Chem. Listy 92, 209 -214 (1998)

BIOANALYZA LIECIV

LADISLAV ŠOLTÉS

Ústav experimentálně] farmakologie, Slovenská akadémiavied, 842 16 Bratislava, Slovenská republika

Došlo dňa 9.VI. 1997

Uvod

Biologické materiály v širšom zmysle slova sú všetkylátky, ktoré majú svoj póvod v organizme rastlín aleboživočíchov. Medzi endogenně vysokomolekulové látky,zlúčeniny, móžeme zaradiť niektoré polysacharidy, glykoz-amínoglykány (napr. kyselinu hyalurónovú (HA) a jej solihyalurónany), 1'udský sérový albumin (HSA), a rkyslý gly-koproteín (oCpAGP), lipoproteíny, imunoglobulíny (IG),a mnoho dalších látok. Typické endogenně nízkomoleku-lové zlúčeniny sú napr. bilirubin, adenozíntrifosfát (ATP), a i.

V „bioanalýze" sa ako biologický materiál — biologickávzorka - klasifikujú tělové tekutiny a to krv, sérum aleboplazma, moč, slina, pot, slzy, mozgomiešný mok, syno-viálny výpotok, žlč, a niekolko ďalších tekutin. Vo vymě-ňovaných biologických vzorkách sa sice stanovujú koncen-trácie i vyššie uvedených endogénnych zlúčenín (HA,HSA, a r AGP, IG, ATP, atď.), avšak ich podiel na počtestanovení tzv. xenobiotík je nepatrný.

Medzi xenobiotiká sa zaraduje vačšina exogénnychlátok, zlúčenín, ktoré „vniknu" do organizmu živočíchov,člověka. Typickými xenobiotikami sú napr. liečivá, drogy,ale aj cudzorodé látky přítomné v potravinách či v poživati-nách, a mnohé ďalšie zlúčeniny.

Liečivo - dávka, lieková forma, spósobpodania

Okamžitú hladinu resp. koncentráciu liečiva v organiz-me - v mieste účinku a v systémovej cirkulácii (v krvnomriečisku) - determinuje predovšetkým sposob podania, lie-ková forma, a aplikovaná dávka farmaka. Z hladiska spó-

sobu klasifikujeme podanie za invazívne (váčšinou injek-čné) a za neinvazívne.

Injekčná aplikácia, ktorú spravidla prevádza odbornýzdravotnicky personál, slúži obvykle na rychle dosiahnutieurčitej hladiny liečiva v krvi alebo v ciďovom tkanive,orgáne pacienta. Pri istých akútnych prípadoch, keď ide až0 záchranu života, neváhá sa liečivo vpravit' hoci aj priamodo srdca postihnutého. Častejšie sa však liečivo injikuje dožily (intravenózne podanie formou bolus alebo infúzia), čido róznou mierou překrvených tkanív, orgánov akými napr.sú brusná dutina (intraperitoneálne podanie), púzdro kíbu(intraartikulárne podanie), sval (intramuskulárne podanie),koza (subkutánne podanie), a i.

Prevažujúcim sposobom neinvazívneho podania resp.příjmu lieku, liečivých látok pacientem je požitie orálně.Liečivá látka po jej prehltnutí sa dostává do tráviaceho,gastrointestinálneho traktu (GIT) t.j. žalúdka a črevnej sú-stavy. Krajná doba pasáže liečivých látok GIT-om sa dápřipodobnit' procesu trávenia, ktorý charakterizuje cca 1-2hodinová fyziologická zádrž potravy v žaludku následova-ná jej cca 24-48 hodinovou pasážou črevným systémom.Liečivé látky nestabilně v prostředí žalúdočných kyselin(pH = 1-2) sa chránia obalom odolným proti pósobeniukyseliny (napr. želatínová tobolka) avšak rozpustným, (bio-)degradabilným, v dvanástníku (pH = 11-12) či v ďalšejčasti črevnej sústavy.

