Biochimie - Curs 12 - 2019 Structura acizilor nucleici · Biochimie - Curs 12 - 2019 1 Structura acizilor nucleici În orice organism acizii nucleici constituie o sursă care codează

Biochimie - Curs 12 - 2019

1

Structura acizilor nucleici

În orice organism acizii nucleici constituie o sursă care codează informaţia

biologică. Forma şi activităţile diverselor celule sunt în mare măsură determinate de

instrucţiunile genetice conţinute de ADN (sau ARN în unele virusuri). În conformitate cu

dogma centrală a biologiei moleculare, secvenţa de baze nucleotidice din ADN codează

secvenţa aminoacizilor din proteine. Multe proteine din celulă sunt enzime care participă

în procesele metabolice. Alte proteine au rol participa în menţinerea şi transmiterea

informaţiei genetice.

Există două tipuri de acizi nucleici, ADN-ul și ARN-ul, care sunt purtători ai

informaţiei genetice şi determină ca această informaţie să fie disponibilă pentru celulă.

Structurile acestor molecule trebuie să fie în concordanţă cu următoarele aspecte:

1. Informaţia genetică trebuie păstrată într-o formă stabilă pentru o perioadă

îndelungată.

2. Informaţia genetică trebuie sa fie decodată înainte de a fi utilizată. Transcripţia

este procesul în care secvenţa nucleotidelor din ADN este copiată sub forma

ARN-ului mesager în aşa manieră încât să determine sinteza proteinelor (proces

de translaţie care se desfășoară în ribozomi).

3. Informaţia conţinută pe ADN sau ARN trebuie să fie accesibilă atât proteinelor

cât şi acizilor nucleici. Aceşti agenţi pot recunoaşte (se pot lega de) acizii nucleici

astfel încât să poată determina schimbări ale funcţiilor acestor molecule.

4. Progenitorii unui organism trebuie să fie echipaţi cu acelaşi set de instrucţiuni ca

ale părintelui. Astfel, ADN-ul este replicat (copiat) astfel încât celulele nou

formate să primească aceeaşi informaţie genetică.

În general, este acceptat faptul că pentru exercitarea funcţiei lor acizii nucleici

necesită şi unele componente celulare.

Structura elicoidală a ADN-ului

Perioada de după anii 1900 până la cel de-al doilea Razboi Mondial a fost

considerată “vârsta de aur” a geneticii. Cu toate acestea cercetătorii nu au reuşit să

confirme faptul că ADN-ul şi nu proteinele constituie materialul ereditar. Oricum,

această perioadă s-a distins printr-o serie de descoperiri genetice care au permis stabilirea

unor corelaţii între genetică şi evoluţie.

În 1869, F. Miescher a izolat ADN-ul din leucocite. Acesta a colectat “puroiul”

(care conţine o cantitate apreciabilă de leucocite) din bandajele folosite la un spital, după

care a îndepărtat acest lichid de pe bandaje utilizând o soluţie salină. După adăugarea

unei soluţii slab alcaline peste celulele albe a constat faptul că nucleele precipită din

soluţie. Meischer a observat faptul că aceasta substanţă din nucleu, numită nucleină, are

un raport constant fosfor:azot (P:N).

ADN-ul s-a dovedit a fi unul din principalii componenţi ai nucleului (Mendel şi

Darwin au publicat descoperirea lor în acelaşi timp). Deoarece s-a izolat din nucleu,

initial compusul (ADN-ul) a fost numit nucleină. Mai târziu a fost denumit acid nucleic şi

în ultima instanţă acid deoxiribonucleic (ADN).


2

Principalele baze din acizii nucleici

În 1914 R. Feulgen a arătat faptul că fuxina (colorant) poate lega ADN-ul. Acestă

proprietate a fost folosită pentru localizarea ADN-ului în nucleul celulelor eucariote. În

1920, P.A. Levene a analizat componentele moleculei de ADN. Studiile sale au dovedit

faptul că ADN-ul conține 4 baze purinice/pirimidinice (Figura 1) legate de o deoxiriboză

pe care este grefată o grupare fosfat (Figura 2).

