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Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Bei Thymosin beta 4 (TB4) handelt es sich um ein kleines intrinsisch unstrukuriertes Protein
(IUP), dessen funktionelle Domänen bisher nicht eindeutig geklärt sind. Im Rahmen dieser
Arbeit wurde TB4 auf proteinbiochemischer und zellbiologischer Basis charakterisiert. Dazu
wurde zur Kontrolle ein randomisiertes Peptid – scrambled-TB4 (scTB4) – eingesetzt,
welches die selbe AS-Zusammensetzung und somit auch den gleichen pI aufweist wie TB4.
Beide Peptide wurden zuerst mittels bioinformatischer Methoden hinsichtlich ihrer
Ausprägung von definierten Sekundärstrukturen untersucht. Hier zeigte sich, dass sowohl
TB4 als auch scTB4 typische Anzeichen eines IUPs aufweisen.
Zur in vitro Untersuchung der Peptide wurden diese durch Klonierung mit einem C-
terminalen 6xHis-Tag fusioniert und unter die Regulation des T7lac-Promotors gestellt. Diese
Strategie erlaubte die prokaryotische Überexpression in E. coli, Stamm BL21 mit
nachfolgender Aufreinigung und Aufkonzentrierung. Auf diese Weise konnten hochreine
Proteinkonzentrate der Peptide TB4-HIS und scTB4-HIS gewonnen werden, die in
biochemischen Versuchen genutzt wurden.
Native Aktin-Bindungsstudien zeigten, dass nur TB4-HIS an G-Aktin binden kann und dessen
Polymerisation inhibiert. Diese Daten zeigten eine korrekte Funktionalität des prokaryotisch
überexprimierten TB4-HIS an.
In Aktin-Bindungsstudien, in denen der chemische Quervernetzer 1-Ethyl-3-[3-
dimethylaminopropyl]carbodiimid (EDC) eingesetzt wurde, war es möglich, neben TB4 auch
scTB4 mit G-Aktin zu verbinden. Die quervernetzten Komplexe konnten sowohl via SDS-Gel
als auch über Western Blot Analysen nachgewiesen werden. Diese Befunde legen die
Beteiligung eines fundamentalen biophysikalischen Parameters bei der Aktin-Bindung von
TB4 nahe, der nicht sequenzspezifisch ist. Konkret kommt hier der pI der Peptide in Betracht.
Die Quervernetzungsstudien und Pulldown-Assays mit Extrakten von HeLa-Zellen zeigten
leider kein distinktes Bandenmuster bei Einsatz von TB4-HIS. Sowohl TB4-HIS als auch das
photoaktivierbare ANP-TB4-HIS zeigten eine hohe Tendenz zur Aggregation und Ausbildung
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Zusammenfassung
von Multimeren, sodass eine Quervernetzung zu einem definierten Bindungspartner nicht
festgestellt werden konnte.
In Quervernetzungsstudien von TB4-HIS mit Aktin-Oligomeren – die als Nukleationskeime
eine wichtige Rolle bei der Aktinpolymerisation spielen – wurde gezeigt dass TB4-HIS mit
Aktin-Dimeren und -Trimeren interagieren kann. Darauf folgend wurde der Einfluss von
TB4-HIS auf die Reaktionskinetik der Aktinpolymerisation bei Einsatz von von Aktin-
Dimeren, -Trimeren und -Tetrameren untersucht. Hier zeigte TB4-HIS nur einen klaren
Einfluss auf die Aktinpolymerisation bei Anwesenheit von Dimeren, der sich
überraschenderweise in einer erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit äußerte.
Zur zellbiologischen Untersuchung wurden durch Klonierung C-terminale Fusionskonstrukte
der Peptide TB4 und scTB4 mit kleinen Epitop-Tags hergestellt und unter die Regulation des
CMV-Promoters gestellt. Es wurden Plasmide zur eukaryotischen Expression der Peptide
TB4-HIS, TB4-HA und scTB4-HA erhalten, die eine erfolgreiche Überexpression in den
Zelllinien HeLa, NRK und HEK ermöglichten.
Die in vivo Transfektionsassays zeigten ein uneinheitliches Bild hinsichtlich der zellulären
Lokalisation der Konstrukte in den verschiedenen Zelllinien. Sowohl in HeLa- als auch in
NRK-Zellen konnten die TB4-Konstrukte mittels immunzytochemischer Färbungen sowohl
im Zytoplasma als auch im Zellkern nachgewiesen werden. Demgegenüber konnten diese
nicht – bzw. nur sehr wenig – im Nukleus von HEK-Zellen gefunden werden. Die Färbung
des scTB4-HA war hingegen bei allen drei Zelllinien homogen in der Zelle verteilt und
umfasste sowohl das Zytoplasma als den Zellkern.
Die Befunde der intrazellulären Verteilung legen eine sequenzabhängige und spezifische
subzelluläre Lokalisation von TB4 nahe. Die unterschiedliche nukleäre Verteilung basiert
möglicherweise auf einer Bindung von TB4 an einen Bindungspartner bzw. nukleären
Exportfaktor, der in HEK-Zellen vorhanden oder aktiver ist als in HeLa- und NRK-Zellen.
Eine vergleichende Transkriptom- und Proteomanalyse der drei Zelllinien mit einer
Fokussierung auf nukleäre Import- und Exportfaktoren könnte hier in Zukunft Klarheit
bringen und helfen neue Bindungspartner von TB4 zu identifizieren.
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