000 1:1000

M. Pawlita, DKFZ, Heidelberg, D, MacArthur, 1984

WB, ELISA

Primär-

anti-

körper

Strep-PE-markiert mouse anti-tag (monoklonal)

1:100 T. Waterboer, DKFZ, Heidelberg, D

Lu

Biotinyliert goat anti-human IgA, IgG, IgM

1:1000 Dianova, Hamburg, D Lu

Cy3-markierter goat anti-rabbit IgG

1:1000 Dianova, Hamburg, D Lu

Donkey anti-goat IgG-HRP

1:10.000 Santa Cruz, Heidelberg, D WB, ELISA

Donkey anti-human IgG-HRP

1:10.000 Dianova, Hamburg, D WB, ELISA

Goat anti-human IgG-AP

1:2500 Dianova, Hamburg, D SADA

Goat anti-mouse IgG-HRP


Sekundär-

antikörper

Goat anti-rabbit IgG-HRP


cTAGE-5a (Peptidantikörper)

1:50 BioGenes, Berlin, D Lu

K5 (MAGE-A9, polyklonal)

1:1000 1:1600

Tierstall des DKFZ, Heidelberg, D

WB, ELISA, Lu

K80 (GAGE-7b, polyklonal)

1:200 1:100

Tierstall des DKFZ, Heidelberg, D

WB, ELISA, Lu, IC, IH


1:5000 Biogenes, Berlin, D Unspezifisch

Selbst

generierte

Anti-

körper


1:5000 Biogenes, Berlin, D Unspezifisch

GST: Glutathion-S-Transferase, Strep-PE: Streptavidin-R-Phycoerythrin, DKFZ: Deutsches Krebsforschungszentrum, HRP: „Horseradish peroxidase“, AP: Alkalische Phosphatase, Ig: Immunglobulin, cTAGE: CTCL Antigen, MAGE: Melanom Antigen, SADA: Serumantikörper-Detektionsarray, ELISA: „Enzyme-linked immunosorbent assay“, WB: Western Blot, Lu: Luminex/Multiplex-Serologie, IC: Immunzytologie, IH: Immunhistologie.


2.3.7 Zelllinien

Zelllinie Tumorart Lokalisation/Typ Herkunft

Cou-L3 Mycosis Fungoides M. Bagot, Créteil, F HH Lymphomatoide Papulosis ATCC, Manassas, USA HuT78 Sézary Syndrom ATCC, Manassas, USA MyLa Mycosis Fungoides K. Kaltoft, Aahrus, DK SeAx

CTCL

Sézary Syndrom K. Kaltoft, Aahrus, DK MeWo Metastase: Lymphknoten Old, New York, USA Ma-Mel-04 Metastase: Harnblase Ma-Mel-05 Metastase: Bauch Ma-Mel-11 Metastase: Mediastinum Ma-Mel-12 Metastase: Bauch, kutan Ma-Mel-16 Metastase: Dünndarm Ma-Mel-21 Metastase: kutan Ma-Mel-37b Metastase: Lymphknoten Ma-Mel-47 Metastase: Lymphknoten Ma-Mel-52 Metastase: Haut Oberarm rechts

Klinische Kooperationseinheit für

Dermato-Onkologie, Prof. Dr. Dirk Schadendorf, DKFZ, Heidelberg, D

SK-Mel-023 - Old, New York, USA UKRV-Mel-02 Metastase: Pleura-Exudat UKRV-Mel-06a Metastase: kutan UKRV-Mel-14a Metastase: kutan UKRV-Mel-21a Metastase: Lymphknoten UKRV-Mel-27 Metastase: kutan UKRV-Mel-31

MM

Metastase: kutan

Klinische Kooperationseinheit

Dermato-Onkologie, Prof. Dr. Dirk Schadendorf, DKFZ, Heidelberg, D

HaCat Immortalisierte humane Haut Keratinozyten

- Norbert Fusenig, DKFZ,

Heidelberg, D

Melanozyten - - PromoCell, Heidelberg, D ATCC: “American Tissue and Culture Collection”

2.4 Software

HUSAR / GCG Package DKFZ, Heidelberg, D Luminex 100 IS 2.2 SP1 Software Luminex Corp., Austin, USA Microsoft Windows / Office 2003/XP Microsoft Corp., Unterschleißheim, D


METHODEN

2.5 SADA

Die SADA-Methode bildete die Grundlage zur Bestimmung der Tumorspezifität zahlreicher

Antigene auf serologischer Ebene. Diese Methode stellt eine Variante der SEREX-Methode dar,

mit welcher viele Antigene gleichzeitig auf ihre Seroreaktivität mit einem Serum getestet werden

können. Die verwendeten Antigene wurden im Verlauf von fünf Jahren in verschiedenen

Projekten für Doktorarbeiten in der Arbeitsgruppe identifiziert.

2.5.1 Auswahl der Antigene

Die Auswahl der Antigene wurde anhand ihrer zuvor ermittelten serologischen Reaktivität in

sekundären SEREX-Experimenten, der Ergebnisse im virtuellen Northern und ihres

Zusammenhangs mit Krebserkrankungen anhand der in Pubmed (http://www.ncbi.nlm.

nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed) vorhandenen Literatur getroffen. Im sekundären SEREX

wird die Reaktivität eines bestimmten Klons mit einer gewissen Anzahl an Seren, zumeist bis zu

20 Seren, ermittelt. Der virtuelle Northern ist über den Link genes/genefinder auf der CGAP-

Homepage (http://cgap.nci.nih.gov) zu erreichen und simuliert einen virtuellen Northern. Dem

Programm liegen Veröffentlichungen von „expressed sequence tags“ (ESTs) in Genbank/EMBL

zu Grunde, von denen bekannt ist, aus welchem Gewebe sie isoliert wurden. Ein Unterprogramm

legt bekannte ESTs aufgrund ihrer Überlappung übereinander und erstellt daraufhin Gen-Cluster.

Das Ergebnis ist eine Zahl, die das Verhältnis von der Anzahl der ESTs, die in den Gen-Cluster

des zu untersuchenden Klons fallen, zu der Gesamtzahl aller ESTs in diesem Gewebe darstellt.

Je größer der Zahlenwert ist, desto mehr wird dieses Gen abgelesen. Die Analyse wird sowohl

für Normal- als auch Tumorgewebe durchgeführt. Die Grenzen des virtuellen Northern liegen

bei geringen Gesamtzahlen für ESTs, unbekannten Genen und differentiell gespleißten

Genprodukten, die durch ein Standard-Gen-Clustering nicht erfasst werden können. Die

ausgewählten Antigene lassen sich Tabelle 2-1 entnehmen.

Tabelle 2-1: Ausgewählte Antigene für die SADA-Methode

In dieser Tabelle sind der Name, der Kontrolltyp, das homologe Gen und die Zugangsnummer aller im SADA verwendeter Antigene aufgeführt.

Name Kontrolltyp Zugangsnummer PINCH Positivkontrolle U09284 Uveal Autoantigen (UACA) Positivkontrolle NM_018003 „Leerer“ Phage (ohne Insert) Negativkontrolle -


Name Genname oder Homologes Gen laut GenBank Zugangsnummer GBP-5a Guanylat-bindendes Protein (GBP)-5a AF430643 GBP-5ta Guanylat-bindendes Protein-5ta AF328727 pGAGEt GAGE-3 NM_001473

se1-1 Glutamat-Rezeptor-interagierendes Protein (GRIP) and coiled-coil domain-containing 2 (GCC2)

AF273042

se2-1 Synaptonemal complex protein 1 (SCP1) AF273043 se2-5 Partitioning defective 3 homolog (PARD3ta) AF177228 HD-CL-12 Zink Finger Protein 195 (ZNF195) AF003540 pMAGE-A9ag MAGE-A9 NM_005365 cTAGE-1 Kutanes T-Zell Lymphom Antigen 1 AF177229 cTAGE-5a Kutanes T-Zell Lymphom Antigen 5a AF338233 se20-7 Golgi Autoantigen, Golgin Subfamilie a, 4 (GOLGA4) AF273047 du20-10L4 Zytoskelett assoziiertes Protein 2 (CKAP2) AF177227 HD-CL-04 Jak und Mikrotubuli interagierendes Protein 2 (KIAA0555) AF273057 HD-CL-03 Retinale kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase (retSDR2) AF273056 HD-CL-09 Serin/Threonin Kinase “dendritic cell derived protein kinase” (DPK) AF328731 HD-MM-01 Dynein heavy chain (DNEL-2) AJ000522 HD-MM-02 PLU-1 AJ132440 HD-MM-03 Retinoblastom-bindendes Protein 2 Homolog 1a (Rbbp2h1a) AJ243706 se57-1 CTCL Tumorantigen se57-1 AF273051 se89-1 Retinoblastom-assoziiertes Protein 140 (RAP140) AF273053 HD-MM-48 Rezeptor-interagierender Faktor 1 (RIF1 Variante 2) NM_001006945 HD-MM-08 Hexamethylen-bis-acetamid-induzierbar 1 (HEXIM-1) AB021179 HD-MM-16 Humanin AY029066 HD-MM-19 Zink Finger Protein 133 (ZNF133) BC001887 HD-MM-23 „Leukocyte antigen-related“ (LAR)-interagierendes Protein 1a/b U22815/6 HD-CL-02 Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase AF273055 HD-CL-08 Eukaryotischer Translations-Elongationsfaktor 1 alpha 1 (EEF1A1) AF328730

HD-CL-14 Nukleärer Faktor von aktivierten T-Zellen, zytoplasmatisch, Calcineurin-abhängig (NFATC3)

NM_004555

HD-CL-17 Hefe ribosomales Protein S28 Homolog D14530

HD-CL-24 Schuppenförmiges Zell Karzinom Antigen erkannt von T-Zellen 3 (SART3)

AB020880

HD-CL-30 Chromosom 8 EST Sequenz, Klon RP11-14I17 AC011726 se20-4 Zellteilung Autoantigen (CDA-1) AF273046 se33-1 Nukleäres Protein 220 (NP220) AF273049 se37-2 Ubiquitin Protein Ligase E3A (UBE3A) AF273050 pMAGE-A3ag MAGE-A3 NM_05362 HD-CL-41 Serin/Threonin Kinase 17b (STK17b) BC016040 HD-CL-49 Nukleäre Verteilung Gen C Homolog (NUDC) BC015153 HD-CL-50 Mitogen-aktivierte Proteinkinase 6 (MAPK6) BC035492 HD-CL-51 Putative S1 RNA-bindende Domäne Protein (PS1D) BC007446 HD-CL-52 Hypothetisches Protein BM-009 BF691904 HD-CL-53 Protein Tyrosin Phosphatase IVA2 (PTP4A2) U14603 HD-CL-54 Chromosom 8, Klon RP11-621B3 AC046174

2.5.2 Präabsorption der Patientenseren

Die SADA-Methode bedient sich der Antikörper aus Seren von Tumorpatienten und

Kontrollpersonen, um die humorale Immunantwort gegen zahlreiche Antigene zu untersuchen.

Hierzu wurde Vollblut nach Koagulation in Serum-Monovetten 10 Minuten (min) bei 2500


Umdrehungen pro Minute (UPM), Rotor 2150, zentrifugiert und das gewonnene Serum bei

-20°C gelagert. Seren von 100 CTCL-, 18 MM-Patienten und 100 Kontrollen (Ctrl) wurden

verwendet. Die Präabsorption erfolgte, um reaktive Antikörper gegen die Antigene des Vektor-

Systems, E. coli und lysierter E. coli-Fragmente zu entfernen, und damit unspezifische

Reaktionen zu vermeiden.

Isolierung eines „leeren“ Phagen

Das Plasmid pBluescript trägt neben einer Amp-Resistenz ein lacZ Gen inklusive eines

Polylinkers. Eine Insertion eines Gens führt somit zu einer Inaktivierung des lacZ Gens und kann

im lacZ deletierten E. coli Stamm MRF für eine Blau-Weiß Selektion verwendet werden. Ein

blauer Plaque auf einer X-gal-Amp-Nähragarplatte weist auf Phagen ohne Insert, ein weißer

Plaque dagegen auf einen Phagen mit Insert hin. Ohne Insert kann das LacZ Gen abgelesen

werden, so dass mit der im Bakterienstamm MRF gebildeten Permease (lac-Y Gen) und

Transacetylase (lac-A Gen) ein funktionsfähiges Lactose-Operon synthetisiert wird. Die

Galaktosidase kann den Farbstoff X-Gal in einen blauen Azoe-Farbstoff umwandeln. Mit Insert

wird keine Galaktosidase gebildet, somit auch kein blauer Farbstoff.

Mehrere „leere“ Phagen wurden isoliert und jeweils 1 Stunde (h) in 500µL SM-Puffer unter

Schütteln aus dem Agar gelöst. Nach der Inkubation wurden die Agarreste mittels Zentrifugation

pelletiert (13.000UPM, 4min). Der Überstand, die Phagenlösung, wurde abgenommen und bei

4°C aufbewahrt. Verwendet wurde dieser „leere“ Phage als Negativkontrolle im Array und um

Antikörper gegen das Vektor-System und lysierte E. coli-Fragmente zu entfernen.

Präabsorptionsschritt I, mechanisch zerkleinerte E. coli

In diesem ersten Präabsorptionsschritt werden zunächst E. coli-Fragmente und Proteine an das

Adsorbens der Säulenmatrix gebunden. Die „mechanische Säule“ wurde hergestellt, indem eine

überwachsene, über Nacht (ÜN) 50mL E. coli MRF-Kultur pellettiert (2000UPM, 15min), das

Pellet in 5mL 1x PBS gelöst und die Zellen mittels Sonifizierung auf Eis (10x 20 Sekunden

(sek)) aufgebrochen wurden. Das gewonnene Lysat wurde gleichmäßig auf 10

Schraubdeckelröhrchen, die jeweils 0,2g Affinitätsadsorbens (aktivierte Glutardialdehyd-Matrix)

enthielten, verteilt, mit 1x PBS auf 4mL aufgefüllt und ÜN bei 4°C im Überkopfrotor inkubiert.

Die Säulen wurden anschließend 3-mal mit 4mL 1x TBS inklusive 0,1% NaN3 1h bei 4°C

gewaschen (Waschschritt). Das 1:10 mit Serumverdünnungslösung vorverdünnte Serum wurde

mit der beladenen Matrix über Nacht bei 4°C im Überkopfrotor inkubiert. Das präabsorbierte

Serum wurde bei 4°C aufbewahrt und die Säule wieder hergestellt (3-mal mit 4mL 0,05M Tris,


pH 3,0). Die Säule konnte nach dem Äquilibrieren (Waschschritt) bei 4°C aufbewahrt werden

und war für maximal 0,6mL unverdünntes Serum zu verwenden.

Präabsorptionsschritt II: lysierte E. coli

Die „lytische Säule“ dient dazu, dem Serum mittels lysierter E. coli-Fragmente und

Phagenelemente unspezifische Antikörper zu entziehen. E. coli MRF wurde in 50mL LB-

Komplettmedium bis zu einer optischen Dichte bei 600nm (OD600) von 0,5 schüttelnd inkubiert.

Die Kultur wurde pelletiert (1500UPM, 15min) und in 2mL 0,01M MgSO4 aufgenommen.

Anschließend wurde die E. coli MRF-Kultur mit einem „leeren“ Phagen in LB-Komplettmedium

für 4h bei 37°C schüttelnd transduziert. In Tabelle 2-2 ist die Zusammensetzung des E. coli

Lysis-Ansatzes für die lytischen Säulen aufgelistet. Im Anschluss wurde die restliche E. coli-

Kultur zugegeben und weitere 2h bei 37°C schüttelnd inkubiert. Die lysierten Bakterien wurden

zusätzlich mittels Sonifizierung auf Eis 10x 20sec zerkleinert. Die mit 0,2g Matrix beladene

Säule wurde mit diesem Lysat ÜN bei 4°C im Überkopfrotor inkubiert und wie die mechanische

Säule äquilibriert. Das bereits mit der mechanischen Säule präinkubierte Serum wurde mit der

hergestellten lytischen Säule bei 4°C ÜN auf dem Überkopfrotor weiter präabsorbiert, dekantiert

und bei 4°C aufbewahrt. Die Säulen wurden anschließend wieder hergestellt und konnten zur

Präabsorption von bis zu 0,6mL unverdünntem Serum verwendet werden.

Tabelle 2-2: E. coli-Lysis-Ansatz zur Herstellung der lytischen Säulen

Der E. coli-Lysis-Ansatz setzt sich aus LB-Medium, Maltose, MRF und dem „leeren“ Phagen zusammen.

Reagenzien Volumen LB-Medium 5mL Maltose, 10mM 100µL E. coli XL1 MRF 200µL „Leerer“ Phage 500µL

Präabsorptionsschritt III: Blot der lysierten E. coli-Proteine

Um nach der mechanischen und lytischen Säule noch vorhandene unspezifische Antikörper zu

entfernen, verwendet die lytische Folie ebenfalls lysierte E. coli-Fragmente. Der Unterschied zur

lytischen Säule besteht darin, dass hier lysierte Bakterien auf Nitrozellulose-Membran geblottet

werden. Es wurden 2 verschieden große lytische Folien hergestellt: kleine und große. Für die

kleine lytische Folie (Durchmesser 8,5cm) wurden 1-2µL isolierter „leerer“ Phage mit 200µL

MRF (OD600=0,5) gemischt und 15min inkubiert. 600µL MRF und 2-4µL Phagenlösung wurden

für die große lytische Folie (Durchmesser 14cm) verwendet. Die Suspension wurde mit heißem

Top-Agar (ca. 50°C) auf eine NZY-Agarplatte ausplattiert und ÜN bei 37°C inkubiert


(Konfluenz der Bakterien). Anschließend wurde jeweils eine Nitrozellulose-Membran 4h und

eine zweite ÜN bei 37°C aufgelegt und geblottet. Nach erfolgtem Blot wurden die Membranen

an der Luft getrocknet und bei Raumtemperatur (Rt) aufbewahrt.

Das Serum aus den Präabsorptionsschritten I und II wurde 1/33 verdünnt, auf eine mit 1x TBS

angefeuchtete, kleine lytische Folie gegeben und ÜN oder tagsüber bei 4°C inkubiert. Pro Serum

wurde dieser Schritt 5-mal mit jeweils einer neuen lytischen Folie wiederholt. Zuletzt wurde das

präabsorbierte Serum auf eine finale Konzentration von 1/100 verdünnt und auf unspezifische

Reaktionen an einer Phagenbank getestet. Falls Reaktionen gegenüber E. coli MRF und/oder

Phagen bestanden, wurde mit großen lytischen Folien weiter präabsorbiert.

2.5.3 Transduktion

Über Nacht wurde zunächst eine 50mL LB-Komplettmedium-Kultur des MRF E. coli-Stamms

mittels Picken einer Einzelkolonie von einer MRF-LB-Tetrazyklin-Kulturplatte hergestellt. Die

Platte konnte eine Woche lang verwendet werden. Am Wochenbeginn wurde mit 200µL dieser

ÜN-Kultur eine 50mL LB-Komplettmedium-Kultur angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,5

schüttelnd inkubiert. Bei dieser OD befinden sich die Bakterien in der exponentiellen

Wachstumsphase und sind somit am stoffwechselaktivsten.

Titration der Phagenlösungen

Alle verwendeten Phagen waren als monoklonale Stocklösung, die bei –80°C gelagert wurde,

vorhanden. Ein µL dieser Lösungen wurde pro Phage für einen Transduktionsansatz in einer

kleinen Petrischale verwendet (Tabelle 2-3).

Tabelle 2-3: Zusammensetzung des Transduktionsansatzes

Die Zusammensetzung des Transduktionsansatzes aus MRF, NZY-Top-Agar und IPTG für den jeweiligen Petrischalentyp kann dieser Tabelle entnommen werden.

Anzahl Platten / Material 1 kleine Petrischale 1 große Petrischale 5 große Petrischalen/

5 OmniTrays MRF (OD=0,5) 200µL 600µL 3mL NZY-Top-Agar 4 mL 7-8 mL 40 mL IPTG 8µL 15µL 75µL

Hierfür wurden 200µL E. coli MRF mit der Phagenlösung 15min bei 37°C inkubiert,

anschließend mit IPTG und NZY-Top-Agar vermischt und auf einer NZY-Agarplatte

ausplattiert. Das IPTG dient der Induktion des Galaktosidase-Gens auf dem Plasmid. Nachdem

der Agar sich verfestigt hatte, wurden die Platten kopfüber bei 37°C ÜN inkubiert. Mehrere

Phagenplaques eines Klons wurden isoliert (siehe Isolierung eines „leeren“ Phagen), damit ein


hoher Phagentiter erreicht werden konnte, und sterilfiltriert (Porengröße 0,2µm), um

Pilzwachstum zu verhindern. Nach angemessener Verdünnung erfolgte ein erneuter

Transduktionsansatz, um die Phagenkonzentration zu bestimmen. Die Phagenlösung wurde bei

4°C gelagert, wobei die Phagenkonzentration monatlich neu bestimmt wurde.

Transduktion

Laut Tabelle 2-3 wurden MRF, NZY-Top-Agar und IPTG auf eine NZY-Agar-OmniTray-Platte

gegeben und 2h bei 37°C kopfüber inkubiert. Mittels eines 96 Lochstempels wurden ca. 0,5µL

Phagenlösung aus einer 96 Lochplatte (150µL Phagenlösung pro Loch) in Duplikaten auf den

wachsenden MRF-Rasen übertragen. Die Phagenlösungen waren zuvor für jeden Klon auf 2000

„Plaque forming units“ (Pfu) pro µL eingestellt worden. Somit konnten pro OmniTray-Platten-

Ansatz bis zu 22 verschiedene Antigene plus eine Negativ- („leerer“ Phage) und eine

Positivkontrolle (PINCH oder „UVEAL Autoantigen“ (UACA)) aufgespottet werden. Die

Anordnung der Phagen auf den Membranen ist Tabelle 2-4 zu entnehmen. Nach dem Einsickern

der Phagenlösung in den Agar wurden die Platten kopfüber ÜN bei 37°C inkubiert.

2.5.4 Blotting und immunologischer Screen

Am darauf folgenden Tag waren die gebildeten Phagenplaques im Bakterienrasen sichtbar. Die

gebildeten rekombinanten Proteine wurden pro OmniTray-Platte auf eine Nitrozellulose-

Membran für 4h bei 37°C geblottet. Die abgezogenen Blots wurden vorsichtig von Agarresten

befreit und 3-mal 10min, schüttelnd in 1x TBS-T gewaschen. Im Anschluss wurden alle

Membranen bis zu ihrer Verwendung bei –20°C eingefroren. Nach dem Auftauen wurden die

Membranen nach einem zweimaligen Waschschritt für 10min in 1x TBS-T 1h bei Rt schüttelnd

mit Blockierungslösung inkubiert, um unspezifische Bindungen abzusättigen. Die Membranen

wurden 3-mal für 10min in 1x TBS gewaschen (Waschschritt) und halbiert. Die Bindung der

Antikörper aus dem präabsorbierten Patienten- bzw. Kontrollserum, das gesammelt und wieder

verwendet wurde, erfolgte ÜN bei 4°C. Am folgenden Tag wurde der sekundäre Antikörper

(1:2500 in 0,5% Milchpulver (w/v) in 1x TBS) nach einem Waschschritt 1h lang mit den

Membranen inkubiert. Als sekundärer Antikörper wurde ein gegen das Fc-Fragment humaner

IgG gerichteter, in einer Ziege hergestellter, spezifischer Antikörper verwendet, der an eine

alkalische Phosphatase (AP) gekoppelt ist. Nach einem Waschschritt und einer Äquilibrierung in

1x CDS, pH 9,5 wurde der Blot in frisch angesetzter Entwicklungslösung für 2h bei 37°C

schüttelnd entwickelt.


Tabelle 2-4: Anordnung der Phagen auf den SADA-Membranen 1 und 2

Dargestellt ist die Anordnung der SADA-Phagenklone auf den Membranen 1 und 2. Ph. = Phage.

SADA-Membran 1

„Leerer“ Ph. „Leerer” Ph. GBP-5ta GBP-5ta GBP-5a GBP-5a PINCH PINCH se2-5 se2-5 se2-1 se2-1 se1-1 se1-1 pGAGE-t pGAGE-t

cTAGE-5a cTAGE-5a cTAGE-1 cTAGE-1 pMAGE-A9 pMAGE-A9 HD-CL-12 HC-CL-12 HD-CL-03 HD-CL-03 HD-CL-04 HD-CL-04 du20-10L4 du20-10L4 se20-7 se20-7 HD-MM-03 HD-MM-03 HD-MM-02 HD-MM-02 HD-MM-01 HD-MM-01 HD-CL-09 HD-CL-09

PINCH PINCH se89-1 se89-1 se57-1 se57-1 „Leerer“ Ph. „Leerer” Ph.

„Leerer“ Ph. „Leerer” Ph. se57-1 se57-1 se89-1 se89-1 PINCH PINCH HD-CL-09 HD-CL-09 HD-MM-01 HD-MM-01 HD-MM-02 HD-MM-02 HD-MM-03 HD-MM-03

se20-7 se20-7 du20-10L4 du20-10L4 HD-CL-04 HD-CL-04 HD-CL-03 HD-CL-03 HD-CL-12 HC-CL-12 pMAGE-A9 pMAGE-A9 cTAGE-1 cTAGE-1 cTAGE-5a cTAGE-5a pGAGE-t PGAGE-t se1-1 se1-1 se2-1 se2-1 se2-5 se2-5 PINCH PINCH GBP-5a GBP-5a GBP-5ta GBP-5ta „Leerer“ Ph. „Leerer” Ph.

SADA-Membran 2

„Leerer“ Ph. „Leerer” Ph. HD-MM-08 HD-MM-08 HD-MM-48 HD-MM-48 UACA UACA HD-CL-02 HD-CL-02 HD-MM-23 HD-MM-23 HD-MM-19 HD-MM-19 HD-MM-16 HD-MM-16 HD-CL-24 HD-CL-24 HD-CL-17 HC-CL-17 HD-CL-14 HC-CL-14 HD-CL-08 HC-CL-08

se37-2 se37-2 se33-1 se33-1 se20-4 se20-4 HD-CL-30 HD-CL-30 HD-CL-50 HD-CL-50 HD-CL-49 HD-CL-49 HD-CL-41 HD-CL-41 pMAGE-A3 pMAGE-A3 HD-CL-54 HD-CL-54 HD-CL-53 HD-CL-53 HD-CL-52 HD-CL-52 HD-CL-51 HD-CL-51

HD-CL-51 HD-CL-51 HD-CL-52 HD-CL-52 HD-CL-53 HD-CL-53 HD-CL-54 HD-CL-54 pMAGE-A3 pMAGE-A3 HD-CL-41 HD-CL-41 HD-CL-49 HD-CL-49 HD-CL-50 HD-CL-50 HD-CL-30 HD-CL-30 se20-4 se20-4 se33-1 se33-1 se37-2 se37-2 HD-CL-08 HC-CL-08 HD-CL-14 HC-CL-14 HD-CL-17 HC-CL-17 HD-CL-24 HD-CL-24 HD-MM-16 HD-MM-16 HD-MM-19 HD-MM-19 HD-MM-23 HD-MM-23 HD-CL-02 HD-CL-02

UACA UACA HD-MM-48 HD-MM-48 HD-MM-08 HD-MM-08 „Leerer“ Ph. „Leerer” Ph.

Der Nachweis erfolgte mittels einer Farbumsetzung des NBT/BCIP in der Entwicklungslösung

durch die AP. Ein positiver Klon erscheint blau-violett auf der geblotteten Membran. Die

Bindung der Serumantikörper gegen die geblotteten Proteine eines Klones und damit die

Reaktion des Serums gegen das jeweilige Antigen wurde im Vergleich mit der Negativkontrolle

auf demselben Blot bestimmt. In Abbildung 2-1 ist das Schema der SADA-Methode dargestellt.


Abbildung 2-1: Schema der SADA-Methode

Die Phagen wurden mittels eines Stempels auf eine Agarplatte übertragen, die exprimierten Phagenklonproteine auf Nitrozellulosemembranen geblottet und eingefroren. Nach dem Auftauen wurden die Membranen blockiert und mit präabsorbiertem Patienten- oder Kontrollserum inkubiert. Die Detektion einer positiven Serumreaktion erfolgte durch eine Inkubation mit sekundärem Antikörper und einer abschließenden Substratreaktion. IPTG: Isopropyl-β-D-thiogalactosid, ÜN: Über Nacht, h: Stunde.

2.5.5 In vivo Exzision

Bei der in vivo Exzision wird der pBluescript Phagemid aus dem Uni-Zap XR Vektor unter

Verwendung des Helfer-Phagen ExAssist, der für F1 Proteine kodiert, isoliert. Die Helfer-

Phagen werden verwendet, um das Wirtsgenom aus dem Lambda Phagen am λ Ursprung

auszuschneiden. Das Plasmid wird mit dem Insert isoliert, da der λ Ursprung an das pBluescript

Phagemid grenzt. Da stets mehrere Phagenplaques für die Stocklösungen gepickt wurden, diente

diese Methode der Bestätigung der Monoklonalität der verwendeten Phagen.

Um das Plasmid aus dem entsprechenden Phagenklon zu gewinnen, wurden Kulturplatten der E.

coli-Stämme MRF (Tetrazyklin-Resistenz) und SOLR (Kanamycin-Resistenz) angelegt. Beide

Stämme wurden in 50mL LB-Komplettmedium bis zu einer OD600 von 1,0 kultiviert, pelletiert

und in 50mL 10mM MgSO4 resuspendiert. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 37°C von

200µL MRF-Lösung mit 250µL Phagenlösung und 1µL Helfer-Phage, wurde die Phagen-

96 well Platte150µL Phagenlösung pro well Phagenlösung: ca. 2000 Phagen/µL

Phagen ÜN bei 37°C inkubieren

NZY-Agar mit MRF (E. coli-Stamm) + IPTG

OmniTray (Nunc)

Phagen in Duplikaten mittels Stempel auf Agar spotten

Blotten der Proteine 4h bei 37°C auf

Nitrozellulose Membran

Blockieren mit 5% Milch in 1xTBS

Inkubation mit präab-sorbiertem Serum 1:100 ÜN bei 4°C

Membranen bis zur Verwendung bei -20°C lagern

Inkubation mit sekundärem Antikörper 1:2500 in 0.5% Milch in 1xTBS

Substratreaktion

Stempel

Phagenplaque

96 well Platte150µL Phagenlösung pro well Phagenlösung: ca. 2000 Phagen/µL

Phagen ÜN bei 37°C inkubierenPhagen ÜN bei 37°C inkubieren

NZY-Agar mit MRF (E. coli-Stamm) + IPTG

OmniTray (Nunc)

Phagen in Duplikaten mittels Stempel auf Agar spotten

Blotten der Proteine 4h bei 37°C auf

Nitrozellulose Membran

Blockieren mit 5% Milch in 1xTBS

Inkubation mit präab-sorbiertem Serum 1:100 ÜN bei 4°C

Membranen bis zur Verwendung bei -20°C lagern

Inkubation mit sekundärem Antikörper 1:2500 in 0.5% Milch in 1xTBS

Substratreaktion

Stempel

Phagenplaque


Bakterien-Lösung nach der Zugabe von 3mL LB-Medium für 3h geschüttelt. Die

Bakterienzellen wurden 20min bei 65-70°C lysiert und anschließend abzentrifugiert. 50µL des

phagenhaltigen Überstands wurden mit 200µL kompetenten E. coli SOLR-Bakterien für 15min

inkubiert und auf LB-Amp-Platten ausplattiert. Da das Plasmid eine Amp-Resistenz trägt,

wurden die erfolgreich transduzierten Bakterien ÜN bei 37°C selektioniert. Von jeder LB-Amp-

Platte wurden je Klon 3 Kolonien gepickt und in LB-Amp ÜN bei 37°C hochgezogen. Sowohl

der phagenhaltige Überstand als auch die LB-Amp-Platten konnten bei 4°C mehrere Wochen

gelagert werden.

2.5.6 Plasmid-DNA-Isolierung

Das Qiaprep Spin Miniprep Kit wurde gemäß des Protokolls des Herstellers zur Isolierung der

Plasmide aus den Bakterien verwendet. Eine 4mL ÜN-LB-Amp-Kultur (100µg/mL Amp) des

entsprechenden Klons wurde pelletiert und in 250µL kaltem Puffer P1 inklusive RNase

resuspendiert. Nach der Zugabe von 250µL Puffer P2 und 350µL Puffer N3 wurden Zelltrümmer

und Proteine abzentrifugiert und der Überstand auf die mitgelieferte Säule gegeben. Die Säule

enthält ein Glasfaservlies, an das die DNA bindet, die in mehrmaligen Schritten zunächst mit

Puffer und anschließend mit ethanolhaltigem Puffer PE gewaschen wurde. Die Plasmid-DNA

wurde schließlich in Aqua ad iniectabilia Braun oder mitgeliefertem TE-Puffer eluiert.

2.5.7 Spaltung der Phagemide

Die Restriktionsspaltung dient dazu, die cDNA aus dem Plasmid herauszuschneiden und somit

die Größe des Inserts zu bestimmen. Das Plasmid enthält einen Polylinker, welcher zahlreiche

Schnittstellen für Restriktionsenzyme besitzt. Da die Schnittstellen SmaI und KpnI das Insert

flankieren, wurden sie für die Restriktion herangezogen. Für eine Probespaltung wurden für

0,5µg Plasmid 1 Unit (U) Restriktionsenzym eingesetzt. Die Spaltung erfolgte 2h bei 37°C unter

Verwendung des OPA-Puffers in einer Endkonzentration von 1x oder 2x in Anlehnung an die

Erfordernisse des Enzyms. Das gespaltene Plasmid wurde in einem DNA-Agarose-Gel im

Vergleich zu einer DNA-Leiter elektrophoretisch aufgetrennt.

2.5.8 Agarose-Gelelektrophorese

Die Agarose (1-2%) wurde mit 1x TAE-Puffer aufgekocht, in eine Gelkammer gegossen und

polymerisierte beim Abkühlen aus. Nach einer gelelektrophoretischen Auftrennung der Proben

von 40-50min bei 80V wurde das Gel für 5-10min in ein Ethidiumbromidbad gelegt, um die

DNA anzufärben. Da Ethidiumbromid unter UV-Licht fluoresziert, konnte das Ergebnis mit

einem Geldokumentationssystem festgehalten werden.


2.6 ELISA und Multiplex-Serologie

Die ELISA-Methode sowie die davon abgeleitete Multiplex-Serologie ermöglichen die

quantitative oder zumindest semiquantitative Bestimmung von Antigen oder Antikörper. Engvall

und Perlman beschrieben als erste Wissenschaftler die ELISA-Methode (Engvall und Perlman

1971). In dieser Arbeit wurden ELISA und Multiplex-Serologie für 16 unterschiedliche Antigene

in einer neuen Form des GST-X-tag-ELISA (capture ELISA) und der Multiplex-Serologie als

serologische Tests zum Nachweis von Antikörpern gegen Tumorantigene des CTCL und MM

verwendet. Der GST-X-tag-ELISA wurde von Dr. C. Gänzler, Dr. P. Sehr und Dr. M. Pawlita

am Deutschen Krebsforschungszentrum entwickelt und in den USA zum Patent angemeldet (US

60/305259). Die Multiplex-Serologie im Sinne eines Suspensions-Arrays als

Antikörperscreeningsystem für komplexe Antikörperantworten (Luminex-Methode) wurde in

derselben Arbeitsgruppe von Dr. T. Waterboer etabliert (Waterboer 2005; Waterboer et al.

2005). Für beide Methoden liegen die in E. coli überexprimierten Proteinantigene als GST-

Fusionsproteine vor. Durch Bindung des GST-Teils an immobilisiertes Glutathion, das sich

entweder auf einer ELISA-Platte oder aber an Beads gekoppelt befindet, wird das lösliche

Antigen durch einen in situ-Affinitätsaufreinigungsschritt aus dem bakteriellen Lysat

immobilisiert und aufgereinigt. Die Herstellung des GC und die Kopplung desselben an die

Beads wurde von Dr. P. Sehr und Dr. T. Waterboer übernommen.

2.6.1 DNA-Klonierungen

2.6.1.1 Plasmide

Alle in dieser Arbeit verwendeten Tumorantigene lagen im Amp-resistenten pBluescript-Vektor

der Firma Stratagene vor und konnten im Weiteren für Umklonierungen verwendet werden. Das

Originalplasmid für GAGE-7 wurde als IMAG-Klon IMAGp998M145158.1 vom Deutschen

Ressourcenzentrum für Genomforschung erworben. Die Antigene MAGE-A1, -A3, -A9, LAGE-

1a, CAMEL, GAGE-7b, cTAGE-5a N- und C-terminal wurden selbst umkloniert, wobei mittels

des Bioinformatik-Systems HUSAR des DKFZ der offene Leserahmen („open reading frame“,

ORF) des jeweiligen Gens ausgewählt wurde, der für das längste Protein kodiert. Die Antigene

se57-1, se70-2 und GBP-5ta wurden von Dr. F. Fellenberg umkloniert. Die Humane

Papillomavirus (HPV)- und Papavovirus-Antigene BK, JC, LPV und HPV1 sowie die

Tumorsuppressorgene p16 und p53 wurden von Dr. P. Sehr und Dr. K. Michael kloniert.

Ausgehend von den umklonierten Plasmiden wurden alle verwendeten Proteine der

Arbeitsgruppe von S. Eichmüller selbst exprimiert. Die viralen GST-Fusionsproteine sowie die

Tumorsuppessorgene wurden von der Arbeitsgruppe von Dr. M. Pawlita zur Verfügung gestellt.


Der verwendete pGEX-Vektor (pGEX-4T-3tag) ist ein IPTG-induzierbarer Expressionsvektor

mit tac-Promoter, der rekombinante Proteine als Doppelfusionsproteine mit N-terminaler GST

(26kDa) und einem C-terminalen Undecapeptid des großen T-Antigens des simian virus 40

(SV40, KPPTPP PEPET) exprimiert. Die Amp-Resistenz des Vektors dient der Selektion bei

Klonierungen.

2.6.1.2 Auswahl der Primer und Klonierungs-PCR

Um ein PCR-Amplifikat für die Klonierung zu erhalten, wurden zunächst Forward Primer

entworfen, die eine eingebaute Restriktionsschnittstelle, vier bis sechs überhängende Basen des

Vektors und die ersten 19-21 Basen des ORF des jeweiligen Antigens enthielten. Die Reverse

Primer waren ähnlich aufgebaut, nur wurden hier die letzten 19-21 Basen des ORF ohne

Stopcodon verwendet (Tabelle 2-5). Mit Hilfe der PCR konnte eine ausreichende Menge an

Amplifikat zur anschließenden Klonierung erhalten werden. Ein Klonierungs-PCR-Ansatz ist in

Tabelle 2-6 dargestellt. Aus Abbildung 2-2 ist das verwendete PCR-Programm ersichtlich, das

für jedes Primerpaar entsprechend modifiziert wurde.

Tabelle 2-5: Primer für die Klonierung in den pGEX-4T-3tag-Vektor

Die unterstrichenen Basen kennzeichnen die eingebauten Restriktionsschnittstellen (1BamHI, 2SalI, 3XmaI, 4EcoRI,) für die Klonierungs-PCR in den pGEX-4T-3tag-Vektor. Alle Primer wurden von Wolfgang Weinig, Abteilung Oligonukleotidsynthese/DNA-Sequenzierung, DKFZ, hergestellt. ORF: Offener Leserahmen, bp: Basenpaar, kDa: kilo Dalton.

Tumor-antigen Primer for Primer rev ORF

[bp] Anlagerungs- temperatur Proteingröße

MAGE-A1

ccg cgt gga tcc1 atg tct ctt gag cag agg agt ctg

agg ttt gtc gac2 gac tcc ctc ttc ctc ctc tct c

930 60°C 70kDa

MAGE-A3

cga att ccc ggg3 tgc ctc ttg agc aga

agg ttt gtc gac2 ctc ttc ccc ctc tct caa a

942 60°C 75kDa

MAGE-A9

ccg cgt gga tcc1 atg tct ctc gag cag agg a

agg ttt ccc ggg3 aga ctc cct ctt gct cct ct

945 45°C 72kDa

LAGE-1a tc ccc gaa ttc4 tat gca

ggc cga agg cca g agg ttt gtc gac2 gcg cct

ctg ccc tga ggg a 540 58,4°C 47kDa

CAMEL long

tc ccc gaa ttc4 tgc aca ggg ggt tcg acg ggc g

agg ttt gtc gac2 gaa ccg ccc ctg gtc ggg gga ga

351 60°C 40kDa

GAGE-7b ccg cgt gga tcc4 tat gag ttg gcg agg aag at

agg ttt gtc gac2 aca ctg tga ttg ctt ttc acc

351 58,4°C 45kDa

cTAGE-5a N-

terminal

ccg cgt gga tcc1 atg aga cca gat tct aat

g ttt gtc gac2 ctc cag ctc ttc agt ggc at

1224 55°C 75kDa

cTAGE-5a C-

terminal

cg cgt gga tcc1 cac agg aaa tta aca gta gag gaa a

agg ttt gtc gac2 ggt ttc ttg ctg tgg t

1107 55°C 75kDa


Tabelle 2-6: Klonierungs-PCR-Materialien und Pipettierschema

Die Tabelle führt die Reagenzien, ihre Endkonzentration und das pipettierte Volumen in einer Klonierungs-PCR auf. PCR: Polymerasekettenreaktion, NTP: Nukleotid-Triphosphat, U: Unit.

Reagenzien Volumen Endkonzentration Plasmid (1:100 verdünnt) 1,5µL 60ng/µL PWO-Polymerase 2,5µL 2,5U 10x PWO Reaktionspuffer komplett 2,5µL 1x Forward Primer 1,0µL 1,0µM Reverse Primer 1,0µL 1,0µM dNTP-Mix (Nukleotide) 0,5µL 0,8µM Aqua ad iniectabilia Braun 16,0µL -

35 Zyklen

95°C 95°C 45-60°C 72°C 72°C

4°C 5min 1min 1min 2min 10min

Aufbewahrung Denaturierung Anlagerung Elongation finale

Elongation

Abbildung 2-2: Programm der Klonierungs-PCR

Die Anlagerungstemperatur der Primer wurde für jedes Primerpaar entsprechend gewählt, wobei alle anderen Parameter unverändert blieben. min: Minute.

2.6.1.3 Restriktionsverdau

Restriktionsendonukleasen, die keine Schnittstelle im jeweiligen Gen besaßen, wurden zur

Restriktionsspaltung eingesetzt. Für die Spaltung eines PCR-Amplifikats wurden die jeweiligen

Enzyme wie folgt verwendet: 24U EcoRI, 60U BamHI, 10U XmaI und 75U SalI. Die

verwendete Enzymmenge wurde für den Spaltungsansatz des Vektors verdoppelt. Um die

Spaltung sicherzustellen wurde mit einem Enzymüberschuss gearbeitet. OPA-Puffer wurde

entsprechend des Enzyms in Endkonzentrationen von 1x oder 2x eingesetzt. Für Klonierungen

erfolgte die Spaltung des Vektors und des PCR-Produkts ÜN bei 37°C.

2.6.1.4 CIAP-Behandlung

Zur Verhinderung einer Religation der Vektor-DNA nach dem Restriktionsverdau wurde eine

Dephosphorylierung der gespaltenen Enden unter Verwendung von CIAP durchgeführt. CIAP

katalysiert die Hydrolyse von 5'-Phosphatenden der DNA. Zunächst wurden die

Restriktionsendonukleasen 10min bei 65°C hitzeinaktiviert. Anschließend wurde die Vektor-

DNA in Anwesenheit von 10x CIAP Reaktionspuffer (500mM Tris-HCl pH 9,0, 10mM MgCl2)

und 2 U/µL CIAP 30min bei 37°C dephosphoryliert. Nach einer gelelektrophoretischen

Auftrennung der Vektor-DNA und des PCR-Amplifikats wurde eine Gelextraktion durchgeführt.


2.6.1.5 Gelextraktion

Vektor- und Insert-DNA wurden mittels langwelligem UV-Licht detektiert, aus dem Agarose-

Gel ausgeschnitten und nach dem Protokoll des Herstellers mit dem Gelextraktionskit der Firma

Qiagen aus dem Gel aufgereinigt. Zu Beginn wurde das Gelstück in entsprechendem Volumen

des Puffers QG aufgenommen, 10min bei 50°C gelöst und nach Zugabe von Isopropanol auf die

mitgelieferte Säule gegeben. Die durch Zentrifugation der Säule im Glasfaservlies gebundene

DNA, wurde mit Puffer QG und ethanolhaltigem Puffer PE gewaschen. Nach dem Entfernen der

letzten Reste an EtOH durch Zentrifugation, wurde die DNA mit Aqua ad iniectabilia Braun

eluiert. Die Konzentration an gelextrahierter Vektor- und Insert-DNA wurde für die weitere

Verarbeitung anhand eines Agarose-Gels im Vergleich zu der Konzentration eines λ-Markers

abgeschätzt.

2.6.1.6 Ligation

Im Ligationsansatz wurden 0,067 U/µL T4-DNA-Ligase und 1x Ligase-Puffer (50mM Tris-HCl

pH 7,6, 10mM MgCl2, 1mM Adenosintriphosphat (ATP), 1mM DTT, 5% Polyethylenglycol)

verwendet. Das molare Verhältnis von Vektor zu Insert wurde wie folgt berechnet:

][

][

bpInsert

bpVektorhältnisMolaresVer =

Dementsprechend wurde das Verhältnis von Vektor zu Insert zwischen 5:1 und 15:1 gewählt.

Ligiert wurde für 5min bei Rt.

2.6.1.7 Herstellung kompetenter Bakterien

Nach der Anzucht einer LB-Agarkulturplatte ÜN bei 37°C von Bakterien (TOP10, BL21,

Rosetta D3) aus einem Glycerolstock, wurden mit einer gewachsenen Kolonie 100mL LB-

Medium angeimpft. Beim Erreichen einer OD600=0,5 wurden die Zellen abzentrifugiert

(4000UPM, 10min) und das Pellet in 10mL kaltem 50mM CaCl2 aufgenommen. Es folgte eine

Inkubation der Bakterien für 30min auf Eis. Die pelletierten Bakterien (4000UPM, 5min)

wurden in 4mL 50mM CaCl2 gelöst. Durch Zugabe von 50% Glycerol (autoklaviert) in gleichen

Volumina konnten die Bakterien in Aliquots von 200µL in flüssigem Stickstoff eingefroren und

bei –80°C gelagert werden. Die kompetenten Zellen wurden durch Transformation eines

bekannten Plasmids überprüft.


25 Zyklen

95°C

50°C60°C

15sek

15sek4min 4°C

Aufbewahrung

DenaturierungAnlagerung

Elongation

25 Zyklen

95°C

50°C60°C

15sek

15sek4min 4°C

Aufbewahrung

DenaturierungAnlagerung

Elongation

2.6.1.8 Transformation

Um die ligierte Vektor- und Insert-DNA in kompetente Bakterien zu transformieren, wurden die

Bakterien auf Eis aufgetaut und der komplette Ligationsansatz zugegeben. Auf eine Inkubation

des Transformationsansatzes für 30min auf Eis folgte ein Hitzeschock von 42°C für 45sek und

eine Abkühlung für 2min auf Eis. Bevor die transformierten Bakterien 1h bei 37°C inkubierten,

wurden 250µL warmes LB-Medium zugefügt. Der Transformationsansatz wurde anschließend

auf einer LB-Amp-Platte ausplattiert und über Nacht bei 37°C herangezogen. Zur Überprüfung

der Klonierung wurden mehrere Einzelkolonien von den Platten gepickt und in 3mL LB-Amp-

Kulturen über Nacht bei 37°C schüttelnd inkubiert. Die Plasmid-DNA der Kulturen wurde wie

unter 2.5.6 beschrieben isoliert und mittels Probespaltung unter Verwendung geeigneter

Restriktionsenzyme analysiert. Zur Proteinexpression wurden kompetente BL21 oder Rosetta D3

Bakterien mit den Plasmiden der Expressionsvektoren transformiert.

2.6.1.9 Sequenzierung

Umklonierte cDNA Abschnitte oder PCR-Produkte wurden mit dem ABI PRISM TM 310

„Genetic Analyser“ und dem „Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit“

sequenziert. Dazu wurden in der Regel Standard-Primer aus dem Vektor verwendet, die das

Insert oder die PCR-Primer flankierten (Tabelle 2-7).

Tabelle 2-7: Verwendete Primer in der Sequenzier-PCR

Jeweils einer der aufgeführten Primer wurde in einer Sequenzier-PCR verwendet.

Primer Sequenz Vektor T3 aat taa ccc tca cta aag gg pBluescript T7 gta ata cga ctc act ata ggg c pBluescript pGEX.for ggg ctg gca agc cac gtt tgg tg pGEX-4T-3tag pGEX.rev ccg gga gct gca tgt gtc aga gg pGEX-4T-3tag

In der Sequenzier-PCR wurden 400ng Plasmid eingesetzt, welche mit 12,5µM Primer und 4µL

BigDye-Mix im Thermocycler mittels des nachfolgenden Programms markiert wurden

(Abbildung 2-3).

Abbildung 2-3: Programm der Sequenzier-PCR

Die Sequenzier-PCR wurde stets nach diesem Schema durchgeführt. min: Minute, sek: Sekunde.


Nach der Sequenzier-PCR musste die DNA für den Einsatz in der Sequenzierung aufgereinigt

werden. Hierzu wurde eine EtOH-Fällung durchgeführt. Zu einem PCR-Reaktionsansatz wurden

2µL 3M NaAc pH 5,0 und 50µL EtOH (absolut) gegeben, 10min auf Eis gefällt und 20min bei

13.000UPM, Rotor PP1/97, abzentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde mit 70% EtOH gewaschen,

10min bei 13.000UPM, Rotor PP1/97, zentrifugiert und bei Rt getrocknet. Die so erhaltene DNA

wurde in 20µL Formamid aufgenommen und im Sequenziergerät ABI PRISM TM 310 Genetic

Analyzer nach der Ketten-Abbruch-Methode sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden

mittels der GCG/HUSAR Programme ausgewertet.

2.6.1.10 Computer-Programme

Sequenzanalysen, Primerauswahl, die Bestimmung der offenen Leserahmen, Datenbank-Suchen

und Sequenzvergleiche wurden unter Verwendung verschiedener GCG-Programme (HUSAR,

DKFZ) durchgeführt.

2.6.2 Proteinexpression der Antigene in E. coli

Die Proteinexpression der verwendeten Tumorantigene erfolgte entweder im proteasedefizienten

E. coli-Stamm BL21 (MAGE-A1, -A3, -A9, GAGE-7b, CAMEL, GBP-5ta, cTAGE-5a N- und

C-terminal, BK, JC, LPV1, p16, p53) oder in E. coli BL21 Rosetta D3 (LAGE-1a, se57-1, se70-

2, HPV1). Die letztere BL21-Subspezies enthält ein zusätzliches Plasmid, das für sechs in E. coli

selten gebrauchte tRNAs codiert und zur Selektion ein Chloramphenicol-Resistenzgen trägt. In

großen Proteinen kommen statistisch gehäuft diese in E. coli selten gebrauchte Codons vor.

Deshalb werden große Proteine häufig besser in BL21 Rosetta D3 in voller Länge exprimiert.

Proteine in E. coli BL21 wurden in LB-Medium mit 100µg/mL Amp, Proteine in BL21 Rosetta

D3 in LB-Medium mit 100µg/mL Amp und 20µg/mL Chloramphenicol exprimiert.

2.6.2.1 Kulturbedingungen und Ernte der Bakterien

Von allen zu exprimierenden GST-Fusionsproteinen wurden entsprechende LB-Amp-

Agarkulturplatten von Glycerolstocks der Bakterienkulturen angelegt. Zur Expression der GST-

Fusionsproteine wurde eine 50mL Vorkultur des jeweiligen BL21 Bakterienstamms mit einer

Kolonie von der Kulturplatte in LB-Amp-Medium angeimpft und bei 37°C ÜN auf einem

Rotationsschüttler (200UPM) inkubiert. Je 5mL der dicht gewachsenen Vorkultur wurden in

sechs Erlenmeyerkolben mit je 250mL LB-Amp-Medium überführt und bei 37°C schüttelnd bis

zu einer OD600=0,7-0,9 kultiviert. Nach dem Test der optimalen Expressionsbedingungen für

jedes Antigen wurden MAGE-A1, -A3, -A9, GAGE-7b, CAMEL und GBP-5ta bei Rt 6h und

LAGE-1a, se57-1, se70-2 sowie cTAGE-5a N- und C-terminal bei 16°C ÜN exprimiert. Durch


Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,25mM wurde die Expression der Proteine

induziert. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Bakterien mittels Zentrifugation 10min bei

5000UPM und 4°C in einer Sorvall Zentrifuge mit JA14-Rotor geerntet und die Überstände

verworfen. Jedes Bakterien-Pellet wurde in 20mL 1x PBS resuspendiert und bei -20°C gelagert.

2.6.2.2 Aufschluss der Bakterien mittels French Press

Nach dem Auftauen des Bakterienlysats bei Rt im Wasserbad wurde pro 1,5L Kultur eine halbe

Tablette „Protease Inhibitor Cocktail CompleteTM“ zugegeben und das Lysat auf Eis gelagert, um

Degradation der Proteine zu vermeiden. Die Lyse der Bakterien wurde mittels

Hochdruckhomogenisator Emulsiflex-C5 (French Press) durchgeführt. Die French Press wurde

ÜN bei 4°C vorgekühlt und wurde während des Gebrauchs ständig von außen mit Eis gekühlt.

Jede Bakteriensuspension wurde dreimal aufgeschlossen. Anschließend erfolgte die Trennung

löslicher Proteine von Zelltrümmern und unlöslichen Proteinen mittels Zentrifugation 30min bei

4°C und 14.000UPM in einer Sorvall-Zentrifuge mit JA17-Rotor.

2.6.2.3 Proteinbestimmung nach Bradford und Lagerung der Proteine

Im geklärten Lysat (Lysat nach Zentrifugation) wurde die Proteinkonzentration mittels Bradford

bestimmt. Hierzu wurden 10µL des Lysats mit 790µL ddH2O und 200µL Bradford Reagenz

(BioRad Protein Assay Reagenz) versetzt und die Extinktion bei 595nm gegen einen Blindwert

(ohne Protein) gemessen. Anhand einer Verdünnungsreihe von BSA konnte die genaue

Proteinkonzentration berechnet werden. Im Anschluss wurde das geklärte Lysat mit

wasserfreiem Glycerin in einer Endkonzentration von 50% gemischt und konnte ohne

einzufrieren bei -20 °C gelagert werden.

2.6.3 SDS-PAGE und Western Blot

Neben der Konzentrationsbestimmung der Fusionsproteine wurden diese als weitere

Qualitätskontrolle im Western Blot und Coomassie-Gel nach SDS-PAGE auf ihre Größe und

Expression hin überprüft. Hierfür wurde das BioRad Protean II und III Gelsystem verwendet.

Die Lysate wurden in 5x SDS-PAGE-Probenpuffer (Endkonzentration 1x) aufgenommen und

5min bei 99°C erhitzt. Nach dem Säubern der Glasplatten mit 70% EtOH und dem Einsetzen

derselben in die Apparatur konnte das Gelsystem verwendet werden. Für die SDS-Mini-Gele

wurde zunächst das Trenngel (12% Acrylamid) gegossen, mit Isopropanol überschichtet und

auspolymerisiert. Anschließend wurde das Gel mit dem Gießen des Sammelgels und Einsetzen

der Kämme fertiggestellt. Die Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels ist Tabelle 2-8 zu

entnehmen.


Tabelle 2-8: Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel für die SDS-PAGE

Die folgende Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels für die „sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis“ (SDS-PAGE) wurde verwendet. APS: Ammoniumpersulfat, TEMED: N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin, ddH2O: bidestilliertes Wasser.

Reagenz Trenngel (15% Polyacrylamid)

Sammelgel (6% Polyacrylamid)

ddH2O 6,0mL 7,4mL 4x Lower Buffer 4,3mL - 4x Upper Buffer - 3,3mL Polyacrylamid 7,0mL 2,1mL 10% APS 42,2µL 128,1µL TEMED 19,1µL 17,1µL

Als Marker wurden 3µL des „Precision Plus Protein Standard Dual Color“ aufgetragen. Die

Proteine wurden bei 130V für 90-100min in 1x Running Buffer aufgetrennt. Im Anschluss

konnten die Polyacrylamid-Gele entsprechend der Anforderungen mit Coomassie gefärbt oder

geblottet werden.

2.6.3.1 Coomassie-Färbung der SDS-PAGE-Gele

Bei der Verwendung der weniger sensitiven Methode der Coomassie-Färbung wird ein

Polyacrylamid-Gel für 30min in Coomassie Brillant Blue-Lösung bei Rt schüttelnd gefärbt und

ÜN bei Rt mit Entfärber-Lösung entfärbt. Die sensitive Methode verwendet hingegen kolloidales

Coomassie zur Färbung. Hier wird das Gel zunächst in Fixierungslösung fixiert. Eine Inkubation

mit der frisch angesetzten Färbelösung erfolgt ÜN bei Rt. Erscheint das Gel am folgenden Tag

ausreichend gefärbt, wird in 25% Methanol schüttelnd bei Rt kurz entfärbt. Um Gele haltbar zu

machen, wurden sie in Wasser gewaschen, in einem Geltrocknungssystem zwischen zwei

Celluphanfolien eingespannt und bei Rt mehrere Tage getrocknet.

2.6.3.2 Blot der Proteine

Zur Detektion der Proteine mit Antikörpern wurden die Polyacrylamid-Gele nach der

Auftrennung in einer BioRad Nassblotkammer zwischen vier Whatman-Papieren auf eine

Nitrozellulosemembran transferiert. Der Transfer erfolgte mit 1x Transferpuffer 1h bei 100V und

wurde mit einer Ponceau-Rot-Färbung überprüft (einminütige Inkubation in Ponceau S-Lösung

und Entfärben mit PBS-T).

2.6.3.3 Antikörper-Inkubation und Detektion von Proteinen

Um unspezifische Antikörper- und Proteinbindungsstellen der Membran zu sättigen, wurden die

Membranen für 2h bei Rt mit Blockierungslösung inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der

Membran in PBS-T für 10min (Waschschritt) wurde die Inkubation der Erstantikörper in 0,5%


Milchpulver (w/v) in PBS-T mit der Membran 1h bei Rt oder ÜN bei 4°C durchgeführt. Nach

einem Waschschritt wurden die mit Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper (1:10.000 in 0,5%

Milchpulver (w/v) in PBS-T) 45min bei Rt auf die Membran gegeben. Der letzte Waschschritt

wurde mit der Inkubation der Membran mit ECL plus-Reagenz nach Herstellerprotokoll für

1min abgeschlossen. Die in Klarsichtfolie luftblasenfrei eingeschweißte Membran wurde in der

Dunkelkammer Röntgenfilmen mit Expositionszeiten von 10 sek bis 5min ausgesetzt, um bei der

stattfindenden Entwicklung die gebundenen Antikörper zu visualisieren.

Um eine Membran mit mehreren Antikörpern zu untersuchen, wurde sie nach der Detektion der

Proteine mit einem Antikörper gestrippt. Hierfür wurde die Membran nach der Inkubation mit

ECL-Reagenz in PBS-T gewaschen und anschließend 30min bei 57°C mit Stripping-Lösung

inkubiert. Nach einem dreimaligen Waschschritt für 10min in PBS-T konnte die Membran für

den nächsten Antikörper verwendet werden. Eine Membran konnte mindestens 2-mal gestrippt

werden.

Um die Qualität von eukaryotischen Proteinproben zu überprüfen und deren Quantität

abzuschätzen, wurde ein Anti-β-Aktin Antikörper an derselben Membran eingesetzt und mit dem

zuvor mit einem anderen Antikörper erhaltenen Ergebnis verglichen.

2.6.4 Antigen-Titration im GST-X-tag-ELISA

Die Antigen-Titration der selbst hergestellten Proteine war notwendig, um die Proteine auf ihre

Verwendbarkeit in der Luminex-Methode zu testen. Bei jeder Antigen-Titration betrug das

Standardvolumen 100µL pro Loch der 96 Loch ELISA-Platte, falls nicht anders angegeben.