Zriedkavejšie využívané liekové formy resp. pre netypické neinvazívne spósoby podania predstavujú kvapky- nosné, očné, ušné, ďalej aerosoly - pre inhaláciu liečivýchprípravkov, čípky - pre rektálnu či pre intravaginálnu apli-káciu liečiva, rózne „masti" - pre topicky a transdermálneaplikované liečivá, atď.

Vyvolanie farmakologického efektu determinuje spra-vidla dosiahnutie určitej koncentrácie liečiva v cieiovomtkanive, orgáne. Tzv. terapeutická hladina reprezentuje teninterval koncentrácií liečiva, ktorého udržiavanie dopre-vádzajú účinky želané. Hladina nižšia je z hladiska terapieneúčinná a v zmysle dávky lieku hovoříme o poddávko-vaní. Koncentrácia liečiva presahujúca terapeutickú hladi-nu je často doprevádzaná nielen efektami neželanými ale1 toxickými, preto je nevyhnutné vyvarovat sa predávko-vaniu liečiva.

209

Dosiahnutie resp. udržiavanie terapeutickej hladiny te-da determinuje spósob (i miesto) podania, lieková forma,ale tiež dávka liečiva resp. i časový interval medzi opaku-júcimi sa aplikáciami.

Liečivo - absorpcia, distribúcia,metabolizmus, eliminácia

Odhalením a popisom zákonitostí pohybu a osudu lie-čiva v organizme sa zaoberá farmakokinetika1. Vzhiadomna skutečnost že miesto aplikácie liečiva, liečivého pří-pravku, obvykle nie je totožné s miestom jeho účinku,predmetom farmakokinetických štúdií sa stávajú nasle-dovné dielčie děje - absorpcia, distribúcia, metabolizmus,a eliminácia.

Absorpciu resp. resorpciu - vstřebáváme sa liečivejlátky do tkanív organizmu - determinuje predovšetkýmpoužitá lieková forma a viacero fyzikálnechemických cha-rakteristik, akými napr. sú rozpustnost liečivej látky vovodě či v tělových tekutinách, stupeň ionizácie molekulliečiva v závislosti od pH prostredia určený hodnotou diso-ciačnej konstanty (pKa), ďalej rozdělovači koeficient mo-lekul liečiva (P) medzi fázu vodnú a lipidickú, ako ajzávislost P od hodnot pH či iónovej sily a dalších para-metrov prostredia, atď.

Distribúcia liečiva v organizme sa často považuje zaproces pasivný, ktorý a priori obstarává krv - jej cirkuláciav riečisku tepien, žil, i kapilár - a sprievodná difúzia liečivado extravaskulárneho priestoru v dósledku samovolnéhovyrovnávania sa chemických potenciálov. Avšak každýživý organizmus sa skládá z určitého počtu zdanlivo funk-čně samostatných oddielov - kompartmentov - navzájomoddělených bariérami, membránami (napr. hematoence-falická bariéra, placenta, a i.), ktoré regulujú přestup ur-čitých skupin látok z jedného kompartmentu do iného.Dokonca i intravenózne podané liečivo prv než dosiahnesystémovú cirkuláciu musí „překročit" bariéru, ktorú pred-stavujú pl'úca - orgán vyznačujúci sa kapacitně poměrnérozsiahlým a selektívnym vychytáváním (extrakciou) bazi-ckých zlúčenín.

Liečivé látky v krvnom riečisku, v extravaskulárnompriestore, ale hlavně v niektorých specializovaných tka-nivách, orgánoch, sú v kontakte s celým radom enzýmov,katalytickým pósobením ktorých dochádza k premene mo-lekul rodičovského liečiva na molekuly iných látok - me-tabolitov. V případe orálně požitého liečiva jeho molekuly,prv než sa dostanu do systémovej cirkulácie, musia „prejsť"

až tromi bariérami a to sliznicami GIT-u, pečenou, a plu-cami - tkanivami, orgánmi, charakterizovanými poměrnévelmi vysokými metabolickými aktivitami.

