BEPALING VAN SULFONAMIDEN ,EN DAPSONE EN … · 2015. 1. 12. · BEPALING VAN SULFONAMIDEN, EN DAPSONE EN TRIMETHOPRIM MET LC-MS LAB 22 I-MET 041 v.06 6/31 4 Definities en afkortingen

LAB 22 I-MET 041 v.06 1/31

Federaal Agentschap

voor de Veiligheid

van de Voedselketen

Bestuur Laboratoria

MET-FLVVG-041

BEPALING VAN SULFONAMIDEN,EN DAPSONE EN

TRIMETHOPRIM MET LC-MS

Versie 06

Datum van toepassing 2014-11-20

Opgesteld door : Inge Heymans; medewerker R&C

Nazicht door : Tanja De Bruyn; medewerker R&C; 2014-10-31

Bert Vandenborre; medewerker R&C; 2014-11-04

Goedkeuring vrijgave door : Ingrid Vermeulen; Sectieverantwoordelijke R&C;

2014-11-17

Beheer & locatie geldende versie : Kwaliteit FLVVG; Lokale server FLVVG

Bestemmelingen : Medewerkers R&C: alle

Trefwoorden : SUL, LC-MS



LAB 22 I-MET 041 v.06 2/31

Overzicht herziening van het document

Herziening

door/datum*

Reden van herziening Tekstdeel / draagwijdte van

de herziening

CVDH 18/09/08 Nieuwe lay-out Volledige tekst

IH 2010/08/25 - Aanpassing detectieniveau voor

melk, vlees, lever en nier

- Up-date

TDB/2012-12-03 - Wijziging loopmiddel LC-MS en druk

LC-kolom

- Aanpassing opzuivering honing:

extractie in warmwaterbad (zie

ringtest RING-2012-10)

- 10.2

- 10.1.4 en D003

TDB/2013-06-04 - Aanpassing “interpretatie resultaten”

naar aanleiding van B non

conformiteit audit (vz-T-B07).

- Aanpassing “criteria analyseserie”.

- 12.2

- 11.1

TDB/2014-01-21 - LC-MS kolom

- tpm wijzigen naar xg

- 10.2

- 10.1

IH/2014-10-29 Aanpassing nieuwe methode vlees +

toevoeging trimethoprim

Volledige tekst

* Het verschil tussen de datum van toepassing en de huidige datum mag niet meer dan 5 jaar

bedragen.

Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood.

Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet

meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit

wordt vermeld in de historiek van het document.



LAB 22 I-MET 041 v.06 3/31

INHOUDSTABEL

1 DOEL .................................................................................................................................. 5

2 TOEPASSINGSGEBIED .................................................................................................... 5

3 WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN. .......................................................... 5

4 DEFINITIES EN AFKORTINGEN ...................................................................................... 6

5 PRINCIPE ........................................................................................................................... 6

6 PRESTATIEKENMERKEN ................................................................................................ 6

7 VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN .......................... 6

7.1 ALGEMENE VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN ......................................................................... 6

7.2 ALGEMENE VOORZORGSMAATREGELEN ............................................................................ 7

7.3 SPECIFIEKE VOORZORGSMAATREGELEN ........................................................................... 7

8 REAGENTIA EN HULPSTOFFEN ..................................................................................... 7

8.1 STANDAARDOPLOSSINGEN (ZIE LAB 22 P 013) ................................................................ 7

8.2 REAGENTIA EN SOLVENTEN ............................................................................................. 8

8.3 OPLOSSINGEN ................................................................................................................ 8

8.4 GLASWERK ..................................................................................................................... 9

8.5 KLEIN MATERIAAL ............................................................................................................ 9

9 TOESTELLEN .................................................................................................................. 10

10 WERKWIJZE .................................................................................................................... 10

10.1 EXTRACTIE EN OPZUIVERING ..................................................................................... 10

10.2 LC-MS ANALYSE ...................................................................................................... 16

11 KWALITEITSCONTROLE ............................................................................................... 17

11.1 CRITERIA ANALYSESERIE ........................................................................................... 17

12 BEREKENING EN RAPPORTERING ............................................................................. 19

12.1 MONSTERS DIE OPNIEUW MOETEN WORDEN OPGEZET ................................................ 19

12.2 INTERPRETATIE RESULTATEN..................................................................................... 19

12.3 RAPPORTERING EN INSCHRIJVING .............................................................................. 20

13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN,

FORMULIEREN OF LIJSTEN. ............................................................................................... 21

13.1 BIJLAGEN ................................................................................................................. 21

13.2 PROCEDURES ........................................................................................................... 21



LAB 22 I-MET 041 v.06 4/31

13.3 INSTRUCTIES ............................................................................................................ 21

13.4 FORMULIEREN, LIJSTEN EN DOCUMENTEN .................................................................. 21



LAB 22 I-MET 041 v.06 5/31

1 Doel

Deze methode beschrijft de extractie-, opzuiverings- en analyseprocedure voor het aantonen

en identificeren, conform EU-criteria, van sulfonamiden,en dapsone en trimethoprim in

voeder, vlees, lever, nier, honing, eieren, melk en kaas.

2 Toepassingsgebied

Met deze LC-MSn methode kunnen sulfonamiden,en dapsone en trimethoprim aangetoond,

geïdentificeerd en eventueel gekwantificeerd worden in voeder, vlees, lever, nier, honing,

eieren, melk en kaas op de niveaus zoals weergegeven in de scope LAB 22 F 009 014-TEST.

Opmerking: de stoffen die opgenomen zijn in de scope kunnen variëren per matrix. Ook

werden sommige stoffen enkel voor screening en niet voor bevestiging opgenomen in de

scope.

3 Wettelijke en normatieve documenten.

Volgende wetgeving is van toepassing voor geneesmiddelenresiduen in dierlijke producten:

- Richtlijn 96/23/EC van 29 april 1996

- Verordening 37/2010 (over MRL-waarden)

De EU bepaalt in deze wetgeving een toegelaten MRL-waarde (maximum residu gehalte),

afhankelijk van het soort dier en het soort weefsel.

Voor de verboden stoffen wordt geen MRL-waarde vastgelegd.

Voor melk, vlees, lever en nier geldt een MRL van 100 µg/kg voor de som van de aanwezige

sulfonamiden.

Voor vlees, lever en nier van paardachtigen geldt een MRL van 100 µg/kg voor trimethoprim.

Voor melk, vlees, lever en nier van alle andere voedselproducerende dieren geldt een MRL

van 50 µg/kg voor trimethoprim.

Uitzondering: het gebruik van sulfonamiden en trimethoprim is niet toegestaan bij dieren die

eieren voor menselijke consumptie produceren.