ÜN wurde die 96 Lochplatte mit 2ng/µL GC in Coating-Puffer bei 4°C beschichtet. Am

folgenden Morgen wurde die Platte ausgeschüttet und auf einem Papierhandtuchstapel

ausgeklopft. Freie Proteinbindungsstellen der Plattenoberfläche wurden mit 180µL Casein-

Blockpuffer pro Loch 1h bei Rt blockiert. Die zusätzlichen 80µL Blockierungspuffer pro Loch

stellten sicher, dass über dem Standardvolumen von 100µL keine unspezifische Anlagerung von

Antikörpern und anschließende Detektion im ELISA-System stattfand. Nach dem Ausschütten

und Ausklopfen der Platte wurden die Antigene in einer zwölfstufigen Verdünnungsreihe in

Casein-Blockpuffer mit einer Anfangskonzentration von 100µg Antigen pro Loch auf die Platte

gegeben und für 1h bei Rt inkubiert. Pro Antigen wurden Doppelwerte der Verdünnungsreihe

gewählt, da jedes Antigen mit zwei Antikörpern (anti-GST und anti-tag) untersucht wurde. Im

Anschluss wurde die Platte durch dreimaliges Eintauchen in eine mit PBS-T (Waschpuffer)

gefüllte Plastikwanne gewaschen (Waschschritt). Anschließend wurde die Platte mit dem

jeweiligen Erstantikörper (Maus anti-tag 1:1000 oder Ziege anti-GST 1:10.000) in Casein-


Blockpuffer für 1h bei Rt beschickt. Nach einem Waschschritt wurde ein mit Meerrettich

Peroxidase (HRP) gekoppelter Zweitantikörper Ziege Anti-Maus oder Ziege Anti-Ziege

(1:10.000) in Casein-Blockpuffer 1h bei Rt in den entsprechenden Löchern inkubiert. Nach

einem Waschschritt fand die Farbreaktion mit 10µg/mL TMB und 0,003% (v/v) H2O2 als

Substrat in Substratpuffer statt. Die Farbreaktion wurde bei entsprechender Färbung nach 5 bis

8min durch Zugabe von 50µL 1M Schwefelsäure pro Loch gestoppt. Die Extinktion der

gesamten Platte wurde am ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 450nm gemessen. Die

Messwerte wurden gegen die Titrationsstufen linear/linear oder linear/logarithmisch aufgetragen.

Der linear/linear Liniengraph diente zur Bestimmung der Sättigungsmenge des Antigens. Der

linear/logarithmische Graph beschrieb den Titrationsverlauf.

Entsprachen die Ergebnisse des jeweiligen Antigens im Western Blot und bei der Antigen-

Titration im ELISA den nachfolgend aufgeführten Anforderungen, konnte das Antigen in der

Multiplex-Serologie eingesetzt werden. Im Western Blot musste eine prominente Bande mit dem

entsprechenden Molekulargewicht des jeweiligen Antigens unter Verwendung beider Antikörper

(anti-GST und anti-tag) detektiert werden. Im ELISA bestätigte ein Erreichen der Sättigung der

Titrationskurve bei 25µg Protein pro Loch eine ausreichende Menge an Volle-Länge-

Antigenprotein.

2.6.5 Methodik der Multiplex-Serologie

Im Unterschied zum ELISA werden die GST-Fusionsproteine bei der Multiplex-Serologie an

GC-Beads gebunden. Diese Tatsache und die Möglichkeit der Vermessung der unterschiedlichen

Beadsorten in einem Luminex-Gerät stellen sicher, dass bis zu 1000 Seren parallel mit

zahlreichen Antigenen gemessen werden können. Deshalb wurde die Reaktivität aller Seren nur

mittels der Multiplex-Serologie ermittelt.

2.6.5.1 Beladung der GC-Beads mit Antigenen

Alle Bakterienlysate wurden auf 1mg Protein in 1mL Casein-Blockpuffer verdünnt. Pro Serum

wurden 3000 Beads einer Beadsorte mit dem jeweiligen Antigen des vorbereiteten

Bakterienlysats 1h bei Rt im Dunkeln zum Schutz der Farbmoleküle jeder Beadsorte schüttelnd

(250UPM) beladen. Bis zu 3 Millionen Beads für die Analyse von 1000 Seren konnten mit 1mL

Bakterienlysat beladen werden. Danach wurden die Beads 2min bei 13.000UPM pelletiert und

dreimal mit 1mL Casein-Blockpuffer gewaschen. Schließlich wurden die Beads in einem

angemessenen Volumen an Casein-Blockpuffer oder Lagerungspuffer aufgenommen.


2.6.5.2 Vorinkubation von Seren

Die Seren wurden in einer Verdünnung von 1:50 für 1h bei Rt auf einem Schüttler mit dem

Serumvorinkubationspuffer in einer ELISA-Platte präabsorbiert. Diese Vorinkubation diente

dazu, das Entstehen von Hintergrundreaktionen mit bakteriellen Proteinen und den GST- und

tag-Anteilen der Antigen-Fusionsproteine zu verhindern.

2.6.5.3 Durchführung der Multiplex-Serologie-Methode

Zunächst wurde jede Beadsorte 6x 30sek im Ultraschallbad behandelt, um die Beads zu

vereinzeln. Danach wurde eine Beadmischung hergestellt, indem verschiedene Beadsorten

beladen mit unterschiedlichen Antigenen gemischt wurden. Je 50µL präabsorbiertes Serum und

Beadmix wurden in einer mit Casein-Blockpuffer äquilibrierten 96 Lochfilterplatte gemischt und

für 1h bei Rt im Dunkeln auf einem Schüttler inkubiert (Serumendverdünnung 1:100). Wenn

nicht anders beschrieben, wurde mit 100µL Lösung pro Loch gearbeitet. Danach wurden die

Beads dreimal mit Blockpuffer auf einer Vakuum-Absaugstation gewaschen. Nach Zugabe des

biotinylierten Sekundärantikörpers (1:1000 in Casein-Blockpuffer) wurde der Ansatz erneut wie

oben inkubiert. Auf einen weiteren Waschschritt folgend wurden die Beads für 30min mit Strep-

PE (1:1000 in Casein-Blockpuffer) inkubiert. Schließlich wurden die Beads gewaschen und zur

Messung in Casein-Blockpuffer aufgenommen. Während der Messung wurde neben der

Autofluoreszenz die Reporter-Fluoreszenz der Beads einzeln gemessen.

2.6.5.4 Analyse der Beads

Die Beadsuspension wird im Luminex-Gerät in einer Mikrokapillare vereinzelt und in einer

Durchfluss-Küvette mit einer Flussrate von 1µL/sek gemessen. Dabei regt der rote

(Klassifizierungs-) Laser die Beads zur Identifizierung der Beadsorte bei einer Wellenlänge von

635nm an. Hingegen regt der grüne (Reporter-)Laser die Beads bei einer Wellenlänge von

532nm an und ermittelt die Reaktivität des jeweiligen Serums mit dem entsprechenden Antigen.

Da eine Photodiode die Reporter-Fluoreszenz der Beads zwischen 565 und 585nm detektiert,

können unterschiedlicher Fluoreszenz-Farbstoffe (z.B. Cy3, PE, Alexa® 532) verwendet werden.

Die Analyse von Beads ist auch in einer Lösung mit überschüssigem, nicht gebundenem Strep-

PE möglich, weil die Hintergrund-Fluoreszenz der Lösung bei 575nm automatisch von der

Reporter-Fluoreszenz der Beads abgezogen wird. Ein Analog/Digital-Wandler speichert die

Signalintensität anschließend im 15bit-Format, so dass die Skala der Signalintensitäten von 0 bis

32768 (215) relative Einheiten als Median Fluoreszenz-Intensität („median fluorescence

intensity“, MFI) reicht. Pro Antigen wurden 100 Beads gemessen und deren MFI bestimmt.


2.6.5.5 Verarbeitung und Analyse der gemessenen Daten

Zusätzlich zu den zu analysierenden Antigenen wurde grundsätzlich GST als Antigen

mitgeführt, um aus den Rohdaten („Brutto“-Werte) durch Subtraktion des GST-Wertes

Hintergrund-korrigierte „Netto“-Werte errechnen zu können. Negative Netto-Werte wurden auf

0 gesetzt solange keine Werte unter –100 MFI erreicht wurden. War dies der Fall, wurde das

betreffende Serum von der Analyse ausgeschlossen. Ob Serum in das entsprechende Loch

pipettiert worden war, wurde unter Verwendung der durchschnittlichen Reaktivität des Serums

gegen alle verwendeten Antigene ermittelt. Lag dieser berechnete Wert unter der

durchschnittlichen Autofluoreszenz der verwendeten Beadsorten, wurde das Serum nachgetestet.

2.6.5.6 Bestimmung des Cut-off-Wertes für jedes Antigen

Um eine Aussage treffen zu können, ob ein Serum positiv oder negativ mit dem jeweiligen

Antigen reagierte, wurde für jedes Antigen ein spezifischer Cut-off-Wert aus den Messwerten

von 100 Kontrollseren der Blutbank berechnet und unter Berücksichtigung der kumulativen

Distribution aller gemessener Seren festgelegt. Von der Normalverteilung der Reaktivitäten

ausgehend, wurde iterativ der Mittelwert plus zweifacher Standardabweichung für alle humanen

Antigene und für alle viralen Antigene der Mittelwert plus dreifacher Standardabweichung

zusätzlich unter Wegfall der außerhalb dieser Grenzen liegenden Messwerte berechnet.

2.6.5.7 Evaluierung der serologischen Daten

Die Evaluierung der serologischen Daten erfolgte unter Verwendung von Microsoft Office

Excel. Es wurden Säulendiagramme und kumulative Distributionen erstellt. Bei der kumulativen

Distribution werden zunächst die Messwerte nach ihrer Größe sortiert und anschließend jedem

Messwert ein Platz auf einer Skala von 1 bis 100% zugewiesen. Damit ergibt sich eine

Verteilung der Seren einer Kohorte, die im Vergleich zu den Seren einer anderen Kohorte z.B.

Ctrl beurteilt werden kann.

Zur Bewertung von Serumverläufen wurde festgelegt, dass ein signifikanter Anstieg einer

Seroreaktivität auftritt, wenn eine der nachfolgenden Seroreaktivitäten eine doppelte Reaktivität

aufweist, deren Wert zudem über dem Cut-off-Wert des jeweiligen Antigens liegt. Ein

signifikanter Abfall wurde definiert als Halbierung der Seroreaktivität bei einer nachfolgenden

Seroreaktivität, solange die erste Seroreaktivität über dem Cut-off-Wert des jeweiligen Antigens

lag.


2.6.5.8 Statistische Auswertung der serologischen Daten – „Fisher’s Exact Test“

Der „Fisher’s Exact Test“ ist ein Unabhängigkeitstest, der häufig in der medizinischen

Forschung angewendet wird. Dieser Test wird bei einer 2 x 2 Matrix verwendet, wenn die

Ereignisse zweier unabhängiger Gruppen in jeweils nur eine sich gegenseitig ausschließende

Kategorie fallen. Festgestellt werden soll, ob ein Unterschied zwischen den beiden Gruppen

besteht hinsichtlich der Verteilung der Ereignisse in die beiden unterschiedlichen Kategorien. In

dieser Arbeit wurden die MFI-Werte der einzelnen Seren anhand des Cut-off-Wertes jedes

Antigens in die beiden Gruppen negative und positive Reaktivität entsprechend der Lage des

Serum MFI-Wertes unter oder über dem Cut-off-Wert eingeteilt. Sobald der berechnete p-Wert

unter dem Signifikanzniveau von p = 0,05 lag, wurde der Test als statistisch signifikant gewertet.

2.7 Expressionsanalyse von GAGE-7b auf RNA- und Proteinebene

Um die Expression des Antigens sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene in MM- und

CTCL-Zelllinien und Patienten zu untersuchen, wurden RNA und Protein isoliert sowie ein

polyklonaler Antikörper in Kaninchen hergestellt.

2.7.1 Isolierung von RNA

Die Gesamt-RNA wurde aus in flüssigem Stickstoff eingefrorenen Zellpellets von Zelllinien und

Gewebe unter Verwendung des RNeasy Kit und nach Herstellerprotokoll isoliert.

Die Zellpellets von 1x 107 Zellen oder 100mg Gewebe wurden in 1mL RNeasy-Lysis-Puffer und

1% β-Mercaptoethanol aufgenommen und in einer Schwingmühle homogenisiert. Für Gewebe

wurde das Lysat nach der Homogenisierung zusätzlich über eine Qiagen Mini Shredder Säule

gegeben, um unlösliche Zellbestandteile zu entfernen. Der Durchfluss oder das Lysat der

Zellpellets wurden nach der Homogenisierung im Qiagen Mini RNeasy Kit weiterverarbeitet.

Zusätzlich zum Protokoll des Herstellers wurde nach dem ersten Waschen der RNA-Säule mit

RW1 Puffer ein DNase-Verdau auf der Säule durchgeführt. Zur DNase-Behandlung wurden

80µL DNase (20U) in 1x DNase-Testpuffer mit der Säule für 15min bei Rt inkubiert. Die RNA

wurde mit DMPC-Wasser eluiert und nachfolgend mit kaltem 96% EtOH und 3M NaAc gefällt.

Die RNA-Konzentration wurde anschließend photometrisch bestimmt.

2.7.2 RNA-Gelelektrophorese

Um die Qualität der isolierten RNA zu überprüfen, wurde eine Agarose–Gelelektrophorese mit

MOPS-Puffer durchgeführt. Hierfür wurden 1-2µg RNA mit 2 Volumenteilen RNA-Puffer

gemischt und 10min bei 65°C denaturiert, damit die RNA einzelsträngig vorlag. Anschließend


wurde die RNA-Lösung mit 2µL RNA-Ladepuffer versetzt und in einem 1% Agarose 1x MOPS-

Gel bei 80V elektrophoretisch aufgetrennt. Die Integrität der RNA wurde bestätigt, wenn bei der

Begutachtung des RNA-Gels im Geldokumentationssystem die Banden der 28S und 18S

ribosomalen RNA deutlich erkennbar waren.

2.7.3 Herstellung von cDNA

cDNA wurde aus der isolierten Gesamt-RNA hergestellt. Hierfür wurde der iScript cDNA

Synthesis Kit verwendet, der mit Hilfe der RT den komplementären Strang zu der Gesamt-RNA

polymerisiert. 1µg RNA wurde für die cDNA-Synthese eingesetzt. Während der cDNA-Synthese

stellt der RNase-Inhibitor sicher, dass keine RNA-Degradation auftritt. Sowohl Oligo (dT)- als

auch random Hexamer-Primer, die sich an den PolyA-Schwanz bzw. zufällig an die RNA

anlagern, wurden in der Synthesereaktion verwendet.

Tabelle 2-9 ist der Ansatz für die cDNA-Synthese dargestellt. Um die Primer an die RNA

anzulagern, wurde der Reaktionsansatz 5min auf 25°C erwärmt. 30min lang polymerisierte die

RT bei 42°C in 5’-Richtung von den Primern ausgehend den komplementären Strang. Eine

Inaktivierung der RT erfolgte für 5min bei 85°C (Abbildung 2-4).

Tabelle 2-9: Pipettierschema für den cDNA-Synthese-Ansatz

* 1µg der in wässriger Lösung vorliegenden RNA ergibt zusammen mit Wasser 15µL. Der komplette Reaktionsansatz verwendet insgesamt 20µL. RNA: Ribonukleinsäure, DMPC: Dimethylpyrocarbonat.

Reagenz Volumen pro Ansatz Endkonzentration 5x iScript Reaction Mix 4µL 1x iScript Reverse Transkriptase 1µL Keine Angaben RNA Gemäß Konzentration* 1µg DMPC-H2O Ad 20µL -

25°C42°C

85°C

4°C5min

30min5min

Aufbewahrung

AnnealingTranskription

Inaktivierung der RT

2542°C

4°C



25°C42°C

85°C

4°C5min

30min5min

Aufbewahrung



2542°C

4°C



Abbildung 2-4: Programm der cDNA-Synthese

Diese schematische Darstellung der cDNA-Synthese stellt das verwendete Programm dar. min: Minute.

Die cDNAs wurden bei -20°C gelagert und ihre Qualität in einer RT-PCR mit einem Haushalts-

Gen, Glycerin-Aldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), überprüft (Abbildung 2-5).


35 Zyklen

95°C 95°C 57°C 72°C 72°C

4°C 5min 30 sec 30 sec 30 sec 10 min

Aufbewahrung

Abbildung 2-5: Programm der GAPDH-PCR

Die Qualitätsbestimmung der cDNA-Synthese erfolgte anhand einer PCR mit GAPDH-Primern. min: Minute, sec: Sekunde.

2.7.4 RT-PCR

Die Expression des jeweiligen Antigens wurde unter Verwendung der RT-PCR in MM- und

CTCL-Zelllinien und Geweben untersucht. Mittels der PCR ist es möglich, eine geringe

Kopienzahl eines DNA-Abschnittes zu amplifizieren. Hierzu werden spezifische Oligo-

Nukleotide/Primer, die im gewünschten Fragment liegen, verwendet. Ein PCR-Reaktionsansatz

enthielt die in Tabelle 2-10 aufgeführten Reagenzien.

Tabelle 2-10: Reaktionsansatz für die RT-PCR

Der 10x Reaktionspuffer enthält 160mM (NH4)2SO4, 670mM Tris HCl (pH 8,0), 15mM MgCl2 und 0,1% Tween 20. Das verwendete DMSO simuliert eine „Hot-Start“ PCR durch Einzelstrangstabilisierung. NTP: Nukleotidtriphosphat, DMSO: Dimethylsulfoxid, cDNA: „copy“ DNA.

Reagenz Volumen pro Ansatz Endkonzentration 10x Biotherm Reaktionspuffer 2,5µL 1x Biotherm Taq Polymerase 0,5µL 2,5U dNTP-Mix 0,5µL 0,8µM Forward Primer 1µL 1µM Reverse Primer 1µL 1µM DMSO 2,5µL 10% cDNA Gemäß Konzentration 0,1 - 1ng Aqua ad iniectabilia Braun Ad 25µL -

In Tabelle 2-11 sind alle Primer, die für die Expressionsanalyse verwendet wurden, aufgeführt.

Für jedes Primer-Paar wurde die Annealing-Temperatur mittels Gradienten-PCR optimiert. Bei

jedem PCR-Programm blieben die Denaturierung der doppelsträngigen cDNA bei 95°C, der

Syntheseschritt der Polymerase bei 72°C, die Zyklenanzahl (35) und der Salzgehalt (MgCl2)

unverändert (siehe Abbildung 2-2). Als Positivkontrolle diente entweder Testis cDNA oder

cDNA einer positiven Zelllinie, als Negativkontrolle wurde Aqua ad iniectabilia Braun

verwendet. Die PCR-Produkte wurden anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt, mit dem

Geldokumentationssystem visualisiert und im Vergleich zur DNA-Leiter analysiert.


Tabelle 2-11: In der RT-PCR verwendete Primer

Jede RT-PCR wurde mit einer Positivkontrolle (cDNA aus Testis oder einer positiven Zelllinie) und einer Negativkontrolle (Aqua ad iniectabilia Braun) in mindestens zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt. bp: Basenpaare, GAPDH: Glycerin-Aldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase.

Untersuchtes Antigen Forward Primer Reverse Primer Produkt-

länge Anlagerungs-Temperatur Referenz

GAPDH ccg ttt aca tgt tcc aat

atg att cca c tca tat ttg gca ggt ttt tct

aga c 638bp 57°C (Eichmuller et al. 2001)

GAGE-1,-2,-8 gac caa gac gct acg tag

(vde44) cca tca gga cca tct tca

(vde24) 244bp 56°C (De Backer et al. 1999)

GAGE-3 bis -7b

gac caa ggc gct atg tac (vv-1)

cca tca gga cca tct tca (vde24) 244bp 58°C

(De Backer et al. 1999)

2.7.5 RNA-Proben

Die Untersuchung der Expression erfolgte in umgeschriebener cDNA aus RNA-Proben von

Gewebe von 7 verschiedenen MM-Patienten, 5 CTCL-Zelllinien (Cou-L3, HH, HuT78, MyLa

und SeAx), 17 MM-Zelllinien (MeWo, MA-Mel-04, -05, -11, -12, -16, -21, -37b, -47, -52, SK-

Mel-023, UKRV-Mel-02, -06a, -14a, -21a, -27, -31), Keratinozyten (HaCat-Zelllinie) und

Melanozyten.

2.7.6 Herstellung von Dialyseschläuchen

20cm lange Stücke von Dialyseschläuchen mit einer Porengröße von 12-14kDa wurden 10min in

2% NaHCO3, 1mM EDTA pH 8,0 gekocht und anschließend in ddH2O gewaschen. Nach einem

weiteren Kochschritt für 10min in 1mM EDTA pH 8,0 konnten die in ddH2O gewaschenen

Schläuche in 20% EtOH bei 4°C bis zu ihrer weiteren Verwendung gelagert werden.

2.7.7 Rekombinante Expression von GAGE-7b als GST-Fusionsprotein

Für die Proteinexpression und Aufreinigung ausreichender Mengen rekombinanten Proteins zur

Herstellung von Antikörpern wurde der kodierende Abschnitt der cDNA von GAGE-7b in den

pGEX-4T-3tag-Vektor kloniert (siehe 2.6.1) und in BL21-Bakterien exprimiert (siehe 2.6.2). Die

somit erhaltenen 20mL Bakteriensuspensionen in 1x PBS konnten monatelang bis zu ihrer

weiteren Aufarbeitung bei –20°C gelagert werden.

2.7.8 Aufschluss der Bakterien

Die aufgetauten Bakteriensuspensionen wurden mittels French Press (siehe 2.6.2.2) oder mittels

Sonifizierung aufgeschlossen. Neben der Zugabe einer Protease Inhibitor Tablette pro 20mL

Suspension wurde dem Ansatz für die Sonifizierung Lysozym (50µg/mL), Triton-X-100

(0,002%), EDTA (0,1mM, pH 8,0) und DTT (1mM) zugegeben. Zunächst wurde die Suspension


in einen Dounce-Homogenisator überführt und mit 15 Hüben homogenisiert. Nach 15-maliger

Sonifizierung für 10sek wurde das Homogenisat einer 30-minütigen Zentrifugation bei

14.000UPM und 4°C, Rotor JA-17, unterzogen (geklärtes Lysat). Diese Zentrifugation folgte

ebenfalls auf den Aufschluss der Bakterienzellen in der French Press. Anschließend wurde das

geklärte Lysat durch einen Filter mit 0,8µm Porengröße von größeren Verunreinigungen geklärt.

2.7.9 Aufreinigung eines GST-Fusionsproteins an Glutathion Sepharose-Beads

Das rekombinant exprimierte GST-Fusionsprotein wurde über die Affinität der N-terminalen

Glutathion-S-Transferase zu Glutathion aufgereinigt und mittels reduziertem Glutathion eluiert

oder das Fusionsprotein abgespalten. Dabei wurde das Protein vom Großteil der E. coli-Proteine

befreit. Für eine Aufreinigung wurde Protein aus 3L Bakterienkultur verwendet, wobei ein Pellet

von 1,5L Bakterienkultur in 20mL 1x PBS aufgenommen wurde. Die Aufreinigung erfolgte

sowohl im Batch- als auch im Säulenverfahren.

Für das Batch-Verfahren wurden zunächst 3mL Glutathion Sepharose 4B (50% Beads in 20%

EtOH) bei 5000UPM für 10min, Rotor 2150, in einem 50mL Falconröhrchen zentrifugiert und

anschließend 2-mal mit 5 Säulenvolumina (SV) 1x PBS gewaschen. Die gewaschenen Beads

wurden in 2SV 1x PBS aufgenommen und ÜN bei 4°C auf einem Überkopfrotor mit dem

geklärten Lysat inkubiert. Am folgenden Morgen wurden die Glutathion Sepharose-Beads

abzentrifugiert (5000UPM, 10min, 4°C) und dreimal mit 7SV 1x PBS gewaschen, um

unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Anschließend wurde das GST-Fusionsprotein mit

1mL Elutionspuffer pro 1SV Glutathion Sepharose für 10min bei Rt, für 1h bei Rt und ÜN bei

4°C eluiert. Um reduziertes Glutathion des Elutionspuffers aus der Proteinlösung zu entfernen,

wurde sie ÜN bei 4°C gegen 1x PBS dialysiert. Das rekombinante Protein wurde in den Eluaten

mit dem anti-GST- und dem anti-tag-Antikörper im Western Blot detektiert.

Für das Säulenverfahren wurde eine Plastiksäule mit Glutathion Sepharose-Beads bis zu einem

Bettvolumen von 3mL gefüllt und mit 10-20SV 1x PBS bei einer Fließgeschwindigkeit von 2mL

pro min gewaschen, wobei der pH zwischen 6,5 und 7,4 lag. Das geklärte Lysat des GST-

Fusionsproteins wurde bei Rt dreimal mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5mL pro min über

die Säule gegeben. Um unspezifische Proteine zu entfernen, wurde die Säule mit 20 – 50SV 1x

PBS gewaschen, bis die OD bei 280nm im Photometer unverändert blieb und einen Wert knapp

über 0 ergab. Das gebundene GST-Fusionsprotein konnte anschließend unter Verwendung von

3SV Elutionspuffer eluiert werden oder der GST-Teil mittels Thrombin abgespalten werden.

Nach der Elution oder Abspaltung des jeweiligen Proteins wurden Reste an gebundenem GST-

Protein mit Elutionspuffer entfernt (sofern zuvor keine Elution durchgeführt wurde) und die


Glutathion Sepharose-Säule mittels 3SV 6M Guanidin-HCl, Buffer high und Buffer low von

ausgefallenen, verunreinigenden Proteinen befreit. Zwischen den jeweiligen Anwendungen

wurde intensiv mit 1x PBS gewaschen, um die Integrität der Beads zu gewährleisten. Die

wiederhergestellte Säule wurde in 20% EtOH bei 4°C gelagert und konnte für dasselbe Protein

wieder verwendet werden.

2.7.10 Abspaltung des GST vom Fusionsprotein

Die Abspaltung des GST-Moleküls vom Fusionsprotein erfolgte im Säulenverfahren. Nach der

Bindung des GST-Proteins an die Glutathion Sepharose-Beads und nachfolgenden

Waschschritten wurde die Säule, falls nötig, mit 3SV 1x PBS pH 7,4 äquilibriert bevor 1SV 1x

PBS pH 7,4 und 100U Thrombin auf die Säule gegeben wurden. Während der 2-stündigen

Inkubation bei Rt wurde die Säule alle 15min mit einer Pasteurpipette umgerührt, um zu

gewährleisten, dass das zugegebene Thrombin alle Thrombinschnittstellen zwischen dem GST-

Molekül und dem Fusionspartner erreicht. Am Ende der Inkubationszeit wurde das abgespaltene

Protein mit 3SV 1x PBS pH 7,4 in jeweils 3mL Aliquots eluiert, die bei –80°C gelagert wurden.

Das GST-Molekül sollte laut Hersteller an den Beads gebunden bleiben. Die

Proteinkonzentration der Aliquots wurde im Photometer bestimmt, da die Bradford-Methode für

diese Proteinkonzentrationsbestimmung zu ungenau war. Die Proteinkonzentration wurde nach

folgender Formel von Warburg-Christian unter Berücksichtigung der Absorption bei 280nm und

260nm berechnet:

Proteinkonzentration [mg/mL] = 1,45 x OD280nm – 0,74 x OD260nm

Anschließend wurde das abgespaltene Fusionsprotein auf seine Reinheit hin im Coomassie-Gel

und mittels Western Blot unter Verwendung der anti-GST- und anti-tag-Antikörper untersucht.

2.7.11 Ionenaustauschchromatographie

Da nach der Abspaltung des GST-Moleküls noch verunreinigende Proteine im Coomassie-Gel

sichtbar waren, war es nötig, die Proteinlösung weiter aufzureinigen. Dies war mittels einer

Ionenaustauschchromatographiesäule (MonoQ) möglich, weil der isoelektrische Punkt des

Zielproteins und des GST-Moleküls ausreichend weit auseinander lagen. Zunächst wurde die

Proteinlösung an das Säulenmaterial gebunden, um anschließend die mittels eines Salzgradienten

aufgetrennten Proteine nacheinander zu eluieren. Die Ionenaustauschchromatographie wurde in

der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Herwig Ponstingl unter der Anleitung von Jürgen Kretschmer

durchgeführt.


Zum Schutz der Proteine wurde die Chromatographie bei 4°C durchgeführt. Alle verwendeten

Puffer wurden mittels eines Filters von 0,45µm Porengröße filtriert, um die Funktionsfähigkeit

der HPLC-Anlage zu gewährleisten. Mit Puffer A wurde die Äkta-HPLC-Anlage gründlich

gespült, um Reste des Lagerungspuffers (20% EtOH) vollständig zu entfernen. Puffer B diente

der Elution der gebundenen Proteine mit einem Salzgradienten. Nach dem Spülen der Anlage

wurde die MonoQ HR 5/5-Säule luftblasenfrei bei einer Flussrate von 0,5mL/min angeschlossen.

Die Höhe der Säulenmatrix betrug 5cm, der Durchmesser 0,5cm. Die Säule wurde vor dem

Probenauftrag zweimal mit einem Salzgradienten über 15min eluiert, damit sich keine

Proteinreste mehr auf der Säule befanden. Anschließend wurde die Säule mit Puffer A

äquilibriert bis die Absorption bei 280nm konstant blieb. Zumeist wurden die ersten beiden

Elutionen nach der Abspaltung des Fusionsproteins von seinem GST-Partner für die

Ionenaustauschchromatographie herangezogen. Hierfür wurden diese Fraktionen 1:10 in Puffer

A verdünnt, um die Salzkonzentration auf ungefähr 15mM NaCl zu verringern. Die

Probenaufgabe erfolgte mit einer Flussrate von 0,5mL/min. Vor Beginn des Salzgradienten

wurden alle ungebunden Proteine in einem Waschgang mit Puffer A von der Säule entfernt.

Sobald kein ungebundenes Protein mehr von der Säule gewaschen wurde, begann die Elution der

an die Säule gebundenen Proteine durch einen Salzgradienten in 45min von 0,15M auf 1M NaCl.

Die Flussrate während des Salzgradienten betrug 1mL/min. Während des gesamten Laufs wurde

das Eluat in 1mL Fraktionen gesammelt. Der Gesamtproteingehalt wurde als Absorption bei

280nm gemessen und im Chromatogramm aufgezeichnet. In Coomassie-Gelen konnte die

Reinheit der Fraktionen bestimmt und über ihre Verwendung zur Immunisierung von Kaninchen

entschieden werden. Nach der Elution der Proteine wurde die Säule über 15min mit einer

Flussrate von 1mL/min von 1M auf 0M NaCl auf einen Waschgang mit Puffer A vorbereitet und

schließlich in Lagerungspuffer bei Rt gelagert.

2.7.12 Umpufferung von Proteinlösungen

Da die Proteinlösungen zumeist nicht in 1x PBS (nötig für die Immunisierung der Kaninchen)

oder aber zu gering konzentriert vorlagen, war ein Umpufferungsschritt nötig. Dieser wurde mit

NAPTM 5 Säulen (Sephadex G-25 DNA Grade) durchgeführt. Die 1mL Säulchen wurden

zunächst mit 10SV 1x PBS äquilibriert, um Reste des Lagerungspuffers zu entfernen und das

richtige Milieu zur Umpufferung zu schaffen. Im Anschluss wurde die in der SpeedVac auf ca.

500µL eingeengte Proteinlösung zur Proteinbindung auf die Säule gegeben. Der Durchfluss, der

keine Proteine enthalten sollte, wurde aufgefangen.. Schließlich wurden die Proteine mit 1mL 1x

PBS eluiert, die Säule mit 1x PBS gewaschen und unter 20% EtOH bei 4°C gelagert. Die Säule

konnte für dasselbe Protein wieder verwendet werden.


2.7.13 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of Flight (MALDI-TOF)

Nach der weitergehenden Aufreinigung des Proteins mittels Chromatographie und

entsprechender Umpufferung wurden die in Coomassie-Gelen sichtbaren Proteinbanden

ausgeschnitten und zur Bestätigung der Proteinidentität in der Arbeitsgruppe von Frau Dr.

Martina Schnölzer (Zentrale Proteinanalytik, DKFZ, Heidelberg) unter Verwendung der

MALDI-TOF Fingerprint-Technik analysiert. Die ausgeschnittenen Banden wurden mit Trypsin

verdaut und mit massenspektrometrischen Methoden identifiziert (Hofmann et al. 2002). Nach

einer „Post source decay fragmentation“ Analyse und anschließender Datenbanksuche konnten

die Proteine identifiziert werden.

2.7.14 Immunisierung von Kaninchen

Biogenes

Um die Expression von GAGE-7b auf Proteinebene zu untersuchen, wurden Antikörper gegen

das rekombinante GST-X-tag-Protein in Kaninchen generiert. Die beiden Proteine wurden nativ

mittels Glutathion Sepharose im Batch-Verfahren aufgereinigt und mittels reduziertem

Glutathion eluiert. Dieses wurde durch eine Dialyse gegen 1x PBS entfernt. Das Protein konnte

im Western Blot mit den beiden Antikörpern anti-GST und anti-tag detektiert werden, woraufhin

eine Immunisierung von 2 Kaninchen von der Firma Biogenes in Berlin durchgeführt wurde.

Mit 1mg Protein wurden 2 verschiedene Kaninchen immunisiert. Sowohl die Präimmun- als

auch die Antiseren wurden durch die Firma Biogenes im ELISA auf natürliche Reaktivitäten

gegen die Proteine oder das Vektorprotein und generierte Antikörper gestestet. In Tabelle 2-12

ist das Immunisierungsschema der Kaninchen dargestellt.

Tabelle 2-12: Immunisierungsschema der Firma Biogenes

Nach diesem Schema wurden zwei Kaninchen durch die Firma Biogenes immunisiert. GST: Glutathion-S-Transferase.

Antigen GAGE-7b Präimmunserum P5101 P5102 Antikörpername K5101 K5102 Protein Nativ GST-GAGE-7b-tag 0.Tag Immunisierung x x 7.Tag Boost x x 14.Tag Boost x x 28.Tag Boost/Blutung x / 25mL x / 25mL 35.Tag Blutung x / 25mL x / 25mL 70.Tag Boost x x 77.Tag Blutung 10mL 10mL


Das gelieferte Antiserum wurde mit 0,02% Thimerosal stabilisiert und bei –20°C gelagert. Die

Antiseren vom 77. Tag wurden zusätzlich viermal über eine Säule, an die GST-tag-Protein

gebunden war, aufgereinigt, um GST- und tag-Antikörper, die bei der Immunisierung

aufgetreten waren zu eliminieren.

Zentrales Tierlabor des DKFZ

Da die Immunisierung von Kaninchen mit rekombinantem GST-X-tag-Protein durch die Firma

Biogenes keine spezifischen Antikörper ergab und festgestellt wurde, dass der GST-Teil des

Fusionsproteins sehr immunogen ist, wurde zur Immunisierung von einem Kaninchen im

zentralen Tierlabor des DKFZ abgespaltenes GAGE-7b-tag-Protein verwendet. Das Protein lag

in 1x PBS und steril (Sterilisierung durch Gamma-Strahlung) vor. Das Immunisierungsschema

kann Tabelle 2-13 entnommen werden. Immunisierungen erfolgten sowohl subkutan in den

Rückenbereich des Kaninchens als auch intravenös in die Ohrvene.

Tabelle 2-13: Im Zentralen Tierlabor des DKZF verwendetes Immunisierungsschema

Nach diesem Schema wurde ein Kaninchen im zentralen Tierlabor des DKFZ immunisiert.

Antigen GAGE-7b Präimmunserum P80 Antikörpername K80 = anti-GAGE-7b Protein Nativ, abgespalten GAGE-7b-tag 0.Tag Immunisierung 750µg subkutan 28.Tag 1. Boost 400µg subkutan

300µg intravenös 38.Tag bzw. 39.Tag Blutentnahme 15mL 45.Tag bzw. 40.Tag Ausblutung 105mL = 57mL Serum

Vor jeder Immunisierung wurden aus einer Ohrvene ca. 15mL Blut entnommen, das nach seiner

Gerinnung für 10min bei 2500UPM, Rotor 2150, zentrifugiert wurde, um Serum zu erhalten. Zur

Verstärkung der Immunreaktion auf das Fremdprotein wurden bei der Immunisierung 750µg

GAGE-7b-tag-Protein 1:2 mit komplettem Freund’schen Adjuvans vermischt und subkutan

injiziert. Um die Immunreaktion des Kaninchens zusätzlich zu boosten, wurden nach 28 Tagen

400µg GAGE-7b-tag-Protein in einer 1:2 Verdünnung mit inkomplettem Freund’schen Adjuvans

subkutan und 300µg reines Protein in die Ohrvene appliziert. Ein ausreichend hoher Titer an

Antikörpern wurde für das Kaninchen nach dem 1. Boost nachgewiesen, so dass das Kaninchen

ohne weiteren Boost ausgeblutet werden konnte.

2.7.15 ELISA

Zur Evaluierung der Kaninchenseren zu verschiedenen Zeitpunkten während der Immunisierung

wurde ein ELISA durchgeführt (siehe 2.6.4). Soweit nicht anders erwähnt wurden 100µL


Lösung pro Loch verwendet, und alle Inkubationsschritte erfolgten für 1h bei 37°C. Eine ELISA-

96 Lochplatte wurde ÜN bei 4°C oder 1h bei 37°C mit 0,5µg aufgereinigtem, rekombinantem

Protein in 1x PBS beschichtet. Nach dem dreimaligen Eintauchen der Platte in eine mit PBS-T

gefüllte Plastikwanne und dem Ausklopfen auf einem Papierhandtuchstapel (Waschschritt)

wurden unspezifische Bindungsstellen mit 0,2% Casein in 1x PBS (180µL pro Loch) blockiert.

Das Serum wurde in einer Verdünnungsreihe in 1x PBS mit der Platte inkubiert. Als

Negativkontrolle wurde 1x PBS verwendet. Auf jeweils einen Waschschritt folgte die Inkubation

der Platte mit Ziege anti-Kaninchen Sekundärantikörper (1:10.000 in 1x PBS) und die

Farbreaktion mit TMB und H2O2 in Substratpuffer. Nach 5- bis 8-minütiger Inkubation der Platte

im Dunkeln wurde die Reaktion bei entsprechender Färbung mit Schwefelsäure gestoppt. Die

Extinktion bei einer Wellenlänge von 450nm wurde in einem ELISA-Lesegerät gemessen.

2.7.16 Aufreinigung von Antikörpern aus Kaninchenantiserum

Um polyklonale, monospezifische Antikörper zu erhalten, wurde eine Aufreinigung der

Antikörper aus dem Antiserum mittels NHS-aktivierter Sepharose durchgeführt. Zunächst

wurden NHS-aktivierte Sepharose-Säulen entweder mit GST-tag-Protein oder mit Protein, das

zur Immunisierung verwendet wurde, beladen. Anschließend wurde das Antiserum zunächst

über die GST-tag-Säule aufgereinigt, um unspezifische GST- oder tag-Antikörper zu entfernen.

Der Durchfluss dieser ersten Aufreinigung wurde im Anschluss für die Aufreinigung der

spezifischen Antikörper mittels einer Säule, an die das zur Immunisierung verwendete Protein

gebunden war, benutzt. Die Säule wurde während der gesamten Prozedur manuell bei Rt

betrieben. Nach der Elution der spezifischen Antikörper von der 2. Säule wurde die

Konzentration der Antikörperlösung bestimmt und die Lösung ÜN bei 4°C gegen 0,3M NaCl

dialysiert. Aliquots der dialysierten Antikörperlösung wurden bei –80°C gelagert.

2.7.16.1 Herstellung einer NHS-aktivierten Sepharose-Säule

Zunächst wurde eine Plastiksäule bis zu einem Bettvolumen von 0,5mL mit NHS-aktivierten

Sepharose-Beads gefüllt. Um das Säulenmaterial zu aktivieren wurden die Beads 3x 2min mit

2SV eiskalter 1mM HCl gespült und mit 10SV Kopplungspuffer äquilibriert. Das zu bindende

Protein wurde 1:2 mit Kopplungspuffer verdünnt oder ÜN gegen den Kopplungspuffer dialysiert

und in 2-3SV mit den Beads für 1h inkubiert, wobei die Säule alle 15min umgerührt wurde.

Ungebundenes Protein wurde in 6SV Kopplungspuffer am Ende der Inkubationszeit aufgefangen

und für die Bestimmung der Kopplungseffizienz zurückgehalten. Im Anschluss wurde die Säule

abwechselnd mit 3x 2SV NHS-Puffer A und NHS-Puffer B je dreimal gewaschen. Eine

Inkubation mit Puffer A war für 30min als mittlerer Waschschritt erforderlich. Nachdem das


Protein durch die unterschiedlichen Waschschritte fest an die Beads gebunden war, wurde die

Säule mit 40SV Bindungspuffer für die Bindung der Antikörper aus dem Antiserum äquilibriert.

Zur Lagerung wurde die Säule bei 4°C unter 20% EtOH aufbewahrt. Die Kopplungseffizienz der

Säule wurde wie folgt berechnet:

%100A

BAEffizienz

−=

wobei A = OD280 vor x VolumenProteinlösung vor

B = OD280 nach x VolumenProteinlösung nach x Verdünnung

2.7.16.2 Antikörper-Aufreinigung aus Kaninchenantiserum

Die NHS-aktivierte Sepharose-Säule mit dem jeweils gebundenen Protein wurde mit 40SV

Bindungspuffer äquilibriert. Das 1:2 mit Bindungspuffer verdünnte Kaninchenantiserum wurde

dreimal mit einer Flussrate von 1mL/min über die Säule gegeben. Um die Bindungen zwischen

den Proteinen und Antikörpern zu festigen, wurde die Säule 1h lang mit dem Serum inkubiert.

Anschließend wurde die Säule mit bis zu 100SV NHS-Waschpuffer gewaschen, bis die OD280nm

einen konstanten Wert knapp über 0 erreicht hatte. Die Säule wurde mit NHS-Elutionspuffer für

5min inkubiert und die Antikörper in 1mL Aliquots eluiert. Nach der Bestimmung der

Proteinkonzentration wurden die Peakfraktionen gepoolt und ÜN bei 4°C gegen den NHS-

Waschpuffer dialysiert. Nach der Antikörper-Elution wurde die Säule mit Bindungspuffer

äquilibriert und unter 20% EtOH bei 4°C gelagert.

2.7.17 Bestimmung von Antikörpern in Serum mittels Western Blot

Um Antikörper in Serum von Patienten und Kontrollpersonen mittels Western Blot zu

detektieren, wurde zunächst eine SDS-PAGE mit dem rekombinanten, aufgereinigten Protein

durchgeführt. Pro Spur wurden 1-2µg Protein aufgetragen (siehe 2.6.3). Das Protein wurde

mittels Western Blot auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und 1,5h mit 5% Milchpulver

(w/v) in 1x PBS-T blockiert. Die Inkubation der 1:50 in 1xPBS verdünnten Seren mit schmalen

Membranstreifen erfolgte ÜN bei Rt in Costar Cluster Tubes, speziellen Serumröhrchen. Nach

der Inkubation der Membranstreifen mit sekundärem, Esel anti-humanem Antikörper (1:10.000

in 0,5% Milchpulver (w/v) in 1x PBS-T) für 1h bei Rt wurden die gebundenen Serumantikörper

mittels DAB (3mg/mL 1x PBS) als braune Banden visualisiert.


2.7.18 Western Blot

Die Analyse der Proteinexpression erfolgte unter Verwendung der generierten Antikörper mittels

Western Blot. Die Methode wurde wie unter 2.6.3 beschrieben durchgeführt. Pro Spur wurden

40µg Protein aus Normalgewebe aufgetragen und gleiche Volumina (20µL) an Proteinlösung,

die aus Zellpellets (1x 106 Zellen) von Zelllinien isoliert wurde.

2.7.18.1 Proteinisolierung

Zellpellets aus 1x 107 Zellen wurden in 200µL 0,1% Trition-X-100 lysiert und 20min auf Eis

inkubiert. Durch Zugabe von 200µL 50mM Tris-HCl pH 7,5 wurden bei einer anschließenden

Zentrifugation (13.000UPM, 10min, 4°C) unlösliche Zellbestandteile gefällt. Das Protein befand

sich im Anschluss im Überstand und konnte für weitere Experimente verwendet werden.

2.7.18.2 Proteinproben

Mit den generierten Antikörpern wurde Protein von Normalgeweben der Firmen Clontech, Palo

Alto, USA (Brustdrüse, Haut, Leber, Magen, Milz, Plazenta, Testis, Thymus und Uterus) und

BioCat, Heidelberg, D (Gehirn, Knochenmark, Kolon, Luftröhre, Skelettmuskulatur und

Prostata) untersucht. Zudem wurde Protein von Zelllinien, Keratinozyten, Melanozyten und

MM-Patienten (siehe 2.7.5) verwendet.

2.7.19 Immunhistologie

Die immunhistochemische Färbung von Zellen mit Antikörpern dient der Proteinlokalisation in

der Zelle. Färbungen wurden sowohl an Zytospins von Tumorzelllinien, Keratinozyten und

Melanozyten (siehe 2.7.5) als auch an Paraffinschnitten von Testis, normaler Haut und 40 MM-

Patienten durchgeführt.

2.7.19.1 Zytospins

Zytospins wurden unter Verwendung einer Zytospin-Zentrifuge mit passenden Einsätzen

hergestellt. 100µL Zellsuspension wurde mit einer Zellzahl von ungefähr 1x 106 Zellen/mL in

Halterungen gegeben, die auf Objektträger aufgebracht und für 4min bei 700UPM zentrifugiert

wurden. Überschüssige Zelllösung wurde mit Hilfe von in die Halterung eingepasstem

Filterpapier entfernt. Anschließend wurden die Objektträger mit den aufzentrifugierten Zellen für

15min bei Rt in 3,7% Formaldehyd fixiert. Diese Fixierung gewährleistete eine Lagerung über

längere Zeit bei -20°C.


Die Zytospins wurden nach dem Auftauen 10min in eiskaltem Aceton fixiert und anschließend

5min in 10mM Citratpuffer pH 6,0 in der Mikrowelle bei 350Watt aufgekocht. Nach dem

Abkühlen wurden die Zellhaufen mit einem DakoCytomation Stift umrandet und 3x 2min in 1x

PBS gewaschen. Danach liefen alle Schritte in einer Feuchtkammer bei Rt ab, wenn nicht anders

erwähnt. Unspezifische Avidin- oder Biotin-Bindungen wurden durch eine je 15-minütige

Inkubation mit Avidin D- und Biotin-Lösung des Avidin/Biotin blocking Kits blockiert. Ein

weiterer Blockierungsschritt folgte nach einem Waschschritt von 3x 5min in 1xPBS. Die

Präparate wurden mit 5% Ziegenserum in 1x PBS für 30min blockiert, um die Bindung von

unspezifischen Antikörpern zu unterbinden. Der Primärantikörper (GAGE-7b 2µg/mL) wurde in

1% Ziegenserum ÜN mit den Zytospins inkubiert. Als interne Kontrolle wurde anstatt des

Primärantikörpers 5% Ziegenserum und als Negativkontrolle wurde Präimmunserum verwendet.

Nach einem erneuten Waschschritt (3x 5min, 1x PBS) wurde der Sekundärantikörper des ABC-

Systems in 10% Ziegenserum für 30min bei 37°C mit den Zellen inkubiert. Dieser

Sekundärantikörper erkennt Kaninchenantikörper und ist Biotin-gekoppelt. Das Avidin und die

Biotin-gekoppelte, AP des „AP Rabbit“ IgG ABC Kits wurden nach Angaben des Herstellers

angesetzt. Nach einem Waschschritt erfolgte eine 30-minütige Inkubation mit dem 30min zuvor

angesetzten Reagenz. Nach erneutem Waschen wurden die Proben kurz mit Tris-HCl pH 8,5

abgespült, um den richtigen pH für die anschließende Färbung herzustellen. Diese erfolgte

mittels des AP-Substrat-Kits für 10-30min nach Herstellerangaben. Die gefärbten Zytospins

wurden nach 3x 5min Waschen in 1x PBS und H2O mit Hämatoxylin für 5-10min gegengefärbt

und durch fließendes Wasser gebläut. Zur Konservierung wurden die Zytospins mit Histogel

eingedeckt.

2.7.19.2 Paraffinschnitte

Gewebeschnitte von MM-Patienten, Testis und normaler Haut wurden in 4% Formaldehyd

fixiert, dehydriert und in Paraffin eingebettet. Zu Beginn der immunhistologischen Untersuchung

wurden die Paraffinschnitte für 3x 5 min in 100% Xylol inkubiert, um das Paraffin zu entfernen.

Anschließend wurden die Schnitte in einer absteigenden Ethanol-Reihe (100%, 96%, 80%)

rehydriert. Die nachfolgenden Inkubationsschritte wurden entsprechend des Protokolls der

Zytospins durchgeführt. Die Konzentration des Primärantikörpers GAGE-7b betrug 0,4µg/mL.

2.7.20 Zellkultur

Um Kontaminationen mit Bakterien, Hefen oder Pilzen zu vermeiden, wurden alle Arbeiten mit

Zelllinien unter einer sterilen Werkbank und mit sterilen Medien und Arbeitsmaterialien

durchgeführt. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, das 1% Penicillin/Streptomycin, 2%


L-Glutamin und 10% Fetales Kälberserum (Vollmedium) enthielt, bei 37°C und 5% CO2

kultiviert. Da die meisten Melanomzelllinien adherente Zellen sind, wurden sie zur

Subkultivierung mit Trypsin/EDTA behandelt. Alle CTCL-Zelllinien sind Suspensionszellen, so

dass sie durch Zentrifugation (900UPM, 10min, 15°C) und anschließender Aufteilung

subkultiviert werden konnten. Die Zelllinie HaCat wurde ebenfalls in Vollmedium kultiviert,

dessen Basismedium jedoch aus DMEM bestand. Melanozyten wurden in Melanocyte Growth

Medium, das mit SupplementMix supplementiert wurde, kultiviert. Um die Zellzahl zu

bestimmen wurde der automatische Zellzähler Casy verwendet.

ERGEBNISSE 74

3 ERGEBNISSE

Ziel dieser Arbeit war es zum Einen, die Häufigkeit von Serumantikörpern bei Tumorpatienten

und Kontrollpersonen gegen eine Vielzahl von Antigenen zu bestimmen und zu vergleichen. Die

auf dieser Basis gewonnenen Daten sollten zur Bewertung der Verwendung von spezifischen

Serumantikörperantworten in Diagnostik, Monitoring und Prognostik dienen. Zum Anderen

wurde ein Cancer Testis Antigen (CTA), GAGE-7b, näher charakterisiert.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Serumantikörperantwort gegen zahlreiche Tumorantigene,

die zuvor in der Arbeitsgruppe identifiziert worden waren, untersucht. Zunächst wurde ein

Serumantikörper-Detektionsarray (SADA) etabliert, der auf der „Serological analysis of

recombinantly expressed copy deoxyribonucleic acid (cDNA) clones“ (SEREX)-Methode

basiert. Hiermit wurden zahlreiche Seren von kutanen T-Zell Lymphom (CTCL), malignes

Melanom (MM) Patienten und von Kontrollen (Ctrl) auf ihre Reaktivität gegen 42

Tumorantigene gestestet. Ein zweites System zur Bestimmung der Seroreaktivität gegen

ausgewählte Tumorantigene stellt die Multiplex-Serologie dar, die von Dr. Tim Waterboer in der

Arbeitsgruppe (AG) von Dr. Michael Pawlita am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ)

für virale Antigene entwickelt wurde. Sieben CTA, drei Tumor-assoziierte Antigene (TAA) und

zwei Tumorsuppressorgene wurden in diesem System auf ihre Serumantikörperantwort in

CTCL-, MM-Patienten und Ctrl untersucht. Vier virale Antigene wurden als interne Kontrolle

zur Zuordnung von Seren zu Patienten mitgeführt, da sich für diese Antigene kaum

Schwankungen in der Serumantikörperantwort über die Zeit ergeben. Schließlich wurde ein

polyklonaler Antikörper gegen das CTA GAGE-7b hergestellt, um dieses auf Proteinebene im

CTCL und MM zu charakterisieren.

Im folgenden sollen zunächst die Ergebnisse, die unter Verwendung der SADA-Methode

erhalten wurden, dargestellt werden, gefolgt von den mit der Multiplex-Serologie generierten

Daten, und abschließend sollen die Ergebnisse zur Charakterisierung von GAGE-7b beschrieben

werden.

ERGEBNISSE 75

3.1 SADA

Da es die SEREX-Methode nur erlaubt, ein Serum mit einem Klon zu testen, wurde auf ihrer

Grundlage und in Anlehnung an Arbeiten von M. Scanlan (Scanlan et al. 2001; Scanlan et al.

2002) die SADA-Methode etabliert. Sie ermöglicht die parallele Bestimmung von

Serumantikörperantworten eines Serums gegen mehrere Antigene. Es wurden 100 Seren von

CTCL-Patienten, 18 Seren von MM-Patienten und 100 Seren von Ctrl auf ihre Reaktivität gegen

42 Antigene getestet.

3.1.1 Aufbau des SADA

Zwei Membranen mit jeweils unterschiedlichen Antigenen wurden hergestellt, die stets eine

Positivkontrolle (Membran1: PINCH, Membran 2: UVEAL Autoantigen (UACA)) und eine

Negativkontrolle (blauer Phage ohne Insert im Vektor) aufwiesen. Auf Membran 1 befanden sich

20 verschiedene Antigene und auf Membran 2 waren 22 unterschiedliche Antigene angeordnet,

die in früheren SEREX-Screens an einer Lymphom-, Testis-, Zelllinien- und Melanom-

Phagenbank identifiziert wurden (siehe Tabelle 2-4). Eine positive Antikörperreaktion wurde

einem Antigen zugeordnet, wenn die Reaktion dieses Antigens auf der Membran eindeutig

stärker violett war als die der Negativkontrolle. Jedes Antigen war als Duplikat auf jeder

Membran gespottet, und jedes Serum wurde zweimal getestet. Eine positive Seroreaktivität

wurde nur gewertet, wenn bei beiden Versuchen eine Positivität aller 4 zusammengehörender

Plaques vorhanden war. Kam es zu unstimmigen Ergebnissen wurde das Serum ein drittes Mal

getestet und bei positiven Ergebnissen auf zwei der drei Membranen als positiv sonst als negativ

gewertet.

3.1.2 Eigenschaften der ausgewählten Antigene

Die im SADA verwendeten Antigene wurden anhand ihrer serologischen Reaktivität in

sekundären SEREX-Experimenten, der Ergebnisse im virtuellen Northern und ihres

Zusammenhangs mit Krebserkrankungen laut Literatur ausgewählt (Eichmuller et al. 2001;

Ehlken et al. 2004; Fellenberg et al. 2004; Hartmann 2004; Hartmann et al. 2004). In Tabelle 3-1

sind die Expression der Antigene auf „messenger“ Ribonukleinsäure (mRNA)-Ebene sowie

wichtige Eigenschaften aus aktueller Literatur und Datenbanken (NCBI, Entrez Gene, Swiss-

Prot) dargestellt.

ERGEBNISSE 76

Tabelle 3-1: mRNA Expression und Eigenschaften der SADA-Antigene

Diese Tabelle beschreibt die Expression auf mRNA-Ebene (D: Differentiell, Ub: Ubiquitär, CTA: Cancer Testis Antigen) und Eigenschaften des jeweiligen Antigens. mRNA: „Messenger“ Ribonukleinsäure, GBP: Guanylat-bindendes Protein, GTP: Guanosintriphophosphat, GDP: Guanosindiphosphat, GMP: Guanosinmonophosphat, PBMC: Periphere Blut mononukleäre Zellen, CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, MM: Malignes Melanom, PARD3: „Partitioning defective 3 homolog“, KRAB: Krüppel-assoziierte Box, MAGE: Melanom Antigen, DPK: “Dendritic cell derived protein kinase”, ERK: Extrazelluläre regulatorische Proteinkinase, JNK: c-Jun N-terminale Kinase, SAPK: Stress-aktivierte Proteinkinase, DNEL-2: “Dynein heavy chain”, PAX9: “Paired Box 9”, BF-1: „Brain factor 1“, EST: „Expressed sequence tag“, RAP: Retinoblastom-assoziiertes Protein, DNA: Desoxyribonukleinsäure, NFκB: Nukleärer Faktor kappa B, P-TEPb: Positiver transkriptioneller Elongationsfaktor b, BRCA1: „Breast Cancer 1“, BAX: B-Zell Leukämie/Lymphom 2 (BCL2)-assoziiertes X Protein, LAR: „Leukocyte antigen-related“, EEF1A1: Eukaryotischer Translations-Elongationsfaktor 1 alpha 1, PTI-1: Prostata Tumor-induzierendes Gen 1, NFATC3: Nukleärer Faktor von aktivierten T-Zellen 3, AP-1: Aktivierungsprotein-1, HIV-1: Humanes Immundefizienz Virus Typ 1, FHL2: Vier-und-ein-halb LIM Protein 2, NP220: Nukleäres Protein 220, HPV: Humanes Papillomavirus, MAP2: Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2.

Antigen, homologes Gen mRNA Expression Eigenschaften GBP-5a, GBP-5ta (HD-CL-05) D - GBPs sind große GTPasen, die GTP, GDP und GMP binden und die Hydrolyse von GTP zu GDP und

GMP katalysieren. - In Normalgeweben werden beide Varianten auf Proteinebene nur in PBMC exprimiert. - GBP-5ta wird in CTCL-Tumorgewebe exprimiert. - Mehrere CTCL- und MM-Zelllinien exprimieren beide GBP-Varianten. - In CTCL-Zelllinien nicht durch Interferon induzierbar. - Isoprenylierungsregion bei GBP-5ta nicht vorhanden, da die letzten 97 Aminosäuren im Vergleich zu

GBP-5a/b fehlen. pGAGEt, GAGE-3 (Van den Eynde et al. 1995; Cheung et al. 1999; Zambon et al. 2001)

CTA

- Multigenfamilie, die in Normalgeweben nur in Testis und in zahlreichen Neoplasien exprimiert wird. - Abgesehen von GAGE-1 unterscheiden sich die Familienmitglieder nur durch einzelne

Nukleotidsubstitutionen. - Alle Familienmitglieder besitzen das Epitop zur Erkennung durch zytotoxische T-Zellen. - GAGE Expression ist mit schlechter Prognose in MM und Ösophaguskarzinom korreliert. - Am N-terminalen Ende um 25 Aminosäuren verkürzt (pGAGEt = pGAGE „truncated“). se1-1, GCC2 (Luke et al. 2003) Ub - GCC2 ist ein peripheres Membranprotein mit Verbindung zum Trans-Golgi-Netzwerk. - GCC2 ist Brefeldin A-sensitiv. - se1-1 fehlt eine GRIP-Domäne gegenüber dem homologen Gen. - se1-1 ist ein überexprimiertes Tumorantigen in Zelllinien und mögliches Onkogen. se2-1, SCP1 (de Vries et al. 2005; Neumann et al. 2005) CTA - Teil des synaptonemalen Komplexes, der für die korrekte Paarung der homologen Chromosomen

während der Meiose wichtig ist. - Expression in vielen verschiedenen Neoplasien. - Sycp1-Null Mäuse sind unfruchtbar. - Antikörperantworten und ein Epitop, das von dendritischen Zellen präsentiert wird, sind bekannt.

ERGEBNISSE 77

Antigen, homologes Gen mRNA Expression Eigenschaften se2-5, PARD3ta (Joberty et al. 2000) Ub - Im Vergleich zu PARD3 fehlt PARD3ta die erste der 3 PDZ-Domänen. - PARD3 ist an der Signaltransduktion während der asymmetrischen Zellteilung und polarisiertem

Wachstum beteiligt. - Par6 verbindet Par3 und atypische Proteinkinase C mit Cdc42, wobei dieser Komplex für die Bildung

von normalen epithelialen „Tight junctions“ an epithelialen Zell-Zell-Kontakten wichtig ist. - Differentielles Spleißen führt zu maligner Überexpression. - PARD3ta ist ein mögliches Onkogen. HD-CL-12, ZNF195 (Hussey et al. 1997) Ub - ZNF195 ist ein DNA-bindendes Protein, das möglicherweise die Regulation der Transkription

beeinflusst. Die ca. 75 Aminosäuren zählende Krüppel-assoziierte Box (KRAB)-Domäne ist eine potente Repressionsdomäne, die abhängig von der DNA-Bindung ist.