Napriek skutočnosti že molekuly metabolitov móžu tiežvykazovat' určitý farmakologický efekt, samotný metabo-lizmus představuje v sebe už zložku procesu eliminácierodičovského liečiva z tkanív organizmu. Ďalšiu z orga-nizmu eliminovánu frakciu tvoří liečivo exkretované t.j.vylučované převážné obličkami (močom), připadne stoli-cou či inými exkrečnými cestami.

Experimentálna farmakokinetika

Okamžitá hladina liečivej látky v rozličných miestach,tkanivách organizmu nie je rovnaká. Tiež časové priebehyzměny koncentrácie liečiva v jednotlivých orgánoch súrózné; závisia od viacerých fyziologických dejov súčasneprebiehajúcich v živom organizme. Preto experimenty vy-konané na živých intaktných organizmoch predstavujú ne-zastupitelnú etapu hodnotenia farmakokinetiky nových po-tenciálnych liečiv.

Experimentálnym živočíchom primárného vyberu súspravidla malé hlodavce - myš, potkan, morča, a i. Ďalšiafáza predklinickej farmakokinetiky sa musí vykonať naváčších cicavcoch - pes, člověk. Stanovovanými farmako-kinetickými parametrami, popři celom radě dalších1, súnapr. polčas absorpcie liečiva, jeho distribučný objem,polčas eliminácie, a absolutna či relativná biologická do-stupnost liečivej látky, ale aj vplyv aplikovanej dávkyliečiva, jeho liekovej formy, spósobu či miesta podania nahodnoty určovaných parametrov.

Bioanalýza liečiv - přístup radiometrický

Biologické vzorky z hl'adiska počtu hoci už i vlastnýchendogénnych zložiek sú klasifikovatelné ako multikompo-nentné zmesi. Stanovenie koncentrácie určitej i keď cu-dzorodej látky - liečiva (připadne i jeho metabolitov) -v biologickej vzorke preto prirodzene představuje poměrnékomplikovaný analytický úkol.

Radikálně zjednodušenie pri „stopovaní" molekul lie-čivej látky, a/alebo jej metabolitov v biologických ma-teriáloch prináša použitie tzv. rádiofarmák t.j. liečiv, ktorémajú vo svojej molekule inkorporovaný izotop 1 4C, 3H, činiektorý iný rádioaktívny atom. Búrlivý rozvoj celého radubiologicko-lekárskych vědných disciplín vrátane farmako-

210

lógie je právě priamym dósledkom využitia rádioizotopmioznačených nízko- i vysokomolekulových látok, a tiežbeta- i gama-rádiometrických metod.

Studium experimentálnej farmakokinetiky nového po-tenciálneho liečiva sa i v súčasnosti váčšinou uberá cestouaplikácie farmaka označeného (P-)rádioizotopom. V or-ganizme sa primárné stanovuje tzv. celková radioaktivita,ktorá spravidla představuje zmes rodičovskej látky a jejmetabolitov „nesúcich" radioizotop. Zo separačných metodpre oddelenie molekul rodičovského liečiva od tzv. sumymetabolitov sa obvykle využívá len jednokroková kvapali-nová extrakci a.

Avšak napriek zrejmej skutočnosti že rádiochemicképostupy v bioanalýze liečiv priniesli mnoho užitočnýchpoznatkov, výsledkom často neadekvátnej špecificity kro-ku kvapalinovej extrakcie je i rad úplné „falošných" dát.Účinnejšie rozseparovanie viaczložkových zmesí seboudnes prinášajú metody chromatografické.