Figura 1. Structura chimică a celor patru baze din componența ADN-ului

Acest amsamblu (baza+deoxiriboză+grupare

fosfat) formează nucleotidele, monomeri care

intră în constituţia ADN-ului (polimer). De

remarcat este faptul că nucleozidele au în

componenţă numai bază şi deoxiriboza. Într-o

nucleotidă baza este ataşată prin intermediul

unei legături N-glicozidice la atomul de carbon

1 din deoxiriboză în timp ce gruparea fosfat

este grefată la atomul de carbon din pozitia 5.

Nucleotidele sunt legate prin legături fosfodi-

esterice (Figura 2): o gruparea fosfat se leagă

de două zaharuri diferite prin intermediul

grupărilor hidroxil din poziţia C3 de la unul

dintre carbohidraţi şi poziţia C5 de la celălalt

carbohidrat.

Deşi Levene a propus corect modul de

legare a nucleotidelor, el a lansat o ipoteză

greşită în ceea ce priveşte distribuţia

nucleotidelor în molecula de ADN, presupu-

nând că nucleotidele se află grupate în serii de

câte patru, care au aceeaşi ordine în lanţul

polinucleotidic.

Erwin Chargaff a izolat ADN-ul din

diverse surse şi a măsurat ponderea fiecărei

baze (purinice sau pirimidinice). Din datele sale

experimentale a reieşit faptul că ponderile adeninei

şi timinei (respectiv cele pentru guanină şi citozină)

sunt egale, însă cele ale adeninei şi guaninei sunt diferite. Asftel, s-a infirmat teoria lui

Levene conform căreia tetranucleotida era unitatea structurală de bază a ADN-ului.

Figura 2. Structura chimică a unei

tetranucleotide


3

Figura 3. Interacțiuni între bazele

nucleotidice din lanțurile

ADN-ului dublu-catenar

După 1900 Garrod a propus o legătură între gene şi metabolismul existent la

naştere. Una din întrebările care au survenit în acea perioadă a fost următoarea: ce este o

genă? Răspunsul a venit după 20 de ani atunci când F. Griffith a studiat diferenţa dintre

două tipuri de bacterii (una care cauzează pneumonia-S şi alta care nu cauzează

pneumonia-R). Tipul S de bacterie era încapsulat, pe când tipul R nu. Griffith a

demonstrat (1928) faptul că un tip de bacterie nepatogenic poate deveni patogenic prin

intermediul unui “factor de transformare”. Cercetătorul a injectat diferite tipuri de bacterii

în șoarece şi a constatat faptul că tipul S induce moartea, în timp ce tipul R nu afectează

organismul. Mai mult, folosind tipul S al bacteriei care este distrus de temperatură a

observat faptul că organismul a supravieţuit. Combinarea ultimului tip de bacterie

(distrusă prin încălzire) cu tipul R (nepatogen) a indus apariţia pneumoniei, respectiv a

decesului. În anul 1944, O. Avery, C. MacLeod și M. McCarty au concluzionat faptul că

“factorul de transformare” este de fapt ADN-ul. Dovada că ADN-ul este materialul

ereditar a fost adusă de M. DelBruck şi S. Luria. Aceştia au analizat bacteriofagele, un tip

de virus (conţinând un inveliş proteic care încapsulează ADN-ul) care atacă bacteriile

E.Coli (din intestinul gros).

În 1952, A. D. Hershey şi M. Chase au demonstrat prin marcare cu radioizotopi a

bacteriofagelor (32P pentru ADN şi 35S pentru proteină) faptul că ADN-ul (care s-a regăsit

în celula infectată) este “purtătorul fizic” al informaţiei genetice.

Structura ADN-ului

ADN-ul este un polimer care are două lanţuri de deoxinucleotide, molecule care

sunt legate prin legături fosfodiesterice. Cea mai cunoscută formă a ADN-ului este aceea

a B-ADN-ului, care are trăsăturile structurale a ADN-ului descris de J. Watson şi F.

Crick, împreună cu R. Franklin şi colaboratorii acesteia:

1. Cele două lanţuri antiparalele sunt rotite spre dreapta în

jurul unei axe comune rezultând o structură elicoidală al

cărei diametru este de aproximativ 20 Å.

