Bioakumulacija teških metala u biljci hiperakumulatoru ... · “hiperakumulator” se odnosio na biljke sposobne da akumuliraju više od 1 mg/g (suve mase) Ni u nadzemne delove,

Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Bioakumulacija teških metala u biljci

hiperakumulatoru Pistia stratiotes

- Master rad -

Mentor: Student:

Prof. dr Tatjana Anđelković Aleksandra Malovac

Niš, 2017.

Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Bioakumulacija teških metala u biljci

hiperakumulatoru Pistia stratiotes

- Master rad -

Mentor: Student:

Prof. dr Tatjana Anđelković Aleksandra Malovac

Niš, 2017.

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: Мастер рад

Аутор, АУ: Александра Маловац

Ментор, МН: Татјана Анђелковић

Наслов рада, НР: Биоакумулација тешких метала у биљци хиперакумулатору Pistia stratiotes

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: српски

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2017

Издавач, ИЗ: Ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/цитата/табела/слика/графика/прилога)

63 страна; 7 поглавља; 8 табела; 23 слика

Научна област, НО: Хемија

Научна дисциплина, НД: Хемија животне средине

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Биоакумулација, тешки метали, хиперакумулатори, Pistia stratiotes

УДК 546.4/.8 : 582.521.41

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Предмет овог мастер рада је испитивање биоакумулације тешких метала (Ni,

Zn, Cu, Pb, Cd) у биљци хиперакумулатору Pistia stratiotes. Испитивање је

вршено излагањем биљака растворима са садржајем тешких метала, а

затим је након сушења и минерализације, садржај метала у биљкама

одређен атомском апсорпционом спектрофотометријом. Добијени резултати

су показали да поређењем просечне концентрације тешких метала

одређених у сувом узорку биљака након излагања растворима метала и

њихових дозвољених вредности да се кадмијум акумулира у концентрацији

која је око 5 пута већа од дозвољене, никл и бакар се акумулирају у два пута

мањој концентрацији од дозвољене, олово у десет пута мањој концентрацији

од дозвољене, док се цинк акумулира у чак двадесет пута мањој

концентрацији од оне концентрације која би могла да изазове

фитотоксичност.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Члановикомисије, КО: Председник: Члан: Члан, Ментор:

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: Master work

Author, AU: Aleksandra Malovac

Mentor, MN: Tatjana Anđelković

Title, TI: Bioaccumulation of heavy metals in hyperaccumulator plant Pistia stratiotes

Language oftext, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English; Serbian

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2017

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

63 pages; 7 chapters; 8 tables; 23 figures

Scientific field, SF: chemistry

Scientific discipline, SD: Environmental chemistry

Subject/Keywords, S/KW: Bioaccumulation, heavy metals, hyperaccumulator, Pistia stratiotes

UC 546.4/.8 : 582.521.41

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: The subject of this work is investigation of heavy metal bioaccumulation (Ni, Zn, Cu, Pb, Cd) in hyperaccumulator plant Pistia stratiotes. The investigation was carried out by exposing the plants to the solutions with the content of heavy metals, and then after drying and mineralization, the content of the metal in plants was determined by atomic absorption spectrophotometry. The obtained results showed that by comparing the average concentration of heavy metals determined in the dry sample of plants after exposure to the metal solutions and their allowed values, it was determined that cadmium is accumulated at a concentration about 5 times higher than the allowed, nickel and copper are accumulated at twice the concentration of permitted, lead in ten times lower concentration than allowed, while zinc accumulates in as much as twenty times less concentration than that concentration that could cause phytotoxicity.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended Board,

DB:

President:

Member: Member,

Mentor:

Eksperimentalni deo ovog master rada urađen je u istraživačkoj laboratoriji Katedre za

primenjenu i industrijsku hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu.

Ovom prilikom bih iskazala zahvalnost svom mentoru, prof. dr Tatjani Anđelković, na

prihvaćenoj saradnji, pomoći oko izbora teme master rada i definisanju njenih okvira. Veliko hvala

i dr Ivani Kostić, naučnom saradniku, na nesebičnoj stručnoj pomoći, strpljenju i razumevanju.

Zahvaljujem se i dr Darku Anđelkoviću, naučnom saradniku i dr Bojanu Zlatkoviću, vanrednom

profesoru Departmana za biologiju i ekologiju, na pomoći oko prikupljanja biljaka i pripreme

eksperimentalnog dela rada. Zahvaljujem se i Milici Branković, studentu doktorskih studija, na

korisnim savetima i uputstvima tokom izrade eksperimentalnog dela master rada.

Na kraju, neizmernu zahvalnost dugujem svojoj porodici, ocu Perici, majci Dušici i sestri

Ani, kao i prijateljima na pruženoj ljubavi, pomoći, podršci i motivaciji tokom studiranja.

Sadržaj

1. Uvod ........................................................................................................................................................... 1

2. Teorijski deo............................................................................................................................................... 3

2.1. Biljke hiperakumulatori ...................................................................................................................... 4

2.2. Teški metali ......................................................................................................................................... 9

2.2.1. Olovo ............................................................................................................................................ 9

2.2.3. Bakar .......................................................................................................................................... 11

2.2.4. Cink ............................................................................................................................................ 11

2.2.5. Nikl ............................................................................................................................................. 12

2.2.6. Toksični efekti teških metala u biljkama .................................................................................... 13

2.2.7. Transport metala među biljnim tkivima .................................................................................... 16

2.2.8. Mehanizmi mobilizacije metala od strane biljaka i usvajanje ................................................... 16

2.2.9. Transport koren-nadzemna tkiva .............................................................................................. 18

2.2.10. Intracelularni transport ........................................................................................................... 18

2.3. Načini pripreme biljnih uzoraka za analizu ....................................................................................... 23

2.3.1. Postupak mokrog razaranja ....................................................................................................... 23

2.3.2. Postupak suvog razaranja .......................................................................................................... 24

2.4. Atomska apsorpciona spektrofotometrija ........................................................................................ 25

2.4.1. Atomski apsorpcioni spektrofotometar .................................................................................... 26

2.4.2. Način rada atomskog apsorpcionog spektrofotometra ............................................................ 33

2.4.3. Osetljivost i tačnost određivanja ............................................................................................... 34

2.4.4. Smetnje ...................................................................................................................................... 35

3. Eksperimentalni deo ................................................................................................................................ 39

3.1. Program i metodika eksperimenta ................................................................................................... 40

3.2. Eksperimentalni postupak ................................................................................................................ 41

3.2.1. Pribor i aparatura ....................................................................................................................... 41

3.2.2. Reagensi ..................................................................................................................................... 41

4. Rezultati i diskusija .................................................................................................................................. 43

4.1. Prikaz rezultata ................................................................................................................................. 44

4.1.1. Kalibracione krive standardnih rastvora metala........................................................................ 44

4.1.2. Masa celih biljaka ...................................................................................................................... 46

4.1.3. Mase biljaka za mineralizaciju ................................................................................................... 47

4.1.4. Koncentracije i mase metala u uzorcima ................................................................................... 48

4.1.5. Mase metala u uzorku ............................................................................................................... 50

4.2. Diskusija rezultata ............................................................................................................................. 51

7. Biografija .................................................................................................................................................. 58

Master rad Uvod

1

1. Uvod

Master rad Uvod

2

Teški metali su prirodne komponente Zemljine kore, ali su koncentracije nekih od njih, u

mnogim ekosistemima, dostigle toksične nivoe, pre svega kao posledica antropogenih aktivnosti.

Do današnjih dana, ukupno 53 elementa je svrstano u kategoriju teških metala, koja je preciznije

definisana kao grupa elemenata čija je gustina veća od 5 g/cm3. Teški metali su široko

rasprostranjeni u životnoj sredini. Njihova zastupljenost u radnoj i životnoj sredini predstavlja

ozbiljan zdravstveni i ekološki problem zato što su toksični, veoma dugo se zadržavaju u zemljištu

i akumuliraju u žive sisteme kroz lance ishrane.

Prema svojoj biološkoj funkciji koju imaju u organizmu metali se dele na esencijalne i

neesencijalne. Metali, kao što su Cu, Fe, Zn, Mn, Mo, Ni, Co su neophodni za normalan rast i razvoj

biljaka. Nedostatak ili potpuni izostanak ovih metala može da dovede do ozbiljnih poremećaja u

organizmu biljaka, pa čak i do uginuća. Zbog toga ovi metali spadaju u grupu esencijalnih metala.

U grupu neesencijalnih metala spadaju Pb, Cd, Hg, As, Cr. Oni nemaju nikakvu poznatu korisnu

ulogu i ispoljavaju samo toksično dejstvo na organizam biljaka.

Toksičnost koja se ispoljava prema biljkama naziva se fitotoksičnost. Na celularnom nivou,

posledice produžene izloženosti visokim koncentracijama metala mogu biti dezintegracija

membrane, gubitak jona, peroksidacija lipida, degradacija DNK/RNK i konačno smrt ćelije. Da bi

se biljke normalno razvijale i rasle, one moraju održavati koncentracije esencijalnih elemenata u

okviru optimalnih vrednosti-stanje homeostaze.

Cilj ovog rada je ispitivanje bioakumulacije teških metala (Ni, Cu, Zn, Pb, Cd) u biljci

hiperakumulatoru Pistii Stratiotes. Sadržaj teških metala u biljkama izloženim rastvorima koji su

sadržali teške metale, određen je nakon sušenja i mineralizacije primenom atomske apsorpcione

spektrofotometrije.

Master rad Teorijski deo

3

2. Teorijski deo


4

2.1. Biljke hiperakumulatori

Biljke koje opstaju na zemljištu zasićenom metalima, mogu biti grupisane u tri kategorije:

1) Ekskluderi – vrste biljaka koje sprečavaju usvajanje toksičnih metala unutar ćelija korena

i u kojima se koncentracija metala u nadzemnim delovima održava ispod kritičnih vrednosti, tj. na

niskom nivou u odnosu na koncentracije metala u zemljištu. Ekskluderi mogu biti iskorišćeni za

stabilizaciju zemljišta i za izbegavanje daljeg širenja zagađenja, povezanog sa erozijom.

2) Akumulatori – vrste biljaka u kojima se metali koncentrišu u nadzemnim delovima.

Akumulatori ne sprečavaju ulazak metala u koren, te samim tim dozvoljavaju bioakumulaciju

visokih koncentracija metala u svojim tkivima.

3) Indikatori – vrste biljaka kod kojih unutrašnje koncentracije proporcionalno odražavaju,

tj. reflektuju eksterne koncentracije.

U odnosu na molekularne mehanizme koje koriste u postizanju svoje rezisten-

tnosti/tolerantnosti prema metalnom stresu, tj. smanjenju negativnih posledica toksičnosti metala,

biljne vrste se mogu posmatrati kao:

1. Vrste osetljive prema metalima (metal-sensitive species),

2. Vrste rezistentne prema metalima – ekskluderi (metal-resistant excluder species),

3. Nehiperakumulatorske vrste tolerantne prema metalima (metal-tolerant

nonhyperaccumulator species) i

4. Vrste hiper-tolerantne prema metalima (metalhypertolerant hyperaccumulator species)

Slika 1. A. Biljke osetljive na teške metale, koje ne mogu sprečiti ulazak metala u koren, niti

mogu sprečiti transport metala do izdanka. B. Metal-rezistentni ekskluderi, koji su sposobni

da drže metale van domašaja korena, ili obezbede brz efluks u slučaju ulaska u ćelije korena. C. Metal-tolerantne nehiperakumulatorne biljke, u kojima metali ulaze u ćelije korena

gde se vrši njihova sekvestracija u vakuole čime se sprečava translokacija kroz stablo. D. Metalhipertolerantne hiperakumulatorne biljke, u kojima se metali aktivno

usvajaju kroz koren i u velikim količinama ubacuju u ksilem. U izdanku, metali se bezbedno odlažu (sekvestriraju) u vakuole. Zn-plave sfere, Cd-crvene sfere.

Hiperakumulatori su podgrupa akumulatorskih vrsta, koja akumulira ekstremno visoke

koncentracije metala u lišću i drugim nadzemnim delovima. Najčešće se radi o endemičnim

vrstama koje prirodno rastu na zemljištu prezasićenom metalima i to kako u kontinentalnim, tako

i u tropskim zonama. Ove vrste biljaka su indentifikovane u vegetaciji regija Južne Afrike, Nove

Kaledonije, Latinske Amerike kao i Severne Amerike i Evrope. U početku, termin


5

“hiperakumulator” se odnosio na biljke sposobne da akumuliraju više od 1 mg/g (suve mase) Ni u

nadzemne delove, što su izuzetno visoke koncentracije, uzevši u obzir da se u organima većine

biljaka toksičnost ovog metala može ispoljiti pri koncentracijama > 10 µg/g suve mase kod

osetljivih i > 50 µg/g suve mase kod umereno osetljivih biljaka. Danas se hiperakumulatori definišu

kao one vrste koje su sposobne da akumuliraju metale u koncentracijama koje su i do 100 puta veće

od onih koje su normalno prisutne u biljkama. Oni mogu koncentrovati metale i do 0.1% suve mase

u svom lišću za Ni, Co, Cr, Cu, Al i Pb; 1% za Zn i Mn i 0.01% za Cd i Se.

Tabela 2.1. Sadržaji metala u biljkama (mg/g suve mase) definisani radi kategorizacije statusa

akumulatora, ili hiperakumulatora Element Prag za akumulatore (mg/g) Prag za hiperakumulatore (mg/g) Broj hiperakumulatorskih vrsta

As / 1 Nije zabeležen

Cd 0,02 0,1 1

Co 0,02 0,1 28

Cr 0,05 0,1 Nepoznat

Cu 0,1 1 37

Mn 2 10 9

Ni 0,1 1 317

Pb 0,1 1 14

Se 0,01 1 20

Zn 2 10 11

Vreme koje je potrebno biljkama da umanje količinu teških metala u kontaminiranim

zemljištima zavisi od produkcije biomase, kao i od njihove sposobnosti akumulacije, tj. njihovih

biokoncentracionih faktora (BCFs). BCF predstavlja odnos koncentracije metala u tkivima izdanka

i koncentracije metala zemljištu, mada se može odnositi i na odnos koncentracije u korenu i

zemljištu. On je određen kapacitetom biljnog organa prema usvajanju metala i njegove sposobnosti

da akumuliše, skladišti i detoksifikuje metale, dok održava metabolizam, rast i produkciju biomase.

Kod hiperakumulatora, BCF je uvek viši od 1, ponekad dostižući vrednosti od 50 do 100.

Ukupno je detektovano preko 500 vrsta biljaka hiperakumulatora iz oko 101 familije biljaka

uključujući članove Asteraceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae, Cyperaceae, Cunouniaceae,

Fabaceae, Flacourtiaceae, Lamiaceae, Poaceae, Violaceae i Euphobiaceae, što čini oko 0.2% svih

angiospermi. Posebno je interesantna familija Brassicaceae, sa rodovima Alyssum i Thlaspi, kod

kojih je primećena akumulacija više vrsta metala. Čak 25% detektovanih hiperakumulatora pripada

ovoj familiji.

Najpoznatiji hiperakumulator metala je biljka Thlaspi caerulescens, koja akumulira velike

količine Zn (39 600 mg/kg) i Cd (1800 mg/kg) bez vidljivijih oštećenja. Ova mala, diploidna biljka

može lako da raste u laboratorijskim uslovima, čime predstavlja odličan eksperimentalni sistem za

ispitivanje mehanizama usvajanja, akumulacije i tolerancije metala povezanih sa fitoekstrakcijom.

Osim T. caerulescens, Brassica juncea je takođe služila kao čest model za ispitivanje fiziologije i

biohemije biljaka tokom akumulacije metala.

Preko 75% taksona može da akumulira Ni, dok je samo mali broj hiperakumulatora (5 vrsta)

do danas pronađeno za Cd. Takođe, Ni je metal koji dostiže najveće koncentracije u biljkama.

Hiperakumulatori Zn su manje zastupljeni i uključuju Arabidopsis halleri i vrste Thlaspi, kao i

Sedum alfredii. Vrste A. halleri i S. alfredii, zajedno sa T. caerulescens i T. praecox su četiri

poznate vrste koje pored Zn, hiperakumuliraju i Cd. Od skora je i Solanum nigrum (krompir)

prepoznat kao peti hiperakumulator kadmijuma. Vrste koje hiperakumuliraju Se su rasprostranjene

u rodovima različitih familija, među kojima su Fabaceae, Asteraceae, Rubiaceae, Brassicaceae,

Scrophulariaceae i Chenopodiaceae. Takođe, neke angiosperme, kao što su Brassicaceae isatis


6

cappadocica i Hesperis persica, ali i neke vrste paprati koje pripadaju rodu Pteris su identifikovane

kao hiperakumulatori As. Nedavno je "Environment Canada" objavila bazu podataka "Fitoterm"

koja predstavlja svetsku popisnu listu za više od 750 kopnenih i vodenih biljaka sa dobrim

potencijalom za fitoremedijaciju.

Očigledno je da se terminom "hiperakumulator" može opisati veliki broj biljaka koje

pripadaju taksonomski udaljenim familijama, ali da sve one dele jednu istu sposobnost akumulacije

izvanredno visokih količina teških metala u nadzemnim delovima, količina mnogo većih nego što

su pronađene u većini drugih biljaka i to bez podleganja fitotoksičnim efektima, što je od posebnog

značaja za eventualnu primenu u postupku fitoekstrakcije/fitoakumulacije.

2.1.1. Pistia stratiotes

Pistia stratiotes je slobodno plutajuće vodeno bilje iz Azije, Afrike i ekvatorijalne Amerike.

Postoji određena debata o tome da li Severna teritorija Amerike čini deo njenog rodnog područja.

Smatra se da je uneta u reke i brane kao zamka za jegulje u Kvinslendu. Koristi se kao biljka za

akvarijume i može se kupiti u rasadnicima. Reke, močvare, jezera, rezervoari i usporeni tokovi su

područja koja su najizloženija dejstvu ovog korova.