- HD-CL-12 fehlt die N-terminale Krüppel-assoziierte Box (KRAB)-Domäne. - ZNF195 enthält zahlreiche Cystein-Histidin-ähnliche Zinkfinger, die ein Zinkion binden können. pMAGE-A9ag, MAGE-A9 (De Plaen et al. 1994; Serrano et al. 1999) CTA - Den 12 Mitgliedern der MAGE-A-Multigenfamilie ist die MAGE-Domäne gemeinsam. - Expression in zahlreichen Tumorentitäten und in Normalgewebe nur in Testis und Plazenta, jedoch

geringer im Vergleich mit anderen MAGE-A Genen. cTAGE-1 (Usener et al. 2003b) CTA - Nur in der gesunden Testis und in zahlreichen Neoplasien (CTCL, Kopf-Hals-Karzinome) exprimiert. - Serumantikörperantwort in CTCL-Patienten beschrieben. cTAGE-5a (Usener et al. 2003b) CTA - Wird auf Proteinebene nur in der gesunden Testis und in zahlreichen Neoplasien (CTCL, MM,

Brusttumore) exprimiert. - Serumantikörperantwort in CTCL-Patienten beschrieben. se20-7, GOLGA4 (Kooy et al. 1992; Funaki et al. 1996) Ub - GOLGA4 ist ein peripheres Membranprotein, das mit dem Trans-Golgi-Netzwerk verbunden ist. - GOLGA4 besitzt möglicherweise eine Funktion im vesikulären Transport vom trans-Golgi-Apparat. - Autoantigen, Autoantikörper im Serum von Patienten mit Sjoegren Syndrom und Hepatitis B. - GOLGA4 besitzt eine GRIP-Domäne. du20-10L4, CKAP2 (Maouche-Chretien et al. 1998; Bae et al. 2003) Ub - CKAP2 ist ein mögliches Lymphozyten-spezifisches Differenzierungsantigen. - Erhöhte Expression von CKAP2/se20-10 in primären Magen-Adenokarzinomen und CTCL. HD-CL-04, KIAA0555 D - KIAA-Gene kodieren für große Proteine aus Gehirngewebe. - Funktion ist noch unbekannt. HD-CL-03, retSDR2 (Brereton et al. 2001; Chai et al. 2003) Ub - In vitro wandelt retSDR2 Androstan-3-alpha und 17-beta-diol in Androsteron um. Dies lässt eine Rolle

im Androgenmetabolismus während der Steroidgenese vermuten. - HD-CL-03 ist ein Tumor-assoziiertes Antigen im CTCL. - Hohe Expression von retSDR2 in Zellen mit Steroidmetabolismus. - Hohe Expression von RetSDR2 in Retina, Pankreas, Niere, Leber, Lunge, Dünndarm, Gebärmutter etc. HD-CL-09, DPK Ub - HD-CL-09 weist einen Verlust der ersten 300 Aminosäuren im Vergleich zu DPK auf. - DPK verhindert die basale Aktivität der Jun Kinase. - Epidermaler Wachstumsfaktor wirkt als negativer Regulator auf DPK. - Bei Überexpression von DPK kann eine Aktivierung von ERK1/ERK2 und JNK/SAPK erfolgen. - Regulierung von Transkriptionsfaktoren für Proliferation, Transformation, Differenzierung durch DPK. - Hohe Expression in peripheren Blutleukozyten, Thymus, Milz, Niere, Skelettmuskel, Herz und Leber.

ERGEBNISSE 78

Antigen, homologes Gen mRNA Expression Eigenschaften HD-MM-01, DNEL-2 (Milisav und Affara 1998) D - DNEL-2 kodiert für die schwere Kette des Dyneins, welches einen Mikrotubulus-assoziierten Motor-

Protein-Komplex darstellt, der vor allem für die Bewegung von Flagellen und Spermien zuständig ist. - Zusammenhang mit Infertilität bei Männern wird vermutet, da DNEL-2 in Testis exprimiert ist. - DNEL-2 könnte im Kartagener Syndrom eine Rolle spielen. HD-MM-02, PLU-1 (Tan et al. 2003) CTA - Expression in Tumorgewebe von Brustkrebspatienten, Brustkrebs- und Melanomzelllinien. - PLU-Domäne ermöglicht Bindung zweier Transkriptionsfaktoren („Paired Box 9“ (PAX9) und „Brain

factor 1“(BF-1)) und somit die Unterdrückung der Transkription. - Im Mausmodell spielen Plu-1-Bf-1/Pax9 eine wichtige Rolle in der Embryogenese. - PLU-1-PAX9 Proteininteraktionen könnten eine Rolle in der Brutskrebsentwicklung spielen. - Zelluläre und humorale Immunantworten gegen PLU-1 sind beschrieben. HD-MM-03, Rbbp2h1a Ub - Rbb2h1a ist identisch zu PLU-1, besitzt jedoch ein längeres 5’-Ende (1080bp). - Interaktionspartner des Retinoblastom-Proteins. - Serumantikörperantworten gegen HD-MM-03 und HD-MM-02 lassen sich vermutlich kaum

unterscheiden, da die Proteine eine sehr hohe Homologie aufweisen. se57-1 D - Homologes EST, welches durch den respiratorischen Syncytialvirus induziert wird. - Möglicher Entzündungsmarker. se89-1, RAP140 D (?) - se89-1 weist einen Verlust von 178 Aminosäuren N-terminal im Vergleich zu RAP140 sowie ein

Fehlen von 20 Aminosäuren in der kodierenenden Sequenz auf. - Funktion ist noch unbekannt. HD-MM-48, RIF1 Variante 2 (Silverman et al. 2004) Ub - In der S-Phase ist RIF1 als Reaktion auf DNA-Schädigung wichtig für die Hemmung der

Zellzyklusprogression. - In der Telophase ist RIF1 an kondensierten Chromosomen und in der Anaphase an Mikrotubuli der

mitotischen Spindel lokalisiert. - Expression von RIF1 in Sertoli-Zellen, frühen primären Spermatozyten und Oozyten sowie

embryonalen Stammzellen. Verlust der Expression während der Zelldifferenzierung. HD-MM-08, HEXIM-1 (Ouchida et al. 2003; Stone et al. 2003; Wittmann et al. 2003; Michels et al. 2004)

Ub

- HEXIM-1 ist ein Inhibitor des Transkriptionsfaktors NFκB und primärer Bindungspartner des Transkriptionsfaktors positiver transkriptioneller Elongationsfaktor b (P-TEPb), der eine wichtige Rolle in der globalen Kontrolle des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung spielt.

- Hemmung der Brustkrebszellproliferation durch HEXIM-1. - HEXIM-1 Expression ist in Brustkrebsgewebe erniedrigt, und Östrogene erniedrigen die HEXIM-1

Expression. - HEXIM-1 ist ein intronloses Gen, das im Nukleus lokalisiert ist. - Hexamethylen-bis-Acetamid-induzierte Expression in vaskulären glatten Muskelzellen. - Lokalisation von HEXIM-1 auf Chromosom 17q21 in einer Region mit Her2/neu und BRCA1. HD-MM-16, Humanin (Hashimoto et al. 2001a; Hashimoto et al. 2001b; Tajima et al. 2002; Guo et al. 2003)

Ub

- Humanin verhindert als neuroprotektiver Faktor den durch Gene der familiären Alzheimer-Erkrankung und beta-Amyloid bedingten Zelltod von Neuronen.

- Humanin verhindert die Translokation von BAX vom Zytosol zu den Mitochondrien. - Humanin ist hoch homolog zur 16S mitochondrialen ribosomalen RNA. - Hohe Expression von Humanin (24 Aminosäuren) in Herz, Skelettmuskel, Niere und Leber sowie

geringere Expression in Gehirn und Gastrointestinaltrakt.

ERGEBNISSE 79

Antigen, homologes Gen mRNA Expression Eigenschaften HD-MM-19, ZNF133 (Margolin et al. 1994; Heiskanen et al. 2000) Ub - ZNF133 ist ein Transkriptionsfaktor der Zinkfingerprotein-Familie. - ZNF133 enthält eine KRAB-Domäne mit beiden Subdomänen (A und B) am N-Terminus. - Es konnte eine erhöhte ZNF133 Expression in einer Neuroblastomzelllinie nachgewiesen werden. HD-MM-23, LAR-interagierendes Protein 1a/b (Serra-Pages et al. 1995; Serra-Pages et al. 1998)

Ub

- Zugehörigkeit zur Familie der LAR Protein Tyrosin Phosphatase-interagierender Proteine (alpha-Liprine).

- LAR transmembrane Protein Tyrosin Phosphatasen sind wichtig in der Führung von Axonen und der Entwicklung von Brustdrüsen.

- LAR-interagierendes Protein 1a/b spielt eine Rolle in Zell-Matrix-Kontakten und der Adhesions-vermittelten Signaltransduktion.

HD-CL-02, Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase (Laxminarayan et al. 1994) Ub - Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase ist das hauptsächliche Isoenzym, das die Dephosphorylierung des

Calcium-ausschüttenden Botenstoffes Inositol-1,4,5-Triphosphat katalysiert, somit inaktiviert und das Signal eines Neurotransmitters beendet.

- Die hohe Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase Expression in den Purkinje Zellen des Gehirns ist begründet auf der zentralen Rolle in der Signaltransduktions-Kaskade im zentralen Nervensystem.

HD-CL-08, EEF1A1 (Ditzel et al. 2000; Sang Lee et al. 2002; Talapatra et al. 2002; Mansilla et al. 2005)

Ub

- EEF1A1 ist die alpha Untereinheit des Elongationsfaktor 1 Komplexes. - Im Vergleich zu EEF1A1 fehlen HD-CL-08 die ersten 77 Aminosäuren. - EEF1A1 ist in zahlreichen Neoplasien überexprimiert (Prostata, Pankreas, Kolon, Lunge und Magen). - EEF1A1 reguliert die GTP-abhängige Bindung von Aminoacyl-tRNA an die 80S Ribosomen während

der Proteinsynthese. - EEF1A1 ist ein Autoantigen in 66% aller Patienten mit Felty Syndrom. - Das Prostata Tumor-induzierende Gen 1 (PTI-1) stellt eine verkürzte Variante von EEF1A1 dar und ist

ein Onkogen. - Überexpression von EEF1A1 führt zur selektiven Resistenz gegenüber Apoptose, die durch Stress des

endoplasmatischen Retikulums verursacht wird. HD-CL-14, NFATC3 (Hoey et al. 1995; Masuda et al. 1995; Graef et al. 2001) Ub - HD-CL-14 kodiert für ein Intron (chromosomale Sequenz) von NFATC3. - NFATC3 spielt eine Rolle in T-Zellen für die Expression von Zytokingenen (v.a. IL-2) nach

Stimulation der T-Zellen durch ein Antigen. - NFATC3 enthält eine Rel homologe Domäne, die wichtig für die Bindung von AP-1 ist. - NFATC3 ist im Mausembryo wichtig für die Angiogenese. HD-CL-17, Hefe ribosomales Protein S28 Homolog (Kenmochi et al. 1998) Ub - Hohe Ähnlichkeit zu ribosomalem Protein S23, das zur 40S Untereinheit der Ribosomen zählt. - Mehrere Pseudogene zum ribosomalen Protein S23 innerhalb des Genoms sind beschrieben. HD-CL-24, SART3 (Yang et al. 1999; Liu et al. 2002; Sasatomi et al. 2002) Ub - SART3 ist ein RNA-bindendes nukleäres Protein. - SART3 ist ein verbreitetes Tumorantigen, das Tumor-spezifische zytotoxische T-Zellen in

Krebspatienten (Ösophagus, Kolon) bildet und für eine spezifische Immuntherapie verwendet werden könnte.

- SART3 spielt eine Rolle im mRNA-Spleißen. - SART3 könnte ein zellulärer Faktor für die Genexpression von HIV-1 und die virale Vermehrung sein. - SART3 wird im Zytoplasma von allen proliferierenden normalen und malignen Zellen exprimiert sowie

im Nukleus maligner Tumorzelllinien und vieler Tumorgewebe (MM, Leukämie). HD-CL-30, Klon RP11-14I17 Ub - Funktion ist noch unbekannt. se20-4, CDA-1 (Chai et al. 2001) Ub - CDA-1 ist ein Autoantigen, welches Antikörper im Serum von Patienten hervorruft. - CDA-1 ist ein negativer Regulator des Zellwachstums, wobei die Aktivität durch die Höhe der

Expression und die Phosphorylierung überwacht wird.

ERGEBNISSE 80

Antigen, homologes Gen mRNA Expression Eigenschaften se33-1, NP220 (Ng et al. 2002) D - NP220 ist ein DNA-bindendes Protein, das an Cytidin Cluster in doppelsträngiger DNA bindet. - Se33-1 ist ein überexprimiertes Tumor-assoziiertes Antigen. - Vier-und-ein-halb LIM Protein 2 (FHL2) ist ein Proteinbindungspartner von NP220 und scheint für die

Differenzierung von Herzmuskelzellen wichtig zu sein. se37-2, UBE3A Ub - UBE3A ist ein Autoantigen und Teil des Ubiquitin Protein Degradationssystems. - Eine vererbte UBE3A Gendeletion führt zum Angelman Syndrom mit schweren motorischen und

intellektuellen Störungen. - Die Reaktion von UBE3A mit dem E6 Protein von HPV16/18 bewirkt die Ubiquitin-abhängige

Proteolyse von p53. pMAGE-A3ag, MAGE-A3 (Gaugler et al. 1994; Kruit et al. 2005; Ma et al. 2005; Zhang et al. 2005a; Zhang et al. 2005b)

CTA

- Verbreitetes Tumorantigen, das eine Expression in Normalgewebe auf Testis beschränkt aufweist und von zytotoxischen T-Zellen erkannt wird.

- Wird in zahlreichen Neoplasien (MM, Lunge, Leber, Brust) exprimiert. - Verwendung als Antigen in der Krebstherapie mittels Peptid-Impfungen, Impfungen mit MAGE-A3-

beladenen dendritischen Zellen. HD-CL-41, STK17b (Sanjo et al. 1998) Ub - C-terminale Domäne ist wichtig für die Funktion als positiver Regulator der Apoptose. HD-CL-49, NUDC (Angus et al. 2002; Zhang et al. 2002; Aumais et al. 2003; Wei et al. 2006)

Ub

- NUDC besitzt eine Funktion in der Neurogenese, neuronaler Wanderung und während der Mitose bei der korrekten Bildung der mitotischen Spindeln sowie der Zell-Proliferation.

- NUDC besitzt eine erhöhte Expression in sich teilenden hämatopoietischen Vorläuferzellen und Zellen von Leukämie-Patienten, erniedrigte Expression während der Reifung von Erythrozyten Vorläuferzellen.

- Vermutlich ist NUDC an der Entstehung von Leukämien beteiligt. - NUDC spielt eine Rolle in der Megakaryogenese, Zytopoiese und Thrombopoiese. HD-CL-50, MAPK6 (Zhu et al. 1994; Meloche et al. 1996; Coulombe et al. 2003) Ub - MAPK6 zählt zu der Serin/Threonin Protein Kinase-Familie. - MAPK6-Aktivierung durch eine Protein Phosphorylierungs-Kaskade als Antwort auf extrazelluläre

Signale führt zur Phosphorylierung von Mikrotubuli-assoziiertem Protein 2 (MAP2). - MAPK6 wird in Fibroblasten nach der Stimulation mit Phorbolestern/Serum aktiviert. - Relativ unstabiles MAPK6 Protein, welches eine höhere Halbwertszeit, Stabilität und somit eine

Anhäufung während der Differenzierung von Muskelzellen aufweist. HD-CL-51, PS1D (Gueydan et al. 2002) Ub - PS1D zählt zu der Hülle der 60S ribosomalen Untereinheit in Eukaryonten. - PS1D enthält ein Zinkfingermotiv und assoziiert mit der 60S ribosomalen Untereinheit. - Funktion ist noch unbekannt. HD-CL-52, BM-009 Ub - Funktion ist noch unbekannt. HD-CL-53, PTP4A2 (Rommens et al. 1995; Zhao et al. 1996; Wang et al. 2002) Ub - PTP4A2 zählt zur Familie der Protein Tyrosin Phosphatasen. - PTP4A2 besitzt eine erhöhte Expression in Prostatatumorgewebe. - PTP4A2 ist ein Signalmolekül in vielen zellulären Prozessen. - PTP4A2 Überexpression ist mit transformiertem Phänotyp assoziiert, was eine Rolle in der

Tumorgenese vermuten lässt. HD-CL-54, Klon RP11-621B3 Ub - Chromosomale Sequenz ohne bekannt Funktion.

ERGEBNISSE 81

3.1.3 Validierung des SADA: Phagenmobilität und Monoklonalität

Der erste Schritt für die Herstellung der SADA-Membranen bestand in der Übertragung der

Phagenlösungen mittels eines Stempels aus einer 96 Lochplatte auf Agarplatten. Hierfür wurde

der Stempel mehrfach in die 96 Lochplatte eingetaucht. Eine 96 Lochplatte inklusive Stempel

wurde höchstens bis zu drei Tage verwendet, um Kontaminationen mit beispielsweise Pilzen

oder Bakterien zu vermeiden. Um sicherzustellen, dass bei dem mehrfachen Eintauchen des

Stempels in die Phagenlösungen keine Phagen in benachbarte Löcher verschleppt wurden, wurde

ein Experiment mit einem Immunglobulin G (IgG)-Phagen durchgeführt. Das Proteinprodukt

dieses Phagenklons reagiert direkt mit dem sekundären Antikörper ohne Bindung eines

Serumantikörpers, wobei ein sehr starkes Signal entsteht. Ein IgG-Phagenklon wurde in zwei

unabhängigen Ansätzen mittels eines Stempels mehrfach auf eine Membran übertragen. Um das

Loch des IgG-Phagen befanden sich Löcher mit anderen Phagenklonen oder SM-Puffer. Nach

der Entwicklung der Membranen konnte der IgG-Klon auf der Membran nur an der gestempelten

Stelle detektiert werden. Somit kam es zu keiner Kreuzkontamination zwischen verschiedenen

Phagen während des mehrfachen Stempelns und das „Springen“ der Phagen zwischen

verschiedenen Löchern der 96 Lochplatte konnte ausgeschlossen werden.

Im SADA wurden die Phagenlösungen zur Herstellung der SADA-Membranen auf einen Titer

von ungefähr 2000 Phagen pro µL eingestellt. Als Basis dienten Phagenstocklösungen mit einem

Titer von über 2000 Pfu/µL. Diese Lösungen wurden dadurch hergestellt, dass mehrere

Phagenplaques in SM-Puffer aufgenommen und die Phagen durch Schütteln aus dem Agar gelöst

wurden. Da mehrere Phagenplaques gepickt wurden, bestand die Gefahr, dass die

Monoklonalität der Phagenlösungen nicht mehr gegeben war. Um dies zu überprüfen, wurden

jeweils Phagengebrauchslösungen zweier Phagenklone von jeder Membran (se1-1, cTAGE-1,

HD-MM-48 und HD-CL-53) auf ihre Monoklonalität getestet. Drei Phagenplaques einer

Agarplatte des jeweiligen Phagenklons wurden gepickt, einer in vivo Exzision unterzogen und

die somit erhaltenen Plasmide mit Restriktionsenzymen gespalten. Die Spaltprodukte wurden in

einer gelelektrophoretischen Kammer aufgetrennt. Wie aus Abbildung 3-1 ersichtlich ist konnte

für alle drei Probespaltungen des Plasmids des jeweiligen Phagenklons dasselbe Spaltmuster

nachgewiesen. Somit ist die Monoklonalität nach der Vereinigung mehrerer Plaques eines Klons

weiterhin vorhanden.

ERGEBNISSE 82

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 M

3000bp

1000bp

2000bp

500bp

3000bp

1000bp

2000bp

500bp

se1-1 HD-CL-53 HD-MM-48 Blauer Ph. cTAGE-1

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 M

3000bp

1000bp

2000bp

500bp

3000bp

1000bp

2000bp

500bp

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 M

3000bp

1000bp

2000bp

500bp

3000bp

1000bp

2000bp

500bp

se1-1 HD-CL-53 HD-MM-48 Blauer Ph. cTAGE-1

Abbildung 3-1: Gelelektrophoretische Auftrennung der mit Restriktionsenzymen ge-

spaltenen Plasmide von vier SADA-Klonen nach einer in vivo Exzision

Die gelelektrophoretische Auftrennung der gespaltenen Plasmide nach der in vivo Exzision weist identische Spaltmuster in den Spuren 1-6 (se1-1), 7-12 (HD-CL-53), 13-15 (HD-MM-48), 16-18 (blauer Phage) und 19-21 (cTAGE-1) nach. M: Marker, bp: Basenpaare.

3.1.4 Validierung des SADA: Sensitivität

Die Serumverdünnung von 1:100 im SADA wurde entsprechend der üblichen Serumverdünnung

im SEREX (Sahin et al. 1995; Eichmuller et al. 2001) gewählt. Zur Bestätigung der

Verwendbarkeit dieser Verdünnung im SADA wurden identische Serumproben eines CTCL-

Patienten jeweils in einer Verdünnung von 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 und 1:1000

unabhängig von einander präabsorbiert und im SADA getestet. Für die Serumverdünnungen

1:50, 1:100 und 1:200 waren die Antigene se2-5, se20-7 und UACA (Positivkontrolle) positiv.

Bei einer Verdünnung von 1:1000 wurde keine Reaktion eines Antigens mit dem Serum des

Patienten detektiert (Abbildung 3-2). Dementsprechend war eine Serumverdünnung von 1:100

eine Verdünnung, bei der noch alle Antigene, gegen welche Serumantikörper gebildet wurden,

mit der SADA-Methode detektiert werden konnten.

ERGEBNISSE 83

A B

CD

A B

CD

Abbildung 3-2: Entwickelte SADA-Membranen verschiedener Serumverdünnungen

Unterschiedliche Serumverdünnungen wurden mit den SADA-Membranen inkubiert und anschließend entwickelt. Positive Reaktionen sind mit Pfeilen gekennzeichnet. A: Membran 1, Serumverdünnung 1:50, positiv sind se2-5 und se20-7; B: Membran 1, Serumverdünnung 1:1000, keine positive Reaktion; C: Membran 2, Serumverdünnung 1:200, positiv ist UACA; D: Membran 2, Serumverdünnung 1:1000, keine positive Reaktion.

3.1.5 Validierung des SADA: Reproduzierbarkeit

Um die Reproduzierbarkeit der Präabsorption der Seren sowie der SADA-Methode selbst zu

testen, wurden je zwei identische Serumproben von 5 Seren von MM-Patienten unabhängig von

einander präabsorbiert. Zunächst wurden die Seren an einer mechanischen und anschließend an

einer lytischen Säule präabsorbiert. Zudem erfolgte eine weitere Präabsorption der Seren mittels

sechs kleiner lytischer Membranen. Zwei der zehn Seren mussten zusätzlich noch mit 3-4 großen

lytischen Membranen präabsorbiert werden. Im Anschluss wurden die Seren an einer Lymphom-

Phagenbank auf die erfolgreiche Präabsorption getestet. Keine Reaktion des Serums mit den

Phagenplaques bestätigte eine erfolgreiche Präabsorption. Jedes Serum wurde in zwei

unabhängigen Experimenten an je einer Membran 1 und 2 getestet. Für alle Patienten ergab sich

eine Übereinstimmung hinsichtlich der Serumantikörperantwort der beiden präabsorbierten

Serumproben für beide Membranen.

ERGEBNISSE 84

3.1.6 Seroreaktivitäten aller SADA-Antigene gegen CTCL-, MM-Patienten und

Kontrollpersonen

Alle 42 Antigene wurden auf ihre Seroreaktivität mit den drei Kollektiven CTCL-, MM-

Patienten und Kontrollpersonen getestet. Ein statistisch signifikanter Unterschied von entweder

CTCL-Patienten und Kontrollgruppe oder MM-Patienten und Kontrollgruppe wurde mit dem

„Fisher’s Exact Test“ berechnet. Ein p-Wert von unter 0,05 wies einen statistisch signifikanten

Unterschied der Gruppen aus. Mehrere repräsentative, entwickelte SADA-Membranen sind

beispielhaft in Abbildung 3-3 dargestellt.

Auffällig hinsichtlich der Seroreaktivitäten war zunächst, dass die Häufigkeit an

Serumantikörperantworten deutlich niedriger lag als in bisher durchgeführten sekundären

SEREX-Untersuchungen (Tabelle 3-2). Insgesamt lagen die Serumantikörperantwort-

Häufigkeiten zwischen 0% bis 72%. Gegen sechs Antigene (cTAGE-1, cTAGE-5a, se89-1, HD-

CL-50, HD-CL-51, HD-CL-54) konnten in diesem Testsystem in keinem Kollektiv

Serumantikörper detektiert werden. Das Antigen se20-7 kann als Autoantigen bezeichnet

werden, da es in 67% der CTCL-Patienten, 72% der MM-Patienten und 65% der Ctrl und somit

in allen drei Kollektiven häufig erkannt wurde.

Fünf von 42 Antigenen (Guanylat-bindendes Protein (GBP)-5a, GBP-5ta, HD-MM-48, HD-

MM-19 und HD-CL-02) wiesen einen statistisch signifikanten Unterschied in der Häufigkeit

ihrer Serumantikörperantworten auf. GBP-5a reagierte mit 0% der Kontrollseren, 5% der CTCL-

Seren und 17% der MM-Seren. Statistisch signifikant unterschieden sich die Kontroll- von der

MM-Gruppe (p=0,0031). Für GBP-5ta wurde eine Seroreaktivität von 0% in Ctrl, 5% in CTCL-

Patienten und 28% in MM-Patienten ermittelt. Ein statistisch signifikanter Unterschied von

p=0,00005 der beiden Gruppen Ctrl und MM-Patienten wurde berechnet. HD-MM-48 konnte

eine Serumantikörperantwort in 3% der Ctrl, 20% der CTCL-Patienten und 17% der MM-

Patienten auslösen. Für dieses Antigen besteht ein statistisch signifikanter Unterschied sowohl

zwischen den Kontroll- und CTCL- (p=0,0002) als auch den Kontroll- und MM-Patienten

(p=0,0449). Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Antigenen induzierte HD-MM-19 auch

im Kontroll-Kollektiv eine hohe Häufigkeit an Serumantikörperantworten mit annähernd 40%.

In CTCL-Patienten wurden in fast der Hälfte aller Patienten Antikörper gegen dieses Antigen

nachgewiesen, und in MM-Patienten in 83% der Fälle. Somit ergab sich ein statistisch

signifikanter Unterschied (p=0,0006) zwischen der Kontroll- und der MM-Gruppe. HD-CL-02

schließlich war in seiner Serumantikörperantwort statistisch signifikant unterschiedlich im

Vergleich der Kollektive Kontroll- und CTCL-Patienten (0%, 6%, p=0,0289). Auch im Kollektiv

der MM-Patienten wurden Serumantikörperantworten bestimmt (6%).

ERGEBNISSE 85

Membran 1 Membran 2

CTCL

Ctrl

MM

A B

C D

E F

Membran 1 Membran 2

CTCL

Ctrl

MM

A B

C D

E F

Abbildung 3-3: Repräsentative SADA-Membranen verschiedener Seren

Membranen A und B wurden mit CTCL-Patientenseren, C und D mit Kontrollseren und E und F mit MM-Patientenseren inkubiert. Positive Serumantikörperantworten sind für die Antigene A: se1-1, se2-5, se20-7; B: UVEAL Autoantigen (UACA), HD-MM-23; C: se2-1; D: HD-MM-48; E: GBP-5a, GBP-5ta, se1-1, se2-1, se2-5, se20-7, du20-10L4, se57-1; F: UACA, HD-MM-23 ersichtlich (siehe Pfeile). CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, Ctrl: Kontrollen, MM: Malignes Melanom.

Im MM-Kollektiv konnten keine Serumantikörper gegen MAGE-A3 und MAGE-A9 detektiert

werden. Serumantikörper gegen diese beiden CTA wurden in 1% (MAGE-A3) und 0% (MAGE-

A9) der Ctrl und 4% und 8% der CTCL-Patienten nachgewiesen. Serumantikörper gegen

pGAGEt wurden in allen 3 Kollektiven gemessen (Ctrl. 1%, CTCL 3%, MM 6%).

Neben se20-7 und HD-MM-19 wurden hohe Serumantikörper-Häufigkeiten für das Antigen HD-

MM-23 detektiert (Ctrl 30%, CTCL 21%, MM 50%). Für dieses Antigen liegen die

Seroreaktivitäten in Ctrl höher als in der CTCL-Gruppe.

37 von 42 Antigenen hatten eine Serumantikörper-Häufigkeit von weniger gleich 5% in Ctrl,

wohingegen 31 von 42 Antigenen im CTCL-Kollektiv und 25 von 42 Antigenen im MM-

Kollektiv diese Häufigkeit aufwiesen. Insgesamt wurde festgestellt, dass beim Vergleich der

Serumantikörper-Häufigkeiten größer gleich 5% mehr Antigene im MM-Kollektiv (15) im

Vergleich zum CTCL-Kollektiv (6) reaktiv waren. Dies deutet auf eine höhere Immunogenität

des MM im Vergleich zum CTCL hin.

ERGEBNISSE 86

Tabelle 3-2: Seroreaktivitäten aller SADA-Antigene, statistische Auswertung und

Ergebnisse im sekundären SEREX

Die Tabelle gibt die Seroreaktivitäten aller SADA-Antigene in Prozent für die Kollektive CTCL-, MM-Patienten und Kontrollpersonen an. Die statistische Auswertung erfolgte anhand des „Fisher’s Exact Test“. Ein statistisch signifikanter Unterschied zweier Kollektive basiert auf einem p-Wert < 0,05.

Seroreaktivitäten aller SADA-Antigene früherer sekundärer SEREX-Untersuchungen sind aufgeführt (Eichmuller et al. 2001; Ehlken et al. 2004; Fellenberg et al. 2004; Hartmann 2004; Hartmann et al. 2004). Ctrl: Kontrollen, n.g.: nicht getestet, -: statistisch nicht signifikant unterschiedlich, n: Anzahl,

AntigenCtrl

(n=100)CTCL(n=100)

MM(n=18)

p-WertCTCL -

Ctrl

p-WertMM - Ctrl

SEREXCtrl

SEREXCTCL

SEREXMM

GBP-5a 0% 5% 17% - 0,0031 0% (0/14) 18% (2/11) n.g.GBP-5ta 0% 5% 28% - 0,00005 0% (0/14) 56% (9/16) n.g.pGAGEt 1% 3% 6% - - n.g. 16% (3/19) n.g.se1-1 19% 17% 28% - - 0% (0/5) 50% (5/10) n.g.se2-1 2% 8% 17% - - 0% (0/10) 22% (4/18) n.g.se2-5 12% 14% 17% - - 0% (0/5) 30% (3/10) n.g.HD-CL-12 0% 1% 0% - - 0% (0/8) 33% (4/12) n.g.pMAGE-A9ag 0% 4% 0% - - n.g. 22% (4/18) 20% (3/15)cTAGE-1 0% 0% 0% - - 0% (0/17) 33% (10/30) 7% (1/15)cTAGE-5a 0% 0% 0% - - 0% (0/14) 15% (3/20) 0% (0/15)se20-7 65% 67% 72% - - 0% (0/5) 30% (3/10) n.g.du20-10L4 0% 4% 6% - - 0% (0/10) 11% (2/18) n.g.HD-CL-04 0% 0% 6% - - 0%(0/7) 33% (7/21) n.g.HD-CL-03 0% 2% 0% - - 0% (0/6) 48% (10/21) n.g.HD-CL-09 1% 7% 0% - - 0% (0/8) 41% (7/17) n.g.HD-MM-01 0% 0% 6% - - n.g. n.g. 8% (1/12)HD-MM-02 0% 1% 6% - - n.g. n.g. 17% (2/12)HD-MM-03 0% 0% 6% - - n.g. n.g. 17% (2/12)se57-1 2% 5% 11% - - 0% (0/5) 33% (3/9) n.g.se89-1 0% 0% 0% - - 0% (0/9) 55% (12/22) n.g.HD-MM-48 3% 20% 17% 0,0002 0,0449 n.g. n.g. n.g.HD-MM-08 3% 6% 0% - - n.g. n.g. n.g.HD-MM-16 3% 9% 0% - - n.g. n.g. 8% (1/12)HD-MM-19 39% 48% 83% - 0,0006 n.g. n.g. 25% (3/12)HD-MM-23 30% 21% 50% - - n.g. n.g. 17% (2/12)HD-CL-02 0% 6% 6% 0,0289 - 0% (0/5) 19% (4/21) n.g.HD-CL-08 1% 2% 0% - - 0% (0/8) 6% (1/16) n.g.HD-CL-14 2% 2% 0% - - 0% (0/8) 25% (3/12) n.g.HD-CL-17 0% 2% 0% - - 50% (4/8) 33% (4/12) n.g.HD-CL-24 0% 5% 0% - - 0% (0/6) 14% (1/7) n.g.HD-CL-30 2% 5% 0% - - 0% (0/6) 14% (1/7) n.g.se20-4 3% 3% 0% - - 0% (0/5) 30% (3/10) n.g.se33-1 0% 1% 0% - - 0% (0/10) 29% (5/17) n.g.se37-2 0% 1% 0% - - 0% (0/10) 29% (5/17) n.g.pMAGE-A3ag 1% 8% 0% - - n.g. 6% (1/18) 27% (4/15)HD-CL-41 0% 2% 0% - - 0% (0/6) 43% (3/7) n.g.HD-CL-49 1% 0% 0% - - 0% (0/6) 43% (3/7) n.g.HD-CL-50 0% 0% 0% - - 0% (0/6) 14% (1/7) n.g.HD-CL-51 0% 0% 0% - - 0% (0/6) 29% (2/7) n.g.HD-CL-52 2% 3% 0% - - 0% (0/6) 43% (3/7) n.g.HD-CL-53 2% 1% 0% - - 0% (0/6) 14% (1/7) n.g.HD-CL-54 0% 0% 0% - - 0% (0/6) 14% (1/7) n.g.

ERGEBNISSE 87

CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, MM: Malignes Melanom, SADA: Serumantikörper-Detektionsarray, GBP: Guanylat-bindendes Protein, MAGE: Melanom Antigen.

Desweiteren induzierten 14 Antigene (GBP-5a, GBP-5ta, HD-CL-12, pMAGE-A9ag, du20-

10L4, HD-CL-03, HD-MM-02, HD-MM-03, HD-CL-02, HD-CL-17, HD-CL-24, se33-1, se37-

1, HD-CL-41) keine Serumantikörperantwort in den Ctrl, wohingegen entweder im CTCL- und

oder im MM-Kollektiv Serumantikörperantworten detektiert werden konnten Obwohl diese

Serumantikörperantworten in den Patientenkollektiven zumeist sehr gering waren, können diese

Antigene als serologisch tumorspezifisch bezeichnet werden.

Im Vergleich zu früheren Ergebnissen im sekundären SEREX ist festzustellen, dass die

Frequenzen der Seroreaktivitäten in Ctrl bis auf die vier Ausnahmen se1-1, se2-5, se20-7, HD-

CL-17 sehr ähnlich sind. Bei der Betrachtung des CTCL-Kollektivs liegen die Frequenzen der

Seroreaktivitäten im SADA deutlich unter denjenigen im sekundären SEREX. Ausnahmen sind

die Antigene se20-7, HD-CL-08 und pMAGE-A3ag. Für diejenigen Antigene, die für ein MM-

Kollektiv sowohl im SADA als auch im sekundären SEREX evaluiert wurden, ergeben sich

deutliche Unterschiede für die Antigene HD-MM-19 und HD-MM-23. Allerdings muss beachtet

werden, dass die Kollektivgrößen sehr unterschiedlich waren.

ERGEBNISSE 88

3.2 ELISA und Multiplex-Serologie

Die Bestimmung der Serumantikörperantwort unter Verwendung der SEREX- und SADA-

Methode ist sehr zeitaufwendig. Deshalb wurde in dieser Arbeit ein weiteres System getestet, das

Serumantikörperantworten in einem Hochdurchsatzverfahren misst: die Luminex-Technologie –

die ein Multiplex-System ist. Sieben CTA, drei TAA und zwei Tumorsuppressorgene wurden in

diesem System auf ihre Serumantikörperantwort in 144 CTCL-, 191 MM-Patienten, 100

Kontrollpersonen und 25 immunbehandelten Tumorpatienten untersucht. Zudem dienten vier

virale Antigene als interne Ctrl zur Überprüfung der Zugehörigkeit von Seren zu Patienten.

Die Multiplex-Serologie stellt eine Weiterentwicklung des GST-X-tag-„Enzyme-linked

immunosorbent assay“ (ELISA) dar. Beide Systeme wurden in der Gruppe von Dr. M. Pawlita

am DKFZ für virale Antigene entwickelt. Der ELISA ist der zur Zeit meistgebrauchte

immunologische Test, um den Immunstatus eines Patienten zu untersuchen und wird in diesem

Zusammenhang zumeist als „Antibody Capture Assay“ verwendet. Um allerdings noch mehr

Seren gleichzeitig mit einer großen Anzahl von Antigenen testen zu können, entwickelte Dr. T.

Waterboer die Multiplex-Serologie als Hochdurchsatzverfahren. Der GST-X-tag-ELISA und die

Multiplex-Serologie besitzen einen entscheidenden Vorteil zu anderen klassischen „Antibody

Capture Assays“. Rekombinant hergestellte Antigene werden direkt auf der Platte bzw. an Beads

gebunden und dabei aufgereinigt, weshalb eine aufwendige Aufreinigung der Proteine im

Vorfeld entfällt. Beide Methoden beruhen auf der Bindung der Glutathion-S-Transferase (GST)

an Glutathion, welches kovalent an Casein gekoppelt, auf eine solide Plastikoberfläche oder an

Beads gebunden vorliegt (Abbildung 3-4). In einer Ein-Schritt-Aufreinigung (In-situ

Affinitätsaufreinigung) werden die Antigene direkt aus dem bakteriellen Lysat entweder auf der

ELISA-Platte oder in der Beadsuspension von den restlichen Lysatbestandteilen abgetrennt (Sehr

et al. 2001; Waterboer 2005; Waterboer et al. 2005). In der vorliegenden Arbeit wurde die

Luminex-Technologie erstmals zur Bestimmung von Serumantikörpern gegen humane

Selbstantigene etabliert und eingesetzt.

3.2.1 Die Grundlage der Multiplex-Serologie

Die Basis der Multiplex-Serologie ist die Luminex-Technologie (xMAPTM), deren Grundeinheit

Polystyrol-Kügelchen (Beads) sind, die einen Durchmesser von 5,6µm besitzen. Da die Beads

mit zwei verschiedenen Fluoreszenz-Farbstoffen gefüllt sind, lassen sich 100 distinkte

Beadsorten unterscheiden. Diese Beads werden in einem Luminex-Analysegerät untersucht, das

weitgehend einem Durchflusszytometer mit zwei Lasern entspricht. Die beiden in die Beads

gefüllten Fluoreszenz-Farbstoffe werden mit Licht einer Wellenlänge von 635nm

ERGEBNISSE 89

(Klassifizierungs-Laser) angeregt. Die Identifizierung der Beadsorte erfolgt durch die Detektion

der Emissionsmaxima der beiden Farbstoffe. Der grüne (Reporter-)Laser erlaubt die

Quantifizierung der Reporter-Fluoreszenz durch eine Anregung der Beads bei 532nm

(Abbildung 3-4).

Abbildung 3-4: Schematische Darstellung von „GST-capture-ELISA“ (A) und Multiplex-

Serologie (B)

Glutathion-Reste sind als grüne Pfeilspitzen dargestellt. An ELISA-Platten bindet das GC mittels Physicosorption, wohingegen es kovalent an Luminex-Beads gekoppelt wird. Das Glutathion-Casein bindet zunächst an die ELISA-Platte oder das Bead. Anschließend wird das Tumorantigen in-situ affinitätsaufgereinigt. Mittels eines HRP-gebundenen oder biotinylierten sekundären Antikörpers werden die gebundenen Serumantikörper erkannt und über eine Farbreaktion oder Streptavidin-Phycoerythrin detektiert. HRP: „Horseradish peroxidase“, GC: Glutathion-Casein.

Die Beadsuspension eines Lochs der 96 Lochplatte wird so lange vermessen, bis von jeder

vorhandenen Beadsorte mindestens 100 einzelne Beads analysiert werden konnten. Die

Bindungsreaktionen auf jeder Beadsorte werden als Median der Reporter-Fluoreszenz-

Intensitäten („mean fluorescence intensity“ – MFI) der 100 analysierten Einzelbeads errechnet.

Im Vergleich von GST-X-tag-ELISA und Multiplex-Serologie wurde im Wesentlichen die feste

Phase ausgetauscht. Für jedes Antigen wurde ein Loch einer ELISA-Platte durch eine Luminex-

Beadsorte ersetzt (Abbildung 3-5). Zu Beginn fand eine in-situ Affinitätsaufreinigung der GST-

Fusionsproteine aus dem Bakterienlysat statt. Kovalentes Koppeln von Glutathion-Casein (GC)

an die Beads ermöglichte die direkte Bindung von GST-Fusionsprotein, und ungebundenes

Bakterienprotein konnte durch Waschen der Beads entfernt werden. Unterschiedliche GC-

Beadsorten wurden mit verschiedenen Antigenen beladen (eine Sorte pro Antigen), separat

gewaschen und schließlich zu einer Beadmischung vereint. Diese Beadmischung wurde in einer

casein

ELISA Platte

GST

GS

T

tag

HRP-/Biotin-gekoppelter Sekundärer Antikörper

Tumorantigen alsGST-tag-Fusionsprotein

Bead

GST

Serum Antikörper

Glutathion-Casein

Streptavidin-R-Phycoerythrin

GS

T

casein

tag

A B

casein

ELISA Platte

GST

GS

T

tagtag

HRP-/Biotin-gekoppelter Sekundärer Antikörper

Tumorantigen alsGST-tag-Fusionsprotein

Bead

GST

Serum Antikörper

Glutathion-Casein

Streptavidin-R-Phycoerythrin

GS

T

casein

tagtag

A B

ERGEBNISSE 90

96 Lochplatte mit Filterboden (Waschplatte) mit gegen GST-tag- und E. coli-Protein

präabsorbiertem Serum inkubiert. Ungebundene Serumproteine wurden durch das Anlegen eines

Vakuums an die Waschplatte entfernt, wobei die Beads vom Filter zurückgehalten wurden. Nach

erneutem Waschen der Beads wurden gebundene Serumantikörper durch biotinylierten

Sekundärantikörper und nach einem weiteren Waschschritt durch Streptavidin-R-Phycoerythrin

detektiert. Nach dem Einsetzen der Waschplatte in den xy-Rastertisch des Luminex-

Analysegeräts saugte die Hohlnadel sukzessive aus jedem der 96 Löcher das entsprechende

Volumen an Lösung auf. Anschließend wurde jede Beadsuspension nach und nach im

Analysegerät vermessen.

Abbildung 3-5: Schematische Darstellung des Luminex-Analysegeräts

Zu Beginn wird eine Mischung verschiedener Beadsorten (verschieden farbige Beads) mittels einer Hohlnadel aus einem Loch einer 96 Lochplatte aufgesogen (nicht dargestellt). Die Beadmischung wird in einer Mikrokapillare vereinzelt und in einer Durchflussküvette unter Verwendung von zwei Lasern analysiert (Quelle: www.luminexcorp.com).

Im Vergleich zum GST-X-tag ELISA hat die Luminex-Technologie die folgenden Vorteile:

o Erhöhter Durchsatz

o Serumsparend, da mit einer Probe theoretisch die Antikörperantwort gegen bis zu 100

Antigene parallel gemessen werden kann.

o Mehrfachbestimmungen bzw. Wiederholungen entfallen, da pro Antigen mindestens 100

Messwerte erzeugt werden, deren Median als MFI-Wert berechnet wird.

3.2.2 Verwendete Antigene in der Multiplex-Serologie

In Tabelle 3-3 sind alle humanen, in der Multiplex-Serologie verwendeten Antigene beschrieben.

Die Antigene MAGE-A1, -A3, -A9, LAGE-1a, GAGE-7b, CAMEL und cTAGE-5a N-terminal

und C-terminal wurden in den pGEX-4T-3-tag-Vektor kloniert. Dr. F. Fellenberg führte diese

ERGEBNISSE 91

Klonierungsarbeiten für die Antigene se70-2, se57-1 und GBP-5ta durch sowie Dr. P. Sehr und

Dr. C. Michael für die Tumorsuppressorgene p53 und p16 und die viralen Antigene BK, JC,

LPV und Humanes Papillomavirus 1 (HPV1). Alle Tumorantigene (X) wurden als

Fusionsproteine mit N-terminaler GST und C-terminalem Markerepitop (tag) als GST-X-tag-

Proteine bakteriell exprimiert. Der Sinn des einheitlichen Markerepitops (tag) am C-Terminus

besteht darin, dass eine vergleichende Quantifizierung aller eingesetzter Fusionsproteine im

GST-X-tag-ELISA möglich ist.

Tabelle 3-3: Übersicht über die verwendeten humanen Tumorantigene

In der Tabelle sind Übersichtsdaten in Bezug auf mRNA, kodierendes Protein („open reading frame“ – ORF), Homologien, mRNA Expression und chromosomale Lokalisation der in der Multiplex-Serologie verwendeten humanen Tumorantigene und Tumorsuppressorgene aufgeführt. bp: Basenpaare, AS: Aminosäuren, RSV: „Respiratory syncytial virus“, EST: „Expressed sequence tag“, CTA: Cancer Testis Antigen, D: Differentiell, U: Ubiquitär.

Tumorantigen/ Tumor- suppressorgen

mRNA [bp]

ORF [AS]

Homologes Gen Homologes EST mRNA Expression

Chromosom

MAGE-A1 1722 310 MAGE-A1 - CTA Xq28



LAGE-1a 766 180 LAGE-1a - CTA Xq28

GAGE-7b 526 117 GAGE-7b - CTA Xp11.2-4

CAMEL 993 117 CAMEL - CTA Xq28

se70-2 1592 306 Neu „Large cell carcinoma, adipose“

D 13q33.3-34

se57-1 3997 336 Neu RSV-induziertes EST D 18q21

GBP-5ta 1981 489 Guanylat-bindendes Protein

- D 1p22.2-3

cTAGE-5a N-terminal

2778 408 Neu - CTA 14q13.3

cTAGE-5a C-terminal

2778 369 Neu - CTA 14q13.3

p53 2629 393 p53 - U 17p13.1

p16 1163 156 p16 - U 9p21

3.2.3 Qualitätskontrolle der Antigene und der Multiplex-Analyse

Da, wie bereits beschrieben, die Multiplex-Serologie eine Weiterentwicklung des GST-X-tag-

ELISA ist, wurde die Verwendbarkeit der Antigene für das Luminex-Verfahren im Vorfeld

durch einen GST-X-tag-ELISA ermittelt. Wurde im ELISA eine Sättigungskurve für die

ERGEBNISSE 92

Antigene ermittelt und die Sättigung unterhalb von 25µg pro Loch erreicht, waren die Antigene

für den Einsatz in der Multiplex-Serologie geeignet (Abbildung 3-6).

Abbildung 3-6: Titration der Antigene für die Multi plex-Serologie im GST-X-tag-ELISA

Mit Glutathion-Casein beschichtete ELISA-Platten wurden mit Lysaten transformierter Bakterien inkubiert, die GST-tag- oder GST-X-tag-Fusionsproteine produziert hatten. Die Menge des Lysatproteins wurde von 100µg bis 0,05µg pro Loch titriert. Gebundenes Antigen wurde mittels polyklonalem GST-Antikörper (A) oder monoklonalem tag-Antikörper (B) quantifiziert. Dargestellt ist eine repräsentative Antigentitration für alle selbst hergestellten Antigene. Laut den Sättigungskurven sind alle Antigene zur Verwendung in der Multiplex-Serologie geeignet. OD: Optische Dichte.

Hierfür wurden die Proteinlysate titriert und in Duplikaten aufgetragen. Mit Hilfe von

Antikörpern gegen GST wurde gebundenes Fusionsprotein gemessen. Der tag-Antikörper

erkennt den C-Terminus und eignet sich daher zur Bestimmung von Volle-Länge-Protein. Für

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 20 40 60 80 100

Gesamtprotein pro Loch [µg]

OD

45

0nm

GST MAGE-A1MAGE-A3 MAGE-A9CAMEL LAGE-1aGAGE-7b cTAGE-5a N-terminalcTAGE-5a C-terminal GBP-5tase57-1 se70-2

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 20 40 60 80 100

Gesamtprotein pro Loch [µg]

OD

45

0nm

GST MAGE-A1MAGE-A3 MAGE-A9CAMEL LAGE-1aGAGE-7b cTAGE-5a N-terminalcTAGE-5a C-terminal GBP-5tase57-1 se70-2

A: GST-Antikörper

B: tag-Antikörper

ERGEBNISSE 93

alle selbst hergestellten Antigene wurden Sättigungen in ähnlicher Höhe mit beiden Antikörpern

nachgewiesen. Alle Antigene waren für den Einsatz in der Multiplex-Serologie geeignet.

Während der Durchführung der Multiplex-Analyse wurden interne Kontrollen mitgeführt. Bei

der Begutachtung der MFI-Werte wurden zunächst für jedes Serum die MFI-Werte gegen alle

Antigene inklusive GST-tag gemittelt. Dieser für jedes Serum berechnete MFI-Mittelwert musste

größer als 20 MFI sein, sonst bestand der Verdacht, dass kein Serum in das entsprechende Loch

pipettiert worden war. Für alle untersuchten Antigene traf diese Bedingung zu. Des Weiteren

wurde ein Loch ohne Serum und ein Loch ohne sekundären Antikörper jedoch ansonsten mit

allen verwendeten Reagenzien angesetzt. Die Mittelwerte der MFI-Werte aller Antigene für

diese beiden Löcher sollten ebenfalls unter 20 MFI liegen. Dies traf mit einem Mittelwert von 3

MFI für das Loch ohne sekundären Antikörper zu. Für das Loch ohne Serum ergab sich ein MFI-

Mittelwert von 37, der etwas erhöht ist und den Hintergrundwert ergibt. Da ansonsten alle

anderen internen Kontrollen geeignet erschienen, wurde dieses Ergebnis als Ausreißer betrachtet.

Schließlich wurde mittels Antikörpern gegen in der Multiplex-Serologie verwendete Antigene

überprüft, ob die Bindung von Antigen an die jeweils ausgewählte Beadsorte erfolgreich und

richtig war. Dies erfolgte mit drei Antikörpern (gegen die Antigene MAGE-A9, GAGE-7b und

cTAGE-5a), da nur gegen diese Antigene Antikörper zur Verwendung in der Multiplex-

Serologie vorlagen. Der MAGE-A9-Antikörper reagierte stark gegen das Antigen MAGE-A9 bei

einer Verdünnung von 1:1000 mit 3294 MFI. Zusätzlich wurden schwächere Reaktionen gegen

MAGE-A1 (67 MFI) und MAGE-A3 (225 MFI) detektiert. Der GAGE-7b-Antikörper reagierte

stark gegen GAGE-7b mit 1604 MFI bei einer Verdünnung von 1:100. cTAGE-5a wurde vom

cTAGE-5a-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:50 mit 902 MFI identifiziert, wobei der

Antikörper nur das C-terminale Proteinende erkannte. Der tag-Antikörper stellte die letzte

interne Kontrolle dar. Mit diesem Antikörper wurde die Verteilung von Voll-Länge-Protein auf

den Beads überprüft. Der MFI-Mittelwert für diesen Antikörper lag bei 2570 MFI. Dies

bedeutet, dass die durchgeführte Multiplex-Serologie die Voraussetzungen für einen

erfolgreichen Assay erfüllte und die erhaltenen MFI-Werte valide waren.

3.2.4 Festlegung der Cut-off-Werte und statistische Auswertung

Zur Festlegung der Cut-off-Werte für alle verwendeten Antigene wurde eine unabhängige

Gruppe von 100 Kontrollseren herangezogen. Der Mittelwert plus zweifacher

Standardabweichung der Antikörperantworten dieser Ctrl wurde als Cut-off für alle humanen

Antigene definiert. Für die viralen Antigene wurde der Cut-off-Wert auf 250 MFI bzw. 100 MFI

ERGEBNISSE 94

festgelegt (Waterboer et al. 2005). Daraus ergaben sich die in Tabelle 3-4 dargestellten Cut-off-

Werte.

Tabelle 3-4: Cut-off-Werte für alle Antigene

In dieser Tabelle sind die Cut-off-Werte für alle in der Multiplex-Serologie verwendeten Antigene dargestellt. Für alle humanen Antigene wurde der Cut-off-Wert anhand eines unabhängigen Kontroll-Kollektivs von 100 Kontrollpersonen als Mittelwert plus zweifacher Standardabweichung bestimmt. Die Cut-off-Werte für die viralen Antigene wurden festgelegt. MFI: „Mean fluorescence intensity“.

Antigen Cut-off-Wert

[MFI] Antigen

Cut-off-Wert [MFI]

MAGE-A1 102 cTAGE-5a N-terminal 1781

MAGE-A3 366 cTAGE-5a C-terminal 2564

MAGE-A9 256 p53 1403

LAGE-1a 85 p16 636

GAGE-7b 59 BK 250

CAMEL 169 JC 250

se70-2 752 LPV 250

se57-1 649 HPV1 100

GBP-5ta 1488

Der prozentuale Anteil an positiven Seren pro Kollektiv wurde anhand der Cut-off- und MFI-

Werte aller Seren berechnet. Zur statistischen Auswertung der Multiplex-Serologie Ergebnisse

wurden die prozentualen Anteile an positiven Seren der unterschiedlichen Patientenkollektive

und Stadiengruppen gegen das Kontroll-Kollektiv unter Verwendung des „Fisher’s Exact Tests“

verglichen. Ein statistisch signifikanter Unterschied lag vor, wenn der p-Wert zwischen dem

Kontroll-Kollektiv und einem Patienten- oder Stadien-Kollektiv unterhalb von 0,05 berechnet

wurde. Um einen statistisch signifikanten Unterschied der verschiedenen Stadiengruppen

gegenüber dem Kontroll-Kollektiv zu sichern, musste neben dem oben erwähnten p-Wert

ebenfalls der p-Wert, der über alle Stadien und das Kontroll-Kollektiv berechnet wurde unterhalb

von 0,05 liegen. Sonst konnte nur eine Tendenz festgestellt werden.

Nachfolgend sind die prozentual positiven Seren pro Antigen zum einen in Säulendiagrammen

dargestellt. Zum anderen werden zur graphischen Darstellung der prozentualen Verteilung von

Seren im Verhältnis zu den entsprechenden MFI-Werten kumulative Distributionen verwendet.

In dieser besonderen Darstellung werden die erhaltenen Messwerte zunächst nach ihrer Größe

sortiert. Im Anschluss wird jedem Messwert ein Platz auf einer Skala von 1 bis 100%

zugewiesen. Die x-Achse wird als prozentuale Achse gewählt, wobei sich die Seren mit den

höchsten MFI-Werten in der linken Hälfte der Achse befinden. Die y-Achse repräsentiert die

ERGEBNISSE 95

Skala der MFI-Werte der Seren. Nach dem Auftragen aller Punkte für die Seren einer

bestimmten Kohorte werden diese verbunden. Demnach kann nach Eintragung des Cut-off-

Wertes des entsprechenden Antigens abgelesen werden, wieviel Prozent der Seren oberhalb des

Cut-off-Wertes liegen und somit positiv sind. Zusätzlich kann anhand dieser Graphik bestimmt

werden, wie viele Seren einer Kohorte prozentual oberhalb eines bestimment MFI-Wertes liegen.

Im Folgenden sollen zunächst die Ergebnisse für das MM- und anschließend für das CTCL-

Kollektiv dargestellt werden. Abschließend werden die Ergebnisse für zwei unterschiedliche

Immunisierungsstrategien in CTCL-Patienten aufgeführt.

3.2.5 Untersuchung der Serumantikörperantwort gegen die verwendeten Antigene

in einem MM-Kollektiv

Antikörper gegen die unter 3.2.2 beschriebenen humanen und viralen Antigene wurden in 191

MM-Patienten sowie 100 Ctrl untersucht. Von den 191 MM-Patienten befanden sich 48

Patienten in Stadium I, 49 Patienten in Stadium II und jeweils 47 Patienten in Stadium III und

IV. Für acht der 191 MM-Patienten konnten zudem Daten von bis zu drei aufeinander folgenden

Serumabnahmen ausgewertet werden. Somit konnte ein Vergleich der Antikörperantworten in

verschiedenen Kollektiven und eine Beurteilung der Antikörperantwort in einigen MM-Patienten

über die Zeit durchgeführt werden.

Bei Betrachtung der kumulativen Distributionen in Abbildung 3-7, Abbildung 3-8, Abbildung

3-9, Abbildung 3-10 und Abbildung 3-11 fällt für die Antigene MAGE-A1 (A, B), A3 (C, D),

A9 (E, F), GAGE-7b (C, D), CAMEL (E, F), se57-1 (C, D) und p16 (A, B) auf, dass nur für

einige wenige MM-Seren MFI-Werte oberhalb der Werte von Kontroll-Personen und oberhalb

des jeweiligen Cut-off-Wertes gemessen wurden. Dies gilt sowohl für das gesamte MM-

Kollektiv als auch für die verschiedenen MM-Stadien-Kollektive insbesondere für höhere

Stadien. Hingegen bestätigen Abbildung 3-9 und Abbildung 3-10, dass die MFI-Werte der

Patientenkollektive für die Antigene se70-2 (A, B), GBP-5ta (E), cTAGE-5a N- (A) und C-

terminal (C, D) sowie p53 (E) unterhalb denjenigen des Kontroll-Kollektivs lagen sobald nur die

MFI-Werte oberhalb des Cut-off-Wertes betrachtet werden. Für die Antigene GBP-5ta

(Abbildung 3-9 F), cTAGE-5a N-terminal (Abbildung 3-10 B) und p53 (Abbildung 3-10 F)

wurden für MM-Patienten einzelner Stadien-Kollektive MFI-Werte oberhalb des Kontroll-

Kollektivs nachgewiesen. Lediglich LAGE-1a unterschied sich deutlich von den anderen

Antigenen im Vergleich der Antikörperantworten zwischen den verschiedenen Kollektiven. In

Abbildung 3-8 A ist der signifikante Unterschied zwischen dem gesamten MM-Kollektiv und

dem Kontroll-Kollektiv ersichtlich. Ca. 10% aller MM-Seren besitzen einen höheren MFI-Wert

ERGEBNISSE 96

im Vergleich zu den Kontrollseren, der zudem oberhalb des Cut-off-Wertes von 85 MFI liegt. In

Abbildung 3-8 B ist der Vergleich des Kontroll-Kollektivs mit allen MM-Stadien dargestellt.

Auch für die verschiedenen Stadien sind deutliche Abgrenzungen zwischen Ctrl und MM-

Patienten zu erkennen. Ca. 8% der MM-Patienten in den Stadien II und III sowie ca. 20% der

MM-Patienten in Stadium IV besitzen einen deutlich höheren MFI-Wert oberhalb des Cut-Off-

Wertes im Vergleich zu allen Kontrollpersonen. Es wurde eine eindeutig stadienabhängige

Serumantikörperantwort in den MM-Patienten gegen LAGE-1a nachgewiesen, die statistisch

signifikant ist. Desweiteren befinden sich die Patienten mit den höchsten gemessenen MFI-

Werten im Stadium IV, welches eine Unterscheidung der verschiedenen Stadien möglich

machen könnte.

Anhand der kumulativen Distributionen ist auf den ersten Blick erkennbar, dass für die Antigene

MAGE-A1, A3, A9, LAGE-1a, GAGE-7b und CAMEL die höchsten detektierbaren MFI-Werte

im MM-Kollektiv und bei näherer Betrachtung im Stadium IV gemessen wurden. Hingegen

wurden die höchsten MFI-Werte für die Antigene se70-2, GBP-5ta, cTAGE-5a N- und C-

terminal sowie p53 im Kontroll-Kollektiv gemessen. Die Antigene se57-1 und p16 wiesen die

höchsten MFI-Werte in den MM-Patienten der Stadien I und II auf. Demnach wurden hohe MFI-

Werte in den Patientenkollektiven vor allem für CTA mit Ausnahme von cTAGE-5a gemessen.