2. Planele formate de bazele nucleotidice, care formează

perechi de legături de hidrogen, sunt aproximativ

perpendiculare pe axa centrală a helixului. În B-ADN,

bazele ocupă ”miezul” helixului iar resturile de

fosfozahar se regăsesc în afara acestuia, formând

adâncituri majore sau minore. Doar porţiuni mici din

perechile de baze sunt expuse spre exterior.

3. Fiecare pereche de baze are aproximativ aceeaşi

înclinaţie, ceea ce conferă o simetrie moleculei de

ADN. Perechile de baze A-T şi G-C (Figura 3) pot fi

interschimbabile fără să afecteze poziţia resturilor de

zahar din afara helixului. Guanina formează 3 legături

de hidrogen cu citozina, iar adenina 2 legături de

hidrogen cu timina. Alte perechi de baze perturbă

semnificativ dispunerea de tip bielicoidal.

4. B-ADN helixul are 10 perechi de baze (eng. “base

pairs” = bp) pentru o rotaţie completă şi pasul de 34 Å.

Pentru a demonstra trăsăturile structurale ale ADN-ului Watson şi Crick s-au

bazat pe informaţiile provenite din modul de difracţie al razelor X de către această


4

moleculă. În practică un fascicul de raze X este direcţionat spre un cristalul unei

substanţe. După bombardarea cristalului unele raze sunt împraştiate sau reflectate în

momentul în care întâlnesc atomi. Razele X împrăştiate pot interfera între ele şi produc

spoturi de diferite intensităţi, care pot fi înregistrate sub forma unei hărţi. Difractograma

(harta rezultată) este asemenea unei semnături caracteristice fiecărei molecule. R.

Franklin şi W. Maurice au obţinut difractogramele specifice ADN-ului. Din aceste

fotografii reieşea faptul că molecula de ADN este simetrică. Distribuţia sub forma literei

“X”, din fotografie, este o dovadă a structurii elicoidale a ADN-ului. Într-o difractogramă

de raze X cu cât spoturile sunt mai apropiate, cu atât distanţa este mai mare. Astfel

“barele orizontale” corespund de fapt cu pasului helixului. Distanţa verticală dintre bare,

34 Å, este o măsură a înălţimii pasului. Distanţa de la mijlocul difractogramei la partea de

sus a acesteia, 3,4 Å, este echivalentă cu distanţa dintre două baze suprapuse. Dat fiind

faptul că înălţimea pasului era de 34 Å iar distanţa dintre baze 3,4 Å cercetătorii au dedus

numărul de baze pe pas - 10 nucleotide. Pasul helixului poate fi calculat din unghiul pe

care “X-ul” îl face cu axa orizontală. Astfel, dacă unghiul este mai mare pasul este mai

mic, iar ADN-ul mai compact. Din difractograma obținută s-a dedus faptul că ADN-ul

prezintă o modalitate de împachetare dublu-elicoidală cu grupările fosfat orientate spre

exterior, iar bazele în interior.

Watson şi Crick erau în concurenţă cu Pauling în rezolvarea structurii tridimen-

sionale a ADN-ului. Ultimul, după ce a rezolvat structura -helixului din proteine,

încerca să deslușească şi structura ADN-ului. Aproape în acelaşi timp Pauling a trimis o

publicaţie despre structura ADN-ului. Watson şi Crick au verificat structura lui Pauling

cu ajutorul unui model cu bile şi bețe, structura care s-a dovedit a fi un triplu-helix.

Distribuţia grupărilor fosfat era în centrul helixului, iar bazele în exteriorul acestuia.

Această orientare a grupărilor fosfat în interiorul helixului era practic imposibilă datorită

repulsiilor electrostatice dintre sarcinile negative, lucru care ar fi îngreunat împachetarea

moleculei.

Figura 4. Cele mai cunoscute variante de împachetare ale ADN-ului dublu catenar (A, B şi Z)

Strcutura dublu-elicoidală poate avea câteva împachetări distincte în funcție de

compoziţia solventului şi secvenţa de baze. Varianta de ADN propusă de Watson și Crick

era aceea B-ADN-ului (Figura 4). Mai târziu au fost propuse și alte variante structurale

ale ADN-ului: A-ADNul şi Z-ADN-ul.