Uticaj

Pod povoljnim uslovima, Pistia stratiotes će obilno rasti, brzo će se širiti i formirati

opstruktivne podloge. Ove velike guste plutajuće podloge mogu imati negativne uticaje na vodene

biljke i životinje. Mogu, takođe, ometati navodnjavanja, plovidbu i vodene sportove. Poznato je da

guste patosnice predstavljaju sklonište komarcima koji izazivaju razne bolesti.

Stanište

Najbolje raste na mirnim slatkovodnim površinama kao što su brane, rezervoari, jezera, reke

i potoci. Opstaje na temperaturama između 15°C i 35°C, a optimalne temperature za rast se kreću

između 22°C i 30°C. Osetljiva je na mraz, a rast je ograničen u područjima sa dugim hladnim

zimama. Pistia stratiotes može dugo vremena opstati na blatnjavim područjima ili na drugim

vlažnim lokacijama kao što su odvodni kanali pored puteva.

Izgled

Pistia Stratiotes je biljka slobodnog plutanja koja izgleda vrlo slično kao otvorena glava

salate. Može dostići visinu 15 cm i širinu 30 cm. Biljke majke i ćerke su povezane stolonima (bele

strukture poput korena koje povezuju biljke zajedno) i dostižu dužinu do 60 cm.

Slika 2. Pistia stratiotes (podseća na otvorenu glavu zelene salate)

Listovi

Bledo zeleni listovi su rebrastii, talasasti i formiraju rozetu. Oni su sunđerasti na dodir i imaju

baršunast izgled zbog malih gustih dlaka koje ih pokrivaju.


7

Koren

Veliki broj žiličastih korena dužine do 80 cm uronjen je u vodu ispod listova biljaka.

Slika 3. Pistia stratiotes slobodno pliva sa potopljenim žiličastim korenom

Cvetovi

Cvetovi su beličasto-zelene boje, vrlo mali (dužine do 1,5 cm) i skriveni su u središtu biljke

među listovima. Cvetanje se dešava tokom cele godine.

Plod

Plod je zelenkasta bobica prečnika 5 – 10 mm. Četiri do petnaest semenki se nalaze obložene

i formiraju bobicu. Semenke su prvo zelene, a zatim zriju do braon boje i dugačke su oko 2 mm.

Reprodukcija

Pistia stratiotes je višegodišnja biljka koja se reprodukuje vegetativno od semena. Svaka

biljka proizvodi brojne stolone, pri čemu svaka proizvede novu rozetu ili ćerku na svom kraju.

Svaka ćerka-biljka će tada formirati svoje stolone, što će omogućiti biljci da brzo raste. U jednom

trenutku seme će plivati na površini vode pre nego što padne na dno. Ono klija početkom leta kada

temperature dostignu preko 20°C, a potom plutaju na površini kao sadnice. Cvetanje i reprodukcija

mogu se desiti već́ u fazi razvoja od četiri do pet listova. Kada su uslovi za rast dobri, biljka može

brzo reprodukovati i pokrivati celu vodu gustim slojem povezanih rozeta.

Prenošenje

Smatra se da se ova biljka proširila odlaganjem vode iz akvarijuma ili ribnjaka u potoke, reke

i močvare ili namernom kultivacijom. Pistia stratiotes može biti raspršena u vidu slomljenog

komada, plutajućih sadnica ili kao biljka u celosti. Delovi biljke mogu se proširiti brodovima ili

opremom za ribolov, koji se pomeraju iz dela gde je biljka prisutna u deo gde je nema. Seme može

plutati nizvodno i obezbediti rezervu u područjima gde ova biljka nije naseljena.


8

Slika 4. Pistia stratiotes se može brzo razmnožavati i pokriti celu površinu vode

Kontrola i upravljanje

Brzo razmnožavanje ove biljke može poremetiti normalan život vodenih biljaka i životinja,

pa se zbog toga dosta pažnje posvećuje kontroli i upravljanju njenog rasta i razmnožavanje. To se

postiže na nekoliko načina:

1)sprečavanje širenja

2)uklanjanje herbicidima i biološka kontrola

3)fizička i mehanička uklanjanja


9

2.2. Teški metali

2.2.1. Olovo

U prirodi uglavnom nalazi u neorganskom obliku, kao oksid (PbO, PbO2), sulfid, ali i kao

karbonat, sulfat ili hromat. U organskom obliku se može naći u vidu soli, koje gradi sa organskim

kiselinama. Usled antropološkog zagađenja životne sredine Pb se može naći i u obliku alkil-olova,

i drugih različitih derivata, koji se koriste u proizvodnji benzina. Prosečan nivo Pb u Zemljinoj kori

procenjen je na 20 mg/kg. U gornjim slojevima zemljišta njegova koncentracija varira između 10

i 70 mg/kg. U blizini većih saobraćajnica i preko 100 mg/kg. Nivoi u površinskim vodama su

generalno ispod 0,01 mg/l, dok se u zagađenim vodama može očekivati koncentracija i do 1 mg/l.

Vazduh u gradskim područjima sadrži 0,2 – 3,0 μg/m3 dok je u brdskim područjima ta količina 10

puta manja. Vegetacija sadrži 0,2 – 0,6 mg/kg. Olovo u tlo, osim prirodnim putem, može doći i

antropogenim putem. Najveći izvori zagađivanja prirode olovom su motorna vozila, industrijske

otpadne vode, deponije, rudnici olova, topionice, hemijska industrija, industrija boja, keramička

industrija, industrija proizvodnje i obrade stakla, industrija baterija i akumulatora, fabrike oružja i

municije. Iz atmosfere, zemljišta i voda, Pb se unosi i zadržava u biljkama, a dalje preko lanca

ishrane i vode za piće dospeva i u ljudski organizam.

Nakupljanje olova u biljkama zavisi od udaljenosti biljaka od centra emisije, pokrivenosti

zemljišta biljkama, dužine trajanja vegetacije, pravca i intenziteta vetra i dr. Biljke olovo u

neorganskom obliku slabo usvajaju i premeštaju u nadzemne organe, izuzev na kiselim

zemljištima. Organska jedinjenja olova, veoma se brzo usvajaju i transportuju u nadzemne delove

biljaka. Taloženje olova kod većine biljaka intenzivnije je u korenu u odnosu na nadzemne delove.

Velika moć korena u akumulaciji olova mogla bi da bude i jedan vid zaštite nadzemnog dela. Olovo

u većim koncentracijama inhibira izduživanje korena i rast listova, inhibira proces fotosinteze, utiče

na morfološko-anatomsku građu biljaka.

Olovo kod čoveka uzrokuje anemiju, razne poremećaje digestivnog trakta, utiče na centralni

nervni sistem, izaziva kardiovaskularna oboljenja, oboljenje kostiju i dr.

Koncentracija olova u krvi od 60 μg/dl je tokom šezdesetih godina smatrana bezopasnom.

Vremenom, proučavanjem toksičnih efekata olova, prihvatljiv sadržaj u krvi je smanjen na 25

μg/dl, pa zatim i na 10 μg/dl 1991. god. Bez obzira na ove izmene, subklinički simptomi izloženosti

olovu se javljaju i pri njegovom sadržaju manjem od 10 μg/dl. Međutim, “bezopasan” nivo olova

u organizmu još uvek nije definisan.

Dnevne količine unetog olova, oralno i inhalacijom, mogu biti i oko 0,3 mg. Iste se delom

eliminišu iz organizma ekskrecijom ali i akumuliraju pa se tako se u krvi normalno može naći oko

250 μg/l. Porast nivoa ovog metala u krvi je dalje umereno rizičan (250-490 μg/l), visokorizičan

(500-690 μg/l) i urgentan, sa više od 700 μg/l telesne tečnosti. Olovo nije esencijalni metal, ali

uneto u organizam može se naći u gotovo svim tkivima i organima sisara. Nakon unošenja u

organizam olovo ispoljava toksični efekat na jetru, bubrege i mozak, koji se i smatraju ciljanim

organima za njegov uticaj. Kao metal sa kumulativnim dejstvom olovo je konkurentno

esencijalnim metalima (gvožđu, kalcijumu, bakru i cinku) za njihove brojne funkcije u organizmu,

posebno one vezane za prisustvo slobodnih–SH grupa u delovima biomolekula proteina i enzima.


10

2.2.2. Kadmijum

Prema geohemijskoj klasifikaciji hemijskih elemenata on je litofilni i halkofilni element.

Relativno je redak metal koji se nalazi na 67. mestu po zastupljenosti u Zemljinoj kori. Do pH 8 je

uvek prisutan kao dvovalentno pozitivan jon (pod uslovom da se u sredini ne nalaze fosfati i sulfati

koji ga mogu istaložiti), kada se može lako sorbovati na suspendovanim česticama ili nagraditi

kompleksna jedinjenja sa organskim ligandima. Tako, sa akvatičnim huminskim supstancama u

zemljištu gradi humatne komplekse. Kadmijum je označen kao jedan od 126 najvećih zagađivača

životne sredine od strane Agencije za zaštitu životne sredine USA.

Kadmijum je element sa vrlo toksičnim dejstvom za biljke, životinje i čoveka. Cd i Zn su

vrlo slični, a pored toga Cd može zameniti (imitirati) ponašanje i nekih drugih esencijalnih

elemenata u usvajanju iz zemljišta i metabolizmu. Glavni uzrok toksičnosti kadmijumom

predstavlja veliki afinitet Cd za tiolne grupe (SH) u enzimima i u drugim proteinima. Višak Cd

takođe može poremetiti metabolizam Fe i izazvati hlorozu. U ishrani životinja i ljudi Cd je

kumulativni otrov. Remeti metabolizam Ca i P, te uzrokuje bolest kostiju, ali i respiratornih organa

i nervnog sistema.

Brzo se transportuje iz tla u biljku. Pristupačnost mu u najvećoj meri zavisi od pH, i prisustva

ostalih katjona. Ca i Zn smanjuju usvajanje Cd, a transport u velikoj meri zavisi od koncentracije

u okolini. Utvrđeno je da 30-60% kadmijuma, sadržanog u biljkama dolazi direktno iz atmosfere,

a 40-60% iz zemljišta. Jedan od načina kojim on dospeva u zemljište su mineralna đubriva, koja se

dobijaju razlaganjem sirovih fosfata mineralnim kiselinama. Kod brojnih biljnih vrsta intenzitet

transporta kadmijuma u nadzemne organe je u korelaciji sa njegovom koncentracijom u hranljivoj

podlozi.

Kadmijum usvojen iz hranljive podloge najvećim delom se zadržava u korenu. Udeo ovog

elementa u stablu i listovima biljaka je približno isti, ali manji od njegove koncentracije u

podzemnom delu biljke. Veće koncentracije u biljkama inhibiraju metabolizam gvožđa i smanjuju

intenzitet fotosinteze. Isto tako, visoke koncentracije kadmijuma inhibiraju disanje i transport

elektrona u procesu oksidativne fosforizacije.

Najveći izvor inhalacione intoksikacije kadmijumom je pušenje. Preko duvanskog dima 50%

kadmijuma se apsorbuje iz pluća u sistemsku cirkulaciju u toku aktivnog pušenja. Kadmijum se

unosi u organizam u obliku para i čestica prašine kao oksid, hlorid, fluorid, sulfid, karbonat i acetat.

Apsorpcija se uglavnom odvija respiratornim putem, a manjim delom gastrointestinalnim traktom,

dok je transkutani put (putem kože) neznatan. Kod nepušača je prosečna koncentracija kadmijuma

u krvi oko 0,5 μg/l.

Preko industrijskog otpada kadmijum ulazi u sastav površinskih voda. Oko 90% kadmijuma

u biljkama dospeva iz zemljišta, a oko 10% iz atmosfere. Preko zagađenog zemljišta i vode biljke

su polazna karika ishrane i osnovni izvor kadmijuma za životinje i ljude. Unos ovog metala

vazduhom je oko 0,5 μg⁄dan, dok putem vode oko 1 μg⁄dan. Najveća količina kadmijuma se unosi

putem kontaminirane hrane (pirinač, iznutrice, pečurke). Koncentracija kadmijuma u vodi za piće

treba da bude manja od 1μg⁄l. Po ulasku u organizam, kadmijum se transportuje u krv pomoću

crvenih krvnih zrnaca i visoko molekularnog proteina krvi-albumina. Normalni nivo kadmijuma u

krvi kod odraslih osoba manji je od 1μg/l. Iako se kadmijum širi putem krvi kroz ceo organizam,

najveća akumulacija (od 50 do 60% telesnog opterećenja kadmijumom) je u bubrezima i u

jetri.Opterećenje kadmijumom, naročito u bubrezima, uglavnom linearno raste sa godinama, do

50-60. godine starosti, nakon čega nivo kadmijuma u bubrezima ostaje konstantan ili vrlo malo

opadne.


11

Visoko toksičan efekat kadmijuma, rezultat je njegovih interakcija sa neophodnim mikro i

makro bioelementima, posebno sa gvožđem, kalcijumom, bakrom i cinkom.

2.2.3. Bakar

Bakar je zastupljen je u Zemljinoj kori u količini od 55 ppm u vidu minerala: halkopirita

(Cu2S x FeS2), halkozina (Cu2S), kuprita (Cu2O) i drugih. Biljke ga usvajaju u vidu jona bakra Cu2+

ili u vidu helata. Za usvajanje bakra iz zemljišta je neophodna energija, mada se smatra i da postoji

specifičan receptor koji igra ulogu prenosioca bakra. Prilikom usvajanja bakra iz zemljišta glavnu

konkurenciju mu čine mangan, gvožđe i cink. Ispitivanja su pokazala da biljke koje imaju visoke

koncentracije kiseonika i fosfora uglavnom odlikuje i niska koncentracija bakra. Najveća

koncentracija bakra se nalazi u korenu biljaka, zbog relativno slabe translokacije kroz ostale delove

biljke. Biljke u proseku sadrže između 2-20 ppm bakra u suvoj supstanci, dok one koje imaju

koncentraciju ispod 4 ppm, spadaju u slabo snabdevene biljke. Bakar koji se nalazi u zemljištu vodi

poreklo iz primarnih minerala gde se nalazi u jednovalentnom obliku, a nakon njihovog raspadanja

oksiduje u Cu2+ oblik. Bakar zajedno sa organskim kiselinama u zemljištu gradi stabilne komplekse

i kao takav je biljkama slabo dostupan.

Manjak bakra se zbog toga uglavnom nalazi na zemljištima koja su bogata humusom.

Pokretljivost bakra kroz različite delove biljke je osrednja. Uzlazni transport kroz biljku i

iskorišćenje zavise od stepena obezbeđenosti biljaka ovim elementom. Ukoliko ga nema dovoljno

u zemljištu, premeštanje iz korena u nadzemne delove, kao iz pravca starijih listova u mlađe, je

jako mala, skoro neznatna. Koncentracija ovog elementa se kreće u proseku od 5 do 30 mg/kg suve

materije. Ukoliko je udeo bakra manji od 4% suve biljke, onda se smatra da datim biljkama

nedostaje bakar, dok je u slučajevima kada njegova koncentracija iznosi od 20 do 100 mg/kg,

smatra se da te biljke imaju veliku koncentraciju ovog elementa. Osetljivost i reakcije biljaka na

njegov nedostatak su jako različite. Osnovni znaci na biljci koji ukazuju na nedostatak bakra su

venjenje listova, savijanje istih, hloroza, odumiranje mladih listova, nekroza i smanjenje prinosa

biljaka. Toksični efekat ovog elementa se javlja kada je njegov ukupan sadržaj u zemljištu od 25

do 40 mg/kg i ukoliko je udružen sa kiselim zemljištem čija se pH vrednost kreće oko 5,5.

Uglavnom se visoke koncentracije bakra javljaju u kiselim zemljištima. Bakru, kao ekološkom

činiocu, treba posvetiti posebnu pažnju, s obzirom da je u visokim koncentracijama jako toksičan.

2.2.4. Cink

Cink biljke usvajaju u obliku jona Zn2+, ZnCl+, Zn – helata i za razliku od Fe, Mn, Cu i Mo

u biljkama se uvek nalazi u formi Zn2+. Slično kao i bakar, cink se apsorbuje iz zemljišta aktivnim

putem, pri čemu na njegovo usvajanja negativno deluju visoke koncentracije kalcijuma i

magnezijuma. Biološka i fiziološka uloga cinka je ogromna imajući u vidu da učestvuje u sintezi

DNK, RNK, proteina kao i u sintezi biljnog hormona auksina. Najniža fiziološki podnošljiva

koncentracija cinka u suvoj materiji biljaka iznosi 15 – 30 ppm. Višak cinka u biljkama se javlja

uglavnom na kiselim podlogama. Gornja granica koncentracije cinka koju biljka može da podnese

iznosi između 200-500 ppm preračunato na suvu materiju lišća. Osnovni izvor cinka u zemljištu

jesu primarni i sekundarni minerali. Granit i gnajs kao kisele stene sadrže manju koncentraciju

cinka u odnosu na basalt koji je alkalne prirode.

Nedostatak cinka koji biljka može da usvoji javlja se najčešce na teškim glinovitim

podlogama. Cink spada u grupu elemenata čija je pokretljivost kroz različite delove biljaka

osrednja. U slučaju kada je njegova koncentracija u zemljištu mala, izuzetno je slab intenzitet

prenošenja iz starijih u mlađe delove biljke. U slučajevima kada je njegova koncentracija u

zemljištu visoka, uglavnom se taloži u korenu biljaka. Koncentracija ovog elementa u suvoj


12

materiji biljaka u proseku se kreće od 30 do 150 mg/kg, a najčešće se nalazi u opsegu između 20

do 50 mg/kg. Ukoliko je njegova koncentracija u biljkama između 10 i 20 mg/kg suve materije,

može se smatrati da ovakavo stanje ima jako toksičan, čak letalan efekat na biljku u smislu

nedostatka ovog elementa. S obzirom da cink ima višestruku ulogu u rastu i razvoju biljaka, njegov

nedostatak izaziva velike promene, kako u razmeni materija, tako i u morfološkoj i anatomskoj

građi biljaka. Po svojoj prirodi i efektima, cink spada u grupu umereno toksičnih metala. Njegova

toksičnost za biljke je manja u odnosu na stepen toksičnosti koji je karakterističan za bakar. Prvi

znaci visoke koncentracije cinka javljaju se na kiselim tresetnim zemljištima, kao i na zemljištima

koja su nastala iz matičnog supstrata bogatog cinkom, kao i u okolini rudnika i topionica cinka.