Laut „Fisher`s Exact Test“ konnten statistisch signifikante Unterschiede zwischen MM-Patienten

und Kontrollpersonen für die Antigene MAGE-A3, LAGE-1a, se70-2 und se57-1 berechnet

werden (Anhang 1). Ein Trend zu einem signifikanten Unterschied konnte für GAGE-7b

festgestellt werden. Die prozentual positiven Seren aller MM-Kollektive im Vergleich mit dem

Kontroll-Kollektiv sind in grafischer Form in Abbildung 3-12 aufbereitet.

Bemerkenswert für das Antigen LAGE-1a ist, dass sechs der 47 MM-Patienten in Stadium IV

Antikörpertiter von mehr als 10000 MFI gebildet hatten. Diese Titer liegen bereits im Bereich

der Reaktivitäten gegen virale Antigene. Zudem traten bei zwei der 47 Patienten Antikörper

gegen mehrere Antigene auf. Eine Patientin besaß gleichzeitig hohe Antikörperantworten gegen

MAGE-A1 (18275 MFI), MAGE-A3 (18000 MFI), MAGE-A9 (14310 MFI), LAGE-1a (17818

MFI) und GAGE-7b (5653 MFI) und eine andere Patientin gegen MAGE-A1 (6788 MFI),

MAGE-A3 (10823 MFI), MAGE-A9 (299 MFI) und LAGE-1a (4733 MFI). Für Patienten in

Stadium IV traten gleichzeitig Antikörper gegen mehrere Antigene der MAGE-Gruppe auf.

Hierzu zählten vier von 47 Stadium IV Patienten im Vergleich zu keinem oder einem Patienten

der anderen Stadien.

ERGEBNISSE 97

Abbildung 3-7: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und MM-

Kollektivs für MAGE-A1, A3 und A9

In den Abbildungen sind die Seren in prozentualer Verteilung gegen die entsprechenden MFI-Werte dargestellt. Der Cut-off-Wert für jedes Antigen ist als unterbrochene Linie eingezeichnet. Laut „Fisher’s Exact Test“ konnten statistisch signifikant erhöhte Seroreaktivitäten der MM-Patienten des Stadiums IV gegenüber der Kontroll-Gruppe für MAGE-A3 berechnet werden (p = 0,0128). Ctrl: Kontrollen, MM: Malignes Melanom, n: Anzahl getesteter Seren, MFI: „Mean fluorescence intensity“.

MAGE-A1

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

ICtrl (n=100)MM (n=191)Cut-off (102 MFI)

MAGE-A1

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)

MM StadiumI (n=48)MM StadiumII (n=49)MM StadiumIII (n=47)MM StadiumIV (n=47)Cut-off (102MFI)

MAGE-A3

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)MM (n=191)Cut-off (366 MFI)

MAGE-A3

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)


MAGE-A9

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


MAGE-A9

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)


D

B A

C

E F

ERGEBNISSE 98


Kollektivs für LAGE-1a, GAGE-7b und CAMEL

In den Abbildungen sind die Seren in prozentualer Verteilung gegen die entsprechenden MFI-Werte dargestellt. Der Cut-off-Wert für jedes Antigen ist als unterbrochene Linie eingezeichnet. Laut „Fisher’s Exact Test“ konnte ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Kontroll-Gruppe und MM-Patienten (p = 0,0034), Kontroll -Gruppe und MM-Patienten des Stadiums III (p = 0,0302) und IV (p = 0,0007) für LAGE-1a berechnet werden, wobei die Seroreaktivitäten der Patienten jeweils erhöht waren. Für GAGE-7b waren die Seroreaktivitäten der Patienten in Stadium II tendentiell gegenüber den Ctrl erhöht. Ctrl: Kontrollen, MM: Malignes Melanom, n: Anzahl getesteter Seren, MFI: „Mean fluorescence intensity“.

LAGE-1a

0

5000

10000

15000

20000

25000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF


LAGE-1a

0

5000

10000

15000

20000

25000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)


GAGE-7b

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)MM Stadium I (n=48)MM Stadium II (n=49)MM Stadium III (n=47)MM Stadium IV (n=47)Cut-off (59 MFI)GAGE-7b

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


CAMEL

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


CAMEL

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)MM Stadium I (n=48)MM Stadium II (n=49)MM Stadium III (n=47)MM Stadium IV (n=47)Cut-off (169 MFI)

A B

D C

E F

ERGEBNISSE 99


Kollektivs für se70-2, se57-2 und GBP-5ta

In den Abbildungen sind die Seren in prozentualer Verteilung gegen die entsprechenden MFI-Werte dargestellt. Der Cut-off-Wert für jedes Antigen ist als unterbrochene Linie eingezeichnet. Laut „Fisher’s Exact Test“ konnten für se70-2 statistisch signifikant erniedrigte Seroreaktivitäten der MM-Patienten (p = 0,0398) gegenüber der Kontroll-Gruppe berechnet werden. Für se57-1 waren die Seroreaktivtäten der MM-Patienten in Stadium II statistisch signifikant erhöht gegenüber der Kontroll-Gruppe (p = 0,0149). Ctrl: Kontrollen, MM: Malignes Melanom, n: Anzahl getesteter Seren, MFI: „Mean fluorescence intensity“.

se70-2

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF


se70-2

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


se57-1

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


se57-1

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


GBP-5ta

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


GBP-5ta

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


A B

E F

D C

ERGEBNISSE 100


Kollektivs für cTAGE-5a N- und C-terminal sowie p53

In den Abbildungen sind die Seren in prozentualer Verteilung gegen die entsprechenden MFI-Werte dargestellt. Der Cut-off-Wert für jedes Antigen ist als unterbrochene Linie eingezeichnet. Laut „Fisher’s Exact Test“ konnte für kein abgebildetes Antigen ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den MM-Patienten und der Kontroll-Gruppe berechnet werden. Ctrl: Kontrollen, MM: Malignes Melanom, n: Anzahl getesteter Seren, MFI: „Mean fluorescence intensity“.

cTAGE-5a N-terminal

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF


cTAGE-5a N-terminal

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


cTAGE-5a C-terminal

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0,1 1 10 100Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)MM Stadium I (n=48)MM Stadium II (n=49)MM Stadium III (n=47)MM Stadium IV (n=47)Cut-off (2564 MFI)cTAGE-5a C-terminal

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


p53

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


p53

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0,1 1 10 100Seren [%]

MF

I


A B

D C

E F

ERGEBNISSE 101


Kollektivs für p16

In den Abbildungen sind die Seren in prozentualer Verteilung gegen die entsprechenden MFI-Werte dargestellt. Der Cut-off-Wert für p16 ist als unterbrochene Linie eingezeichnet. Laut „Fisher’s Exact Test“ konnte für p16 kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den MM-Patienten und der Kontroll-Gruppe berechnet werden. Ctrl: Kontrollen, MM: Malignes Melanom, n: Anzahl getesteter Seren, MFI: „Mean fluorescence intensity“.

Antikörper gegen MAGE-A1 konnten in 7,3% der MM-Patienten und in 6,0% der Ctrl detektiert

werden. In Stadium I fanden sich in 10,4% der MM-Patienten, in Stadium II in 4,1%, in Stadium

III in 4,3% und in Stadium IV 10,6% Serumantikörperantworten gegen MAGE-A1 (Abbildung

3-12 und Anhang 2). Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Ctrl und Patienten

konnte nicht berechnet werden (siehe Anhang 1).

Gegen MAGE-A3 besaßen 8,4% der MM-Patienten und 5,0% der Ctrl Antikörper. 4,2% der

MM-Patienten in Stadium I, 2,0% in Stadium II, 8,5% in Stadium III und 19,1% in Stadium IV

waren seropositiv für MAGE-A3. Ein statistisch signifikanter Unterschied (p = 0,0128) für eine

höhere Frequenz an seropositiven MAGE-A3-Seren im Kollektiv der MM-Patienten in Stadium

IV gegenüber den Ctrl konnte bestimmt werden.

2,0% der Kontrollpersonen und 4,2% der MM-Patienten wiesen Antikörper gegen MAGE-A9

auf. Ähnliche Antikörperfrequenzen unter 10% wurden für Stadium I MM-Patienten mit 2,1%,

Stadium II mit 2,0%, Stadium III mit 4,3% und Stadium IV mit 8,5% gemessen. Für dieses

Antigen konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen

Kollektiven bestimmt werden.

LAGE-1a-Antikörper wurden in 3,0% der Ctrl und in 13,6% der MM-Patienten nachgewiesen.

Laut „Fisher’s Exact Test“ wurden statistisch signifikant erhöhte Antikörperfrequenzen in MM-

Patienten gegenüber Ctrl gemessen (p = 0,0034). In Stadium I MM-Patienten konnten in 10,4%

p16

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0,1 1 10 100Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)MM Stadium I (n=48)MM Stadium II (n=49)MM Stadium III (n=47)MM Stadium IV (n=47)Cut-off (636 MFI)p16

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF


A B

ERGEBNISSE 102

der Fälle Antikörper detektiert werden sowie in 10,2% in Stadium II, 12,8% in Stadium III und

21,3% in Stadium IV (Anhang 2). Neben den statistisch signifikant erhöhten

Antikörperantworten im Gesamtkollektiv bestätigte sich die signifikante Erhöhung der

Antikörperfrequenzen in Stadium III (p = 0,0302) und Stadium IV (p = 0,0007).

1,0% der Kontrollpersonen und 5,8% aller MM-Patienten waren seropositiv für GAGE-7b.

Antikörperantworten unter 10% ergaben sich ebenfalls für die Patientenkollektive der

verschiedenen Stadien (I: 4,2%, II: 8,2%, III: 4,3%, IV: 6,4%). Ein Trend hin zu signifikant

erhöhten Antikörperantworten gegen GAGE-7b in MM-Patienten des Stadiums II konnte

analysiert werden (p = 0,0404). Der p-Wert war nicht statistisch signifikant, da keine Signifikanz

im Vergleich aller Stadien mit dem Kontroll-Kollektiv berechnet wurde (Anhang 1).

Ein MM-Patient im Gegensatz zu keiner Kontrollperson bildete Antikörper gegen CAMEL.

Ebenso wurden keine Serumantikörper gegen CAMEL in MM-Patienten des Stadiums I und III

detektiert. Nur in 2,0% der Patienten des Stadiums II und 2,1% in Stadium IV wurden

Serumantikörper identifiziert. Aufgrund der niedrigen Serumantikörperantworten konnte kein

statistisch signifikanter Unterschied für CAMEL zwischen den Kollektiven festgestellt werden.

Für das Antigen se70-2 fanden sich in 3,0% der Ctrl Antikörper, jedoch nicht in MM-Patienten.

Daraus ergaben sich statistisch signifikant erhöhte se70-2-Antikörper in Kontrollpersonen im

Vergleich zum MM-Gesamtkollektiv (p = 0,0398).

se57-1 Antikörper wurden in 1,0% der Kontrollpersonen gegenüber 3,7% der MM-Patienten

gemessen. Hingegen besaßen 10,2% der MM-Patienten des Stadiums II Antikörper gegen se57-1

(p = 0,0149), woraus sich ein statistisch signifikanter Unterschied berechnen ließ. In Stadium I

(2,1%), Stadium III (0%) und Stadium IV MM-Patienten (2,1%) wurden weniger häufig

Antikörper gegen dieses Antigen nachgewiesen.

Das Antigen GBP-5ta erzeugte Antikörper in gleicher Häufigkeit in MM-Patienten (3,1%) und in

Ctrl (3,0%). Weder MM-Patienten in Stadium I noch in Stadium IV wiesen Antikörper gegen

GBP-5ta auf. MM-Patienten in Stadium II (6,1%) und IV (6,4%) besaßen leicht höhere

Antikörperfrequenzen, die jedoch allesamt nicht statistisch signifikant erhöht gegenüber den Ctrl

waren (Anhang 1 und Anhang 2).

ERGEBNISSE 103

Abbildung 3-12: Vergleich der prozentualen Seroreaktivität der Kontrollen mit allen MM-

Patienten (A) und den verschiedenen MM-Stadiengruppen (B)

Die Säulendiagramme stellen die prozentuale Seroreaktivität der einzelnen Personengruppen gegen die humanen Antigene dar. Die mit Stern (*) gekennzeichneten Antigene sind laut „Fisher’s Exact Test“

0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16%

MAGE-A1

MAGE-A3

MAGE-A9

LAGE-1a

GAGE-7b

CAMEL

se70-2

se57-1

GBP-5ta

cTAGE-5a N-terminal

cTAGE-5a C-terminal

p53

p16

Ant

igen

Seren über cut-off [%]

Ctrl (n=100)

MM (n=191)

0% 5% 10% 15% 20% 25%

MAGE-A1

MAGE-A3

MAGE-A9

LAGE-1a

GAGE-7b

CAMEL

se70-2

se57-1

GBP-5ta

cTAGE-5a N-terminal

cTAGE-5a C-terminal

p53

p16

Ant

igen


Ctrl (n=100)

MM-St I (n=48)

MM-St II (n=49)

MM-St III (n=47)

MM-St IV (n=47)

A: Prozentuale Sero-reaktivitäten Kontroll-Gruppe versus gesamtes MM-Kollektiv

B: Prozentuale Sero-reaktivitäten Kontroll-Gruppe versus verschiedene MM-Stadien

*

**

*

*** *

*

*

ERGEBNISSE 104

statistisch signifikant unterschiedlich zwischen der Kontroll-Gruppe und dem jeweiligen MM-Kollektiv. Dies trifft auf die Antigene MAGE-A3, LAGE-1a, se70-2 und se57-1 zu. Für GAGE-7b konnte laut Anhang 1 nur ein Trend nachgewiesen werden. *: 0,05 > p > 0,01; **: 0,01 > p > 0,001; ***: 0,001 > p. Ctrl: Kontrollen, MM-St I: Malignes Melanom Stadium I, n: Anzahl getesteter Seren.

Bei der Betrachtung der Antikörperantworten gegen das Antigen cTAGE-5a wurden der N-

terminale und C-terminale Teil unterschieden. Höhere Serumantikörper-Frequenzen wurden für

den N-terminalen Teil nachgewiesen. Jedoch konnte für beide Teile kein statistisch signifikanter

Unterschied zwischen MM-Patienten und Ctrl bestimmt werden. Gegen beide Antigene

produzierten 2,0% der Ctrl Antikörper. MM-Patienten wiesen in 2,6% (N-terminal) und 0,5%

(C-terminal) der Fälle Antikörper auf. Kein Stadium I Patient hatte Antikörper gegen einen der

beiden Teile. Der N-terminale Teil wurde von keinem Stadium II, 4,3% Stadium III und 6,4%

Stadium IV MM-Patienten erkannt. Der C-terminale Teil wurde von 2,0% der Stadium II MM-

Patienten und keinem Patienten in Stadium III und IV erkannt.

Für die Antigene p53 und p16 konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen MM-

Patienten und Kontrollpersonen berechnet werden, da ähnliche Serumantikörperantworten für

alle Kollektive gemessen wurden. Für p53 wurden folgende Werte bestimmt: Ctrl: 3,0%, MM:

2,1%, MM I: 0%, MM II: 2,0%, MM III: 4,3%, MM IV: 2,1%. Für p16 wurden die angegebenen

Werte erhalten: Ctrl: 2,0%, MM: 2,1%, MM I: 4,2%, MM II: 2,0%, MM III: 2,1%, MM IV: 0%

(Anhang 2).

Zusammenfassend bedeutet dies für die Beurteilung der Ergebnisse anhand der kumulativen

Distributionen und der statistischen Auswertung, dass Serumantikörper gegen die untersuchten

Antigene mit Ausnahme von LAGE-1a in einem MM-Kollektiv eher selten per se nachgewiesen

werden können. Die Antikörper-Häufigkeiten liegen zumeist unterhalb von 10%.

Kontrollpersonen haben teilweise bereits Serumantikörper gegen die verwendeten Antigene

gebildet. Hingegen sind Serumantikörper gegen LAGE-1a gerade in Stadium IV Patienten

deutlich gegenüber Kontrollpersonen erhöht. Ein eindeutig stadienabhängiges Auftreten an

LAGE-1a Serumantikörpern wurde nachgewiesen.

Verläufe von acht MM-Patienten

Ein Antikörper-Monitoring war bei acht MM-Patienten möglich. Es wurden zwei bis drei Seren

untersucht, deren Abnahmedatum bis zu 171 Wochen auseinander lag. Die zeitlich erste

Serumabnahme wurde als Woche 0 definiert. Von einem Patienten konnten drei Serumproben,

von den sieben weiteren Patienten jeweils zwei Serumproben untersucht werden. Fünf Patienten

schritten im Zeitraum der Serumabnahmen im Stadium fort („progressive disease“, PD, Patienten

#M1, #M3 - #M5 und #M8), für zwei Patienten blieb das Stadium gleich („stable disease“, SD,

ERGEBNISSE 105

Patienten #M6 und #M7) und für einen Patienten verbesserte sich das Stadium („partial

response“, PR, Patient #M2). In Abbildung 3-13 sind die Serumantikörperantworten

exemplarisch für einige humane Antigene (LAGE-1a, se57-1 und cTAGE-5a C-terminal) und

alle viralen Antigene angegeben.

Eine Serokonversion, die durch mindestens eine Verdopplung oder eine Halbierung der

Serumantikörperantwort gekennzeichnet ist, wobei mindestens ein Wert über dem Cut-off-Wert

liegen muss, wurde bei Patient #M3 nachgewiesen. Dieser schritt über einen Zeitraum von 98

Wochen von Stadium I bis IV fort. Diese Tatsache spiegelte sich in der Serumantikörperantwort

gegen LAGE-1a wider, welche von 0 auf 13820 MFI signifikant anstieg. Obwohl für MAGE-A9

kein MFI-Wert über dem Cut-off-Wert lag, ist auch hier ein Trend der Zunahme der Antikörper

zu erkennen (5 auf 139 MFI). Zudem lagen die gemessenen MFI-Werte gegen cTAGE-5a C-

terminal für diesen Patienten mit 2563 auf 2531 MFI nur knapp unter dem Cut-off-Wert und

blieben über den untersuchten Zeitraum hinweg gleich. Für Patient #M2 konnten Antikörper

gegen se57-1 nachgewiesen werden, die sich kaum über den Zeitraum von 144 Wochen

veränderten (2262 auf 1781 MFI). Patient #M6 in Stadium III hatte gleichbleibende Antikörper

gegen p16 (935 auf 654 MFI) über den Verlauf von 171 Wochen. Für Patient #M7 in Stadium IV

wurde ein Anstieg unterhalb Cut-off von 589 auf 1316 MFI für Antikörper gegen cTAGE-5a N-

terminal über den Verlauf von 33 Wochen gemessen. Schließlich verringerte sich die

Seroreaktivität von Patient #M8 gegen cTAGE-5a C-terminal über einen Zeitraum von 36

Wochen von 1615 auf 289 MFI, wobei auch diese MFI-Werte wiederum unter dem Cut-off Wert

lagen. Dieser Patient schritt in der Stadieneinteilung von III nach IV fort.

Keine signifikanten Antikörper-Veränderungen über die Zeit wurden für alle anderen Antigene

analysiert. Die gemessenen MFI-Werte lagen unter den Cut-off-Werten der jeweiligen Antigene.

Die viralen Antigene erzeugten deutlich höhere Serumantikörperantworten (BK bis zu 20000

MFI, vgl. Skala Abbildung 3-13) als die humanen Antigene. Für die viralen Antigene konnte

keine Serokonversion nachgewiesen werden. Dies entspricht den Erfahrungen der Arbeitsgruppe

von Dr. M. Pawlita am DKFZ (persönliche Mitteilung). Daher bestätigte sich die

Verwendbarkeit der Antikörperantworten gegen die viralen Antigene als Fingerprint.

ERGEBNISSE 106

Abbildung 3-13: Monitoring der Serumantikörperantwort von acht MM-Patienten

Die Serumantikörperantwort von acht MM-Patienten in unterschiedlichen Stadien der Erkrankung wurde während unterschiedlicher Zeiträume (33 bis 171 Wochen) betrachtet. Die erste untersuchte Serumabnahme wurde mit Woche 0 betitelt. In Abbildung A wurden drei der humanen Antigene ausgewählt und exemplarisch die Serumantikörperantworten über die Zeit dargestellt. Die Cut-off-Werte sind mit unterbrochenen Linien und dem Farbcode des jeweiligen Antigens eingezeichnet. Der Patient

BK, JV,LPV, HPV1

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 w

o (

I)

38

wo

(II

I)

65

wo

(IV

)

0 w

o (

II)

14

4 w

o (

I)

0 w

o (

I)

98

wo

(IV

)

0 w

o (

II)

87

wo

(II

I)

0 w

o (

III)

21

wo

(IV

)

0 w

o (

III)

17

1 w

o (

III)

0 w

o (

IV)

33

wo

(IV

)

0 w

o (

III)

36

wo

(IV

)

#M1(PD)

#M2(PR)

#M3(PD)

#M4(PD)

#M5(PD)

#M6(SD)

#M7(SD)

#M8(PD)

Patient [#], Zeit nach erster Serumabnahme [wo] und Stadium

MF

I

BKJCLPVHPV1

B

LAGE-1a, se57-1,cTAGE-5a C-terminal

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

0 w

o (

I)

38

wo

(II

I)

65

wo

(IV

)

0 w

o (

II)

14

4 w

o (

I)

0 w

o (

I)

98

wo

(IV

)

0 w

o (

II)

87

wo

(II

I)

0 w

o (

III)

21

wo

(IV

)

0 w

o (

III)

17

1 w

o (

III)

0 w

o (

IV)

33

wo

(IV

)

0 w

o (

III)

36

wo

(IV

)

#M1(PD)

#M2(PR)

#M3(PD)

#M4(PD)

#M5(PD)

#M6(SD)

#M7(SD)

#M8(PD)

Patient [#], Zeit nach erster Serumabnahme [wo] und Stadium

MF

ILAGE-1a

se57-1

cTAGE-5a C-terminal

A

ERGEBNISSE 107

#M3 durchlief eine deutliche Serokonversion für LAGE-1a, die mit der Verschlechterung des Stadiums einhergeht. Patient #M2 besaß ungefähr gleich bleibende Antikörper gegen se57-1. In Abbildung B sind die Veränderungen der Serumantikörperantworten über die Zeit gegen alle viralen Antigene dargestellt. Für die viralen Antigene konnte keine Serokonversion nachgewiesen werden, weshalb diese als Fingerprint dienen. #M1: Patient 1, wo: Wochen, (I): Stadium I, MFI: „Mean fluorescence intensity“, PD: “Progressive disease”, PR: “Partial response”, SD: “Stable disease”.

3.2.6 Untersuchung der Serumantikörperantwort gegen die verwendeten Antigene

in einem CTCL-Kollektiv

Antikörper gegen die unter 3.2.2 beschriebenen humanen und viralen Antigene wurden in 144

CTCL-Patienten sowie 100 Kontrollpersonen untersucht. Von den 144 CTCL-Patienten

befanden sich 55 Patienten in Stadium I, jeweils 14 Patienten in Stadium II und III und 16

Patienten in Stadium IV. Informationen über die Zuordnung zu einem Stadium waren nur für 99

CTCL-Patienten vorhanden, die entsprechend zur Evaluierung der Ergebnisse für die Stadien-

Kollektive herangezogen wurden. Die übrigen CTCL-Patienten wurden nur im Gesamtkollektiv

berücksichtigt. Für zwölf der 144 CTCL-Patienten konnten zudem Daten von bis zu 4

aufeinander folgenden Serumabnahmen ausgewertet werden. Somit konnte ein Vergleich der

Antikörperantworten in verschiedenen Kollektiven und ein Monitoring der Antikörperantwort in

CTCL-Patienten über die Zeit durchgeführt werden

Die kumulativen Distributionen in Abbildung 3-14 und Abbildung 3-15 stellen grafisch alle

Antigene dar, für die die MFI-Werte der verschiedenen CTCL-Kollektive zumeist über

denjenigen des Kontroll-Kollektivs und des Cut-off-Wertes lagen. Dies galt für die Antigene

MAGE-A1 (A, B), A3 (C, D), A9 (E, F), LAGE-1a (A, B), GAGE-7b (C, D) und CAMEL (E,

F). Für die Antigene se57-1 (Abbildung 3-16 C und D), cTAGE-5a N-terminal (Abbildung 3-17

A und B) und p53 (Abbildung 3-17 E und F) wurden ähnliche Profile der

Serumantikörperantworten in den CTCL-Kollektiven im Vergleich zum Kontroll-Kollektiv

gemessen. Für diese drei Antigene lagen die Kurven der MFI-Werte der Patienten und Ctrl fast

aufeinander und waren kaum unterscheidbar. Die Antigene se70-2 (Abbildung 3-16 A und B),

GBP-5ta (Abbildung 3-16 E und F), cTAGE-5a C-terminal (Abbildung 3-17 C und D) und p16

(Abbildung 3-18 A und B) schließlich bildeten höhere Serumantikörperantworten im Kontroll-

Kollektiv im Vergleich zu den CTCL-Kollektiven. Für diese Antigene verliefen die Kurven der

CTCL-Patienten unterhalb der Kurve des Kontroll-Kollektivs.

Neben dem Verlauf der Kurven für CTCL-Patienten und Kontrollpersonen kann anhand der

kumulativen Distributionen abgelesen werden, welches Kollektiv die höchsten MFI-Werte

aufwies. Damit können Stadiengruppen identifiziert werden, in denen sehr hohe

Antikörperantworten induziert wurden. Die Antigene MAGE-A1, A3, LAGE-1a, CAMEL und

ERGEBNISSE 108

cTAGE-5a N-terminal erzeugten die höchsten MFI-Werte in der Gruppe der CTCL-Patienten,

die sich in Stadium I befanden. MAGE-A9, GAGE-7b und p53 induzierten die höchsten MFI-

Werte in CTCL-Patienten der Stadiengruppe IV. Allein die MFI-Werte des Antigens se57-1

waren in CTCL-Patienten in Stadium II am höchsten. Für die restlichen Antigene (se70-2, GBP-

5ta, cTAGE-5a C-terminal und p16) wurden die höchsten MFI-Werte in der Kontroll-Gruppe

gemessen. In den CTCL-Patienten-Kollektiven konnte für kein Antigen eine eindeutig

stadienabhängige Induktion von Serumantikörpern gemessen werden (vgl. LAGE-1a im MM-

Kollektiv). Allerdings erzeugten wiederum vor allem die CTA hohe MFI-Werte in den CTCL-

Patienten. Dies weist auf die Immunogenität dieser Antigene hin.

Um die CTCL-Kollektive mit dem Kontroll-Kollektiv vergleichen zu können, wurde der

„Fisher`s Exact Test“ angewandt. Statistisch signifikant erhöhte Antikörperantworten in CTCL-

Patienten in Stadium IV gegenüber den Kontrollpersonen wurden nur für das CTA MAGE-A9

berechnet (Anhang 1). Ein Trend zu erhöhten Serumantikörper-Häufigkeiten konnte für

Patienten in Stadium III im Vergleich zu den Kontrollpersonen für MAGE-A1 bestimmt werden.

In grafischer Form sind diese Ergebnisse in Abbildung 3-19 dargestellt. Allerdings ist

hinsichtlich der Berechnung der statistischen Signifikanz zu bedenken, dass die Anzahl an Seren

in den vier Stadiengruppen sehr unterschiedlich und teilweise gering mit unter 20 Seren pro

Stadium für die Stadien II bis IV war.

Gegen MAGE-A1 konnten Antikörper in 10,4% aller CTCL-Patienten und 6,0% der Ctrl

nachgewiesen werden (Anhang 2). 10,9% der CTCL-Patienten in Stadium I, 7,1% in Stadium II

und 6,3% in Stadium IV besaßen Antikörper gegen dieses CTA. Signifikant erhöhte

Serumantikörper konnten in 28,6% der CTCL-Patienten in Stadium III gegenüber den Ctrl

identifiziert werden (p = 0,0199). Jedoch ist hier nur ein Trend erkennbar, da die statistische

Signifikanz über alle CTCL-Kollektive und das Kontroll-Kollektiv nicht erfüllt war.

Antikörper gegen MAGE-A3 konnten in 4,9% aller CTCL-Patienten und in 5,0% der Ctrl

detektiert werden. In Stadium I wurden in 3,6% der CTCL-Patienten und in Stadium IV in

12,5% Serumantikörperantworten gegen MAGE-A3 gemessen (Abbildung 3-19). Keine

Serumantikörper wurden in Patienten in Stadium II und III identifiziert. Ein statistisch

signifikanter Unterschied zwischen Ctrl und Patienten konnte nicht berechnet werden (siehe

Anhang 1).

Gegen MAGE-A9 besaßen 4,9% der CTCL-Patienten und 2,0% der Ctrl Antikörper. CTCL-

Patienten in Stadium I, II und III waren seronegativ für MAGE-A9. Hingegen wurden MAGE-

A9-Antikörper in einem Viertel aller CTCL-Patienten in Stadium IV beobachtet, so dass ein

ERGEBNISSE 109

statistisch signifikanter Unterschied (p = 0,0032) zwischen dem CTCL- und dem Kontroll-

Kollektiv bestimmt wurde.

Für alle folgenden Antigene konnte laut „Fisher’s Exact Test“ kein statistisch signifikanter

Unterschied zwischen den einzelnen Kollektiven berechnet werden.

Ähnliche Frequenzen an Serumantikörperantworten wurden im Gesamt-CTCL-Kollektiv (4,9%)

im Vergleich zum Kontroll-Kollektiv (3,0%) für LAGE-1a gemessen. Nur in Stadium I CTCL-

Patienten (10,9%) wurden Serumantikörper gegen LAGE-1a nachgewiesen, wohingegen in

keinem anderen Stadium Serumantikörper vorhanden waren (Anhang 2).

1,0% der Kontrollpersonen und 2,8% aller CTCL-Patienten wiesen Antikörper gegen GAGE-7b

auf. Antikörper-Frequenzen unter 10% wurden ebenfalls für Stadium I CTCL-Patienten mit

1,8% und Stadium IV mit 6,3% gemessen. Keine Antikörper lagen für dieses CTA in Stadium II

und III Patienten vor.

Für CAMEL konnten Antikörper nur im Gesamt-CTCL-Kollektiv (2,8%) und in Stadium I

(3,6%) detektiert werden. Alle anderen Kollektive waren seronegativ für CAMEL. Aufgrund der

geringen Antikörper-Frequenzen von CAMEL in allen Kollektiven wurde kein statistisch

signifikanter Unterschied berechnet.

0,7% aller CTCL-Patienten und eine Kontrollperson bildeten Antikörper gegen se70-2. CTCL-

Patienten in Stadium I besaßen zu 1,8% Serumantikörper gegen se70-2, wohingegen keine

Antikörper in Patienten in Stadium II bis IV gefunden wurden.

Für das Antigen se57-1 wurden in 1,0% der Kontrollpersonen und 0,7% aller CTCL-Patienten

Antikörper gemessen. Neben der Seronegativität der CTCL-Patienten in Stadium I, III und IV,

bildeten Patienten in Stadium II in 7,1% der Fälle Serumantikörperantworten gegen se57-1.

GBP-5ta-Antikörper wurden in 3,0% der Ctrl und 3,5% aller CTCL-Patienten gemessen. Eine

ähnliche Antikörper-Häufigkeit wurde mit 3,6% für CTCL-Patienten in Stadium I bestätigt,

wohingegen Patienten in Stadium II bis IV seronegativ waren (Anhang 2).

Die Antigene cTAGE-5a N- und C-terminal hatten ein ähnliches Antikörperprofil in CTCL-

Patienten und Ctrl. Beide erzeugten Antikörper von derselben Frequenz in Ctrl (2,0%) und in

CTCL-Patienten in Stadium III (7,1%). Weder CTCL-Patienten in Stadium II noch in Stadium

IV wiesen Antikörper gegen beide Antigene auf. Alle CTCL-Patienten (2,8%) und Patienten in

Stadium I (3,6%) wiesen Antikörper gegen den N-terminalen Anteil des Antigens auf, jedoch

nicht gegen den C-terminalen Teil.

ERGEBNISSE 110

Abbildung 3-14: Darstellung der kumulativen Distribution des Kontroll- und des CTCL-

Kollektivs für MAGE-A1, A3 und A9

In den Abbildungen sind die Seren in prozentualer Verteilung gegen die entsprechenden MFI-Werte dargestellt. Der Cut-off-Wert für jedes Antigen ist als unterbrochene Linie eingezeichnet. Laut „Fisher’s Exact Test“ konnten für MAGE-A1 tendentiell erhöhte Seroreaktivitäten der CTCL-Patienten im Stadium III gegnüber der Kontroll-Gruppe berechnet werden (p = 0,0199). Für MAGE-A9 wurden statistisch signifikant erhöhte Seroreaktivitäten der CTCL-Patienten in Stadium IV gegenüber der Kontroll-Gruppe berechnet (p = 0,0032). Ctrl: Kontrollen, CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, n: Anzahl getesteter Seren, MFI: „Mean fluorescence intensity“.

MAGE-A1

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

ICtrl (n=100)CTCL (n=144)Cut-off (102 MFI)

MAGE-A1

0

500

1000

1500

2000

2500

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)CTCL Stadium I (n=55)CTCL Stadium II (n=14)CTCL Stadium III (n=14)CTCL Stadium IV (n=16)Cut-off (102 MFI)

MAGE-A3

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)

CTCL StadiumI (n=55)CTCL StadiumII (n=14)CTCL StadiumIII (n=14)CTCL StadiumIV (n=16)Cut-off (366MFI)

MAGE-A3

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)CTCL (n=144)Cut-off (366 MFI)

MAGE-A9

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


MAGE-A9

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


A B

D C

E F

ERGEBNISSE 111


Kollektivs für LAGE-1a, GAGE-7b und CAMEL

In den Abbildungen sind die Seren in prozentualer Verteilung gegen die entsprechenden MFI-Werte dargestellt. Der Cut-off-Wert für jedes Antigen ist als unterbrochene Linie eingezeichnet. Laut „Fisher’s Exact Test“ konnte für kein abgebildetes Antigen ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den CTCL-Patienten und der Kontroll-Gruppe berechnet werden. Ctrl: Kontrollen, CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, n: Anzahl getesteter Seren, MFI: „Mean fluorescence intensity“.

LAGE-1a

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)CTCL Stadium I (n=55)CTCL Stadium II (n=14)CTCL Stadium III (n=14)CTCL Stadium IV (n=16)Cut-off (85 MFI)LAGE-1a

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF


GAGE-7b

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


GAGE-7b

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


CAMEL

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)CTCL Stadium I (n=55)CTCL Stadium II (n=14)CTCL Stadium III (n=14)CTCL Stadium IV (n=16)Cut-off (169 MFI)CAMEL

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


A B

D C

E F

ERGEBNISSE 112


Kollektivs für se70-2, se57-1 und GBP-5ta


se70-2

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF


se70-2

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


se57-1

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


se57-1

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


GBP-5ta

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


GBP-5ta

01000

2000

30004000

5000

60007000

8000

9000

10000

0,1 1 10 100Seren [%]

MF

I


E F

D C

A B

ERGEBNISSE 113


Kollektivs für cTAGE-5a N- und C-terminal sowie p53


cTAGE-5a N-terminal

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

0,1 1 10 100Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)CTCL Stadium I (n=55)CTCL Stadium II (n=14)CTCL Stadium III (n=14)CTCL Stadium IV (n=16)Cut-off (1781 MFI)cTAGE-5a N-terminal

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF


cTAGE-5a C-terminal

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


cTAGE-5a C-terminal

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0,1 1 10 100Seren [%]

MF

I


p53

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0,1 1 10 100Seren [%]

MF

I

Ctrl (n=100)CTCL Stadium I (n=55)CTCL Stadium II (n=14)CTCL Stadium III (n=14)CTCL Stadium IV (n=16)Cut-off (1403 MFI)p53

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


E F

D C

A B

ERGEBNISSE 114


Kollektivs für p16

In den Abbildungen sind die Seren in prozentualer Verteilung gegen die entsprechenden MFI-Werte dargestellt. Der Cut-off-Wert für p16 ist als unterbrochene Linie eingezeichnet. Laut „Fisher’s Exact Test“ konnte für p16 kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den CTCL-Patienten und der Kontroll-Gruppe berechnet werden. Ctrl: Kontrollen, CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, n: Anzahl getesteter Seren, MFI: „Mean fluorescence intensity“.

Das Tumorsuppressorgen p53 induzierte in 3,0% der Kontrollpersonen und 2,1% aller CTCL-

Patienten Antikörper. Seropositive Seren wurden zudem in 3,6% der Stadium I und 6,3% der

Stadium IV Patienten gemessen. Entsprechend wurden keine Antikörper in Stadium II und III

Patienten nachgewiesen.

Schließlich konnten für p16 nur Antikörper in 2.0% der Ctrl identifiziert werden, wohingegen

kein CTCL-Patient seropositiv für p16 war (Anhang 2).

Zusammenfassend kann anhand der kumulativen Distributionen und der statistischen

Auswertung festgestellt werden, dass ähnlich wie bereits für das MM-Kollektiv Serumantikörper

gegen die untersuchten Antigene in einem CTCL-Kollektiv eher selten per se nachgewiesen

werden können. Die Antikörper-Häufigkeiten liegen zumeist unterhalb von 10%.

Kontrollpersonen haben teilweise bereits Serumantikörper gegen die verwendeten Antigene

gebildet. Ein Antigen, das eindeutig stadienabhängig Serumantikörper in CTCL-Patienten

induziert, konnte bei dieser Untersuchung nicht identifiziert werden.

p16

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0,1 1 10 100

Seren [%]

MF

I


A B

p16

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0,1 1 10 100Seren [%]

MF

I


ERGEBNISSE 115

Abbildung 3-19: Vergleich der prozentualen Seroreaktivität der Kontrollen mit allen

CTCL-Patienten (A) und den verschiedenen CTCL-Stadiengruppen (B)

Die Säulendiagramme stellen die prozentuale Seroreaktivität der einzelnen Personengruppen gegen die humanen Antigene dar. Die mit Stern (*) gekennzeichneten Antigene sind laut „Fisher’s Exact Test“ statistisch signifikant unterschiedlich zwischen der Kontroll-Gruppe und dem jeweiligen CTCL-

0% 2% 4% 6% 8% 10% 12%

MAGE-A1

MAGE-A3

MAGE-A9

LAGE-1a

GAGE-7b

CAMEL

se70-2

se57-1

GBP-5ta

cTAGE-5a N-terminal

cTAGE-5a C-terminal

p53

p16

Ant

igen


Ctrl (n=100)

CTCL (n=144)

0% 5% 10% 15% 20% 25% 30%

MAGE-A1

MAGE-A3

MAGE-A9

LAGE-1a

GAGE-7b

CAMEL

se70-2

se57-1

GBP-5ta

cTAGE-5a N-terminal

cTAGE-5a C-terminal

p53

p16

Ant

igen


Ctrl (n=100)

CTCL-St I (n=55)

CTCL-St II (n=14)

CTCL-St III (n=14)

CTCL-St IV (n=16)

*

**

A: Prozentuale Sero-reaktivitäten Kontroll-Gruppe versus gesamtes CTCL-Kollektiv

B: Prozentuale Sero-reaktivitäten Kontroll-Gruppe versus verschiedene CTCL-Stadien

ERGEBNISSE 116

Kollektiv. Dies trifft auf das Antigen MAGE-A9 zu. Für MAGE-A1 konnte laut Anhang 1 nur ein Trend zu erhöhten Serumantikörper-Häufigkeiten in MM-Patienten gegenüber Ctrl gemessen werden *: 0,05 > p > 0,01, **: 0,01 > p > 0,001. Ctrl: Kontrollen, CTCL-St I: Kutanes T-Zell Lymphom Stadium I, n: Anzahl getesteter Seren.

Verläufe von zwölf CTCL-Patienten

Ein Antikörper-Monitoring war bei zwölf nicht immununbehandelten CTCL-Patienten möglich.

Es wurden zwei bis vier Seren pro Patient untersucht, die Zeiträume von bis zu 398 Wochen

überspannen. Die zeitlich erste Serumabnahme wurde als Woche 0 definiert. Von vier Patienten

war das Stadium zu Beginn und zum Ende des Abnahmezeitraumes bekannt. Bei zwei dieser

Patienten erfolgte eine Stadienverschlechterung (#C5, #C10) und zwei Patienten verblieben in

demselben Stadium (#C11, #C12). Acht der zwölf Patienten waren seronegativ für alle humanen

Tumorantigene und Tumorsuppressorgene (#C1, #C4 - #C7, #C9, #C11 #C12). Zu dieser

Gruppe zählten ebenfalls die Patienten mit bekannten Stadien. Allerdings wurde für Patient #C5

ein Anstieg der Antikörper gegen BK und für Patient #C12 ein Abfall der Antikörper gegen

HPV1 jeweils im Sinne einer Serokonversion nachgewiesen. Diese Veränderungen in der

Serumantikörperantwort der viralen Antigene standen jedoch in keinem Zusammenhang mit

einer Veränderung der Serumantikörperantwort gegen humane Antigene. Patient #C2 wies einen

signifikanten Abfall der Antikörper gegen MAGE-A1 über 287 Wochen (von 241 auf 120 MFI,

Serokonversion) und einen signifikanten Anstieg der Antikörper gegen MAGE-A3 von 272 auf

859 MFI (Serokonversion) auf. Dieser Patient befand sich zum Zeitpunkt 0 in Stadium Ib, das

Stadium nach 287 Wochen ist jedoch unbekannt. Für Patient #C3 konnte ein signifikanter

Anstieg der Antikörper gegen p53 von 137 auf 12361 MFI in einem Zeitraum von 52 Wochen

analysiert werden (Abbildung 3-20). Der Patient befand sich bei der letzten Serumabnahme im

Stadium IVc. Eine Korrelation der Zunahme an p53-Antikörpern mit einem Übergang in

Stadium IV ist bei diesem Patienten leider nicht zu treffen, da die Angabe des Stadiums zum

Zeitpunkt 0 fehlt. Patient #C8, der sich zu Beginn im Stadium Ic befand, besaß Antikörper gegen

MAGE-A1 über 147 Wochen. Seine Antikörper gegen LAGE-1a nahmen signifikant von 5700

auf 2325 MFI ab. Auch für diesen Patienten ist das Stadium nach 147 Wochen nicht bekannt.

Patient #C10 schließlich schritt über 200 Wochen von Stadium Ib nach IIIc fort. Dies spiegelte

sich in einer signifikanten Antikörperzunahme gegen cTAGE-5a C-terminal (1159 auf 2773

MFI) wider. Bei vier von zwölf CTCL-Patienten konnte demnach eine Serokonversion

hinsichtlich der Serumantikörperantwort gegen humane Antigene im Verlauf der Erkrankung

festgestellt werden, die zumindest für einen Patienten mit einer Verschlechterung des Stadiums

korreliert.

ERGEBNISSE 117

Abbildung 3-20: Monitoring der Serumantikörperantwort von zwölf CTCL-Patienten

Die Serumantikörperantwort von zwölf CTCL-Patienten in unterschiedlichen Stadien der Erkrankung wurde während unterschiedlicher Zeiträume (17 bis 398 Wochen) betrachtet. Die erste untersuchte Serumabnahme wurde mit Woche 0 betitelt. In Abbildung A wurden vier der humanen Antigene ausgewählt und exemplarisch die Serumantikörperantworten über die Zeit dargestellt. Die Cut-off-Werte sind mit unterbrochenen Linien und dem Farbcode des jeweiligen Antigens eingezeichnet. Patient #C2 wies einen signifikanten Anstieg der Antikörper gegen MAGE-A3 auf, ebenso wie Patient #C3 gegen p53 und Patient #C10 gegen cTAGE-5a C-terminal. Antikörper gegen LAGE-1a nahmen signifikant in Patient #C8 ab. In Abbildung B sind die Veränderungen der Serumantikörperantworten über die Zeit gegen alle viralen Antigene dargestellt. Eine Serokonversion konnte für BK in Patient #C5 und für HPV1 in Patient #C12 gemessen werden. #C1: Patient 1, wo: Wochen, (I): Stadium I, MFI: „Mean fluorescence intensity“,

MAGE-A3, LAGE-1a,cTAGE-5a C-terminal, p53

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0 w

o (

Ib)

103

wo

0 w

o (

Ib)

287

wo

0 w

o5

2 w

o (

IVc)

0 w

o (

Ib)

62 w

o (

Ic)

285

wo

398

wo

0 w

o (

Ib)

19

2 w

o (

IIIc)

0 w

o33

wo

(Ic

)85

wo

0 w

o (

Ib)

315

wo

(Ib

)

0 w

o (

Ic)

147

wo

0 w

o (

Ib)

17 w

o

0 w

o (

Ib)

20

0 w

o (

IIIc)

0 w

o (

IVa)

39

wo

(IV

a)

0 w

o (

Ib)

261

wo

(Ib

)

#C1 #C2 #C3 #C4 #C5(PD)

#C6 #C7(SD)

#C8 #C9 #C10(PD)

#C11(SD)

#C12(SD)

Patient [#], Zeit nach erster Abnahme [wo], Stadium und klinisches Bild

MF

IMAGE-A3LAGE-1ap53cTAGE-5a C-terminal

BK, JC,LPV, HPV1

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

0 w

o (I

b)

103

wo

0 w

o (I

b)

287

wo

0 w

o52

wo

(IV

c)

0 w

o (I

b)

62

wo

(Ic)

285

wo

398

wo

0 w

o (I

b)

192

wo

(IIIc

)

0 w

o3

3 w

o (I

c)85

wo

0 w

o (I

b)

315

wo

(Ib

)

0 w

o (I

c)1

47 w

o

0 w

o (I

b)

17 w

o

0 w

o (I

b)

200

wo

(IIIc

)

0 w

o (I

Va

)39

wo

(IV

a)

0 w

o (I

b)

261

wo

(Ib

)

#C1 #C2 #C3 #C4 #C5(PD)

#C6 #C7(SD)

#C8 #C9 #C10(PD)

#C11(SD)

#C12(SD)

Patient [#], Zeit nach erster Abnahme [wo], Stadium und klinisches Bild

MF

I

BK

JCLPV

HPV1

A

B

ERGEBNISSE 118

CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, PD: “Progressive disease”, PR: “Partial response”, SD: “Stable disease”.

Zusammenfassend ist in den vorliegenden Studien festzustellen, dass sowohl bei CTCL- als auch

bei MM-Patienten, die keine Immuntherapie erfahren haben, eine Veränderung des

Serumantikörperprofils oder eine Serokonversion relativ selten stattfinden. Das

Serumantikörperprofil ist somit relativ stabil über die Zeit gesehen. Falls es jedoch zu einer

dramatischen Serokonversion bzw. Veränderung der Serumantikörper kommt, ist dies teilweise

mit einer Veränderung des Stadiums korreliert (vgl. Patient #M3 Verläufe der acht MM-

Patienten). Allein für LAGE-1a wurde in MM-Patienten ein stadienabhängiges

Serumantikörperprofil nachgewiesen, welches für Therapieverlaufskontrollen verwendet werden

könnte.

ERGEBNISSE 119

3.2.7 Monitoring der Serumantikörperantwort in immunbehan delten CTCL-

Patienten

Für an CTCL erkrankte Patienten werden immunmodulierende Behandlungen als

vielversprechende Therapien diskutiert (Muche and Sterry 2002). Um mögliche Effekte

verschiedener Immuntherapien auf CTCL-Patienten zu untersuchen, wurden Seren auf ihre

Seroreaktivität gegen alle in Tabelle 3-4 aufgeführten humanen und viralen Antigene mittels der

Multiplex-Serologie getestet. Für diese Untersuchung konnten 66 Seren von 19 Patienten, die

mit einem rekombinanten Adenovirus als Träger von Interferon-γ (IFN-γ) behandelt wurden,

herangezogen werden. Zudem wurden 45 Seren von fünf Patienten, die mit einem

handelsüblichen Masernimpfstoff immunisiert wurden, auf ihre humorale Immunantwort

getestet. Von den Patienten standen jeweils Seren vor, während und nach den jeweiligen

Immunisierungen zur Verfügung. Um die Veränderung der Serumantikörperantwort richtig

werten zu können, wurden folgende Kriterien festgelegt: Eine Serokonversion liegt erst vor,

wenn sich die Antikörperantwort gegen ein Antigen über die Zeit mindestens verdoppelt oder

mindestens halbiert. Zu beachten ist, dass hierbei mindestens ein MFI-Wert über dem Cut-off-

Wert liegen muss.

Adenovirale Immuntherapie

Neunzehn CTCL-Patienten wurden mit einem nicht-replizierenden Adenovirus Typ 5 Vektor

immunisiert, der ein humanes IFN-γ cDNA Insert trägt. Die Patienten erhielten in den ersten drei

Wochen der Behandlung einmal wöchentlich eine Injektion in den Tumor. In der vierten Woche

erfolgte keine Injektion. Diese Art der Immunisierung im Verlauf von vier Wochen wurde in bis

zu vier Zyklen durchgeführt. Elf der 19 immunbehandelten Patienten wiesen keine Antikörper

gegen eines der humanen Antigene auf. Jedoch konnte für Patient #008 eine eindeutig positive

Serokonversion detektiert werden. Für diesen Patienten stiegen die Antikörper gegen MAGE-A3

von 30 über 1539 bis zu finalen 798 MFI an. Sieben Patienten hatten gleich bleibende

Serumantikörper gegen unterschiedliche Antigene (Tabelle 3-5, Abbildung 3-21). Patient #003

besaß Antikörper gegen GBP-5ta und cTAGE-5a N-terminal (zwei Seren von vier seropositiv).

Patient #004 erkannte mit gleich bleibenden Serumantikörpern die Antigene MAGE-A3 und A9.

LAGE-1a hatte Antikörper in Patient #006 und GAGE-7b in Patient #009 bereits vor der

Immuntherapie induziert. Gegen CAMEL und GBP-5ta (ein Serum von drei Seren seropositiv)

konnten Antikörper im Serum von Patient #014 identifiziert werden. Patient #018 schließlich

bildete gleich bleibende Antikörper gegen die vier Antigene MAGE-A1, A3, A9 und LAGE-1a.

Jedoch konnte kein einheitlicher Effekt der adenoviralen Immuntherapie auf die humorale

ERGEBNISSE 120

Immunantwort der Patienten erkannt werden. Die Auswertung der klinischen Parameter und des

klinischen Verlaufs liegen zur Zeit nur für die Patienten #001 bis #009 vor. Eine vollständige

Regression konnte für drei Patienten (#002, #006, #009) detektiert werden. Wie oben

beschrieben besaßen #006 und #009 gleich bleibende Antikörpertiter ohne Serokonversion. Eine

partielle Regression wurde für die Patienten #001 und #008 registriert. Einzig Patient #008 wies

eine Serokonversion auf. Die Patienten #003 bis #005 und #007 befanden sich in einem stabilen

Zustand ihrer Erkrankung. Der stabile Krankheitszustand der Patienten #003 und #004 spiegelte

sich in konstanten Antikörpertitern wider (Dummer et al. 2004). Die Serumantikörperantworten

gegen die viralen Antigene waren für alle Patienten bis auf die Patienten #011, #015 und #020

gleich bleibend (Abbildung 3-21). Für Patient #011 wurde ein Anstieg der Serumantikörper

gegen BK und HPV1 detektiert und für Patient #015 gegen JC. Die Antikörperantworten von

Patient #020 stiegen gegen die Antigene BK, JC und LPV an, wobei in einem Wiederholungstest

diese Anstiege nicht mehr detektiert werden konnten. Somit ist von einem Pipettierfehler

auszugehen. Für eine verlässliche statistische Auswertung war die Anzahl der getesteten Seren

zu gering.

Tabelle 3-5: Veränderung der Serumantikörperantwort gegen alle Antigene in 19

immunbehandelten CTCL-Patienten im Verlauf der Therapie

Neunzehn CTCL-Patienten wurden mit einem adenoviralen Vektor, der das humane Interferon (IFN)-γ Gen trägt, immunisiert und die Serumantikörperantwort analysiert. Während des Monitorings der Serumantikörperantwort wurden vor allem gleich bleibende Antikörpertiter (→,→1 ein Serum von drei Seren seropositiv,→2 vier Seren von sechs seropositiv,→3 zwei Seren von vier seropositiv) und für ein humanes Antigen (MAGE-A3) eine positive Serokonversion (↑) nachgewiesen. PR: „Partial response“, CR: „Complete response”, SD: “Stable disease”.

Patient MAGE-A1

MAGE-A3

MAGE-A9

LAGE-1a

GAGE-7b

CAMEL se70-2

se57-1

GPB-5ta

cTAGE-5aN-terminal

cTAGE-5aC-terminal

p53 p16 Klinisches Bild

# 001 - - - - - - - - - - - - - PR# 002 - - - - - - - - - - - - - CR

# 003 - - - - - - - - → → 3 - - - SD# 004 - → → - - - - - - - - - - SD# 005 - - - - - - - - - - - - - SD# 006 - - - - → - - - - - - - - CR# 007 - - - - - - - - - - - - - SD# 008 - ↑ - - - - - - - - - - - PR# 009 - - - - → - - - - - - - - CR# 010 - - - - - - - - - - - - - -# 011 - - - - - - - - - - - - - -# 013 - - - - - - - - - - - - - -

# 014 - - - - - → - - → 1 - - - - -# 015 - - - - - - - - - - - - - -# 016 - - - - - - - - - - - - - -# 017 - - - - - - - - - - - - - -# 018 → → → → - - - - - - - - - -

# 019 - - - - - - - - → 2 - - - - -# 020 - - - - - - - - - - - - - -

ERGEBNISSE 121

Abbildung 3-21: Darstellung der Serumantikörperantwort der 19 immunbehandelten

CTCL-Patienten im Verlauf der Therapie

In Abbildung A und B sind die Serumantikörperantworten aller 19 CTCL-Patienten, die mit einem adenoviralen Vektor, der das humane Interferon (IFN)-γ-Gen trägt, immunisiert wurden, im Verlauf der Therapie dargestellt. Mit Ausnahme von Patient #002 (X) sind alle Seren am Tag 0 vor Beginn der Immuntherapie entnommen worden. Der Zeitraum des Monitorings der Patienten beträgt bis zu 234 Tage nach der ersten Immunisierung. Cut-off-Werte der humanen Antigene sind mit unterbrochenen Linien entsprechend des Farbcodes des jeweiligen Antigens eingezeichnet. In A sind die Serumantikörperantworten exemplarisch für die humanen Antigene MAGE-A3, CAMEL und GBP-5ta zusammengefasst, in B für alle viralen Antigene. Eine positive Serokonversion wurde in Patient #008 gegen MAGE-A3 nachgewiesen. In verschiedenen Patienten konnten gleich bleibende

A

B

BK, JC, LPV, HPV1

0

5000

10000

15000

20000

25000

03

6 X 41

91

14

0 03

56

41

05 0

33 0

29

66

93 0

36 0

32 0

69

10

21

44 0

62 0

42 0

43

78

10

41

40 0

32

6 03

66

4 03

36

29

0 03

46

41

33 0

42

77

10

61

33

16

91

97

22

42

52

29

4 03

8 04

07

51

10

15

22

15 0

41

#001 #002 #003 #004 #005 #006 #007 #008 #009 #010 #011 #013 #014 #015 #016 #017 #018 #019 #020

Patienten [#] und Tage nach Vakzinierung

MF

I

BK

JC

LPV

HPV1

MAGE-A3, CAMEL, GBP-5ta

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 36 X 41

91

14

0 0 35

64

10

5 0 33 0 29

66

93 0 36 0 32 0 69

10

21

44 0 62 0 42 0 43

78

10

41

40 0

32

6 0 36

64 0 33

62

90 0 34

64

13

3 0 42

77

10

61

33

16

91

97

22

42

52

29

4 0 38 0 40

75

11

01

52

21

5 0 41

#001 #002 #003 #004 #005 #006 #007 #008 #009 #010 #011 #013 #014 #015 #016 #017 #018 #019 #020

Patienten und Tage nach Vakzinierung

MF

I

MAGE-A3

CAMEL

GBP-5ta

A

B

ERGEBNISSE 122

Antikörperantworten gegen MAGE-A1, A3, A9, LAGE-1a, GAGE-7b, CAMEL, GBP-5ta und cTAGE-5a N-terminal gemessen werden. Über die Zeit wurden positive Serokonversionen einiger viraler Antigene in den Patienten #011, #015 und #020 gemessen. MFI: „Mean fluorescence intensity“, CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom.

Masernimpfstoff

Fünf Patienten wurden mit dem Lebendimpfstoff des Edmonston-Zagreb Masernvirus behandelt.

Der Lebendimpfstoff wurde direkt in den Tumor appliziert, nachdem eine neun Millionen

Einheiten Dosis an IFN-α zweimalig subkutan verabreicht worden war. Diese Vorbehandlung

fand jeweils 72 und 24 Stunden vor der eigentlichen Lebendimpfstoff-Injektion statt. Jeder

Behandlungszyklus bestand aus zwei Injektionen in den Tumor an Tag vier und 17 der Therapie,

wobei zwei unterschiedliche Dosierungen an Lebendimpfstoff gewählt wurden (Heinzerling et

al. 2005).

Für die Patienten, die mit dem Masernimpfstoff immunisiert wurden, wurden ausschließlich

gleich bleibende Antikörperantworten gemessen, sowohl für die humanen als auch für die viralen

Antigene (Tabelle 3-6). Für keinen Patienten fand eine Serokonversion in Form eines Anstiegs

oder eines Abfalls der Serumantikörperantwort statt.

Tabelle 3-6: Veränderung der Serumantikörperantwort gegen alle Antigene in fünf

immunbehandelten CTCL-Patienten im Verlauf der Therapie

Fünf CTCL-Patienten wurden mit einem handelsüblichen Masernimpfstoff immunisiert und die Serumantikörperantwort analysiert. Während des Monitorings der Serumantikörperantwort wurden ausschließlich gleich bleibende Antikörpertiter (→,→1 sechs Seren von zwölf Seren seropositiv,→2 ein Serum von elf Seren seropositiv) nachgewiesen. CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, MAGE: Melanom Antigen, HPV: Humanes Papillomavirus, PR: „Partial response“, CR: „Complete response”, MR: “Minor response”.

Zwei der fünf Patienten wiesen keine Antikörper gegen humane Antigene auf. Patient #0005

bildete gleich bleibende Serumantikörper gegen die humanen Antigene MAGE-A3 und A9. Nur

ein Serum von elf von Patient #0001 war positiv für p53. Antikörper gegen CAMEL waren vor

und nach der Therapie bei Patient #0002 vorhanden sowie Antikörper gegen GBP-5ta bei der

Hälfte von 12 Seren (Abbildung 3-22). Allerdings ist bei Patient #0002 eine eindeutige Tendenz

zum Anstieg verschiedener Serumantikörper zu erkennen, wenn auch teilweise unterhalb des

Cut-off-Wertes oder nicht gemäß der Definition einer Serokonversion.

Patient MAGE-A1

MAGE-A3

MAGE-A9

LAGE-1a

GAGE-7b

CAMEL se70-2

se57-1

GBP-5ta

cTAGE-5aN-terminal

cTAGE-5aC-terminal

p53 p16 Klinisches Bild

# 0001 - - - - - - - - - - - → 2 - PR

# 0002 - - - - - → - - → 1 - - - - CR# 0003 - - - - - - - - - - - - - PR# 0004 - - - - - - - - - - - - - MR# 0005 - → → - - - - - - - - - - PR

ERGEBNISSE 123

Abbildung 3-22: Darstellung der Serumantikörperantwort der fünf mit einem

Masernimpfstoff behandelten CTCL-Patienten im Verlauf der Therapie

In Abbildung A und B sind die Serumantikörperantworten der fünf CTCL-Patienten, die mit einem handelsüblichen Masernimpfstoff immunisiert wurden, im Verlauf der Therapie dargestellt. Allen Patienten wurde vor der Immuntherapie (Tag 0) Blut entnommen. Der Zeitraum des Monitorings der Patienten beträgt bis zu 113 Tage nach der ersten Immunisierung. Cut-off-Werte der humanen Antigene sind mit unterbrochenen Linien entsprechend des Farbcodes des jeweiligen Antigens eingezeichnet. In A sind die Serumantikörperantworten exemplarisch für die humanen Antigene MAGE-A3, CAMEL, GBP-

A

B

MAGE-A3, CAMEL, GBP-5ta, cTAGE-5a N-terminal

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 14

21

28

32

91

92

98

10

51

09

11

3 0 6 12

15

16

56

58

61

65

68

69

90 0 1 6 14

22 0 13

14

21

27

34

38

41

42

48

56 0 10

11

16

24

31

# 0001 # 0002 # 0003 # 0004 # 0005


MF

IMAGE-A3CAMELGBP-5tacTAGE-5a N-terminal

BK, JC, LPV, HPV1

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 14

21

28

32

91

92

98

10

51

09

11

3 0 6 12

15

16

56

58

61

65

68

69

90 0 1 6 14

22 0 13

14

21

27

34

38

41

42

48

56 0 10

11

16

24

31

# 0001 # 0002 # 0003 # 0004 # 0005


MF

I

BK

JC

LPV

HPV1

(PR) (PR) (PR) (MR) (CR)

(PR) (PR) (PR) (MR) (CR)

ERGEBNISSE 124

5ta und cTAGE-5a N-terminal zusammengefasst, in B für alle viralen Antigene. Nur für Patient # 0002 lässt sich eine tendenziell ansteigende Antikörperantwort der Antigene CAMEL, GBP-5ta und cTAGE-5a N-terminal erkennen. MFI: „Mean fluorescence intensity“, CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, PR: „Partial response“, CR: „Complete response”, MR: “Minor response”.

