BIOCHEMIA MEDICA

BIOCHEMIA MEDICA Č A S O P I S H R V A T S K O G A D R U Š T V A M E D I C I N S K I H B I O K E M I Č A R A

Broj: 2 -3 Zagreb, t ravanj-rujan 1996. Godište: 6

UDK 577:61 ISSN 1330-0962

Pregledni članak UDK 616-003.829-006 Revieiu

MOLEKULARNA PATOFIZIOLOGIJA TUMORSKOG PREOBRAŽAJA SOMATSKIH STANICA (PRVI DIO)

Zdenko Kovač Zavod za patofiziologiju Medicinskog fakulteta, Sveučilište u Zagrebu,

Kišpatićeva 12, 10000 Zagreb

SAŽETAK - U radu su prikupljene suvremene molekulske spoznaje o ključnim patogenetskim mehanizmima tumorskog rasta. Fiziološka tkivna masena ravnoteža se održava usklađenom kontroliranom diobom i kontroliranim odumiranjem stanica. U tumorskim bolestima zbog povećanja mase dolazi do poremećaja masene ravnoteže. Prije kliničke pojave tumora u stanicama nastaju različite molekulske promjene, od kojih neke pridonose tumorskom preobražaju stanice. Molekulska je patogeneza tumorskog rasta i nastanka raščlanjena u četiri koraka: 1. nestabilnost genoma, 2. stjecanje diobotvorne neovisnosti stanice, 3. preživljavanje u nepovoljnom unutarnjem okolišu, i 4. metastaziranje tumora, (patogeneza metastaziranja tumora je obrađena u drugom dijelu ovog pregleda). Nestabilnost genoma uzrokuje sklonost strukturnim i funkcijskim promjenama gena koji mogu uzrokovati tumorski preobražaj stanice. Stečena ili I i naslijeđena nestabilnost genoma preduvjet je pokretanja diobotvornih nekontroliranih mehanizama koji nastaju aktiviranjem protoonkogena, disfunkcijom protuonkogena, kočenjem apoptotskih mehanizama, ili kombinacijom nekoliko tih uzročnika. Isto tako neki virusni proteini mogu interferencijom s dioboupravnim molekulskim procesima uzrokovati tumorski preobražaj. Stanice koje su stekle diobotvornu neovisnost prolaze treći korak preživljavanja u nepovoljnom okolišu, pri čemu moraju svladati genomsku, imunonadzornu i energijsku barijeru. Na tom se selektivnom koraku gubi velika masa novostvorenih stanica, što određuje relativno sporu kinetiku tumorskog rasta.

K l j u č n e r i j eč i : molekularna patogeneza tumora, onkogeni, antionkogeni, vi-rusna onkogeneza, mehanizmi autonomne proliferacije stanica, procesi staničnog ciklusa

BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 2-3, 1996. 195

Molekulska patofiziologija tumorskog preobražaja somatskih stanica Z. Kovač

DIOBOUPRAVNI I SAMOUBOJSTVENI MEHANIZMI SOMATSKIH STANICA ODREĐUJU HOMEOSTAZU MASENE TKIVNE RAVNOTEŽE

Preživljavanje složenog višestaničnog organizma ovisi o funkciji posebno diferenciranih somatskih stanica koje oblikuju tkiva, te o energijskoj i informacijskoj homeostazi. Fiziološka se homeostaza tkiva i tkivnih funkcija održava ravnotežom između strogo nadzirane diobe stanica i njihove kontrolirane smrti. Ljudske somatske diferencirane stanice nasljeđuju i nose genske mehanizme samoubojstva stanice i oni se u određenim fiziološkim uvjetima mogu pokrenuti s posljedičnim smanjenjem mase tkiva (1). Poremećaji homeostaze tkivne ravnoteže mogu nastati kao posljedica poremećaja diobotvornih ili/i samouboj-stvenih staničnih mehanizama. Patogeneza raznovrsnih nozoloških skupina uključuje poremećaje masene tkivne ravnoteže koji se očituju kao smanjenje ili povećanje mase (primjerice, tumorske bolesti, neurodegenerativne bolesti, autoimunosne, involutivni procesi, atrofija organa).

Dioba i diferencijacija somatskih stanica, tkivna funkcija te smrt stanica upravljani su informacijskim i energijskim međurazmjenama susjednih ili/i udaljenih stanica. Stanice primaju i odašilju komunikacijske signale pobude autostimulatornim, parastimulatornim i jukstast imulatornim mehanizmima. Istodobno, stanice primaju i odašilju signale kočenja. Trenutni se zbir pobuda i kočenja integrira i to određuje fiziološko ponašanje stanice. Na molekulskoj se razini signali pobude u stanicama očituju lučenjem molekula, pokretanjem staničnog ciklusa u smislu diobe, promjenom izražaja dijelova genoma te pokretanjem programirane smrti stanica. Funkcijska i s trukturna homeostaza fizioloških tkiva se odražava u selektivnim prilagodbama koje se očituju na tkivnoj, staničnoj te molekulskoj razini (2, 3). Prijenos informacija se ostvaruje proteinsko-proteinskim međudjelovanjima (3, 4), fosforilacijama proteina (5), proteinsko-DNA-interakcijama (2, 3), lipidnim signalima (7, 8), lipidacijom proteina (9) te ionskim prijenosom signala (6, 10). Prijenosi signala u citoplazmi se sastaju na nekim križnim točkama različitih putova, koje time postaju integracijske točke na kojima se zbrajaju negativni i pozitivni signali. Takve točke fizioloških križanja putova signala su potencijalna mjesta za nas tanak aberantne pobude stanice.

Ciklini i kinaze ovisne o ciklinima (engl. Cvcline Dependent Kinase, CDK) su važne skupine dioboupravnih bjelančevina čiji izražaj i t renutna koncentracija upravlja umnažanjem DNA i diobom stanice (11, 12). CDK su molekule relativne molekulske mase 35-40 kD, ciklini oko 60 kD (13, 14). U slici 1. shematski je prikazano vrijeme regulacijskih utjecaja pojedinih CDK i pripad-nih ciklina. Fizičkim vezivanjem ciklina i CDK molekulski sklop stječe enzim-sku aktivnost, a disocijacijom sklopa CDK postaje inaktivna (15, 16). Isto tako inhibitorne molekule CDK - ciklinskog sklopa, autofosforilacija, te dinamika sinteze i razgradnje ciklina i CDK putem ubikvitinizacije i proteasomske degradacije, određuju aktivnost tih dioboupravnih sklopova u staničnom ciklusu (17, 18). Aktivne kinaze, sklopovi CDK-ciklini fosforiliraju supstrate među kojima protein RB (pRB) predstavlja ključnu molekulsko-molekulsku sponu prema izravnim transkripcijskim čimbenicima u jezgri. pRB je bjelančevina relativne molekulske mase 105 kD čiji gen je kod čovjeka smješten na 13q kromosomu (19). U nefosforiliranom obliku pRB molekula čvrsto veže E2F

196 BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 2-3, 1996.

1

Z. Kovač Molekulska patofiziologija tumorskog preobražaja somatskih stanica

transkripcijski čimbenik zbog čega on nedostaje u DNA-vezivnim transkrip-cijskim sklopovima. Kao posljedica vezivanja CDK-ciklinskog sklopa na pRB ti sklopovi se raspadaju i prestaje prepisivanje DNA. E2F prijepisni čimbenik se pojavljuje kod čovjeka kao skupina molekula E2F 1, E2F 2, E2F3, E2F4 i E2F5 koje djeluju u obliku heterodimera s partnerskom molekulom DP 1 (19, 20, 21). Vezno mjesto E2F molekule za pRB čine 18 aminokiselina na karboksi-kraju proteina (19). S druge strane, E2F prijepisni čimbenici izravno se vežu na DNA i to na specifični oktanukleotidni slijed TTTCGCGC, odnosno konsen-zualni slijed (19). U tablici 1. su navedeni transkripcijski relevantni geni koji sadrže jednu ili više takvih oligonukleotidnih podudarnih slijedova.