5

5S-rARNul Phe-tARNul

(118 nucleotide) (77 nucleotide)

Figura 5. Tipuri de structuri ale ARN-ului

Figura 6. Conformerii sin și anti ai adenozinei

diferă prin rotația în jurul legăturii N-glicozidice

Perechile de baze ale A-ADN-ului sunt inclinate în raport cu axa helixului

În condiții de deshidratare B-ADN-ul suferă schimbări conformaționale

reversibile și este transformat în A-ADN o macromoleculă a cărei structură este mai

aplatizată și mai largă decât aceea a B-ADN-ului. A-ADNul are 11,6 bp pe rotație și

pasul de 34 Å. Diferenta majoră dintre B-ADN și A-ADN este aceea că perechile de baze

sunt inclinate cu un unghi de 20º în raport cu axa helixului. Mai mult, A-ADN-ul are

adâncituri majore mai profunde comparativ cu B-ADN-ul.

Z-ADN-ul formează un helix orientat spre stânga

La 25 de ani de la descoperirea B-ADN-ului, studiul structurii deoxi(CGCGCG)

de către A. Wang și A. Rich a evidenţiat o altă modalitate de împachetare a ADN-ului.

Lanțurile acestui tip de ADN s-au dovedit a fi orientare spre stânga (Z-ADN). Acest tip

de ADN are 12 bp pe rotaţie şi pasul de 44 Å, adâncitura minoră mai profundă, iar

adâncitura majoră se distinge mai puţin. Difracţia fibrelor şi studiile RMN au arătat faptul

că polinucleotidele complementare cu purinele şi pirimidinele afectate (de exemplu poli

d(GC)·poli d(GC) sau poli d(AC)·poli d(GC)) adoptă conformaţia Z la o concentraţie

mare de sare. Stabilizarea Z-ADN-ului de către săruri se explică prin faptul că repulsiile

dintre gruparile fosfat vecine sunt mai atenuate în prezenţa sărurilor.

ARN-ul formează un A-helix

ARN-ul dublu-helix este materialul genetic al unor virusuri, dar este sintetizat numai sub

forma unui singur lanţ. Acest lanţ poate

forma punţi de hidrogen intramoleculare

formând un lanţ dublu, respectiv bucle

(Figura 5).

Segmente scurte din lanţul ARN-ului sunt

implicate în multiplicarea unor gene.

În mod uzual ARN-ul formează con-

formații de tip A-ADN şi are 11 bp pe

rotaţie şi pasul de 30,9 Å, iar perechile de

baze sunt înclinate cu aproximativ 16,7º

în raport cu axa elicoidului.

Flexibilitatea conformaţională a

ADN-ului este limitată

Conformaţia unei unităţi de nucle-

otidă indică prezenţa a 6 unghiuri de tor-

siune pentru partea de fosfo-zahar şi un

unghi de torsiune atribuit legăturii glicozidice. Rotaţia în jurul legăturii glicozidice este


6

impiedicată. Rezidurile purinice posedă două conformaţii, sin şi anti, ultima dintre

acestea fiind mai stabilă (Figura 6). În marea majoritate a acizilor nucleici, toate bazele

adoptă conformaţia anti. Numai în cazul Z-ADN-ului apar resturi de purină şi pirimidină

a căror conformaţie alternează (anti și sin).

Conformaţiile plic ale ribozei sunt esenţiale în acizii nucleici, determinând

orientarea relativă a substituienţilor fosfat la fiecare rest de riboză. În B-ADN

conformaţia este C2’-endo, pe când în A-ADN conformaţia este C3’-endo. În schimb în

nucleotidele purinice din Z-ADN au conformaţia de tip 3’-endo iar nucleotidele

pirimidice au conformaţia 2’-endo.