Für cTAGE-5a N-terminal wurde in Patient #0002 ein deutlicher Anstieg der Antikörper von 84

auf 408 MFI gemessen. Auch für CAMEL ist dieser Anstieg von 1889 auf 2400 MFI zu

erkennen. Für GBP-5ta steigen die Antikörper leicht von 1408 auf 1759 MFI an. Dieser Trend

des Anstiegs von Serumantikörpern korreliert mit dem Krankheitsverlauf des Patienten.

Heinzerling et al. (2005) beschrieben im Verlauf der Therapie bei diesem Patienten eine

komplette Remission des mit dem Masernimpfstoff behandelten Plaque sowie ein Ansprechen

einer weiteren Läsion, die im Anschluss an die Remission des ersten Plaques behandelt wurde.

Einzig bei Patient #0003 konnte eine vollständige Remission des behandelten Plaques erzielt

werden. Drei der anderen Patienten wiesen eine partielle Remission auf. Für Patient #0004

konnte nur ein geringfügiges Ansprechen auf die Therapie nachgewiesen werden.

ERGEBNISSE 125

3.3 Expressionsanalyse des Cancer Testis Antigens GAGE-7b

Das CTA GAGE-7b sollte in dieser Arbeit hinsichtlich seiner Expression an verschiedenen

Zelllinien und Gewebeproben von MM-Patienten untersucht werden. Dies erfolgte auf mRNA-

Ebene mittels Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) und auf Proteinebene

mittels polyklonaler Antikörper, die hierfür in Kaninchen generiert wurden. Für die Herstellung

der Antikörper musste zunächst aufgereinigtes Protein gewonnen werden.

3.3.1 Identifizierung von GAGE-7b und Homologie der GAGE-Familie

Zunächst wurde GAGE-1 unter der Verwendung von Tumor-reaktiven, autologen zytotoxischen

T-Lymphozyten (CTL) an der MM-Zelllinie MZ2-Mel identifiziert (Van den Eynde et al. 1995).

Das antigene Peptid YRPRPRRY wurde von reaktiven CTL auf dem HLA Klasse I Molekül

Cw6 erkannt und führte zur Lyse der Tumorzellen. GAGE-1, 2 und 8 kodieren für dieses Peptid.

Die durchgeführte Expressionsanalyse ergab eine Cancer Testis-spezifische Expression. Ein

anderer CTL-Klon reagierte gegen das HLA Klasse I A29-präsentierte Epitop YYWPRPRRY,

welches aus dem gleichen Bereich des GAGE-Proteins stammt (De Backer et al. 1999). Dieses

Epitop wird von den Antigenen GAGE-3, -4, -5, -6, -7 und –7b kodiert. Somit konnten an

cDNA-Banken insgesamt 9 verschiedene GAGE-mRNAs isoliert werden (Van den Eynde et al.

1995; Chen et al. 1998; De Backer et al. 1999). In Abbildung 3-23 ist eine Analyse mit dem

HUSAR-Programm „Clustal“ zur Verdeutlichung der hohen Homologie der GAGE-Familie auf

Proteinebene dargestellt.

3.3.2 Expressionsanalyse von GAGE-7b mRNA

Zwei verschiedene Primerpaare wurden für die Expressionsanalyse verwendet (De Backer et al.

1999). Es wurde darauf verzichtet, Normalgewebe auf mRNA-Ebene zu testen, da bekannt ist,

dass alle GAGE-Gene CTA sind. Für den Nachweis von GAGE-1, 2 und 8 wurden der Forward

Primer vde44 und der Reverse Primer vde24 verwendet, die ein Produkt der Länge 244bp

ergeben. Ein Produkt gleicher Größe wurde für den Nachweis von GAGE-3 bis 7 und 7b unter

Verwendung des Forward Primers vv-1 und des Reverse Primers vde24 gewählt. In Abbildung

3-24 ist ein repräsentatives Agarosegel der RT-PCR mit verschiedenen Zelllinien unter

Verwendung beider Primerpaare dargestellt.

ERGEBNISSE 126

1 50 GAGE-1.PEP ~MSWRGR.ST YRPRPRRYVE PPEMIGPMRP EQFSDEVEPA TPEEGEPATQ GAGE-2.PEP ~MSWRGR.ST YRPRPRRYVE PPEMIGPMRP EQFSDEVEPA TPEEGEPATQ GAGE-3.PEP MNLSRGKSTY YWPRPRRYVQ PPEVIGPMRP EQFSDEVEPA TPEEGEPATQ GAGE-4.PEP ~MSWRGRSTY YWPRPRRYVQ PPEMIGPMRP EQFSDEVEPA TPEEGEPATQ GAGE-5.PEP ~MSWRGRSTY YWPRPRRYVQ PPEVIGPMRP EQFSDEVEPA TPEEGEPATQ GAGE-6.PEP ~MSWRGRSTY YWPRPRRYVQ PPEVIGPMRP EQFSDEVEPA TPEEGEPATQ GAGE-7.PEP ~MSWRGRSTY YWPRPRRYVQ PPEMIGPMRP EQFSDEVEPA TPEEGEPATQ GAGE-7b.pep ~MSWRGRSTY YWPRPRRYVQ PPEMIGPMRP EQFSDEVEPA TPEEGEPATQ GAGE-8.PEP ~MSWRGR.ST YRPRPRRYVE PPEMIGPMRP EQFSDEVEPA TPEEGEPATQ 51 100 GAGE-1.PEP RQDPAAAQEG EDEGASAGQG PKPEADSQEQ GHPQTGCECE DGPDGQEMDP GAGE-2.PEP RQDPAAAQEG EDEGASAGQG PKPEAHSQEQ GHPQTGCECE DGPDGQEMDP GAGE-3.PEP RQDPAAAQEG EDEGASAGQG PKPEADSQEQ GHPQTGCECE DGPDGQEMDP GAGE-4.PEP RQDPAAAQEG EDEGASAGQG PKPEADSQEQ GHPQTGCECE DGPDGQEMDP GAGE-5.PEP RQDPAAAQEG EDEGASAGQG PKPEADSQEQ GHPQTGCECE DGPDGQEMDP GAGE-6.PEP RQDPAAAQEG EDEGASAGQG PKPEADSQEQ GHPQTGCECE DGPDGQEVDP GAGE-7.PEP RQDPAAAQEG EDEGASAGQG PKPEAHSQEQ GHPQTGCECE DGPDGQEMDP GAGE-7b.pep RQDPAAAQEG EDEGASAGQG PKPEAHSQEQ GHPQTGCECE DGPDGQEMDP GAGE-8.PEP RQDPAAAQEG EDEGASAGQG PKPEADSQEQ GHPQTGCECE DGPDGQEMDP 101 140 GAGE-1.PEP PNPEEVKTPE EEMRSHYVAQ TGILWLLMNN CFLNLSPRKP GAGE-2.PEP PNPEEVKTPE EGEKQSQC~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ GAGE-3.PEP PNPEEVKTPE EGEKQSQC~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ GAGE-4.PEP PNPEEVKTPE EGEKQSQC~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ GAGE-5.PEP PNPEEVKTPE EGEKQSQC~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ GAGE-6.PEP PNPEEVKTPE EGEKQSQC~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ GAGE-7.PEP PNPEEVKTPE EGEKQSQC~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ GAGE-7b.pep PNPEEVKTPE EGEKQSQC~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ GAGE-8.PEP PNPEEVKTPE EGEKQSQC~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~

Abbildung 3-23: Multiples Alignment der GAGE-Proteine Unter Verwendung der Software „Clustal“ des HUSAR Bioinformatik-Programms des DKFZ wurde dieses multiple Alignment der Proteine der 9 Familienmitglieder der GAGE-Familie angefertigt. Blau: 100% Identität der Aminosäuren innerhalb der Spalte, rot: mindestens 75% Identität der Aminosäuren innerhalb der Spalte, grün: mehr als 50% Identität der Aminosäuren in der Spalte.

Abbildung 3-24: Repräsentative RT-PCR mit beiden GAGE-Primerpaaren cDNA von CTCL- und MM-Zelllinien sowie MM-Geweben wurde verwendet. Als Positivkontrolle diente Testis- und UKVR-Mel-02-cDNA, als Negativkontrolle Wasser. In A wurde das Primerpaar für GAGE-1, 2, 8 und in B für GAGE-3 bis 7b verwendet. Es ist jeweils eine Bande in Höhe von 244bp zu sehen. A Gewebe von MM-Patienten, Spur 1:MM10, 2: MM9, 3: MM6, 4: MM2, 5: MM7, 6: MM4, 7: MM3, 8: MM5, 9: Wasser, 10: UKVR-Mel-02, M: Marker. B CTCL- und MM-Zelllinien, Spur 1: Cou-L3, 2: MeWo: 3: Ma-Mel-47, 4: Ma-Mel-12, 5: Ma-Mel-52, 6: Ma-Mel-04, 7: SeAx, 8: Ma-Mel-11, 9: Ma-Mel-05, 10: Ma-Mel-37b, 11: Ma-Mel-16, 12: Wasser, 13: UKRV-Mel-02, 14: Testis, M: Marker, bp: Basenpaare.

3000bp

3000bp

1000bp1000bp

500bp 500bp250bp

A 1 2 3 4 5 6 M M 7 8 9 10

3000bp 3000bp

1000bp 1000bp

500bp500bp250bp 250bp

B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M

3000bp

3000bp

1000bp1000bp

500bp 500bp250bp

A 1 2 3 4 5 6 M M 7 8 9 10

3000bp 3000bp

1000bp 1000bp

500bp500bp250bp 250bp

B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M

ERGEBNISSE 127

Die Expression der beiden GAGE-Gruppen wurde an cDNA von 5 CTCL-, 17 MM- sowie zwei

Kontrollzelllinien (Melanozyten, HaCat) und Gewebeproben von 8 MM-Patienten untersucht.

Die Ergebnisse der RT-PCR sind in Tabelle 3-7 zusammengefasst.

Tabelle 3-7: Expressionsanalyse der beiden GAGE-Gruppen in Zelllinien und

Geweben

In der Tabelle sind die positiven Zelllinien und Gewebe aufgeführt. Die Gesamtzahl der getesteten Proben ist in Klammern (n) angegeben. Die Einzelergebnisse der RT-PCR sind in Anhang 3 dargestellt. CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, MM: Malignes Melanom, n: Anzahl, RT-PCR: Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion.

Positive RT-PCR GAGE-Gruppe Kontrollzelllinien

(n=2) CTCL-Zelllinien

(n=5) MM-Zelllinien

(n=17) MM-Gewebe

(n=8) GAGE-1, 2, 8 0 (0%) 0 (0%) 12 (71%) 3 (38%) GAGE-3 bis 7b 0 (0%) 0 (0%) 14 (82%) 4 (50%)

Weder GAGE-1, 2, 8 noch GAGE-3 bis 7b wurden in den untersuchten Kontroll- und CTCL-

Zelllinien exprimiert. GAGE-3 bis 7b waren mit 82% in den MM-Zelllinien und 50% in den

MM-Geweben häufiger exprimiert als GAGE-1, 2, 8 (71% und 38%).

3.3.3 Antikörper-Herstellung mittels GST-GAGE-7b-tag-Fusionsprotein

GAGE-7b wurde in den GST-tag-Vektor kloniert und rekombinant exprimiert. Aus 6L

Expressionskultur wurden 2mg Protein, welches nativ im Batch-Verfahren über Glutathion

Sepharose aufgereinigt wurde, gewonnen. Dieses Protein wurde im Western Blot mit den GST-

und tag-Antikörpern und im Coomassie-Gel überprüft. Da eine ausreichende Reinheit erhalten

wurde, konnte das Protein abschließend gegen 1x phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)

dialysiert werden, um das Glutathion aus dem Elutionspuffer zu entfernen. Mit dem dialysierten

Protein wurden zwei Kaninchen bei der Firma Biogenes immunisiert und die Antikörper K5101

und K5102 hergestellt. Beide Antikörper wurden anschließend im Western Blot (15%

Polyacrylamidgel) in einer Verdünnung von 1:5000 evaluiert. Wie aus Abbildung 3-25

ersichtlich wurden keine spezifischen Antikörper gegen GAGE-7b in den immunisierten

Kaninchen gebildet. Es ist keine spezifische Bande, die das GAGE-7b-Protein bei 25 kilo Dalton

(kDa) (laut HUSAR 13kDa) darstellt, in Testis zu sehen. Zudem reagierte das Antiserum gegen

andere GST-X-tag-Proteine, die rekombinant in Bakterien exprimiert wurden, was auf die

Bildung von GST- und tag-Antikörper hindeutet. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die

Aufreinigung des rekombinanten Proteins abgeändert. Um die Bildung von GST-Antikörpern zu

verhindern, wurde die Abspaltung des GST-Proteinteils und ein sehr reines Protein angestrebt.

ERGEBNISSE 128

Abbildung 3-25: Analyse der Antikörper K5101 und K5102 im Western Blot

Sowohl das Antiserum K5101 (A) als auch das Antiserum K5102 (B) reagierten stark gegen andere GST-X-tag-Fusionsproteine. Keine spezifische Reaktion wurde in Testis bei einer Verdünnung von 1:5000 gemessen. GAGE-7b sollte durch eine Bande bei 25kDa detektiert werden. Die folgenden Proteine stammen aus rekombinanter Expression in Bakterien, Zelllinien oder gesunden Spendern, M: Marker, Spur 1: GST-tag, 2: GST-tag, 3: GST-LAGE-1a-tag, 4: GST-LAGE-1a-tag, 5: SeAx, 6: MyLa, 7: Testis, 8: GST-GAGE-7b-tag, 9: GST-GAGE-7b-tag, kDa: kilo Dalton, GST: Glutathion-S-Transferase.

3.3.4 Evaluierung der optimalen Expressions- und Aufreinigungsbedingungen für

das rekombinante GST-GAGE-7b-tag-Protein

Um die optimalen Expressionsbedingungen für das rekombinante GST-GAGE-7b-tag-Protein zu

erhalten, wurde jeweils 1mL Bakteriensuspension einer 250mL Expressionskultur vor und nach

der Induktion der Proteinbildung mit Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) entnommen. Die

Induktion wurde jeweils über Nacht durchgeführt. Die pelletierten Bakterien wurden direkt in

Probenpuffer für den Western Blot aufgenommen und lysiert. Zum Vergleich der Bedingungen

wurden gleiche Volumina aller Proben in einem Coomassie-Gel aufgetragen. Das GST-GAGE-

7b-tag-Protein wurde bei 45kDa als dicke Bande detektiert und im Western Blot mit den

Antikörpern anti-GST und anti-tag identifiziert (Ergebnisse nicht dargestellt). Laut Abbildung

3-26 ist die deutliche Induktion von GST-GAGE-7b-tag-Protein in allen Fraktionen nach der

Proteininduktion durch IPTG-Zugabe als dicke Bande bei 45kDa erkennbar. Bei einer IPTG-

Konzentration von 0,5mM und einer Induktion bei Raumtemperatur (Rt) wurde mehr Protein als

bei 17°C gewonnen und weniger Abbruchbanden als bei 37°C erzeugt. Unterschiedliche IPTG-

Konzentrationen erbrachten bei 17°C vergleichbare Proteinmengen. Deshalb wurde eine mittlere

IPTG-Konzentration von 0,25mM zur Induktion gewählt. Zudem wurde später festgestellt, dass

sowohl eine Induktion über Nacht als auch eine Induktion für 6h ein äquivalentes Ergebnis

ergibt, so dass fortan die rekombinante Proteinproduktion für 6h bei Rt mittels 0,25mM IPTG

induziert wurde.

B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9202kDa128kDa80kDa

37,9kDa

30,5kDa

19kDa

6,8kDa

202kDa128kDa80kDa

37,9kDa

30,5kDa

19kDa

6,8kDa

A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9202kDa128kDa80kDa

37,9kDa

30,5kDa

19kDa

6,8kDa

202kDa128kDa80kDa

37,9kDa

30,5kDa

19kDa

6,8kDa

A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ERGEBNISSE 129

Abbildung 3-26: Coomassie-Gel zur Bestimmung der optimalen Expressionsbedingungen

für GST-GAGE-7b-tag

In dieser Abbildung ist ein Coomassie-Gel (15% Polyacrylamidgel) zur Bestimmung der optimalen Expressionsbedingungen für GST-GAGE-7b-tag-Protein dargestellt. In allen Spuren wurden gleiche Probevolumina des Bakterienlysats aufgetragen. Der Zeitpunkt der Probenentnahme, die Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG)-Konzentration und die Temperatur sind der dargestellten Tabelle zu entnehmen. Das GST-GAGE-7b-tag-Protein ist durch Pfeile gekennzeichnet. Rt: Raumtemperatur, kDa: kilo Dalton, M: Marker, GST: Glutathion-S-Transferase.

Die Art der Bakterienlyse, French Press im Vergleich zu Sonifizierung inklusive

Homogenisieren, wurde unter Verwendung des GST-tag-Proteins evaluiert. 1L GST-tag-

Proteinlysat wurde in zwei gleiche Teile geteilt. Ein Teil wurde dreimal in der French Press

lysiert, wohingegen der andere Teil sonifiziert, mit Lysozym, Triton-X-100 und 1,4-Dithiotreitol

(DTT) behandelt und homogenisiert wurde. Abbildung 3-27 verdeutlicht, dass in den Eluaten

nach der French Press deutlich mehr eluiertes GST-tag-Protein enthalten ist und dass in allen

vier Eluaten nach der French Press hohe GST-tag-Proteinmengen messbar sind. Das GST-tag-

Protein wurde bei 26kDa detektiert. Deshalb wurden alle Bakterienlysate fortan mittels French

Press aufgearbeitet.

Aus zahlreichen Vorversuchen war ersichtlich, dass GST-X-tag-Fusionsprotein nicht an die

Glutathion Sepharose gebunden wurde und mit dem Durchfluss, auch nach mehrmaligem

Inkubieren der Sepharose mit demselben Proteinlysat, entfernt wurde. Um den Einfluss des pHs

während der Bindung der GST-X-tag-Proteine an die Glutathion Sepharose zu analysieren

wurden neben dem üblichen pH von 7,4 zwei andere pH-Werte von 6,5 und 8,0 in den

Bakterienlysaten gewählt. Da im Lysat ausreichend GST-GAGE-7b-tag-Protein enthalten war,

konnte dieses Protein an die Glutathion Sepharose binden (Abbildung 3-27). Bei einem

Bindungs-pH von 6,5 wurde mehr Protein gebunden als bei einem pH von 8,0. Die Fraktionen

75kDa

50kDa

75kDa

37kDa

25kDa

20kDa

100kDa150kDa250kDa 250kDa

150kDa100kDa

50kDa

37kDa

25kDa

20kDa

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

Induktion vor nach vor nach vor nach vor nach vor nachIPTG [mM] 0.1 0.1 0.25 0.25 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5Temperatur [°C] 17 17 17 17 17 17 Rt Rt 37 37

75kDa

50kDa

75kDa

37kDa

25kDa

20kDa

100kDa150kDa250kDa 250kDa

150kDa100kDa

50kDa

37kDa

25kDa

20kDa

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

Induktion vor nach vor nach vor nach vor nach vor nachIPTG [mM] 0.1 0.1 0.25 0.25 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5Temperatur [°C] 17 17 17 17 17 17 Rt Rt 37 37

ERGEBNISSE 130

der Eluate mit einem Bindungs-pH von 6,5 enthalten deutlich mehr Protein als pH8,0 Eluate. In

Folge dessen wurde ein pH von 6,5 in den Bakterienlysaten für die Bindung der Proteine an die

Glutathion Sepharose gewählt.

Abbildung 3-27: Coomassie-Gel zum Vergleich der Lyse von GST-tag-Protein in der

French Press gegenüber Sonifizierung und Homogenisieren (A) und zur

Bestimmung des optimalen pH-Werts während der Bindung von GST-

GAGE-7b-tag-Protein an Glutathion Sepharose (B)

A In diesem Coomassie-Gel (15% Polyacrylamidgel) wird die Lyse von Bakterien mittels French Press verglichen mit Sonifizierung und Homogenisieren. Das aufgereinigte, von der Glutathion Sepharose-Säule eluierte GST-tag-Protein wurde bei einer Größe von 26kDa detektiert und ist vermehrt in den Eluaten des mit der French Press erhaltenen Proteins vorhanden. M: Marker, Spuren 1-4: French Press, 1: Eluat 1, 2: Eluat 2, 3: Eluat 3. 4:Eluat 4, Spuren 5-7: Sonifizierung und Homogenisieren, 5: Eluat 2, 6:Eluat 3, 7: Eluat 4, kDa: kilo Dalton. B Im Coomassie-Gel (15% Polyacrylamidgel) ist der Unterschied zwischen der Bindung von GST-GAGE-7b-tag-Protein an Glutathion Sepharose bei einem pH-Wert des Lysats von 6,5 und 8,0 dargestellt. GST-GAGE-7b-tag-Protein bindet bei einem pH von 6,5 vermehrt an die Glutathion Sepharose. Entsprechend wird mehr Protein eluiert, wobei gleiche Probevolumina aufgetragen wurden. GST-GAGE-7b-tag-Protein ist bei 45kDa detektierbar. M: Marker, Spur 1: Geklärtes Lysat, 2: Durchfluss bei pH6,5, 3: Durchfluss bei pH8,0, 4: gebundenes Protein pH6,5, 5: gebundenes Protein pH8,0, 6: Eluat pH6,5, 7: Eluat pH8,0. GST: Glutathion-S-Transferase.

3.3.5 Aufreinigung des GST-GAGE-7b-tag-Proteins an Glutathion Sepharose und

Abspaltung des GST-Fusionspartners mittels Thrombin

Eine 3L Expressionskultur des rekombinanten GST-GAGE-7b-tag-Proteins wurde 6h bei Rt mit

0,25mM IPTG induziert, die Bakterienpellets in insgesamt 40mL 1x PBS pH6,5 aufgenommen

und bis zur Verarbeitung in der French Press eingefroren. Die 40mL Bakterienlysat wurden drei

Mal in der French Press aufgeschlossen und anschließend direkt über eine Glutathion Sepharose-

Säule aufgereinigt. Hierbei wurde das eisgekühlte Bakterienlysat bei Rt drei Mal über die Säule

gegeben, um Fusionsprotein zu binden. Zur Entfernung von ungebundenem Protein wurde die

Säule intensiv mit PBS gewaschen. Der GAGE-7b-tag-Fusionsteil wurde unter Verwendung von

100 Units (U) Thrombin während einer zweistündigen Inkubation bei Rt abgespalten. Das

lösliche GAGE-7b-tag-Protein konnte anschließend in zwei bis drei Elutionsschritten mit PBS

50kDa

37kDa

25kDa

20kDa

50kDa

37kDa

25kDa20kDa

A M 1 2 3 4 5 6 7 M

50kDa37kDa

25kDa

20kDa

B M 1 2 3 4 5 6 7

50kDa

37kDa

25kDa

20kDa

50kDa

37kDa

25kDa20kDa

A M 1 2 3 4 5 6 7 M

50kDa

37kDa

25kDa

20kDa

50kDa

37kDa

25kDa20kDa

A M 1 2 3 4 5 6 7 M

50kDa37kDa

25kDa

20kDa

B M 1 2 3 4 5 6 7

50kDa37kDa

25kDa

20kDa

B M 1 2 3 4 5 6 7

ERGEBNISSE 131

erhalten werden. Schließlich lagen zumeist zwei Mal je 3mL abgespaltenes Protein von ca.

1mg/mL Konzentration vor. Wie in Abbildung 3-28 dargestellt, war eine deutliche Bande mit

GST-GAGE-7b-tag-Fusionsprotein (ca. 45kDa) im aufgeschlossenen Bakterienlysat vor und

nach Zentrifugation vorhanden. Allerdings befanden sich ebenfalls ein Anteil an unlöslichem

Fusionsprotein und einigen Abbauprodukten im Pellet. Deutlich kann man in Spur vier das an

die Säule gebundene Fusionsprotein erkennen. Nach der Abspaltung lag nur noch GST-Protein

an der Säule gebunden vor (Spur 5), das abgespaltene Protein befand sich in Lösung und war als

26kDa große Bande sichtbar (Spur 6). Jedoch wurde GST-Protein in der Proteinlösung nach

GST-Abspaltung nachgewiesen (Spur 6, 25kDa), so dass eine weitere Aufreinigung notwendig

wurde. GST-Protein sollte möglichst gänzlich entfernt werden, damit es bei einer Immunisierung

zu keiner Bildung von unspezifischen GST-Antikörpern kommen würde.

Abbildung 3-28: Coomassie-Gel zur Aufreinigung von GST-GAGE-7b-tag und

Abspaltung des GST-Fusionspartners

Dieses repräsentative Coomassie-Gel (15% Polyacrylamidgel) stellt die Aufreinigung von GST-GAGE-7b-tag und die Abspaltung des GST-Fusionspartners von GAGE-7b-tag mittels Thrombin dar. In den Spuren 1-3 wurden ca. 10µg Protein und in den Spuren 4-6 ca. 1µg Protein aufgetragen. Das GST-GAGE-7b-tag-Protein wird in den Spuren 1-4 bei ca. 45kDa, das GST-Protein in den Spuren 4-6 bei ca. 25kDa und das GAGE-7b-tag-Protein in Spur 6 bei 26kDa detektiert. M : Marker, Spur 1: E. coli Lysat, 2: geklärtes E. coli Lysat, 3: Pellet, 4: GST-GAGE-7b-tag-Protein gebunden an Glutathion Sepharose, 5: GST-Protein gebunden an Glutathion Sepharose nach Thrombinabspaltung von GAGE-7b-tag, 6: Abgespaltenes lösliches Protein. kDa: kilo Dalton, GST: Glutathion-S-Transferase.

3.3.6 Zusätzliche Aufreinigung des GAGE-7b-tag-Proteins mittels Anionenaus-

tauschchromatographie (MonoQ) und Identifizierung von GAGE-7b mittels

MALDI-TOF

Mittels Anionenaustauschchromatographie sollten verunreinigende Proteine aus der Lösung des

abgespaltenen GAGE-7b-tag-Proteins entfernt werden. Hierzu wurden die ersten beiden

M 1 2 3 4 5 6

15kDa

20kDa

37kDa

25kDa

75kDa

50kDa

ERGEBNISSE 132

Elutionen nach der Abspaltung des GAGE-7b-tag-Proteins vom GST-Fusionspartner verwendet.

Diese beiden Elutionen wurden vereint und mit Puffer A 1:10 verdünnt, um eine

Salzkonzentration von ungefähr 15mM Natriumchlorid (NaCl) zu erhalten. Nach der Bindung

der Proteine an die MonoQ Säule wurde ein Salzgradient von 15mM bis 1M NaCl verwendet,

um die Proteine aufzutrennen. Das Eluat wurde in Fraktionen von 1mL gesammelt. Anhand des

Chromatogramms der Proteinauftrennung (Abbildung 3-29) wurde entschieden, welche

Fraktionen in einem Coomassie-Gel untersucht wurden. Im Chromatogramm ist deutlich zu

erkennen, dass kein Reinheitspeak und somit keine optimale Auftrennung der Proteinlösung

erzielt werden konnte. Sechs Peaks laufen zu Beginn der Auftrennung bei einer

Salzkonzentration von 200 bis 400mM NaCl ineinander. Jedoch konnten einige Proteine (Peaks

bei Fraktion 26, 30 und 35) abgetrennt werden. Da aus dem Chromatogramm keine eindeutige

Auftrennung erkennbar war, musste ein Coomassie-Gel die Güte der Auftrennung während der

Ionenaustauschchromatographie aufklären.

Abbildung 3-29: Chromatogramm der Ionenaustauschchromatographie für GAGE-7b-tag

In diesem repräsentativen Chromatogramm ist die Auftrennung der GAGE-7b-tag-Proteinlösung an einer MonoQ Säule dargestellt. Auf der x-Achse sind die Anzahl der bereits durch die Säule geflossenen mL an Lösung und Puffer und die gesammelten Fraktionen aufgeführt. Die y-Achse gibt die milli „absorption units“ (mAU) an. Die rote Kurve stellt das UV-Spektrum bei 260nm und die blaue Kurve das Spektrum bei 280nm dar. Der NaCl-Gradient wird durch die grüne Gerade und an der rechten Achse in %B angegeben. NaCl: Natriumchlorid.

Zur Untersuchung des Ergebnisses der Ionenaustauschchromatographie in einem Coomassie-Gel

(15% Polyacrylamidgel) wurden die Proben vor der Chromatographie sowie Fraktionen, die

prominente Peaks im Chromatogramm darstellen ausgewählt. Die so erzeugten Coomassie-Gele

NWGAGE101:1_UV1_280nm NWGAGE101:1_UV2_260nm NWGAGE101:1_Conc NWGAGE101:1_Fractions

0

200

400

600

mAU

0

20

40

60

80

%B

105.0 110.0 115.0 120.0 125.0 130.0 135.0 ml

Waste 3 4 5 6 7 8 9 101112 13 14 15 161718 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 3839

NWGAGE101:1_UV1_280nm NWGAGE101:1_UV2_260nm NWGAGE101:1_Conc NWGAGE101:1_Fractions

0

200

400

600

mAU

0

20

40

60

80

%B

105.0 110.0 115.0 120.0 125.0 130.0 135.0 ml

Waste 3 4 5 6 7 8 9 101112 13 14 15 161718 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 3839

ERGEBNISSE 133

sind in Abbildung 3-30 dargestellt. In Spur 1 und 2 sind die Banden von GAGE-7b-tag bei

26kDa und darunter bei 25kDa für GST sichtbar. In der stark verdünnten Proteinlösung des

Durchlaufs durch die MonoQ Säule sind auch bei maximalem Volumenauftrag keine nicht an die

Säule bindenden Proteine erkennbar. Ab Spur 7 sind unterschiedliche Fraktionen, die während

der Elution der gebundenen Proteine mittels Salzgradienten aufgefangen wurden, aufgetragen. In

den Fraktionen 15, 16 und 18 (Spuren 10-12 und 15-17) ist kein GST-Protein detektierbar und

die Bande für GAGE-7b-tag-Protein ist prominent. Die Bande unterhalb von 25kDa wurde in der

„Matrix assisted laser desorption/ionisation-time of flight“ (MALDI-TOF) Analyse untersucht.

Die Bande bei 75kDa in Fraktion 30 (Spur 22) stellt ein abgetrenntes Protein dar. Somit wurden

die Fraktionen 15, 16 und 18 (Spuren 10-12 und 15-17) eindeutig als Fraktionen mit ausreichend

aufgereinigtem Protein identifiziert und nach ihrer Vereinigung mittels Vakuumzentrifugation

eingeengt. Schließlich konnten aus 3L Bakterienlysat ca. 1,5mg aufgereinigtes und abgespaltenes

GAGE-7b-tag-Protein erhalten werden.

Abbildung 3-30: Coomassie-Gele der Proben und Fraktionen der Ionenaustausch-

chromatographie

In diesen Coomassie-Gelen (15% Polyacrylamidgele) sind die Proben vor und Fraktionen nach der Ionenaustauschchromatographie dargestellt. Für die Spuren 1 und 2 wurden ca. 5µg Protein aufgetragen. In den restlichen Spuren wurden gleiche Probevolumina von 10µL (Spuren 10-13, 15-19) und 20µL (Spuren 3-9, 14, 20-23) aufgegeben. Spur 1+2: GAGE-7b-tag 1.+2. Elution, 3+4: 1.+2. Elution 1:10 verdünnt mit Puffer A, 5+6: Durchlauf 1+2, 7-14: Fraktion 9, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 22, 15-17: Fraktion 15, 16, 18 1:10 verdünnt mit 1xPBS, 18-23: Fraktion 20, 21, 24, 26, 30, 35, kDa: kilo Dalton, M: Marker.

In der Arbeitsgruppe von Dr. M. Schnölzer in der zentralen Proteinanalytik des DKFZ wurde die

Analyse des abgespaltenen Proteins mittels MALDI-TOF durchgeführt. Hierzu wurden die

Banden bei 26 und 22,5kDa aus dem denaturierten Coomassie-Gel ausgeschnitten, mit Trypsin

verdaut und massenspektrometrisch untersucht. Die Bande bei 26kDa konnte als GAGE-7b-tag

identifiziert werden. Mittels Peptidmassen-Fingerprint Analyse unter Verwendung von MALDI-

TOF-MS und massenspektrometrischer Sequenzierung mit MALDI „Post source decay

M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18 19 20 21 22 23

75kDa 50kDa 37kDa

25kDa 20kDa

15kDa

ERGEBNISSE 134

fragmentation“ wurden drei eindeutig GAGE-7b-tag zuzuordnende Peptide nachgewiesen:

STYYWPR (m/z 972,47), STYYWPRPRR (m/z 1225,60) sowie QSQCVDKPPTPPPEPET (m/z

1906,85; C: carbamidomethyliert). Die Analyse der Bande bei 22,5kDa konnte nur das GAGE-

7b-tag zugehörige Peptid STYYWPRPRR in sehr geringer Konzentration bestätigen. Somit ist

die untere Bande höchstwahrscheinlich GAGE-7b-tag. Für eine eindeutige, zuverlässige

Zuordnung sollten zwei Peptide des jeweiligen Proteins identifiziert werden.

3.3.7 Immunisierung eines Kaninchens mit aufgereinigtem GAGE-7b-tag-Protein

Im zentralen Tierlabor des DKFZ wurde ein Kaninchen mit dem wie unter 3.3.5 und 3.3.6

beschrieben aufgereinigten, abgespaltenen GAGE-7b-tag-Protein immunisiert. Zunächst wurde

das Kaninchen K80 mit 750µg Protein subkutan immunisiert und über vier Wochen beobachtet.

Anschließend wurde K80 mit insgesamt 700µg Protein sowohl subkutan als auch intravenös

geboostet. Nach 10 Tagen wurde dem Tier Blut entnommen, und ein ELISA mit

Präimmunserum, Serum vier Wochen nach der Immunisierung bzw. vor dem 1. Boost sowie

dem Serum 10 Tage nach dem 1. Boost durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind

in Abbildung 3-31 dargestellt. Aus den Titrationskurven ist deutlich ersichtlich, dass K80 vor der

Immunisierung keine Antikörper gegen GAGE-7b-tag-Protein besaß, da das Präimmunserum

selbst bei einer Verdünnung von 1:200 eine optische Dichte (OD) bei 450nm von unter 0,1

aufwies. Desweiteren wurden innerhalb der vier Wochen nach Immunisierung Antikörper

gebildet (Kurve K80 Serum vor dem 1. Boost), die nach dem Boost deutlich zunahmen. Ein

Antikörpertiter von 1:6400 konnte ermittelt werden, woraufhin K80 am 17. Tag nach dem 1.

Boost ausgeblutet wurde.

ERGEBNISSE 135

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

1:2001:4001:8001:16001:32001:64001:128001:25600

Verdünnung

OD

450

nm

K80 Präimmunserum

K80 Serum vor dem 1. Boost

K80 Serum 10 Tage nach dem 1. Boost

Abbildung 3-31: Titration der Kaninchenseren vor und nach Immunisierung im ELISA

Diese Abbildung stellt die Titration des Präimmunserums des Kaninchen 80 (K80), des Serums vier Wochen nach der Immunisierung mit GAGE-7b-tag-Protein und vor dem 1. Boost und des Serums 10 Tage nach dem 1. Boost mittels ELISA dar. Verdünnungen von 1:200 bis 1:25600 wurden als Titrationsstufen gewählt. Nach dem 1. Boost ist ein deutlicher Anstieg der spezifischen GAGE-7b-Antikörper im Antiserum gegenüber dem Präimmunserum, das auch bei einer 1:200 Verdünnung eine vernachlässigbar niedrige Reaktion besitzt, zu erkennen. OD 450nm: Optische Dichte bei 450nm, K80: Kaninchen 80.

3.3.8 Isolierung der spezifischen GAGE-7b-Antikörper aus dem Antiserum

Zur Isolierung der monospezifischen GAGE-7b-Antikörper aus dem Kaninchenantiserum

wurden jeweils eine N-hydroxysuccinimid (NHS)-aktivierte Sepharose-Säule mit gebundenem

GST-tag-Protein und eine Säule mit gebundenem GAGE-7b-tag-Protein hergestellt. Die

Effizienz der Bindung von GST-tag-Protein an die NHS-aktivierte Sepharose-Säule lag bei 97%,

so dass insgesamt 3,88mg Protein gebunden werden konnten. Für GAGE-7b-tag lag die

Effizienz bei 66%, und 0,7mg GAGE-7b-tag-Protein wurde an die Säule gebunden. Um die

spezifischen Antikörper gegen GAGE-7b isolieren zu können, wurden 10mL Serum, das nach

der Ausblutung von K80 gewonnen wurde, über die NHS-aktivierte Sepharose-Säule mit

gebundenem GST-tag aufgereinigt. Gebundene GST- bzw. tag-Antikörper wurden anschließend

eluiert. Das über die 1. Säule (GST-tag) geflossene Serum wurde anschließend über eine NHS-

ERGEBNISSE 136

aktivierte Sepharose-Säule mit gebundenem GAGE-7b-tag-Protein gegeben. Das Serum nach

dem Durchlauf durch beide Säulen sollte weniger Antikörper enthalten. Die spezifischen

Antikörper gegen GAGE-7b konnten von der 2. Säule (GAGE-7b-tag) eluiert werden. Eine

durchschnittliche Proteinkonzentration von 0,1mg/mL an monospezifischem GAGE-7b-

Antikörper sowie ein Titer von 1:2560 konnten erzielt werden. In einem ELISA wurde das

Serum vor, während und nach der Säulenaufreinigung, sowie die eluierten Antikörper untersucht

(Abbildung 3-32). Für den ELISA wurde identisch aufgereinigtes Protein wie bereits für die

Immunisierung verwendet.

Wie in Abbildung 3-32 dargestellt, nahm die Antikörperkonzentration im Serum K80 vor der

Säulenaufreinigung, nach der 1. Säule (GST-tag) und nach der 2. Säule (GAGE-7b-tag) deutlich

ab. Insbesondere die Bindung von Antikörpern an die 2. Säule entfernte Antikörper aus dem

Serum K80. Dies wird anhand der Erniedrigung der OD bei 450nm um 0,5 deutlich.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

unverdünnt 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280

Verdünnung

OD

450

nm

Serum K80 (1:2 vorverdünnt)

Serum K80 nach NHS-GST-tag-Säule

Serum K80 nach NHS-GAGE-7b-tag-Säule

tag-AK

GAGE-7b-AK

Abbildung 3-32: Titration des Antiserums und der isolierten Antikörper nach den

unterschiedlichen Aufreinigungsschritten

Mittels ELISA und unter Verwendung des in der Immunisierung eingesetzten aufgereinigten GAGE-7b-tag-Proteins wurde eine Titration des K80 Antiserums und der isolierten Antikörper nach unterschiedlichen Aufreinigungsschritten durchgeführt. Titrationsstufen von unverdünntem Serum bis zu einer Verdünnung von 1:1280 wurden gewählt. Das Antiserum von K80 vor Aufreinigung 1:2 verdünnt, das Antiserum nach Aufreinigung über eine NHS-Säule (GST-tag-Protein), das Antiserum nach Aufreinigung über eine NHS-Säule (GAGE-7b-tag-Protein), und die eluierten tag-Antikörper sowie die eluierten GAGE-7b-Antikörper wurden untersucht. tag-Antikörper wurden entfernt. GAGE-7b-Antikörper wurden aufgereinigt. AK: Antikörper, OD 450nm: Optische Dichte bei 450nm, K80: Kaninchen 80, NHS: N-hydroxysuccinimid, GST: Glutathion-S-Transferase.

ERGEBNISSE 137

Die Analyse der eluierten tag- und GAGE-7b-Antikörper wies nach, dass tag-Antikörper aus

dem Antiserum entfernt werden konnten. Somit bildete K80 Antikörper gegen das C-terminale

tag-Ende des Proteins. Diese sind jedoch gegen ein nicht-humanes Protein gerichtet. Deshalb

sollten diese Antikörper in Untersuchungen an humanem Material nicht störend sein.

Theoretisch konnten mittels der verwendeten GST-tag-NHS-aktivierte Sepharose-Säule

gebildete GST-Antikörper entfernt werden, falls bei der Ionenaustauschchromatographie eine

minimale Konzentration an GST-Protein im aufgereinigten Protein enthalten gewesen sein sollte.

Die eluierten monospezifischen GAGE-7b-Antikörper reagierten eindeutig mit dem auf der

ELISA-Platte gebundenen GAGE-7b-tag-Protein. Ein ähnlicher Kurvenverlauf wurde für die

GAGE-7b-Antikörper und das Serum vor der Aufreinigung ermittelt. Das Serum nach dem

Durchfluss durch beide Säulen enthielt noch Antikörper gegen das aufgereinigte GAGE-7b-tag-

Protein. Dies weist auf eine Sättigung der Säulen mit Antikörpern hin.

3.3.9 Spezifität des GAGE-7b-Antikörpers

Um die Spezifität des aufgereinigten monospezifischen GAGE-7b-Antikörpers zu überprüfen,

wurde der Antikörper sowohl im Western Blot, in der Immunzytologie als auch in der Multiplex-

Serologie getestet.

Western Blot

Der aufgereinigte monospezifische GAGE-7b-Antikörper wurde im denaturierenden Western

Blot (15% Polyacrylamidgel) gegen verschiedene GST-Fusionsproteine sowie verschiedene

Verdünnungen an aufgereinigtem GAGE-7b-tag-Protein getestet (Abbildung 3-33). Der

monospezifische Antikörper erkannte bei einer Verdünnung von 1:200 bzw. einer Konzentration

von 1µg/mL die GAGE-7b-tag Bande bei ca. 26kDa sowie eine GAGE-7b-Bande bei 22,5kDa

(Spur 1). Ansonsten reagierte der Antikörper schwach gegen drei Proteine bei ca. 35, 55 und

75kDa, die zu den E. coli-Proteinen zählen könnten. Diese Banden wurden ebenfalls im GST-

GAGE-7b-tag-Lysat (Spur 2) erkannt. In Spur 2 wurde zudem eine eindeutige Reaktion des

Antikörpers gegen GST-GAGE-7b-tag-Protein bei ca. 45kDa nachgewiesen. Der Antikörper

reagierte sehr schwach gegen MAGE-A9-tag-Protein bei einer Größe von ca. 43kDa (Spur 3). In

allen Spuren detektierte der Antikörper eine Bande bei ca. 75kDa, die vermutlich dem E. coli-

Protein Hsp70 zuzuordnen ist. Dieses Protein wird während der Proteinexpression gebildet, ist

jedoch prokaryontenspezifisch. Die ausgewählten GST-Fusionsproteine besitzen ein

Molekulargewicht von 70 bis 80kDa. Die Reaktion des Antikörpers ist vermutlich gegen das C-

terminale tag-Ende gerichtet. Eine Ausnahme bildet GST-LAGE-1a-tag-Protein, das ein

Molekulargewicht von 47kDa besitzt. Der Antikörper erkannte in Spur 9 eine schwache Bande

ERGEBNISSE 138

dieses Proteins sowie vermutlich das prokaryontenspezifische E. coli Protein HSP70. Dies deutet

ebenfalls auf einen Restgehalt an tag-Antikörpern hin. Die Untersuchung unterschiedlicher

Verdünnungen an aufgereinigtem Protein mit dem GAGE-7b-Antikörper bestimmte eine

Nachweisgrenze von 15ng GAGE-7b-tag-Protein (Verdünnung 1:100). Ab einer Proteinmenge

von 1,5ng (Verdünnung 1:1000) erkannte der Antikörper das aufgereinigte Protein nicht mehr.

Abbildung 3-33: Western Blot an verschiedenen GST-Fusionsproteinen unter

Verwendung des monospezifischen GAGE-7b-Antikörpers

A In diesem Western Blot (15% Polyacrylamidgel) wurden ca. 0,1µg aufgereinigtes, rekombinantes GAGE-7b-tag-Protein sowie 0,1µg andere rekombinante GST-Fusionsproteine aufgetragen. Zur Detektion wurde der GAGE-7b-Antikörper in einer 1:200 Verdünnung (1µg/mL) eingesetzt. Der aufgereinigte monospezifische Antikörper reagierte deutlich mit GAGE-7b-tag und GST-GAGE-7b-tag-Protein sowie einigen unspezifischen E. coli Banden. Es bestehen schwache Reaktionen mit den GST-Fusionsproteinen vermutlich aufgrund des tag-Anteils. Spur 1: GAGE-7b-tag, 2: GST-GAGE-7b-tag, 3: MAGE-A9-tag, 4: GST-MAGE-A9-tag, 5: GST-MAGE-A1-tag, 6: GST-MAGE-A3-tag, 7: GST-GBP-5ta-tag, 8: GST-tag, 9: GST-LAGE-1a-tag. B Der GAGE-7b-Antikörper (1:200, 1µg/mL) erkennt das aufgereinigte GAGE-7b-tag-Protein bis zu einer Verdünnung von 1:100. Dies entspricht einer Proteinmenge von 15ng. Ab einer Verdünnung von 1:1000 wird das aufgereinigte Protein nicht mehr erkannt. Spur 1, 2, 3, 4: Aufgereinigtes GAGE-7b-tag-Protein (1,5mg/mL) 1:10, 1:100, 1:1000 und 1:10000 verdünnt. M: Marker, kDa: kilo Dalton, GST: Glutathion-S-Transferase.

Immunzytologie

In der Immunzytologie erkannte der GAGE-7b-Antikörper die Zelllinie UKRV-Mel-27, die in

Abbildung 3-34 dargestellt ist. Diese positive Reaktion konnte nach der Präabsorption des

Antikörpers mit aufgereinigtem Antigen vollständig aufgehoben werden. Das Antigen besaß

dieselbe Qualität wie das zur Immunisierung verwendete Antigen. Ein mol Antikörper wurde mit

2 mol Antigen für 30min präabsorbiert und anschließend ÜN bei RT mit den Zellen inkubiert.

Somit konnte bestätigt werden, dass der Antikörper GAGE-7b spezifisch erkennt, das GAGE-7b-

tag-Protein bindet und keine anderen unspezifischen Antikörper vorhanden sind, die mit

A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

75kDa

50kDa

37kDa

25kDa

20kDa

100kDa

250kDa

15kDa

B M 1 2 3 4

75kDa

50kDa

37kDa

25kDa

20kDa

100kDa

250kDa

15kDa

A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

75kDa

50kDa

37kDa

25kDa

20kDa

100kDa

250kDa

15kDa

B M 1 2 3 4

75kDa

50kDa

37kDa

25kDa

20kDa

100kDa

250kDa

15kDaGAGE-7b-tag

GST-GAGE-7b-tag

GAGE-7b-tag

ERGEBNISSE 139

humanen Proteinen reagieren. Entsprechend der Färbung in Abbildung 3-34 A ist GAGE-7b im

Cytosol der Zellen lokalisiert. Innerhalb einer Zelllinie sind GAGE-7b-positive und GAGE-7b-

negative Zellklone nachweisbar. Eine Erklärung hierfür ist, dass diese MM-Zelllinie aus der

Kultivierung von Biopsiematerial einer kutanen Metastase eines MM-Patienten stammt, und hier

die Vermehrung mehrerer Zellklone möglich ist.

Zur internen Kontrolle wurde die Zelllinie UKRV-Mel-27 mit dem 1:100 verdünnten K80

Präimmunserum gestestet. Diese Verdünnung entspricht der Verdünnung des aufgereinigten

Antikörpers. Nach der Gegenfärbung der Zellen wurde keine positive Reaktion des

Präimmunserums mit der GAGE-7b-positiven Zelllinie nachgewiesen. Diese Untersuchung

bestätigt die Spezifität des GAGE-7b-Antikörpers.

Abbildung 3-34: Überprüfung der Spezifität des GAGE-7b-Antikörpers mittels

Immunzytologie

Mittels Immunzytologie wurden zwei Zytospins der GAGE-7b-positiven Zelllinie UKRV-Mel-27 untersucht. In A wurde eine Färbung mit 2µg/mL GAGE-7b-Antikörper durchgeführt. In B wurde die Färbung unter vorheriger Präabsorption des GAGE-7b-Antikörpers mit GAGE-7b-tag-Antigen in einer 1:2 Verdünnung parallel vorgenommen. Beide Zytospins wurden mit einer 40-fachen Vergrößerung betrachtet und fotografiert.

Multiplex-Serologie

Der GAGE-7b-Antikörper wurde ebenfalls in der Multiplex-Serologie verwendet, da er auf diese

Weise gleichzeitig gegen 17 verschiedene Antigene getestet und die Bindung von GAGE-7b-tag-

Protein an die entsprechende Beadsorte bestätigt werden konnte. In diesem System wurde der

Antikörper eine Stunde mit GST-tag-Protein präabsorbiert und in einer Verdünnung von 1:100

(2µg/mL) eingesetzt. Schließlich wurde der MFI-Wert, der mit dem GAGE-7b-Antikörper gegen

das GST-tag-Protein erzielt wurde (7 MFI), von den MFI-Werten von allen anderen Antigenen

subtrahiert, um die Netto MFI-Werte zu erhalten. Die somit berechneten MFI-Werte sind in

Tabelle 3-8 festgehalten. Der GAGE-7b-Antikörper reagierte ausschließlich mit dem GST-

GAGE-7b-tag-Protein. Die MFI-Werte von 22 und 21, die jeweils für das GST-MAGE-A9-tag-

und GST-LAGE-1a-tag-Protein berechnet wurden, liegen im Rahmen der Hintergrundreaktion.

A B A: UKRV-Mel-27, GAGE-7b-Antikörper 2µg/mL, 40x

B: UKRV-Mel-27, GAGE-7b- Antikörper 2µg/mL, Präabsorption mit Antigen 1:2, 40x

ERGEBNISSE 140

Sie weisen nicht auf eine Reaktion des Antikörpers mit diesen beiden Proteinen hin. Der

niedrigste Cut-off-Wert, der in dieser Arbeit verwendet wurde und negative von positiven Seren

unterschied, lag bei 59 MFI (siehe Tabelle 3-4). Dementsprechend sind Reaktionen erst ab ca. 50

MFI als positiv zu werten.

Nach dem Nachweis der Spezifität des GAGE-7b-Antikörpers in Western Blot, Immunzytologie

und Multiplex-Serologie wird deutlich, dass der Antikörper sowohl denaturiertes als auch natives

sowie rekombinant hergestelltes Protein erkennt und entsprechend in verschiedenen

Testsystemen verwendet werden kann. Im Western Blot wurde der Antikörper in einer

Verdünnung von 1:200 (1µg/mL), in der Immunzytologie von 1:50 bis 1:100 (2µg/mL) und in

der Multiplex-Serologie in einer Verdünnung von 1:100 (2µg/mL) verwendet.

Tabelle 3-8: Verwendung des GAGE-7b-Antikörpers in der Multiplex-Serologie

Diese Tabelle führt die MFI-Werte, die die Reaktion des GAGE-7b-Antikörpers mit jedem einzelnen Antigen in der Multiplex-Serologie darstellen, auf. Die MFI-Werte bestätigen, dass der Antikörper ausschließlich das GAGE-7b-Antigen bindet. Reaktionen von ungefähr 20 MFI liegen innerhalb der Hintergrundreaktion und sind somit vernachlässigbar. MFI: „Mean fluorescence intensity“.

Antigen MFI-Wert Antigen MFI-Wert Antigen MFI-Wer t

MAGE-A1 0 se70-2 0 JC 0

MAGE-A3 0 se57-1 0 LPV 0

MAGE-A9 21 GBP-5ta 0 HPV1 0

LAGE-1a 22 cTAGE-5a N-

terminal 0 p53 0

GAGE-7b 1597 cTAGE-5a C-

terminal 0 p16 0

CAMEL 0 BK 0

3.3.10 Expressionsanalyse des Proteins GAGE-7b

Um die Expression des Proteins GAGE-7b zu untersuchen, wurde der wie oben beschrieben

selbst generierte GAGE-7b-Antikörper im Western Blot sowie in der Immunzytologie und

-histologie eingesetzt.

Expression in Kontrollgewebe

Um das CTA-Profil von GAGE-7b auf Proteinebene zu bestätigen, wurden 15 verschiedene

Kontrollgewebe mit dem generierten GAGE-7b-Antikörper im Western Blot (15%

Polyacrylamidgel) untersucht. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:200 (1µg/mL)

eingesetzt und detektierte eine spezifische Bande bei 26kDa. In Testis- und in Gehirngewebe

wurde weiterhin eine sehr schwache Bande bei ca. 90kDa detektiert. In Testisgewebe könnte

ERGEBNISSE 141

diese Bande ein GAGE-Protein-Aggregat darstellen, das nicht denaturiert wurde. Im

Gehirngewebe ist die Bande nur sehr schwach erkennbar und somit vernachlässigbar. In

Abbildung 3-35 ist ein repräsentativer Western Blot dargestellt. Der Antikörper erkannte GAGE-

7b ausschließlich in Testisgewebe und keinem anderen Normalgewebe. Dies bestätigt, dass

GAGE-7b auch auf Proteinebene ein CTA ist. Der Western Blot unter Verwendung eines β-

Aktin-Antikörpers verdeutlicht, dass von allen Normalgeweben gleiche Proteinmengen

aufgetragen wurden.

Abbildung 3-35: Western Blot an Kontrollgewebe mit GAGE-7b-Antikörper

Ca. 40µg Kontrollprotein wurden zur Untersuchung im Western Blot (15% Polyacrylamidgel) mit den Antikörpern GAGE-7b (1:200) (A) und β-Aktin (1:5000) (B) aufgetragen. GAGE-7b konnte als Bande bei 26kDa und β-Aktin als Bande bei 45kDa nachgewiesen werden. Die GAGE-7b Expression in Normalgeweben ist auf Testis beschränkt. A und B Spur 1: Plazenta, 2: Brustdrüse, 3: Knochenmark, 4: Testis, 5: Haut, 6: Leber, 7: Thymus, 8: Magen, 9: Gehirn. kDa: kilo Dalton, M: Marker.

Expression in Zelllinien und Tumorgewebe

Insgesamt wurden 24 Zelllinien auf GAGE-7b-Expression mittels Western Blot (15%

Polyacrylamidgel) untersucht. Als internes Kontrollprotein wurde β-Aktin verwendet. Alle

Kontroll- (Melanozyten und HaCat) sowie alle CTCL-Zelllinien waren GAGE-7b-negativ

(Abbildung 3-36). Hingegen konnte eine GAGE-7b-Expression in zehn von 17 MM-Zelllinien

als Bande von 26kDa nachgewiesen werden. Dies bedeutet, dass mehr als 50% aller MM-

Zelllinien GAGE-7b auch auf Proteinebene exprimieren.

Zusätzlich wurden neun Tumorgewebe mit dem GAGE-7b-Antikörper im Western Blot (15%

Polyacrylamidgel) getestet. Da die Proteinkonzentration der aus den Tumorgeweben erhaltenen

Proteinlösungen gering war, konnten nur sehr schwache Banden im Western Blot detektiert

werden (Abbildung 3-37, Spur 9 und 11). In zwei MM-Tumorgeweben (22%) konnte GAGE-7b

nachgewiesen werden. Obwohl die malignen Gewebe zur Proteinisolierung nicht denjenigen

entsprachen, die zur Zelllinienetablierung verwendet wurden, wurde GAGE-7b sowohl in

75kD

50kD

37kD

25kD

20kD

100kD250kD

15kD

10kD

75kD

50kD37kD

25kD20kD

100kD250kD

15kD

A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ERGEBNISSE 142

Tumorgewebe- als auch Zelllinienprotein der Zelllinien Ma-Mel-37b und -47 exprimiert. Von

weiteren vier Tumorgeweben konnten die entsprechenden Zelllinien innerhalb der

durchgeführten Untersuchungen auf GAGE-7b-Expression getestet werden.

Abbildung 3-36: Western Blot an verschiedenen Zelllinien mit GAGE-7b-Antikörper

Ca. 40µg Zelllinienprotein wurden zur Untersuchung im Western Blot (15% Polyacrylamidgel) mit den Antikörpern GAGE-7b (1:200) und β-Aktin (1:5000) aufgetragen. GAGE-7b konnte als Bande bei 26kDa und β-Aktin als Bande bei 45kDa nachgewiesen werden. 58% der MM-Zelllinien waren GAGE-7b-positiv, wohingegen alle CTCL- sowie Kontroll-Zelllinien GAGE-7b-negativ waren. A Spur 1: UKRV-Mel-02, 2: UKRV-Mel-06a, 3: UKRV-Mel-14a, 4: UKRV-Mel-21a, 5: UKRV-Mel-27, 6: UKRV-Mel-31, 7: SK-Mel-023, 8: Ma-Mel-04, 9: Ma-Mel-05, 10: Ma-Mel-11, 11: Ma-Mal-12, 12: Ma-Mel-16, 13: Ma-Mel-21, 14: Ma-Mel-37b, 15: Ma-Mel-47, 16: Ma-Mel-52, 17:MeWo. B Spur 1: Melanozyten, 2: HaCat, 3: Cou-L3, 4: HH, 5: HuT78, 6: MyLa, 7: SeAx. kDa: kilo Dalton, M: Marker, MM: Malignes Melanom, CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom.

Ein MM-Patient reagierte weder im Tumorgewebe noch in der entsprechenden Zelllinie (UKRV-

Mel-06a) positiv gegen GAGE-7b. Für zwei weitere MM-Patienten wurde keine GAGE-7b-

Expression in Western Blot Untersuchungen des Tumorgewebes und der Zelllinie nachgewiesen

(Ma-Mel-05 und Ma-Mel-12), jedoch GAGE-7b-Positivität auf mRNA-Ebene in Gewebe und

Zelllinie. Ein weiterer auf diese Weise evaluierter MM-Patient war GAGE-7b-positiv auf

mRNA- und Proteinebene für die entsprechende Zelllinie (UKRV-Mel-27), jedoch das

Tumorgewebe war GAGE-7b-negativ (vgl. Anhang 3).

26kDa

A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

GAGE1µg/mL

β-Actin1:500045kDa

26kDa

45kDa

B M 1 2 3 4 5 6 7

GAGE1µg/mL

β-Actin1:5000

26kDa

A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

GAGE1µg/mL

β-Actin1:500045kDa

26kDa

45kDa

B M 1 2 3 4 5 6 7

GAGE1µg/mL

β-Actin1:5000

ERGEBNISSE 143

Abbildung 3-37: Western Blot an MM-Tumorgewebe mit GAGE-7b-Antikörper

Da die Konzentration an Tumorgewebeprotein gering war, wurden ca. 10µg Protein im Western Blot (15% Polyacrylamidgel) aufgetragen. Die Blots wurden mit den Antikörpern GAGE-7b (1:200) und β-Aktin (1:5000) untersucht. GAGE-7b konnte als Bande bei 26kDa und β-Aktin als Bande bei 45kDa nachgewiesen werden. 22% der MM-Tumorgewebe waren sehr schwach GAGE-7b-positiv (Spur 9 und 11). Als Vergleich wurde Protein der Zelllinien aufgetragen, die von denselben Patienten stammen wie das schwach positive Tumorgewebe (Spur 8 und 10). Spur 1-7: Tumorgewebe von MM-Patienten 1-7, 8: Protein der Zelllinie Ma-Mel-37b, die von MM-Patient 8 stammt, 9: Tumorgewebe von MM-Patient 8, 10: Protein der Zelllinie Ma-Mel-47, die von MM-Patient 9 stammt, 10: Tumorgewebe von MM-Patient 9. kDa: kilo Dalton, M: Marker, MM: Malignes Melanom.

Zelluläre Lokalisation von GAGE-7b

Immunzytologie

Neben den Untersuchungen der Expression von GAGE-7b im denaturierenden Western Blot

wurde die Expression in der Immunzytologie und somit einer nativen Form des Proteins getestet.