T a b l i c a 1. - Mnogi geni koji su uključeni u dioboupravne procese stanice sadrže jedan ili više oktanukleotidnih konsenzualnih slijedova za vezno mjesto E2F*

T a b l e 1 - Many of the genes participating in the processes controling cell mitosis contain one or more octanucleotide consensual sequences for E2F* link site

Stanični gen

DHFR*#

Timidinska kinaza

DNA polimeraza a

c-myb

cdc2 (CDK1)

N-myc

Oktanukleotid

TTTCGCGC

TTTGGCGC

TTTCGCGC

TTTGGCGC

TTTGGCGG

TTTCGCGC

TTTCGCGC

TTTGGCGC

TTTGGCGC

Mjesto u genu#

+2...+9

+ 13...+6

-105...-112

-128.. .-135

-278.. .-271

-128.. .-121

-130.. .-137

-142...-134

-126...-119

* Priređeno prema podacima u radovima 20, 21, 22, 23 i 24. # Brojke označavaju relativni odnos položaja baze u odnosu na mjesto početka prijepisa (eng.

transcription inititation site) u svim navedenim genima, osim kod c-myb gena kod kojeg brojke označavaju odnos prema mjestu ATG-početničkog kodona.

*# DHFR = dihidrotretrafolatna reduktaza.

Fosforilirani pRB gubi afinitet za E2F-transkripcijske čimbenike koji odmah obrazuju DNA-vezivne prijepisne sklopove što odvodi stanicu u diobu (15).

Dakle, stanični mehanizmi su ugođeni na neprestanu diobu, a citoplaz-matski čimbenici mogu modificirati ciklus. Na slici 2. shematski su prikazani međuodnosi ključnih molekula u dioboupravnim procesima. Izvanstanični i unutarnji fiziološki signali se stapaju na nekima od tih molekula. Primjerice, interleukin-2 (IL-2) kočeći aktivnost p27 otkočuje kinaznu aktivnost ciklin-CDK sklopa čime se hiperfosforilira pRB, a stanica prevodi preko Gl /S nadzorne točke ciklusa u proliferaciju (usporedi sliku 1) (11, 25). Transformirajući čimbenik rasta - (3 (TGF-(3) koči diobu putem pobude p l 5 , p l 6 i p27, a ciklički AMP pobudom p27 koči stanični diobeni ciklus (25, 26). Regulatorne molekule



p l 5 , p l6 , p21, p27, p53, p l07 , p l30 i RB potencijalna su mjesta poremećaja regulacije staničnog diobenog ciklusa (27, 28, 29). Odsutnost molekula, patoge-netski povoljne mutacije ili kemijska modifikacija tih molekula kočenja rezultira otkočenjem staničnog ciklusa i pojavom nekontrolirane diobe. Isto tako, molekulske promjene koje utječu na izražaj i funkciju ovih regulacijskih sklopova mogu otkočiti sustav i dovesti do nekontrolirane diobe.

Vrijeme staničnog ciklusa

S l i k a 1. - Shematski prikaz približnih vremena utjecaja pojedinih dioboupravnih molekula u staničnom diobenom ciklusu. Gl/s i G2/M nadzorne točke (označene uspravnim isprekidanim linijama) su kritične dobe staničnog ciklusa na kojima se ciklus zaustavlja pri pojačanju signala kočenja. Pri otkočenju molekulski signali pobude nesmetano i spontano vode stanični ciklus kroz diobe: Cl:CDK=cycline dependent ki-nase, kinaza ovisna o ciklinima, to jest kinaza kojoj je fizičko vezivanje ciklina neopho

dan preduvjet za funkcioniranje.) F i g u r e 1. Schematic presentation of approximative time of influence ofcertain con-

trolling molecules in cell cycle.

Nasuprot diobenim procesima kojima se stvara nova tkivna masa stoji aktiviranje programirane smrti stanice kojom se može smanjiti tkivna masa. Somatske stanice sadrže gene čijim se sinkroniziranim aktiviranjem pokreće niz biokemijskih promjena koje uzrokuju samoubojstvo stanice (30, 31). Progra-



UČINAK NA DIOBENI STATUS STANICE REZULTAT JE ODNOSA FOSFORILIRANOG I DEFOSFORILIRANOG RB-PROTEINA: 1. POBUDA: Hiperfosforiliranjem RB smanjuje se nefosforilirani RB čime se oslobađa E2F, koji oblikuje s drugim jezgrinim čimbenicima ključne DNA-vezivne sklopove što pokreće diobu. 2. KOČENJE: Smanjenom fosforilacijom RB povećava se vezivanje E2F, što uzrokuje prestanak diobe, budući da se raspadaju ključni DNA vezivni polimerni sklopovi.

S l i k a 2 . - Shematski prikaz molekulskih putova koji određuju aktivnost staničnog ciklusa. Proteini pl5, pl6, p21 i p27 su inhibitori CDK-ciklinskih kinaznih kompleksa, čime se smanjeno fosforilira RB i pojačano veže E2F što koči stanični ciklus. Proteini pl07 i pl30 izravno koče E2F i stanični ciklus. Simbol "(—)" označava kočenje, a simbol "(+)" pobudu čimbenika iza strelice čimbenikom ispred strelice. Simbol "(+P)" označava

fosforilaciju čimbenika iza strelice. F i g u r e 2 . - Schematic presentation of molecular pathways that determine cell cycle

activity.

mirano samoubojstvo stanice, tj. apoptotička smrt, poseban je oblik smrti stanice koji ne pokreće upalni odgovor susjednih stanica pa se ne mijenja tkivna arhitektonika fibroziranjem niti stradaju susjedne somatske stanice



(30). Programirana smrt stanice ili apoptoza očituje se zbijanjem kromatina uz jezgrinu ovojnicu (piknoza), sama stanica se smanjuje gubitkom stanične tekućine, subcelularna tjelešca su očuvana ali zbijena. Stanica se odvaja od susjednih stanica ali održava kontinuitet stanične membrane. Na površini stanice izbočuju se dijelovi stanične membrane koji sadrže ulomke kromatina i citoplazme. Te površinske vezikule, apoptotička tijela, fagocitiraju susjedne stanice bez pokretanja upalnog odgovora (32, 33). Pritom se stanični sadržaj ne egzocitira. Makrofazi ne otpuštaju enzime niti kisikove radikale u okoliš kao posljedicu fagocitiranja apoptotičnih tjelešaca. Elektroforetski razlučeni ulomci kromatina apoptotizirane stanice su pravilni cjelobrojni višekratnici veličine 180 parova baza. Dakle, očituju se kao 180, 360, 540 (i tako redom) parova baza veliki ulomci. Isti nastaju cijepanjem međunukleosomskih veza putem endonukleaze, nespecifičnog enzima čija funkcija ovisi o nazočnosti pogodne koncentracije iona Ca++ i Mg++. Snižena tkivna koncentracija cinka pojačava sklonost apoptozi. Istodobno s gornjim molekulskim i obličnim promjenama stanice u njoj se mogu dokazati značajne promjene tvarnog i energijskog metabolizma. Smanjen je prijenos glukoze, aminokiselina, nukleozida u stanicu. Smanjena je aktivnost RNA polimeraze, sinteza ATP-a, sinteza proteina, lipida i nukleinskih kiselina. Apoptotičko cijepanje kromatina se može dokazati unutar 2-3 sata od pobude, a potpuna smrt unutar 12-24 sata (30, 32). U tablici 2. navedeni su poznatiji fiziološki i farmakološki signali koji uključuju pobudu ili kočenje programirane smrti, kao dio svojih učinaka u organizmu. Isto tako, odsutnost nekih fizioloških signala pokreće apoptozu (vidi tablicu 2.).