Chromatografia v bioanalýze liečiv

Analytické separačné metody plynovochromatografic-ké (GC, GLC) i kvapalinovochromatografické - a to vyso-koúčinná kolonová (HPLC) a vysokoúčinná tenkovrstvová(HPTLC) - sa v súčasnom období zaraďujú medzi tietechniky, ktorých nasadenie v bioanalýze prinieslo pod-statné prehíbenie poznania. Aplikácia metody GLC, HPLC,ale aj HPTLC vo farmakologii - v experimentálnej farma-kokinetike a hlavně pri klinickom hodnotení farmák -rezultuje v poznaní pohybu a osudu liečiv a ich metabolitovv organizme člověka a výsledné i v účinnejšej farmako-terapii celého radu ochorení.

Chromatografické stanovenie koncentrácie liečiva,a/alebo jeho metabolitov v biologickej vzorke pozostávanajčastejšie z dvoch etap:- Prvú představuje přeměna biologickej vzorky na vzor-ku analytičku. (Základnou úlohou tejto etapy spravidla jepredseparovanie, predkoncentrovanie stanovovaných ana-lytov, ako aj odstránenie interferujúcich příměsi, a za-bezpečenie znášanlivosti vzorky so zvoleným analytickýmt.j. chromatografickým systémom2.)- Druhou následnou etapou je samotné hodnotenie ana-lytickej vzorky. (Úlohou tejto následnej etapy je chromato-grafická separácia stanovovaných analytov, získanie odoz-vy vlastnej detekčnej jednotky použitého chromatografic-kého zariadenia, a kvalitatívne-kvantitatívne vyhodnotenievýsledku analýzy.)

Obr. 1. Chromatogram vzorky obsahujúcej metanolický roz-tok TMAH, heptakaín (/) - 4,7; a pentakaín (//) - 9,1 min (a),ako aj chromatogramy blank biologických vzoriek - sérum (b),slina (c), moč5 (d), kolona: 2 mm x 1 m, teplota kolony: 260 "C,náplň: 3 % OV-17 na Chromosorbe W, nosný plyn: N2, prietokplynu: 35 ml.min"1, detektor: plameňovo ionizačný

Na izoláciu analytov z biologických vzoriek sa využívácelý rad fyzikálnych a chemických procesov akými napr.sú (ultra-)filtrácia, kvapalinová extrakcia, chemická deri-vatizácia, atď. V poslednom čase sa však pre přeměnu bio-

Obr. 2. Chromatogram vzorky séra (a - blank) obsahuj úcehoetimizol - 6,3; vnútorný standard - 7,6; a metabolity etimizolu -10,2 (Mj); 14,3 (M2) min (fe)5-6, kolona: 4,6 mm x 25 cm, náplň:LiChrosorb SI 100, 5 um, eluent: N-heptán/dichlórmetán/5 %trietylamínu v metanole = 85:10:5, rychlost' elúcie: 1,2 ml.min' ,detektor: spektrofotometer SP 770, Abs. = 262 nm

211

Obr. 3. Chemická struktura etimizolu, jeho metabolitov Mja M2, ako aj štrukturálneho analogu použitého ako vnútornýstandard. Etimizol: R, = CH2CH3, R2 = R3 = CH3, rnetabolitetimizolu M,: Rt = CH2CH3, R2 = H, R3 = CH3, metabolitetimizolu M2: R, = CH2CH3, R2 = CH2OH, R3 = CH3, vnútornýstandard Antifein: R, = R2 = R3 = CH3

logickej vzorky na vzorku analytičku čoraz častejšie použí-vajú sorbenty, ktorými možno analyty s využitím adsorp-čných, absorpčných (particionačných), ióno-výmenných,chelatačných, a iných kvapalinovochromatografických se-paračných procesov pohodlné predseparovať i koncentro-vat3. Celý súbor takýchto úprav sa nazývá extrakciou tu-hým sorbentom.