Dapsone wordt in bijlage I van EU Richtlijn 96/23/EG ondergebracht bij de groep A-

verbindingen (A6). Het gebruik van deze stoffen is verboden bij voedselproducerende dieren.

In het document ‘CRL Guidance Paper’ van 7/12/2007 worden richtlijnen gegeven voor de

detectieniveaus van stoffen waarvoor er geen MRL is vastgelegd in Verordening 37/2010.

Voor de bepaling van dapsone in melk en vlees wordt een niveau van 5 ppb aanbevolen.



LAB 22 I-MET 041 v.06 6/31

4 Definities en afkortingen

5 Principe

Eerst worden labmonsters bereid door homogeniseren en malen van de monsters. Daarna

volgt een extractie- en opzuiveringsstap. Tenslotte worden detectie, identificatie en eventuele

kwantificatie uitgevoerd met LC-MSn.

6 Prestatiekenmerken

Het validatieschema en de bekomen prestatiekenmerken zijn terug te vinden in Vmap 041.

7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen

7.1 Algemene veiligheidsvoorschriften

Zie Instructie “Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBMs)”

LAB 22 I 017

ACN:

DAP / D:

EtAc:

EtOH:

H20:

HAc:

HCl:

LC-MS:

MeOH:

Acetonitrile

Dapsone

Ethylacetaat

Ethanol

Water

Azijnzuur

Waterstofchloride

Liquid Chromatography Mass Spectrometry

Methanol

MRL:

MRPL:

NaOH:

NH4OH:

Na2SO4:

PFPA:

PBM’s:

SUL / S:

TRIM / T:

TBME:

Maximum Residue Level

Minimum Required Performance Level

Natriumhydroxide

Ammoniak

Natriumsulfaat

Pentafluorpropionzuur

Persoonlijke beschermingsmiddelen

Sulfonamiden

Trimethoprim

Tertiair-butylmethyl-ether



LAB 22 I-MET 041 v.06 7/31

7.2 Algemene voorzorgsmaatregelen

- Om contaminatie tegen te gaan wordt voor elk monster schone hulpmiddelen gebruikt.

Onder schone hulpmiddelen wordt verstaan: hulpmiddelen die niet eerder gebruikt zijn

of die in een wasmachine of op een andere manier grondig zijn gereinigd.

- Het is meestal niet gekend of gebruikte standaarden afbreken onder invloed van

daglicht en/of wit kunstlicht. Vermijd daarom onnodig lang in het licht staan van stoffen

in oplossingen. Plaats de stoffen en oplossingen zo spoedig mogelijk na gebruik terug

op de voorziene plaats.

- De extractie met organische solventen dient bij voorkeur te gebeuren in een trekkast.

7.3 Specifieke voorzorgsmaatregelen

N.v.t.

8 Reagentia en hulpstoffen

Verwijzingen naar een product en/of fabrikant dienen enkel ter informatie en identificatie en

houden geen uitsluiting in van andere producten en/of fabrikanten die mogelijk ook voldoen.

Deze verwijzingen dienen om vergissingen te vermijden en het uitvoeren van bestellingen te

vereenvoudigen. De in de procedure vermelde reagentia en apparatuur kunnen aldus door

materiaal vervangen worden van minstens evenwaardige kwaliteit.

De houdbaarheid van zelfbereide oplossingen is 1 jaar bij kamertemperatuur, behalve indien

anders vermeld. De geschiktheid van gebruikte oplossingen, buffers en

standaardoplossingen wordt nagegaan aan de hand van ingebouwde borgingspunten en

langetermijnvalidatie. Indien hieraan voldaan wordt, wijst dit op de aanvaardbaarheid van

deze reagentia en toont dit eveneens aan dat de kwaliteit van de analyse gewaarborgd blijft.

Met ged. water wordt bedoeld: gedemineraliseerd water of water gereinigd over een

aquadem-installatie.

8.1 Standaardoplossingen (zie LAB 22 P 013)

8.1.1. M108: standaardmengsel SUL + TRIM (5 ng / µl in MeOH)

8.1.2. M109: standaardmengsel SUL + TRIM (1 ng / µl in MeOH)

8.1.3. M110: standaardoplossing sulfadimidine-d4, sulfadiazine-C13 en trimethoprim-d9

(10 - 25 ng / µl in MeOH)

8.1.4. M111: standaardoplossing sulfadimidine-d4, sulfadiazine-C13 en trimethoprim-d9

(1 - 2,5 ng / µl in MeOH)

8.1.5.

8.1.6.

8.1.7. M167 : standaardmengsel dapsone (5 ng / µl in MeOH)



LAB 22 I-MET 041 v.06 8/31

8.1.8. M168 : standaardmengsel dapsone (1 ng / µl in MeOH)

8.2 Reagentia en solventen

8.2.1. Aceton (01-0045-00068)

8.2.2. Watervrij Na2SO4 (01-0716-01000)

8.2.3. HCl 0,1 M (01-0290-00451)

8.2.4. Iso-octaan (01-0315-00506)

8.2.5. LC-MS methanol (01-0369-00578)

8.2.6. LC-MS water (01-0700-01145)

8.2.7. Acetonitrile voor LC-MS (ACN) (01-0046-00078)

8.2.8. Pentafluorpropionzuur (PFPA) (01-0474-00723)

8.2.9. Ammoniakoplossing 25% (01-0062-00107)

8.2.10. Ged. H2O

8.2.11. Tertiair-butylmethyl-ether (TBME) (01-0637-01047)

8.2.12. HCl 37% (01-0290-00461)

8.2.13. NaOH 32% (01-0603-00975)

8.2.14. Natriumacetaat (01-0585-00924)

8.2.15. Glycerol (01-0270-02076)

8.2.16. Ethylacetaat (01-0243-00364)

8.2.17. Azijnzuur HAc (01-0043-02093)

8.3 Oplossingen

8.3.1. 5 % ACN in PFPA-oplossing 10 mM pH 4

3,28 g (+ 0,1g) PFPA (8.2.11.) afwegen in een beker van 2000 ml (8.4.4.), aanlengen

met LC-MS water (8.2.6.) tot ongeveer 1500 ml en homogeniseren. Op pH 4 (+ 0,2)

brengen met NH4OH 2M (8.3.2.), 78,1 g (+ 0,1g) ACN (8.2.7.) toevoegen en

overbrengen in een maatkolf van 2000 ml (8.4.3.). Aanlengen tot de ijkstreep met LC-

MS water (8.2.6.) en homogeniseren.

8.3.2. NH4OH 2M

- breng 150 ml ammoniakoplossing 25% (8.2.9.) in een maatkolf van 1000 ml (8.4.3.)