Jasni znaci viška ovog elementa javljaju se kada njegova koncentracija u suvoj materiji prelazi 300

do 5000 mg/kg. U takvim slučajevima kod biljaka dolazi do nižeg rasta, smanjenja korenovog

sistema, obrazovanja sitnih listova i njihove nekroze.

2.2.5. Nikl

Nikl gradi dva tipa jedinjenja: nikl(II) i nikl(III). Veoma retko se nalazi u vidu ovih drugih

jedinjenja. Od poznatijih jedinjenja sa oksidacionim stanjem +2, tu su svakako nikl sulfat- NiSO4,

i nikl hlorid-NiCl2, koji se koriste kao komponente elektrolita za elektrohemijsko nanošenje nikla

na metale. Problem koji se javlja u procesima galvanske zaštite metala su otpadne vode koje se

moraju prečistiti pre ispuštanja u reke. Za to se koriste različiti postupci. Osim njih, poznat je i nikl

hipofosfit, koji služi kao komponenta rastvora za hemijsko nanošenje prevlaka, takođe i nikl

tetrakarbonil, kompleksno jedinjenje koje se primenjuje u organskoj sintezi. Još jedno jedinjenje

koje ima veliki značaj jeste NiO2. Iako je nikl ovde u oksidacionom stanju +4, i ovo je jedno od

retkih jedinjenja nikla u ovom oksidacionom stanju, ovaj oksid je našao primenu u izradi Ni-Cd

akumulatorima. Oni predstavljaju izuzetan problem kao otpad, nakon prestanka korišćenja, te se

moraju pažljivo i kontrolisano odlagati pre procesa reciklaže, koji je u poslednjim decenijama

razvijen u svetu i kod nas. Tako će se na najbolji način unaprediti stanje životne sredine i smanjiti

štetni uticaj nikla.

Nikl spada u grupu teških metala. Rasprostranjen je u prirodi. Veoma je toksičan metal i

može veoma štetno uticati na životnu sredinu ali je zbog svojih osobina našao je široku primenu.

Veliki sadržaj nikla u hrani direktno zavisi od njegovog sadržaja u zemljištu. Pravilnom

upotrebom hemijskih sredstava u poljoprivrednoj proizvodnji, smanjuje se rizik od pojave nikla u

hrani i tako eliminiše mogućnost pojave bolesti kod biljaka koja može u lancu ishrane izazvati i

razne bolesti kod čoveka.

Posebna uloga nikla u uticaju na stanje životne sredine je prisustvo ovog metala u zemljištu

i vodi. Prosečan sadržaj nikla u zemljištu je 40 mg/kg, a sadržaj zavisi od tipa zemljišta. Nikl se u

biljkama nalazi u malim koncentracijama od 1-10 ppm, pretežno u dvovalentnom obliku. Gornja

granica visoke koncentracije koja postaje toksična iznosi 10-50 ppm. Fiziološka uloga mu se ogleda

u pomaganju biljkama pri usvajanju gvožđa. Jako je bitan za aktivnost enzima ureaze, a ima uticaj

i na klijanje semena.

Dva najveća izvora nikla u zemljištu su matični supstrat i čovek, koji upotrebom

poljoprivrednih materijala i nepravilnim odlaganjem različitih proizvoda koji sadrže nikl, povećava

sadržaj ovog metala u zemljištu. Nikl ima dobru pokretljivost kako u ksilemu tako i u floemu

(biljnim tkivima) i u značajnoj količini se nakuplja u plodovima i semenu. Uočeno je da višak nikla

izaziva hlorozu koja podseća na hlorozu izazvanu nedostatkom gvožđa. Nikl nepovoljno utiče ne

samo na pokretljivost, odnosno translokaciju gvožđa, već i na samo njegovo usvajanje.

Ispitivanjem uticaja nikla na porast paradajza ustanovljeno je da relativno male koncentracije mogu


13

izazvati hlorozu, naročito kod mladih listova. Kod ovsa dolazi do nekroze a kod pšenice,

suncokreta i kukuruza do smanjenja rasta. Visoke koncentracije nikla u zemljištu izazivaju pojavu

oboljenja kod biljaka, a korišćenje biljaka u ishrani ljudi i životinja mogu da prouzrokuju pojavu

malignih oboljenja, kao rezultat inhibicije nekih enzima i poremećaja u radu imunološkog sistema.

Nikl se u vodi nalazi u vidu Ni2+ jona. MDK u vodi je 0,01mg/l. Povećan sadržaj nikla u vodi

može izazvati oboljenja bubrega kod čoveka.

2.2.6. Toksični efekti teških metala u biljkama

U ekološkom pogledu, svaki metal, ili metaloid koji prouzrokuje problem u životnoj sredini,

odnosno onaj koji se ne može biološki uništiti, trebalo bi posmatrati kao teški metal. Teški metali

su prirodne komponente Zemljine kore, ali su koncentracije nekih od njih, u mnogim ekosistemima,

dostigle toksične nivoe, pre svega kao posledica antropogenih aktivnosti. Do današnjih dana,

ukupno 53 elementa je svrstano u kategoriju teških metala, koja je preciznije definisana kao grupa

elemenata čija je gustina veća od 5 g/cm3.

Na osnovu svoje rastvorljivosti u fiziološkim uslovima, 17 teških metala može biti relativno

lako dostupno živim ćelijama, te su zato oni od posebnog značaja za organizme i ekosisteme u

celini. Fe, Mo i Mn su važni kao mikronutrijenti, Zn, Ni, Cu, V, Co, W i Cr su toksični elementi

neophodni u tragovima, dok As, Hg, Ag, Sb, Cd, Pb i U, nemaju nikakvu poznatu korisnu ulogu i

oni su toksični po žive organizme

Mnogi autori ukazuju da se i elementi kao što su: Cu, Zn, Ni i Co mogu smatrati esencijalnim

za normalan rast i metabolizam, jer je odavno poznato da su neophodni u brojnim fiziološkim

procesima koji se odvijaju u biljkama. Većina ovih metala su kofaktori enzima i uključeni su u

važne procese kao što su fotosinteza (Cu, Mn), transkripcija DNK (Zn), hidroliza uree u CO2 i NH3

(Ni), kao i nodulacija (stvaranje čvorova) kod leguminoza i fiksacija azota (Co, Zn); neki od njih

igraju važnu ulogu u cvetanju i produkciji semena, kao i porastu biljaka (Cu, Zn) (tabela2).

Da bi se biljke normalno razvijale i rasle, one moraju održavati koncentracije ovih

esencijalnih elemenata u okviru optimalnih vrednosti (stanje homeostaze). Kada njihove

koncentracije pređu te vrednosti, metali mogu ispoljiti i svoje toksične efekte (fitotoksičnost), koji

se obično ogledaju u redukovanoj biomasi, hlorozi lišća (smanjenje intenziteta fotosinteze),

inhibiranju rasta korena, kao i morfološkim alteracijama (slika1). Na celularnom nivou, posledice

produžene izloženosti visokim koncentracijama metala mogu biti dezintegracija membrane,

gubitak jona, peroksidacija lipida, degradacija DNK/RNK i konačno smrt ćelije. Fitotoksičnost je

pre svega povezana sa neesencijalnim metalima kao što su to: As, Cd, Pb i Cr, koji uobičajeno

imaju i veoma niske pragove toksičnosti (tabela 2).

Slika 5. Kriva zavisnosti mase biljaka od koncentracije metala (Zn i Cd)

Za esencijalne mikronutrijente postoji gornja granica rasta biljaka u odnosu na niske i visoke

koncentracije metala. Kada su koncentracije Zn ispod donjih kritičnih vrednosti, biljke će


14

ispoljavati deficit, ali ako su koncentracije iznad gornjih granica, biljke će pokazati toksičnost

izazvanu viškom cinka. Kako bi se biljke normalno razvijale i rasle, one moraju održavati

koncentracije esencijalnih mikronutrijenata u okviru optimalnih vrednosti. Neesencijalani elementi

nisu neophodni za rast biljaka. Kada je koncentracija Cd na primer, ispod graničnih vrednosti,

biljke će biti tolerantne. U suprotnom, kada koncentracija Cd pređe granične vrednosti biljke će

postati osetljive.

Tabela 2.2. Uloga metala u biljkama i mogući toksični efekti sa odgovarajućim koncentracijama

Metal Funkcija u biljkama Toksični efekti

Normalne koncentracije (mg/kg suve

mase)

Prag toksičnosti u tkivu biljaka (mg/kg suve

mase)

Cu

Redoks aktivan; odlučujući kofaktor komponenata lanca transporta elektrona u mitohondrijama i

hloroplastu; konstituent brojnih

enzima; važna uloga u kvalitetu reprodukcije i roda biljne kulture;

asimilacija CO2 i sinteza ATP.

Usporen biljni rast i hloroza lišća. 4-15 5-20

15-20 2-100

Pb /

Inhibicija enzimske aktivnosti

vezivanjem na sulfhidrilne grupe,

vodni disbalans, promene u permeabilnosti membrane i

poremećaj mineralne ishrane.

1-13 0.2-20

10-20 30-300

Zn

Konstituent enzima i ćelijske membrane; aktivacija enzima;

transkripcija DNK; učešće u

reprodukciji i određivanju roda i kvaliteta biljnih kultura; otpornost

na biotičke i abiotičke stresove;

čvorovanje kod mahuna i fiksacija

azota; redoks neaktivan.

Ograničen rast korena i izdanka, kao

i hloroza pre svega mladog lišća.

Višak cinka može izazvati

deficitarnost u bakru, manganu i

fosforu.

8-100 1-400

150-200 100-400

Cd /

Direktno - oštećenje ćelijske strukture, ili indirektno – zamena

esencijalnih metala. Inhibicija metabolizma

gvožđa, hloroza; inhibicija disanja i transporta elektrona u procesu

oksidativne fosforilacije; inhibicija

transpiracije kao i stominih pokreta.

0.1-2.4 5-10

10-20 5-30

Ni Konstituent enzima; aktivacija

ureaze

Hloroza koja podseća na hlorozu izazvanu nedostatkom gvožđa. Nepovoljno utiče ne samo na translokaciju Fe, već i na samo

njegovo usvajanje; poremećaji u balansu nutritijenata, vode i funkciji

ćelijske membrane.

1 0.02-5

20-30 10 kod

osetljivih vrsta 50 kod umereno tolerantnih

vrsta 10-100

Brojne biohemijske reakcije postoje u biljkama koje trpe stres izazvan metalima, ili

metaloidima. Većina ovih reakcija nastaje kao posledica zamene u katjonskim centrima proteina,


15

zatim visokog afiniteta za vezivanje na tiolne grupe metabolički važnih molekula (blokiranje

funkcionalnih grupa enzima), ili pak povećanja produkcije reaktivnih kiseoničnih vrsta, tj. radikala

(Reactive Oxygen Species, ROS) (slika 6).

Produkcija slobodnih radikala je inače efekat koji se uobičajeno javlja kod svih stresnih

uslova koji se mogu pojaviti u okruženju biljke kao što su: izraženi salinitet zemljišta, suša,

ekstremne temperature, napad različitih vrsta patogena, kao i preterane koncentracije teških metala.

Kao posledica nastalog oksidativnog stresa, javlja se akumulacija ROS molekula, koji pak dalje

aktiviraju određeni odbrambeni mehanizam u biljci (slika 6), tako da se može reći da ROS imaju

dvostruku ulogu: oni deluju i kao oksidacioni molekuli koji agresivno reaguju sa ćelijskim

makromolekulima, ali i kao signalni molekuli koji pomažu biljci da oseti prisustvo metala.

Preciznije rečeno, biljci je potrebno da oseti te sofisticirane promene u koncentracijama metala u

svojim tkivima, odnosno promene koje se dešavaju već na nivou citoplazmatičnih koncentracija i

koncentracija u organelama, radi pripreme za detoksifikaciju. Biljka u ove procese uključuje i

enzimske (superoksid-dismutaza, SOD, katalaza, itd.) i neenzimske molekule (askorbat i glutation,

GSH) koji imaju sposobnost detoksifikacije ROS.

Slika 6. Toksični efekti teških metala u biljkama

Afinitet teškog metala za vezivanje na proteine promeniće njihovu aktivnost i prouzrokovati

disbalans i prekide koji vode do makromolekularnih oštećenja. Međutim, ćelije se mogu "podesiti"

prema toksičnim metalima i signalizirati određene reakcije kako bi prevenirale oštećenja.

Ljubičaste sfere-metali koji imaju oksido-redukcione sposobnosti; crvene i plave sfere- metali koji

ne poseduju ove sposobnosti; zelene sfere- metalni centri u proteinima napadnuti od strane teških

metala.


16

Vrlo često, međutim u slučajevima velike izloženosti, bilo koji od navedenih poremećaja,

može dovesti i do uginuća biljaka. I dok životinje i ljudi mogu da se kreću i tako izbegnu

kontaminirane predele, sa biljkama to nije slučaj, tako da su one prinuđene da pronađu drugačiju

vrstu taktike kako bi mogle da se izbore sa ovim problemom. Neke biljke su u tome bile toliko

uspešne, da su se razvile u takozvane tolerantne vrste, tj. vrste koje mogu opstati i razvijati se i na

teško kontaminiranim terenima. Brojne studije ukazuju da te biljne vrste ovo ostvaruju

adaptiranjem mehanizama koji su uključeni u homeostazu. Strategija usvojena od strane biljaka

kao odgovor na visoke koncentracije teških metala u okruženju, regulisana je na molekularnom

nivou i ogleda se u izbegavanju usvajanja preteranih količina metala u samu citoplazmu (citosol),

gde metali u stvari i ispoljavaju svoju fitotoksičnost. Pri tome, primećeno je da biljke poseduju

čitav niz celularnih mehanizama koji se potencijalno mogu uključiti u proces ostvarivanja ovog

cilja, praktično u proces detoksifikacije teških metala, odnosno u proces tolerancije prema

metalnom stresu.

2.2.7. Transport metala među biljnim tkivima

Do današnjih dana ostalo je nerazjašnjeno da li je u proces detoksifikacije/tolerancije prema

pojedinom metalu uključen samo jedan, ili više pomenutih mehanizama. Takođe je nedovoljno

jasno kakvi su mehanizmi adaptacije uključeni u uslovima kada biljka raste na zemljištu koje je

zasićeno prisustvom više teških metala. Postoji mišljenje da se u ovom slučaju razvija pojava

poznata kao "kotolerancija" (co-tolerance) zasnovana na delovanju nedovoljno specifičnog

mehanizma koji razvija otpornost prema širokom opsegu metala, ili pak pojava poznata kao

"višestruka tolerancija" (multiple tolerance) koja uključuje seriju nezavisnih mehanizama

specijalno razvijenih za svaki pojedini metal. Kako su dokazi za pojavu kotolerancije još uvek

nedovoljno jaki, pretpostavlja se da je višestruka tolerancija onaj mehanizam koji je i realno moguć.

Mnoge od esencijalnih uloga metala odvijaju se u fotosintetičkim tkivima nadzemnog dela biljke.

Zbog toga se metali moraju transportovati iz korena do onih tkiva u kojima su potrebni za normalno

funkcionisanje biljke. Iz epidermalnih ćelija korena, metalni joni se dalje mogu kretati kroz

simplastične prolaze do pericikla, kako bi bili ubačeni u ksilem. Ovo je moguće ostvariti jedino

aktivnim transportom. Metali dalje putuju kroz ksilem transpiracionim tokom, do nadzemnih

delova. Kako se pojedina tkiva, kao što je tkivo semena, ne ishranjuju putem transpiracionog toka,

to se ona moraju oslanjati na floem. Ovo se odnosi i na tkiva mladog lišća u razvoju, koja još uvek

nemaju dobro oformljen ksilem (floem se diferencira mnogo brže u odnosu na ksilem).

2.2.8. Mehanizmi mobilizacije metala od strane biljaka i usvajanje

Efikasno usvajanje esencijalnih metala neophodno je za normalan rast i razvoj biljaka,

odnosno za održanje normalne homeostaze i svaka biljna vrsta u tom smislu, razvija odgovarajuće

sposobnosti. Plazma-membrana korena biljke može se posmatrati kao prva živa struktura koja se

nalazi na putu usvajanja metala u samu biljku. Najaktivnije područje ovog procesa nalazi se 20-40

mm iznad korenove kape. Sa ove tačke, bilo koja apsorbovana supstanca može da prolazi u druge

delove biljke kroz sva živa tkiva (simplast – floem i ćelijska citoplazma), ali i neživa tkiva (apoplast

– ćelijski zidovi i ksilem).

Smatra se da metali mogu da uđu u biljku pasivno, prodiranjem vode, putem apsorpcije u

simplast korena vođeni gradijentom elektrohemijskog potencijala same plazma-membrane, ili pak

aktivno, uz učešće proteina smeštenih u dvostrukom lipidnom sloju membrane koji omogućavaju

transport metala kroz plazmalemu (tzv.transportni proteini, ili proteini-transporteri).

Naime, iako metalni joni mogu da difunduju u apoplast korena (prostor između ćelijskog zida

i plazma-membrane), njihov dalji transport kroz apoplast je ustvari blokiran nepropusnim


17

prostorom smeštenim u endodermalnom sloju tkiva korena ( tzv. Kasparijev prostor). Na ovom

mestu, metalni joni moraju dalje biti transportovani kroz plazmamembranu u simplastični prostor

na jedan aktivan način. Ovaj transport u simplast epidermisa opet podrazumeva angažovanje

transportnih proteina membrane. Familije proteina-transportera su brojne i uglavnom specifične za

svaki pojedini metal. Tako na primer, Fe 2+ se primarno usvaja transporterom visoke specifičnosti

IRT1 koji pripada tzv. familiji ZIP-proteina (Zinc-regulated transporter/Iron-regulated

transporter Proteins) koji omogućavaju transport dvovalentnih jona i kod korena i kod izdanka.

Ekspresija (pojava) IRT1 je regulisana (dirigovana, uslovljena) nedostatkom Fe u zemljištu.

