Niklas Dahrén

Bestäm koncentrationen av ett ämne med UV/Vis-spektrofotometri

                   

UV/Vis-spektrofotometri

ü  Sy$et  med  spektrofotometri  är  a%  mäta  koncentra-onen  av  e%  ämne  i  en  lösning.  Det  sker  genom  a%  vi  bestrålar  lösningen  med  ultraviole%  eller  visuellt  ljus  (beroende  på  vilken  typ  av  ljus  ämnet  kan  absorbera)  och  får  ut  e%  ”absorbansvärde”.  Desto  mer  ljus  som  absorberas  av  lösningen  desto  högre  koncentra-on  finns  det  av  ämnet.  

ü  UV=  Ultraviole%  ljus  (korta  våglängder  som  våra  ögon  ej  kan  uppfa%a).    ü  Vis=  Visuellt  ljus  (medellånga  våglängder  som  våra  ögon  kan  uppfa%a).  

ü  UV/Vis-­‐spektrofotometri  u6örs  med  en  UV/Vis-­‐spektrofotometer.        

                   

UV/Vis-spektrofotometerns uppbyggnad

Monokromator  

Kyve:  (med  provet  som  ska  undersökas)  

Ljuskälla  

Detektor  

                   

Principen bakom UV/Vis-spektrofotometri

Kyve%  med  provlösning  

ü  En  ljuskälla  skickar  ut  ljus  mot  kyve:en  där  provlösningen  med  ämnet  finns.  Ämnets  molekyler  absorberar  en  stor  del  av  det  ljus  som  åker  in  i  kyve%en.  Desto  fler  molekyler  (högre  koncentra-on  av  ämnet)  desto  mer  ljus  absorberas.    

ü  Detektorn  registrerar  transmi:ansen  vilket  är  den  andel  ljus  som  tar  sig  igenom  och  träffar  detektorn.  Detektorn  kan  sedan  u-från  transmi%ansen  beräkna  absorbansen.  

Detektor  

0,38  

                   

Från detektorn får vi ett absorbansvärde

Kyve%  med  provlösning  

I1:  Den  mängd  ljus  som  tar  sig  igenom  kyve%en  och  träffar  detektorn.    I0:  Den  mängd  ljus  som  skickades  in  i  kyve%en.  

T  =  0,42  %T  =  42  %  A  =  0,38  

T:  3/7=  0,42=  42  %  -­‐log(0,42)=  0,38    

I1  

1.   Detektorn  registrerar  det  ljus  som  träffar  detektorn  och  räknar  sedan  ut  transmi%ansen  med  följande  formel:    

Detektor  

Vårt  exempel:  

I0  

0,38  

2.   Detektorn  räknar  sedan  ut  absorbansen  med  följande  formel:    

                   

Monokromatorns funktion

ü  Vi  ställer  in  monokromatorn  på  den  våglängd  av  ljuset  som  ämnet  är  bäst  på  a%  absorbera.  Varje  ämne  har  en  specifik  våglängd  som  ämnet  absorberar  bäst.  

 ü  Monokromatorn  filtrerar  alltså  bort  de  oönskade  våglängderna  och  släpper  enbart  igenom  den  

våglängd  vi  har  ställt  in  den  på.    

ü  En  monokromator  innehåller  e:  vridbart  prisma  och  en  spalt:  Prismat  delar  upp  det  vita  ljuset,  som  kommer  från  ljuskällan,  i  alla  dess  våglängder.  Spalten  gör  a%  bara  en  enda  våglängd  passerar  ut  ur  monokromatorn.  När  vi  ställer  in  spektrofotometern  på  en  viss  våglängd  så  vrider  vi  prismat  så  a%  rä%  våglängd  ”slinker”  ut  genom  spalten!  

Vi%  ljus  

                   

Absorbansvärdet är proportionerligt mot koncentrationen

Absorbans  

KoncentraWon  

                   

En högre koncentration av ämnet ger ett högre absorbansvärde

Kyve%  med  provlösning   Detektor  

0,85  

T:  1/7=  0,14=  14  %  -­‐log(0,14)=  0,85    

Uträkning  av  absorbansvärdet:   T  =  0,14  %T  =  14  %  A  =  0,85  

                   

Men hur vet vi den exakta koncentrationen?  

 ü  Vi  blandar  därför  Wll  e:  antal,  ca  4-­‐6  st,  ”standardlösningar”    

(eller  kalibreringslösningar)  med  kända  koncentra-oner  av  ämnet  (kallas  o_a  för  en  ”standardserie”).  Koncentra-onerna  av  dessa  bör  ligga  inom  e%  rimligt  intervall.    