- leng aan met LC-MS water (8.2.6.) tot 1000 ml en homogeniseer

8.3.3. Glyceroloplossing 10% in methanol

- 100 ml glycerol (8.2.15.) in een maatkolf van 1000 ml (8.4.3.) brengen



LAB 22 I-MET 041 v.06 9/31

- leng aan tot de ijkstreep met LC-MS MeOH (8.2.5.)

8.3.4. HCl 0,01 M

- breng 30 ml LC-MS H2O (8.2.6.) in een maatkolf van 100 ml (8.4.3.)

- voeg 10 ml HCl 0,1 M (8.2.3.) toe

- leng aan met LC-MS H2O (8.2.6.) tot 100 ml en homogeniseer

8.3.5. Natriumacetaatoplossing 5 M

- weeg 41,02 g natriumacetaat (8.2.14) af

- los geleidelijk de afgewogen hoeveelheid op in een maatbeker van 100 ml (8.4.4.)

gevuld met 80 ml LC-MS H2O (8.2.6.)

- giet over in een maatkolf van 100 ml (8.4.3.) en leng aan met LC-MS H2O (8.2.6.) tot

100 ml en homogeniseer

8.3.6. HCl 2 M

- breng 300 ml H2O (8.2.6.) in een maatkolf van 1000 ml (8.4.3.)

- voeg 166 ml HCl 37% (8.2.12.) toe

- leng aan met H2O (8.2.6.) tot 1000 ml en homogeniseer

8.4 Glaswerk

8.4.1. Glazen autosamplerflesjes (vials) (02-0074-00331)

8.4.2. Glazen flesjes met schroefdop (40 ml) (02-0027-01277)

8.4.3. Maatkolven

8.4.4. Maatbekers

8.4.5. Glazen kolfjes 100 ml

8.4.6. Pyrexbuisjes 12x75 mm (02-0063-01398)

8.4.7. Pyrexbuisjes 13x100 mm (02-0063-00122)

8.5 Klein materiaal

8.5.1. Spatel, scalpel, vleesplank en papieren handdoekrol

8.5.2. Micropipetten met eurotips

8.5.3. Multipette systeem met combitips

8.5.4. Lange pipettips (02-0065-01416)

8.5.5. Stomacherzakken (02-0003-01167)

8.5.6. centrifugeerbuizen 50 ml (02-0009-01200)

8.5.7. centrifugeerbuizen 15 ml (02-0009-01201)

8.5.8. Plooifilters (02-0044-01342)



LAB 22 I-MET 041 v.06 10/31

8.5.9. LC-kolom: Waters Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm 2,1 x 100 mm (02-0011-01236)

8.5.10. Centrifugeerbuisje 0,5 ml (02-0051-01370)

8.5.11. Chem-Elut 1010 kolom (02-0010-01202)

8.5.12. Centrifugeerbuisje 2 ml (02-0051-01373)

8.5.13. PP microvial voor LC-MS (02-0040-01328)

8.5.14. PP insert en schroefdop met septum (02-0007-01189 tot 02-0007-01194)

9 Toestellen

9.1. Moulinette-mixer

9.2. Bovenweger

9.3. Vortex

9.4. Stomachertoestel

9.5. Centrifuge

9.6. Ultracentrifuge

9.7. LC-MS

9.8. Schudtoestel

9.9. Diepvriezer ‘Ultra Low Freezer’

9.10. Ultrasoonbad

9.11. Rotavapors

9.12. Indampsysteem: turbovap

9.13. Analytische balans

9.14. pH-meter

9.15. Warmwaterbad

10 Werkwijze

10.1 Extractie en opzuivering

10.1.1 Voorbereiding monsters en controlemonsters

Alle monsters worden ingeschreven op het werkblad “Inschrijvingsblad ” LAB 22 F 022.

Malen en afwegen van de monsters: zie instructie ‘‘Monstervoorbereiding voor de sectie

R&C’’ LAB 22 I 011.

10.1.1.1 Monsters

Weeg 3 g gemalen vlees af in een centrifugeerbuis van 50 ml (8.5.6.) op de bovenweger

(9.2).

Weeg 10 g gemalen vlees, lever of nier af in een stomacherzakje (8.5.5.) op de bovenweger

(9.2).

Weeg 5 g voeder af in een glazen flesje met schroefdop (8.4.2.) op de bovenweger (9.2).



LAB 22 I-MET 041 v.06 11/31

Weeg 5 g honing af in een centrifugeerbuis van 50 ml (8.5.6.) op de bovenweger (9.2).

Pipetteer 1 ml melk af in een centrifugeerbuis van 50 ml (8.5.7.)

Voor melkpoeder: weeg 1 g melkpoeder af in een centrifugeerbuis van 50 ml (8.5.6.) op de

bovenweger (9.2).

Weeg 1 g gehomogeniseerd ei of afgeleide producten van melk af in een centrifugeerbuis van

50 ml (8.5.6.) op de bovenweger (9.2).

10.1.1.2 Controlemonsters

Screening

Bij het uitvoeren van een screening wordt per reeks minstens 1 belast controlemonster op de

MRL of rapporteringslimiet meegenomen meegenomen op niveau van de rapporteringsgrens

voor verboden stoffen en voor MRL-verbindingen op een niveau lager dan de MRL. Voor de

MRL-verbindingen wordt nog een extra belast monster op 1/5 van de MRL meegenomen, dit

omdat men er vanuit gaat dat er maximum 5 verschillende sulfonamiden kunnen voorkomen

in één monster.

Per controlemonster wordt op een bovenweger (9.2.) de benodigde hoeveelheid blanco

monster, zoals weergeven in 10.1.1.1, afgewogen.

Onderstaand schema wordt gevolgd voor de belasting van de controlemonsters.

Bevestiging

Bij het uitvoeren van een bevestiging kunnen naargelang het ingeschat gehalte meerdere

belaste monsters meegenomen worden.

Matrix

Belast controlemonster

Vlees,

lever en

nier

*20 ppb S + T/ 5 ppb D

*100 ppb SUL / 25 ppb DAP

+ 40 µl M108 (5ng/µl) + 10 µl M167 (5ng/µl)

+ 200 µl M108 (5ng/µl) + 50 µl M167(5ng/µl)

Vlees

*20 ppb S + T / 5 ppb D

+ 60 µl M109 (1ng/µl) + 15 µl M168 (1ng/µl)

Ei *5 ppb S + T + D + 5 µl M109(1ng/µl) + 5 µl M168 (1 ng/µl)

Melk en

kaas

*20 ppb S + T/ 5 ppb D

*100 ppb SUL / 25 ppb DAP

+ 20 µl M109 (1ng/µl) + 5 µl M168 (1 ng/µl)

+ 100 µl M109 (1ng/µl) + 25 µl M168 (1 ng/µl)

Honing *20 ppb S + T + D + 20 µl M108 (5 ng/µl) + 20 µl M167(5 ng/µl)

Voeder

*50 ppb S + T + D

+ 50 µl M108 (5 ng/µl) + 50 µl M167 (5 ng/µl)



LAB 22 I-MET 041 v.06 12/31

Bij een kwantitatieve bevestiging dient de ijklijn minstens 5 belaste monsters te bevatten.