Aplikácia dnes už i komerčně bežne dostupných ex-trakčných minikolón, patron, pri predchromatografickomspracovaní multikomponentných biologických vzoriekumožňuje rýchlu a efektívnu přípravu velkého počtu vzo-riek analytických4, ktoré sú nevyhnutné pre farmakoki-netické hodnotenie nových potenciálnych liečiv, pre stu-dium metabolizmu či pre terapeutické monitorovanie hladi-ny liečiva, a pod.

Obr. 1 až 3 ilustrujú výsledky GLC a HPLC analýzbiologických vzoriek pri predchromatografickom spraco-vaní ktorých sa využila metoda extrakcie tuhým sorben-tom5'6.

Studium metabolizmu liečiva (in vivo)

Studium premien molekul xenobiotík katalytickým pó-sobením enzýmov resp. rozličných enzymatických sys-témov je jedným z významných predmetov toxikologie, aleaj farmakologie, či iných vědných disciplín. Biochemizmustakýchto premien sa hodnotí s využitím viacerých standar-dizovaných prístupov, experimentálnych usporiadaní.

Metabolizmus xenobiotík na subcelulárnej úrovni saštuduje s pomocou tzv. frakcie S-9000, ktorá je zmesoumikrozómalných enzýmov vyizolovaných z pečeňovéhohomogenátu metodou rovnovážnej ultracentrifugácie. In-kubácia látky s hepatocytmi představuje úroveň celulárnu,zatial' čo perfúzia vypreparovanej pečené fyziologickým

roztokom obsahujúcim i študované xenobiotikum, liečivo,už do určitej miery simuluje situáciu in vivo. Avšak najrele-vantnejším výsledkom je priamy dokaž přítomnosti meta-bolitov liečiva v živom organizme, ktoré napr. rezultujúz orálně požitého Heku7.

V organizme člověka sa metabolity liečiv najčastejšie„stopujú" analýzou krvi a moču. V niektorých prípadochako vyšetřovaná biologická vzorka sa dá s výhodou použiti slina. Separačné, přednostně kvapalinovochromatogra-fické metody izolácie a čistenia metabolitov sa v případeanalýz kvalitatívnych nevyhnutné dopíňajú technikamiidentifikačnými akými najčastejšie sú jádrová magnetickárezonancia (NMR) a tiež hmotnostná spektrometria (MS).

Terapeutické monitorovanie hladiny liečiva

Jedným z najnáročnejších úkolov ktorý bioanalýzariešivo fannakokinetike je sledovanie časového priebehu kon-centrácie rodičovského liečiva po jednorazovom orálnomaplikovaní, užití rázných dávok lieku. Potřeba spolehli-vého stanovenia hladin liečiva vo fáze jeho ustálenej eli-minácie po dobu minimálně troch, najčastejšie však 5-tichpolčasov kladu nezriedka nároky na citlivost analytickejmetody do oblasti koncentrácií ,,sub-ppb" (< 1 ng.ml"1).Súčasne limitovaný objem vyšetriteinej biologickej vzorkyurčuje ako jedinú možnú alternativu prácu s rádiofarma-kami o vysokej špecifickej aktivitě.

Na druhej straně terapeutické monitorovanie hladinyliečiva charakterizujú spravidla stanovenia v oblasti kon-centrácií ppb i ppm. Avšak v tomto případe je potřebné maťna zřeteli hlavně skutočnosť že samotné monitorovanie jeobvykle „stažené" ako dósledok tzv. multi-farmakoterapie,t.j. že pacient okrem sledovaného, stanovovaného liečivadostává často ešte niekol'ko dalších.

Esenciálnou požiadavkou pri monitorovaní hladiny lie-čiva je popři rychlosti i garancia absolútnej špecificitystanovenia. V klinickej praxi sa preto v narastajúcej mierepoužívajú speciálně monitorovacie súpravy (kity). Z chro-matografických metod bezosporu dominuje HPLC (cit. 8)spravidla s vybavením i plné automatizovanou predchro-matografickou úpravou biologických vzoriek s použitímtechniky extrakcie tuhým sorbentom4-9-10.