Unutarnju kontrolu programirane smrti obnaša gen bcl-2, smješten na 18 kromosomu, koji programira protein relativne molekulske mase od oko 25 kD

T a b l i c a 2. - Popis fizioloških i farmakoloških signala koji mogu pokrenuti ili zakočiti apoptotički program smrti u stanici.

T a b l e 2 - List of phvsiological and pharmacological signals that may initiate or hinder apoptosis in a cell

Kočenje programirane smrti

Čimbenici rasta* Molekule izvanstaničnog matriksa* CD40-ligand* Neutralne aminokiseline Cink* Estrogeni* Interleukin-2*, interleukin-5* Androgeni Farmakološke tvari: Kalpainski inhibi-

tori, inhibitori cisteinskih proteaza

Pobuda programirane smrti

TNF-skupina čimbenika*: FAS-ligand, TNF Preobražajni čimbenik - p (TGF-P)## Neurotransmitori: Glutamat, dopamin, N-metil-D-aspartat Kalcij Slobodni kisikovi radikali Glukokortikoidi Farmakološke tvari: cisplatina, doksorubicin,

cirozin-arabinozid, metotreksat, vinkristin

* Odsutnost naznačenih fizioloških čimbenika uzrokuje spontano pokretanje apoptoze u odgovarajućim stanicama.

# TNF=Tumorski nekrotski čimbenik (od eng. Tumor necrosis factor). ## TGF-P=Preobražajni čimbenik rasta-P (od eng. Transforming growth Factor-P)



(34, 35). Pojačan izražaj tog gena može potpuno zakočiti, a odsutnost pospješiti aktivaciju programirane smrti.

NESTABILNOST GENOMA PREDUVJET JE STJECANJA TUMORSKOG FENOTIPA STANICE

Fiziološka genomska stabilnost i usklađen izražaj genoma osigurava staničnu homeostazu i genski kontinuitet višestaničnog organizma. Stabilnost genoma fiziološki se održava molekulskim, staničnim i nadstaničnim mehanizmima. Fiziološku stabilnost genoma osiguravaju višestruki paralelni molekulski mehanizmi nadzora i popravka DNA, hijerarhijska subordiniranost nadzornih mehanizama i metaboličkog ustroja stanice, heterozigotnost somatskih stanica s kodominantnim izražajem te specifični imunosni nadzor (29, 37).

Zbog vanjskih i endogenih utjecaja mogu nastat i s t rukturne i funkcijske promjene molekula. Na slici 3. razvrstane su raznorodne patogenetske nokse u četiri nezavisne kategorije. Vanjski kemijski, biološki i fizički čimbenici mogu proizvesti u stanicama funkcijske pogreške na nekoj od regulacijskih razina. Isto tako unutarnji čimbenici kao nasljedne disfunkcije genoma te oksidativni stres mogu dovesti do nestabilnosti genoma. Oksidativni stres je patogenetsko stanje povećanog stvaranja i/ili smanjene razgradnje i/ili smanjenog uklanjanja ("puferiranja") radikala (38, 39). Kisikova radikalna vrsta (kisikov superoksid, vodikov peroksid, hidroksilni radikal, singletni kisik, hipokloritni anion, perhidroksinitritni anion, dušikov monoksid, te proteinske i lipidne radikalne molekule) mogu proizvesti stabilne mutacije DNA, s t rukturne i funkcijske promjene proteina i lipida, što ima veliki patogenetski značaj u brojnim nozo-loškim entitetima f(38, 40, 41). Oksidativni stres je redovito povratna kratkotrajna pojava. Budući da stvoreni radikali pokreću lančaste međumolekulske interakcije koje uključuju patogenetske korake inicijacije, razgranjenje i terminaciju, završetak oksidativnog stresa ostavlja u stanici tragove u obliku modificiranih molekula (42, 43, 44). Modificirane molekule, kada im je zahvaćen kritični funkcijski dio, postaju hipofunkcionalne ili disfunkcionalne što se na razini organa i organizma očituje kao progresivno smanjenje funkcijske rezerve. Strukturne promjene nukleinskih baza mogu uzrokovati stabilne unutargenske i izvangenske mutacije od kojih neke mogu imati patogenetski značaj u razvitku tumora. Na slici 3. su navedene neke s t rukturne promjene DNA prouzročene različitim endogenim i egzogenim patogenetskim noksama. Budući da navedene nokse djeluju neselektivno, aditivno i ponekad sinergi-stički njihov se učinak u stanici očituje kao genomska nestabilnost. Nestabilnost genoma očituje se sklonošću prema pojavljivanju otklona kao što su gubitci dijelova genoma, gašenje izražaja gena, prema smanjenju odnosno pojačanju izražaja gena, stvaranju kimeričnih gena, umnažanju cijelih gena (amplifi-kacija gena) ili dijelova gena, ektopičnom umetanju dijelova DNA (insercijama) te protusmjernoj orijentaciji dijela genoma (inverzija kromosoma). Kada se takve promjene dogode intragenski, tj. u genima kritičnih regulacijskih molekula fenotipsko ponašanje se često skokovito (katastrofalno) promijeni. Stanične se promjene mogu očitovati kao smrt stanice, povećane ili / i smanjene pojedine fiziološke funkcije, pobuda neočekivanih genskih izražaja i disdiferen-cijacije, te imortaliziranje stanice. Nestabilnost genoma kod tumorskih stanica



FIZIČKE NOKSE : lonizacijska zračenja Ultraljubičasta zračenja

BIOLOŠKE NOKSE: Virusna integracija u

genom stanice domaćina Međudjelovanje virusnih

molekula s dioboupravnim proteinima i procesima

KEMIJSKE NOKSE: N-nitroso spojevi Policiklički ugljikovodici Križno vezivne molekule Neki lijekovi i ksenobiotici i

polutanti

POVIŠENI OKSIDATIVNI STRES U STANICI:

Procesi starenja Kronične upale

Suvišak prijelaznih metala Smanjen proturadikalni odgovor Ishemijsko-reperfuzijsko

oštećenje

OŠTEĆENJE DNA U STANICAMA DOMAĆINA: 1. Lomovi tračaka DNA 2. Stvaranje apurinskih i apirimidinskih mjesta 3. Ciklobutanski pirimidinski dimeri 4. Križna vezivanja baza 5. Modifikacija baza i dodavanje molekulskih

privjesaka

FIZIOLOŠKI POPRAVAK DNA POREMEĆAJA 1. Mali nukleotidni izrezni popravak 2. Popravak krivog hibridiziranja

pri prijepisu

I ISPRAVAK NASTALE POGREŠKE I FIZIOLOŠKI ZlVOT STANICE

POREMEĆAJI POPRAVKA DNA S ODRŽANOM REPLIKACIJOM *

I STVARANJE STABILNIH MUTACIJA UGENOMU:

I TUMORSKI FENOTIP STANICE: 1. Aktivacijom onkogena 2. Kočenjem apoptoze 3. Kočenjem antionkogena

I TUMORSKI RAST I KLINIČKO OČITOVANJE TUMORA

S l i k a 3 . - Shematski prikaz ključnih točaka molekulske i stanične patogeneze tumora. (* Pored nasljednih poremećaja popravka DNA gornje četiri etiopatogenetske

skupine čimbenika mogu uzrokovati disfunkciju enzima popravka DNA i time utjecati na ishod oštećenja DNA.)