Insgesamt konnten Zytospins von 22 verschiedenen Zelllinien hergestellt werden, wobei 16

MM-, fünf CTCL-Zelllinien und Melanozyten untersucht wurden. Der GAGE-7b-Antikörper

wurde in einer Verdünnung von 1:100 (2µg/mL) eingesetzt. Als Kontroll-Zelllinie dienten

Melanozyten, die nicht mit dem Antikörper reagierten. In den untersuchten CTCL-Zelllinien

konnte keine GAGE-7b Expression nachgewiesen werden. 43,8% der MM-Zelllinien (7/16)

konnten in der Immunzytologie als GAGE-7b-positiv identifiziert werden (Tabelle 3-9, Anhang

3). Bis auf eine Ausnahme (Ma-Mel-12) waren alle Zelllinien, die in der Immunzytologie eine

positive Reaktion mit dem GAGE-7b-Antikörper aufwiesen, ebenfalls im Western Blot GAGE-

7b-positiv. Wie bereits in 3.3.9 beschrieben ist GAGE-7b zytoplasmatisch lokalisiert. In der

Mehrheit der untersuchten Zelllinien wurden sowohl GAGE-7b-positive als auch GAGE-7b-

negative Zellklone nachgewiesen, so dass zumeist von heterogenen Zellkulturen ausgegangen

werden kann. Abschließend wird angenommen, dass der generierte GAGE-7b-Antikörper

sowohl GAGE-3, 4, 5, 6, 7 und 7b erkennt, da diese Proteine sich wie unter 1.5.1 und 3.3.1

aufgeführt nur durch einzelne Nukleotidsubstitutionen unterscheiden.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

26kDa

45kDa

GAGE1µg/mL

β-Actin1:5000

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

26kDa

45kDa

GAGE1µg/mL

β-Actin1:5000

ERGEBNISSE 144

Immunhistologie

Um eine Aussage über die GAGE-7b Expression in Gewebeschnitten treffen zu können, wurde

der GAGE-7b-Antikörper mit einer Konzentration von 0,4µg/mL in der Immunhistologie

verwendet. Bei der Untersuchung von Paraffinschnitten von 40 MM-Patienten konnten in 21 von

40 Patienten (53%) GAGE-7b-positive Zellen detektiert werden (Tabelle 3-9). GAGE-7b-

positive Zellen wurden jedoch hauptsächlich als einzelne Zellen oder Zellhaufen nachgewiesen.

Normale Haut war GAGE-7b-negativ, wohingegen Spermatogonien in gefärbten Schnitten von

normaler Testis vom GAGE-7b-Antikörper gefärbt wurden. Dies bestätigt zusätzlich den CTA

Charakter von GAGE-7b auf Proteinebene.

Tabelle 3-9: Zusammenfassung der Ergebnisse der Expressionsanalyse von GAGE-7b

In dieser Tabelle sind zusammenfassend alle Ergebnisse, die mit dem GAGE-7b-Antikörper erhalten werden konnten dargestellt. Zudem ist die Verwendung des Antikörpers sowohl im Western Blot als auch in der Immunzytologie und -histologie aufgeführt. MM: Malignes Melanom, CTCL: kutanes T-Zell Lymphom, n: Anzahl, Ctrl: Kontrolle, neg.: negativ, pos.: positiv.

Western Blot Immunzytologie Immunhistologie

Zelllinie Gewebe Zelllinie Gewebe

Ctrl

Pos. Neg.

GAGE-7b Ctrl

(n=2)

MM

(n=17)

CTCL

(n=5)

Ctrl

(n=15) inkl.

Testis

MM

(n=9)

Ctrl

(n=1)

MM

(n=16)

CTCL

(n=5)

Testis Haut

MM

(n=40)

Anwen-dung

1:200 (1µg/mL) 1:100 (2µg/mL) 1:500 (0,4µg/mL)

Positiv

0 (0%)

10 (58,8%)

0 (0%)

1 (4,4%, Testis

positiv)

2 (22,2%)

0 (0%)

7 (43,8%)

0 (0%)

Pos. Neg. 21 (53%)

In Abbildung 3-38 sind sowohl immunzytologische als auch -histologische Untersuchungen

unter Verwendung des GAGE-7b-Antikörpers zusammengefasst.

ERGEBNISSE 145

A B C

D E F

G H I

J K L

BC

H

Testis Haut

Präabsorbierter GAGE-7b-Antikörper

Präimmunserum

Abbildung 3-38: Immunzytologische und –histologische Untersuchungen mit GAGE-7b-

Antikörper

Immunzytologische und -histologische Färbungen mit dem GAGE-7b-Antikörper an Zytospins sind in A-F und an Paraffinschnitten in G-L dargestellt. MM-Zellen der Zelllinie UKRV-Mel-27 wurden durch den GAGE-7b-Antikörper in A, B, C und E gefärbt. Hingegen färbte das Präimmunserum von K80 keine MM-Zellen (D). Die Spezifität des GAGE-7b-Antikörpers konnte durch die Präabsorption des Antikörpers mit rekombinantem GAGE-7b-tag-Protein (2 mol GAGE-7-tag + 1 mol GAGE-7b-Antikörper) in F nachgewiesen werden. Färbungen in MM-Gewebe sind in einzelnen Zellen (G, H) und in Zellhaufen (I, J) erkennbar. Normale Haut ist GAGE-7b-negativ (K), wohingegen normale Testis GAGE-7b-positiv ist. Maßstab: 50µm. K80: Kaninchen 80.

ERGEBNISSE 146

3.3.11 Serumantikörperantworten gegen GAGE-7b

Neben der Bestimmung der Serumantikörperantwort gegen GAGE-7b unter Verwendung der

SADA-Methode und Multiplex-Serologie wurde eine dritte Methodik herangezogen. Im

Anschluss an eine “sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis” (SDS-PAGE,

15%) mit aufgereinigtem GAGE-7b-tag-Protein und dem Blotten der Proteine auf eine

Nitrozellulose-Membran, wurden anstelle eines polyklonalen Antikörpers Serumantikörper mit

der Membran inkubiert. Um einen hohen Durchsatz an Seren zu erzielen, wurden die

Membranen in kleine Streifen zerteilt und mit dem entsprechenden Serum (1:50) inkubiert. Das

Binden von Serumantikörpern an das aufgereinigte Protein wurde mittels Farbreaktion (braune

Bande) mit Diaminobenzidin (DAB) nachgewiesen. Die somit erhaltenen positiv reagierenden

Seren wurden zur endgültigen Bestätigung der Antigen-Antikörper-Reaktion nochmals in einem

Western Blot und Chemilumineszenz-Detektion gestestet (Abbildung 3-39). Auf diese Weise

konnten für GAGE-7b 36 Kontroll-, 72 MM- und 34 CTCL-Seren getestet werden. Im Kontroll-

Kollektiv konnte keine positive Reaktion gegen GAGE-7b nachgewiesen werden. Vier MM-

(5,6%, positive Reaktion in Abbildung 3-39 Spur 10) und zwei CTCL-Patienten (5,9%) besaßen

Antikörper gegen dieses Antigen. Zahlreiche Seren detektierten eine Bande bei 12,5kDa

(Abbildung 3-39 Spur 3). Vermutlich handelt es sich um ein E. coli-Protein, das nicht abgetrennt

werden konnte. Antikörper gegen E. coli-Proteine sind häufig im Serum von Menschen

vorhanden infolge der ständigen Abwehr von Bakterien durch das körpereigene Immunsystem.

Abbildung 3-39: Serumantikörperantworten gegen GAGE-7b ermittelt mit Western Blot

und DAB (A) sowie Chemilumineszenz (B)

Der Nachweis von GAGE-7b-Antikörpern im Serum erfolgte mittels Western Blot und den Detektionssystemen Diaminobenzidin (A) und Chemilumineszenz (B). Es wurde 1µg aufgereinigtes GAGE-7b-tag-Protein pro Spur aufgetragen. In A fallen positive Reaktionen von Antikörpern mit geblotteten Proteinen durch eine gelb bis braune Bande bei 26kDa (Spur 3, siehe Pfeil, Antikörperreaktion gegen unspezifisches geblottetes Protein) und in B durch eine schwarze Bande (Spur 10, siehe Pfeil, Antikörperreaktion gegen GAGE-7b-Protein) auf. In diesen repräsentativen Blots wurden Kontrollseren (A) und MM-Seren (B) untersucht. A Spur 1-5: Kontrollen 1-5. B Spur 1-12: Malignes Melanom 1-12. M: Marker, kDa: kilo Dalton.

25kDa20kDa

15kDa

10kDa

A M 1 2 3 4 5 B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

25kDa20kDa

15kDa

10kDa

75kDa50kDa37kDa

100kDa

25kDa20kDa

15kDa

10kDa

75kDa50kDa37kDa

100kDa

25kDa20kDa

15kDa

10kDa

A M 1 2 3 4 5 B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

25kDa20kDa

15kDa

10kDa

75kDa50kDa37kDa

100kDa

25kDa20kDa

15kDa

10kDa

75kDa50kDa37kDa

100kDa

DISKUSSION 147

4 DISKUSSION

In den letzten Jahren steigt die Zahl an Krebserkrankungen weltweit an. Dennoch gibt es für

viele Krebsarten keine umfassende und adäquate Therapie, so dass neben der Inzidenz auch die

Mortalität einen ansteigenden Trend aufweist. Neben operativen Maßnahmen und

Chemotherapie stehen den Medizinern heute verschiedene Immuntherapieansätze zur

Verfügung, um betroffene Patienten zu behandeln. Eine Vielzahl dieser Immuntherapien

benötigt Zielstrukturen, die tumorspezifisch oder zumindest Tumor-assoziiert sind sowie eine

spezifische Immunantwort in Tumorpatienten auslösen können. Zudem können tumorspezifische

Strukturen in der Diagnose, Prognose, dem Monitoring von Krebserkrankungen und einer

Therapieentscheidung Verwendung finden. Deshalb wurde in den letzten beiden Jahrzehnten

intensiv an der Identifizierung und möglichen Anwendung von Tumorantigenen geforscht.

Ziel dieser Arbeit war es, bereits identifizierte Cancer Testis Antigene (CTA) und Tumor-

assoziierte Antigene (TAA) hinsichtlich ihrer Seroreaktivität in Kontrollen (Ctrl) und Patienten

zweier Hauttumorentitäten zu untersuchen. Dies erfolgte mittels zweier Untersuchungsansätze,

dem Serumantikörper-Detektionsarray (SADA) und der Multiplex-Serologie. Des Weiteren

wurde das CTA GAGE-7b auf Desoxyribonukleinsäure (DNA)- und Proteinebene hinsichtlich

seiner Expression in beiden dermalen Tumorentitäten charakterisiert.

Im Folgenden soll zunächst die Verwendung von Tumorantigenen in Prognose, Diagnose und

Immuntherapien im Allgemeinen dargestellt werden. Anschließend werden die in dieser Arbeit

erzielten Ergebnisse der humoralen Immunantwort gegen und Expression von bestimmten

Tumorantigenen diskutiert.

4.1 Verwendung von Tumorantigenen

Tumorantigene können sowohl für Prognose-, Monitoring- und Diagnoseverfahren als auch in

Immuntherapien eingesetzt werden. Um Antigene in der Krebsdiagnostik zu verwenden, müssen

sie nicht tumorspezifisch exprimiert, hingegen jedoch spezifisch immunogen sein.

Immuntherapien mit solchen Zielstrukturen (Vakzinierungen) bei Krebspatienten setzen

immunologische Spezifität voraus, um Autoimmuneffekten vorzubeugen. Sind membranständige

Tumorantigene das Ziel einer Krebstherapie, können monoklonale Antikörper gegen diese

Tumorantigene entwickelt und eingesetzt werden.

DISKUSSION 148

4.1.1 Prognose und Diagnose

Antigene, die serologisch erkannt werden, können als Tumormarker dienen, sofern Antikörper

nur in Patienten, nicht aber in gesunden Kontrollpersonen nachgewiesen werden. Zumeist steht

die Höhe der serologischen Reaktivität in direktem Zusammenhang mit der Eignung des

Antigens als Marker. Im Gegensatz zur Immuntherapie müssen die Antigene für die

diagnostische Tumorserologie, zur Beurteilung der Erkrankung oder zur Früherkennung von

Rezidiven nicht tumorspezifisch exprimiert sein (Old und Chen 1998; Sahin et al. 1999). Die

Verwendung von Tumorantigenen als spezifische Marker soll eine frühere Diagnose und eine

bessere Unterscheidung von Patienten mit aggressiven Formen von anderen Erscheinungsbildern

ermöglichen. Insbesondere die Antigene Her2/neu und p53 wurden hinsichtlich ihrer

Antikörperantworten in verschiedenen Krebserkrankungen untersucht. Hohe Her2/neu

Antikörper-Titer wurden häufiger in neu diagnostizierten Brustkrebspatienten identifiziert im

Vergleich zu einer Kontrollgruppe (Disis et al. 1997). Ein signifikant höheres Auftreten von

Antikörpern gegen p53 wurde in Krebspatienten im Vergleich zu Kontrollen berichtet (Shimada

et al. 2003).

4.1.2 Immuntherapie

Herkömmliche Krebstherapien basieren zumeist weder auf einer gezielten noch auf einer

gesicherten Vernichtung aller Krebszellen in einem Patienten und sind daher oft nur palliativer

Natur. Deshalb zielen neuere Therapieansätze auf eine Stärkung der Tumorimmunantwort ab, da

es Hinweise darauf gibt, dass viele und sogar womöglich alle Krebserkrankungen immunogen

sind (Sahin et al. 1995). Das körpereigene Immunsystem besitzt das Potential, neoplastische

Zellen erkennen und anschließend lysieren zu können, ebenso wie auch fremde oder

virusinfizierte Zellen entdeckt und eliminiert werden können. Dies ist bereits bei verschiedenen

Tumoren nachgewiesen worden (Hammad et al. 2003; Kageshita et al. 2003; Mangel et al.

2003). Da neben der T-Zellantwort auch humorale Immunantworten gegen Tumorzellen

beschrieben sind (Sahin et al. 1995), kann sowohl die zelluläre als auch die humorale

Immunantwort durch gezielte Aktivierung des Immunsystems induziert werden. Vorteile einer

Immuntherapie liegen eindeutig in einem eingeschränkteren Nebenwirkungsspektrum und einer

geringeren systemischen Toxizität im Vergleich zu Chemo- oder Radiotherapie (Nencioni et al.

2004). Immuntherapien in Form von Vakzinierungen müssen die Unterdrückung einer

Immunantwort durch den Tumor überwinden und effektiv sowie langfristig vorbeugen, ohne

eine Autoimmunität im Patienten hervorzurufen (Finn 2003).

DISKUSSION 149

4.1.2.1 Nicht-spezifische Immuntherapie

Tumore durch eine unspezifische Immunstimulation des Patienten-eigenen Immunsystems zu

bekämpfen, ist ein in den letzten Jahrzehnten intensiv untersuchter Ansatz. Hier werden

spezifische Zytokine als Adjuvantien und als Therapieform in der Behandlung von

Krebserkrankungen eingesetzt. Zytokine sind Proteine, die von einer Vielzahl von Zellen

gebildet und sezerniert werden sowie durch Rezeptorbindung als interzelluläre Mediatoren zur

Aktivierung von anderen Zellen beitragen (Pschyrembel 1998). Das Zytokinprofil in der

Umgebung eines Tumors entscheidet über die Art der Immunabwehr, mit der der Organismus

gegen die neoplastischen Zellen vorgeht (Chouaib et al. 1997). In verschiedenen in vitro und in

vivo Untersuchungen konnten bislang sowohl antiproliferative als auch immunsupprimierende

Effekte von Zytokinen gemessen werden. Insbesondere die Wirkungen von Interferon (IFN)-α

und -γ, Interleukin (IL)-2 und Tumor Nekrosis Faktor (TNF)-α finden in der Behandlung von

verschiedenen Krebserkrankungen Anwendung. Für IFN-α und IL-2 konnten klinische

Ansprechraten von 13% bis 50% in malignen Melanom (MM)- und kutanen T-Zell Lymphom

(CTCL)-Patienten detektiert werden (Asadullah et al. 2002). Verschiedene Therapiestrategien

(z.B. Hoch-Dosis-Therapie, Chemotherapie plus IL-2) wurden bereits verwendet. Hierbei führten

die Hoch-Dosis-IL-2-Therapien jedoch zu einer sehr hohen Toxizität (Kragel et al. 1990).

Schließlich erfolgt die Anwendung von Zytokinen ebenfalls indirekt über die Gabe von

genmodifizierten Tumorzellen, die in der Lage sind, diese Zytokine zu sezernieren. Ein

klinischer Erfolg kann häufig durch die Kombination einer Therapie mit diesen

Immunmodulatoren verstärkt werden (Salgaller und Lodge 1998).

4.1.2.2 Spezifische Immuntherapie

Die Expression von spezifischen Antigenen auf Krebszellen stellt die Grundlage von

spezifischen Immuntherapien dar. In diesem Zusammenhang ist die Identifizierung von neuen

TAA von großer Bedeutung, die ebenfalls eine stetig zunehmende Anwendung in Diagnostik

und Prognostik finden. Die geeignetsten Tumorantigene sind Patienten-spezifisch (z.B.

Mutationsantigene), Tumor-spezifisch (z.B. bcr/abl) oder aber Gewebe-spezifisch (z.B. CTA)

und wurden zuvor nicht vom Immunsystem erkannt. Bei der Vakzinierung von Mäusen mit

Tumorantigenen und gleichzeitig nicht-mutierten Selbstantigenen konnte eine höhere anti-Tumor

Aktivität erzielt werden als mit Tumorantigenen allein (Nishikawa et al. 2001). Spezifische

Immuntherapien für Krebspatienten dienen dazu, die Immunabwehr des Patienten auf spezifische

Zielstrukturen z.B. in Form von Tumorantigenen zu richten. Diese Vakzinierungen müssen die

immunologische Toleranz überwinden und T-Zellen aktivieren, die eine niedrige Affinität zu

DISKUSSION 150

Antigenen besitzen, die auf Tumorzellen exprimiert werden (Pardoll 1998). Grundsätzlich

können zwei Arten von Immuntherapien unterschieden werden: Antikörper- und Vakzintherapie.

Antikörpertherapie

Die Lyse von Tumorzellen, die von monoklonalen Antikörpern spezifisch erkannt werden, kann

sowohl durch direkte als auch indirekte Mechanismen erfolgen. Zu den direkten Effekten zählen

die Aktivierung der Zell-eigenen Apoptose (Trauth et al. 1989), die Blockierung von

Wachstumsfaktor-Rezeptoren (Baselga und Mendelsohn 1994) und eine Anti-Idiotyp-Antwort

(Bhattacharya-Chatterjee et al. 2000). Die indirekten Mechanismen umfassen die Antikörper-

abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) (Steplewski et al. 1983) und die lokale Aktivierung

der Komplementkaskade (Ballare et al. 1995).

Für Krebserkrankungen sind bisher drei monoklonale Antikörper zugelassen. Rituximab

(Handelsname: MabThera) ist gegen das B-Zell Oberflächenantigen „Cluster of Differentiation“

(CD) 20 gerichtet und wird bei Non-Hodgkin Lymphomen (NHL) angewendet. In ersten

klinischen Studien wurden mit Rituximab vielversprechende Ergebnisse hinsichtlich der

Ansprechrate erzielt (McLaughlin et al. 1998). Trastuzumab (Handelsname: Herceptin) findet

Anwendung bei Mammakarzinomen und richtet sich gegen das überexprimierte Her2/neu

Membranprotein. Die Kombination von Herceptin und Chemotherapie verlängerte in klinischen

Studien signifikant das progressionsfreie Intervall und erzielte eine höhere Überlebensrate im

Vergleich zu herkömmlichen Chemotherapieansätzen (Slamon et al. 2001). Gemtuzumab

(Handelsname: Mylotarg) wird bei rezidivierender akuter myeloischer Leukämie angewendet

und erkennt CD33 (Glennie und van de Winkel 2003).

Zusätzlich wurde in einigen Therapieansätzen die Antikörperantwort verstärkt, in dem die

monoklonalen Antikörper an Toxine (z.B. radioaktive Isotope oder bakterielle Toxine) gekoppelt

wurden oder spezifische Sekundärantikörper mit gekoppelten Toxinen produziert wurden

(Clynes et al. 2000; Flieger et al. 2000). Schließlich kommen ebenfalls bispezifische Antikörper

in klinischen Studien zum Einsatz, die sowohl gegen ein Tumorantigen auf der Krebszelle als

auch einen Rezeptor auf einer Effektorzelle (z.B. CD20 auf B-Zellen oder CD3 auf T-Zellen)

gerichtet sind (De Gast et al. 1995).

Vakzinierungsstrategien

Im Gegensatz zu den Antikörpertherapien hat eine Vakzinierungsstrategie generell die aktive

Beteiligung und Unterstützung des Immunsystems zum Ziel, damit eine gegen die Tumorzellen

DISKUSSION 151

gerichtete Immunantwort hervorgerufen werden kann. Verschiedene Ansätze dieser

Impfstrategien können unterschieden werden.

In klinischen Studien wurden Peptid-Vakzinierungen vor allem an MM-Patienten unter

Verwendung z.B. des MAGE-3.A1 Peptids getestet. Bei sieben Patienten wurden signifikante

Tumorregressionen und bei zwei dieser Patienten komplette Regressionen nachgewiesen

(Marchand et al. 1999).

Gentherapien in Form von Vakzinierungen mit „copy“ DNA (cDNA), die für ein TAA kodiert,

unter Verwendung von Plasmid- oder viraler Vektoren, stellen eine weitere Möglichkeit der

spezifischen Tumorbekämpfung dar (Naitoh und Belldegrun 1998).

Neben der Peptid- und Gen-Vakzinierung werden Immunzellen selbst zur Immunbehandlung

herangezogen. Antigen-präsentierende Zellen (APC), zumeist in Form von dendritischen Zellen

(DC), werden mit spezifischen Antigenen oder Tumorlysaten von außen beladen. Bei fünf von

16 MM-Patienten konnte eine Regression von Metastasen in mehreren Organen nach einer

Vakzinierung mit DC, die mit Peptiden oder Tumorlysat beladen wurden, gemessen werden

(Nestle et al. 1998). Da die Beladung der DC mit Peptiden humanem Leukozyten Antigen

(HLA) abhängig erfolgt, können nur spezifische und zuvor identifizierte Epitope verwendet

werden. Andere Ansätze versuchen APC mittels rekombinanter Viren oder Bakterien zu

infizieren zur Aktivierung von Lymphozyten (Xiang et al. 1996; Paschen et al. 2000). Die Fusion

von autologen Tumorzellen und APCs soll zur Präsentation von autologen Antigenen an der

Oberfläche der APC eingesetzt werden (Stuhler und Walden 1994). Erste Studien mit diesem

Therapieansatz ergaben eine gute Resonanz bei MM-Patienten (Trefzer et al. 2000).

Vakzinierungen mit autologen Gedächtniszellen stehen ebenfalls in der Diskussion (Feuerer et

al. 2001).

Um prämaligne Erkrankungen oder Krebs im Frühstadium identifizieren und Antworten auf

Immuntherapien monitorieren zu können, werden quantitative Verfahren zur Bestimmung von

Tumor-spezifischen Antikörper-Immunreaktionen immer häufiger als klinische Instrumente

verwendet. Zwei mögliche methodische Ansätze, die in dieser Arbeit verwendet wurden, werden

im Folgenden diskutiert.

4.2 SADA

Der SADA wurde in dieser Arbeit als eine von zwei methodischen Ansätzen zur Bestimmung

von Immunreaktionen im Serum verwendet. Antikörperantworten wurden in Kontrollen und

einem CTCL- und MM-Kollektiv bestimmt. Alle untersuchten Antigene hatten entweder laut

DISKUSSION 152

Literatur oder im „serological analysis of recombinantly expressed cDNA clones“ (SEREX)

positive Ergebnisse und eine humorale Immunantwort zumeist ausschließlich in Tumorpatienten

erbracht. Die etablierte Methode basiert auf der SEREX-Methode und Arbeiten von M. Scanlan

(Scanlan et al. 2001; Scanlan et al. 2002). Um eine Eignung der untersuchten Tumorantigene

anhand der gemessenen Seroreaktivität in Diagnostik und Prognostik an sich oder aber als

Kombination von mehreren Tumorantigenen bewerten zu können, wurde die Häufigkeit der

serologischen Reaktivität herangezogen. Insgesamt wurden 42 Antigene an 218 Seren getestet.

4.2.1 Validierung des SADA

Bei der Etablierung einer neuen Methode ist eine Validierung der Methode in gewissem Umfang

angebracht. Für den SADA wurden die Parameter Phagenmobilität, Monoklonalität, Sensitivität

und Reproduzierbarkeit evaluiert.

Da Phagen eine hohe Mobilität besitzen und durch Lösungen leicht verschleppt werden können,

wurde getestet, ob beim Stempeln der Phagenlösungen eine Kontamination eines

Phagenstammes mit einem anderen möglich sei. Hierzu wurde ein Immunglobulin G (IgG)-Klon

verwendet, der eine starke Reaktion mit dem sekundären Antikörper im SADA-System besitzt.

Es konnte eindeutig belegt werden, dass ein „Springen“ oder Übertreten der Phagen von einem

zum anderen Loch der 96 Lochplatte und somit eine Vermischung der Phagenstämme beim

mehrfachen Stempeln nicht auftritt. Dies ist entscheidend für die Monoklonalität der

Phagenklone. Die Monoklonalität der Phagenlösungen konnte auch nach dem Picken von

mehreren Phagenplaques unter Verwendung von in vivo Exzision und reverse Transkriptase

Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) exemplarisch für vier verwendete Phagenklone bewiesen

werden. Somit wurden ausschließlich monoklonale Phagenlösungen mit eindeutig definierten

Phagenklonen verwendet.

Die Sensitivität der SADA-Methode wurde bestimmt, um die in Anlehnung an die SEREX-

Methode gewählte Verdünnung von 1:100 zu bestätigen. Die Untersuchung eines Serums eines

CTCL-Patienten in fünf Verdünnungen von 1:50 bis 1:1000 belegte deutlich, dass eine 1:100

Verdünnung in einem adäquaten Verdünnungsbereich liegt. Bei den Verdünnungen 1:50, 1:100

und 1:200 wurden dieselben Antigene von Antikörpern aus dem Serum erkannt. Ab einer

Verdünnung von 1:400 wurden weniger Antigene erkannt und bei einer Verdünnung von 1:1000

wurde kein Antigen mehr erkannt. Somit stellt eine 1:1000 Verdünnung eine eindeutig zu hohe

Verdünnung dar, um Serumantikörper mittels SADA detektieren zu können. Da die 1:100

Verdünnung in einem adäquaten Verdünnungsbereich liegt, kann im Gegensatz zu einer 1:50

Verdünnung Serum gespart werden. Ein direkter Vergleich mit der SEREX-Methode kann

DISKUSSION 153

aufgrund der identischen Serumverdünnung erfolgen. Die Sensitivität liegt laut diesem Test bei

einer Verdünnung von 1:200.

Die Reproduzierbarkeit der SADA-Methode wurde durch die unabhängige Präabsorption von

jeweils zwei identischen Serumproben von fünf MM-Patienten belegt. Die Seren wurden an

verschiedenen Tagen nach demselben Schema präabsorbiert. Beim Test der Seren mittels SADA

wurden identische Antikörperreaktionen nach erfolgreicher Präabsorption nachgewiesen. Dies

bedeutet, dass die Präabsorption der Seren keinen Einfluss auf das Ergebnis hat und die Methode

reproduzierbar ist.

4.2.2 Untersuchung von humoralen Immunantworten mittels SADA

In dieser Arbeit wurden erstmalig Seren von CTCL- und MM-Patienten im Vergleich zu

gesunden Ctrl mittels SADA auf ihre humorale Immunantwort gegen 42 SEREX-definierte

Antigene getestet.

Hierzu wurden die titrierten Phagenlösungen von 42 Antigenen sowie einem Negativ- und einem

Positivphagenklon auf einen E. coli Bakterienrasen aufgespottet und inkubiert. Die gebildeten

Phagenplaques, die das rekombinant exprimierte Protein des jeweiligen Phagenklons darstellten,

wurden auf Nitrozellulosemembranen geblottet, die Membranen blockiert, mit Serum und einem

Zweitantikörper inkubiert und schließlich mit Detektionsreagenz gefärbt. Zwei Membranen mit

in Duplikaten geblotteten Proteinspots von jeweils 20 bzw. 22 Antigenklonen und einem

Negativ- sowie einem Positivklon wurden hergestellt.

Die Serumantikörper-Häufigkeiten in den drei untersuchten Kollektiven lagen zwischen 0% und

72%. Gegen die Antigene cTAGE-1, cTAGE-5a, se89-1, HD-CL-50, 51 und 54 wurden in

keinem der drei Kollektive Antikörperantworten nachgewiesen. In sekundären SEREX-

Untersuchungen hingegen reagierten alle sechs Antigene mit Antikörperantworten über 10%.

Dieser deutliche Unterschied in der Antikörperreaktion könnte auf die Anwesenheit von

Negativ- und Positivkontrolle zusammen mit dem Antigen auf einer Membran zurückzuführen

sein. Zudem wurden andere und eine bedeutend höhere Anzahl an zufällig ausgewählten Seren

verwendet. Ein größeres Kollektiv spiegelt möglicherweise die Verteilung von reaktiven und

nicht-reaktiven Ctrl und Patienten besser wider als kleine Kollektive wie sie im SEREX

verwendet wurden. Der Klon se20-7 kann als Autoantigen bezeichnet werden, da er im CTCL-

Kollektiv zu 67%, im MM-Kollektiv zu 72% und in den Ctrl zu 65% erkannt wurde. Dieser Klon

könnte in zukünftigen SADA-Projekten als Positivkontrolle dienen, da Serumantikörper-

antworten in über 50% aller Seren zu erwarten sind.

DISKUSSION 154

Auffallend ist ebenfalls, dass die Serumantikörper-Häufigkeiten gegen die CTA MAGE-A3, A9

und GAGE-t sehr gering waren. Im MM-Kollektiv wurden keine Antikörper gegen die MAGE-

Antigene detektiert, obwohl MAGE-Antigen Expression in MM-Patienten beschrieben wurde

(Brasseur et al. 1995; Dalerba et al. 1998; Roeder et al. 2005). Ein Grund hierfür könnte sein,

dass diese Antigene eine eher schwache humorale Immunantwort auslösen und die

Antikörpertiter, falls Antikörper vorhanden sind, zu niedrig für eine Detektion im SADA sind.

Bereits in der Literatur beschriebene Antikörperuntersuchungen kamen zu ähnlich niedrigen

Ergebnissen unter Verwendung der „Enzyme linked immunosorbent assay“ (ELISA)-Methode

(Stockert et al. 1998).

Vierzehn Antigene (Guanylat-bindendes Protein (GBP)-5a, GBP-5ta, HD-CL-12, pMAGE-

A9ag, du20-10L4, HD-CL-03, HD-MM-02, HD-MM-03, HD-CL-02, HD-CL-17, HD-CL-24,

se33-1, se37-1, HD-CL-41) wiesen ausschließlich Antikörperantworten in den

Patientenkollektiven auf, so dass sie als serologisch tumorspezifisch bezeichnet werden können.

Jedoch waren die bestimmten Serumantikörperantworten gegen diese Antigene in den

Patientenkollektiven zumeist eher gering mit 1% bis 28%.

Zwischen den SADA- und zuvor durchgeführten sekundären SEREX-Ergebnissen ist ein

gewisser Unterschied nachweisbar. Die mittels SEREX untersuchten Ctrl besaßen keine

Serumantikörper gegen 29 im SADA verwendete Antigene mit Ausnahme von HD-CL-17. Im

SADA hingegen wurden keine Antikörper gegen 21 Antigene in Kontrollseren detektiert. Elf der

im SADA an Kontrollseren getesteten Antigene wurden bisher nicht im sekundären SEREX

untersucht. Im SADA wurden für alle anderen Antigene Antikörper-Häufigkeiten in den

Kontrollen von 1% bis 39% gemessen. Viele der SADA-Antigene, die im SADA und im

sekundären SEREX mit CTCL-Seren getestet wurden, wiesen höhere Antikörper-Häufigkeiten

im sekundären SEREX im Vergleich zum SADA auf. In sekundären SEREX-Untersuchungen

unter Verwendung von MM-Seren wurden nur HD-MM-Antigene sowie die cTAGE-Antigene

getestet. Auch für diese Antigene sind leicht höhere Antikörper-Häufigkeiten bei

Untersuchungen im sekundären SEREX vorhanden. Diese Unterschiede könnten wiederum auf

die höhere Anzahl an Seren und die Anwesenheit von Positiv- und Negativkontrolle auf der

SADA-Membran zurückzuführen sein.

Schließlich wurde nachgewiesen, dass beim Vergleich der Serumantikörper-Häufigkeiten größer

gleich 5% mehr Antigene im MM-Kollektiv (15) im Vergleich zum CTCL-Kollektiv (6) reaktiv

waren. Dies deutet auf eine höhere Immunogenität des MM im Vergleich zum CTCL hin. Die

hohe Immunogenität des MM wurde bereits in der Literatur beschrieben (Kawakami et al. 2000;

Anichini et al. 2004).

DISKUSSION 155

Serumantikörperantworten in CTCL-Patienten

30 von 42 Antigenen besaßen Serumantikörper-Häufigkeiten von weniger gleich 5% im

Kontroll- und CTCL-Kollektiv. 22 dieser 30 Antigene hatten keine Immunreaktion in der

Kontroll-Gruppe hervorgerufen. Die zwölf anderen Antigene erzeugten Antikörperantworten von

6% bis 67% in den CTCL-Patienten und 12% bis 39% in den Ctrl.

Für zwei von 42 Antigenen wurde ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den

Serumantikörper-Häufigkeiten von CTCL-Patienten und der Kontroll-Gruppe gemessen. HD-

MM-48 ist mit 3% Antikörper-Häufigkeit zwar nicht serologisch tumorspezifisch. Jedoch ist die

Reaktivität in den CTCL-Patienten mit 20% deutlich unterschiedlich von den Ctrl. Das heißt

jeder fünfte CTCL-Patient bildete Antikörper gegen dieses Antigen, so dass es in ein Panel von

Antigenen zur Diagnose und Monitoring aufgenommen werden könnte. Die Anzahl an positiven

Kontrollseren ist mit 3% eher vernachlässigbar. Ein weiteres Antigen, das einen statistisch

signifikanten Unterschied in seiner Reaktivität zwischen CTCL-Patienten und Ctrl besitzt ist

HC-CL-02. Dieses Antigen ist serologisch tumorspezifisch und erzeugte Antikörper in 6% der

CTCL-Patienten. HD-CL-02 ist sicherlich aufgrund seiner serologischen Tumorspezifität

interessant und sollte in weiteren Screening-Studien zur Zusammenstellung eines Panels an

Antigenen enthalten sein. Aufgrund der statistischen Berechnungen werden im Folgenden nur

die soeben genannten Antigene genauer beschrieben.

HD-MM-48

Dieser in CTCL- und MM-Patienten stark reaktive Phagenklon ist homolog zum Rezeptor-

interagierenden Faktor 1 Variante 2 (RIF1). Dieser Phagenklon wurde zuvor nicht in sekundären

SEREX-Untersuchungen analysiert. Das homologe nukleäre Protein RIF1 spielt eine wichtige

Rolle bei der Hemmung der Zellzyklusprogression in der S-Phase nach DNA Schädigung

(Silverman et al. 2004). In der Telophase lokalisiert RIF1 an kondensierte Chromosomen,

wohingegen es in der Anaphase an Mikrotubuli der mitotischen Spindel nachgewiesen wird.

Expression von RIF1 wurde in Sertoli-Zellen, frühen primären Spermatozyten und Oozyten

sowie embryonalen Stammzellen detektiert. Jedoch nimmt die RIF1 Expression bis hin zu ihrem

Verlust während der Zelldifferenzierung ab. Eine Reduzierung der RIF1 Expression unter

Verwendung von „small interfering“ Ribonukleinsäure (siRNA) führte zu einer höheren

Radiosensitivität.

DISKUSSION 156

HD-CL-02

HD-CL-02 ist homolog zur Homo sapiens mRNA für Inositol-1,4,5-Trisphosphat 5-Phosphatase

(Hartmann et al. 2004). Dieses Membran-assoziierte Enzym katalysiert die Dephosphorylierung

des Botenstoffes Inositol-1,4,5-Triphosphat, welches zur Inaktivierung des Botenstoffes führt

(Laxminarayan et al. 1994). Der Botenstoff Inositol-1,4,5-Triphosphat reguliert die

Mobilisierung von intrazellulärem Calcium. HD-CL-02 stellt einen verkürzten Klon mit einer

veränderten C-terminalen Proteinregion dar, der auf mRNA-Ebene in 80% der CTCL-Gewebe

exprimiert ist. In sekundären SEREX-Analysen erzeugte HD-CL-02 mit 19% fast in einem

Fünftel aller CTCL-Patienten Antikörper, wohingegen keine Antikörperreaktion in Ctrl

detektiert werden konnten. Somit war dieser Klon sowohl im SEREX wie auch im SADA

tumorspezifisch. Dies ist eine gute Voraussetzung für weitere serologische Untersuchungen an

verschiedenen Patientenkollektiven. Immunogenität dieses ubiquitären Proteins kann von seinem

gegenüber dem homologen Protein veränderten C-terminalen Ende stammen. Die Inositol-1,4,5-

Trisphosphat 5-Phosphatase ist in den Purkinje Zellen des Gehirns stark exprimiert (De Smedt et

al. 1994). Das Enzym könnte eine Rolle bei der Zellproliferation spielen, da Patienten mit akuter

und chronischer Leukämie nur eine geringe oder keine Enzymaktivität aufwiesen (Mengubas et

al. 1994).

Serumantikörperantworten in MM-Patienten

25 von 42 Antigenen induzierten keine Serumantikörper in MM-Patienten. Die restlichen 17

Antigene hingegen wiesen Antikörper-Häufigkeiten von mehr als 5% auf. Bei der Berechnung

des statistisch signifikanten Unterschieds zwischen Ctrl und MM-Patienten konnten vier dieser

Antigene identifiziert werden.

GBP-5a reagierte mit keiner Ctrl, jedoch mit 17% aller MM-Seren. Ähnlich verhielt sich auch

GBP-5ta, das ebenfalls serologisch tumorspezifisch getestet wurde und 28% aller MM-Patienten

zur Bildung von Antikörpern angeregt hatte. Wie bereits für den Vergleich von Ctrl und CTCL-

Kollektiv war der Vergleich von Ctrl und MM-Kollektiv hinsichtlich der

Serumantikörperantworten gegen HD-MM-48 statistisch signifikant mit 17% der MM-Patienten

gegenüber 3% der Ctrl. Schließlich wurde für HD-MM-19 ein statistisch signifikanter

Unterschied zwischen Kollektiven identifiziert. Allerdings erzeugte dieses Antigen eine sehr

hohe Reaktivität mit annähernd 40% in Ctrl. Dieses Antigen ist, obwohl 83% der MM-Patienten

Antikörper gebildet hatten, nicht für die Diagnosestellung geeignet, da es vermutlich zu viele

falsch positive Ergebnisse erzeugen würde. Hingegen ist die hohe Reaktivität in MM-Patienten

DISKUSSION 157

wirklich bemerkenswert. Im Folgenden sollen die bisher noch nicht genauer beschriebenen

Antigene näher erläutert werden.

GBP-5a und GBP-5ta

GBP-5 stellt ein neues Gen der GBP-Familie dar, dessen drei Spleißvarianten in zwei Proteine,

GBP-5a/b und GBP-5ta, translatiert werden. Am C-terminalen Ende ist GBP-5ta um 97

Aminosäuren gegenüber GBP-5a/b verkürzt. Eine hohe Immunogenität von GBP-5ta von 50% in

CTCL-Patienten wurde mittels SEREX bestimmt. Von Interesse ist, dass GBP-5ta im SEREX

immunogener war als das Volle-Länge-Protein. Auf „messenger“ RNA (mRNA)-Ebene sind alle

drei Varianten in Normalgeweben differentiell sowie GBP-5ta/-5b zu 26% - 58% in CTCL-

Tumorgewebe und zu 45% in MM exprimiert. Auf Proteinebene wird eine Expression aller drei

Varianten nur in peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC) nachgewiesen, wobei die

Expression von GBP-5ta sehr schwach ist. In diesem Zusammenhang wurde GBP-5ta als

PBMC-spezifisches Tumorantigen identifiziert. In CTCL-Tumorgewebe wurde nur GBP-5ta

nachgewiesen, wohingegen im MM hauptsächlich GBP-5a/b detektiert wurde. In

Untersuchungen von Zelllinien des CTCL und MM wurden die GBP-5 Proteine perinukleär und

intrazellulär lokalisiert. In den untersuchten CTCL-Zelllinien wurde weder auf mRNA- noch auf

Proteinebene eine induzierte Expression der GBP-5 Proteine nach INF-γ Behandlung gemessen.

Dies deutet auf eine IFN-γ-Resistenz der Zelllinien hin (Fellenberg et al. 2004). Alle drei GBP-5

Proteine sind auf dem Chromosom 1p22 lokalisiert, welches vielfach in der Literatur als Region

mit chromosomalen Veränderungen im Zusammenhang mit malignen Transformationen

beschrieben wurde (Parada et al. 1998; Cigudosa et al. 1999; Dave et al. 2002). Schließlich

könnte GBP-5ta ein potentielles Onkogen darstellen, da GBP-5ta gegenüber GBP-1 einen

Verlust der C-terminalen Region aufweist. Bei GBP-1 bewirkt diese Region den

antiproliferativen Effekt auf Endothelzellen (Guenzi et al. 2001).

HD-MM-19

HD-MM-19 ist zu 99% homolog zum Zinkfingerprotein 133 (ZNF133), welches zur größten

Gruppe von Transkriptionsfaktoren zählt (Ehlken et al. 2004). Die „Krüppel-associated Box

(KRAB)“ ist eine stark konservierte Region von 75 Aminosäuren am N-Terminus von etwa

einem Drittel der Krüppel-Klasse Cys2His2-Zinkfingerproteine. 25% von 12 MM-Patienten

erzeugten in sekundären SEREX-Untersuchungen eine Antikörperreaktion gegen dieses

ubiquitär exprimierte Antigen nach einer Immunisierung mit entweder IL-7 oder IL-2. Einer der

drei Patienten besaß bereits Antikörper vor der Immunisierung. CTCL-Patienten und Ctrl

wurden im sekundären SEREX nicht analysiert.

DISKUSSION 158

Die KRAB-Domäne wird durch zwei Untereinheiten, der A- und B-Unterdomäne, gebildet. Laut

Margolin et al. können KRABs potente transkriptionelle Repressionsdomänen darstellen

(Margolin et al. 1994). Schließlich konnte in Mikroarray-Untersuchungen eine erhöhte

Expression von ZNF133 in einer Neuroblastomzelllinie nachgewiesen werden (Heiskanen et al.

2000).

4.2.3 SADA als Methode zur Bestimmung der Antikörperantwort

In der Literatur sind vier Untersuchungen unter Verwendung der SADA-Methode beschrieben,

die neben SADA auch als „Spot assay“ oder „Serological mini-arrays of recombinant tumor

antigens“ (SMARTA) bezeichnet wird. Die Untersuchungen von Devitt et al. wurden mit

Membranen, die in dieser Arbeit angefertigt wurden, durchgeführt. In der SMARTA-Studie

wurde ausschließlich die Etablierung und Optimierung der Methode selbst anhand von neun

Tumorantigenen beschrieben (Lagarkova et al. 2003).

Scanlan et al. identifizierten 94 Brustkrebs-assoziierte Antigene, von welchen 40 Antigene

mittels des „Spot assays“ an Seren von 25 Brust-, 19 Dickdarm-, 15 Lungen-, 15 Gebärmutter-

und 15 Speiseröhrenkrebspatienten aufgrund ihrer Reaktion mit ausschließlich

Krebspatientenseren getestet wurden (Scanlan et al. 2001). Die berichteten Antikörper-

Häufigkeiten lagen ähnlich wie die der SADA-Ergebnisse dieser Arbeit unter 20%. Die Antigene

mit den höchsten Häufigkeiten waren NY-BR-53 (homolog zu LAGE-1) mit annähernd 20%

Reaktivität in Brustkrebspatienten, einem reaktiven Serum jeweils im Dickdarm- und

Gebärmutterkrebskollektiv und zwei reaktiven Seren jeweils im Lungen- und

Speiseröhrenkrebskollektiv. Zwei weitere häufiger reaktive Antigene stellten NY-BR-94

(homolog zu p53, 3 von 19 Seren von Dickdarmkrebspatienten positiv) und NY-BR-98

(homolog zu MAGE D, 2 von 25 Seren von Brustkrebspatienten positiv) dar (Scanlan et al.

2001).

In einer weiteren Studie untersuchten Scanlan et al. ein Panel von 77 SEREX-definierten

Tumorantigenen mit Seren von 74 Dickdarmkrebspatienten und 75 Ctrl (Scanlan et al. 2002).

Dreizehn der getesteten Antigene wiesen Seroreaktionen ausschließlich in Krebspatienten auf, so

dass nur diese Antigene weiter untersucht wurden. Auch hier lagen die analysierten

Antikörperreaktivitäten für alle 77 Antigene unter 20%. Das Antigen NY-CO-13 (homolog zu

p53) hatte die stärkste immunologische Reaktion mit Antikörpern in 15% der Patienten. 8% der

Patienten reagierten mit Antikörpern auf die Antigene NY-CO-42 (homolog zu Thyroidhormon

Rezeptor-interagierendes Protein 4 (TRIP4)) und MAGE-A3. Desweiteren wurden Antikörper

gegen diese dreizehn Antigene mit dem Stadium der Erkrankung korreliert. Hier war eine

DISKUSSION 159

Abnahme an Antikörper-Häufigkeit gegen mindestens eines der dreizehn Antigene von Phase I

(71%) über Phase II (36%) zu Phase III (14%) auffällig. In Phase IV wurden wieder höhere

Antikörper-Häufigkeiten (52%) identifiziert (Scanlan et al. 2002).

Devitt et al. analysierten Serumantikörperantworten unter Verwendung desselben Panels von

Antigenen, welches in dieser Arbeit mittels SADA untersucht wurde. Seren von 35

Nierenzellkarzinom (RCC)-Patienten und 15 Ctrl wurden für diese Studie herangezogen (Devitt

2004; Devitt et al. 2006). Für zwei Antigene konnte ein statistisch signifikanter Unterschied in

der Antikörperantwort von RCC-Patienten und Ctrl nachgewiesen werden. 23% der RCC-

Patienten besaßen Antikörper gegen se2-5, wohingegen keine Antikörper in Ctrl identifiziert

wurden. 40% aller RCC-Patienten wiesen Antikörper gegen HD-MM-19 auf, jedoch nur 7%

aller Ctrl. Da in dieser Studie andere Kontrollseren verwendet wurden als in der vorliegenden

Arbeit, sind die Ergebnisse hinsichtlich der Antwort der Kontrollseren gegen se2-5 und HD-

MM-19 in dieser Studie im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit unterschiedlich. Dies könnte auf

die Anzahl und Auswahl der Seren zurückzuführen sein. Gegen die vier Antigene se1-1, se2-1,

se20-4 und HD-MM-19 wurden höhere Antikörperantworten in RCC-Patienten als in Ctrl

gemessen. Die acht Antigene HD-MM-03, cTAGE-5a, se2-5, se89-1, se57-1, du20-10L4,

GAGE-t und HD-MM-08 wurden immunologisch tumorspezifisch erkannt. Gegen 28 Antigene

konnten keine Antikörper im Serum detektiert werden. Se20-7 konnte ebenso wie in dieser

Arbeit als Autoantigen identifiziert werden, da 100% der RCC-Patienten und Ctrl Antikörper

gegen dieses Antigen gebildet hatten. HD-MM-23 wurde mit Antikörper-Häufigkeiten von 100%

in Ctrl und 97% in RCC-Patienten ebenfalls häufig von Seren erkannt (Devitt 2004; Devitt et al.

2006).

4.2.4 Vergleich von SADA und SEREX

Beim Vergleich der SADA- und SEREX-Methode fällt zunächst auf, dass beim SADA

vergleichsweise viele Antigene, das heißt bis zu 22 verschiedene Antigene plus Negativ- und

Positivkontrolle, gleichzeitig mit einem Serum getestet werden können. Dies stellt eindeutig den

Vorteil des SADA gegenüber der SEREX-Methode dar, bei der pro Platte nur ein Phagenklon

mit einem Serum getestet werden kann. Zusätzlich kann ein Vergleich zwischen Färbung des

Antigenspots mit der Negativ- und Positivkontrolle durchgeführt werden. Somit ist eine

vergleichende und bessere Beurteilung der Positivität eines Antigens möglich als beim SEREX.

Beim SADA ist die Stelle eines Antigens auf der Membran definiert, wohingegen auf der

SEREX-Membran nur zwischen reaktiven und nichtreaktiven Plaques unterschieden werden

kann. Erst nach der Isolierung des entsprechenden SEREX-Plaques und einer in vivo Exzision

DISKUSSION 160

kann eindeutig die Identität eines Plaques festgestellt werden. In sekundären SEREX-

Untersuchungen wird zumeist eine heterogene Phagenlösung mit dem Phagenklon und einem

Phagen ohne Insert (Negativkontrolle) eingesetzt. Auf der Platte jedoch kann nicht festgestellt

werden, welche Plaques welchem Phage zuzuordnen sind.

Ein deutlicher Unterschied zwischen den beiden Methoden besteht in der Bildung der

Phagenplaques. Beim SEREX lässt sich ein Phagenplaque auf der Platte auf ein einziges

Bakterium, das von einem einzigen Phagenklon infiziert wurde, zurückführen. Beim SADA

hingegen werden ca. 2µL Phagenlösung eines Phagenklons mit einem Titer von ca. 2000 Phagen

pro µL mittels Stempel auf den Bakterienrasen übertragen. Dies bedeutet, dass viele Bakterien

an der Auftragstelle mit einem Phagenklon infiziert werden und somit viele Plaques

nebeneinander entstehen. Teilweise wurde beim SEREX eine helle Hofbildung um die

Phagenplaques bei der Färbung der entwickelten Membranen beschrieben. Dieser Effekt wurde

bei den SADA-Membranen nicht festgestellt. Somit wurde durch die Entstehung von vielen

Phagenplaques an einer Stelle keine Auslöschung der Färbung durch Randeffekte ermittelt.

4.2.5 SADA - Fazit und Ausblick

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die gemessenen humoralen Immunantworten sowohl in

CTCL- als auch in MM-Patienten hinsichtlich ihrer Frequenz in den verschiedenen Kollektiven

niedrig sind und selten über 20% der entsprechenden Kohorte ausmachen. Die Frequenz der

Antikörperantworten in MM-Patienten ist zumeist höher als in den CTCL-Patienten. Dies ist

vermutlich auf die höhere Immunogenität des MM selbst zurückzuführen. Die

Antikörperantworten gegen CTA liegen in allen Kollektiven unter 10%. Dies entspricht

Ergebnissen von E. Stockert, die unter Verwendung eines ELISAs ähnlich geringe Frequenzen

an Antikörperantworten gegen CTA in MM-Patienten nachwies. Schließlich lagen alle

gemessenen Antikörperfrequenzen in CTCL-Patienten unterhalb der Frequenz, die in sekundären

SEREX-Untersuchungen bestimmt wurden. Ursachen hierfür können in einem größeren, zufällig

ausgewählten Serenkollektiv im SADA und im direkten Vergleich von Antikörperreaktionen

gegen den Phagenklon und den Negativ- sowie Positivklon liegen

Generell ist festzustellen, dass mittels SADA im Vergleich zu SEREX mehr Antigene

gleichzeitig und parallel mit einem Serum getestet werden können. Jedoch ist SADA eine

aufwendige Methode, da die Präabsorption der Seren zeitaufwendig und teuer ist. Zudem dauert

ein vollständiger Test inklusive Wiederholung vier Arbeitstage, so dass eine Anwendung in der

Klinikroutine wohl eher unwahrscheinlich ist. Des Weiteren wurden in dieser Untersuchung

mittels SADA nur zwei Phagenklone für das CTCL und vier Phagenklone für das MM

DISKUSSION 161

identifiziert, die statistisch signifikant unterschiedlich zwischen Ctrl und dem jeweiligen

Patientenkollektiv waren, so dass sie in Prognostik und Diagnostik eingesetzt werden könnten.

Für eine relevante Vorhersage wäre jedoch ein Panel von mindestens zehn Antigenen

wünschenswert, die in weiteren SEREX- und SADA-Screens identifiziert sowie überprüft

werden müssten. Schließlich wäre ein direkter Vergleich von denselben Seren im SEREX und

SADA unter Verwendung derselben Antigene sinnvoll, um präzisere Aussagen über die

Vergleichbarkeit beider Methoden zu ermöglichen. Antigene, die auf diese Art und Weise als

relevant für Diagnostik und Prognostik bestätigt würden, wären ebenfalls ideale Kandidaten-

Antigene zum Einsatz in der nachfolgend diskutierten Multiplex-Serologie.

4.3 Multiplex-Serologie

Für die diagnostische Tumorserologie, zur Beurteilung von Krebserkrankungen oder zur

Früherkennung von Rezidiven wird der ELISA unter Verwendung von tumor-assoziierten,

tumorspezifischen und nicht-tumorspezifischen Antigenen seit Jahrzehnten eingesetzt (Old und

Chen 1998; Sahin et al. 1999). Die Entwicklung des ELISA erfolgte, um viele Seren in kurzer

Zeit zu testen. Durch die einfache Handhabung eignet sich diese Methode ausgezeichnet für

einen Einsatz sowohl in der Forschung als auch in der Klinikroutine. Dr. Peter Sehr (DKFZ,

Heidelberg) entwickelte den Glutathion-S-Transferase (GST) „capture“ ELISA, der den Einsatz

von Proteinen in einem ELISA-System in ihrer nativen Konformation ohne vorherige

Aufreinigung erlaubt (Sehr et al. 2001). Dieser methodische Ansatz ist sehr sensitiv und

spezifisch und kann mit jedem löslichen, rekombinant hergestellten GST-Fusionsprotein

durchgeführt werden. Der einzige Nachteil ist jedoch die Beschränkung auf ein Antigen pro

Loch sowie ein hoher Serumverbrauch und Zeitaufwand.

Seit Ende der 80er Jahre wird der Begriff „Multiplex“ im Zusammenhang mit der PCR benutzt.

Heute bedeutet „Multiplex“, dass die Reaktion von einer Probe mit mehreren Bindungspartnern

untersucht wird. Seit Mitte der 90er Jahre sind Suspensions-Arrays erhältlich, die meistens auf

Polystyrol-Kügelchen (Beads) basieren, die sich durch ihre Größe oder Farbe voneinander

unterscheiden. Die Beads dienen hierbei als feste Phase für Bindungsassays, wobei die

Identifikation mittels Durchflusszytometrie erfolgt. Obwohl die Bead-Population auf maximal

100 verschiedene Beads beschränkt ist, erlaubt dieses System einen hohen Durchsatz (Templin et

al. 2004). Das xMAP-System, das Ende der 90er Jahre von der Firma Luminex auf den Markt

gebracht wurde, wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet. Es beruht auf bis zu 100

unterschiedlich farbkodierten Beads. Die Auswertung erfolgt mit einem speziellen

Durchflusszytometer, dem Luminex Analyzer. Das xMAP-System ist derzeit das kommerziell

DISKUSSION 162

als auch wissenschaftlich erfolgreichste System. Dr. Tim Waterboer (DKFZ, Heidelberg)

entwickelte die Multiplex-Serologie auf der Grundlage des xMAP-Systems für die Analyse von

komplexen Antikörperantworten inklusive einer in situ Aufreinigung der rekombinant

exprimierten Antigene direkt auf den Beads (Waterboer 2005; Waterboer et al. 2005). In

bisherigen xMAP-basierten Publikationen wurden beispielsweise Zytokine (Prabhakar et al.

2002), monoklonale Antikörper (Seideman und Peritt 2002), Antikörper gegen virale Antigene

(Opalka et al. 2003) und Autoantigene (Gilburd et al. 2004) im Serum untersucht.

In dieser Arbeit wurde das xMAP-System als Multiplex-Hochdurchsatzverfahren angewendet,

um Antikörperantworten gegen sieben CTA, drei TAA und zwei Tumorsuppressorgene in 144

CTCL-, 191 MM-Patienten, 100 Kontrollpersonen und 25 immunbehandelten Tumorpatienten zu

untersuchen. Vier virale Antigene dienten als interne Ctrl zur Überprüfung der Zugehörigkeit

von Seren zu Patienten. Insgesamt wurden zwölf humane und vier virale Antigene an 460 Seren

getestet. Ähnlich wie die Untersuchungen mittels SADA diente die Untersuchung von

Antikörperantworten mittels Multiplex-Serologie der Analyse der Eignung der untersuchten

Tumorantigene in Diagnostik und Prognostik an sich oder aber als Kombination von mehreren

Tumorantigenen.

4.3.1 Qualitätskontrolle und statistische Auswertung

In dieser Arbeit wurden erstmalig Seren von CTCL- und MM-Patienten im Vergleich zu

gesunden Ctrl mittels Multiplex-Serologie auf ihre humorale Immunantwort gegen zwölf

humane und vier virale Antigene untersucht.

Die kovalent an Glutathion-Casein (GC) gekoppelten Beads wurden von Dr. T. Waterboer zur

Verfügung gestellt, da diese sehr stabil sind und über Monate im Kühlschrank gelagert werden

können (Waterboer 2005). An jede GC-Beadsorte wurde ein rekombinant hergestelltes GST-

Fusionsprotein direkt gebunden. Dies ging mit einer in situ Aufreinigung der GST-

Fusionsproteine aus dem Bakterienlysat einher. Die gewaschenen 17 verschiedenen Beadsorten

wurden zu einer Mischung vereinigt und in einer 96 Lochplatte mit Filterboden mit gegen GST-

tag- und E. coli-Protein präabsorbiertem Serum inkubiert. Ungebundene Serumproteine wurden

durch Waschen der Beads entfernt. Gebundene Serumantikörper wurden durch Inkubation mit

biotinyliertem Sekundärantikörper und anschließender Streptavidin-R-Phycoerythrin-Reaktion

markiert. Die Detektion der Antigen-Antikörper-Reaktion erfolgte schließlich im Luminex-

Analysegerät. Die Beadsorte wird unter Verwendung eines Klassifizierungs-Lasers identifiziert

und die Quantifizierung der Bindungsreaktion erfolgt unter Verwendung eines Reporter-Lasers.

DISKUSSION 163

Pro Beadsorte wurden 100 Beads vermessen, und die Reporter-Fluoreszenz-Intensitäten als

Median der 100 Einzelbeads in „mean fluorescence intensity“ (MFI) berichtet.

Zur Qualitätskontrolle der Multiplex-Serologie wurden zwei verschiedene Ansätze gewählt.

Zunächst wurden die rekombinant exprimierten GST-Fusionsproteine, die im Bakterienlysat

vorlagen, im GST „capture“ ELISA mittels der GST- und tag-Antikörper untersucht. Hierzu

wurde der GST „capture“ ELISA durchgeführt und eine zwölfstufige Verdünnungsreihe jedes

GST-Fusionsproteins hergestellt. Die Untersuchung jedes Antigens mit beiden Antikörpern

bewies eindeutig, dass alle Proteine in voller Länge exprimiert waren. Zusätzlich wurden alle

GST-Fusionsproteine mittels GST- und tag-Antikörper im Western Blot analysiert. Hier konnte

für alle Antigene die volle Länge jedes GST-Fusionsproteins neben einigen Abbauprodukten

nachgewiesen werden.

In einem zweiten Ansatz wurden interne Ctrl während der Durchführung der Multiplex-

Serologie mitgeführt. Hierzu diente der tag-Antikörper, mittels welchem die Bindung von Volle-

Länge-Protein an die Beads überprüft wurde. Diese Bindung konnte für alle Antigene

nachgewiesen werden. Zudem wurde der Mittelwert aller MFI-Werte gegen alle Antigene

inklusive GST-tag für jedes Serum berechnet. Für alle untersuchten Seren lag dieser Mittelwert

über 20 MFI. Weiterhin wurde je ein Loch ohne Serum und ohne sekundären Antikörper als

interne Ctrl herangezogen. Der MFI-Mittelwert über alle Antigene lag für das Loch ohne

sekundären Antikörper wie erwartet unter 20 MFI. Für das Loch ohne Serum ergab sich mit 37

MFI ein leicht erhöhter Wert, der eine geringe Hintergrundreaktion verdeutlichte. Schließlich

wurden drei spezifische Antikörper zur Bestätigung der Bindung des richtigen Antigens an die

entsprechende Beadsorte in der Multiplex-Serologie eingesetzt. Für die Antigene cTAGE-5a C-

terminal, GAGE-7b und MAGE-A9 wurde nachgewiesen, dass sie an die entsprechend

ausgewählte Beadsorte gebunden waren. Für alle anderen verwendeten Antigene lagen keine in

der Multiplex-Serologie verwendbaren Antikörper bei der Durchführung der Analyse vor.