Akumulacija Fe u tkivu biljke prilikom pojave IRT1, očigledno se javlja kao njen odgovor na

izazvan stres. Ovo sve nameće zaključak o genetskoj kontroli ekspresije IRT1. Ovaj protein može

transportovati i druge dvovalentne metalne jone, ali ne i Zn. Još uvek nije poznato koji su to tačno

transporteri iz ZIP familije zaduženi za usvajanje Zn, ali se pretpostavlja da i Ni koristi isti put

ulaska u biljku.

ZIP transporteri takođe omogućavaju ulazak neesencijalnih jona Cd 2+ u ćelije korena. U

ovom slučaju radi se o više ortologa. Pri ovome, primećeno je da visoke koncentracije Fe u

zemljištu često redukuju usvajanje Cd od strane biljaka. I drugi dvovalentni metali, kao što su Zn,

Ca, Mg i Cu, takođe mogu da inhibiraju usvajanje Cd iz rizosfernog rastvora, među kojima nivo

Ca ima najjači uticaj. Naime, kako oba ova jona mogu prolaziti kroz membranu i putem katjonskih

kanala, to je njihova kompeticija jako izražena. Dodatno, kako i Cd i Zn mogu biti transportovani

u biljku istim transporterom ZNT1 (Zinc Transporter), to je odnos ova dva elementa (Zn/Cd),

veoma značajan za eventualno kasnije ispoljavanje toksičnosti samog Cd.

Za razliku od Fe, Zn i Cd koji se usvajaju kao dvovalentni joni, Cu se izgleda usvaja kao Cu+

i to pomoću proteina COPT1 (Copper Transporter). Kako se Cu u zemljištu uglavnom nalazi kao

dvovalentni jon, to se Cu2+ prvo mora redukovati pomoću FRO2 enzima (feri-helat-reduktaza, koja

inače redukuje i trovalentno Fe do dvovalentnog). Ipak, izgleda da je u nekim slučajevima moguće

da se Cu usvaja i kao dvovalentni jon, jer je primećena akumulacija proteina ZIP familije u

slučajevima deficijencije ovog jona.

Neesencijalni arsen(V) se od strane biljaka lako mobiliše i usvaja kroz transportne kanale

fosfata. Zbog njihove hemijske sličnosti, As(V) se nadmeće sa fosfatima u procesu usvajanja i

interferiše sa metaboličkim procesima, kao što je sinteza ATP-a (adenozin-trifosfat) i oksidativna

fosforilacija.

Za olovo, kao još jedan izrazito toksičan element, biljke nemaju kanale za usvajanje i još

uvek je nepoznato kako tačno ulazi u koren. Jedino se pouzdano zna da ovaj element može da

ostane vezan na karboksilne grupe uronskih kiselina na površini korena. Količina olova koja se

apsorbuje korenom uglavnom i ostaje u njemu, čineći tako koren prvom barijerom za dalju

translokaciju Pb u nadzemne delove biljke, gde bi njegova fitotoksičnost mogla da dođe do fatalnog

izražaja. U korenu, olovo se najvećim delom vezuje na ćelijski zid kao ekstraćelijski precipitat u

vidu fosfata, ili karbonata.

I druge metalne forme uobičajeno formiraju sulfatne, fosfatne, karbonatne i druge precipitate.

Ovi precipitati se dalje imobilišu ne samo u apoplastičnim prostorima, kao što je ćelijski zid, već i

u simplastičnim (unutarćelijskim) prostorima, kao što su vakuole. Vakuole su ćelijske organele

koje se smatraju rezervoarima za čuvanje metala i to pre svega u ćelijama semena, kome su zalihe

metala neophodne u onim inicijalnim fazama razvoja, kada usvajanje iz okolne sredine još uvek

nije moguće. Iako su obično prisutni u zemljištu u dovoljnim količinama, metali su često teško

dostupni usvajanju od strane biljaka, jer u podlozi predominantno postoje u svojim nerastvornim

formama.


18

Tako na primer, Zn i Cu su obično adsorbovani na česticama gline, CaCO3, ili organsku

materiju, dok se Fe sreće najčešće u vidu svojih hidroksida. Primećeno je da visoke vrednosti

parametara kao što su kapacitet izmene katjona (cation exchange capacity, CEC) i pH zemljišta,

redukuju dostupnost većine metala, samim tim i mobilnost i izluženje. Naime, primećeno je da

usvajanje metala od strane biljaka više zavisi od njihovih biodostupnih frakcija, a manje od ukupne

količine metala u zemljištu. U ovom smislu, ističe se dostupnost metala zavisi od: intenziteta

adsorpcije metala na česticama zemljišta, sposobnosti biljaka da desorbuju i prenesu metale do

svojih tkiva, ali i interakcije sa mikroorganizmima zemljišta.

Kako bi se izborile sa nedostupnošću metala, tj. kako bi ih učinile dostupnijim za usvajanje

(biodostupnost), biljke su razvile različite mehanizme. Tako se na primer, biljke iz familije trava

(Poaceae), tj. monokotiledone biljke, služe strategijom baziranom na helatizaciji metala, dok su

dikotiledone biljke razvile strategiju baziranu na promeni oksidacionog stanja metala (praktično na

redukciji). Takođe, biljke se sa ovim problemom mogu izboriti i pokušajem zakišeljavanja

zemljišta.

2.2.9. Transport koren-nadzemna tkiva

Tačan transporter koji prevodi Fe u ksilem još uvek nije poznat, ali je najverovatnije da se

Fe transportuje u helatnom obliku do drugih molekula. Kao kandidati za helatizaciju pojavljuju se

citrati i nikocian-amin (NA). NA je nađen u svim višim biljkama i služi kao prekursor u formiranju

fitosiderofora kod trava. Međutim, pH koje vlada u ksilemu favorizuje helatizaciju Fe sa citratima,

pre nego sa NA. Nesumnjiva je činjenica da Fe postoji u ksilemu pre svega kao Fe3+-citrat (slika

3). Transporter citrata, feri-reduktaza FRD3, koja je smeštena na plazma-membrani pericikla

korena i vaskularnog cilindra, je onaj protein koji isporučuje citrat u ksilem. Biljke koje nemaju

ove proteine, hiperakumuliraju Fe u tkivu korena.

Cink se isporučuje u ksilem na dugodometni transport preko HMA2 transportera (Heavy

Metal transporting ATP-ases), koji su lokalizovani na plazma-membrani između korena i

nadzemne vaskulature (slika 3). Generalno, HMAs proteini se dele u dve klase: oni koji

transportuju monovalentne katjone (Cu/Ag grupa) i oni koji transportuju dvovalentne katjone

(Zn/Co/Cd/Pb grupa). Ligandi koji bi mogli da omoguće transport Zn u nadzemne delove su NA i

organske kiseline.

Da isporučivanje Cu u vaskulaturu takođe postoji kroz HMAs familiju proteina, pokazali su

i eksperimenti: ekspresija HMA5 postoji u korenu samo u slučaju previsokih koncentracija ovog

metala u tom delu biljke. Akumulacijom HMA5, biljka nastoji da te visoke koncentracije prevede

iz korena u nadzemne delove. Tom prilikom, Cu se izgleda pre svega helatizuje na NA.

Biljke translociraju u svoje nadzemne organe čak i Pb, koje, kao ekstremno toksičan element

inače nastoje da zadrže u korenu. Tako se preostalo nevezano Pb, preko Ca-kanala prvo prebacuje

do Kasparijevog prostora endodermisa. Pri niskim koncentracijama Pb, ovaj prostor može da bude

dobra barijera za dalje kretanje prema tkivu centralnog cilindra. Međutim, Pb se može helatizovati

na fitohelatine i tako preneti u nove strukture. Takođe, neke biljke transportuju Pb do stabljika i

listova u strukturama sličnim Pb-acetatu, Pb-nitratu i Pb-sulfidu.

2.2.10. Intracelularni transport

Kada su jednom transportovani u odgovarajuće tkivo, metali se moraju ispravno distribuirati

i na celularnom nivou, tj. u samoj ćeliji, kako bi se njihovi neophodni nivoi osigurali u

odgovarajućim delovima ćelije, ili pak kako bi se bezbedno uklonili njihovi viškovi. Tako na


19

primer, Fe, Cu i Zn se moraju transportovati do hloroplasta, mitohondrija, ali i vakuola, što je sve

takođe uslovljeno i omogućeno ekspresijom odgovarajućih proteina transportera.

Slika 7. Međućelijski transport metala u dikotiledonim biljkama. Oblast kvadrata, tamno braon boje,

predstavlja Kasparijev prostor; FRO2 i AHA – enzimi koji doprinose boljem usvajanju metala; ZIP,

IRT1, COPT1, HMAs, FRD3, YSL – proteini transporteri; NA – nikocian-amin

Biljke mogu da poseduju čitav niz potencijalnih celularnih mehanizama koji su uključeni u

procese detoksifikacije i tolerancije prema metalnom stresu, kao što su:

1. upotreba mikoriza u restrikciji kretanja metala prema korenu,

2. vezivanje metala na ćelijski zid i izlučivanje ekstracelularnih ekskudata korena,

3. redukovano usvajanje, ili čak ispumpavanje metala na plazma membrani korena,

4. helatizacija metala u citosolu različitim ligandima (peptidi bogati cisteinom: fitohelatini,

PCs i metalotioneini, MTs, kao i amino- i organske kiseline) radi:

a) popravke proteina membrane koji su oštećeni stresom (MTs i HSPs (Heat Shock Proteins,

proteini indukovani toplotnim šokom)) i

b) kompartmentacije metala u vakuole fitohelatinima i to transporterima lokalizovanim u

tonoplastu (na primer: razmenjivač protona sa jonima metala, tj. antiporter: H+/katjon metala je

protein koji je integralni deo fosfolipidne membrane i omogućuje aktivni transport dva jona u

suprotnim pravcima, tj. omogućuje njihovu razmenu).

Uloga mikoriza

Uloga gljiva koje žive na korenju biljaka (pre svega drveća i žbunja), a posebno ektomikoriza,

još uvek je nedovoljno jasna u smislu efekata koji se pojavljuju prilikom usvajanja metala od strane

biljaka. Brojna istraživanja koja su se bavila ovim pitanjem pružila su kontradiktorne rezultate.

Tako na primer, pokazalo se da ektomikorizalna gljivica Paxillus involutus zadržava Zn, tj. ne

dozvoljava njegov prodor u tkiva biljke crnog bora (Pinus sylvestris), dok jedna druga

ektomikorizalna gljivica: Thelephora terrestris, zadržava samo manju količinu cinka i čak

omogućava povećanje sadržaja ovog metala u domaćinu. Naime, gljive pre svega ostvaruju

restrikciju kretanja metala prema korenju biljke-domaćina, što se realizuje kroz: apsorpciju metala

na samom gljivičnom omotaču, redukovani pristup metala u apoplast korena (u skladu sa

hidrofobnošću samog štita), helatizaciju ekskudatima gljiva i adsorpciju na spoljašnjem

micelijumu.


20

Vezivanje metala na ćelijski zid i izlučivanje ekstracelularnih ekskudata korena

Vezivanje metala na ćelijski zid korena je još jedna kontroverzna tema, jer iako je ovaj biljni

organ u direktnom kontaktu sa zemljišnim rastvorom, adsorpcija metala na ćelijskom zidu mora da

bude ograničenog kapaciteta, te zbog toga ima i ograničeni uticaj na aktivnost metala na površini

plazma-membrane. Ipak, istraživanja su pokazala da metal-tolerantna vrsta, Silene vulgaris ssp.

humilis akumulira brojne metale na ćelijskom zidu epidermisa, podjednako vezane na proteine, ili

pak u vidu silikata.

Ćelijski zid korena identifikovan je kao krucijalno mesto nagomilavanja kod biljaka, kao i

da je ta depozicija jedan od odlučujućih mehanizama u toleranciji teških metala. Pretpostavlja se,

naime, da zbog svog negativnog naelektrisanja, ćelijski zid ima značajan kapacitet za vezivanje i

zadržavanje teških metala. Analiza lokalizacije Cd elektronskim mikroskopom pokazala je da

ćelijski zid korena sadrži najveći deo ovog metala u poređenju sa sadržajem u citoplazmi.

Mnogo pouzdaniji dokazi nađeni su na polju izlučivanja različitih ekskudata biljaka, za koje

se pokazalo da mogu na više načina da deluju na metale iz zemljišta. Ekskudati biljaka uobičajeno

sadrže ligande koji su pogodni za helatizaciju metala (brojne amino i organske kiseline, itd.), te se

njihovim izlučivanjem u zemljište uobičajeno mobilišu mnogi metalni joni, koji na taj način postaju

dostupniji za usvajanje.

Slika 8. Sistemi koji su uključeni u usvajanje i translokaciju od korena do izdanka, kao i sekvestraciju

teških metala kod biljaka hiperakumulatora

Uloga plazmaleme

Visoke koncentracije teških metala (posebno Cu) mogu značajno uticati na funkciju

plazmaleme. Tako je na primer, bilo pokazano da visoke koncentracije Cu, ali ne i Zn, izazivaju

povećani efluks K+-jona iz korenja Agrostis capilaris. Sličan efekat Cu je pokazao i na druge jone,

te se danas smatra da je ovo "curenje" jona glavni pokazatelj oštećenja membrane usled toksičnog


21

dejstva Cu. Ovakvo oštećenje može biti rezultat različitih mehanizama uključujući oksidaciju i

unakrsno vezivanje tiolnih grupa proteina, inhibiciju ključnih membranskih proteina, kao i

promenu u sastavu i permeabilnosti lipida membrane. Kontradiktorno, tolerancija može obuhvatiti

zaštitu integriteta plazma-membrane čak i putem povećanog curenja ćelijskog rastvora, mada u

ovom smislu, još nema dovoljno dokaza.

Drugi faktor koji može biti uključen u održanje integriteta membrane u prisustvu teških

metala može biti i poboljšana reparacija membrane posle njenog oštećenja. Ovo uobičajeno

podrazumeva učešće proteina indukovanih toplotnim stresom (Heat Shock Proteins) i

metalotioneina (MTs).

Sledeći faktori koji igraju značajnu ulogu u homeostazi metala jesu prevencija, ili redukcija

njihovog ulaska u biljnu ćeliju, ili pak aktivni efluks, odnosno izbacivanje metala ukoliko su već

usvojeni u citosolu. Međutim, kako su mnogi od metala i esencijalni za biljke, to njihova potpuna

ekskluzija nije moguća; selektivni efluks je mnogo verovatniji. Najjasniji primer redukovanog

usvajanja kao mehanizma tolerancije stečenog adaptacijom vezan je za As: kod genotipa biljke

Holcus lanatus koji je tolerantan prema ovom metaloidu, iznosi usvajanja su mnogo niži nego kod

netolerantnog genotipa. Tolerantne biljke verovatno razvijaju supresiju transportnog sistema

visokog afiniteta i to zajedno sa povećanom produkcijom fitohelatina ( PCs), pošto se značajne

količine As svakako još uvek mogu naći u citosolu. Alternativna strategija za kontrolu

intracelularnih nivoa metala, aktivni efluks (efluks pumping) je mehanizam za koji postoji vrlo

malo direktnih dokaza. Kod bakterija, međutim, ovo je osnova skoro svih rezistencija prema

toksičnim jonima, gde su uključeni transporteri kao što su ATP-aze P-tipa, ili katjon/H + antiporteri.

Kod biljaka, efluks transporteri koji su identifikovani su: CPx-ATP-aze, NRAMP (Natural

Resistance Associated Macrophage Protein) , familija proteina CDF (Cation Diffusion Facilitator)

i familija ZIP proteina.

Uloga helatora metala

Proteini indukovani toplotnim šokom

Proteini indukovani toplotnim šokom (HSPs) su pronađeni u svim vrstama organizama, kao

odgovor na stresne uslove, pa tako i u slučajevima metalnog stresa. Mogu biti različite molekulske

mase, pa se razlikuju "sitni" i "krupni" HSPs. HSPs su odgovorni za normalno funkcionisanje

proteina, ali imaju i ulogu u njihovoj zaštiti i reparaciji. U uslovima visokih koncentracija teških

metala kao što su Cu i Cd na primer, primećena je povećana ekspresija ovih proteina kod mnogih

metaltolerantnih biljaka i to kako u nukleusu i citosolu, tako i u plazma-membrani (praktično,

zaštita i unutrašnjosti ćelije i same membrane).

Fitohelatini

Jedan od najvažnijih mehanizama u detoksifikaciji i toleranciji prema teškim metalima

predstavlja stvaranje helata u citosolu ćelije. Ovo se odvija zahvaljujući prisustvu onih molekula

koji imaju visok afinitet prema metalima, te tako grade sa njima odgovarajuće komplekse. Kao što

je već istaknuto, potencijalni ligandi u ovom slučaju su amino-kiseline, organske kiseline i peptidi

bogati cisteinom: fitohelatini (PCs) i metalotioneini (MTs).

PCs su peptidi koji se indukuju u biljci vrlo brzo posle izlaganja metalnom stresu. PCs se

sintetišu uz enzim PC-sitaza koji se aktivira upravo u prisustvu metalnih jona koristeći kao supstrat

molekul glutationa. Osim funkcije prekursora fitohelatina, GSH se danas smatra najvažnijim


22

antioksidantom uključenim u ćelijsku odbranu od toksikanata; on funkcioniše kao direktni "hvatač"

slobodnih radikala nastalih u biljci koja se razvija pod stresnim uslovima.

Koristeći biljku Brassica juncea, bilo je pokazano da se ovi peptidi brzo biosintetišu u ćeliji

posle izlaganja visokim koncentracijama Cd i to čak u količini koja je teoretski bila dovoljna da

helatizuje sav usvojeni Cd . PCs helatizuju slobodne jone Cd preko tiolnih grupa cisteina, štiteći

na taj način citosol od toksičnih efekata ovog opasnog polutanta, dok poslednji korak u

Cddetoksifikaciji uključuje akumulaciju helata Cd-PCs u vakuolama .