Speciálně HPLC experimentálně usporiadania, akoi relativné vysoké hladiny niektorých monitorovanýchliečiv, umožňujú prevedenie chromatografickej analýzyi priamo bez přeměny biologickej vzorky na vzorku ana-lytičku11"15.

212

Krv - sérum/plazma

Krv je nielen rozpúšťadlom celého radu esenciálnychendogénnych látok, zlúčenín, ale aj špeciálnym tkanivomktoré v organizme plní viacero fyziologicky dóležitýchfunkcií. „Makroskopickú" zložku koloidného tkaniva re-prezentujú predovšetkým krvné buňky - erytrocyty a leu-kocyty - a tiež krvné elementy akými napr. sú krvné do-štičky. Rozmerom menšie sú proteiny a ďalšie makrobio-molekulové látky. Přestup týchto zložiek krvi doextravaskulárneho priestoru organizmu podstatné ob-medzuje bariéra ktorú představuje cievna stená.

Váčšina nízkomolekulových zlúčenín vrátane molekulliečiva netvoří v krvi len pravý roztok. Časť molekul móžebyť inkorporovaná do krvných buniek, a/alebo reverzibilneasociovaná s krvnými elementární i proteínmi čoho dósled-kom je, že táto frakcia liečiva extravaskulárny priestororganizmu, cielové tkanivá priamo „zasiahnúť" nemóže.Preto aj poznanie, stanovenie, hladiny liečiva vo vzorkekompletnej krvi je vlastně irelevantně.

Krv odobratá bez aplikácie tzv. antikoagulanta sa samo-volné zráža - agreguje. Po uplynutí určitej doby (1-2 h) sazíská kvapalné sérum a krvný koláč, ktorý je agregátomkrvných buniek a krvných elementov „stmelených" dovednáspolymerizovaným fibrínom. Prídavok heparínu či inéhoantiagregačného činidla do odoberanej krvi umožňuje zís-kat' prakticky okamžité krvnú plazmu, ktorá však na rozdielod séra obsahuje fibrín a prirodzene i použitý antikoagulant.

Obidve tekutiny - plazma i sérum - sú najčastejšieanalyzovanými klinickými vzorkami. Odběry iných bio-logických vzoriek akými napr. je mozgomiešny mok, slina,atď. pre účely terapeutického monitorováni a hladiny liečivasú poměrné ojedinělé.

Plazmatické/sérové proteiny

ILudský sérový albumin (HSA) je polypeptid so sekven-ciou 585-tich 1-amínokyselinových zvyškov přepojenýchintramolekulovo 17-imi disulfidickými vazbami. Z hra-diska nadmolekulovej chemická struktura polypeptidu HSAvytvára usporiadanie typu oc-helixu (45-75 %) i (3-formy(do 18 %). Priemerná plazmatická koncentrácia albuminuu zdravých dospělých 43 g.l"1 ("• 650 ii.mol.l~1) představujepřibližné 2/3 z hladiny celkových plazmatických proteínov16.

Jednou z hlavných fyziologických funkcií albuminu jetransport celého radu reverzibilne viazaných endogénnychlátok a to napr. volných mastných kyselin, bilirubinu16,

1-tryptofánu, a dalších zlúčenín. Z látok exogénneho cha-rakteru HSA ochotné interaguje napr. s liečivami kyslýmiakými sú hoci warfarín či ibuprofén (pKa < 7) pričomkonstanta ich vzájomnej asociácie, k, leží obvykle v inter-vale hodnot 104až 106l.moH.