Zur Beurteilung der Seroreaktivitäten gegen jedes Antigen mussten seropositive von

seronegativen Reaktionen unterschieden werden. Im allgemeinen wird ein diskriminatorischer

Schwellenwert (Cut-off) anhand des Mittelwerts plus x-facher Standardabweichung der

Seroreaktivitäten einer seronegative Kontroll-Gruppe berechnet (Stockert et al. 1998; Stone et al.

2003; Zhang et al. 2003; Goodell und Disis 2005; Strid et al. 2007). In dieser Arbeit dienten 100

unabhängige Kontrollseren von einer Blutbank als Kontroll-Gruppe. Für die vier in dieser Arbeit

verwendeten viralen Antigene ist diese Methode der Cut-off-Wert-Bestimmung jedoch

problematisch, weil sehr viele Erwachsene Antikörper gegen die verwendeten Antigene (BK, JC,

LPV, humanes Papillomavirus (HPV) 1) besitzen. Deshalb wurde der Cut-off-Wert für jedes

DISKUSSION 164

virale Antigen anhand von Voruntersuchungen festgesetzt (Waterboer 2005). Für alle humanen

Antigene wurde der Cut-off-Wert als Mittelwert plus zweifacher Standardabweichung der

Seroreaktivitäten berechnet. Diese Vorgehensweise ist bereits in der Literatur für HER-2/neu

(Goodell und Disis 2005) und Salmonellen Lipopolysaccharid (Strid et al. 2007) beschrieben.

Für die humanen Antigene wurde eine andere Bestimmung des Cut-off-Wertes im Vergleich zu

den viralen Antigenen gewählt. Denn nur wirklich reaktive Seren sollten identifiziert werden, um

eine fundierte Aussage über die Verwendung der Antigene in Diagnose, Prognose oder

Monitoring treffen zu können. Allerdins handelt es sich letztlich jedoch um Autoantigene. Die

Darstellung der Reaktivitäten aller Seren einer Kohorte erfolgte durch kumulative

Distributionen. Bei dieser grafischen Darstellung kann nach Einzeichnung des Cut-off-Wertes

direkt die Prozentzahl an reaktiven Seren, das heißt Seren über Cut-off, abgelesen werden.

Statistisch ausgewertet wurden die erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung des „Fisher’s Exact

Tests“. Zwei unterschiedliche Serumkategorien wurden verwendet: reaktive und nicht-reaktive

Seren beziehungsweise seropositive oder seronegative Patienten und Ctrl. Nach der Bestimmung

der prozentualen Anteile an reaktiven und nicht-reaktiven Seren in jedem Kollektiv, wurden die

Reaktivitäten der unterschiedlichen Kollektive anhand des „Fisher’s Exact Tests“ verglichen.

Sobald ein Signifikanzniveau von unter 0,05 bei der Bewertung eines Tests ermittelt wurde,

wurde dieses Ergebnis als statisch signifikant unterschiedlich gewertet.

Serumverläufe wurden als signifikant ansteigend gewertet, wenn eine der nachfolgenden

Seroreaktivitäten eine doppelte Reaktivität aufwies und zudem über dem Cut-off-Wert lag. Ein

signifikanter Abfall bestand in mindestens einer Halbierung der Seroreaktivität bei einer

nachfolgenden Seroreaktivität, solange die erste Seroreaktivität über dem Cut-off-Wert des

jeweiligen Antigens lag.

4.3.2 Humorale Immunantworten von MM-Patienten

Häufigkeiten von Antikörperantworten gegen sieben CTA, drei TAA, zwei

Tumorsuppressorgene und vier virale Antigene wurden mittels Multiplex-Serologie in insgesamt

191 MM-Patienten untersucht. Die grafische Auswertung erfolgte anhand von kumulativen

Distributionen. Die statistische Beurteilung wurde nach der Bestimmung eines Cut-off-Wertes

anhand eines unabhängigen Kontroll-Kollektivs für jedes Antigen unter Verwendung des

„Fisher’s Exact Tests“ vorgenommen.

Die Analyse der MM-Patienten im Vergleich zu den Kontrollpersonen ergab eindeutig, dass

Serumantikörperreaktionen gegen die verwendeten CTA, TAA und Tumorsuppressorgene nur

sporadisch auftreten und zumeist unter 10% liegen. Antikörperantworten wurden auch in

DISKUSSION 165

Kontrollpersonen detektiert. Somit sind alle CTA und TAA außer CAMEL immunologisch nicht

tumorspezifisch. Allerdings traten die höchsten, gemessenen MFI-Werte in MM-Patienten vor

allem in Stadium IV auf. Dies traf für die Antigene MAGE-A1, A3, A9, LAGE-1a, GAGE-7b

und CAMEL zu. Entsprechend könnte gerade bei Patienten in Stadium IV eine Abgrenzung

gegenüber Patienten anderer Stadien anhand MFI-Werten von teilweise mehr als 10000 MFI

erfolgen. Einschränkend muss jedoch erwähnt werden, dass Stadium IV Patienten bereits anhand

des klinischen Bildes von Patienten anderer Stadien unterscheidbar sind. Des Weiteren wurden

gerade in Stadium IV Patienten häufiger Antikörper gegen mehrere CTA in einem Patienten

nachgewiesen. Diese Häufung von Antikörpern gegen verschiedene CTA war außerordentlich

deutlich bei zwei der 47 Patienten in Stadium IV ausgeprägt.

Statistisch signifikante Unterschiede zwischen Patienten- und Kontroll-Kollektiv wurden für die

Antigene MAGE-A3, LAGE-1a, se70-2 und se57-1 berechnet. Patienten in Stadium IV besaßen

statistisch signifikant häufiger Antikörper gegen MAGE-A3 (19,1%) gegenüber der Ctrl (6%).

Statistisch signifikant häufiger bildeten Patienten des Stadiums II (10,2%) Antikörper gegen

se57-1 gegenüber der Ctrl (1%). Für GAGE-7b konnte ein Trend zu einem statistisch

signifikanten Unterschied zwischen Antikörper-Häufigkeiten in MM-Patienten des Stadiums II

(8,2%) und Ctrl (1%) erkannt werden. Für se70-2 hingegen wurden statistisch signifikant mehr

Antikörperantworten im Kontroll-Kollektiv (3%) gegenüber dem Patientenkollektiv (0%)

gemessen. Für alle anderen Antigene ließen sich keine statistischen Unterschiede zwischen

Kontrollpersonen und Patienten ermitteln.

LAGE-1a stellte sich in dieser Arbeit als sehr wertvolles CTA hinsichtlich

Serumantikörperantworten in MM-Patienten dar. Als einziges CTA aller untersuchter Antigene

demonstrierte LAGE-1a eine stadienabhängige Serumantikörper-Häufigkeit. Bereits der

Unterschied an Serumantikörpern zwischen Ctrl (3%) und allen 191 MM-Patienten (13,6%) ist

statistisch signifikant. Des Weiteren wurden statistisch signifikant erhöhte Antikörper-

Häufigkeiten in Stadium III (12,8%) und Stadium IV Patienten (21,3%) nachgewiesen. Ein

Einsatz dieses Antigens in der Prognostik und eventuell sogar in der Diagnostik (Stadium I

10,4%) von MM-Erkrankungen wäre anhand dieser Untersuchungen sinnvoll. Nachfolgend soll

das CTA LAGE-1a besonders hinsichtlich humoraler Immunantworten näher beschrieben

werden.

Das Antigen LAGE-1 zählt aufgrund seines Expressionsprofils zu den CTA und wurde 1998

zum ersten Mal mittels einer differentiellen RT-PCR-Analyse an einer MM-Zelllinie beschrieben

(Lethe et al. 1998). Ein Jahr zuvor wurde das CTA NY-ESO-1 mittels SEREX an einer

Ösophaguskarzinombank identifiziert, zu welchem LAGE-1 zu 84% homolog ist (Chen et al.

DISKUSSION 166

1997). Dadurch sind Kreuzreaktionen zwischen den beiden Proteinen, die hintereinander auf

Chromosom Xq28 lokalisiert sind, nicht auszuschließen. Zudem hat LAGE-1 mit LAGE-1a und

–1b zwei Spleißvarianten, und CAMEL, ein kürzeres Produkt von einem alternativen

Leserahmen, zählt ebenfalls zu dieser Genfamilie (Lethe et al. 1998; Aarnoudse et al. 1999). Vor

einigen Jahren wurde das ubiquitäre ESO-3, das zu weniger als 50% homolog zu NY-ESO-1 ist,

identifiziert (Alpen et al. 2002). Die Funktion von LAGE-1 und NY-ESO-1 ist bisher noch

ungeklärt. LAGE-1 Expression wird häufig zusammen mit jener von NY-ESO-1 bei RT-PCR-

Untersuchungen detektiert. Für ungefähr ein Drittel aller Tumore wurden individuelle

Expressionsmuster berichtet (Vaughan et al. 2004; Bolli et al. 2005). Auch andere CTA wie

beispielsweise MAGE-Antigene werden mit NY-ESO-1 koexprimiert (Bolli et al. 2005). NY-

ESO-1 und LAGE-1 sind in vielen Neoplasien z.B. Mamma-, Kolon- und Prostatakarzinom

exprimiert (Lethe et al. 1998). Im MM wurden Expressionen von 24% bis 43% berichtet (Lethe

et al. 1998; Sahin et al. 2000; Prasad et al. 2004; Vaughan et al. 2004). Dies würde die hohe

Reaktivität der MM-Seren, die in dieser Arbeit gemessen wurde, erklären. Die NHL-Gewebe

waren NY-ESO-1- und LAGE-1-negativ (Lethe et al. 1998; Claus et al. 2005). Wie unter 3.2.6

und 4.3.3 beschrieben wurden kaum seropositive CTCL-Patienten identifiziert.

Antikörperantworten wurden bisher oft gegen NY-ESO-1 untersucht, da es ein sehr

immunogenes Antigen ist und das Auftreten von Antikörpern in vielen Neoplasien mit seiner

Expression einhergeht. Höchstwahrscheinlich sind diese Antikörper auch gegen LAGE-1 reaktiv

aufgrund der hohen Proteinhomologie. Im MM und Ovarialkarzinom wurden Antikörper in 5% -

15% aller Patienten gemessen (Stockert et al. 1998; van Rhee et al. 2005). In fortgeschrittenem

MM wurden bei ca. 50% der Patienten mit NY-ESO-1-positiven Tumoren Antikörper gegen

NY-ESO-1 detektiert (Jager et al. 2000b). Fünfzehn von 42 Seren (35,7%) von Patienten mit

sporadischem Schilddrüsenkarzinom waren NY-ESO-1-positiv (Maio et al. 2003). Die hohe

Immunogenität von NY-ESO-1 wird durch eine häufig simultane Antwort des humoralen und

zellulären Immunsystems bestätigt. In einem MM-Patienten wurden Antikörper gegen NY-ESO-

1 gemeinsam mit HLA-A2/NY-ESO-1-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) im

Blut nachgewiesen (Jager et al. 1998). Dieses parallele Auftreten von Antikörpern und CTL traf

ebenfalls auf zehn von 36 Patienten mit fortgeschrittenen Krebserkrankungen zu. Kein Patient

mit NY-ESO-1-negativem Tumor wies Antikörper auf (Jager et al. 2000b). In einer weiteren

Studie wurde nachgewiesen, dass NY-ESO-1 Antikörper auf der Anwesenheit von NY-ESO-1-

exprimierenden Tumoren und dem Verlauf der Erkrankung in Abhängigkeit von NY-ESO-1

basieren (Jager et al. 1999). Für NY-ESO-1/LAGE-1 sind mittlerweile eine Vielzahl von

Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) I präsentierten CD8+ Epitopen, HLA-A2 (Jager et al.

1998) oder HLA-A31 (Wang et al. 1998) präsentiert, bekannt. CD4+ T-Zellepitope sind

DISKUSSION 167

ebenfalls identifiziert worden (Zeng et al. 2000; Mandic et al. 2003). Aufgrund der CTA

Expression und Immunogenität von NY-ESO-1/LAGE-1 wurden bereits einige Immuntherapien

unter Verwendung von NY-ESO-1 durchgeführt. In den ersten Studien wurden HLA-A2-

spezifische NY-ESO-1-Epitope in Verbindung mit Adjuvantien intradermal injiziert, und CD8+

T-Zellantworten konnten nachgewiesen werden (Jager et al. 2000a; Chen et al. 2005). Volle

Länge NY-ESO-1 Protein wurde in Verbindung mit dem Adjuvans ISCOMatrixTM in klinischen

Studien eingesetzt (Davis et al. 2004). Da komplexe Immunantworten mit Antikörperbildung

und CD8+ und CD4+ T-Zellantworten nachgewiesen wurden, befinden sich die Studien

zwischenzeitlich in Phase II. Somit stellt NY-ESO-1/LAGE-1 ein aussichtsreiches Antigen für

Immuntherapien in Krebspatienten dar.

Im Zuge der Untersuchung von MM-Patienten konnten Serumverläufe von acht MM-Patienten

mittels Multiplex-Serologie getestet werden. Von den Patienten lagen jeweils zwei bis drei

aufeinander folgende Serumproben vor, so dass Zeiträume von bis zu 171 Wochen untersucht

werden konnten. Wie bereits im Kollektiv analysiert, traten Antikörperantworten über Cut-off

auch in den Serumverläufen weniger häufig auf. Einzig die Antigene LAGE-1a, se57-1, cTAGE-

5a N-terminal und p16 hatten Antikörperantworten in den acht untersuchten Patienten

hervorgerufen. Relativ hohe MFI-Werte, jedoch unter Cut-off, wurden ebenfalls für cTAGE-5a

C-terminal identifiziert. Nur für Patient #M3 wurde eine Serokonversion gemessen. Die

Antikörper gegen LAGE-1a stiegen von 0 auf über 13000 MFI signifikant an. Dieser enorme

Antikörperanstieg korrelierte mit dem Krankheitsbild des Patienten, der im Zeitraum von 98

Wochen von Stadium I nach Stadium IV fortschritt. Dieser Patient stellt ein ausgezeichnetes

Beispiel einer erhöhten Tumorlast im Zuge der Krankheitsverschlechterung dar. In diesem

Zusammenhang wäre es sicherlich interessant gewesen, den Tumor hinsichtlich LAGE-1a zu

charakterisieren. Leider lag dieses Material nicht vor. Mit Ausnahme von MAGE-A9, für

welches der Antikörpertiter von 5 auf 139 MFI zunahm, wiesen andere Antigene keine

Antikörperanstiege auf. Für zwei weitere Patienten konnten Antikörperantworten gemessen

werden. Patient #M2, Stadium IV, besaß gleichbleibende Antikörper gegen se57-1 genauso wie

Patient #M6, Stadium III, gegen p16. Somit wird auch bei der Untersuchung von

Serumverläufen deutlich, dass Patienten individuelle Antikörperantworten besitzen und diese

nicht generell mit dem Stadium korrelieren. Einzig LAGE-1a bildete in diesem Punkt eine

Ausnahme für einen Patienten. Jedoch ist ersichtlich, dass vorhandene Antikörperantworten über

lange Zeiträume hinweg stabil bleiben können. Deutlich wurde ebenfalls, dass virale Antigene

eine bedeutend höhere Antikörperantwort, gemessen in MFI-Werten, von bis zu annähernd

20000 MFI erzeugen können. Dies ist eindeutig auf die hohe Immunogenität dieser Antigene, die

DISKUSSION 168

dem Körper fremd sind, zurückzuführen. Für einen optimalen Vergleich mit

Serumantikörperverläufen von gesunden Personen wären Multiplex-Untersuchungen an Seren

von gesunden Personen über ähnliche Zeiträume wie die der MM-Patienten angeraten.

4.3.3 Humorale Immunantworten von CTCL-Patienten

Entsprechend der Untersuchung der humoralen Immunantwort von MM-Patienten wurde die

Häufigkeit von Antikörperantworten in 144 CTCL-Patienten mittels Multiplex-Serologie an dem

in dieser Arbeit verwendeten Antigenpanel untersucht.

Ähnliche Aussagen wie für das MM-Kollektiv trafen auch für das CTCL-Kollektiv zu.

Serumantikörperreaktionen gegen die verwendeten CTA, TAA und Tumorsuppressorgene waren

im CTCL-Kollektiv nur sporadisch vorhanden und lagen zumeist unter 10%. Die höchsten,

gemessenen MFI-Werte in CTCL-Patienten wurden vor allem in Stadium I für die Antigene

MAGE-A1, A3, LAGE-1a, CAMEL und cTAGE-5a N-terminal sowie in Stadium IV für die

Antigene MAGE-A9, GAGE-7b und p53 gemessen. Somit erzeugten wiederum die CTA hohe

MFI-Werte. Einschränkend muss jedoch erwähnt werden, dass die Stadiengruppengröße

unterschiedlich und gerade für Stadium II bis IV sehr klein war (n=14-16). Gleichzeitiges

Auftreten von Antikörpern gegen mehrere Antigene in einem Patienten wurde in den CTCL-

Patienten für höchstens vier CTA nachgewiesen. Die MFI-Werte lagen deutlich unterhalb von

10000 MFI. Nur für jeweils einen Patienten in Stadium I (12172 MFI, LAGE-1a) und Stadium

IV (12361 MFI, p53) wurden hohe MFI-Werte gemessen. Diese Ergebnisse weisen auf die

höhere Immunogenität des MM hin. Schließlich konnte im CTCL-Kollektiv kein Antigen

identifiziert werden, welches stadienabhängig Serumantikörper in Patienten induziert.

Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Patienten- und Kontroll-Kollektiv wurde

einzig für das Antigen MAGE-A9 berechnet. Patienten in Stadium IV besaßen statistisch

signifikant häufiger Antikörper gegen MAGE-A9 (25%) gegenüber den Ctrl (2%). Allerdings

waren Patienten der Stadien I bis III seronegativ für MAGE-A9. Deshalb wäre MAGE-A9 wohl

primär für prognostische jedoch weniger für diagnostische Untersuchungen geeignet. Für

MAGE-A1 konnte ein Trend zu statistisch signifikant erhöhten Antikörper-Häufigkeiten in

CTCL-Patienten des Stadiums III (28,6%) gegenüber Ctrl (6%) nachgewiesen werden. Für alle

anderen Antigene ließen sich keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Ctrl und

Patienten ermitteln. Interessant ist, dass LAGE-1a ausschließlich in MM-Patienten starke und

stadienabhängige Antikörperreaktionen hervorrief. Nur knapp 5% der CTCL-Patienten waren

LAGE-1a-seropositiv. LAGE-1a-seropositive Patienten beschränkten sich auf Stadium I. Da nur

DISKUSSION 169

die MAGE-Antigene statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich von CTCL-Patienten und

Ctrl aufwiesen, soll diese Antigengruppe im Folgenden näher beschrieben werden.

Die MAGE-Antigenfamilie stellt eine der größten CTA-Gruppen des X Chromosoms dar, zu

welcher die MAGE-A, B und C Antigene zählen. Die biologische Funktion der MAGE-Antigene

ist noch weitgehend unbekannt. Einige Studien weisen jedoch auf eine regulatorische Rolle hin

(Nagao et al. 2003; Laduron et al. 2004). Mittlerweile sind 12 Mitglieder der MAGE-A-Familie

bekannt, die hinsichtlich ihrer Expression in den verschiedensten Tumorentitäten untersucht

wurden (De Plaen et al. 1994). Diese Daten beschränken sich jedoch vor allem auf MAGE-A1,

A3, A4, A6, A10 und A12. In einer Studie von Akcakanat et al. in Patienten mit

Speiseröhrenkrebs wurde die Proteinexpression von MAGE-A-Antigenen (A1, A2, A3, A4, A6,

A10 und A12) in 52% (111/213) aller Patienten gemessen (Akcakanat et al. 2006). In kutanen

MM war MAGE-A3 bis zu 65% exprimiert (De Plaen et al. 1994). Eine hohe Expression von

MAGE-A1 von 80% wurde in Leberkarzinomen beschrieben (Yamashita et al. 1996),

wohingegen myelomonozytische Leukämien MAGE-A-negativ waren (Chambost et al. 1993). In

nicht-kleinzelligem Lungenkrebs wurde in ungefähr 45% der Patienten eine Genexpression von

MAGE-A1 oder A3 gemessen (Gure et al. 2005). Des Weiteren wurden NY-ESO-1 und MAGE-

A3 als Marker für eine schlechte Prognose in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs identifiziert

(Gure et al. 2005). Untersuchungen von Antikörperantworten gegen die MAGE-Antigene sind

bisher eher selten durchgeführt worden. Antikörperantworten gegen NY-ESO-1, MAGE-A1, A3

und einige andere CTA wurden mittels ELISA an Seren von Sarkompatienten getestet. Zwei von

54 Patienten (4%) wiesen Antikörper gegen NY-ESO-1 auf. Antikörper gegen andere CTA

wurden nicht nachgewiesen (Lee et al. 2003). Diese Untersuchungen bestätigen wiederum, die in

dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse sowie Studien von Stockert et al. (Stockert et al. 1998).

Schließlich wurde insbesondere MAGE-A3 häufig in klinischen Vakzinierungsstudien

eingesetzt. Eine Verbesserung des klinischen Krankheitsbildes wurde häufig nur in einem

kleinen Prozentsatz der Patienten nachgwiesen (10%) (Marchand et al. 1999; Thurner et al.

1999). In einer Phase I/II Studie, die ein rekombinantes MAGE-A3 Fusionsprotein mit

Lipoprotein D von H. influenzae verwendete, wurden anti-MAGE-A3 CD4+ T-Lymphozyten in

einem von fünf MM-Patienten, die eine klinische Antwort auf die Therapie aufwiesen, detektiert

(Kruit et al. 2005). Antikörper gegen MAGE-A3 wurden nur in einem von 24 MM-Patienten

nach der Vakzinierung und in keinem von 26 MM-Patienten vor der Vakzinierung gemessen

(Kruit et al. 2005). Hoon et al. immunisierten MM-Patienten mit einer MAGE-A1

exprimierenden Melanomzell-Vakzine. Antikörperantworten gegen MAGE-A1 wurden mittels

eines ELISA überwacht. IgG Antikörperantworten von 57% der 53 immunisierten MM-Patienten

DISKUSSION 170

nahmen signifikant zu (Hoon et al. 1995). Spontane Immunantworten gegen MAGE-A3

vermittelt durch CTL sind mit ca. 5% sehr selten in MM-Patienten (Hanagiri et al. 2006).

Serumverläufe konnten ebenfalls für CTCL-Patienten mittels Multiplex-Serologie untersucht

werden. Hierbei wurden Serumantikörperantworten von zwölf Patienten über bis zu 398 Wochen

analysiert. Auch in diesen Patienten waren Antikörperantworten individuell und eher selten.

Serokonversionen traten wie bereits im Kollektiv der MM-Patienten eher selten auf. Die

Antigene MAGE-A1, A3, LAGE-1a, cTAGE-5a C-terminal und p53 hatten Antikörper in vier

(#C2, #C3, #C8 und #C10) der zwölf Patienten induziert. Serokonversionen wurden für diese

vier Patienten gemessen, wobei leider für drei der vier Patienten entweder das Stadium zu

Beginn oder am Ende des Abnahmezeitraumes nicht vorlag. Patient #C2 war über fast 290

Wochen seropositiv für MAGE-A1 und wies eine positive Serokonversion für MAGE-A3 auf

(272 auf 859 MFI). Patient #C8 war seropositiv für MAGE-A1 und über 147 Wochen wurde

eine negative Serokonversion für LAGE-1a (5700 auf 2325 MFI) gemessen. Eine eindeutige

Korrelation von Antikörperantwort und Krankheitsstadium konnte für Patient #C10 berichtet

werden. Über einen Zeitraum von 200 Wochen nahmen die Antikörper gegen cTAGE-5a C-

terminal signifikant zu (1159 auf 2773 MFI), und das klinische Bild des Patienten

verschlechterte sich von Stadium Ib nach IIIc. Eine Untersuchung des Tumors hinsichtlich

cTAGE-5a Expression wäre nützlich gewesen, um die Tumorlast und Antigenexpression mit

dem Krankheitsverlauf optimal korrelieren zu können. Auch hier lag das entsprechende Material

leider nicht vor. In zukünftigen Untersuchungen ist es angeraten, Antigenexpression und

Antikörperantwort parallel zu testen sowie Serumverläufe mit mehr Serumabnahmen in

Patienten inklusive aller Patienteninformationen und Serumverläufe von Ctrl zu testen. Die

signifikanteste positive Serokonversion wurde für Patient #C3 gegen p53 (137 auf 12361 MFI)

in einem Zeitraum von einem Jahr gemessen. Der Patient befand sich am Ende des

Abnahmezeitraumes in Stadium IVc. Im Folgenden soll das Antigen p53 noch etwas näher mit

Fokus auf humorale Immunantworten beschrieben werden.

Das Protein p53 wird durch das Gen TP53 kodiert. Dieses Tumorsuppressorgen, das seit Jahren

im Fokus der Krebsforschung steht, ist ein nukleäres Phosphoprotein. Es spielt eine

entscheidende Rolle in der Zellzykluskontrolle zur Erhaltung der Integrität des Genoms und

Erkennung sowie Beseitigung von DNA-Schäden. Unter normalen Bedingungen ist der

Transkriptionsfaktor p53 nicht aktiv. Beim Auftreten eines DNA-Schadens oder anderer

onkogener Stresssignale wird p53 mittels Checkpoint-Kinasen und DNA-abhängiger

Proteinkinase phosphoryliert und damit aktiviert. Die Zelle wird entsprechend in G1 oder G2 zur

DNA-Reparatur arretiert. Nach erfolgreicher Reparatur wird der Zellzyklus fortgesetzt; nach

DISKUSSION 171

erfolgloser Reparatur wird in der Zelle die Apoptose eingeleitet. Da bei etwa der Hälfte aller

Tumoren somatische Mutationen des TP53-Gens auftreten, kann mutiertes p53 seine zentrale

Kontrollfunktion nicht erfüllen, so dass es trotz DNA-Schäden zur Teilung und Vermehrung

mutierter Zellen kommt (Vousden und Lu 2002). Aufgrund der Heterogenität der p53

Mutationen sind Antikörperantworten leichter zu evaluieren als T-Zellantworten. Entsprechend

gibt es zahlreiche Studien über immunologische Antworten gegen p53 in den verschiedensten

Tumorentitäten. Antikörperantworten wurden in präoperativen Seren von 255

Kolonkarzinompatienten untersucht. Eine Häufigkeit von 25% wurde hier ermittelt, wobei das

Auftreten von Antikörpern mit schlechter Prognose gerade bei Patienten in frühen Stadien,

korrelierte (Houbiers et al. 1995). Antikörperantworten von ungefähr 30% in

Kolonkarzinompatienten wurden ebenfalls von anderen Gruppen nachgewiesen (Angelopoulou

et al. 1997; Hammel et al. 1997; Hammel et al. 1999). In einer Studie von Shimada et al. wurden

1085 Krebspatienten unterschiedlicher Entitäten auf Antikörper gegen p53 untersucht (Shimada

et al. 2003). 20% aller Patienten hatten Antikörper gebildet. Häufigkeiten von 0% bis 32%

abhängig von der Krebserkrankung wurden gemessen (Hals und Kopf 32%, Speiseröhre 30%,

Kolon 24%, Gebärmutter 23%, Gebärmutterhals 19%, Brust 18%, Prostata 17%, Galle 17%,

Lunge 14%, Blase 12%, Magen 11%, Pankreas 11%, Eierstöcke 7%, Gliom 6%, Leber 0%). In

5% der Kontrollpersonen wurden Antikörper gegen p53 identifiziert. Der Einsatz von

Antikörpern gegen p53 als diagnostisches Werkzeug in Lungen- und Brustkrebs wird durch die

folgenden Studien unterstrichen. Lubin et al. berichteten von zwei starken Rauchern, die eine

Antikörperantwort gegen p53 ohne Anzeichen eines Lungentumors besaßen. Im Folgenden

entwickelten beide Raucher p53-positive Lungenkarzinome, so dass Antikörper gegen p53 in

diesem Zusammenhang als diagnostische Biomarker identifiziert wurden (Lubin et al. 1995).

Allerdings konnte die Verwendung von p53 als diagnostischer und prognostischer Marker bei

Lungenkrebs von Mitsudomi et al. nicht bestätigt werden (Mitsudomi et al. 1998). In einer

Studie von Green et al. wurden Antikörper gegen p53 häufiger in Frauen (11%), die noch keinen

Brustkrebs entwickelt jedoch eine familiäre Brustkrebsvorbelastung hatten, identifiziert als in

Kontrollpersonen (1%) (Green et al. 1994). In Ovarialkarzinomen wurde p53 als prognostischer

Biomarker identifiziert (Goodell et al. 2006). Goodell et al. ermittelten, dass das

Gesamtüberleben signifikant höher für Patienten, die Antikörper gegen p53 gebildet hatten, war

gegenüber Patienten ohne Antikörper gegen p53. Antikörper gegen p53 wurden in 6% der

Patienten in Stadium I und II und in 30% der Patienten in Stadium III und IV gemessen (Goodell

et al. 2006). Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Antikörperantworten gegen p53

mit einer Häufigkeit von zumeist niedriger als 35% in Krebspatienten auftreten. Die in dieser

Arbeit gemessenen Antikörper-Häufigkeiten von 2-3% bei MM- und CTCL-Patienten liegen

DISKUSSION 172

deutlich unter der Antikörper-Häufigkeit von Kolonkarzinom- oder Brustkrebspatienten. Dies

könnte auf das weniger häufige Auftreten von Mutationen im TP53-Gen im MM und CTCL

zurückzuführen sein. Die gemessene Antikörper-Häufigkeit von 3% in Ctrl lässt sich hingegen

gut mit Werten aus der Literatur vergleichen.

4.3.4 Humorale Immunantworten von immunbehandelten CTCL-Patienten

Neben der Untersuchung von Immunantworten in Patientenkollektiven ohne

immunmodulatorische Vorbehandlung wurden Seren von immunbehandelten Patienten mittels

Multiplex-Serologie unter Verwendung aller Antigene getestet. Pro Patient wurden ein Serum

vor der Behandlung und mehrere Seren nach wiederholten Immunisierungen untersucht.

In einer Impfstudie wurden 19 CTCL-Patienten mit einem rekombinanten Adenovirus

immunisiert (Dummer et al. 2004). Die Adenoviridae besitzen ein doppelsträngiges, lineares

Genom und infizieren bevorzugt Epithelzellen des Pharynx, des Dünndarmes sowie die

Konjunktivalzellen. Der in der klinischen Studie unter der Leitung von Prof. Dummer

verwendete rekombinante Adenovirus wurde mittels Klonierungstechnologie verändert. Das

humane IFN-γ-Gen ist in die E1 Region des Adenovirus 5 integriert, so dass E1 und E3 deletiert

sind und der Adenovirusvektor sich nicht unabhängig vermehren kann. Das vom Zytomegalo

Virus (CMV)-Promoter gesteuerte IFN-γ-Gen wird mittels des Adenovirus in die humanen

Zellen transfiziert. An der Injektionsstelle kommt es anschließend zu einer lokalen IFN-γ

Expression. In dieser Impfstudie wurde der IFN-γ-exprimierende Adenovirus direkt in die

Tumorläsion injiziert, um das Zytokinmilieu des Tumors positiv in Richtung einer T-Helferzelle

1 (TH1)-Typ Immunantwort zu beeinflussen.

In einer zweiten Impfstudie wurden fünf CTCL-Patienten mit dem handelsüblichen

Masernimpfstoff behandelt (Heinzerling et al. 2005). Das Masernvirus zählt zu den

Paramyxoviridae und besitzt einzelsträngige RNA in Negativorientierung. Es infiziert

Makrophagen, Endothelzellen, Mono- und Lymphozyten. Im Verlauf der akuten Erkrankung

eliminieren vor allem CTL virusinfizierte Zellen. Zudem werden virusspezifische CD4+ T-

Zellen vom TH2 Typ aktiviert. Diese sezernieren Zytokine, die Makrophagen und zusätzliche T-

Zellen aktivieren und die Proliferation von B-Zellen induzieren. Der Masernimpfstoff stellt einen

attenuierten Lebendimpfstoff dar, der vor allem CD4+ T-Zellen vom TH2-Typ aktiviert (Bedford

2003). Da das CTCL vorwiegend auf der Proliferation von TH2-Zellen beruht, besteht das Ziel

dieser Immunisierungsstrategie in einer Virus-induzierten anti-Tumor Immunantwort.

DISKUSSION 173

Bei der Betrachtung der Antikörperantworten in beiden Immuntherapiestudien ist festzustellen,

dass unter Verwendung der bestimmten Cut-off-Werte sowohl bei den Patienten in der

Adenovirusstudie als auch der Masernimpfstoffstudie ungefähr die Hälfte aller untersuchter

Patienten keine Antikörper gegen die humanen Antigene aufwies. In der Adenovirusstudie traf

dies für elf von 19 und in der Masernimpfstoffstudie für zwei von fünf Patienten zu. Insgesamt

wurden hauptsächlich stabile Antikörperantworten über die Zeit gemessen. Sieben Patienten der

Adenovirusstudie und drei Patienten der Masernimpfstoffstudie besaßen Antikörper gegen

verschiedene Antigene vor und während der Studie. Antikörperantworten traten gegen alle

humanen Antigene mit der Ausnahme von se70-2, se57-1 und p16 auf (siehe Tabelle 3-5 und

Tabelle 3-6).

Einzig für Patient #008 der Adenovirusstudie wurde eine Serokonversion anchgewiesen. Die

Antikörper gegen p53 stiegen von 30 über 1539 bis auf 798 MFI an. Das klinische Bild dieses

Patienten war durch eine partielle Regression gekennzeichnet. Für die drei Patienten #002, #006

und #009 wurde keine Serokonversion detektiert. Eine vollständige Regression wurde für diese

drei Patienten nachgewiesen. Hingegen wurden gleichbleibende Antikörpertiter gegen GAGE-

7b für Patient #006 und #009 gemessen. Während der Erstellung dieser Arbeit waren nur für

neun der 19 Patienten klinische Daten erhältlich. Mit dieser begrenzten Information konnte kein

einheitlicher Effekt der adenoviralen Immuntherapie auf die humorale Immunantwort der

Patienten der Adenovirusstudie erkannt werden. Dies bedeutet, dass die erhaltenen Ergebnisse

wenig Aufschluss über systemische Effekte der Immunisierung geben. Ähnlich verhielt es sich

ebenfalls für die Patienten der Masernimpfstoffstudie, für welche keine Serokonversion

festgestellt wurde. Einzig Patient #0002 wies eine eindeutige Tendenz zum Anstieg

verschiedener Serumantikörper auf. Die Antikörper gegen cTAGE-5a N-terminal (84 auf 408

MFI), CAMEL (1889 auf 2400 MFI) und GBP-5ta (1408 auf 1759 MFI) stiegen teilweise stark

an. Jedoch lagen die Zunahmen entweder unterhalb des Cut-off-Wertes oder waren geringer als

eine Verdopplung des MFI-Wertes. Trotz der nicht-Signifikanz dieser gemessenen

Antikörperanstiege korreliert der beschriebene Trend mit dem Krankheitsverlauf des Patienten.

Einzig dieser Patient hatte eine komplette Regression des mit dem Masernimpfstoff behandelten

Plaques sowie ein Ansprechen einer weiteren Läsion, die im Anschluss an die Remission des

ersten Plaques behandelt wurde. Für die vier anderen Patienten der Masernimpfstoffstudie wurde

eine partielle Regression (#0001, #0003 und #0005) des behandelten Plaques oder nur ein

geringes Ansprechen (#0004) beschrieben.

Für eine zuverlässige und statistisch auswertbare Beurteilung der Antikörperantworten der

untersuchten immunbehandelten CTCL-Patienten müsste eine größere Anzahl an Seren und

DISKUSSION 174

Antigenen getestet werden. Jedoch ist es möglich, dass die Antikörperantwort keine Aussage

über den immunmodulierenden Effekt zulässt, sondern die Immunantwort nur auf Ebene der

CD8+ und/oder der CD4+ T-Zellen nachweisbar ist.

4.3.5 Vergleich von Multiplex-Serologie und SADA/SEREX

Beim Vergleich der Ergebnisse für die humanen Antigene in der Multiplex-Serologie, im SADA

und im SEREX (Tabelle 4-1) unterscheidet sich insbesondere die SEREX-Analyse gegenüber

den Analysen mittels Multiplex-Serologie und SADA. Jedoch ist der Vergleich über alle

Methoden und alle drei Kollektive nur für das Antigen cTAGE-5a möglich. Für alle anderen

Antigene wurden nicht alle Methoden an allen Kollektiven durchgeführt. Die Antigene MAGE-

A1, LAGE-1a, CAMEL, se70-2, p53 und p16 wurden nicht im SADA eingesetzt. Im SEREX

wurden die Antigene CAMEL, p53 und p16 nicht und die Antigene MAGE-A1, A3, A9, LAGE-

1a, GAGE-7b, se70-2, se57-1 und GBP-5ta nur an ein bis zwei Patientenkollektiven untersucht.

Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, dass SEREX eine aufwendige Methode ist und gerade

für die CTA das Kontroll-Kollektiv häufig nicht untersucht wurde aufgrund der ausschließlichen

Expression der CTA in der immunprivilegierten Testis. Es ist kein Vergleich der drei Methoden

für die Antigene CAMEL, p53 und p16 möglich. Einschränkend muss zudem erwähnt werden,

dass der im SADA und SEREX verwendete GAGE-t Phagenklon eine verkürzte Variante des

Gens GAGE-3 ist. Da jedoch GAGE-3 bis –7b für dasselbe Protein kodieren, sollten

Antikörperantworten gegen diese Proteine ähnlich sein.

Während in der Multiplex-Serologie 0 - 6% der Kontrollseren (n = 100) und im SADA 0 – 2%

(MAGE-A3, A9, GAGE-7b, se57-1, GBP-5ta, cTAGE-5a, n = 100) positiv waren, reagierte im

SEREX kein Kontrollserum (n = 5 – 14) gegen die im SEREX untersuchten Antigene se70-2,

se57-1, GBP-5ta und cTAGE-5a. Das heißt, dass alle im SEREX an Kontrollseren untersuchten

Antigene serologisch tumorspezifisch waren, dies jedoch nicht in den Analysen mittels

Multiplex-Serologie und SADA bestätigt werden konnte.

Im SADA wurden in keinem Kollektiv Antikörper gegen cTAGE-5a gemessen. Hingegen

wurden im SEREX Antikörper in 15% der CTCL-Patienten (n = 20) identifiziert. Keine

Antikörper gegen cTAGE-5a wurden im SEREX gegen MM-Patienten (n = 15) und Ctrl (n = 14)

detektiert. Mittels Multiplex-Serologie wurden Antikörper-Häufigkeiten zwischen 0,5 und 2,8%

gegen cTAGE-5a in Ctrl, MM- und CTCL-Patienten gemessen, die jedoch bedeutend geringer

sind als im SEREX. Ein entscheidender Unterschied könnte die Größe der Kollektive sein und

die Unterschiedlichkeit der Blutspender in den Kollektiven, die jeweils für SADA, SEREX und

Multiplex-Serologie verwendet wurden.

DISKUSSION 175

Im Vergleich der Antikörperantworten gegen die CTA ergaben sich insbesondere im Vergleich

von SEREX und Multiplex-Serologie deutliche Unterschiede. 27% der MM-Patienten besaßen

laut SEREX Antikörper gegen MAGE-A1, hingegen nur 7,3% laut Multiplex-Serologie.

Deutliche Unterschiede im Vergleich der Antikörperantworten im MM-Kollektiv ergaben sich

ebenfalls für die CTA MAGE-A3 (SEREX: 27%, Multiplex: 8,4%, SADA: 0%), MAGE-A9

(SEREX: 20%, Multiplex: 4,2%, SADA: 0%) und se57-1 (SADA: 11%, Multiplex: 3,7%).

Vergleichbare Antikörperantworten wurden im MM-Kollektiv für die Antigene LAGE-1a

(SEREX: 13%, Multiplex: 13,6%) und GAGE-7b (SADA: 6%, Multiplex: 5,8%) nachgewiesen.

Ähnliche Antikörperantworten gegen MAGE-A1 wurden für CTCL-Patienten im SEREX mit

6% und in der Multiplex-Serologie mit 10,4% bestimmt. Ebenfalls vergleichbare Ergebnisse

wurden für MAGE-A3 (SEREX: 6%, SADA: 8%, Multiplex: 4,9%) und LAGE-1a (SEREX:

0%, Multiplex: 4,9%) im CTCL-Kollektiv gemessen. Unterschiede bei der Betrachtung des

CTCL-Kollektivs waren für die Antigene MAGE-A9 (SEREX: 22%, SADA: 4%, Multiplex:

4,9%), GAGE-7b (SEREX: 16%, SADA: 3%, Multiplex: 2,8%), se70-2 (SEREX: 16%,

Multiplex: 0,7%) und se57-1 (SEREX: 33%, SADA: 5%, Multiplex: 0,7%) ersichtlich.

Große Unterschiede in der Antikörperantwort je Methode wurden für das Antigen GBP-5ta

getestet. Während im SADA 28% der MM-Patienten Antikörper aufwiesen, waren in der

Multiplex-Serologie nur 3,1% der MM-Patienten Antikörper-positiv. CTCL-Patienten hatten laut

SEREX sogar zu 56% Antikörper gegen GBP-5ta gebildet, wohingegen im SADA nur 5% und in

der Multiplex-Serologie nur 3,5% der CTCL-Patienten Antikörper besaßen.

DISKUSSION 176

Tabelle 4-1 Vergleich der Seroreaktivitäten von Ctrl, MM- und CTCL-Patienten in

der Multiplex-Serologie, im SADA und SEREX

Die Tabelle stellt die Ergebnisse der serologischen Untersuchungen mittels Multiplex-Serologie (Multi), SADA (Serumantikörper-Detektionsarray) und sekundärem „serological analysis of recombinantly expressed cDNA clones“ (SEREX) mit allen humanen Antigenen dar, die in dieser Arbeit verwendet wurden (Eichmuller et al. 2001; Fellenberg et al. 2004). Untersucht wurden Seren von kutanes T-Zell Lymphom (CTCL)-, malignes Melanom (MM)-Patienten und Kontrollen (Ctrl). *Im SADA und SEREX wurde nur ein Klon für cTAGE-5a verwendet. Aufgrund der Proteingröße musste dieser Klon in zwei Teilen kloniert werden, so dass in der Multiplex-Serologie zwei Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsproteine eingesetzt wurden. n: Anzahl, n.g.: nicht getestet.

% Positive (n)

Methode Multi SADA SEREX Multi SADA SEREX Multi SADA SEREX

Tumorantigen MAGE-A1 MAGE-A3 MAGE-A9

Kontrollseren 6,0

(100)

n.g.

n.g. 5,0

(100) 1

(100)

n.g. 2,0

(100) 0

(100)

n.g.

MM-Seren 7,3

(191)

n.g. 27

(15) 8,4

(191) 0

(18) 27

(15) 4,2

(191) 0

(18) 20

(15)

CTCL-Seren 10,4 (144)

n.g.

6 (18)

4,9 (144)

8 (100)

6 (18)

4,9 (144)

4 (100)

22 (18)

Tumorantigen LAGE-1a GAGE-7b CAMEL

Kontrollseren 3,0

(100)

n.g.

n.g. 1,0

(100) 1

(100)

n.g. 0,0

(100)

n.g.

n.g.

MM-Seren 13,6 (191)

n.g.

13 (15)

5,8 (191)

6 (18)

n.g.

1,0 (191)

n.g.

n.g.

CTCL-Seren 4,9

(144)

n.g. 0

(19) 2,8

(144) 3

(100) 16

(19) 2,8

(144)

n.g.

n.g.

Tumorantigen se70-2 se57-1 GBP-5ta

Kontrollseren 3,0

(100)

n.g. 0

(14) 1,0

(100) 2

(100) 0

(5) 3,0

(100) 0

(100) 0

(14)

MM-Seren 0,0

(191)

n.g.

n.g. 3,7

(191) 11

(18)

n.g. 3,1

(191) 28

(18)

n.g.

CTCL-Seren 0,7

(144)

n.g. 16

(19) 0,7

(144) 5

(100) 33 (9)

3,5 (144)

5 (100)

56 (16)

Tumorantigen cTAGE-5a N-terminal* cTAGE-5a C-terminal* p53

Kontrollseren 2,0

(100) 0

(100) 0

(14) 2,0

(100) 0

(100) 0

(14) 3,0

(100)

n.g.

n.g.

MM-Seren 2,6

(191) 0

(18) 0

(15) 0,5

(191) 0

(18) 0

(15) 2,1

(191)

n.g.

n.g.

CTCL-Seren 2,8

(144) 0

(100) 15

(20) 0,7

(144) 0

(100) 15

(20) 2,1

(144)

n.g.

n.g.

Tumorantigen p16

Kontrollseren 2,0

(100)

n.g.

n.g.

MM-Seren 2,1

(191)

n.g.

n.g.

CTCL-Seren 0,0

(144)

n.g.

n.g.

DISKUSSION 177

Um die dargestellten Unterschiede zwischen den Multiplex-Serologie-, SADA- und SEREX-

Ergebnissen erklären zu können, werden nachfolgend die Komponenten „Protein“, „Serum“ und

„Auswertung“ der Methoden miteinander verglichen. Mögliche Unterschiede zwischen SADA

und SEREX wurden bereits unter 4.2.4 diskutiert.

Im SEREX und SADA liegt die kodierende Region zusammen mit der „untranslated region“

(UTR) des Antigens im pBluescript-Vektor vor. Die genaue Translation der Proteine ist

unbekannt. Es ist somit möglich, dass neben dem „open reading frame“ (ORF) auch kleine

Proteinfragmente der UTR translatiert werden können, die immunogen sind. Für die Multiplex-

Serologie wurde die kodierende Sequenz im Leseraster in den Expressionsvektor pGEX-4T-3tag

kloniert. Laut Western Blot Analyse wurde ein definiertes Protein exprimiert. Dieses Protein ist

N-terminal durch das 26 kilo Dalton (kDa) große GST-Protein verlängert. Eventuell könnten

immunogene Epitope durch das GST-Fusionsprotein sterisch behindert werden. Dies könnte

gerade für kleine Proteine (< 20 kDa) zutreffen. Ein weiterer möglicher Grund für die höheren

Reaktivitäten im SEREX im Vergleich zur Multiplex-Serologie, könnte in der Nativität des

Proteins liegen. Während das Antigen im SEREX nativ vorliegt, ist das Antigen in der

Multiplex-Serologie durch den Bakterienaufschluß in der French Press hohen Scherkräften

ausgesetzt, die Einfluss auf die Konformation des Proteins haben könnten. Zudem unterscheidet

sich die Art der Blockierung von unspezifischen Bindungen. Im SEREX/SADA wird die

geblottete Membran mit einer Milchpulverlösung inkubiert, damit unspezifische Bindungsstellen

abgesättigt werden. In der Multiplex-Serologie hingegen, wird dem Seruminkubationspuffer eine

Mischung aus Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Superchemiclock zugesetzt. Dadurch

könnte ein Unterschied im Zustand des Antigens im SEREX/SADA gegenüber der Multiplex-

Serologie bedingt sein.

Im SEREX/SADA sind die Seren 1:100 verdünnt und aufwendig gegen E. coli- und

Phagenproteine präabsorbiert. In der Multiplex-Serologie werden die Seren in der Verdünnung

1:50 eingesetzt und 1h mit 2mg/mL E. coli-Lysat bei Raumtemperatur (Rt) deutlich kürzer

präabsorbiert. Beim Vergleich der verwendeten Seren lässt sich feststellen, dass im SEREX

meist Seren aus späteren Krankheitsstadien untersucht wurden, die meist höhere Antikörpertiter

besitzen (Talpur et al. 2002). Sowohl in der Multiplex-Serologie als auch im SADA wurde

hingegen eine wesentlich größere Anzahl an zufällig zusammengestellten Seren aus allen

Krankheitsstadien und Altersgruppen getestet, welches die geringere Anzahl an positiven Seren

erklären könnte (Abendstein et al. 2000).

Unterschiede in der Auswertung bestehen zwischen SEREX/SADA und Multiplex-Serologie.

Die SEREX/SADA-Analyse erfolgt visuell durch den Vergleich positiver und negativer Plaques

DISKUSSION 178

auf der jeweiligen Membran. Die Ergebnisermittlung in der Multiplex-Serologie findet im

Luminex-Gerät objektiv unter Verwendung des Reporter-Lasers statt. Der Antigen-spezifische

Cut-off-Wert entscheidet über die Positivität eines Serums (siehe 2.6.5.6). Die visuelle Analyse

bei SEREX/SADA birgt mehr Fehlerquellen in sich durch die subjektive Sichtweise des

Bearbeiters (Verhältnis der positiven zu den negativen Plaques, ungleiche Entwicklung etc.) als

die Cut-off-Bewertung. Andererseits ist die Festlegung eines Cut-off-Wertes für die untersuchten

Autoantigene ebenfalls diskussionsfähig. Da die Reaktivitäten gegen Autoantigene im Vergleich

zu Reaktivitäten gegen z.B. virale Antigene sehr niedrig sind, ist es fraglich, ob die berechneten

Cut-off-Werte nicht zu hoch gewählt wurden und damit reaktive Seren übersehen werden. Dies

könnte für cTAGE-5a der Fall sein, da hier sehr hohe Cut-off-Werte berechnet und ausgewählt

wurden (1781 und 2564 MFI).

Schließlich stellten Lagarkova et al. die These auf, dass SEREX sensitiver als ein wenn auch

einfacherer und robusterer ELISA (somit letztlich auch Multiplex-Serologie) sei (Lagarkova et

al. 2003). Demnach wäre die SEREX-Methode besser für schwach immunogene Antigene

geeignet, im Gegensatz zum ELISA, der eine ideale Methode für immunogene Antigene

darstellt.

4.3.6 Multiplex-Serologie im Vergleich zu ELISA in der Krebsdiagnostik

Die Multiplex-Serologie kombiniert ein gut etabliertes Proteinantigensystem inklusive in situ

Affinitätsaufreinigung mit einem Hochdurchsatz-Suspensionsarray. Die eindeutigen Vorteile

dieser Methode gegenüber dem konventionellen ELISA sind bedeutend geringerer Zeitaufwand,

weniger Normalisierungsaufwand, Durchführung von großen komplexen seroepidemiologischen

Studien in kurzer Zeit und Serumersparnis. In Studien von Waterboer et al. wurde zudem

nachgewiesen, dass die Multiplex-Serologie für HPV 16 E7 sensitiver war als der GST „capture“

ELISA (Waterboer 2005; Waterboer et al. 2005). In einer Studie von Komatsu et al. wurde das

Luminex-System auf seine Verwendung zur Detektion von Antikörpern gegen Peptide der

Proteine „Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells“ (SART),

Lymphozytenprotein Tyrosinkinase (Lck) und Adenosindiphosphat-Ribosyltransferase (ART)

untersucht (Komatsu et al. 2004). Dieses System soll laut den Autoren bei Vakzinierungsstudien

einsetzbar sein. Eine ähnliche Sensitivität wie bereits vorhandene ELISA-Systeme konnte

ermitelt werden. Auch hier überwiegen die Vorteile der Luminex-Technologie gegenüber dem

ELISA-System. Andere zwischenzeitlich verwendete Ansätze, die jedoch hauptsächlich der

Identifizierung von Antigenen dienen, beinhalten 2D Western Blot Analysen (Le Naour et al.

2001) und Protein Microarrays (Qiu et al. 2004). Hier handelt es sich jedoch um planare

DISKUSSION 179

Systeme, die teilweise sehr aufwändig sind. Anders als Infektionen, bei denen Patienten vor

allem auf ein immundominantes Antigen reagieren, besteht Krebs aus einer Mischung von

verschiedenen Antigenen. Deshalb bilden Krebspatienten zumeist Antikörper gegen

verschiedene Antigene, wobei ein Antigen jedoch nicht in allen Tumoren exprimiert wird. Somit

liegen die meisten Antikörperantworten gegen Selbstantigene um die 15-20%. Entsprechend ist

es äußerst wichtig und interessant in zukünftigen Analysen den Multiplex-Ansatz zu verwenden,

um die Antikörperantworten gegen mehrere Antigene gleichzeitig bestimmen zu können. Dies

erhöht die Sensitivität und Spezifität der Analysen deutlich (Anderson und LaBaer 2005).

Die bislang entwickelten ELISA, die Antikörperantworten gegen Tumorantigene in

Krebspatienten analysierten, wiesen keine hohen Antikörperhäufigkeiten nach. Stockert et al.

untersuchten Antikörper gegen die Tumorantigene NY-ESO-1, MAGE-1, 3, MelanA, Tyrosinase

und SSX in 234 Seren von Krebspatienten und 70 Ctrl (Stockert et al. 1998). NY-ESO-1 bildete

die häufigsten Antikörperantworten mit 9,4% (12/127) der MM-, 12,5% (4/32) der

Ovarialkarzinom-, 4,2% (1/24) der Lungenkrebsseren und 7,7% (2/26) der Seren von

Brustkrebspatienten (Stockert et al. 1998). Kein Patient war seropositiv für MelanA und

Tyrosinase. Drei Patienten besaßen Antikörper gegen MAGE-1, zwei gegen MAGE-3 und einer

gegen SSX2. Damit wurden Reaktivitäten gegen NY-ESO-1 in MM-Patienten signifikant

häufiger nachgewiesen als gegen die MAGE-Antigene, obwohl die Expression der MAGE-

Antigene in MM-Gewebe höher ist. Vergleichbar mit den Multiplex-Serologie Ergebnissen

dieser Arbeit liegen gegen die untersuchten Tumorantigene nur schwache und niedrig frequente

humorale Immunantworten vor. Ähnlich niedrige Antikörperantworten wurden gegen das CTA

OY-TES-1 in epithelialen Ovarialkarzinompatienten (10%) und gegen TA90 (12%) in einer

MM-Patientengruppe gemessen (Litvak et al. 2004; Tammela et al. 2006). Litvak et al.

identifizierten IgM Antikörper gegen TA90 in 12% der MM-Patienten, die nach einer operativen

Tumorentfernung in Stadium Ib und IIa innerhalb von sieben Jahren an Stadium IV Symptomen

starben, und in 62% der MM-Patienten, die innerhalb von 10 Jahren keine Krankheitssymptome

entwickelten (Litvak et al. 2004). IgG Antikörper wurden in 74% beider Patientengruppen

ermittelt. Zhang et al. untersuchten Antikörperantworten in 527 Krebspatienten gegen ein Panel

von sieben Tumorantigenen: c-myc, p53, Cyclin B1, p62, Koc, Insulin-ähnlicher

Wachstumsfaktor 2 mRNA Bindungsprotein 1 (IMP1) und Survivin (Zhang et al. 2003). Die

Antikörper-Häufigkeit gegen einzelne dieser Antigene in den sechs untersuchten Tumorentitäten

(Brust-, Lungen-, Kolon-, Magen-, Prostata- und Leberkrebs) lag zumeist unter 20%. Bei der

Betrachtung des kompletten Antigenpanels erhöhte sich die Antikörperhäufigkeit auf 44-68%.

Des Weiteren besaßen Brust-, Lungen- und Prostatakrebspatienten ein charakteristisches

DISKUSSION 180

Reaktivitätsprofil (Zhang et al. 2003). Höhere Häufigkeiten von Antikörperantworten konnten

gegen die extrazelluläre Proteinkinase A in verschiedenen Tumorentitäten (90%) und in Ctrl

(12%) gemessen werden (Nesterova et al. 2006).

4.3.7 Multiplex-Serologie – Fazit und Ausblick

Aufgrund der erzielten Ergebnisse ist festzuhalten, dass die verwendeten Antigene für die

Multiplex-Serologie zumindest bedingt geeignet sind und eindeutig Antikörperantworten gegen

Autoantigene detektiert werden können. Da die Multiplex-Serologie die Messung von bis zu 100

verschiedenen Antigenen mit einem Serum zulässt, ist eine Eignung für die klinische Routine

generell möglich und empfehlenswert. Die Methode benötigt sehr wenig Serum, lässt sich

innerhalb von ein bis zwei Tagen durchführen und benötigt aufgrund der Messung von 100

Beads pro Antigen und der Mitführung von internen Ctrl keine Wiederholung der Untersuchung.

Dies bedeutet, dass pro Tag 100 Antigene an 1000 Seren gemessen werden können. Die

Festlegung von sinnvollen Cut-off-Werten für Autoantigene ist notwendig.

In dieser Arbeit wurden die Antikörperantworten von MM- und CTCL-Patientenkollektiven

gegenüber Ctrl untersucht. In den MM-Patienten erzeugte einzig LAGE-1a eine eindeutig

stadienabhängige Induktion von Antikörpern in den Patienten, die besonders in Stadium IV

ausgeprägt war. Somit könnte LAGE-1a das erste CTA darstellen, das in der Multiplex-

Serologie als diagnostisches und prognostisches humanes Tumorantigen für MM-Patienten

nützlich sein und in der Klinik Anwendung finden könnte. Für das CTCL-Kollektiv wurde kein

Antigen identifiziert, das stadienabhängig Antikörperantworten hervorruft. Nur CTCL-Patienten

des Stadiums IV besaßen statistisch signifikant häufiger Antikörper gegen MAGE-A9 gegenüber

Ctrl. Die Untersuchung von Serumverläufen in MM- und CTCL-Patienten ergab bei einem MM-

Patienten eine Korrelation von Progression und Zunahme an LAGE-1a Antikörpern sowie bei

einem CTCL-Patienten von Progression und Zunahme an cTAGE5a C-terminal Antikörpern.

Weitere Untersuchungen von Serumverläufen wären in diesem Zusammenhang angebracht. Bei

der Betrachtung der Antikörperantworten in immunstimulierten CTCL-Patienten war

festzustellen, dass kaum Antikörperantworten gegen die untersuchten Antigene gebildet wurden.

Nur in einem Patienten wurde eine Serokonversion für das Antigen p53 identifiziert. Diese

Serokonversion korrelierte mit einer partiellen Regression des Patienten. Im Allgemeinen waren

die Antikörperhäufigkeiten mit zumeist unter 10% eher selten. Nur das CTA CAMEL wies eine

immunologische Tumorspezifität auf. Schließlich erzeugten die verwendeten Tumorantigene

zumeist eindeutig niedrigere Serumantikörper-Häufigkeiten als virale Antigene. Eine Erklärung

DISKUSSION 181

für diese Ergebnisse liegt in der Natur der Antigene selbst, da virale Antigene vom Körper als

fremd, Tumorantigene jedoch als körpereigen angesehen werden.

Die Untersuchungen von Antikörperantworten gegen humane Tumorantigene mittels Multiplex-

Serologie befinden sich noch in den Anfängen. In Zukunft sollten noch mehr Tumorantigene in

diesem System getestet werden, um ein relevantes und optimales Antigenpanel zusammenstellen

zu können. Nützliche und sinnvolle Folgeanalysen könnten folgende MM- und CTCL-Kollektive

beinhalten: IFN-γ behandelte Patienten, Patienten aus Studien mit verschiedenen

Tumorantigenen z.B. MAGE-Antigene, LAGE-1a und/oder NY-ESO-1, weitere Verläufe von

Patienten sowie Verläufe von Ctrl als Vergleich und Patienten nach einer operativen Entfernung

des Tumors mit und ohne Rezidiv in Verbindung mit der Untersuchung der Antigenexpression

im Tumor.

4.4 Das Cancer Testis Antigen GAGE-7b

Eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Entwicklung von Antigen-spezifischen

Tumortherapien ist eine eingehende Charakterisierung der verwendeten Antigene und ihrer

Funktion. Spezifische Funktionen konnten bisher nur wenigen Tumorantigenen zugeordnet

werden wie z.B. SCP-1 (Meuwissen et al. 1997) und OY-TES-1 (Baba et al. 1994).