F i g u r e 3 - Schematic presentation of basic points of molecular and cellular tumor pathogenesis



se očituje u citogenetskim (kariotipskim) promjenama, višeklonalnošću pojedine tumorske mase i metastaza, u genskom pojačanju (amplifikaciji) pri čemu se umnaža broj kopija istog gena u genomu, mutacijama te promjene mikrosa-telitskih slijedova produženjem jednostavnih ponavljajućih DNA-slijedova (29, 37). Svaki od tih događaja mogu na proteinskoj i funkcijskoj razini proizvesti posebne učinke.

Pored patogenetskih noksi navedenih na slici 3. nestabilnost genoma može biti posljedica unutarnjih genskih promjena, naslijeđenih ili / i stečenih (vidi kasnije) (28, 29, 45). Usto, nestabilnost se genoma može razviti disfunkcijom ili afunkcijom telomeričnog molekulskog sklopa (46). Telomerični se sklop sastoji od 65 - 70 heptanukleotida TTAGGG, u obliku dvostruke uzvojnice i proteina TRF (od eng. telomere repeat binding factor, TRF), koji ima molekulsku masu oko 60 kD (46). Telomerični molekulski sklopovi se nalaze na oba kraja svakog kromosoma tako da u zdravoj somatskoj stanici kromosomi ukupno imaju do 15 kilobaza repetitivnog materijala kao obvezatni privjesak (46, 47). Telomerične ponavljajuće slijedove heptanukleotida sintetizira enzim telome-raza (48). Ti privjesci sprečavaju rekombinaciju i djelovanje enzima ekzonu-kleaza (engl. end-degrading enzvmes) i ligaza, čime se sprečavaju razgradnja i kriva vezivanja kromosomskih dijelova. Time se kromosomi stabiliziraju (46, 49). Skraćenje kromosoma gubitkom telomeričnih ponavljajućih heptanukleotida uzrokuje nestabilnost genoma. Starenjem organizma se progresivno skraćuju kromosomi procijenjenom brzinom od oko 15-40 parova baza godišnje, što uzrokuje i progresivni porast nestabilnosti genoma starenjem (46, 47, 49). Zanimljivo je da se pri aktivaciji nekih somatskih stanica (limfociti T, CD34+CD38 (slabo+) stanice, tj. matične stanice koštane srži) povećava aktivnost telomeraze (51, 52).

PATOGENETSKI MEHANIZMI DIOBOTVORNE NEOVISNOSTI TUMORA

Za razliku od fiziološkog, homeostatski usklađenog ponašanja somatskih stanica, tumorske stanice posjeduju sposobonost neprestane diobe. Tumorska je stanica izvan regulacijskih utjecaja susjednih i / ili udaljenih stanica i njihovih signala, ili je taj utjecaj minimalan. Nestabilnost genoma može proizvesti promjene genoma (shematski istaknuto na slici 3) koje svojim funkcioniranjem predstavljaju neoplastični preobražaj i ponašanje stanice. Somatske stanice stječu fenotipska svojstva tumorskih stanica putem četiriju neovisnih patogenetskih skupina molekulskih mehanizama.

Prvu skupinu mehanizama koji izravno djeluju diobotvorno čini aberantno ponašanje strukturno promijenjenih protoonkogenskih molekula. Ključni događaj posljedične autonomne diobe je preobražaj protoonkogena u onkogene s fenotipskim očitovanjem tumorskog rasta. U tablici 3. navedeni su primjeri preobrazbe protoonkogena u onkogene. Pojedinim mutacijama ili / i fuzijama gena novostvoreni onkoproteini imaju veću aktivnost od ishodne molekule i stalno je u aktiviranom obliku. Primjerice, ras protoonkogen mutacijom 12Gly neka aminokiselina i / ili mutacija 6 1 neka polarna aminokiselina stječe takvo svojstvo. Fuzijom gena stvaraju se kimerične molekule koje imaju veću aktivnost od ishodne molekule i prekomjerni izražaj, a izvan su nadređenih regulacijskih učinaka drugih gena. Primjerice, translokacijom t:9,22 se abl protoonko-



gen prebacuje na 22 kromosom i pritom stapa s dijelom bcr gena. Novonastala kimerična molekula ima veću molekulsku masu i znatno povišenu nekontroliranu tirozinskokinaznu aktivnost (50). Pored protoonkogena navedenih u tablici 1 dokazan je čitav niz (stotinjak) gena koji mogu imati protoonkogenska svojstva, kao primjerice myb, fos, src, sis, trf, raf-1, mos, fes i drugi (29, 37, 53, 54, 55, 56). Ti geni obnašaju raznorodne funkcije kao što su funkcija transkripcijskih jezgrinih čimbenika, citoplazmatske signalne molekule, funkcija membranskih receptora. Njihova aktivacija u patofiziološki relevantne onkogene predmet je intenzivnih istraživanja (29, 50, 57, 58).

Preobražajem samo jednog alela protoonkogena stanica stječe tumorsko svojstvo neprestane diobe, ona se "imortalizira" (postaje besmrtnom), unatoč fiziološkom funkcioniranju homolognog protoonkogena na drugom kromosomu. Dakle, izražaj onkogenske promjene je dominantan. Isto tako, transfekcijom

T a b l i c a 3 . - Primjeri patogenetski relevantnih protoonkogena za koje je dokazan molekulski mehanizam preobrazbe u onkogene*.

T a b l e 3 - Instances of pathogenetically relevant protooncogenes with confirmed molecular mechanism of transformation into oncogenes*.

Proto-onkogen

H-ros

K-ras

N-ras

c-abl

c-myc

EWS

bcl-2**

Smještaj u genomu

l l p l 4 . 1

12pl2.1

l p l l - 13

9q34

8q24

l lq24

18q21

Fiziološka uloga

Sekundarni cito-plazmatski glasnik

Sekundarni cito-plazmatski glasnik

Sekundarni cito-plazmatski glasnik Tirozinska kinaza

DNA-vezivni regu-lacijski protein (gen ranog odgovora)

DNA vezivni trans-kripcijski čimbenik

Kočenje programirane smrti stanice (apoptotičke smrti)

Mehanizam pretvorbe u onkogen

Mutacija 12Gly—meka aminokiselina Mutacija 61Gln—»polarna aminokiselina

Mutacija 12Gly—>neka aminokiselina Mutacija 61GLN—»polarna aminokiselina

Mutacija 12Gly—>neka aminokiselina Fuzija c-abl protoonkoproteina s brc, kao posljedica translokacije • t(9;22)(q34:qll).