Osim Cd, PCs su važni i za detoksifikaciju od As, ali zato nije do kraja jasno kakvu ulogu

igraju u detoksifikaciji Zn, Ni i Se. Takođe, njihova uloga u detoksifikaciji Cu još uvek nije

dovoljno jasno potvrđena. PCs takođe mogu helatizovati i druge ekstremno toksične metale, kao

što je olovo.

Metalotioneini

Metalotioneini (MTs) su polipeptidi koji su lokalizovani u citosolu i mogu da helatizuju

metalne jone formirajući komplekse. Oni se produkuju kao odgovor na metalni stres i mogu se

klasifikovati u dve osnovne grupe. Klasa 1MTs poseduje ostatke cisteina koji se mogu porediti sa

ostacima cisteina kod MTs sisara, dok se ova paralela ne može povući kod klase 2MTs. Mnoge

više biljke imaju i više klasa ove familije proteina, ali njihova potpuna uloga u detoksifikaciji teških

metala tek treba da bude objašnjena. Smatra se da mogu imati značajnu ulogu u vezivanju Cd.

Takođe se smatra ispravnim da oni mogu delovati u popravci oštećene membrane i kao

antioksidansi.

Organske kiseline i amino-kiseline

Karboksilne kiseline kao što su: limunska, jabučna i amino-kiseline poput histidina (His) i

NA su helatori teških metala, tako da se pretpostavlja da mogu uzeti ušešća i u procesima

detoksifikacije. Tako na primer, zapaženo je povećanje koncentracije His u ksilemu i do 36 puta

veće u odnosu na normalno, onda kada je biljka hiperakumulator Ni bila izložena visokim nivoima

ovog metala. Histidin takođe može biti i konstituent ekskudata korena.

Kompartmentalizacija u vakuole

Većina stručne javnosti se slaže da opisani efluks jona kroz plazma-membranu i transport u

vakuole predstavljaju dva najvažnija mehanizma tolerancije. Kompartmentalizacija u vakuole

potvrđena je u slučaju mnogih metala. Tako na primer, pomenuti mehanizam transporta Cd u

vakuole fitohelatinima se pokazao uspešnim i u slučaju Zn, što je bilo potvrđeno eksperimentima

sa Zn65 obeleženim jonom. Međutim, izgleda da ovo nije slučaj kada je u pitanju jon Ni. Moguće

je da se Ni i neki drugi metalni joni ubacuju u vakuole putem razmene sa jonima H+, tj. sistemom

katjon/H+ antiportera, ali i ova pretpostavka još uvek nije nesumnjivo potvrđena. Za Zn se

pouzdano zna da se može prebaciti iz citosola u vakuolu putem Zn2+/H+ antiportera, a isto važi i za

Cd (pomoću Cd/H+ antiportera).


23

2.3. Načini pripreme biljnih uzoraka za analizu

2.3.1. Postupak mokrog razaranja

Ove metode su malo manje zavisne od prirode uzorka jer velike količine dodatog reagensa

teže da potisnu uticaj raznolikosti sastava. One su stoga verovatno prvi izbor kada se radi sa novom

vrstom uzorka, pa se mokri postupak oksidacije realno može preporučiti za dobijanje svakog

elementa.

Kod tradicionalnog mokrog postupka razaranja uzorak se razgrađuje u Kjeldahl boci za

spaljivanje sa dugačkim grlom. Međutim, tip aparata prikazan na Slici 8 ima mnogo prednosti u

odnosu na tradicionalnu Kjeldahl metodu, i preporučuje se njegova upotreba. Ključna

karakteristika je slavina (A) sa tri položaja, koja se koristi da se omogući refluks (položaj a) ili

destilacija (položaj b) i uklanjanje destilata (položaj c). Njenom primenom, oksidacioni potencijal

sistema se može stabilizovati omogućavanjem refluksa smeše kiseline, ili se može pospešiti

omogućavajući destilaciju, i zatim ponovo stabilisati ispuštanjem destilata i vraćanjem u položaj

za refluks. Mogu se izdvojiti frakcije destilata, sačuvati za kasnije tretmane, ili ispitati (u slobodno

vreme u toku ispitivanja). U nekim slučajevima pogodno je koristiti bocu sa dva grla umesto sa

jednim (kao što je prikazano), da bi se stavio termometar u bocu. Na ovaj način, dužina stupnjeva

destilacije se može kontrolisati preko temperature koju dostiže reakcioni rastvor; ovo može biti

posebno važno kod smeša koje sadrže perhlornu kiselinu.

Slika 9. Aparatura za kontrolisano razaranje organskih materija

Predložene su različite smeše za razaranje, ali do sada nema ni jedne smeše koja na

odgovarajući način razara sve uzorke sa potpunim dobijanjem svih tragova metala.

Smeša azotne i sumporne kiseline

Ovo je najčešće korišćena smeša oksidacionih sredstava, i u jednoj i u drugoj opisanoj

varijanti je pogodna za dobijanje praktično svih elemenata osim selena, i moguće rutenijuma i

osmijuma, iz skoro svih tipova uzoraka, osim možda onih koji sadrže kovalentni hlorin. U ovom

poslednjem slučaju mogu nastupiti problemi sa elementima kao što je arsen ili germanijum gde se

mogu formirati isparljivi hloridi.

http://www.tehnologijahrane.com/wp-content/uploads/2009/11/aparatura-za-kontrolisano-razaranje-organskih-materija.jpg


24

Problemi mogu nastati kod uzoraka bogatih kalcijumom, jer usled taloženja kalcijum-sulfata

mogu nastati gubici usled koprecipitacije. Iako se većina metala dobija u potpunosti, razaranje je

sporo a potpuna razgradnja masti može da traje i do 24 h; sloj masti se obično izdvoji bez

razgradnje. Mnoge laboratorije još uvek koriste ovu metodu radije nego upotrebu perhlorne

kiseline, koja može biti štetna u drvenim digestorima.

Smeše sa perhlornom kiselinom

Perhlorna kiselina se može koristiti kao mali finalni dodatak u postupku koji se uglavnom

bazira na drugim oksidansima, ili kao glavni konstituent prisutan u sistemu od početka. U oba

slučaja moraju se preduzeti mere zaštite kod rukovanja perhlornom kiselinom.

Ne preporučuje se da se koristi perhlorna kiselina za razgradnju osim u prisustvu viška azotne

kiseline; azotna kiselina efikasno oksidiše većinu reaktivnih jedinjenja u uzorku pri srazmerno

niskim temperaturama, gde perhlorna kiselina nije efikasna, i pri nastavljenom zagrevanju

povećana snaga oksidacije perhlorne kiseline će delovati u pravcu dovršavanja razgradnje.

2.3.2. Postupak suvog razaranja

Mnogo je teže opisati suvu oksidaciju koja zadovoljava potrebe širokog spektra uzoraka.

Verovatno da ima toliko varijacija u osnovi postupka suvog razaranja, koliko ima i prehrambenih

analitičara i upoređivanje rezultata je često veoma teško, ali za davanje osnove za neophodne

varijacije sledeći postupak bi trebalo da bude odgovarajući.

Suština ovog postupka je u tome da se za razgradnju organskog dela uzorka koristi

atmosferski kiseonik.

Prednost mokrog postupka razaranja je što je dosta brz, potrebna je jednostavna aparatura i

manje su sklonosti ka gubicima usled isparavanja i zadržavanja na zidovima posude zahvaljujućim

„tečnim“ uslovima i niskim temperaturama. Nedostaci su: da je zbog velike količine reagenasa

potrebna slepa proba, nije pogodan za velike uzorke (do 10 g) i potrebno je značajno nadgledanje.

Nasuprot tome, postupak suvog razaranja ima i prednosti i nedostatke koji su skoro suprotni

postupku mokrog razaranja. Lako se radi sa velikim uzorcima, ništa ili malo reagensa se dodaje,

tako da je problem slepe probe sveden na minimum i potrebno je malo nadgledanja. Problem je što

je potrebno više vremena, oprema je skuplja i veća je mogućnost da dođe do gubitaka usled

isparavanja i zadržavanja na zidovima posude usled visoke temperature i suvih uslova.


25

2.4. Atomska apsorpciona spektrofotometrija

Atomska apsorpciona spektrofotometrija je apsorpciona metoda koja se zasniva na merenju

smanjenja intenziteta monohromatskog zračenja, nakon prolaska istog kroz atomsku paru uzorka.

To je tehnika koja se koristi u kvalitativnoj i kvantitativnoj analizi. Ovom tehnikom se određuje

oko 60 elemenata periodnog sistema . Metoda se zasniva na Lambert-Beer-ovom zakonu i

smanjenje intenziteta monohromatskog zračenja zavisi od broja atoma u osnovnom stanju koji su

u stanju da apsorbuju monohromatsko zračenje.

𝐼𝑡 = 𝐼0 · 10−𝜀𝑙𝑁0

ε-molarni apsorpcioni koeficijent

l-debljina sloja atomske pare uzorka

No-broj atoma u osnovnom stanju koji mogu da apsorbuju zračenje

Ako se prethodna jednačina predstavi u logaritamskom obliku, kao:

i ako se uzme da je dužina apsorpcionog sloja konstantna pri određivanjima, dobija se:

U atomskoj apsorpciji linearnost postoji samo pri manjim vrednostima apsorbance,

najčešće do A <0,2. Dakle, linearna zavisnost moguća je samo u oblasti niskih apsorbanci ali i tada

je taj opseg različit za različite elemente. Najčešće odstupanje od linearnosti je povijanje prema

koncentracionoj osi–što se definiše kao normalna zakrivljenost. Retko je povijanje prema osi

apsorbance–obrnuta zakrivljenost, vrlo retko se događa složena zakrivljenost.

Slika 10. Zavisnost apsorbance od koncentracije, 1 – linearna zavisnost, 2 – normalna zakrivljenost,

3 – obrnuta zakrivljenost

Atomska apsorpciona spektrofotometrija je relativna analitička metoda u kojoj se signal elementa

koji se ispituje poredi sa signalom istog u standardnom rastvoru poznate koncentracije.


26

U atomskoj apsorpcionoj spektrofotometriji primenjuju se dve metode kalibracije:

1) direktna kalibracija, pri određivanju metala iz rastvora poznatog ili jednostavnijeg sastava

matrice

2) kalibracija standardnim dodavanjem, kod složenog ili nepoznatog sastava matrice. Ova

tehnika se često koristi i pri ekstrakcionim postupcima određivanja kada se neorganski

standard podvrgava kompleksiranju i ekstrakciji kao i uzorak.

Direktna kalibracija daje veću tačnost određivanja u širokom rasponu apsorbance, za

razliku od kalibracije standardnim dodavanjem koja ima ograničenja zbog potrebe rada u oblasti

linearne zavisnosti apsorbance od koncentracije.

Direktna kalibracija podrazumeva određivanje uz upotrebu standardnih rastvora koji su

pripremljeni sa istovetnim rastvaračem kao i uzorak, sa ili bez upotrebe jonizacionih pufera,

reagenasa za oslobađanje ili dodataka za podešavanje sastava matrice.

2.4.1. Atomski apsorpcioni spektrofotometar

AAS aparati zovu se atomski apsorpcioni spektrofotometri. Osnovni delovi:

1) izvor zračenja

2) atomizer

3) monohromator (disperzioni element)

4) detektor

Izvor zračenja

Kao izvor zračenja koristi se lampa sa šupljom katodom koja je diskontinualni izvor zračenja.

Razlog je to što kontinualni izvori emituju široke spektralne linije slabog intenziteta, pa veći deo

zračenja (95%) ne biva apsorbovan, a lampa sa šupljom katodom emituje uske i intenzivne

spektralne linije.

Intenzitet apsorpcione trake određivanog elementa je 10 puta manji od propusne širine

monohromatora, pa kad se koristi kontinualni izvor veliki deo zračenja ostaje neapsorbovan.

Lampa sa šupljom katodom emituje linije koje su reda veličine ili manje od poluširine apsorpcione

linije ispitivanog elementa.

Cev sa šupljom katodom (Slika 11) se sastoji od staklenog balona sa prozorom od kvarca u

kojem je smeštena šuplja katoda i anoda koja se izrađuje od volframa ili cirkonijuma u obliku

spirale. Katoda se izrađuje od ispitivanog elementa ili ako to nije moguće tehnički onda od legure

tog elementa ili se ispitivani element u vidu tankog sloja nanosi na unutrašnjost katode. Za svaki

ispitivani element potrebna je druga lampa. Lampa se puni inertnim gasom, neonom ili argonom

pod niskim pritiskom (200-1000Pa). Inertni gas služi kao energetski pufer, jer jonizacioni

potencijal gasa određuje maksimalnu energiju ekscitacije. Na ovaj način se sprečava pojava drugih

rezonantnih linija, koje zahtevaju veću energiju ekscitacije. Da bi se povećao intenzitet pražnjenja

i da bi se ono usmerilo što bolje u unutrašnjost katode oko nje se nalazi ekran od izolatorskog

materijala, najčešće stakla ili kvarca. Napon pražnjenja iznosi do 200V a struja pražnjenja je od

220Ma. Maksimalna jačina struje na kojoj lampa radi utisnuta je na telu lampe.


27

Slika 11. Cev sa šupljom katodom

Kada se lampa uključi u struju usled saopštene razlike potencijala između anode i katode,

dolazi do jonizacije inertnog gasa. Stvoreni pozitivni joni kreću se ka katodi i reaguju sa atomima

ispitivanog elementa, dolazi do pobuđivanja atoma i nakon vraćanja u osnovno stanje dolazi do

emisije zračenja koje je karakteristično za svaki ispitivani element. Elektroni nastali jonizacijom

vrše dodatnu jonizaciju gasa, pa se gas kojim je punjena lampa naziva nosiocem pražnjenja.

Do danas su uspešno konstruisane cevi sa šupljom katodom za veliki broj elemenata (metala).

Na tržištu nalaze lampe koje predstavljaju 10 elemenata u kombinaciji. Cevi sa šupljom katodom

nisu konstruisane za elemente koji imaju rezonantnu liniju u oblasti ispod 190 nm (vakuumska UV

oblast), jer je spektrofotometrijsko merenje u ovoj oblasti teško izvodljivo (potreban je vakuum),

a to su elementi C, H, N, O, S, P, halogeni elementi i inertni gasovi.

Slika 12. Šematski prikaz atomskog apsorpcionog spektrofotometra i principa merenja atomske

apsorpcije

Atomizer

Uloga atomizera je da vrši atomizaciju uzorka. Postoje dve vrste:

1) plameni

2) termalni


28

Plameni atomizer

Plamen je niskotemperaturni izvor pobuđivanja. Temperatura plamena varira i zavisi od

sastava gasne smeše tj. od goriva i oksisansa. U zavisnosti od temperature plamena razlikuju se

niskotemperaturni (od 1000 do 2000 K), srednjetemperaturni (od 2000 do 3000 K) i

visokotemperaturni (od 3000 do 4500 K). Temperatura ugljovodoničnih plamena ne prelazi 3000

K, jedino smeša dicijana i kiseonika dostigne 4500 K.

Kao niskotemperaturni izvor pobuđivanja plamen se koristi za pobuđivanje elemenata koji

imaju niske energije jonizacije (alkalni i zemnoalkalni elementi).

U strukturi plamena razlikuju se tri zone:

1) unutrašnja zona u kojoj se vrši mešanje goriva i oksidansa i njihovo paljenje

2) središnja zona (redukciona) u kojoj se vrši nepotpuno razlaganje goriva tj. Redukcija

(plavozelena boja)

3) spoljašnja zona u kojoj se vrši potpuno razlaganje goriva tj. potpuna oksidacija

(plavoljubičasta boja)

Slika 13. Zone plamena

U AAS se koristi smeša acetilena i vazduha (ili acetilena i azot-suboksida). Ovi plamenovi

spadaju u srednjetemperaturne (2000 – 3000K). Ako bi se koristili niskotemperaturni plamenovi

efikasnost atomizacije bi bila mala (negativna karakteristika), dok sa druge strane ne bi dolazilo do

hemijskih interferencija (pozitivna karakteristika). Ako bi se koristili visokotemperaturni

plamenovi efikasnost atomizacije bi bila dobra ali bi dolazilo do hemijskih interferencija. Kod

srednjetemperaturnih plamenova postignut je kompromis u pogledu atomizacije uzorka i mogućih

hemijskih interferencija. Uzorak se uvodi u vidu aerosola.


29

Oblik plamena je konusan i zavisi od brzine prostiranja gasova i mešanja gasova . Brzina

prostiranja i mešanja gasova treba da bude 2-3 puta veća od brzine prostiranja plamena da ne bi

došlo do uvlačenja plamena u gorionik i eksploziji. Danas se koristi difuzioni plamen kod koga se

mešanje goriva i oksidanasa vrši na samom izlazu iz gorionika.

Plamenik koji se koristi je većeg otvora kako bi zračenje iz lampe sa šupljom katodom duže

putovalo kroz atomizer pri čemu bi bila efikasnija apsorpcija tog zračenja od strane slobodnih

atoma. U plamenoj fotometriji plamenik je okruglog oblika.

Tabela 2.3. Vrste plamena

Smeše, temperature i elementi za određivanje

Naziv smeše

Radne

temperature

Elementi koji se određuju

Vazduh/vodeni gas 1800oC Alkalni metali, Zn, Cu, Cd, Pb

Vazduh/propan 1900oC Alkalni metali, Zn, Cu, Cd, Pb

+isparljivi elementi

Vazduh/acetilen (siromašna

smeša)

2300 oC

Zemnoalkalni metali + mnogi drugi

Vazduh/acetilen (bogata smeša) 2300oC Sn, Ba, Cr i dr.

H2O/acetilen 2950oC Refraktorni elementi: Al, V, Ti, Ta,

Be, Si i dr.

Elektrotermalni atomizer

Kao elektrotermalni atomizeri koriste se grafitne peći koje se izrađuju u obliku cevi/kivete.