Hierbij is het aangeraden een belast monster mee te nemen op het niveau van de MRL.

Het hoogste punt van de ijklijn moet groter dan of gelijk zijn aan de CCα. Doorgaans wordt

voor het hoogste punt een concentratie gekozen die gelijk is aan 2 maal de MRL.

10.1.1.3 Blanco monsters

Screening

Bij het uitvoeren van een screening wordt per matrix en per reeks minimum 1 blanco monster

meegenomen. Weeg de benodigde hoeveelheid blanco monster, zoals weergeven in

10.1.1.1, af op de bovenweger (9.2.).

Bevestiging

Bij het uitvoeren van een bevestiging kunnen worden per reeks en per matrix minimum 2

meerdere blanco monsters meegenomen worden; verdachte monsters worden in de

analyseserie tussen 2 blanco monsters en/of solventen gezet.

10.1.1.4 Monsters, controlemonsters en blanco monsters

Screening

Aan alle analysemonsters (monsters, controlemonsters en blanco monsters) inwendige

standaard sulfadimidine-d4 M110 (10 - 25 ng/µl) (8.1.3.) of sulfadimidine-d4 M111 (1 – 2,5

ng/µl) (8.1.4.) toevoegen, volgens onderstaand schema.

Matrix Belasting met M110 (10-25 ng/µl) of M111 (1-2,5 ng/µl)

Voeder 25 µl M110

Vlees, lever en nier 20 µl M110

Vlees 60 µl M111

Honing 10 µl M110

Melk en kaas 10 µl M110

Ei 10 µl M111

Bevestiging

Om het gehalte van een eventueel aanwezige stof beter te kunnen inschatten, wordt bij een

bevestiging de overeenkomstige gedeutereerde stof, indien deze voorhanden is, toegevoegd

en gemeten.



LAB 22 I-MET 041 v.06 13/31

10.1.2 Extractie en opzuivering in voeder (Flow-chart zie LAB 22 I-MET 041 D001)

- 5 g watervrij Na2SO4 (8.2.2.) toevoegen

- 25 ml aceton (8.2.1.) toevoegen

- vortexen (9.3.)

- 30 min schudden met schudtoestel (9.8.)

- 2 ml uitnemen in centrifugeerbuisje (8.5.12.) van 2 ml

- 15 min centrifugeren in ultracentrifuge (9.6.) op 12500xg

- 1 ml overbrengen in pyrex buisje 12 x 75 mm (8.4.6.) en indampen (9.12.) in turbovap

- 400 µl HCl 0,01 M (8.3.4.) toevoegen

- 1 ml iso-octaan (8.2.4.) toevoegen

- vortexen (9.3.)

- 15 min centrifugeren (9.5.) op 2700xg

- 130 µl uit onderste fase overnemen met lange pipettip (8.5.4.) in microvial voor LC-MS (8.5.13.)

en injecteren in LC-MS

10.1.3 Extractie en opzuivering in vlees, lever en nier (Flow-chart LAB 22 I-MET 041

D002)

- + 30 ml ged. H2O (8.2.10.)

- extraheren met behulp van stomacher gedurende 2 min bij 230 tpm (9.4.)

- 2 ml extract overnemen in centrifugeerbuis 2 ml (8.5.12.)

- ultracentrifugeren gedurende 15 min bij 12500xg (9.6.)

- 1 ml uitnemen in pyrex buis 13 x 100 mm (8.4.7.)

- 4 ml TBME toevoegen (8.2.11.)

- goed vortexen (9.3.)

- krachtig schudden met de hand en onmiddellijk in ultrasoonbad (9.10.) plaatsen voor 10 min,

tussendoor 2 maal krachtig schudden.

- centrifugeren gedurende 15 min bij 2700xg (9.5.)

- bevriezen in ‘Ultra Low Freezer’ (9.9.) tot bevriezen onderste fase

- bovenste, niet bevroren, fase overgieten in andere pyrexbuis 12 x 75 mm (8.4.6.)

- indampen (9.12.) in turbovap

- 500 µl HCl 0,01 M (8.3.4.) toevoegen aan het residu en vortexen (9.3.)

- 1 ml iso-octaan (8.2.4.) toevoegen en vortexen (9.3.)




10.1.4 Extractie en opzuivering in honing (Flow-chart zie LAB 22 I-MET 041 D003)

- + 5 ml HCl 2 M (8.3.6.)



LAB 22 I-MET 041 v.06 14/31


- 30 min laten staan in een warmwaterbad van ± 50°C (9.15) en vortexen om de 10 minuten

- 5 min centrifugeren (9.5.) op 2700xg

- supernatans overbrengen in andere centrifugeerbuis van 50 ml (8.5.6.)

- op pH 4,5 brengen (9.14.) met

- 1°) enkele druppels NaOH 32% (8.2.13.)

- 2°) natriumacetaat 5M (8.3.5.)

- let op: het totaal volume vloeistof in de centrifugeerbuis mag niet meer zijn dan 10 ml

- extract op Chem Elut kolom van 10 ml (8.5.11.) brengen

- 10 min laten optrekken

- elueren met 3 x 8 ml TBME (8.2.11.) en opvangen in glazen kolfje van 100 ml (8.4.5.)

- 250 µl glycerol 10% (8.3.3.) toevoegen

- indampen met rotavapor (9.11.)

- kolfje naspoelen met 2 ml TBME (8.2.11.), residu losmaken in ultrasoonbad (9.10.) en

overnemen in pyrex buis 12 x 75 mm (8.4.6.)


- droogrest heroplossen in 500 µl HCl 0,01 M (8.3.4.) en vortexen (9.3.)


- 15 min centrifugeren (9.5.) bij 2700xg



10.1.5 Extractie en opzuivering in melk en kaas (Flow-chart zie LAB 22 I-MET 041

D004)

- 0,7 g watervrij Na2SO4 (8.2.2.) toevoegen

- vortexen (9.3.), tot goed gemengd !


- vortexen (9.3.)

- 15 min schudden op schudtoestel (9.8.)