Makrobiomolekulu 1'udského (Xj-kyslého glykoproteí-nu (ocj-AGP) tvoří reťazec polypeptidu, so sekvenciou 1811-amínokyselinových zvyškov přepojených dvomi intra-molekulovými disulfidickými vazbami, na ktorý sa kova-lentnou vazbou pripája pať heteropolysacharidových struk-turných jednotiek chemicky pozostávajúcich z neutrálnychhexóz (14 %), N-acetylglukózamínu (14 %), kyseliny sialo-vej (11 %), a z fruktózy (1 %). Samotná proteinová časťmakrobiomolekuly v OC]-AGP vytvára nadmolekulovústrukturu typu a-helixu (21 %) i p-formy (21 %) a úsekósmich tzv. p-ohybov ((3-slučiek).

Fyziologická plazmatická hladina cq-AGP leží v inter-vale hodnot 0,4-1,0 g.l"1 (9-23 iJ.mol.l~1). Sprievodnýmjavom pri niektorých zápalových procesoch - napr. po-páleninách, nádorových ochoreniach, ale i pri dalších pa-tofyziologickýchstavoch17-je signifikantně zvýšeniekon-centrácie ocrAGP v krvi. Zo skupiny xenobiotík ocj-AGPpřednostně interaguje s nízkomolekulovými bazickými li-gandami (liečivami s pKa > 7) pričom vzájomná asociácia- konstanta k - dosahuje najčastejšie hodnoty v intervale104až 107 l.mol-1 (cit. 1 7 ) .

Lipoproteíny sú komplexy, asociáty, zaujímajúce tvarsférických partikul. Hydrofóbne jádro pozostávajúcez esterov cholesterolu a triacylglycerolov obaluje hydro-filná vrstva, ktorá je zložená z fosfolipidov, cholesterolu,a z apolipoproteínu. Z hladiska hodnot špecifickej hustotyrozdeíujú sa lipoproteíny spravidla do skupiny vysoko-(HDL), nízko- (LDL), a velmi nízkohustotných (VLDL).

Primárnou fyziologickou funkciou lipoproteínov jetransport lipidov. Vzájomná interakcia nízkomolekulovýchxenobiotík, liečiv, s lipoproteínmi móže mať charakter špe-cifickej, a/alebo nešpecifickej asociácie liečiva s apolipo-proteínom, nešpecifickej „solubilizácie" molekul liečivav lipickom jadre; najpravdepodobnejšie však dochádzai k určitej kombinácii oboch vyměňovaných procesov.

Stereochémia liečiv

Převážná vačšina nízkomolekulových xenobiotík, lie-čiv, po vstupe do systémovej cirkulácie - krvného riečiska- sa reverzibilne viaže, asociuje, s plazmatickými bielkovi-nami (HSA, ocrAGP, HDL, LDL, VLDL, a i.18). A preto,

213

s ohladom aj na skutečnost' že farmakologický efekt deter-minuje spravidla výhradné volná na makrobiomolekulynenaviazaná frakcia, určenie parametrov ktoré kvantifikujúmieru vazby liečiva na proteiny je esenciálnou fázou pred-klinického i klinického hodnotenia nových potenciálnychliečiv. V případe keď liečivom je zmes izomérov — napr.dvoch optických antipódov - ukazuje sa potřebným sta-novit', kvantifikovat' příslušné vazbové charakteristiky preobidva enantioméry.

Vývoj nových progresívnych postupov pre studiumreverzibilných vazbových interakcií plazmatických pro-teínov s jednotlivými enantiomérmi liečiva je dnes v mi-moriadnom centre pozornosti. Dóležitú skupinu použitel-ných experimentálnych metod představuji! postupy sepa-račné vrátane kvapalinovochromatografických.

Vysokomolekulové liečivé pósobky

V súčasnej terapeutickej praxi sa povedfa liečiv, lie-čivých látok nízkomolekulových aplikujú i pósobky vyso-komolekulové. Osobitnú skupinu takýchto pósobkov pred-stavujú tělu vlastné makrobiomolekulové zlúčeniny akýminapr. sú niektoré hormony (inzulín), glykozamínoglykányreprezentované kyselinou hyalurónovou a jej solami hya-lurónanmi19, a ďalšie zlúčeniny.