Fuzija myc protoonkoproteina s imunoglobulinskim genom kao posljedica translokacije t(8;14)(ql4;q32). Fuzija myc protooknoproteina kao posljedica translokacije t(8:22)(q24;qll).

Fuzija EWS protoonkogena s Fli-1, kao posljedica t(ll;22)(q24;ql2) translokacije uzrokuje Ewingov sarkom.

Fuzija bcl-2 gena s imunoglobulinskim genom kao posljedica translokacije t(14;18)(q32;q21) u folikularnom limfomu.

* Protoonkogeni se nasljeđuju na somatskim kromosomima poput drugih gena (37, 50, 54, 55, 56, 57).

** Kočenje apoptoze nije diobotvorni mehanizam, zbog čega se kao onkogen svrstava u zasebnu skupinu.



mutiranog protoonkogena može se u stanicu domaćina prenijeti tumorski fenotip.

Drugu skupinu mehanizama imortaliziranja stanice Čini kočenje programirane smrti stanice. U tablici 1 među tumorotvorne pojave je svrstana i trans-lokacija t(14;18) kojom bcl-2 pojačava izražaj tog gena. bcl-2 protein koči programiranu smrt, a pojačanim izražajem produženo održava stanice na životu. Iako gen ne djeluje diobotvorno, kočenjem apoptotičke smrti stanica stanice se nakupljaju i to se fenotipski očituje kao tumor. Taj je mehanizam odgovoran za patogenezu folikularnog limfoma limfocita B u kojem se redovito susreće gore navedena translokacija kromosoma (vidi tablicu 3) (59). Kočenje apoptoze ima dominantan izražaj.

Treća skupina diobotvornih promjena u stanici je disfunkcija protuonko-gena. Funkcionalnom inaktivacijom protuonkogena oslobađaju se fiziološki transkripcijski čimbenici koji spontano i neregulirano prevode stanicu iz G l u S fazu čime započinje dioba. Izostanak antionkogenskog izražaja i upravljanja funkcijom drugih gena predstavlja "derepresiju", "dezinhibiciju", otkočenje staničnih pro-diobenih čimbenika, kao primjerice ciklina Dl , D2 i D3 te trans-formirajućeg čimbenika E2F (38) (usporedi sliku 2). Stanica takvim otkočenim sustavom fenotipski se ponaša autonomno i neprestano se dijeli. U tablici 4 navedeni su primjeri protuonkogena i mehanizmi njihove inaktivacije.

T a b l i c a 4. - Gubitak antionkogenske funkcije omogućuje nekontroliranu proliferaciju stanica dezinhibicijom endogenih transformacijskih čimbenika*

T a b l e 4 - Loss of antioncogene function allows uncontrolled cell prolipheration via disinhibition of endogenic transformation factors*

Anti-onkogen

p 5 3

WT-1

RB

Fiziološka funkcija

Koči p21 čime se otkočuju CDK kinaze koje fosforilira RB protein

Veže DNA vezivni tran-sformacijske čimbenike koji imaju svojstva "zink finger"

Veže i time regulira funkciju transformacijskih čimbenika E1A, E2F, te ciklina Dl , D2 i D 3

Mehanizam gubitka kontrole

Mutacija u četiri hipervarijabilne molekule smještene na 17p

Homozigotna delecija l l p l 3 Mutacija s hemizigotnom đelecijom l lpl3,LOH**

l l p l 3 delecija s točkastom mutacijom

Homozigotna delecija 13ql4 Mutacija s hemizigotnom đelecijom 13ql4 LOH

Promjena u bolesti

Li Fraumenijev sindrom Mnogi drugi tumori

Wilmsov tumor (>50% tumora)

Sindrom Denys-Drash (>90 pacijenata)

Retinoblastom (100% tumora) Karcinom paratiroideje (100% tumora)

* U literaturi se kadšto rabe pojmovi supresorski geni, te negativni regulacijski geni kao sinonimi pojma antionkogeni. Priređeno prema podacima u radovima 29, 37, 56, 60.

** LOH=Loss of heterozygosity, gubitak heterozigotnosti, koji može nastati mutacijom zdravog alela homolognog gena, ili đelecijom tog alela.



Za fenotipsko očitovanje antionkogenske dezinhibicije nužna je inaktivacija oba alela. Dakle, fenotipski je izražaj antionkogenske disfunkcije recesivan. U tablici 4 naglašeno je da se diobotvorni učinak često postiže delecijom oba kromosoma, gubitkom heterozigotnosti hemizigotno deletirane stanice ili pak patogenetski povoljnom mutacijom oba alela istodobno.

Transfekcijom supresorskih gena (primjerice p53 odnosno RB) u tumorske stanice u kojima je dokazana lezija baš tih gena smanjuje se potencijal rasta takvih tumora (60), što povratno ukazuje na njihovu fiziološku zadaću u stanici. U tablici 5 istaknuti su drugi supresorski geni čijom disfunkcijom se može razviti tumorotvorni učinak. Uz spomenute treba navesti i p l5 , p l6 , p21, p27, MyoD, Myf5, p l07, p l30 i nm23 molekule koje imaju svojstva antionkogena i predmet su brojnih istraživanja. Na slici 2 shematski je prikazana fiziološka uloga tih negativnih regulatora staničnog ciklusa. Disfunkcija bjelančevine p l 6 se susreće u 75% melanomskih staničnih linija, što stanicama daje vrlo visoki malignitet (61, 62).

T a b l i c a 5. — Supresorski geni u različitim tumorima kod kojih su djelomično poznati biokemijski mehanizmi tumorskog rasta.#

T a b l e 5 — Suppressor genes in various tumors with partially knovvn biochemical mechanisms of tumor grovvth.

Gen

WT-2 DDC APC NF1 NF2 FAP MEN-1

MEN-2A VHL BRCA-1 ?*

7 7 ?

Smještaj gena na kromosomu

l l p l5 .5 18q21 5ql2-q22 17qll.2 22ql2 5q21-22 l l q l 3

10qll 3p25 17q21 16q22.1-23.1 3p21 3pl2-14 lp36.1

Neoplazma

Wilmsov tumor Karcinom debelog crijeva Obiteljski nepolipozni karcinom debelog crijeva Neurofibromatoza tipa 1. Neurofibromatoza tipa 2. Karcinom debelog crijeva Udruženi tumori paratiroidne žlijezde, hipofize, pankreasa i kore nadbubrežne žlijezde (multipla endokrina neoplazija tipa 1) Multipla endokrina neoplazija tipa 2A von Hippel Lindauov sindrom Obiteljski karcinom dojke Karcinomi jetre Karcinomi pluća Karcinomi bubrega Neuroblastom

# Prema podacima u literaturnim izvorima 60, 90, 91. * ?=Nije identificiran gen već samo mjesto na kromosomu.

Četvrtu skupinu mehanizama čine interakcije genskih proizvoda unutar-staničnih klica s dioboupravnim molekulskim procesima, što se u patogenetski povoljnom slučaju u stanicama domaćinu očituje kao transformacijski signal.