- bevriezen in ‘Ultra Low Freezer’ (9.9.) tot bevriezen onderste fase, ± 20 minuten

- iso-octaan afgieten, onderste fase laten ontdooien en verder werken met de onderste fase

- 3 ml ethylacetaat (8.2.16.) toevoegen

- 0,17 ml HCl 0,1M (8.2.3.) toevoegen

- vortexen (9.3.)

- 5 minuten in het ultrasoonbad (9.10.)

- vortexen (9.3.)


- 1 ml supernatans overnemen in een pyrex buis 12 x 75 mm (8.4.6.)



LAB 22 I-MET 041 v.06 15/31


- droogrest heroplossen in 500 µl HCl 0,01 M (8.3.4.)

- vortexen (9.3.)


- vortexen (9.3.)




10.1.6 Extractie en opzuivering in eieren (Flow-chart zie LAB 22 I-MET 041 D005)

- 3 g watervrij Na2SO4 (8.2.2.) toevoegen

- vortexen (9.3.), tot goed gemengd !

- 25 ml acetonitrile (8.2.7.) toevoegen

- 1 min vortexen (9.3.)

- 10 min schudden op schudtoestel (9.8.)


- supernatans afgieten over plooifilter (8.5.8.) in kolfje van 100 ml (8.4.5.)

- indampen met rotavapor (9.11.)

- heroplossen in 2 x 1 ml aceton (8.2.1.), losmaken in ultrasoonbad (9.10.) en overbrengen in

pyrex buis 12 x 75 mm (8.4.6.)


- droogrest heroplossen in 500 µl HCl 0,01 M (8.3.4.) en vortexen (9.3.)



- als de onderste fase troebel is: overnemen in centrifugeerbuisje 0,5 ml (8.5.10.) en 15 min

ultracentrifugeren (9.6.) bij 12500xg



10.1.7 Extractie en opzuivering in vlees (Flow-chart zie LAB 22 I-MET 041 D 008)

- 30 ml ged. H2O (8.2.10.) toevoegen

- 30 min. schudden (9.8.)

- centrifugeren gedurende 5 min. bij 2700xg (9.5.)

- 500 µl van het extract overnemen in een centrifugeerbuisje van 2 ml (8.5.12.)

- 500 µl iso-octaan (8.2.4.) toevoegen


- ultracentrifugeren gedurende 15 min. bij 12000xg (9.6.)

- 200 µl van de onderste fase overnemen in een pyrexbuis 13 x 100 mm (8.4.7.)

- 2 ml TBME (8.2.11.) toevoegen



LAB 22 I-MET 041 v.06 16/31

- goed vortexen (9.3.) en krachtig schudden met de hand, onmiddellijk in ultrasoonbad (9.10.)

plaatsen voor 10 min, tussendoor 2 maal krachtig schudden.


- bevriezen in ‘Ultra Low Freezer’ (9.9.) tot bevriezen onderste fase

- bovenste, niet bevroren, fase overgieten in andere pyrexbuis 13 x 100 mm (8.4.7.)

- 100 µl glycerol 10% (8.3.3.) toevoegen

- indampen in turbovap (9.12.)

- 20 µl LC-MS MeOH (8.2.5.) toevoegen aan het residu en vortexen (9.3.)

- 180 µl HCl 0,01 M (8.3.4.) toevoegen en vortexen (9.3)

- alles overnemen met lange pipettip (8.5.4.) in microvial voor LC-MS (8.5.13.) en injecteren in

LC-MS

10.2 LC-MS Analyse

10.2.1 Standaardvoorbereiding

Een standaardmengsel met een concentratie van 0,01ng/µl wordt in een glazen

autosamplerflesje (8.4.1.) bereid als volgt:

- 10 µl M109 (8.1.2.)

- 10 µl M168 (8.1.8.)

- 10 µl M111 (8.1.4.)

- 970 µl 0,01 M HCl (8.3.4.)

vortexen (9.3.) en overbrengen in microvial voor LC-MS (8.5.13.) met lange pipettip (8.5.4.)

10.2.2 Instellingen LC-parameters

Kolom HPLC: Waters Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm 2,1 x 100 mm (8.5.9.)

Solventen: ACN (8.2.7.)

5% ACN in PFPA 10 mM (pH 4) (8.3.1.)

Injectievolume : 10 µl

Kolomtemperatuur: 50 °C

HPLC-setup: zie methode C:\Xcalibur:\methods:\ESI_SUL

10.2.3 Instellingen MS-parameters

De analyse gebeurt in de ESI-mode. Acquisitie gebeurt in MS2 in de positieve mode met de

methode ESI_SUL.



LAB 22 I-MET 041 v.06 17/31

De instellingen voor de ESI en de acquisitie zijn vermeld in deze methode.

LAB 22 I-MET 041 L007 geeft een overzicht van de kenmerkende ionen van de gezochte

componenten.

Een voorbeeld van het LC-MSn chromatogram is terug te vinden onder LAB 22 I-MET 041

D006.

10.2.4 Criteria analysesysteem

Vóór elke bepaling moet gecontroleerd worden of het systeem in orde is a.d.h.v. de

begeleidende controlelijst “Kwaliteitsborging MS” (LAB 22 F 027) welke dient ingevuld te

worden.

De druk van het systeem in de beginomstandigheden wordt genoteerd op deze controlelijst

“Kwaliteitsborging MS” (LAB 22 F 027). De druk moet gecontroleerd worden om het risico van

stilvallen van het systeem te vermijden. Een richtwaarde voor de maximum begindruk voor

deze analyse is 600 bar. Een hogere druk wijst waarschijnlijk op verstopping van de prekolom

of kolom, deze kan dan eventueel vervangen worden.

Injecteer bovenstaand standaardmengsel (10.2.1) en controleer de geschiktheid van het

systeem voor analyse aan de hand van het document criteria voor LC-MS (zie log LC-MS).

Het chromatogram van de standaard die vooraf werd geïnjecteerd, wordt aan de checklist

bevestigd.

Voor de goedkeuring van het systeem voor gebruik worden de initialen genoteerd op de

begeleidende controlelijst “Kwaliteitsborging MS” (LAB 22 F 027).

10.2.5 Analysevolgorde

De analysevolgorde wordt vermeld op de analyselijst voor elk systeem. Elke run start met

injectie van tenminste 1 maal de standaard alvorens de monsters te analyseren. Na injectie

van de standaard volgt steeds injectie van solvent om contaminatie vanuit het

standaardmengsel te voorkomen en te controleren of er geen overdracht is in het systeem.

Blanco monsters en De belaste monsters worden bij voorkeur ofwel voor een standaard ofwel

op het einde van de reeks geanalyseerd.