Najčešću primenu imaju grafitne peći dužine do 8mm i prečnika 5 mm. S obzirom na to da je grafit

porozan, unutrašnjost peći se oblaže pirolitičkim grafitom koji sprečava apsorpciju uzorka od

strane zidova peći. Rad peći je programiran i sastoji se iz nekoliko faza:

1) sušenje uzorka (T = 100K)

2) sagorevanje i oksidacija organskog dela (T = 100 – 500K)

3) atomizacija uzorka (nastaju slobodni atomi koji mogu da apsorbuju upadno

monohromatsko zračenje, T = 2000 – 3000K)

4) čišćenje peći (od ostatka uzorka koji se deponuje na zidove peći, T > 3000K)


30

Ceo proces traje 60-90 sekundi, a sama atomizacija 10-ak sekundi. S obzirom da uzorak u

peći boravi relativno dugo, atomizacija je potpuna čime se postižu niže granice detekcije u

poređenju sa plamenim atomizerom. Uzorak se u grafitnu peć unosi pomoću mikropipete pri čemu

ne dolazi do gubitka uzorka usled rasprašivanja kao što je to slučaj kod plamenog atomizera.

Uzorak se uvodi u vidu aerosola pri čemu se za dobijanje finih kapljica rastvora koristi pneumatski

rasprašivač u kombinaciji sa rasprašivačkom komorom.

Slika 14. Grafitna peć

Sistem za raspršivanje – Nebulizer

Sistem za raspršivanje ima vrlo značajnu ulogu u osetljivosti određivanja plamenom

atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom. Na osetljivost određivanja u velikoj meri utiče

količina rastvora koja dospeva u plamen u jedinici vremena kao i veličina i ujednačenost

(homodisperznost) kapljica raspršenog rastvora. Povećanjem količine rastvora koji dospeva u

plamen, smanjenjem veličine kapljica i povećanjem homodisperznosti povećava se osetljivost

atomske apsorpcione spektrofotometrije.

Za raspršivanje rastvora se uglavnom koriste pneumatični raspršivači, pri čemu se gas koji

potpomaže sagorevanje gorećeg gasa, obično vazduh, koristi za raspršivanje.

U atomskoj apsorpcionoj spektrofotometriji koriste se tzv. posredni raspršivači. Za razliku od

neposrednih raspršivača, kod kojih se rastvor neposredno raspršuje u plamen, rastvor se kod

posrednih tipova raspršivača raspršuje u jednoj komori.

U rastvor ispitivane supstance uronjena je kapilarna cevčica, čiji je drugi kraj izložen struji

oksidacionog gasa (obično vazduh). Pod dejstvom strujanja vazduha na kraju kapilarne cevčice

stvara se vakuum, pri čemu se ispitivani rastvor usisava i raspršuje u komoru u obliku finih kapi.

Komore u kojima se vrši raspršivanje, u literaturi se nazivaju kondenzacione ili

homogenizacione komore. U ovim komorama pored stvaranja smeše sa gorećim gasom (obično

acetilen), koja odlazi kroz plamenik, gde se pod uticajem temperature plamena ispitivana supstanca

prevodi u atomsko stanje, dolazi i do taloženja većih kapljica čime se obezbeđuje da u plamen

dospeju samo sitne i ujednačene veličine kapljica, što povećava osetljivost određivanja. U cilju

poboljšavanja mešanja gasova i ubrzanja taloženja kapljica većih prečnika, u kondenzacione

komore se često ugrađuju pera za ometanje protoka gasa.

U nekim atomskim apsorpcionim spektrofotometrima (npr. Pye Unicam SP 90 A serija 2)

postoji mogućnost postavljanja jedne kuglice ispred raspršivača u cilju povećanja efikasnosti

raspršivanja. Raspršene kapi iz raspršivača udaraju u površinu kuglice i na taj način dolazi do

dodatnog raspršivanja kapi, odnosno do smanjivanja prečnika kapi.

Mana posrednih sistema za raspršivanje je što relativno mala zapremina raspršenog rastvora


31

(oko 10%) dospeva u plamen, jer se veći deo raspršenog rastvora kondenzuje i preko odvodne cevi

kondenzacione komore izvodi kao neupotrebljiv rastvor za dalje određivanje.

Monohromator

Kao monohromator koristi se difrakcina rešetka. Ona razlaže zračenje po talasnim dužinama.

Mogu da budu transprarentne i refleksione rešetke. Refleksione mogu da budu sa ravnom

refleksionom površinom i refleksionom površinom koja je pod nagibom. Poseban tip refleksione

rešetke su konkavne rešetke. Transparentne rešetke predstavljaju staklene ploče na kojima je

pomoću dijamantskog šiljka urezan veliki broj linija na jediničnom rastojanju. Broj linija zavisi od

moći razlaganja rešetke i kreće se od 500-4000 linija po milimetru.

Osnovna karakteristika rešetke je konstanta rešetke d koja predstavlja zbir širine ureza i

rastojanja između dva ureza.

Refleksione rešetke se nalaze u modernim uređajima. Poseban tip refleksione rešetke je

konkavna rešetka kod koje su po obimu Rolandovog kruga smešteni razrez i detektor. Ova rešetka

je ujedno i disperzioni element i element za fokusiranje. Da bi se dobio dobar spektar poluprečnik

radijusa krivine na kome je smeštena rešetka treba da bude veći od poluprečnika Rolandovog kruga

(R > r). Kada zračenje padne na rešetku na mestima ureza dolazi do difrakcije. Zraci koji padaju

između između ureza padaju kroz rešetku bez difrakcije. Zraci čija je putna razlika jednaka

celobrojnom umnošku talasnih dužina pojačavaće se, dok će se intenzitet ostalih zraka smanjivati.

Najviše skreću zraci najvećih talasnih dužina. Rešetka daje više spektralnih redova. Zrak koji

prolazi između dva ureza prolazi bez difrakcije i na zaklonu izaziva najveće zacrnjenje. Takav zrak

obrazuje difrakcioni maksimum nultog reda. Zraci čija je putna razlika jednaka jednoj talasnoj

dužini obrazuju spektar prvog reda, a oni čija je putna razlika jednaka 2λ obrazovaće spektar

drugog reda. Sa povećanjem spektralnog reda slabi intenzitet zračenja.

Slika 15. Monohromator- Difrakciona rešetka


32

Za disperzonu rešetku važi Brag-ova jednačina:

a - putna razlika dva susedna zraka m redni broj difrakcionog maksimuma d - konstanta rešetke α - upadni ugao β - ugao difrakcije

Kada su upadni i difraktovani ugao sa iste strane normale znak je „+“, a kada su sa različite

znak je „–“.

Iz Bragove jednačine sledi da će zraci iste λ imati maksimum u svakom od pravaca u

zavisnosti od spektralnog reda, upadnog i difraktovanog ugla.

Detektor

Detekcija je fotoelektrična. Kao uređaj za detekciju koristi se fotomultiplikator. To je

evakuisani balon od stakla ili kvarca u kome se nalazi anoda, katoda i sistem dinoda. Katoda je na

negativnom potencijalu, anoda na pozitivnom a dinode su poređane po rastućem potencijalu. Kada

svetlosni zrak koji ima određenu energiju padne na katodu dolazi do izbijanja elektrona koji se

kreću do prve dinode. Sa nje se izbija dvostruko veći broj elektrona koji dolazi do druge dinode i

tako redom. Multiplicirana struja elektrona dolazi do anode. Faktor multipliciteta se kreće do 106 i

zavisi od broja dinoda. Ovo znači da se kod fotomultiplikatora primarna struja se pojačava na račun

sekundarne emisije elektrona.

Slika 16. Detektor – Fotomultiplikator


33

2.4.2. Način rada atomskog apsorpcionog spektrofotometra

Lampa sa šupljom katodom emituje svetlost koja prolazi kroz plamenik. Istovremeno u

plamenik se usisava rastvor ispitivanog uzorka. Pod uticajem visoke temperature uzorak disosuje

na atome koji su sada sposobni da apsorbuju deo emitovane energije, odnosno svoju rezonantnu

liniju proporcionalno njihovoj koncentraciji. Iza plamenika postavljen je monohromator ili

specijalan filter pomoću koga se rezonantna linija odvaja od nekarakterističnih radijacija i

registruje na detektoru. Nastali električni signal pojačava se u elektronskom pojačalu a dobijeni

rezultati očitavaju na galvanometru ili pisaču (rikorderu). Visina pika na pisaču proporcionalana je

koncentraciji ispitivanog elementa.

Šema najjednostavnijeg AAS je prikazana na slici, a sistem je poznat kao istosmerni sistem

sa jednim zrakom. Ovaj sistem ima svojih nedostataka obzirom da detektor nije u mogućnosti da

razlikuje fotone koji potiču od lampe sa šupljom katodom i one koje emituje plamen, pa ih oba

registruje.

Slika 17. Šema jednozračnog spektrofotometra

Da bi se otklonio ovaj nedostatak izrađen je sistem kod koga je svetlost dok plamen zrači

kontinualno. Ovaj sistem je poznat kao naizmenični sistem sa jednim zrakom, jer isprekidana

svetlost na izlazu iz detektora daje signal naizmenične struje. Elektronski pojačivač je konstruisan

tako da pojačava samo naizmeničnu struju pa na taj način svetlost iz plamenika uopšte ne registruje.

Emitovanje isprekidane svetlosti u pravilnim vremenskim intervalima može se postići

ugrađivanjem rotirajućeg sektora između svetlosnog izvora i plamenika ili pak napajanjem lampe

pulsirajućim naponom.

Slika 18. Šema dvozračnog spektrofotometra


34

Danas se u praksi najčešće može sresti sistem poznat pod nazivom naizmenični sistem sa

dvostrukim zrakom. Umesto rotirajućeg sektora ugrađen je rotirajući reflektorni sektor (sistem

ogledala) koji naizmenično šalje svetlost iz lampe kroz plamenik (zrak uzorka) i pored plamenika

(referentni zrak). Zrak koji potiče od uzorka i referenti zrak se kasnije rekombinuju pomoću

specijalnog polupropustljivog ogledala i prolaze zajedno kroz preostali deo instrumenta. Kod ovog

sistema, elektronika je tako podešena da registruje odnos intenziteta ova dva zraka pri čemu

intenzitet uzorkovanog zraka nalazi u brojiocu, a intenzitet refrektovanog zraka u imeniocu.

Eventualne promene u intenzitetu lampe, osetljivosti detektora, ili pojačalu kompenzuju se jer se

javljaju podjednako u brojiocu i imeniocu.

Ovaj sistem ima svoje prednosti u odnosu na sistem sa jednim zrakom:

Daje stabilnu baznu liniju koja omogućava da se primete najmanji otkloni koji kod

instrumenta sa jednim zrakom nije moguće učiniti Omogućava veliku preciznost zbog

stabilne bazne linije

Lampe se mogu koristiti odmah po uključenju

Omogućava korišćenje široke ekspanzije skale na pisaču

Međutim, pored ovih prednosti on ima i svoje nedostatke:

Duži optički put zraka kroz instrument

Komplikovanost uređaja zahteva predhodnu dužu obuku analitičara

Aparat je skuplji u odnosu na instrument sa jednim zrakom

2.4.3. Osetljivost i tačnost određivanja

Atomskom apsorpcinom spektrofotometrijom se mogu neposredno određivati svi oni

elementi čije se rezonantne linije nalaze u oblasti od 190 do 850 nm (bliska ultravioletna i vidljiva

oblast spektra) i koji se mogu prevesti u osnovno atomsko stanje. Ovim uslovima uglavnom

odgovaraju metali.

Osetljivost u atomskoj apsorpcionoj spektrofotometriji je definisana kao onaj sadržaj

vodenog rastvora ispitivanog elementa, u μg/ml (ppm), koji izaziva apsorpciju od 1%. Pri

eksperimentalnim određivanjima, poznavanje osetljivosti je veoma koristan podatak za pripremu

uzorka i standardnih rastvora, jer se optimalni interval određivanja obično nalazi u rasponu od 20

do 200 puta većim koncentracijama od osetljivosti za dati element.

Mnogo značajniji pojam je granica detekcije. Vrednost granice detekcije ne zavisi samo od

vrednosti merenog signala, nego i od vrednosti „šuma“ aparata. Granica detekcije definiše se onim

sadržajem elementa u rastvoru koji izaziva dvostruko veći signal od signala „šuma“ aparata.

Osetljivost i granica detekcije aparata veoma se razlikuju za pojedine elemente. Ova razlika

potiče od razlika između apsorpcionih koeficijenata elemenata, ali zavisi i od osobina elementa u

procesima koji se dešavaju pri dovođenju u atomsko stanje.

Optimalna osetljivost i tačnost mogu se postići kada se, prethodnim ispitivanjima, za dati

aparat i element koji se određuje, nađu najpogodniji uslovi raspršivanja, najpogodniji sastav

gorućeg gasa i gasa koji potpomaže sagorevanje, njihova brzina strujanja, visina plamena i

intenzitet izvora svetlosti.


35

Tačnost određivanja atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom definiše se relativnom

greškom određivanja koncentracije (Δc• 100/c). Pri vrlo pažljivom radu, vodeći računa o činjenici

da su najtačnija merenja apsorbancije u intervalu apsorbancije od 0,2 do 0,8, može se postići

minimalna greška od 0,3 do 0,8%.

2.4.4. Smetnje

Atomska apsorpciona spektrofotometrija spada u relativne metode, tj u metode pri kojima se, pomoću rastvora poznatih koncentracija (standardnih rastvora), određuje nepoznata koncentracija ispitivanog elementa u rastvoru pomoću kalibracionog grafa.

Usled različitog hemijskog sastava standardnih rastvora i uzorka, mogu nastati različite

greške. Ove greške se manifestuju time da se pri istovetnim koncentracijama posmatranog

elementa u standardnom rastvoru i rastvoru uzorka, atomizacijom dobija različiti broj atoma

sposobnih za apsorpciju.

Smetnje koje se javljaju u plamenoj atomskoj apsorpcionoj spektrofotometriji dele se na:

1) Spektralne smetnje

2) Hemijske smetnje

3) Smetnje usled apsorpcije pozadine

4) Jonizacione smetnje

5) Fizičke smetnje

Spektralne smetnje

Atomska apsorpciona spektrofotometrija je veoma selektivna i specifična metoda. Talasne

dužine, na kojima apsorbuju pojedini elementi, dobro su definisane, a mogućnost da dva elementa

apsorbuju na istoj talasnoj dužini je neznatna. Primenom modulacije emitovane svetlosti sa šupljih

katodnih lampi i usklađenog pojačavanja ove modulovane frekvencije, praktično je eliminisana

mogućnost pojave spektralnih smetnji

Hemijske smetnje

Hemijskim smetnjama se naziva svako obrazovanje hemijske veze posmatranog elementa

koja ometa kvantitativnu termičku disocijaciju (atomizaciju). Kvantitativna atomizacija praktično

se postiže iz neutralnih ili slabo kiselih vodenih rastvora hlorida ili nitrata ispitivanih metala, pod

optimalno podešenim uslovima.

Hemijske smetnje se prema uzročnicima dele na katjonske i anjonske, a prema mehanizmu

njihove pojave na dve grupe:

1) Hemijske smetnje koje nastaju kada termička disocijacija ispitivanog elementa nije

kvantitativna. To se događa kada u plamenu nastaju teško topljive soli ili teško isparljive

soli koje termički ne disociraju u potpunosti.

2) Hemijske smetnje koje nastaju usled toga što atomi ispitivanog elementa u osnovnom

stanju, nakon svog nastanka, vrlo brzo reaguju sa drugim atomima ili radikalima u plamenu,

pa atomi nisu dovoljno dugo u osnovnom stanju i ne mogu apsorbovati svetlosne zrake

rezonantne talasne dužine. Pojava druge grupe hemijskih smetnji je vrlo karakteristična za

atomizaciju u plamenu. Pojava ovog tipa smetnji zavisi od hemijskog sastava i afiniteta

posmatranog atoma prema mogućim partnerima za reakciju u plamenu. Pri ovoj smetnji


36

posmatrani atomi najčešće grade okside ili oksidne radikale, hidrokside ili hidroksilne

radikale, karbide i nitride. Ovo je uzrok da oko 30 elemenata, među koje spadaju svi

lantanidi, zatim elementi kao Al, Si, B i drugi, imaju vrlo malu osetljivost određivanja u

plamenu, jer spontano grade okside.

Veći broj hemijskih smetnji može se izbeći ili smanjiti povišenjem temperature plamena i

izborom pogodnije hemijske okoline (sastav plamena) pri atomizaciji. Tako se veći deo hemijskih

smetnji koje se javljaju u plamenu acetilen/vazduh može izbeći primenom redukujućeg plamena

acetilen/azot-suboksid, koji pored više temperature (oko 2750°C) poseduje pogodniji hemijski

sastav, dok se, na primer u plamenu acetilen/kiseonik, koji ima još višu temperaturu (oko 3050°C),

nasuprot očekivanju, povećava broj i intenzitet hemijskih smetnji, zbog izrazito oksidacionih

osobina plamena.

Smetnje usled apsorpcije pozadine

Do pojave ove smetnje (Background ili Matrix interference) dolazi usled rasipanja svetlosti

na čvrstim ili tečnim česticama prisutnim u plamenu i usled apsorpcije svetlosti od strane molekula

ili radikala u plamenu. Uzročnici pojave ovog tipa smetnji većinom potiču iz matriksa uzorka.

Efekti rasipanja svetlosti na čvrstim ili tečnim česticama, iako nemaju veze sa apsorpcijom,

uvrštavaju se u smetnje usled apsorpcije pozadine, jer su njihovi krajnji efekti slični ovome tipu

apsorpcije, a i način njihove kompenzacije, odnosno eliminisanja, istovetan je.

Ispitivanja su pokazala da se ovaj tip smetnji vrlo retko javlja primenom posrednih

raspršivača sa dobro konstruisanim kondenzacionim komorama, ako je ukupan sadržaj soli u

rastvoru ispod 5% i ako je radna talasna dužina iznad 300 nm.

Drugi efekt je prava apsorpcija svetlosti od strane molekula i radikala u plamenu. Do smetnji

dolazi kada rezonantna linija ispitivanog elementa pada u oblast molekularne apsorpcije molekula

ili radikala koji se nalaze u plamenu. Do pojave većeg broja molekula u plamenu dolazi kada je

plamen niže temperature, kada se određuju elementi koji se lako atomizuju u prisustvu teško

atomizirajućeg matriksa, ili ako neki elemenat, koji se nalazi u većim koncentracijama u matriksu,

gradi sa gasovima plamena oksidne molekule ili hidroksilne radikale.