Avšak, na rozdiel od liečiv nízkomolekulových, vpra-venie exogénnych vysokomolekulových liečivých pósob-kov priamo do krvného riečiska vedie spravidla k fatálnymimunologickým, zápalovým reakciám. A s ohl'adom naskutočnosť že váčšina makrobiomolekulových látok buďv GIT-e degraduje („strávi sa") alebo sa z něho neresorbujeorálně požitie takýchto pósobkov je farmakologický ob-vykle neúčinné.

Vysokomolekulové liečivé pósobky sa preto aplikujú vý-hradné injekčne a to najčastejšie priamo do miesta svojho účinku.Výnimočnú skupinu predstavujú pósobky ktorých podaniestimuluje imunitný systém organizmu a samotný terapeu-tický zásah obstarajú obranné mechanizmy tohoto systému.

Závěr

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia naprieksvojej poměrné krátkej 20 až 25 ročnej historie v súčasnejplejádě separačných metod využívaných pre analýzu bio-logických materiálov nesporné zaujímá vedúce postavenie.Tuto skutočnosť dokumentuje okrem iného i doslova „zá-

plava" vědeckých článkov, oznámení, zveřejňovaných v ce-lom radě periodik věnovaných problematike bioanalýzy.

LITERATURA

1. Gibaldi M., Perrier D.: Pharmacokinetics. MarcelDekker, New York and Basel 1982.

2. MehtaA. C.:TalantaJ3, 67(1986).3. McDowall R. D.: J. Chromatogr. 492, 3 (1989).4. McDowall R. D., Pearce J. C, Murkitt G. S.: Trends

Anal.Chem. 8, 134(1989).5. Šoltés L.: Biomed. Chromatogr. 6, 43 (1992).6. Šoltés L., Biomed. Chromatogr. 6, 177 (1992).7. Reeves P. R., Čase D. E., Jepson H. T„ McCormick

D. J., Nicholls J. T., Felix R. H., Holt P. J. L., ZachariasF. J„ Fluke R. W.: J. Pharmacol. Exptl. Therap. 205,489(1978).

8. GieseR. W.:Clin. Chem. 29, 1331 (1983).9. Kupferschmidt R., Schmid R. W.: Clin. Chem. 55,

1313(1989).10. Doyle E., McDowall R. D., Murkitt G. S., Picot V. S.,

Rogers S. 1: J. Chromatogr. 527, 67 (1990).11. Roth W., Beschke K., Jauch R., Zimmer A., Koss F.

W.: J. Chromatogr. 222, 13 (1981).12. Juergens U.: J. Chromatogr. 310, 97 (1984).13. HagestamI. H.,PinkertonT.C: Anal. Chem.57,1757(1985).14. Pearce J. C, Jelly J. A., Fernandes K. A., Leavens W.

J., McDowall R. D.: J. Chromatogr. 353, 371 (1986).15. AscaloneV.,DalBo'L.:J.Chromatogr.423,239(1987).16. Honoré B.: Pharmacol. Toxicol. 66, Suppl. II (1990).17. Kremer J. M. H., Wilting J., Janssen L. H. M.:

Pharmacol. Rev. 40, 1 (1988).18. Barré J., Riant P., Tillement J.-P.: Fundam. Clin.

Pharmacol. 4, Suppl. 2, 141S (1990).19. Lapčík L., Bohdanecký M., Lapčík II., Bakoš D.:

Chem. Listy 85, 281 (1991).

L. Šoltés (Institute of Experimental Pharmacology,Slovák Academy of Sciences, Bratislava, Slovák Republic):Bioanalysis of Drugs

HPLC has the leading role in the analysis of drugs inbiological materials. A qualitative-quantitative determina-tion as such usually requires more steps which are essentialfor achieving a correct result. The páper introduces anddiscusses several facts met in the bioanalytical practice andis aimed to those interested in the HPLC determinations ofdrugs and their metabolites in biological materials.

214