Na een analysereeks wordt solvent geïnjecteerd met de methode “”STOP” waarbij alle flows

geminimaliseerd worden.

11 Kwaliteitscontrole

11.1 Criteria analyseserie

11.1.1 Solvent



LAB 22 I-MET 041 v.06 18/31

Bij injecties van solvent moeten de analyt(en) afwezig zijn: de intensiteit van de analyt(en)

mag niet groter zijn dan 5% van de intensiteit van de analyt(en) in het belaste monster op de

actielimiet.

11.1.2 Blanco monsters

De intensiteit van de inwendige standaard moet minstens op de helft aanwezig zijn van de

intensiteit van de inwendige standaard in het belast controlemonster. De opgespoorde

analyt(en) moeten afwezig zijn:

- Screening: de relatieve intensiteit van de analyt(en) moet kleiner zijn dan de relatieve

intensiteit van de analyt(en) in het belaste monster op de actielimiet.

- Bevestiging: de relatieve intensiteit van de analyt(en) mag niet groter zijn dan 1% van de

relatieve intensiteit van de analyt(en) in het belaste monster op de actielimiet.

11.1.3 Controlemonsters en standaarden

In belaste controlemonsters en standaarden moeten de opgespoorde analyt(en) en de

inwendige standaard teruggevonden worden met een S/N ≥ 6 op zicht.

De resultaten worden bijgehouden in controlekaarten, terug te vinden onder

M:\R&C\Controlekaarten\LC-MS.

11.1.4 Monsters

In monsters moet de inwendige standaard teruggevonden worden op minstens de helft van

het niveau in het belaste controlemonster op de actielimiet.

11.1.5 Identificatiecriteria

Voor de identificatiecriteria wordt verwezen naar de publicatie 2002/657/EG; pagina L221/16

en L221/17 (LAB 22 D 049).

11.1.6 Criterium voor goedkeuring calibratiecurve bij bevestiging MRL-verbindingen

De correlatiecoëfficiënt R² moet groter dan of gelijk zijn aan 0,98.

Indien hieraan niet voldaan is, moet er eerst overlegd worden, alvorens de serie goed te

keuren.

11.1.7 Criteria voor goedkeuring gehele serie

Aan de hand van de vastgestelde criteria 11.1.1. t.e.m. 11.1.56. besluit de analist, zo nodig in

overleg, of de serie goedgekeurd wordt en parafeert hiervoor op de controlelijst (LAB 22 F

027).



LAB 22 I-MET 041 v.06 19/31

Indien de borgingspunten van de serie niet voldaan zijn, moet nagegaan worden wat de

oorzaak is en welke maatregelen getroffen moeten worden. Deze worden vermeld op de

controlelijst (LAB 22 F 027).

Afkeuring van de gehele serie houdt automatisch in dat de gehele serie opnieuw moet

worden opgewerkt. Daarnaast kan, ondanks dat bv. een monster niet goedgekeurd wordt, de

serie als zodanig wel goedgekeurd worden.

In dat geval worden enkel de afgekeurde monsters opnieuw opgezet.

12 Berekening en rapportering

12.1 Monsters die opnieuw moeten worden opgezet

Monsters waarvan de borgingscriteria niet voldaan zijn en opnieuw moeten worden opgezet,

worden vermeld op de controlelijst “Kwaliteitsborging MS” (LAB 22 F 027) en genoteerd voor

heranalyse op het “Inschrijvingsblad” (LAB 22 F 022)

12.2 Interpretatie resultaten

12.2.1 Screening

Een monster wordt beoordeeld als “conform” :

- voor verboden stoffen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van de analyt /

signaal inwendige standaard) kleiner is dan dat van het belaste controlemonster op

de actielimiet (= rapporteringslimiet).

- voor MRL-verbindingen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van de analyt /

signaal inwendige standaard) kleiner is dan dat van het belaste controlemonster op

de helft van de MRL

Een monster wordt beoordeeld als “verdacht”:

- voor verboden stoffen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van het analyt /

signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het belaste

controlemonster op de actielimiet (= rapporteringslimiet).

- voor MRL-verbindingen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van het analyt /

signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het belaste

controlemonster op de helft van de MRL.

Verdachte monsters moeten opnieuw geanalyseerd worden (bevestiging).

Voor MRL-verbindingen moet er voor bevestiging in de analyseserie een ijklijn, bestaande uit

minimum 5 punten, meegenomen worden, zie 10.1.1.2 voor verdere instructies.

Opmerking: voor verboden stoffen kan ook gerapporteerd worden op basis van een eerste

analyse, wanneer voldaan is aan de identificatiecriteria (zie punt 11.1.5)



LAB 22 I-MET 041 v.06 20/31

12.2.2 Bevestiging

Verboden stoffen

Een monster wordt beoordeeld als “niet-conform” als het relatief signaal van de analyt

(signaal van het analyt / signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het

belaste controlemonster op de actielimiet (= rapporteringslimiet) en als het voldoet aan de

criteria volgens beschikking 2002/657/EG (zie punt 11.1.5).

MRL-verbindingen

Indien aan de identificatiecriteria (zie 11.1.5) en het criterium voor de calibratiecurve (zie

11.1.6) voldaan is, wordt het monster gerapporteerd voor de gevonden stof indien het gehalte

groter dan of gelijk is aan het gehalte van het laagste punt ( laagste belast controlemonster

bv. ¼ van de MRL) van de calibratiecurve. De rapportering gebeurt op basis van de waarden

bekomen met de calibratiecurve.

De gehaltes worden afgerond tot op 2 beduidende cijfers voor gehaltes kleiner dan 100 ppb

en tot op 3 beduidende cijfers voor gehaltes vanaf 100 ppb.

Indien het gehalte groter is dan het hoogste punt (hoogst belast controlemonster) van de

calibratiecurve dan wordt als gehalte gerapporteerd ‘ > concentratie hoogste punt ’ bv. indien

het hoogste punt van de calibratiecurve een concentratie van 200 ppb heeft wordt ‘ > 200ppb’

als concentratie gerapporteerd.

Een monster wordt als ‘conform’ beoordeeld wanneer de concentratie van de analyt kleiner is

dan de CCα.

Een monster wordt als ‘niet-conform’ beoordeeld wanneer de concentratie van de analyt

groter dan of gelijk is aan de CCα.

De waarde van CCα is terug te vinden in Vmap 041 alsook in de scope 014-TEST.

Bij niet-conforme monsters wordt ter informatie de waarde van de CCα en eventueel de MRL

meegedeeld op het verslag.