,


U tablici 6 su navedeni potvrđeni primjeri takve bolesti. Dakle, unutarstanične klice pored ugradnje u genom, čime mogu izazvati disfunkciju protoonkogena ili / i onkogena i time pojavu malignog preobražaja, svojim proteinima uzrokuju tumorsku transformaciju. Virusni proteini navedeni u tablici 6 očituju transformirajući učinak u stanici domaćina neovisno djeluju li kao integrirani ili episomalni virusi.

T a b l i c a 6. - Primjeri unutarstaničnih klica čiji proteini mijenjaju dioboupravne procese u stanici domaćina, što fenotipski dovodi do tumorskog preobražaja.

T a b l e 6. - Instances of ... cellular germs with proteins changing controlling processes in the host cell and thus leading to tumor transformation.

Klica

Ebstein-Barrov virus

Adeno-virusi

Papilloma virus

Pox virusi

Virus hepatitisa B

Ključna molekula

BHRF1

LMP-1

E1B

E2A

E6

E7

crmA

HBx

Patogenetski učinak u stanici domaćinu Literaturni ili7i organizmu izvor

- strukturni i funkcijski analog bcl-2 proteina, čime uzrokuje kočenje apoptoze u inficiranim stanicama i njihovo nakupljanje u organizmu, što doprinosi kliničkom očitovanju infekcijske mononukleoze.

- pobuđuje izražaj bcl-2 gena čime koči apoptozu i doprinosi nakupljanju limfatičkih stanica, što doprinosi kliničkom očitovanju infekcijske mononukleoze.

- strukturni i funkcijski analog bcl-2 proteina, čime koči apoptozu.

- natječe se za vezivanje na Rb-defosforilirani protein s E2F transkripcijskim čimbenikom. Vezivanjem na pRB, E2F je slobodan i pokreće stanični ciklus, što uzrokuje proliferaciju stanice domaćina.

- koči p53 izravnim vezivanjem, i dodatno pobudom degradacije p53 ubikvitinizacijom i proteasomskom razgradnjom, što smanjuje izražaj p21 i time otkočuje distalne prodiobene molekule (usporedi sliku 2.)

- istiskuje E2F iz sklopa s RB molekulom, a također veže pl07 i pl30, čime se paralelno otkočuje diobeni ciklus (usporedi sliku 2.)

- izravno koči ICE funkciju (Interleukin-ip conversion enzvme, ICE), čime je zakočen osnovni put aktivacije apoptoze u stanici, što uzrokuje nakupljanje stanica.

- virusni protein HBx izravno veže p53 u citoplazmi čime se otkočuje diobotvorni sustav na razini CDK--ciklinskog sustava (usporedi sliku 2.). Taj mehanizam odgovoran za nastanak hepatocelularnog karcinoma u pacijenata s persistentnim hepatitisom.

32,63

63

64

65

66

66

67

68,69



PATOFIZIOLOŠKA OGRANIČENJA TUMORSKOG RASTA U UNUTARNJEM OKOLIŠU

Stanice sa stečenim tumorotvornim potencijalom se susreću s vlastitim i okolišnim ograničenjima koja usporavaju rast tumorske mase. Iako je dioba stanica tumora sensu stricto autonomna, rast tumorske mase je pod značajnim ograničenjima rasta, zbog vlastitih unutarnjih i okolišnih permisivnih čimbenika. Uvodno je naglašeno da je nestabilnost genoma patogenetski preduvjet stjecanja nekontroliranih diobotvornih mehanizama. Međutim, isto tako, ta nestabilnost genoma dovodi i do letalnih ishoda samih tumorskih stanica zboga čega stanice kćeri odumiru. Budući da je genom tumorske stanice nestabilan, stvaraju se daljnje genomske promjene koje mogu pozitivno mijenjati tumorski fenotip, ali i dovesti do smrti tumorske stanice. Iako je eksperimentalno teško dokazati takav mehanizam, u rastu tumora s nestabilnim genomom susreću se takva genomska ograničenja, čime se gubi dio tumorske mase. Isto tako nestabilnošću genoma u tumorskoj se stanici mogu pokrenuti procesi programirane smrti stanice aktiviranjem gena odgovornih za apoptozu. Taj poseban oblik samoubojstva stanice predstavlja značajno unutarnje stanično ograničenje. Pokretanjem programirane smrti tumorski se klon suicidalno gasi (32, 70, 71, 72). Kontrola pobude apoptoze u tumorskim stanicama bi osiguravala patogenetsku prednost. Ne-tumorske stanice uspijevaju disdiferencijacijom postići kontrolu nad svojim proapoptogenim procesima. Primjerice, u nekim karcinomima dojke izraženi su estrogenski i progesteronski receptori preko kojih hormoni organizma koče programiranu smrt tumorskih stanica. Isto tako neki tumori uterusa, ovarija i prostate koriste endogene hormonske pobude za svladavanje genomskih ograničenja koja nastaju u tumorigenezi zbog nestabilnosti genoma (70). Protuapoptotičko djelovanje pojedinih čimbenika nije nužno jedini patogenetski povoljni učinak takvih čimbenika (70).

Sve su promjene proteinske strukture vlastitih molekula pod neprestanim imunonadzornim ograničenjima koja vrlo precizno otkrivaju i uklanjaju stanice s promjenama ne samo membranskih već i citoplazmatskih proteina. Novonastala tumorska stanica svojim mutacijama, tj. stopljenim proteinima čest je i lak plijen specifičnog imunosnog odgovora. Time imunosni aparat neprestano tijekom života nadzire antigensku kakvoću organizma. Ključna fiziološka uloga molekula glavnog sustava tkivne snošljivosti (HLA-molekule) je imunopre-dočavanje prerađenih antigenskih peptida u obliku imnogeničnih sklopova limfocitima T, što pokreće specifični imunosni odgovor (73). Isto tako izražaj HLA molekula određuje ontogenijsko sazrijevanje limfocita T (73, 74, 75). Novonastale promjene u strukturi bjelančevina uzrokuju stvaranje novih nepoznatih imunogeničnih sklopova, što uzrokuje specifično imunosno odbacivanje tumorskih stanica (73, 74). Zbog nestabilnosti genoma u tumorskim se stanicama mogu pojaviti i klonovi koji ne izražavaju HLA molekule, čime postaju "nevidljive" za specifične imunonadzorne, što bi im dalo selektivnu prednost preživljavanja. Izostankom imunopredočavanja novonastalih epitopa, tumorska stanica može preživjeti iako izražava neoantigene. Brojni klinički očitovani tumori na svojoj membrani ne izražavaju ili imaju smanjenju gustoću HLA molekula (75, 76), čime se smanjuje vjerojatnost specifičnog imunosnog odgovora. U sljedećem koraku imunosnog nadzora HLA-ogoljene stanice posta-



ju plijenom stanica prirodnih ubojica (engl. natural killer cells, NK-stanice) kojih u periferiji ima do 1-3% svih limfocita (77). Naime, neizražajem HLA molekula tumorska stanica pobuđuje NK izvršne citotoksične stanice, koje učinkovito uklanjaju tumorske stanice (78). Usto, u nekim se tumorima HLA molekule ljuštenjem s površine stanica oslobađaju solubilne HLA molekule koje mogu zakočiti imunosni odgovor domaćina. Izravnim vezivanjem solubil-nih HLA molekula (koje u sebi sadrže antigenske peptide) na receptore pobud-nih i / ili izvršnih limfocita T vrlo selektivno paralizira imunosni odgovor (79, 80). Takav mehanizam pobuđene imunopareze u tumorskoj bolesti dobiva sve više eksperimentalnih potvrda u različitim stanjima (81, 82). Očito je da su klinički očitovani tumor one stanice koje su prošle višekratni imunonadzor i selekciju. Fiziološka reaktivnost imunonadzornih mehanizama je preduvjet odstranjenja novonastalih tumorskih stanica. U kliničkim stanjima imuno-nedostatnosti, uključno i jatrogene imunosupresije, organizam je skloniji razvitku tumora zbog kvantitativnog sniženja pobudnog ili / i izvršnog kraka specifičnog imunosnog odgovora (72). Primjerice, dugotrajna imunosupresija primalaca bubrežnog presatka se očituje 4-500 puta učestalijom pojavom različitih tumora u usporedbi s incidencijom tumora u kontrolnim neimunosu-primiranim skupinama (83).