ü  Vi  mäter  sedan  absorbansen  av  dessa  kända  prover.  Om  en  standardlösning  med  känd  koncentra-on  också  har  absorbansvärdet  0,38  så  borde  vårt  prov  ha  samma  koncentra-on  som  denna  standardlösning!  

Standard-­‐lösningar:  

KoncentraWon:  

Prov  1   0,625  %    Prov  2   1,25  %    Prov  3   2,5  %    Prov  4   5  %  

ü  När  vi  mä:e  vårt  ämne  fick  vi  absorbansvärdet  0,38.  Men  vad  innebär  e%  absorbansvärde  på  0,38  i  koncentra-on?  Vi  vet  bara  a%  e%  högt  absorbansvärde  innebär  en  hög  koncentra-on  och  tvärtom.  Vi  vet  däremot  inte  den  exakta  koncentra-onen.  För  a%  ta  reda  på  det  måste  vi  jämföra  med  absorbansen  från  prover  med  kända  koncentra-oner.    

 

                   

Vi jämför vårt erhållna absorbansvärde med absorbansvärdet från standardlösningarna  

 

Standard-­‐lösningar:  

KoncentraWon:   Lösningarnas  uppmä:a  absorbansvärden:  

Prov  1   0,625  %   0,11  Prov  2   1,25  %   0,21  Prov  3   2,5  %   0,38  Prov  4   5  %   0,79  

ü  Nedanstående  tabell  visar  de  absorbansvärdena  vi  fick  när  vi  mä%e  våra  standardlösningar  med  kända  koncentra-oner  (vår  standardserie).  

ü  Fråga:  Vilken  är  koncentra-onen  av  vårt  okända  prov  om  absorbansen  av  provet  var  0,38?  

ü  Lösning:  Genom  a%  jämföra  vårt  prov  med  dessa  värden  kan  vi  lista  ut  den  okända  koncentra-onen.  Tabellen  visar  a%  absorbansvärdet  0,38  motsvarar  koncentra-onen  2,5  %.  

                   

Men vad gör vi om absorbansvärdet inte matchar?  

ü  Vad  gör  vi  om  vårt  uppmä:a  absorbansvärde  inte  exakt  matchar  absorbansvärdet  från  något  av  våra  kända  prover.    

ü  Exempel:  Om  absorbansvärdet  från  vårt  prov  är  0,30.  Vad  gör  vi  då?  

ü  Lösning:  Vi  gör  en  standardkurva  som  baseras  på  våra  standardlösningar  med  kända  koncentra-oner!  

                   

Vi gör en ”standardkurva” med värdena från standardlösningarna

Absorbans  

KoncentraWon  5  %  3  %  2  %  1  %  

Proverna:   KoncentraWon:   Absorbans:  Prov  1   0,625  %   0,11  Prov  2   1,25  %   0,21  Prov  3   2,5  %   0,38  Prov  4   5  %   0,79  

0,10  

0,20  

0,40  

0,50  

0,60  

0,30  

0,70  

0,80  

4  %  

                   

Vi använder standardkurvan för att ta reda på den okända koncentrationen

Absorbans  

KoncentraWon  5  %  3  %  2  %  1  %  

0,10  

0,20  

0,40  

0,50  

0,60  

0,30  

0,70  

0,80  

4  %  

Tillvägagångssä::  1.  Läs  av  det  uppmä%a  absorbansvärdet  

på  y-­‐axeln.  2.  Dra  e%  streck  från  y-­‐axeln  -ll  

standardkurvan.    3.  Dra  e%  streck  från  standardkurvan  

rakt  ner  -ll  x-­‐axeln.  4.  Läs  av  koncentra-onen.  

Svar:  2  %  

                   

”Lambert-Beers lag” visar sambandet mellan absorbans och koncentration

TAclA 10log−== λεOm  exWnkWonskoefficienten  är  känd  kan  ”Lambert-­‐Beers  lag”  användas  för  a%  beräkna  koncentra-onen  istället  för  a%  göra  en  standardkurva  (i  prak-ken  föredrar  man  dock  o_ast  a%  göra  en  standardkurva).  

A  =  Absorbansen.      ε=  ”Molära  ex-nk-onskoefficienten”,  den  är  specifik  för  det  ämne  som  undersöks  och  är  e%  värde  på  hur  bra  ämnet  är  på  a%  absorbera  ljus  vid  en  viss  specifik  våglängd.    c=  Koncentra-onen  av  ämnet  i  kyve%en.      l=  Kyve%ens  längd,  o_ast  1  cm  (den  sträcka  ljusets  färdas  genom  kyve%en).  

Se  gärna  fler  filmer  av  Niklas  Dahrén:       h:p://www.youtube.com/KemilekWoner  

h:p://www.youtube.com/MedicinlekWoner