12.3 Rapportering en inschrijving

De rapportering gebeurt zoals beschreven onder punt 12.2

De rapportering en inschrijving van resultaten gebeurt zoals beschreven in de

procedure “Monsterbeheer” ( LAB 22 P 007)



LAB 22 I-MET 041 v.06 21/31

13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten,

formulieren of lijsten.

13.1 Bijlagen

LAB 22 I-MET 041 D001: Flow-chart: Bepaling van sulfonamiden,en dapsone en trimethoprim

in voeder met LC-MS


in vlees, lever en nier met LC-MS


in honing met LC-MS


in melk en kaas met LC-MS


in eieren met LC-MS

LAB 22 I-MET 041 D006: Voorbeeld LC-MSn chromatogram

LAB 22 I-MET 041 D008: Flow-chart: Bepaling van sulfonamiden, dapsone en trimethoprim in

vlees met LC-MS

13.2 Procedures

LAB 22 P 013: “Aanmaak en beheer van standaarden”.

LAB 22 P 007: “Monsterbeheer”

13.3 Instructies

LAB 22 I 017: “Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBMs)”

LAB 22 I 011: Instructie ‘‘Monstervoorbereiding voor de sectie R&C’’

13.4 Formulieren, lijsten en documenten

LAB 22 F 009: Scope R&C



LAB 22 I-MET 041 v.06 22/31

014-TEST: scope FAVV

LAB 22 F 027: Controlelijst ‘‘Kwaliteitsborging MS’’

LAB 22 F 022: Inschrijvingsblad

LAB 22 I-MET 041 L007: “Sulfonamiden: overzicht van de retentietijden en kenmerkende

ionen”

LAB 22 D 049: Copie L221/16-L221/17 van 2002/657/EG

BEPALING VAN SULFONAMIDEN EN DAPSONE MET LC-MS

Flow-chart: Bepaling van sulfonamiden,en dapsone en trimethoprim in voeder

met LC-MS

DATUM VAN TOEPASSING: 2014-11-20

LAB 22 I-MET 041 D001 v.06 23/31

Blanco monster:

5 g blanco matrix afwegen in

glazen flesje (40 ml) met

schroefdop

Belaste monsters:

5 g blanco matrix afwegen in glazen flesje (40 ml) met schroefdop

* 50 ppb S + T + D: + 50 µl M108 (5 ng/µl) + 50 µl M167 (5 ng/µl)

Monster:

5 g matrix afwegen in

glazen flesje (40 ml) met

schroefdop

+ 25 µl M110 (10-25 ng/µl)

+ 5 g watervrij Na2SO4

+ 25 ml aceton

vortexen

30 min schudden

2 ml uitnemen in centrifugeerbuisje van 2 ml

15 min centrifugeren in ultracentrifuge 12500xg

1 ml overbrengen in gemerkt pyrex buisje (12 x 75 mm)

Indampen in turbovap

+ 400 µl HCl 0,01 M

+ 1 ml iso-octaan

vortexen

15 min centrifugeren bij 2700xg

130 µl uit onderste fase overnemen met lange pipettip in microvial voor LC-MS en injecteren in LC-MS


Flow-chart: Bepaling van sulfonamiden,en dapsone en trimethoprim in vlees, lever en

nier met LC-MS


LAB 22 I-MET 041 D002 v.06 24/31

Blanco monster:

10 g gemalen blanco matrix

afwegen in stomacherzakje

Belaste monsters:

10 g gemalen blanco matrix afwegen in stomacherzakje

* 20 ppb S +T / 5 ppb D: + 40 µl M108 (5 ng/µl)+ 10 µl M167 (5 ng/µl)

* 100 ppb SUL / 25 ppb DAP: + 200 µl M108 (5 ng/µl) 50 µl M167 (5 ng/µl)

Monster:

10 g gemalen matrix

afwegen in

stomacherzakje

+ 20 µl M110 (10-25 ng/µl)

+ 30 ml ged. H2O

extraheren m.b.v. stomacher gedurende 2 min bij ± 230 tpm

2 ml extract overnemen in centrifugeerbuisje van 2 ml

15 min ultracentrifugeren bij 12500xg

1 ml uitnemen in pyrexbuis 13 x 100 mm

+ 4 ml TBME

goed vortexen en krachtig schudden met de hand, onmiddellijk 10 min in het ultrasoonbad en tussendoor 2 x krachtig schudden


bevriezen in ‘Ultra Low Freezer’ tot bevriezen onderste fase

bovenste, niet bevroren, fase overgieten in andere pyrexbuis 12 x 75 mm

indampen in turbovap

+ 500 µl HCl 0,01 M

vortexen

+ 1 ml iso-octaan

vortexen




Flow-chart: Bepaling van sulfonamiden,en dapsone en trimethoprim in honing

met LC-MS


LAB 22 I-MET 041 D003 v.06 25/31

Blanco monster:


centrifugeerbuis 50 ml

Belaste monsters:

5 g blanco matrix afwegen in centrifugeerbuis 50 ml

* 20 ppb S +T+ D : + 20 µl M108 (5 ng/µl)+ 20 µl M167 (5 ng/µl)

Monster:



+ 10 µl M110 (10-25 ng/µl)

+ 5 ml HCl 2 M

goed vortexen en daarna 30 min laten staan in warmwaterbad bij ± 50°C en vortexen om de 10 min


supernatans overbrengen in andere centrifugeerbuis van 50 ml

op pH 4,5 brengen met

extract op Chem Elut kolom van 10 ml brengen

1°) enkele druppels NaOH 32%

2°) natriumacetaat 5M

Let op: totaal volume in centrifugeerbuis < 10 ml !

10 min laten optrekken

elueren met 3 x 8 ml TBME en opvangen in glazen kolfje van 100 ml

+ 250 µl glycerol 10 %

indampen met rotavapor

+ 2 ml TBME

losmaken in ultrasoonbad en overnemen in pyrexbuis 12 x 75 mm

indampen

+ 500 µl HCl 0,01 M

vortexen

+ 1 ml iso-octaan


Flow-chart: Bepaling van sulfonamiden,en dapsone en trimethoprim in honing

met LC-MS


LAB 22 I-MET 041 D003 v.06 26/31

vortexen




Flow-chart: Bepaling van sulfonamiden,en dapsone en trimethoprim in melk en kaas

met LC-MS


LAB 22 I-MET 041 D004 v.06 27/31

Blanco monster:

1 ml blanco matrix pipetteren in

centrifugeerbuis 50 ml of

1 g blanco matrix afwegen in een


Belaste monsters:

1 ml blanco matrix pipetteren in centrifugeerbuis 50 ml of

1 g blanco matrix afwegen in een centrifugeerbuis 50 ml

* 20 ppb S +T / 5 ppb D: + 20 µl M109 (1 ng/µl)+ 5 µl M168 (1 ng/µl)