Zbog brze diobe i nakupljanja novih stanica tumorsko tkivo razvija lokalne energijski nepovoljne uvjete. Naime, novostvorene stanice razmiču kapilare i time povećavaju stanično kapilarni difuzijski put čime se otežava difuzija energijskih i gradidbenih tvari. Stanična se euenergoza može održati do 2 mm žilno stanične udaljenosti (84). Pri većim udaljenostima stanice od kapilara u stanicama se snizuje koncentracija ATP-a ispod kritične koncentracije održanja (energv threshold) (85). Zbog tog energijskog ograničenja udaljene stanice često odumiru citoplazmatskom smrću zbog supstratne i hpoksijske hipener-goze (86). Očito je da rastući tumor neprestano gubi množinu vlastitith stanica. Taj se gubitak procjenjuje u različitim tumorima iznositi 76-99% novostvorenih stanica, što se može prepoznati kao česte nekroze tumorskog tkiva. Iz iste činjenice proizlazi dugo vrijeme udvostručenja mase (30 do 120 dana), te spora i duga kinetika razvitka kliničkog očitovanja od prvog tumorotvornog događaja (nekoliko godina).

Energijska ograničenja tumorske stanice svladavaju unutarnjim metaboličkim prilagodbama te pokretanjem angiogeneze (84, 87, 88). Prožiljenje ishe-mičnih dijelova uraštanjem novih kapilara nastaje pobudom pupanja kapilara tvarima kao bazični i kiselog čimbenika rasta fibroblasta (bFGF i aFGF), angiogenina, IL-8, i druge (84, 89). Izražajem nekog od tih čimbenika tumori pobuđuju uraštanje žila što im donosi selektivnu prednost preživljavanja svladavanjem energijskog ograničenja rasta. S druge strane, fiziološka tkiva izražavaju čimbenike kočenja angiogeneze, kao angiostatin, trombospondin-1, interferoni IFNa i IFN(3, te trombocitni čimbenik PF-4 (84). Homeostaza prožiljavanja tkiva se održava ravnotežom proangiogenetskih i protuangio-genetskih čimbenika. Gubitkom izražaja protuangiogenetskih čimbenika tumorska stanica se pomiče prema sklonosti novoproživljavanju tkiva čime premošćuje energijska ograničenja. Tijekom disdiferencijacije pokretanje lučenja proangiogenetskih citokina ili/i kočenje i gubitak izražaja protuangio-



genetskih čimbenika daje tumoru selektivnu prednost u odnosu na energijska ograničenja i ubrzava kinetiku rasta. Pobuda angiogeneze je usko vezana uz patogenezu metastaziranja tumorskih stanica (84).

THE MOLECULAR PATHOPHYSIOLOGY OF NEOPLASTIC TRANSFORMATION OF SOMATIC CELLS

SUMMARY - Molecular and cellular basis of pathophysiological mechanisms of tumor groivth have been discussed in the paper. Expressed quantity ofphysi-ological tissues represents a balance betiveen cell proliferation and cell death. Tumor groivth in the body can be considered as an imbalance of tissue mass groioth and degradation. Long before the clinical appearance of tumor, cells undergo various molecular alterations, some ivith a possible pathogeneic role in the tumor development. In the pathogenesis of any tumor, the folloiving four separate steps can be outlined: (1) instability of genome produces a mutator phenotype ofthe host cell, (2) acquisition of autonomous cell proliferation and immortalization, (3) avoidance of endogenous defense barriers, and (4) development of metastatic potential of tumor. Genome instability is the first prereq-uisite for the development of tumor. Due to physical, chemical and biological environmental influences, and endogenous disorders like increased oxidative stress and inherited errors of repair mechanisms, somatic cell might acquire a tumor cell phenotype. Activation of protooncogenes, inhibition of apoptosis and a loss of antioncogene function are potential molecular mechanisms of cell immortalization. In addition, some viral proteins interfere voith the cellular regulatory processes, thus producing the malignant alteration of the host cell. Survival of tumor cell is faced ivith genomic, immune defence and energy barriers in the host. An extensive cellular loss contributes to a sloiv tumor groivth.

Key words: molecular tumor pathogenesis, oncogenes, antioncogenes, viral oncogenes, mechanisms of autonomous proliferation, cell cycle control

LITERATURA

1. Tennant RW. A perspective on nonmu-tagenic mechanisms in carcinogenesis. Environ Health Perspect Suppl 1993; 101:231-6.

2. Berridge MJ. Inositole triphosphate and calcium signalling. Nature 1993;361:315-25.

3. Paivson T. Protein modules and signal networks. Nature 1995;373:573-9.

4. Cohen GB. Modular binding domain in signal transduction proteins. Cell 1995; 80:237-48.

5. Mockley-Rosen D. Localization of protein kinases by anchoring proteins: A theme

in signal transduction. Science 1995; 268:475-70.

6. Brouin EM, Pollak M, Seidman CE i sur. Calcium-ion-sensing cell surface recep-tors. New Eng J Med 1995;333:234-40.

7. Liscovitch M, Cantley LC. Lipid Second messenger. Cell 1994;77:329-34.

8. Diveche N, Irvine T. Phospholipid signal-ing. Cell 1995;80:269-78.

9. Casey PJ. Protein lipidation in cell sig-naling. Science 1995;268:221-5.

10. Clapham DE. Calcium signaling. Cell 1995;80:259-68.



11. Sherr CJ. Mammalian G 1 cvclins. Cell 1993;73:1053-65.

12. Morgan DO. Principles of cDK regulation. Nature 1995;374:131-4.

13. Pines J, Hunter T. Human cvclin A is ad-enovirus E1A associated protein p60 and behaves differentlv from cvclin B. Nature 1990;346:760-3.

14. Tsai LH, Harloiv E, Mejerson M. Isola-tion of the human cdk2 gene tha t encodes the cvclin A and adenovirus E1A associated p33 kinase. Nature 1991;353:174-7.

15. Dowdy ST, Hinds PW, Louie K i sur Phvsical interaction of retinoblastoma protein with huma D cvclins. Cell 1993; 73:499-511.

16. Peter M, Herscoivitz. Joining the complex: Cvclin dependent kinase inhibitorv pro-teins and the cell cycle. Cell 1994;79:181-4.