Proprietăţile ADN-ului în soluţie

Moleculele de ADN de diferite dimensiuni pot fi studiate prin diverse metode

fizico-chimice. Dimensiunile genomului bacteriofagilor și virușilor variază de la câteva

mii de baze (kilobaze) la câteva sute de kilobaze. Genomul bacterian poate varia de la 0,5

Mb la 10 Mb. Genomul eucariotelor este divers și variază de la aproximativ 10 Mb în

unele ciuperci la mai mult de 100000 Mb în anumite plante.

Proprietăţile acido-bazice

Grupările fosfat din legăturile diesterice ale ADN-ului, care se repetă periodic în

fiecare nucleotidă, au valori scăzute ale pKa-ului şi din acest motiv sunt ionizate la valori

ale pH-ului mai mari de valoarea 4, fapt care conferă ADN-ului un caracter acid.

Grupările fosfat sunt orientate spre exteriorul dublu-helixului şi pot fi interacţiona cu

moleculele de apă, ioni divalenţi (Ca2+, Mg2+) sau amine policationice (spermidina şi

spermina-sunt asociate cu moleculele de ADN virale sau bacteriene). Stabilitatea

legăturilor de hidrogen din perechile de baze din ADN depinde de gradul de ionizare al

gruparilor amino (pH 4-11).

Vâscozitatea

Rigiditatea şi lungimea apreciabilă a lanţului conferă ADN-ului o vâscozitate

apreciabilă. Măsurătorile de vâscozitate sunt folosite pentru a urmări gradul de denaturare

al ADN-ului şi implicit gradul de împachetare al duplexului.

Coeficientul de sedimentare

Coeficientul de sedimentare şi masa moleculară a tipurilor de ADN pot fi deter-

minate prin ultracentrifugare. Masa moleculară a ADN-ului poate fi determinată prin

compararea vitezei de sedimentare într-un gradient de densitate de zaharoză cu o probă

de ADN cu dimensiuni şi coeficient de sedimentare determinate în prealabil.

Sedimentarea la echilibru în gradient de CsCl este folosită pentru determinarea

densităţii de plutire a ADN-ului. Moleculele de ADN se concentrează într-o banda stabilă

la nivelul care densitatea de plutire este egală cu densitatea CsCl din acea zonă. ADN-ul

monocatenar are o densitate mai mare decât ADN-ul dublucatenar, care la rândul său are

în general o densitate mai mare decât proteinele. ARN-ul poate fi diferenţiat de ADN

(mono sau bicatenar) prin faptul că primul are o densitate mai mare. Densitatea de plutire

a ADN-ului poate furniza informaţii referitoare la ponderea perechilor G-C şi A-T din

moleculă. Mai mult, ADN-urile virale intacte, omogene, prezintă benzi înguste, în timp

ce fragmetele heterogene de ADN din celulele eucariotelor apar sub forma unor benzi

(grupuri de benzi) mai largi.


7

Figura 7. Denaturarea (desfacerea)

ADN-ului dublu-catenar în mono-catenar

Denaturarea și renaturarea

În cazul în care o soluţie care conţine

duplex-ADN-ul este încălzită peste o anumită

temperatură, structura nativă a acestuia este alterată

rezultând separat cele două lanţuri complementare

care au conformaţii aleatorii (Figura 7). Astfel

procesul de denaturare este însoţit de schimbări

calitative în cazul proprietăţilor fizice ale ADN-ului

(scăderea vâscozităţii şi creşterea absorbanţei în

UV în cazul formei denaturate). Denaturarea ADN-

ului este un fenomen cooperativ în care alterările

dintr-o parte a moleculei destabilizează celelalte

legături (dintre cele două lanţuri rămase). Această

denaturare are loc într-un interval îngust de

temperatură. Mijlocul acestui interval poartă

numele de temperatură de topire, Tm (m = eng.

melting-topire). Stabilitatea duplex-ADN-ului

(ilustrată de Tm) depinde de o serie de factori:

natura solventului, tăria ionică, conţinutul de perechi G-C (care conţin o legătură de

hidrogen suplimentară în comparaţie cu perechea A-T) sau de pH.

În 1960, J. Marmur a arătat faptul că ADN-ul denaturat poate fi renaturat (să

revină la starea iniţială) în condiţiile în care temperatura este menţinută cu 25 mai jos

decât Tm.