U modernijim atomskim apsorpcionim spektrofotometrima ugrađena je jedna deuterijumova

lampa kao izvor UV svetlosti. Pomoću UV svetlosti meri se vrednost smetnji usled apsorpcije

pozadine i automatski se obavlja kompenzacija merenog signala na rezonantnoj liniji posmatranog

elementa.

Jonizacione smetnje

U plamenu visoke temperature (posebno u plamenu azot-suboksid/acetilen, a delimično i u

plamenu vazduh/acetilen), dolazi do znatne jonizacije atoma većeg broja metala, a naročito onih

metala koji imaju niže jonizacione potencijale. Jonizovani atomi više ne apsorbuju rezonantno

elektromagnetno zračenje, što dovodi do smanjenja osetljivosti, a i do greške u merenju, ako je

stepen jonizacije posmatranog metala iz rastvora uzorka i standardnog rastvora različit.

U plamenu postoji ravnoteža između atoma u osnovnom stanju i jona:

Me ↔ Men+ + ne-


37

Do različitog stepena jonizacije posmatranog metala u plamenu dolazi zbog različitog sastava

ispitivanih rastvora, a samim tim i različitog sastava plamena.

Ako je u rastvoru (najčešće u uzorku) prisutan neki drugi elemenat koji u datom plamenu

takođe jonizuje, doći će do povećanja koncentracije elektrona u plamenu i time će biti suzbijena

jonizacija posmatranog metala.

Pojava jonizacije je i uzrok zakrivljenja kalibracione krive ka osi apsorbancije.

Iz navedenih razloga, pokazalo se neophodnim eliminisanje pojave jonizacije, naročito onih

elemenata koji imaju niže jonizacione potencijale (alkalni i zemnoalkalni metali). Najjednostavniji

način uklanjanja pojave jonizacije, a time i smetnje koju ona izaziva, jeste primena plamena nižih

temperatura. Na žalost, ovaj vrlo efikasan način uklanjanja jonizacije često nije primenljiv, jer se

u plamenu niže temperature dati elemenat ne može određivati (npr. lantanidi). Zbog toga se

najčešće primenjuje metoda pri kojoj se u rastvor uzorka i u standardne rastvore dodaje u velikom

višku neki elemenat niskog jonizacionog potencijala (jonizacioni pufer), koji će u plamenu jako

jonizovati, najčešće kalijum ili cezijum. Jonizacioni pufer povećava koncentraciju elektrona u

plamenu i time suzbija jonizaciju posmatranog elementa.

Fizičke smetnje

Uopšteno se fizičke smetnje definišu kao smetnje koje se javljaju usled različitih fizičkih

dejstava na procese atomizacije posmatranog elementa iz rastvora uzorka i iz standardnih rastvora.

U fizičke smetnje spadaju već opisane smetnje usled apsorpcije pozadine, rasipanja svetlosti i

jonizacije, koje su posebno izdvojene zbog svoje specifičnosti.

Fizičkim smetnjama će se smatrati samo one smetnje koje nastaju usled različitih fizičkih

osobina rastvora uzorka i standardnih rastvora, tj. usled razlike u viskoznosti, površinskom naponu

i gustine rastvora.

Ove razlike u velikoj meri utiču na brzinu raspršivanja i na veličinu raspršenih kapljica, a

time i na osetljivost određivanja.

Ako u rastvoru ispitivanog uzorka, pored posmatranog elementa, postoji velika koncentracija

(iznad 1%) neke soli ili kiseline, tada se već javljaju fizičke smetnje. Smatra se da u ovakvim

slučajevima već dolazi do promene fizičkih osobina rastvora u odnosu na standardne vodene

rastvore posmatranog elementa, pa se smanjuje brzina raspršivanja i povećava prosečna veličina

raspršenih kapljica.

Ukupni efekat ovog dejstva je smanjenje osetljivosti određivanja, tj. pojave greške u

određivanju, ako standardni rastvori ne sadrže istu koncentraciju soli. Ako umesto neorganskih soli

ima više od 1% organskih jedinjenja (npr. belančevina, šećera, itd.), efekat smetnje je znatno

izraženiji, iako je najčešće kombinovan sa pojavom hemijskih smetnji.

Organske supstance (rastvarači) mogu već i veoma malim koncentracijama u rastvoru metala

da izazovu smetnje, pri čemu mogu izazvati ili povećanje ili smanjenje osetljivosti (mernog

signala). U literaturi se može naći veliki broj objašnjenja načina na koji različite organske materije

izazivaju smetnje.


38

Izazivaju promenu uslova raspršivanja rastvora. To je čista fizička smetnja koja najčešće

nastaje usled promene površinskog napona ili viskoziteta rastvora. Utiču na promenu temperature

plamena (termički efekat).

Izazivaju redukcioni efekat u plamenu, jer njihovim sagorevanjem povećava se koncentracija

ugljeničnih radikala u plamenu.

Izazivaju prave hemijske smetnje stvaranjem organskih jedinjenja sa metalima, kompleksa

ili helata.

Zavisno od osobina ili koncentracije organskog jedinjenja, pomenuti načini dejstva mogu biti

manje ili više izraženi u sumarnom dejstvu smetnji.

Faktori koji utiču na rezultate

U principu se slobodni atomi svih elemenata mogu, dovođenjem zračenja referentne talasne

dužine, prevesti u pobuđeno stanje. Međutim, samo se atomi metala i metaloida mogu pobuditi

zracima ultravioletne i vidljive svetlost (190-850 nm). Za pobuđivanje nemetala potrebno je

zračenje kraćih talasnih dužina. U oblasti ispod 190 mn počinje da apsorbuje vazduh. Za talasne

dužine veće od 850 nm potreban je detektor osetljiv na crvenu svetlost. Ove činjenice odredile su

domet atomske apsorpcije kao metode za određivanje, pre svega metala.

Dva različita pristupa susreću se pri radu u atomskoj apsorpciji: maksimalnom osetljivošću

izmeriti minimalni signal elementa ili precizno odrediti koncentraciju kada je element prisutan u

velikoj koncentraciji.

Brojni efekti doprinose neizvesnosti signala a izvori greške su sledeći:

nestabilnost izvornog signala lampe sa šupljom katodom, šumovi elektronike, netačnost sistema očitavanja nestabilnost plamena, šum raspršivanja i atomizacije, interferencije između elemenata, sistemske i slučajne greške kod pripreme uzorka i standardnih rastvora.

Pojedini od ovih faktora uslovljeni su dizajnom aparata a neke može da kontroliše operater.

Na osetljivost i preciznost atomskog apsorbera utiču sledeći parametri:

propusni opseg, struja lampe,

visina plamenika, ravnanje plamenika, protok goriva, tip plamena, podešenost komore

Master rad Eksperimentalni deo

39

3. Eksperimentalni deo


40

3.1. Program i metodika eksperimenta

Predmet ovog diplomskog rada je određivanje bioakumulacije teških metala u biljci

hiperakumulatoru Pistia stratiotes. Bioakumulacija je ispitivana izlaganjem biljaka određenim

koncentracijama teških metala. Praćeno je usvajanje sledećih metala: Ni, Cu, Zn, Pb i Cd.

Program eksperimentalnog dela master rada se sastojao iz sledećih faza:

1. Priprema rastvora

1.1. Priprema standardnog rastvora Ni

1.2. Priprema standardnog rastvora Cu

1.3. Priprema standardnog rastvora Zn

1.4. Priprema standardnog rastvora Pb

1.5. Priprema standardnog rastvora Cd

1.6. Priprema rastvora nutrijenata

1.7. Priprema rastvora za mineralizaciju

1.8. Priprema razblaženog rastvora HNO3

2. Prikupljanje biljaka

3. Priprema kanistra sa vodenim rastvorima nutrijenata i teških metala

4. Postavljanje biljaka u kanistre sa rastvorima

5. Uzorkovanje biljaka

6. Sušenje biljaka, usitnjavanje i merenje mase biljaka

7. Mineralizacija biljaka

8. Određivanje sadržaja metala pomoću AAS


41

3.2. Eksperimentalni postupak

Uzorci biljke Pistia stratiotes prikupljeni su u ataru sela Ostrovica, nadomak Niša. U

kanistrima su pripremljeni rastvori ispitivanih metala koncentracije 10 µmol/L. Biljke su

postavljene i podvrgnute uticaju metala u toku 30 dana. Nakon isteka vremena od 30 dana, biljke

su izvađene iz vodenih rastvora i osušene na vazduhu, na sobnoj temperaturi.

Uzorci pripremljeni za eksperimentalnu analizu stavljeni su na sahatno staklo i preneti u

sušnicu gde su sušeni na 100oC u toku 20 minuta. Nakon toga osušene biljke su izvađenjene iz

sušnice i ostavljene da se hlade. Ohlađeni uzorci su usitnjeni i homogenizovani u avanu sa tučkom,

svaki uzorak je izmeren i masa je zabeležena. Oko 0,3 grama od svake mase uzorka je preneto u

čase u kojima je vršena mineralizacija. Mineralizacija je izvršena smešom koncentrovanog H2O2 i

koncentrovane HNO3 u razmeri 1:2, odnosno sa 5 mL H2O2 i 10 mL HNO3. Nakon mineralizacije,

suvi ostatak je ohlađen, a nakon hladjenja rastvoren u potpunosti pomoću 13 mL 0,1M HNO3.

Rastvori su proceđeni kroz kvantitativni filter papir, a nakon filtracije fitrat je proceđen i kroz

mikrofilter, veličine pora 0,45 µm. Ovako pripremljen filtrat je snimljen na atomskom

apsorpcionom spektrofotometru.

3.2.1. Pribor i aparatura

U toku eksperimentalnog rada korišćeni su sledeći pribor i aparatura

1. Atomski apsorpcioni sprektrofotometar (Perkin Elmer)

2. Analitička vaga (Kern, Nemačka)

3. Dejonizator (Smart2Pure, Thermo)

4. Rešo (Gorenje)

5. Sušnica (Raypa Dry Oven)

6. Čaše od 100 mL i 150 mL (15 kom.)

7. Sahatno staklo (15 kom.)

8. Pipeta od 5 mL i 10 mL (10 kom.)

9. Propipete (3 kom.)

10. Levak (5 kom.)

11. Stakleni štapić (5 kom.)

12. Plastične kivete (75 kom.)

13. Metalni prsten (5 kom.)

14. Mikrofiltri (75 kom.)

15. Špric od 5 mL (75 kom.)

16. Avan sa tučkom (3 kom.)

3.2.2. Reagensi

U toku eksperimentalnog rada korišćeni su sledeći rastvori i reagensi:

1. Koncentrovana HNO3

2. Koncentrovan H2O2

3. 0,1M HNO3 (dobijen rastvaranjem 7 mL koncentrovane HNO3 u 993 mL dejonizovane vode )

4. Dejonizovana voda

5. Destilovana voda

6. Bakar(II)-hlorid, koncentracije 0,0916 mol/L


42

7. Nikal(II)-hlorid, koncentracije 0,0454 mol/L

8. Kadmijum(II)-hlorid, koncentracije 0,0513 mol/L

9. Olovo(II)-nitrat, koncentracije 0,0516 mol/L

10. Cink(II)-sulfat, koncentracije 0,0565 mol/L

11. Kalijum-di-H-fosfat, koncentracije 0,1000 mol/L

12. Amonijum-nitrat, koncentracije 0,7601 mol/L

Master rad Rezultati i diskusija

43

4. Rezultati i diskusija


44

4.1. Prikaz rezultata

4.1.1. Kalibracione krive standardnih rastvora metala

Određivanje sadržaja metala nakon mineralizacije izvršen je pomoću atomske apsorpcione

spektrofotometrije. Na slikama 19 – 23. prikazane su kalibracione krive pomoću kojih je određen

sadržaj metala. Korelacioni koeficijenti kalibracionih kriva za rastvore Ni, Cu, Zn, Pb i Cd su bili

veći R > 0,99 iznosili su 0,9993; 0,99344; 0,99783; 0,99707 i 0,99426, respektivno.

Slika 19. Kalibraciona kriva rastvora Ni

Slika 20. Kalibraciona kriva rastvora Cu

Koncentracija Ni (mg/L)

0 2 4 6 8 10 00 , 0

05 , 0

10 , 0

0 15 ,

20 , 0

0 25 ,

30 , 0


45

Slika 21. Kalibraciona kriva rastvora Zn

Slika 22. Kalibraciona kriva rastvora Pb

Slika 23. Kalibraciona kriva rastvora Cd

Koncencentracija Zn (mg/L)

0 2 4 6 8 10 00 0 ,

02 , 0

04 0 ,

, 06 0

08 , 0

10 , 0

12 , 0

Koncentracija Pb (mg/L)

0 1 2 3 4 5 00 , 0

01 , 0

02 , 0

03 , 0

0 04 ,


46

4.1.2. Masa celih biljaka

U tabeli 4.1. su prikazane mase celih biljaka nakon procesa sušenja najpre na vazduhu i

sobnoj temperaturi, a zatim i u sušnici na 100OC u toku 20 minuta.

Tabela 4.1. Mase osušenih uzoraka (g)

Red. br. uzorka

(biljke)

Masa biljke (g)

I kanister II kanister III kanister IV kanister V kanister

1 1,9677 0,8349 1,1340 2,2095 3,0109

2 1,4571 1,2576 1,8017 1,1027 1,3769

3 0,4228 0,7107 0,8726 1,1060 1,1096

4 1,7358 1,2770 0,7019 1,9089 2,3942

5 2,2371 1,0401 0,6918 1,6477 1,9389

6 0,9317 1,9619 2,6880 1,6085 2,9488

7 0,8859 1,9283 0,8687 0,9638 1,4759

8 0,7945 0,8360 1,8030 0,7226 1,1352

9 2,2932 1,3872 1,5009 1,3635 2,2651

10 2,4472 1,3364 1,1490 1,8143 1,7497

11 1,0549 2,5190 1,3676 1,2791 0,9529

12 1,0602 1,3548 0,8629 1,0493 1,1665

13 1,2278 1,2754 1,1176 1,7165 1,3400

14 1,6333 2,2849 / 0,7114 0,8198

15 2,1234 1,9773 / 1,5313 0,7359

Na osnovu podataka prikazanih u tabeli 4.1. može se uočiti da se mase osušenih biljaka dosta

razlikuju. Mase se kreću u intervalu od 0,4228 g do 3,0109 g. Razlika u masi između biljaka javlja

se usled razlike u veličini nadkorenskog dela biljke.


47

4.1.3. Mase biljaka za mineralizaciju

Tabela 4.2. prikazuje mase biljaka (g) koje su korišćene u procesu mineralizacije.

Tabela 4.2. Mase biljaka (g) korišćene za mineralizaciju

Red. br. uzorka (biljke)

Masa biljke za mineralizaciju (g)

I kanister IIka nister III kanister IV kanister V kanister

1 0,3031 0 ,3 123 0,3409 0,3469 0,4695

2 0,3555 0 ,2 862 0,3924 0,3159 0,3316

3 0,2731 0 ,2 611 0,2360 0,3689 0,3843

4 0,3812 0 ,3 597 0,3389 0,2923 0,3384

5 0,3098 0 ,3 658 0,2277 0,3174 0,3084

6 0,3235 0 ,3 849 0,6376 0,3411 0,3649

7 0,2414 0 ,4 128 0,4025 0,3579 0,3454

8 0,3290 0 ,3 326 0,3435 0,3423 0,3556

9 0,3541 0 ,3 399 0,3925 0,3887 0,3228

10 0,3235 0 ,3 523 0,4061 0,3457 0,3529

11 0,3185 0 ,3 043 0,3604 0,3365 0,3138

12 0,2468 0 ,4 198 0,3416 0,3994 0,2614

13 0,3417 0 ,3 605 0,3472 0,3885 0,2830

14 0,3069 0 ,3 129 / 0,1796 0,3558

15 0,3153 0 ,3 164 / 0,3134 0,3617

Mase biljaka uzete za proces mineralizacije su odmerene približno oko 0,3 g. Međutim, iz

rezultata prikazanih u tabeli 4.2. može se uočiti da su pojedini uzorci imali manje mase od 0,3 g. S

obzirom na to da se u tabeli 4.1. uočava razlika između masa celih biljaka, odnosno da su pojedini

uzorci imali veoma male mase, kao posledica toga se javio i nedostatak materijala kod određenih

uzoraka za odmeravanje mase od 0,3 g.


48

4.1.4. Koncentracije i mase metala u uzorcima

Koncentracije metala u uzorcima

Nakon mineralizacije suvi ostatak je rastvoren pomoću 0,1 M HNO3, i rezultati određivanja

sadržaja metala u dobijenim rastvorima prikazani su u tabeli 4.3.

Tabela 4.3. Koncentracije metala (mg/L) u uzorcima rastvora nakon mineralizacije

Red. br.

uzorka

(biljke)

Izmerena koncentracija metala u rastvoru nakon mineralizacije (mg/L)

Ni Zn Cu Pb Cd

1 12,050 13,230 10,810 0,272 13,530

2 8,595 13,520 11,220 3,002 10,410

3 6,691 13,200 5,772 1,203 13,600

4 8,431 12,580 12,480 0,673 11,850

5 16,360 12,450 8,886 1,318 15,490

6 14,960 12,570 10,160 1,728 17,100

7 20,390 12,790 10,190 3,566 14,100

8 17,490 12,740 8,001 4,342 17,550

9 8,184 12,770 13,250 0,725 14,100

10 18,840 13,410 10,770 3,142 11,690

11 16,500 12,930 11,030 3,959 14,760

12 12,970 11,150 9,778 0,312 15,200

13 16,190 12,230 13,860 0,180 10,480

14 16,580 13,210 12,870 9,968 /

15 9,517 13,230 13,220 0,478 /

Koncentracije metala (mg/L) koje su izmerene u uzorcima rastvora nakon mineralizacije

pokazuju širok opseg. Najviše koncentracije izmerene su u uzorcima koji su bili izloženi rastvorima

Cd. Koncentracije Ni, Zn i Cu izmerene u rastvorima nakon mineralizacije uzoraka koji su bili

izloženi uticaju ovih metala neznatno se razlikuju u poređenju sa rezultatima dobijenim za Cd.