17. Murray A. Cvclin ubiquitination: The de-structive end of mitosis. Cell 1995;81:149-52.

18. Hengst L, Dulić V, Slingerland JM i sur. A cell cycle-regulated inhibitor of cvclin-dependent kinases. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:5291-5.

19. Shan B, Durfee T, Wen-Hwa L. Disrup-tion of RB / E2F1 interaction by single point mutation in E2F1 enhances S-phase entry and apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:679-84.

20. Nevi.ns JR. E2F: A link between the Rb tumor suppressor protein and viral onco-genesis. Science 1992;258:424-9.

21. Weinberg RA. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell 1995;81:323-30.

22. De Pinho RA, Legouy E, Feldman LB i sur. Structure and expression of the murine N-myc gene. Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:1827-31.

23. Watson RJ, Dyson J, McMahon. Multiple c-myb transcripts cap sites are variously utilized in cells of mouse hematopoietic origin. EMBOJ 1987;6:1643-51.

24. Kovesdi I, Reichel R, Nevins JR. Identification of a cellular transcripts involved in E1A transactivation. Cell 1986;45:219-28.

25. Klein G. Genes that can antagonize tumor development. FASEB J 1993;7:821-4.

26. Hunter T Pines J. Cyclins and Cancer II: Cyclin D and CDK inhibitors come of age. Cell 1994;79:573-82.

27. El-Diery WS, Tokino T, Valculescu VE i sur. WAF-1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell 1993;75:817-25.

28. Hartivell LH, Kasten MB. Cell cycle control and cancer. Science 1994;266:1821-8,

29. Bishop M. Molecular themes in oncoge-nesis. Cell 1991;64:235-48.

30. Saiagh S, Auger C, Fabien N i sur. In-duction of apoptosis in mouse thymocytes by cyclosporine A An in vitro studies. Immunopharmacol Immunotoxicol 1994; 16:553-76.

31. Kovač Z. Smrt stanice. U: Patofiziologija, urednici S. Gamulin, M. Marušić i S.

32. Thompson CB. Apoptosis in the pathoge-nesis and t reatment of diseases. Science 1995;267:456-62.

33. Wyllie AH. Glucocorticoid induced thy-mocvtes apoptosys is associated with en-dogenous nendonuclease acivation. Naure 1980; 284:55-6

34. Vaux DL, Hecker G, Strasser A. An evolutonary prospective of apoptosys. Cell 1994; 76:777-9.

35. Strasser A, Whittingham S, Vaux DL i sur. Enforced bcl-2 expression in B-lymfoidmcells prolongs antibody re-sponses and elicits autoimmune disease. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:8661-5.

36. Hacjenbry DM, Zutter M, Hickey W, i sur. BCL-2 protein is topolographically re-stricted in tissues by apopotic ncell death. Proc Natl Acad Sci USA 1001;88:6961-5.

37. Coleman B, Tsongalis GJ. Multiple me-chanism account for genomic instabil-lity and molecular mutation in neoplastic transformation. Clin Chem 1995; 41: 644-57.

38. Southorn PA, Potvis G. Free radicals in medicine. I. Chemical nature and biologi-cal reactions. Mayo Clin Proc 1988; 63:381-9.

39. Sinclair AJ, Barnett AH, Lunec J. Free radicals and antioxidant system in health an disease. Br j Hosp Med 1990;43:334-44.

40. Bast A, Goris RJA. Oxidative stress. Pharm Weekbl /Sci/ 1989;11:199-206.

41. Kovač Z. Kisikovi i drugi radikali. U Paofiziologija, urednici S Gamulin, M Marušić i S Krvavica. Medicinska naklada, Zagreb 1995, str 303-5.

42. Ames BN, Shigenaga MK, Hagen TM. Oxidants, antioxidants and degenerative diseases of aging. Proc Natl Acad Sci USA1993;90:7915-22.



43. Stadtman ER. Covalent modification re-actions are marking steps in protein turn-over. Biochemistry 1990;29:6324-31.

44. Fraga CG, Shigenaga MK, Park JW i sur. Oxidative damage to DNA during aging: 8-hidroksy-2-deoxyguanosyne in rat organ DNA and urine. Proc Natl Acad Sci USA 1990;87:4533-7.

45. Kastan MB, Zhan Q, El-Diery WS i sur. A mammalian cell cycle checkpoint path-way utilizing p53 and Gadd45 is defec-tius in ataxia teleangiectasia. Cell 1992;71:587-97.

46. Cang L, van Steensel B, Broccoli D i sur. A human telomeric protein. Science 1995;270:1663-7.

47. Moyzis RK, Buckingham JM, Cram LS, et al. A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG)N, present at the telomers of human chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA 1988;85:6622-6.

48. Morin GB. The human talomere terminal transferase enzyme is a ribonucle-oprotein tha t synthetizes TTAGGG re-peats. Cell 1989;59:521-9.

49. Rhyu MS: Talomers, telomerase and im-mortalitv. J Natl Canc Inst 1995;87:884-94.

50. Rabbitts TH. Cromosomal translocation in human cancer. Nature 1994, 372:143-9.

51. Hiyama K, Hiral Y, Kyoizumi S i sur. Acrivation of telomerase in human lym-phocytes and henatopoetic progenitor cells. J Immunol 1995;155:3711-15.

52. Kipling D. Telomerase: Imortalization enzyme or oncogene. Nature Genetics 1995;9:104-6.

53. Hunter T. Cooperation betvveen onko-gesnes. Cell 1991;64:249-70.

54. Cline MJ. The molecular basis of leuke-mia. New Eng J Med 1994;330:328-36.

55. Nishimura S, T Sekiya. Human cancer and cellular oncogenes. Biochem J 1987;243:313-327.

56. McCormic F. Gasp: Not use another oncogene. Nature 1993; 340:678-9.

57. Crist WM, Kun LE: Common solid tumors of childhood. New Eng J Med 1991;324: 461-71.

58. Gallie BL. Retinoblastoma gene muta-tions in human cancer. New Eng J Med 1994; 330:786-7.

59. McDonnel TJ et al. Progression from lym-phoid hyperplasia to high grade malig-nant lymphoma in miče transgenic for the t(14;18). Nature 1991;349:256-6.

60. Fidler U, Ellis LM. The implications of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis. Cell 1994;79:185-8.

61. Wallace DC. Diseases of the mitochondrial DNA. Annu Rev Biochem 1992;61:11175-212.

62. Kovač Z. Patogenetske vrste smrti stanice. U: Patofiziologija, urednici S. Ga-mulin, M. Marušić i S. Krvavica. Medicinska naklada, Zagreb 1995, str. 81-3.

63. Zetter BR. The cellular basis of site-spe-cific tumor metastasis. New Engl J Med 1990;322:605-12.

64. Liotta LA, et al. Cancer metastasis and angiogenesis: An imbalance of positive and negative regulation. Cell 1991;64:327-36.

65. V/eidner N, Semple JP, Vfelch WR i sur. Tumor angiogenesis and metastasis - cor-relation in invasive breast carcinoma. New Eng J Med 1991;324:1-8.

66. Knudson AG Mutation and cancer: Sta-tistical study of retinoblastoma. Proc Natl Acad Sci USA 1971;68:820-3.

67. Wooster R, Clenton-Jansen AM, Mangion N i sur. Instability of short tandem re-peats (microsatellites) in human cancers. Nature Genet 1994;6:152-5.


Documents

BIOCHEMIA MEDICA