Die CTA stellen eine wichtige Gruppe an Antigenen dar, die vom Immunsystem auf Krebszellen

erkannt werden können. Zu den CTA zählt unter anderem die Familie der GAGE-Antigene, die

wie viele der CTA auf dem X-Chromosom lokalisiert sind. Die GAGE-Gene wurden in den 90er

Jahren identifiziert (Van den Eynde et al. 1995; De Backer et al. 1999). Die GAGE-Familie

bestand ursprünglich aus neun Mitgliedern, die drei Gruppen zugeordnet werden konnten.

Mittlerweile sind 16 Familienmitglieder bekannt (Gjerstorff und Ditzel, 2008). GAGE-2 bis 7,

7b und 8 weisen eine Proteinhomologie von 95% auf, wohingegen GAGE-1 gegenüber den

anderen GAGE-Proteinen eine Homologie von 80% besitzt. HLA-A- und -C-präsentierte

Epitope wurden bereits für GAGE beschrieben (Van den Eynde et al. 1995; De Backer et al.

1999). Nah verwandte Gene zu GAGE sind Prostatakarzinom-assoziiertes Antigen (PAGE) und

XAGE. Beide Antigenfamilien wurden mittels differentieller Expressionsanalysen an einem

Prostatakarzinom Modell, mittels Computeranalysen von Prostata „expressed sequence tags“

(ESTs) und Krebs-assoziierter ESTs identifiziert (Brinkmann et al. 1998; Chen et al. 1998;

Vasmatzis et al. 1998; Brinkmann et al. 1999). Die GAGE-, PAGE- und XAGE-Antigene sind

durch eine Krebs-spezifische Expression gekennzeichnet. Alle Antigene sind nicht auf eine

Tumorentität beschränkt.

DISKUSSION 182

In dieser Arbeit wurde die Expression des Antigens GAGE-7b im MM und CTCL auf

Proteinebene unter Verwendung eines eigens zu diesem Zweck generierten Antikörpers in

Zelllinien und Tumorgewebe näher charakterisiert. Mittels dieser Untersuchungen sollte

schließlich der Wert dieses CTAs für Immuntherapien beim MM und CTCL abgeschätzt werden.

4.4.1 Spezifität des Antikörpers

Drei unterschiedliche Ansätze wurden verwendet, um die Spezifität des GAGE-7b-Antikörpers

zu testen. Durch diese ausführliche und aussagekräftige Analyse des Antikörpers konnte seine

Spezifität zweifelsfrei belegt werden. Anhand der Analyse des Antikörpers mit verschiedenen

Methoden wurde festgestellt, dass der Antikörper sowohl denaturiertes als auch natives und

rekombinantes sowie Wildtyp-Protein erkennt. Antikörperkonzentrationen von 1 – 2µg/mL

wurden eingesetzt.

Zunächst wurde der aufgereinigte Antikörper in einer Konzentration von 1µg/mL im

denaturierenden Western Blot gegen verschiedene GST-Fusionsproteine getestet. Dabei konnte

eine eindeutige Reaktion des Antikörpers gegen das GST-GAGE-7b-tag-, das GAGE-7b-tag-

sowie das verkürzte GAGE-7b-tag-Protein analysiert werden. Allerdings wurde ebenfalls ein

Restgehalt an tag-Antikörpern und Antikörpern gegen E. coli-Proteine wie Hsp70 festgestellt.

Die Anwesenheit dieser Antikörper neben den GAGE-7b-spezifischen Antikörpern ist jedoch

unproblematisch, da der GAGE-7b-Antikörper in Untersuchungen an humanem Material

Anwendung findet. Hier spielen E. coli- und SV40-Virus-Proteine keine Rolle. Neben der

Untersuchung an GST-Fusionsproteinen wurde der Antikörper ebenfalls an einer

Verdünnungsreihe des aufgereinigten GAGE-7b-tag-Proteins im Western Blot getestet. Im

Western Blot betrug die Nachweisgrenze von GAGE-7b-Protein 15ng.

In immunzytologischen Untersuchungen wurde GAGE-7b im Cytosol der Zellen detektiert.

Innerhalb Zellen einer Zelllinie wurde eine heterogene GAGE-7b-Expression nachgewiesen. Da

diese Zelllinien aus Biopsiematerial eines Tumorpatienten stammen, ist das Auftreten von

verschiedenen Zellklonen mit unterschiedlichen Antigenexpressionsmustern möglich. Die

Inkubation von aufgereinigtem GAGE-7b-Antikörper und aufgereinigtem GAGE-7b-tag-Protein

führte zur Bindung von Antigen und Antikörper, wodurch die Färbung einer GAGE-7b-positiven

Zelllinie vollständig verhindert wurde. Dies ist ein eindeutiger Nachweis der Spezifität des

Antikörpers. Zudem reagierte das Präimmunserum des immunisierten Kaninchens bei einer

Verdünnung von 1:100 nicht mit einer GAGE-7b-positiven Zelllinie.

Schließlich konnte die Spezifität des GAGE-7b-Antikörpers ebenfalls in der Multiplex-Serologie

nachgewiesen werden. Der Antikörper (2µg/mL) wurde parallel gegen 17 GST-Fusionsproteine

DISKUSSION 183

getestet. Da in diesen Analysen zusätzlich E. coli- und GST-tag-Antikörper aus dem zu

untersuchenden Material entfernt werden, ist diese Methode vermutlich am aussagekräftigsten

hinsichtlich der Spezifität des GAGE-7b-Antikörpers. Die Reaktion des GAGE-7b-Antikörpers

mit den GST-GAGE-7b-tag-Beads betrug 1597 MFI und ist somit spezifisch für das GAGE-7b-

Antigen. Andere CTA und TAA sowie Tumorsuppressorgene wurden nicht erkannt.

Beim Vergleich der Untersuchungen der GAGE-7b-Expression auf mRNA- und Proteinebene

wurde festgestellt, dass der generierte Antikörper vermutlich zumindest die Antigene GAGE-3

bis 7b erkennt. Dies ist auf die hohe Homologie von über 95% dieser Proteine zurückzuführen.

Deshalb impliziert eine Expression von GAGE-7b auf Proteinebene im folgenden stets die

Expression aller GAGE-Antigene (Bazhin et al. 2007).

4.4.2 Expressionsanalyse von GAGE-7b

Zunächst wurde die Expression des Antigens GAGE-7b auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR in

Kontroll-, CTCL- und MM-Zelllinien sowie MM-Gewebe untersucht. Hierbei ließ die Auswahl

an möglichen Primersequenzen nur eine Unterscheidung zwischen GAGE-1, 2, 8 und GAGE-3

bis 7b zu (De Backer et al. 1999). Wie bereits durch in der Literatur beschriebene

Untersuchungen erwartet, wurde keine Expression von GAGE-Antigenen in den beiden

Kontrollzelllinien (Melanozyten und HaCat) nachgewiesen. Die CTCL-Zelllinien waren

ebenfalls GAGE-negativ. Die GAGE-Expression der MM-Zelllinien und –Gewebe betrug bis zu

82%. GAGE-1, 2 und 8-Expression wurde zu 71% in MM-Zelllinien und zu 38% in MM-

Gewebe gemessen. GAGE-3 bis 7b wurde in 82% der MM-Zelllinien und 50% der MM-Gewebe

nachgewiesen. Ähnlich hohe Expressionen sind bereits in der Literatur beschrieben. Van den

Eynde et al. wiesen GAGE-1 bis 6 in keiner Lymphomzelllinie (n=6), jedoch in 61% der MM-

Zelllinien (n=74), in 13% der primären (n=39) und in 36% der metastasierten MM-Gewebe

nach. GAGE-1 und 2 wurden in 13% der primären und 28% der metastasierten MM-Gewebe

sowie in 54% der MM-Zelllinien (n=74) gemessen (Van den Eynde et al. 1995). De Backer et al.

konnten eine GAGE-1, 2, 8- und/oder GAGE-3 bis 7b-Expression in 42% primärer kutaner MM

(n=79) und 54% metastasierter kutaner MM (n=211) detektieren (De Backer et al. 1999).

Häffner et al. untersuchten die GAGE-Expression in 41 CTCL-Geweben, wobei GAGE-mRNA

lediglich für einen Sézary Syndrom Patienten nachgewiesen werden konnte (Haffner et al. 2002).

Somit ist festzustellen, dass GAGE-Gene häufig in MM-Zelllinien und –Geweben, jedoch eher

selten in CTCL-Zelllinien und –Geweben exprimiert sind. Damit beschränkt sich die Relevanz

von GAGE auf mRNA-Ebene auf das MM.

DISKUSSION 184

Zur Untersuchung der Expression von GAGE-7b auf Proteinebene wurden Western Blot

Analysen unter Verwendung des innerhalb dieser Arbeit generierten monospezifischen

Antikörpers durchgeführt.

Zunächst konnte die CTA-spezifische Expression von GAGE-7b in Testis anhand der

Untersuchung von 15 verschiedenen Kontrollgeweben auch auf Proteinebene bestätigt werden.

Die spezifische Bande für GAGE-7b bei 26kDa wurde ausschließlich im Testisgewebe

detektiert.

Die untersuchten 24 Zelllinien hatten unterschiedliche GAGE-7b-Profile. Die MM-Zelllinien

waren zu mehr als 50% (10/17) GAGE-7b-positiv, wohingegen keine Kontrollzelllinie (HaCat

und Melanozyten) und keine CTCL-Zelllinie (n=5) GAGE-7b-positiv war. Dies unterstreicht die

Ergebnisse auf mRNA-Ebene dahingehend, dass GAGE-7b auch auf Proteinebene für das MM

interessant zu sein scheint, hingegen jedoch keine Rolle im CTCL spielt.

In 22% der untersuchten MM-Tumorgewebe (2/9) wurde GAGE-7b nachgewiesen. Die GAGE-

7b-positiven Tumorgewebe stammen von zwei Patienten, aus deren Tumorgewebe ebenfalls

GAGE-7b-positive Zelllinien etabliert werden konnten. Ein Vergleich der GAGE-7b-Expression

zwischen den Tumorgeweben und zugehörigen Zelllinien war für vier weitere MM-Patienten

möglich. Das Tumorgewebe wie auch die etablierte Zelllinie eines der vier MM-Patienten waren

GAGE-7b-negativ. Weitere zwei MM-Patienten exprimierten GAGE-7b in Tumorgewebe und

Zelllinie auf mRNA-Ebene jedoch nicht auf Proteinebene. Ein letzter Patient war GAGE-7b-

positiv hinsichtlich Expression auf mRNA-Ebene und auf Proteinebene in der Zelllinie und

GAGE-7b-negativ auf Proteinebene im Tumorgewebe. Unterschiede der Expression auf mRNA-

und Proteinebene könnten auf eine fehlende Translation der mRNA zurückzuführen sein.

Unterschiede der Expression zwischen aus Tumorgewebe etablierten Zelllinien und

Tumorgewebe selbst könnten auf die Heterogenität des Tumors zurückzuführen sein. Es ist

durchaus möglich, dass ein Teil des Tumorgewebes CTA-positiv auf Proteinebene ist, ein

anderer Teil des Tumors jedoch nicht.

Immunzytologische Untersuchungen wurden an 22 verschiedenen Zellllinien durchgeführt.

Melanozyten, die als Kontrollzelllinie dienten, waren eindeutig GAGE-7b-negativ. Gerade für

einen Einsatz von GAGE als mögliches Immuntherapeutikum ist diese Tatsache entscheidend,

da keine Normalgewebe in der Haut durch einen Therapieansatz mit der Zielstruktur GAGE

geschädigt würden. Wie bereits in den Untersuchungen mittels Western Blot wurde auch in der

Immunzytologie keine GAGE-7b-positive CTCL-Zelllinie (n=5) identifiziert. Entsprechend

scheint der Einsatz von GAGE als Immuntherapeutikum im CTCL fraglich. Während dieser

DISKUSSION 185

Arbeit standen keine Gewebe von CTCL-Patienten zur Verfügung, um diese Frage eingehender

an Tumormaterial zu evaluieren. Knapp 44% der MM-Zelllinien (7/16) waren GAGE-7b-positiv.

Die GAGE-7b-Expression war zytoplasmatisch lokalisiert und erwies sich als heterogen. Dies

bedeutet, dass sowohl GAGE-7b-positive als auch GAGE-7b-negative Zellklone in einer

immunzytologischen Analyse vorhanden waren. Beispiele hierfür liegen auch in der Literatur

vor (Akcakanat et al. 2006). Alle MM-Zelllinien, die in der Immunzytologie positiv mit dem

Antikörper reagierten, waren ebenfalls im Western Blot positiv. Eine Ausnahme hierzu bildete

die Zelllinie Ma-Mel-12. Diese Zelllinie war GAGE-3 bis 7b-positiv in RT-PCR-

Untersuchungen, negativ in Western Blot Untersuchungen an der Zelllinie und an Tumorgewebe

sowie positiv in immunzytologischen Untersuchungen. Diese unterschiedlichen Ergebnisse

könnten darauf zurückzuführen sein, dass im denaturierenden Western Blot einige Epitope durch

den Antikörper nicht erkannt, jedoch in der Immunzytologie detektieren werden können. Eine

andere Möglichkeit wäre, dass die GAGE-7b-Expression sehr heterogen in diesem

Tumorpatienten war. Entsprechend ließ sich zwar eine GAGE-7b-positive Zelllinie etablieren.

Zur Aufarbeitung des Tumorgewebes selbst jedoch wurde Gewebe aus einer anderen Region des

Tumors verwendet, welches eine bedeutend geringere GAGE-7b-Expression aufwies, die im

Western Blot nicht mehr nachweisbar ist.

Neben der Analyse der GAGE-7b-Expression auf Proteinebene an Zelllinien wurden

Tumorgewebe von MM-Patienten untersucht. Die Hälfte der Paraffingewebeschnitte war

GAGE-7b-positiv (21/40). Allerdings wurden GAGE-7b-positive Zellen nur vereinzelt oder in

Zellhaufen nachgewiesen. Dieses Expressionsverhalten ähnelt der heterogenen Expression von

GAGE-7b in den MM-Zelllinien. Die GAGE-7b-Negativität der Melanozyten als Zellen der

Haut wurde durch Untersuchungen an normaler Haut bestätigt. In Schnitten von normaler Testis

wurden die Spermatogonien als GAGE-7b-positive Zellen identifiziert und GAGE-7b ebenfalls

anhand dieser Untersuchungen als CTA bestätigt.

Untersuchungen der GAGE-Expression auf Proteinebene sind bisher nur selten in der Literatur

beschrieben.

Akcakanat et al. berichteten von Analysen der CTA GAGE, NY-ESO-1, MAGE-A und SSX auf

Proteinebene bei 213 Speiseröhrenkrebspatienten (Akcakanat et al. 2006). SSX-Expression

wurde nicht detektiert, wohingegen GAGE-Expression in 20% der Patienten, MAGE-A-

Expression in 52% und NY-ESO-1-Expression in 21% der Patienten gemessen wurde. Zur

Detektion von GAGE in immunhistologischen Untersuchungen wurde ein monoklonaler GAGE-

Antikörper der Firma BD Biosciences verwendet. Die Färbung der GAGE-positiven Gewebe

war ebenfalls heterogen, zytoplasmatisch und nukleär. Die GAGE-Expression war statistisch

DISKUSSION 186

signifikant erhöht in Patienten, die älter als 64 Jahre waren und Tumoren größer als 60mm sowie

in der abdominalen Speiseröhre aufwiesen. Jedoch wurde keine Korrelation gefunden zwischen

CTA-Expression und Krankheitsfortschritt oder Überlebensrate. Des Weiteren wurde eine

Korrelation zwischen der MAGE-A- und GAGE-Expression sowie der GAGE- und NY-ESO-1-

Expression beschrieben. Somit kann man von einer hohen Koexpression der MAGE-A-Proteine

mit anderen CTA wie GAGE-Proteinen sprechen (Akcakanat et al. 2006).

Gjerstorff et al. generierten einen Maus-Hybridom monoklonalen Antikörper, führten eine

Charakterisierung des Antikörpers durch und untersuchten sowohl Kontroll- als auch

Tumorgewebe (Gjerstorff et al. 2006). Bei der Untersuchung der GAGE-Expression auf

Proteinebene in Kontrollgeweben, wurde die Expression von GAGE-1 bis 8 in Testis bestätigt.

Eine GAGE-Expression wurde zum ersten Mal in postfötalen Oozyten nachgewiesen, die wie

Spermatogonien zu immunprivilegierten Zellen zählen. Insgesamt wurden 256 Tumorgewebe

aus 22 Tumorentitäten getestet. Zu den Tumorentitäten mit den meisten zur Verfügung

stehenden Geweben zählten Brust- und Lungenkrebs sowie MM. GAGE-Expression wurde in

12% (5/43) der Brustkrebsgewebe, 16% (10/64) der Lungenkrebsgewebe und 17% (4/24) der

MM-Gewebe nachgewiesen. Diese Expression ist deutlich geringer als die in dieser Arbeit

berichteten Ergebnisse. Die Anzahl an untersuchten MM-Geweben war nur halb so groß. Diese

Ergebnisse könnten auf eine unterschiedliche Sensitivität der Antikörper zurückzuführen sein.

Die Expression in den Gewebeschnitten war stark heterogen, zytoplasmatisch und teilweise sehr

stark im Nukleus repräsentiert. Die GAGE-Expression in zwei Lymphomgeweben war negativ,

welches sich mit den negativen Ergebnissen dieser Arbeit in den CTCL-Zelllinien deckt. Zudem

berichteten die Autoren über eine Assoziation der GAGE-Expression mit dem Phenotyp, jedoch

nicht mit dem Genotyp einer distinkten Zellpopulation. Die Hypothese, dass GAGE-Proteine

Marker für Stammzellen und Kontrollproteine der Keimzell-Genexpression sein könnten wird

diskutiert. Schließlich wurde der Antikörper mit dem kommerziell erhältlichen Antikörper von

BD Biosciences verglichen. Es wurde ein vergleichbares Färbeverhalten berichtet (Gjerstorff et

al. 2006).

In einer dritten Studie wurden MM-Gewebe auf GAGE-Expression getestet unter Verwendung

des GAGE-Antikörpers von BD Biosciences. Alle 19 analysierten Naevi waren GAGE- sowie

MAGE-A1-, A4- und NY-ESO-1-negativ (Luftl et al. 2004). Fünf der 26 (19%) untersuchten

primären kutanen MM waren GAGE-positiv. Zudem wurden 19% der kutanen MM positiv

getestet für MAGE-A1, 35% für MAGE-A4, 15% für MAGE-A3, 31% für NY-ESO-1 und 38%

für MAGE-C1. Zwanzig der 26 Gewebe waren mindestens für ein CTA positiv, so dass die

Sensitivität der CTA-Immunreaktivität in MM-Gewebeschnitten mit der Anzahl an CTA zunahm

DISKUSSION 187

(Luftl et al. 2004). Die untersuchten CTA wiesen auf eine maligne Transformation der kutanen

MM hin. Die Expressionshäufigkeit jedes einzelnen CTA war eher gering. Laut den Autoren

steht die optimale Kombination von CTA für immunhistologische Analysen zur Diskussion.

4.4.3 Serologische Untersuchung von GAGE-7b

Neben SADA und Multiplex-Serologie wurde eine dritte Methode zur Bestimmung von

spezifischen Antikörpern gegen Tumorantigene im Serum von Ctrl und Patienten verwendet. Im

Anschluss an eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese des aufgereinigten

GAGE-7b-tag-Proteins wurde das geblottete Protein mit Serum inkubiert, um auf diese Weise

vorhandene Serumantikörper nachzuweisen. Diese Methode stellt sicherlich keine vergleichbare

Hochdurchsatzmethode ähnlich der Multiplex-Serologie dar, ist jedoch mit zwei Tagen Dauer

schneller als die SADA-Methode. Positiv reagierende Seren wurden zusätzlich mittels

Chemilumineszenz bestätigt. In diesem methodischen Ansatz konnte kein GAGE-7b-positives

Kontrollserum ermittelt werden. 5,9% der 34 untersuchten CTCL-Seren und 5,6% der 72 MM-

Seren waren GAGE-positiv. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigen sowohl die SADA (Ctrl: 1%,

MM: 6%, CTCL: 3%) als auch die Multiplex-Serologie Ergebnisse (Ctrl: 1%, MM: 5,8%,

CTCL: 2,8%). Für alle drei Methoden wurden Kontrollseren aus demselben Serenpool

verwendet, wobei die verwendeten Seren im SADA und in der Multiplex-Serologie identisch

waren. Jedoch war das jeweils positiv reagierende Serum nicht identisch (SADA: BB36-39,

Multiplex: BB15-59). Das MM-Kollektiv war für jede Methode unterschiedlich, so dass hier

einzig die Häufigkeit der Seropositivität verglichen werden kann. Diese ist wie bereits erläutert

mit ungefähr 6% in allen Methoden sehr ähnlich. Der CTCL-Serenpool war ebenfalls für alle

Methoden gleich, so dass ein Vergleich angestellt werden kann. Jede Methode identifizierte

andere Seren als seropositiv, so dass hier keine Übereinstimmung herrscht. Bezüglich der

SADA-Methode könnte dies damit erklärt werden, dass ein in der cDNA-Sequenz verkürzter

Klon verwendet wurde und somit eventuell vorhandene antigene Strukturen des volle-Länge-

Proteins verloren gegangen sind. Allerdings sollten die in dieser Methode identifizierten

positiven Seren auch mit den anderen Methoden als positiv detektiert werden. Zudem gibt es bei

der SADA-Methode keine Kontrolle des induzierten Proteins. Es wäre theoretisch möglich, dass

auch Proteine der UTR abgelesen werden und hier Antikörperreaktionen auftreten. Im Western

Blot könnten durch die Denaturierung des Proteins antigene Strukturen sowohl entstehen als

auch verschwinden. In der Multiplex-Serologie könnte eventuell der GST-Teil einen Teil des

GAGE-7b-Proteins verdecken und somit schwerer zugänglich für Serumantikörper machen.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Häufigkeit an Immunreaktivitäten gegen GAGE in

Kontrollen sehr gering oder nicht vorhanden ist, jedoch einige MM- und CTCL-Patienten

DISKUSSION 188

Antikörper ausbilden. Die Häufigkeit an humoralen Immunreaktionen gegen GAGE in Patienten

sind jedoch mit unter 10% so gering, dass eine aussagekräftige Diagnose allein anhand dieser

Immunreaktion nicht möglich erscheint. Da CTCL-Patienten Antikörper gegen GAGE besitzen,

wären weitere Analysen hinsichtlich GAGE-Expression in CTCL-Gewebe interessant.

Untersuchungen der humoralen Immunantwort gegen GAGE sind bisher noch sehr selten in der

Literatur beschrieben. Wadle et al. untersuchten die Immunantwort gegen verschiedene CTA in

Pankreaskrebspatienten (Wadle et al. 2006). Hierfür wurde die „rekombinant exprimierte

Antigene auf Hefeoberfläche“-(RAYS)-Technologie angewendet, die der SEREX-Methode

ähnelt. 14% der Seren waren „synaptonemal complex protein“ (SCP-1)-positiv, wohingegen alle

Seren GAGE-negativ waren.

4.4.4 GAGE-7b als Ziel einer Immuntherapie

Aufgrund der in dieser Arbeit dokumentierten Ergebnisse sowie Berichten in der Literatur stellt

die GAGE-Antigenfamilie eine interessante Proteinfamilie für Tumorimmuntherapien dar. Da

die Expression der GAGE-Gene sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene CTA-spezifisch

ist, würden Immuntherapien nur Krebszellen angreifen ohne normales Gewebe zu schädigen. Die

gerringe Immunogenität des Antigens selbst könnte mittels Immuntherapien verstärkt werden.

Immuntherapien sind am erfolgreichsten, wenn die Antigenexpression homogen und hoch im

Tumorgewebe ist. Dies trifft laut der Ergebnisse dieser Arbeit jedoch nicht zu. Dementsprechend

gibt es zwei Ansätze, diese Hürde zu überwinden. Zum einen kann eine Immuntherapie

verschiedene Antigene als Zielstruktur definieren oder zum anderen die Antigenexpression

erhöhen und anschließend immuntherapeutisch wirken. Der zweite Ansatz konnte in einer Studie

von Bazhin et al. für GAGE auf Zelllinien-Ebene unter Verwendung eines Histondeacetylase

Inhibitors und DNA Methyltransferase Inhibitors nachgewiesen werden. Eine MM-Zelllinie

wurde mit dem DNA Methyltransferase Inhibitor 5-Aza-2’-Deoxycytidin und dem

Histondeacetylase Inhibitor Trichostatin A behandelt. 5-Aza-2’-Deoxycytidin führt zu einer

Promotordemethylierung vieler CTA-Gene und verursacht eine erhöhte mRNA Expression.

Trichostatin A inhibiert die Histondeacetylase spezifisch und stimuliert die Genexpression

ausgewählter Gene wie CTA. Unter Verwendung der Western Blot und ELISA-Methode konnte

die GAGE-Expression nach 5-Aza-2’-Deoxycytidin-Behandlung um 200% erhöht werden. Eine

Erhöhung um das vierfache wurde nach Kombination von 5-Aza-2’-Deoxycytidin und

Trichostatin A berichtet (Bazhin et al. 2007). Drei weitere Zelllinien wurden mit diesen

Inhibitoren behandelt. In immunhistologischen Untersuchungen wurde eine erhöhte Zahl an

GAGE-positiven Zellen detektiert. Durch die Behandlung von MM-Zelllinien mit

DISKUSSION 189

Histondeacetylase und Methyltransferase Inhibitoren könnte eine homogene GAGE-Expression

erzielt werden. Die Übertragung dieser Ergebnisse auf den Menschen muss in klinischen Studien

nachgewiesen werden und steht momentan noch aus.

Grundlage dieser Ergebnisse waren Studien von Sigalotti et al. Demnach ist die

Promotermethylierung von CTA für die starke Heterogenität der Expression von CTA in

Tumoren verantwortlich. Die Expression aller untersuchter CTA wurde durch 5-Aza-2’-

Deoxycytidin in CTA-negativen Zellklonen induziert (Sigalotti et al. 2004). Entsprechend

könnte 5-Aza-2’-Deoxycytidin ein Wirkstoff sein, der die therapeutische Effizienz einer multi-

CTA-Immuntherapie in MM-Patienten verbessert. In RCC-Zelllinien konnte die Expression von

GAGE-1 bis 6 ebenfalls hochreguliert werden (Coral et al. 2002). Die Expression von GAGE-1

bis 6 konnte in MM-Xenografts von 5-Aza-2’-Deoxycytidin-behandelten Mäusen nachgewiesen

werden. Kontrollmäuse wiesen hingegen keine Expression auf (Coral et al. 2006). Zudem wurde

berichtet, dass die Transkription der CTA mit der Hypomethylierung der CTA Promoter

korreliert (De Smet et al. 2004). Erste klinische Phase I Studien zur Verwendbarkeit und

Sicherheit von 5-Aza-2’-Deoxycytidin in Krebspatienten wurden bereits durchgeführt

(Samlowski et al. 2005; Gollob et al. 2006).

Schließlich wurde für ein Antigen der GAGE-Familie, GAGE-7c, eine mögliche Funktion

nachgewiesen. Cilensek et al. berichteten, dass GAGE-7c eine Funktion in der Tumorgenese hat.

Durch eine GAGE-7c-Expression wurde die Epithelialkarzinom Zelllinie HeLa resistent gegen

Apoptose und Krebstherapien wie Radio- und Chemotherapie (Cilensek et al. 2002). Dies betraf

apoptotische Ereignisse, die durch Fas oder IFN-γ initiiert wurden. Im Fas-

Signaltransduktionsweg wurde der Einfluss von GAGE-7c auf die Apoptose nach der Caspase-8-

Aktivierung und vor der poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP)-Spaltung lokalisiert. GAGE-7b-

positive Zelllinien waren ebenfalls resistent gegen Fas-induzierte Apoptose (Cilensek et al.

2002). GAGE-7b und 7c unterscheiden sich in zwei Aminosäuren an den Positionen 50 und 87.

Somit könnten sich GAGE-7b- und 7c-positive Tumorzellen der T-Zell-induzierten Apoptose

entziehen und zur Tumorprogression durch Proliferation beitragen. Entsprechend wäre eine

zielgerichtete Immuntherapie gegen GAGE eine Möglichkeit, GAGE-positive Tumore sensitiv

gegen Chemotherapeutika wie Taxol und γ-Bestrahlung zu machen.

4.4.5 GAGE-7b – Fazit und Ausblick

Die in dieser Arbeit durchgeführte Charakterisierung von GAGE-7b im MM und CTCL ergänzt

das bereits in der Literatur beschriebene Wissen über die Bedeutung der CTA. Die Ergebnisse

dieser Arbeit stellen deutlich dar, dass GAGE-7b eine hohe Expression in MM-Zelllinien und

DISKUSSION 190

eine mittlere Expression in MM-Geweben besitzt. In immunhistologischen Analysen wurde eine

heterogene Expression von GAGE-7b in MM-Tumorgewebe ermittelt. In weitergehenden

Untersuchungen von Bazhin et al. konnte eine starke Induktion der GAGE-7b-Expression in mit

5-Aza-2’-Deoxycytidin behandelten Zelllinien nachgewiesen werden (Bazhin et al. 2007). Für

das CTCL ist GAGE-7b nicht relevant, da in CTCL-Zelllinien keine GAGE-7b-Expression

nachgewiesen werden konnte.

Aufgrund der beschränkten Expression von GAGE auf immunprivilegierte Gewebe und der

weitverbreiteten Expression in verschiedenen Tumorentitäten hat GAGE das Potential für ein

optimal geeignetes Therapieziel in der Onkologie. Um dieses Potential noch deutlicher

hervorzuheben, sollten Expressionsanalysen auf Proteinebene für verschiedenste Tumorentitäten

durchgeführt werden. Interessant wäre hier zum einen der Vergleich von Ergebnissen, die mittels

PCR und mittels Immunhistologie erhoben werden. Ein Vergleich der Ergebnisse von

immunhistologischen Untersuchungen mittels polyklonalem und monoklonalem Antikörper wäre

hier ebenfalls von Interesse. Des Weiteren müsste die Funktion von GAGE untersucht werden.

Eine Annäherung an die Aufklärung der Funktion von GAGE kann über die genaue Lokalisation

von GAGE in der Zelle z.B. mittels FACS-Untersuchungen erfolgen in Verbindung mit der

Suche nach Bindungspartnern. Bindungspartner könnten durch die Immobilisierung von GST-

GAGE-Protein an eine Glutathion-Säule, Inkubation mit Zelllysat und anschließende

Charakterisierung von gebundenen Proteinen erfolgen. Zudem könnte die Zellproliferation nach

Zugabe des GAGE-Antikörpers zu bestimmten Zellsystemen untersucht werden. Auf der Basis

der Analysen von Bazhin et al. wäre es sicherlich sinnvoll, klinische Studien mit einer

Kombination von GAGE-Antikörpern und 5-Aza-2’-Deoxycytidin durchzuführen, um den

Erfolg einer Therapie beurteilen zu können, während welcher die Expression des Zielantigens

hochreguliert wird.

4.5 CTA und TAA in der Krebstherapie

Das Ziel von Immuntherapien ist die Stärkung der Immunantwort gegen den Tumor unter

Verwendung von spezifischen Strukturen z.B. in Form von Antigenen. CTA sind von einem

immunologischen Standpunkt aus ausgezeichnete Ziele für Immuntherapien, da sie in vielen

Tumorentitäten exprimiert sind und in Normalgeweben ausschließlich in Testis vorkommen. Die

Testis selbst ist für Immunzellen nicht zugänglich, da es keinen direkten Kontakt zwischen

Keim- und Immunzellen gibt, und die MHC I Oberflächenexpression auf den Keimzellen fehlt

(Barker und Billingham 1977; Tomita et al. 1993). Bislang stimulieren viele Immuntherapien

den zellulären CD8+ T-Zellarm mit weniger befriedigenden Resultaten (Wang 2001), die auf

DISKUSSION 191

eine fehlende Induktion der humoralen Immunantwort zurückgeführt werden (Nakatsura et al.

2002). Eine effektive CTL-Immunantwort gegen Tumorantigene benötigt jedoch die

Unterstützung von CD4+ T-Helferzellen (Bennett et al. 1997). In aktuellen Studien wird eine

erfolgreiche Immunantwort immer im Zusammenhang mit einer CD4+ T-Helferzellantwort

diskutiert (Hung et al. 1998; Toes et al. 1999). Neben der MHC Klasse II-Präsentation exogener

und endogener Proteine durch APC konnte eine MHC Klasse I-Präsentation derselben Proteine

über eine „Cross“-Präsentation nachgewiesen werden. Dieses APC-„Cross-Priming“ induziert

über CD4+ T-Lymphozyten eine humorale und über CD8+ T-Lymphozyten eine zelluläre

Immunantwort. Es wurde berichtet, dass intrazelluläre Proteine mittels Autophagie prozessiert

werden können und somit in den MHC Klasse II Präsentationsweg gelangen (Dengjel et al.

2005; Paludan et al. 2005; Zhou et al. 2005). Hierbei sind Endosomen und Lysosomen beteiligt.

„Cross“-Präsentation wurde für virale Proteine (Gooding und Edwards 1980) und

Tumorantigene sowie Selbstantigene (Huang et al. 1994; Kurts et al. 1996) berichtet. Beim

CTCL, einer Neoplasie der CD4+ Immunzellen, könnte die Aktivierung einer CD8+ T-

Zellantwort beeinträchtigt sein. In Diskussion steht bis heute, ob nur die TH1-Immunzellen, die

eine zelluläre Immunantwort induzieren, oder auch die TH2-Immunzellen, die eine humorale

Immunantwort induzieren, eine effektive Anti-Tumor-Immunantwort hervorrufen. Zudem

werden mittlerweile multi-Epitop Immuntherapien, die zwei oder mehr Antigene als

Zielstrukturen haben, diskutiert (Wadle et al. 2006).

Die Therapie des MM ist vor allem durch die operative Entfernung des Tumorgewebes mit

teilweise sich anschließender adjuvanter Therapie in Form von Chemotherapeutika und

Immunmodulatoren gekennzeichnet. Für fortgeschrittene Stadien werden Chemotherapien und

Immuntherapien empfohlen. Vor allem bei Immuntherapien kommen CTA und TAA zum

Einsatz. Zahlreiche Ansätze von Immuntherapien z.B. Peptide, beladene DC unter Verwendung

der CTA MAGE-A1 und A3 sowie NY-ESO-1 sind bisher beschrieben worden (Hoon et al.

1995; Marchand et al. 1999; Jager et al. 2000a). Auch das in dieser Arbeit näher charakterisierte

CTA GAGE-7b stellt durch seine Expression in MM-Tumorgeweben ein vielversprechendes

Ziel für Immuntherapien dar. Durch die Kombination mit 5-Aza-2’-Deoxycytidin wird die

Expression dieses Antigens deutlich erhöht, welches den Angriff auf den Tumor in einer

möglichen Immuntherapie intensivieren würde. Deshalb wären Studien zur Verwendung von

Therapien mit GAGE-7b-Peptiden oder beladenen DC in Kombination mit 5-Aza-2’-

Deoxycytidin angebracht. Möglich wäre auch, dass die Expression anderer CTA parallel erhöht

würde, so dass eine Immuntherapie gegen eine Vielzahl an CTA gleichzeitig möglich wäre.

DISKUSSION 192

In der Therapie des CTCL werden vor allem Psoralen plus ultraviolettes Licht, Radiotherapie

und topische Medikamente eingesetzt. In fortgeschrittenen Stadien finden Chemotherapie,

Retinoide und Interferone sowie Interleukine Anwendung. Mittlerweile werden therapeutische

Antikörper, Immuntherapien in Form von Vakzinierungen und Histondeacetylase Inhibitoren in

der Therapie des CTCL verwendet. Allerdings sind bisher kaum Ansätze unter Verwendung von

CTA und TAA beschrieben. In dieser Arbeit konnte kein eindeutiges antigenes Ziel für das

CTCL identifiziert werden. Jedoch sind zahlreiche Antigene, die im CTCL relevant sein könnten

beschrieben, so dass weitere Untersuchungen in diese Richtung angebracht sind (Usener et al.

2003b; Hartmann et al. 2004).

4.6 CTA und TAA in der Krebsdiagnostik und -prognostik

Neben Serumbiomarkern standen Antikörper gegen bestimmte immunogene Ziele jeher im

Fokus der Diagnostik. Antikörper sind stabil im Serum, hochspezifisch, haben eine

Halbwertszeit von mehr als sieben Stunden und können schnell mit charakterisierten

Sekundärreagenzien und validierbaren Methoden gemessen werden (Anderson und LaBaer

2005). Zudem sind Antikörper bereits im Serum amplifiziert, wenn auch nur geringe Mengen an

immunogenem Protein vorhanden sind. Die Höhe der Immunantwort gegen Krebs ist zumeist

geringer als gegenüber Infektionserregern. Die mögliche Zahl an Tumorantigenen ist ähnlich

groß wie das gesamte Tumorproteom inklusive aller Varianten (Anderson und LaBaer 2005).

Wenn Antikörper gegen ein Tumorantigen durch SEREX oder SADA detektiert werden, ist eine

immunologische Relevanz der Antigene per se vorhanden, da beide Methoden hohe

Antikörpertiter voraussetzen. Ein hoher Titer an spezifischen Antikörpern setzt die Hilfe von

CD4+ T-Zellen voraus. SEREX und SADA spiegeln demnach das CD4+ T-Zell-Repertoire der

Tumorerkrankung wider (Jager et al. 1998; Old und Chen 1998). Humorale und zelluläre

Immunantwort in SEREX und Immunantworten durch CTL korrelieren für einige Antigene

(Sahin et al. 1995; Chen et al. 1997). In Diskussion steht mittlerweile, dass parallel ablaufende

Immunantworten für eine effektivere Immunantwort verantwortlich sind (Nishikawa et al. 2001).

Einige Studien haben bereits für andere Antigenklassen nachgewiesen, dass die Detektion eines

Panels an Serumantikörpern ein wertvolles diagnostisches Werkzeug darstellen könnte. Wang et

al. verwendeten 22 Phagenpeptide als Screeningtest für Prostatakrebs (Wang et al. 2005). Diese

Peptide stammen aus kodierenden und nicht-kodierenden Regionen von Prostatakrebsgewebe

und fanden in einem Phagenproteinmicroarray Anwendung. Mit 88,2% Spezifität und 81,6%

Sensitivität konnten Seren von Prostatakrebspatienten von Ctrl unterschieden werden (Wang et

al. 2005). In einem Proteinmicroarray wurden 65 Antigene zur Unterscheidung zwischen

DISKUSSION 193

Gebärmutterhalskrebspatienten und Ctrl verwendet (Chatterjee et al. 2006). Die Sensitivität lag

hier bei 55% und die Spezifität bei 98%.

Bisher wurden Immunantworten gegen CTA und TAA per se nur sehr selten gemessen, so dass

von einer niedrigen Immunogenität der CTA und TAA unter Normalbedingungen auszugehen

ist. Dies könnte auf die Verarbeitung dieser Antigene im Proteasom zurückzuführen sein. Hoch

organisierte Proteine, die einen großen Anteil an α-helikalen Strukturen haben, scheinen der

Entfaltung der Proteine im Proteasom zu widerstehen. Somit können diese Proteine schlechter

verarbeitet und damit auch präsentiert werden. Zu dieser Proteingruppe zählen unter anderem die

CTA-Antigengruppen MAGE, „Synaptonemal complex protein“ (SCP) und SART. NY-ESO-1,

welches in dieser Arbeit hohe Antikörperhäufigkeiten in MM-Patienten in der Multiplex-

Serologie hatte, gehört nicht zu dieser Gruppe, da es deutlich weniger α-helikale Strukturen

besitzt (Kirkin et al. 2002). Generell zählen die CTA und TAA zu den Autoantigenen und somit

zu den körpereigenen Proteinen. In Gesunden werden autoreaktive T-Zellen, die ein durch APC

präsentiertes Selbstpeptid erkennen, entweder im Thymus eliminiert oder in der Peripherie

inaktiviert. Im Tumor kann eine Fehlfunktion dieses Mechanismus vorliegen, so dass es zu

Antikörper- und T-Zell-vermittelten Immunreaktionen gegen körpereigene Strukturen bzw.

Antigene kommen kann (Janeway et al. 2002). Diese Reaktionen gegen Selbstpeptide stellen

jedoch eher schwächere Immunantworten im Vergleich zu Fremdpeptiden von Bakterien oder

Viren dar (Houghton et al. 2001). Es ist nicht bekannt, ob Autoantikörper die

Immunüberwachung widerspiegeln oder einen Einfluss auf die klinische Entwicklung des

Patienten haben könnten (Anderson und LaBaer 2005). Jedoch verschwanden IgG Antikörper

gegen die Antigene KU-MEL1 und CDX2 nach einer Behandlung und nachfolgender guter

Prognose von Patienten (Kiniwa et al. 2001; Ishikawa et al. 2003).

Im Fokus der Diagnostik und Prognostik des MM steht die immunhistologische Untersuchung

von Tumorgewebe unter Verwendung von Antikörpern gegen Differenzierungsantigene wie

S100, Melan A und Tyrosinase (Busam und Jungbluth 1999; Orchard 2000). Verschiedene

serologische Tumormarker wie S100β, Laktatdehydrogenase und „melanoma inhibitory activity“

sind ebenfalls bekannt (Djukanovic et al. 2001; Bottoni et al. 2003). Allerdings ist bisher kein

spezifischer und sensitiver diagnostischer und prognostischer Marker für das MM identifiziert

worden. Bislang spielen CTA und TAA eine eher untergeordnete Rolle in der Diagnostik und

Prognostik des MM. In dieser Arbeit konnte kein eindeutiger, diagnostischer Marker bestimmt

werden. Jedoch stellen die Antikörper gegen LAGE-1a einen ausgezeichneten prognostischen

Marker dar. Antikörper gegen NY-ESO-1, zu welchem LAGE-1a hoch homolog ist, wurden

bereits für MM-Patienten beschrieben, jedoch noch nicht in einem ähnlich großen Kollektiv.

DISKUSSION 194

Neben LAGE-1a sollten ebenfalls MAGE-A3, se57-1 und GAGE-7b in weiteren serologischen

Studien eingeschlossen werden. Die Messung von Antikörpern gegen GBP-5a, 5ta und HD-MM-

48 sollte auch in Betracht gezogen werden. Zusätzlich sollte die Expression von HD-MM-48 im

MM untersucht werden. Zudem sollten weitere Antigene identifiziert werden, um ein mindestens

10 Antigene umfassendes Panel zusammenstellen zu können.

Die Diagnostik und Prognostik des CTCL stützen sich bisher hauptsächlich auf klinische und

(immun-) histologische Untersuchungen, wobei CTA und TAA bisher keine große Rolle spielen.

Oberflächenmarker, β-Ketten-Rearrangement des T-Zellrezeptors in Lymphknoten, maligne

Zellen und verschiedene Proteine wie Neopterin und β2-Mikroglobulin im Blut werden ebenfalls

zur Analyse der Erkrankung herangezogen (Ralfkiaer 1994; Guitart und Kaul 1999; Hassel et al.

2004). Antikörper im Blut von CTCL-Patienten wurden bisher nur selten untersucht (Dummer et

al. 2004). Zur Diagnose werden zur Zeit hauptsächlich monoklonale Antikörper, die gegen die

Differenzierungs- und Proliferations-assoziierten Antigene Ki-1/CD30, Ki67 und IL2R/CD25

gerichtet sind, in immunhistologischen Untersuchungen oder lösliche Formen dieser Antigene im

Serum verwendet (Nadali et al. 1995; Vonderheid et al. 1998; Kanavaros et al. 2001). Allerdings

ermöglicht nur die kombinierte Auswertung der Antikörperanwesenheit in Verbindung mit der

Expression der Antigene im Patientengewebe eine korrekte Klassifizierung. Anhand der

Untersuchungen in dieser Arbeit wären HD-MM-48, HD-CL-02 und MAGE-A9 interessante

Antigene für ein Panel, gegen welches Antikörperantworten in CTCL-Patienten untersucht

werden sollten. Diese Antigene sollten weiterhin näher im CTCL charakterisiert werden. Zudem

sollten weitere Antigene hinsichtlich ihrer Antikörperantworten in CTCL-Patienten untersucht

werden, um ein Panel von mindestens 10 relevanten Antigenen zusammenstellen zu können.

ZUSAMMENFASSUNG 195

5 ZUSAMMENFASSUNG

Essentielle Voraussetzungen für die Entwicklung von spezifischen Immuntherapien und Verfahren zur Diagnose und Prognose von Tumorerkrankungen sind die Kenntnis und Charakterisierung von Tumorantigenen. Potentielle Antigene für immuntherapeutische Strategien und Diagnoseverfahren sollten möglichst tumorspezifisch sein. Zudem sollten Hinweise auf bereits im Patienten induzierte Immunantworten z.B. in Form von Antikörper- oder T-Zellantworten bestehen. In dieser Arbeit wurden Antikörperantworten in Patienten des kutanen T-Zell Lymphoms (CTCL), des malignen Melanoms (MM) und von Kontrollen (Ctrl) mittels zweier methodischer Ansätze untersucht sowie das Tumorantigen GAGE-7b unter Verwendung eines in einem Kaninchen generierten polyklonalen Antikörpers charakterisiert.

Um Antikörper-Häufigkeiten für zahlreiche Tumorantigene parallel zu bestimmen, wurde ein Serumantikörper-Detektionsarray (SADA) etabliert. Bei der Untersuchung von 42 Tumorantigenen wurden für 14 Antigene Antikörper nur in Patienten jedoch nicht in Ctrl detektiert. Die Serumantikörper-Häufigkeiten der Antigene GBP-5ta, GBP-5a, HD-MM-48 und HD-MM-19 im MM-Kollektiv war signifikant höher als im Kontroll-Kollektiv. Dies traf auch für die Antigene HD-MM-48 und HD-CL-02 im Vergleich von CTCL- und Kontroll-Kollektiv zu. Insgesamt waren die Antikörperantwort-Häufigkeiten mit zumeist unter 10% relativ gering, welches die Verwendung der entsprechenden Antigene als diagnostische Ziele einschränkt.

Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung der Immunreaktion von 13 Cancer-Testis- und Tumor-assoziierten Antigenen in verschiedenen Kollektiven wurde in Form der Multiplex-Serologie verwendet. In einem MM-Kollektiv wurden Antikörper gegen LAGE-1a signifikant häufiger identifiziert im Vergleich zu einem Kontroll-Kollektiv. Zusätzlich war diese höhere Antikörper-Häufigkeit in MM-Patienten stadienabhängig. Für die Antigene MAGE-A3, GAGE-7b und se57-1 wurden ebenfalls höhere Antikörper-Häufigkeiten in MM-Patienten gemessen. Antikörper-Titer von MM- und CTCL-Patienten veränderten sich über die Zeit selten, so dass Serokonversionen nur vereinzelt nachgewiesen werden konnten. Für MAGE-A1 und A9 konnten für verschiedene Stadien signifikant höhere Reaktivitäten im CTCL- im Vergleich zum Kontroll-Kollektiv ermittelt werden. Interessante Ansatzpunkte für zukünftige Analysen wären Kollektive, die mit Interferon-γ, Tumor- oder dendritischen Zellen behandelt oder in Immuntherapien gegen spezifische Tumorantigene aufgenommen wurden.

Erstmalig konnte ein umfassend beschriebener polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen GAGE-7b hergestellt werden, der im Western Blot und in der Immunhistologie verwendet wurde. Im Western Blot konnte nachgewiesen werden, dass 59% der untersuchten MM-Zelllinien GAGE-7b exprimierten, wohingegen kein Protein in CTCL-Zelllinien und in Kontrollgeweben mit Ausnahme von Testis detektiert werden konnte. Dieses Expressionsverhalten konnte in immunzytologischen Untersuchungen bestätigt werden. Immunhistologisch exprimierten 53% der MM-Gewebe GAGE-7b. Des Weiteren konnten in 6% der MM- und CTCL-Patienten Antikörper gegen GAGE-7b nachgewiesen werden, während keine Antikörper in Ctrl gefunden wurden. Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse erkennt der GAGE-7b Antikörper wohl alle GAGE-Familienmitglieder. Zukünftige Untersuchungen unter Verwendung dieses Antikörpers können die Aufklärung funktioneller Aspekte der GAGE-Expression in Tumorerkrankungen ermöglichen.

SUMMARY 196

6 SUMMARY

Essential prerequisites for the development of specific immunotherapies and procedures for diagnosis and prognosis of tumor diseases are the knowledge and characterization of tumor antigens. Potential antigens for immunotherapeutic strategies and diagnosis tools should be tumor-specific. Moreover, indications for immune responses in patients e.g. antibody or T cell responses should be available. In this thesis, antibody responses of patients of cutaneous T cell lymphoma (CTCL), melanoma (MM) and controls were investigated using two different methods. In addition, the tumor antigen GAGE-7b was characterized using a rabbit polyclonal antibody.

In order to test antibody frequencies of various tumor antigens in parallel, a serum antibody detection array (SADA) was established. Testing 42 tumor antigens, antibodies against 14 antigens were only detectable in patients but not in controls. Serum antibody frequencies of antigens GBP-5ta, GBP-5a, HD-MM48 and HD-MM-19 were significantly higher in MM patients compared to controls. The same was true for antigens HD-MM-48 and HD-CL-02 comparing CTCL patients and controls. In summary, antibody frequencies were relatively low ranging most frequently from 0% to 10% which limits the use of the respective antigens as diagnostic targets.

An additional method to measure immunoreactivities of 13 cancer testis and tumor-associated antigens in different groups named multiplex serology was used. Antibodies against LAGE-1a were detected significantly more frequently in MM patients in comparison to controls. In addition, this higher antibody frequency in MM patients was stage dependent. For antigens MAGE-A3, GAGE-7b and se57-1 a higher antibody frequency in MM patients was measured likewise. Antibody titers of MM and CTCL patients rarely changed over time, thus seroconversions were seen only sporadically. Significantly higher reactivities could be identified for MAGE-A1 and A9 in CTCL patients of different stages compared to controls. In future, analyzing patients immunized with interferon-γ, tumor or dendritic cells or immunotherapy targeting specific tumor antigens would be of high interest.

For the first time, a comprehensively characterized rabbit polyclonal antibody against GAGE-7b was generated and used in Western Blot and immunohistology. In Western Blot analysis, 59% of all MM cell lines tested expressed GAGE-7b, whereas no protein was detected in both CTCL cell lines and control tissues except testis. This expression pattern was confirmed by immunocytology. Immunohistological tests confirmed that 53% of MM tissues are positive for GAGE-7b protein expression. Moreover, antibodies against GAGE-7b could be identified in 6% of MM and CTCL patients whereas controls had no detectable antibody responses. On the basis of the achieved results, the GAGE-7b antibody recognizes probably all GAGE family members. Future analysis using this antibody may permit the elucidation of functional aspects of GAGE expression in tumor diseases.

LITERATURVERZEICHNIS 197

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ANHANG 229

8 ANHANG

Anhang 1: Darstellung der p-Werte für alle humanen Antigene in der Multiplex-

Serologie laut „Fisher’s Exact Test“

Ctrl: Kontrollen, MM: Malignes Melanom, MM I: MM Stadium I, CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, CTCL I: CTCL Stadium I, n.e.: nicht evaluierbar.

p-Wert Antigen Kollektiv

MAGE-A1

MAGE-A3

MAGE-A9

LAGE-1a

GAGE-7b

CAMEL se70-2

Ctrl – MM 0,8092 0,3475 0,5026 0,0034 0,0638 0,5473 0,0398 Ctrl – MM I – MM II – MM III – MM IV

0,5464 0,0198 0,3300 0,0088 0,1657 0,3743 0,4309

Ctrl – MM I 0,3363 1,0000 1,0000 0,1128 0,2457 n.e. 0,5512 Ctrl – MM II 1,0000 0,6640 1,0000 0,1151 0,0404 0,3289 0,5511 Ctrl – MM III 1,0000 0,4676 0,5930 0,0302 0,2397 n.e. 0,5514 Ctrl – MM IV 0,3295 0,0128 0,0828 0,0007 0,0964 0,3197 0,5514 Ctrl - CTCL 0,2549 1,0000 0,3154 0,5327 0,6512 0,1464 0,3080 Ctrl – CTCL I – CTCL II – CTCL III – CTCL IV

0,1052 0,5386 0,0024 0,1941 0,5498 0,3884 1,0000

Ctrl – CTCL I 0,3483 1,0000 0,5392 0,0688 1,0000 0,1244 1,0000 Ctrl – CTCL II 1,0000 1,0000 1,0000 0,6724 1,0000 n.e. 1,0000 Ctrl – CTCL III 0,0199 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 n.e. 1,0000 Ctrl – CTCL IV 1,0000 0,2476 0,0032 1,0000 0,2579 n.e. 1,0000 p-Wert Antigen Kollektiv

se57-1 GBP-5ta

cTAGE-5a N-terminal

cTAGE-5a C-terminal

p53 p16

Ctrl – MM 0,2708 1,0000 1,0000 0,2724 0,6949 1,0000 Ctrl – MM I – MM II – MM III – MM IV

0,0265 0,1390 0,1484 1,0000 0,7456 0,8472

Ctrl – MM I 0,5450 0,5512 1,0000 1,0000 0,5512 0,5956 Ctrl – MM II 0,0149 0,3952 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 Ctrl – MM III 1,0000 0,3846 0,5930 1,0000 0,6549 1,0000 Ctrl – MM IV 0,5387 0,5514 0,3276 1,0000 1,0000 1,0000 Ctrl - CTCL 1,0000 1,0000 1,0000 0,5695 0,6913 0,1670 Ctrl – CTCL I – CTCL II – CTCL III – CTCL IV

0,3130 1,0000 0,5573 0,3015 0,8223 0,7208

Ctrl – CTCL I 1,0000 1,0000 0,6155 0,5392 1,0000 0,5392 Ctrl – CTCL II 0,2315 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 Ctrl – CTCL III 1,0000 1,0000 0,3276 0,3276 1,0000 1,0000 Ctrl – CTCL IV 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,4524 1,0000

ANHANG 230

Anhang 2: Darstellung der positiven Seroreaktivitäten für alle humanen Antigene in

der Multiplex-Serologie

Ctrl: Kontrollen, MM: Malignes Melanom, MM I: MM Stadium I, CTCL: Kutanes T-Zell Lymphom, CTCL I: CTCL Stadium I.

Positive Antigen Kollektiv (n)

MAGE-A1

MAGE-A3

MAGE-A9

LAGE-1a

GAGE-7b

CAMEL se70-2

Ctrl (100) 6,0% 5,0% 2,0% 3,0% 1,0% 0,0% 3,0% MM (191) 7,3% 8,4% 4,2% 13,6% 5,8% 1,0% 0,0% MM I (48) 10,4% 4,2% 2,1% 10,4% 4,2% 0,0% 0,0% MM II (49) 4,1% 2,0% 2,0% 10,2% 8,2% 2,0% 0,0% MM III (47) 4,3% 8,5% 4,3% 12,8% 4,3% 0,0% 0,0% MM IV (47) 10,6% 19,1% 8,5% 21,3% 6,4% 2,1% 0,0% CTCL (144) 10,4% 4,9% 4,9% 4,9% 2,8% 2,8% 0,7% CTCL I (55) 10,9% 3,6% 0,0% 10,9% 1,8% 3,6% 1,8% CTCL II (14) 7,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% CTCL III (14) 28,6% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% CTCL IV (16) 6,3% 12,5% 25,0% 0,0% 6,3% 0,0% 0,0% Positive Antigen Kollektiv (n)

se57-1 GBP-5ta

cTAGE-5a N-terminal

cTAGE-5a C-terminal

p53 p16

Ctrl (100) 1,0% 3,0% 2,0% 2,0% 3,0% 2,0% MM (191) 3,7% 3,1% 2,6% 0,5% 2,1% 2,1% MM I (48) 2,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 4,2% MM II (49) 10,2% 6,1% 0,0% 2,0% 2,0% 2,0% MM III (47) 0,0% 6,4% 4,3% 0,0% 4,3% 2,1% MM IV (47) 2,1% 0,0% 6,4% 0,0% 2,1% 0,0% CTCL (144) 0,7% 3,5% 2,8% 0,7% 2,1% 0,0% CTCL I (55) 0,0% 3,6% 3,6% 0,0% 3,6% 0,0% CTCL II (14) 7,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% CTCL III (14) 0,0% 0,0% 7,1% 7,1% 0,0% 0,0% CTCL IV (16) 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 6,3% 0,0%

ANHANG 231

Anhang 3: GAGE-7b Expressionsanalyse

n.g.: nicht getestet.

RT-PCR Western Blot Zelllinie

GAGE-1, -2, -8 GAGE-3 bis –7b Zelllinie Gewebe Immunzytochemie

MeWo + + - n.g. -

Ma-Mel-04 - - - n.g. -

Ma-Mel-05 + + - - -

Ma-Mel-11 + + + n.g. -

Ma-Mel-12 - + - - +

Ma-Mel-16 + + + n.g. n.g.

Ma-Mel-21 + + + n.g. -

Ma-Mel-37b + + + + +

Ma-Mel-47 + + + + -

Ma-Mel-52 - - - n.g. -

SK-Mel-023 - + + n.g. +

UKRV-Mel-02 + + + n.g. +

UKRV-Mel-06a - - - - -

UKRV-Mel-14a + + - n.g. -

UKRV-Mel-21a + + + n.g. +

UKRV-Mel-27 + + + - +

UKRV-Mel-31 + + + n.g. +

Melanozyten - - - n.g. -

HaCat - - - n.g. n.g.

Cou-L3 - - - n.g. -

HH - - - n.g. -

HuT78 - - - n.g. -

MyLa - - - n.g. -

SeAx - - - n.g. -

RT-PCR MM-Gewebe

GAGE-1, -2, -8 GAGE-3 bis –7b Western Blot

Korrespondie-rende Zelllinie

MM1 n.g. n.g. + Ma-Mel-37b

MM2 + + - n.g.

MM3 - - n.g. n.g.

MM4 + + - Ma-Mel-05

MM5 - - - n.g.

MM6 + + - UKRV-Mel-06a

MM7 - - - Ma-Mel-12

MM8 n.g. n.g. + Ma-Mel-47

MM9 - - - n.g.

MM10 + + - UKRV-Mel-27

LEBENSLAUF 232

LEBENSLAUF

Name: Wiedemann geb. Gottstein

Vorname: Nicole

Staatsangehörigkeit: deutsch

Geburtsdatum: 11.01.1976

Geburtsort: Pforzheim

Familienstand: verheiratet

Schulbildung und Studium

1982 – 1986 Grundschule Neulingen-Bauschlott

1986 – 06/1995 Hildagymnasium Pforzheim

Allgemeine Hochschulreife 06/1995

10/1995 – 09/1996 Studium der Rechtswissenschaften, Universität Heidelberg

08/2001 – 04/2002 Diplomarbeit, Hugh Sinclair Human Nutrition Unit, School of Food

Biosciences, University of Reading, UK

Thema: “Molecular mechanisms by which isoflavones protect against

coronary artery disease – studies in cultured cells

10/1996 – 06/2002 Studium der Ernährungswissenschaft, Universität Hohenheim

Diplom 06/2002

06/2002 – 03/2006 Promotion unter Betreuung von Frau Prof. Dr. Christiane Bode, Institut

für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft, Fachgebiet

Ernährungsphysiologie, Universität Hohenheim durchgeführt bei Herrn

Prof. Dr. Stefan Eichmüller, Klinische Kooperationseinheit für Dermato-

Onkologie, Arbeitsgruppe Tumorantigene, Deutsches Krebsforschungs-

zentrum, Heidelberg

Seit 03/2006 Wissenschaftliche Referentin, Analytical Development Biotech Products,

Merck KGaA, Darmstadt

EIDESTATTLICHE ERKLÄRUNG 233

EIDESTATTLICHE ERKLÄRUNG

Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur mit den

angegebenen Quellen und Hilfsmitteln und der zitierten Literatur angefertigt habe. Wörtlich oder

inhaltlich übernommene Stellen wurden als solche gekennzeichnet.

Diese Dissertation wurde weder in gleicher noch in ähnlicher Form in einem anderen

Promotionsverfahren vorgelegt.

Nicole Wiedemann

Rheinhausen, den 22.06.2008

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Bedeutung von Tumorantigenen bei Hauttumorpatienten · Für die freundliche und kompetente Unterstützung hinsichtlich Multiplex-Serologie und Auswertung derselben danke ich Dr. Tim