Najniža izmerena koncentracija je uzorcima koji su bili izloženi rastvoru Pb.


49

Ukupna masa metala u rastvoru nakon mineralizacije

U tabeli 4.4. prikazane su ukupne mase metala (mg) koje su izmerene u uzorcima rastvora

nakon mineralizacije.

Tabela 4.4. Mase metala (mg) u uzorcima rastvora od 13 mL

Red. br.

uzorka

Izmerena koncentracija metala u rastvoru nakon mineralizacije (mg/L)

Ni Zn Cu Pb Cd

1 0,1567 0,1720 0,1405 0,0035 0,1759

2 0,1117 0,1758 0,1459 0,0390 0,1353

3 0,0870 0,1716 0,0750 0,0156 0,1768

4 0,1096 0,1635 0,1622 0,0087 0,1541

5 0,2127 0,1619 0,1155 0,0171 0,2014

6 0,1945 0,1634 0,1321 0,0225 0,2223

7 0,2651 0,1663 0,1325 0,0464 0,1833

8 0,2274 0,1656 0,1040 0,0564 0,2282

9 0,1064 0,1660 0,1723 0,0094 0,1833

10 0,2449 0,1743 0,1400 0,0408 0,1520

11 0,2145 0,1681 0,1434 0,0515 0,1919

12 0,1686 0,1450 0,1271 0,0041 0,1976

13 0,2105 0,1590 0,1802 0,0023 0,1362

14 0,2155 0,1717 0,1673 0,1296 /

15 0,1237 0,1720 0,1719 0,0062 /

Ukupne mase metala (mg) koje se nalaze u rastvoru nakon mineralizacije (13 mL) direktno

su proporcionalne koncentraciji metala (mg/L) u uzorku rastvora nakon mineralizacije.


50

4.1.5. Mase metala u uzorku

U tabeli 4.5. prikazan je sadržaj metala (mg/g) u biljnim uzorcima nakon izlaganja biljaka

rastvorima teških metala.

Tabela 4.5. Mase metala (mg/g) u biljnim uzorcima

Red. br.

uzorka

Ukupna masa metala u uzorku (mg/g)

Ni Zn Cu Pb Cd

1 0,5016 0,3663 0,4636 0,0102 0,5159

2 0,3904 0,5300 0,4103 0,1235 0,3449

3 0,3331 0,4465 0,2748 0,0424 0,7491

4 0,3047 0,4833 0,4256 0,0299 0,4546

5 0,5814 0,5248 0,3729 0,0540 0,8844

6 0,5053 0,4478 0,4083 0,0658 0,3486

7 0,6421 0,4814 0,5488 0,1295 0,4554

8 0,6836 0,4657 0,3161 0,1649 0,6642

9 0,3130 0,5143 0,4864 0,0242 0,4670

10 0,6952 0,4940 0,4328 0,1181 0,3742

11 0,7049 0,5357 0,4502 0,1529 0,5324

12 0,4016 0,5545 0,5150 0,0101 0,5784

13 0,5838 0,5618 0,5273 0,0060 0,3924

14 0,6888 0,4827 0,5452 0,7215 /

15 0,3910 0,4755 0,5451 0,0198 /

Prosečna

vrednost

± SD

0,5147

± 0,1499

0,4910

± 0,0498

0,4482

± 0,0838

0,1115

± 0,1776

0,5201

± 0,1629

Razlike u sadržaju metala (mg/g) koje su izmerene u biljnim uzorcima posledica su različite

sposobnosti akumulacije biljke za određeni metal. Rezultati pokazuju da se najviše akumulirao

Cd, potom slede Ni i Zn. Masa akumuliranog Cu više odstupa od vrednosti za prethodna tri

navedena metala. Najmanje se akumuliralo Pb, i njegova izmerena masa se dosta razlikuje od mase

ostalih akumuliranih metala.

Razlike u sadržaju istog metala između uzoraka se javljaju usled nejednakosti sastava uzorka.

Naime, pošto je ispitivana ukupna sposobnost akumulacije teških metala od strane biljke, odnosno

nije posebno ispitana sposobnost akumulacije u korenu i nadkorenskom delu biljke, pretpostavlja

se da usled različitog odnosa u masi između ova dva dela, javila se i razlika u masi akumuliranog

metala u ispitivanom uzorku.


51

4.2. Diskusija rezultata

Rezultati ispitivanja bioakumulacije određenih teških metala u biljci Pistii stratiotes

pokazuju da biljka ima najveći afinitet za akumulaciju kadmijuma. Prosečna vrednost sadržaja Cd

iznosi 0,5201 mg/g uzorka biljke. S obzirom na to da toksična koncentracija kadmijuma u

hiperakumulatorima iznosi 0,100 mg/g suve mase, koncentracije koje izmerene u ispitivanim

uzorcima su čak pet puta veće.

Nešto manji prosečni sadržaj u odnosu na Cd, dobijen je za nikl i iznosio je 0,5147 mg/g

uzorka biljke. Toksične koncentracije nikla kod hiperakumulatora iznose 1 mg/g uzorka suve biljke

pa se stoga može zaključiti da su izmerene koncentracije ispod fitotoksičnih vrednosti.

Prosečna koncentracija cinka u biljnim uzorcima iznosila je 0,4910 mg/g. Na osnovu

poređenja sa pragom toksičnosti cinka za hiperakumulatore koji iznosi 10 mg/g uzorka suve biljke

izmerene koncentracije su znatno ispod toksičnih vrednosti.

Sadržaj Cd, Ni i Zn u ispitivanim uzorcima iznose respektivno 0,5201; 0,5147 i 0,4910 mg/g

što pokazuje da ispitivana biljka ima približno istu sposobnost njihovog akumuliranja.

Nešto manji prosečni sadržaj nakon izlaganja rastvoru metala izmeren je za Cu i iznosi

0,4482 mg/g suvog uzorka, što je, takođe, ispod fitotoksičnih koncentracija bakra koje kod

hiperakumulatora iznose 1 mg/g.

Prosečni sadržaj Pb u ispitivanim uzorcima Pistie stratiotes pokazuje najmanje vrednosti, i

iznosi 0,1115 mg/g suve biljke, što je znatno manje u poređenju sa prosečnom koncentracijom koja

je izmerena za prethodna četiri metala. Takođe, određeni sadržaj je daleko manji u poređenju sa

pragom toksičnosti za hiperakumulatore, koji iznosi 1 mg/g suve materije.

Poređenjem prosečne koncentracije teških metala i njihovih dozvoljenih vrednosti u suvom

uzorku utvrđeno je da se kadmijum akumulira u koncentraciji koja je oko 5 puta veća od

dozvoljene, nikal i bakar se akumuliraju u dva puta manjoj koncentraciji od dozvoljene, dok se

olovo akumulira u deset, a cink u čak dvadeset puta manjoj koncentraciji od one koncentracije koja

bi mogla da izazove fitotoksičnost.

Master rad Zaključak

52

5. Zaključak

Master rad Zaključak

53

Na osnovu dobijenih rezultata ispitivanja mogu se izvesti sledeći zaključci:

Rezultati ispitivanja bioakumulacije određenih teških metala u biljci Pistii stratiotes

pokazuju da biljka ima najveći afinitet za akumulaciju Cd

Određena prosečna vrednost sadržaja Cd iznosi 0,5201 mg/g uzorka biljke, što je čak pet

puta više od toksične koncentracije kadmijuma u hiperakumulatorima koja iznosi 0,100 mg/g suve

mase.

Prosečni sadržaj Ni u ispitivanim uzorcima je iznosio 0,5147 mg/g uzorka biljke što je niža

vrednost od toksične koncentracije nikla kod hiperakumulatora (1 mg/g uzorka suve biljke).

Prosečni sadržaj Zn u biljnim uzorcima iznosio je 0,4910 mg/g, što je znatno ispod toksičnih

vrednosti (10 mg/g uzorka suve biljke).

Prosečni sadržaj Cu izmeren iznosio je 0,4482 mg/g suvog uzorka, što je, takođe, ispod

fitotoksičnih koncentracija bakra koje kod hiperakumulatora iznose 1 mg/g.

Prosečni sadržaj Pb iznosio je 0,1115 mg/g suve biljke, i određeni sadržaj je daleko manji u

poređenju sa pragom toksičnosti za hiperakumulatore, koji iznosi 1 mg/g suve materije.

Poređenjem prosečne koncentracije teških metala i njihovih dozvoljenih vrednosti u suvom

uzorku utvrđeno je da se kadmijum akumulira u koncentraciji koja je oko 5 puta veća od dozvoljene,

Nikl i bakar se akumuliraju u dva puta manjoj koncentraciji od dozvoljene

Olovo se akumulira u deset puta manjoj koncentraciji od dozvoljene

Cink se akumulira u čak dvadeset puta manjoj koncentraciji od one koncentracije koja bi

mogla da izazove fitotoksičnost.

Master rad Literatura

54

6. Literatura


55

[1] Abdolkarim Chehregani, Mitra Noori, Hossein Lari Yazdi, (2009) Phytoremediation of

heavy-metal-polluted soils: Screening for new accumulator plants in Angouran mine (Iran)

and evaluation of removal ability. Ecotoxicology and Environmental Safety 72 (2009)

1349–1353.

[2] Alagić Č. Slađana (2014) Plants Strategies Against Metal Phytotoxicity As a key

Prerequisite For An Effective Phytoremediation: Cellular Mechanisms, Part I.

[3] Alagić Č. Slađana, Nujkić M. Maja, Dimitrijević D. Mile (2014), Plants strategies against

metal phytotoxicity as a key prerequisite for an effective phytoremediation: Excluders and

hyperaccumulators, part II.

[4] Alagić S.Č, Dimitrijević M, Grujić A, (2014) Mehanizmi fitoremedijacije perzistentnih

organskih zagađivača: trihlor-etilena i polihlorovanih bifenila iz kontaminiranih zemljišta.

Ecologica 73(21), str 61 – 66.

[5] Alagić SČ, Šerbula SS, Tošić SB, Pavlović AN, Petrović JV, (2013) Bioaccumulation of

Arsenic and Cadmium in Birch and Lime from the Bor Region. Arch Environ Contam

Toxicol 65(4), 671-682.

[6] Alloway BJ (1990), Heavy metals in soil. Blackie and Son Ltd, London, pp: 1-339.

[7] Antonijevic MM, Dimitrijevic MD, Milic SM, Nujkic MM (2012) Metal concentrations

in the soils and native plants surrounding the old flotation tailings pond of the Copper

Mining and Smelting Complex Bor (Serbia). J Environ Monit 14, 866-877.

[8] Bhaduri AM and Fulekar MH, (2012) Antioxidant enzyme responses of plants to heavy

metal stress. Rev Environ Sci Biotechnol 11, 55–69.

[9] Bhargava A, Carmona FF, Bhargava M, Srivastava S. (2012) Approaches for enhanced

phytoextraction of heavy metals, Review. J Environ Manage 105, 103-120.

[10] Boyd RS. (2011) The defense hypothesis of elemental hyperaccumulation: status,

challenges and new directions. Plant Soil 293 (2007) 153-176.

[11] Flora SJS, Mittal M, Mehta A, (2008) Heavy metal induced oxidative stress & its possible

reversal by chelation therapy. Indian J Med Res 128, 501–523.

[12] Gallego SM, Pena LB, Barcia RA, Azpilicueta CE, Iannone MF, Rosales EP, Zawoznik

MS, Groppa MD, Benavides MP, (2012) Unravelling cadmium toxicity and tolerance in

plants: Insight into regulatory mechanisms. Environ Exp Bot 83, 33-46.

[13] Ghazala Mustafa, Setsuco Komatsu, (2016) Toxicity of heavy metals and metal-containing

nanoparticles in plants.

[14] Giovanna Visioli, Nelson Marmiroli (2012) The proteomics of heavy metal

hyperaccumulation by plants.

[15] Gonnelli C, Renella G (2012), Chromium and Nickel. In Alloway BJ (ed) Heavy Metals in

Soils. Trace Metals and Metalloids in Soils and their Bioavailability. Environmental

Pollution (22). ThirdEdition, Springer Dordrecht Heidelberg New York London, pp

313334.

[16] Hall JL, (2002) Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance. J Exp

Bot 53 (366), 1-11.

[17] http://stocarstvo.edu.rs/wp-content/uploads/2015/05/9.-TE%C5%A0KI-METALI.pdf.

[18] http://www.gradjevinarstvo.rs/tekstovi/1203/820/teski-metali-u-zemljistu-i-njihovuticajna-biljke

[19] https://kutak006.wordpress.com/2011/06/09/nikal-i-zivotna-sredina/

http://stocarstvo.edu.rs/wp-content/uploads/2015/05/9.-TE%C5%A0KI-METALI.pdf



http://www.gradjevinarstvo.rs/tekstovi/1203/820/teski-metali-u-zemljistu-i-njihov-uticaj-na-biljke






https://kutak006.wordpress.com/2011/06/09/nikal-i-zivotna-sredina/




56

[20] https://www.tehnologijahrane.com/enciklopedija/osnovni-principi-atomskeapsorpcionespektrofotometrije

[21] Kabata-Pendias A, Pendias H (2001) Trace elements in soils and plants. CRC Press LLC,

Boca Raton.

[22] Lin Y-F, Aarts MGM, (2012) The molecular mechanism of zinc and cadmium stress

response in plants. Cell Mol Life Sci 69, 3187–3206.

[23] M. Todorović, P. Đurđević, V. Antonijević, Optičke metode instrumentalne analize,

Beograd, 1997. [24] Marc Hanikenne and Ce´ cile Nouet, (2011)Metal hyperaccumulation

and hypertolerance: a model for plant evolutionary genomics. Current Opinion in Plant

Biology 2011, 14:252– 259.

[25] Maric M, Antonijevic M, Alagic S. (2013) The investigation of the possibility for using

some wild and cultivated plants as hyperaccumulators of heavy metals from contaminated

soil, Environ Sci Poll Res 20 (2), 1181-1188.

[26] Marques APGC, Rangel AOSS, Castro PML, (2009) Remediation of Heavy Metal

Contaminated Soils: Phytoremediation as a Potentially Promising Clean-Up Technology.

Crit Rev Env Sci Tec 39, 622–654.

[27] Muhammad Azim Khan, Khan Bahadar Marwar, Bakhtiar Gul, Fazil Wahid, Haroon Khan

and Saima Hashim, (2014) Pistia Stratiotes L. (Araceae): Phytochemistry, Use In

Medicines, Phytoremediation, Biologas Ans Management Options. Pak. J. Bot., 851-860.

[28] Nagajyoti PC, Lee KD, (2010) Sreekanth TVM Heavy metals, occurrence and toxicity for

plants: a review. Environ Chem Lett 8, 199–216.

[29] Nicoletta Rascio, Flavia Navari-Izzo, (2010) Heavy metal hyperaccumulating plants: How and why do they do it? And what makes them so interesting?

[30] Palmer CM, Guerinot ML, (2009) Facing the challenges of Cu, Fe and Zn homeostasis in

plants. Nat Chem Biol 5(5), 333-340.

[31] Pavlović A, Atomska apsorpciona spektrofotometrija, Predavanja iz predmeta

Instrumentalna analitička hemija, Niš, 2014.

[32] Peralta-Videa JR, Lopez ML, Narayan M, Saupe G, Gardea-Torresdey J, (2009) The

biochemistry of environmental heavy metal uptake by plants: Implications for the food

chain. Int J Biochem Cell B 41, 1665–1677.

[33] Rascio N, Navari-Izzo F, (2011) Heavy metal hyperaccumulating plants: How and why do

they do it? And what makes them so interesting? Plant Sci 180, 169-181.

[34] Rudy Syah Putra, Fachri Cahyana, Desi Novarita, (2015) Removal of Lead and Copper

from Contaminated Water Using EAPR System and Uptake by Water Lettuce (Pistia

Stratiotes L.) .

[35] Sarma H, (2011) Metal Hyperaccumulation in Plants: A Review Focusing on

Phytoremediation Technology. J Environ Sci Technol 4(2), 118-138.

[36] Vamerali T, Bandiera M, Mosca G, (2010) Field crops for phytoremediation of

metalcontaminated land. A review. Environ Chem Lett 8, 1-17.

[37] Verbruggen N, Hermans C, Schat H, (2009) Molecular mechanisms of metal

hyperaccumulation in plants. New Phytol 181, 759–776.

https://www.tehnologijahrane.com/enciklopedija/osnovni-principi-atomske-apsorpcione-spektrofotometrije







57

[38] Xiaoe Yang, Ying Feng, Zhenli He, Peter J. Stoffella, (2005) Molecular mechanisms of

heavy metal hyperaccumulation and phytoremediation. Journal of Trace Elements in

Medicine and Biology 18 (2005) 339–353.

[39] Yadav SK, (2010) Heavy metals toxicity in plants: An overview on the role of glutathione

and phytochelatins in heavy metal stress tolerance of plants. S Afr J Bot 76, 167–179.

[40] Yusuf M, Fariduddin Q, Hayat S, Ahmad A, (2011) Nickel: An Overview of Uptake,

Essentiality and Toxicity in Plants. Bull Environ Contam Toxicol 86(1), 1-17.

Master rad Biografija

58

7. Biografija

Master rad Biografija

59

Aleksandra Malovac je rođena 23. 06. 1993. godine u Pirotu. Završila je osnovnu školu

„8.septembar“ u Pirotu sa odličnim uspehom. 2008. godine upisuje „Gimnaziju Pirot“ u Pirotu,

prirodno-matematički smer, koju završava sa odličnim uspehom.

Osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu, Univerziteta u Nišu, na

Departmanu za hemiju upisuje 2012. godine. Studije završava 2015. godine, a iste godine upisuje

i master akademske studije na Departmanu za hemiju, smer Primenjena hemija , modul Primenjena

hemija.

Documents

Bioakumulacija teških metala u biljci hiperakumulatoru ... · “hiperakumulator” se odnosio na biljke sposobne da akumuliraju više od 1 mg/g (suve mase) Ni u nadzemne delove,