* 100 ppb SUL /25 ppb DAP: + 100 µl M109 (1 ng/µl)+ 25 µl M168 (1 ng/µl)

Monster:

1 ml matrix pipetteren in

centrifugeerbuis 50 ml of

1g matrix afwegen in een


+ 10 µl M110 (10-25 ng/µl)

+ 0,7 g watervrij Na2SO4

vortexen

vortexen

15 min schudden


bevriezen in ‘Ultra Low Freezer’ tot bevriezen onderste fase, ± 20 min

iso-octaan afgieten, onderste fase laten ontdooien en verder werken met onderste fase

+ 3 ml ethylacetaat

+ 0,17 ml HCl 0,1 M

vortexen

5 min in ultrasoonbad

vortexen


1 ml supernatans overnemen in pyrex buisje 12 x 75 mm


+ 500 µl HCl 0,01 M

vortexen

+ 2 ml iso-octaan

Vortexen

+ 10 ml iso- octaan


Flow-chart: Bepaling van sulfonamiden,en dapsone en trimethoprim in melk en kaas

met LC-MS


LAB 22 I-MET 041 D004 v.06 28/31




Flow-chart: Bepaling van sulfonamiden,en dapsone en trimethoprim in eieren

met LC-MS


LAB 22 I-MET 041 D005 v.06 29/31

Blanco monster:



Belaste monsters:

1 g blanco matrix afwegen in centrifugeerbuis 50 ml

* 5 ppb S + T+ D: + 5 µl M109 (1 ng/µl)+ 5 µl M168 (1 ng/µl)

Monster:



+ 10 µl M111 (1-2,5 ng/µl)

+ 3 g watervrij Na2SO4

vortexen, tot goed gemengd !

+ 25 ml acetonitrile

1 min vortexen

10 min schudden


supernatans afgieten over plooifilter in kolfje van 100 ml

indampen met rotavapor

+ 2 x 1 ml aceton

losmaken in ultrasoonbad en overnemen in pyrexbuis 12 x 75 mm

indampen in indampcentrifuge

+ 500 µl HCl 0,01 M

vortexen

+ 2 ml iso-octaan

vortexen


Als onderste fase troebel is: overnemen in centrifugeerbuisje 0,5 ml en 15 min ultracentrifugeren bij 12500xg



Flow-chart: Bepaling van sulfonamiden, dapsone en trimethoprim in vlees

met LC-MS


LAB 22 I-MET 041 D008 v.06 30/31

Blanco monster:

3 g gemalen blanco matrix

afwegen in

centrifugeerbuis van 50 ml

Belaste monsters:

3 g gemalen blanco matrix afwegen in een centrifugeerbuis van 50 ml

* 20 ppb S +T / 5 ppb D: + 60 µl M109 (1 ng/µl) + 15 µl M168 (1 ng/µl)

Monster:

3 g gemalen matrix afwegen

in centrifugeerbuis van 50 ml

+ 60 µl M111 (1- 2,5 ng/µl)

+ 30 ml ged. H2O

30 min schudden

5 min. centrifugeren bij 2700xg

500 µl extract overnemen in centrifugeerbuisje van 2 ml

+ 500 µl iso-octaan

goed vortexen

15 min ultracentrifugeren bij 12000xg

200 µl van de onderste fase overnemen in pyrexbuis 13 x 100 mm

+ 2 ml TBME

goed vortexen en krachtig schudden met de hand, onmiddellijk 10 min in het ultrasoonbad en tussendoor 2 x krachtig

schudden


bevriezen in ‘Ultra Low Freezer’ tot bevriezen onderste fase

bovenste, niet bevroren, fase overgieten in andere pyrexbuis 13 x 100 mm


+ 20 µl LC-MS MeOH

vortexen

vortexen

Alles overnemen in een microvial voor LC-MS en injecteren in LC-MS

+ 180 µl HCl 0,01 M

+ 100 µl glycerol 10%


Voorbeeld van LC-MS chromatogram


LAB 22 I-MET 041 D006 v.06 31/31

LAB 22 I-MET 041 L007_Sulfonamiden: overzicht kenmerkende ionen en retentietijden

Versie: 5

Datum van toepassing: 20/11/2014

Analyt Parent ion Indicatieve RT (min.)

Indicatieve RRT

t.o.v. Sulfadimidine-d4

Indicatieve RRT

t.o.v. Sulfadiazine-C13

Indicatieve RRT

t.o.v. Trimethoprim-d9 Diagnostische ionen in MS2

Sulfadiazine-C13 (IS) 257 1,16 0,68 114-162

Sulfadiazine 251 1,16 0,68 1,00 0,64 92-108-156

Sulfathiazole 256 1,26 0,74 1,09 0,69 92-108-156

Sulfapyridine 250 1,4 0,82 1,21 0,77 108-156-184

Sulfamerazine 265 1,49 0,88 1,28 0,82 108-156-172

Sulfamethizole 271 1,59 0,94 1,37 0,87 92-108-156

Sulfamethazine 279 1,7 1,00 1,47 0,93 124-156-186

Sulfadimidine-d4 (IS) 283 1,7 1,00 160-186

Sulfamoxole 268 1,59 0,94 1,37 0,87 108-113-156

Sulfamethoxypyridazine 281 1,67 0,98 1,44 0,92 108-126-156

Sulfamonomethoxine 281 1,79 1,05 1,54 0,98 108-126-156

Sulfachloorpyridazine 285 1,84 1,08 1,59 1,01 92-108-156

Sulfamethoxazole 254 1,92 1,13 1,66 1,05 92-156-188

Sulfadoxine 311 1,96 1,15 1,69 1,08 108-156-245

Sulfadimethoxine 311 2,17 1,28 1,87 1,19 108-156-245

Sulfisoxazole 268 1,98 1,16 1,71 1,09 108-113-156

Sulfaquinoxaline 301 2,17 1,28 1,87 1,19 92-108-156

Dapsone 249 1,77 1,04 1,53 0,97 92-108-156

Trimethoprim 291 1,83 1,08 1,58 1,01 110-123-230

Trimethoprim-d9 (IS) 300 1,82 1,07 110-234

LAB 22 I-MET 041 L007_Overzicht van de retentietijden en de kenmerkende ionen v.05.xls

Documents

BEPALING VAN SULFONAMIDEN ,EN DAPSONE EN … · 2015. 1. 12. · BEPALING VAN SULFONAMIDEN, EN DAPSONE EN TRIMETHOPRIM MET LC-MS LAB 22 I-MET 041 v.06 6/31 4 Definities en afkortingen