Perechile de baze

Împerecherea bazelor este asemeni unui “relipiri” a celor două lanţuri din acizii

nucleici. În cazul modelului proous de Watson și Crick aceste perechi de baze se

formează între oligonucleotide complementare. Există însă şi situaţii diferite. De

exemplu, perechea de baze A-T poate avea atomul de azot din poziția 7 (perechea

Hoogsteen) drept acceptor şi nu cel din pozitia 1 care corespunde situaţiei clasice

(modelului Watson-Crick). Oricum, măsurătorile experimentale au arătat faptul că numai

perechile de baze Watson-Crick au o stabilitate mai mare față de celelalte perechi. Există

şi situaţii diferite în care segmentele ce se împachetează dublu-elicoidal, din multe ARN-

uri, conţin perechi de baze de tipul G-U care au rol în stabilizarea structurii terţiare a

acestora.

Figura 8. Tipuri de perechi de baze


8

Interacţiunile de van der Waals

Purinele şi pirimidinele din interiorul structurii dublu elicoidale au tendinţa de a

se orienta într-o manieră paralelă prin intermediul interacţiunilor de tip van der Waals

(interacţiuni electronice de tip -) sau hidrofobe. Aceste interacţiuni contribuie în mod

esenţial la stabilizarea structurii ADN-ului.

Interacţiunile ionice

Interacţiunile electrostatice care au loc între grupările fosfat trebuie considerate,

alături de legăturile de hidrogen şi interacţiunile hidrofobe din acizii nucleici, factori care

contribuie la stabilizarea structurii acizilor nucleici. De exemplu, Tm a duplex-ADNului

creşte dacă concentraţia ionilor de Na+ este mărită. Acest fapt se datorează intercalării

acestor ioni între grupările fosfat. Analog ionii divalenţi, Mg2+, Mn2+ şi Co2+ se leagă

specific de grupările fosfat şi astfel constituie agenţi de protecţie a acizilor nucleici. Ionii

de Mg2+ joacă de asemenea un rol esenţial în stabilizarea structurilor complexe adoptate

de diverse molecule de ARN.

Reacția de polimerizare în lanț (PCR-The polymerase chain reaction)

Geneticienii au înțeles faptul că sunt necesare mai multe componente pentru a

realiza replicarea ADN-ului. În acest scop este nevoie de enzimă denumită ADN

polimeraza și de deoxinucleotide care constituie “cărămizile” de bază ale ADN-ului.

Reacția de polimerizare în lanț (PCR) este o reacție enzimatică de amplificare

mediată de primeri (secvențe scurte de ADN) specifici secvențelor de ADN genomic sau

clonat. Metoda PCR a fost inventată de Karry Mullis în 1983 și implică utilizarea unor

primeri (a căror lungime este de obicei 20-25 pb) și a unei ADN polimeraze termostabile,

cele mai utilizate fiind Taq, Pfu sau Pwo polimeraza. ADN-ul matriță conține secvența

țintă, care poate avea de la zeci la zeci de mii de nucleotide lungime. Tehnica PCR

standard realizează amplificarea unei singure secvențe de ADN care are o lungime de cel

puțin 5 kb (5000 de baze). Long PCR este tehnica prin care se pot amplifica fragmente

mai lungi de ADN (de până la 40 kb). A treia variantă de PCR, multiplex, este utilizată

pentru amplificarea unor secvențe multiple care au o lungime sub 5 kb. Taq polimeraza

catalizează reacția într-un sistem tampon, în care există un exces de perechi de primeri și

cele patru fosfat-deoxinucleotide (dNTP), generându-se astfel milioane de copii ale

secvenței țintă. PCR poate fi utilizat și pentru amplificarea secvenței de ARN, care

trebuie convertită inițial în ADN de enzima revers transcriptaza. Spre deosebire de ADN

trebuie luată în considerare instabilitatea și susceptibilitatea ARN-ului la degradare.

ADN-ul utilizat ca matriță pentru PCR poate proveni din diferite surse: sânge

liofilizat, salivă, țesut parafinat, păr. De asemenea reacția PCR poate fi utilizată pentru

amplificarea ADN-ului din materiale degradate: mumii sau fosile.

Replicarea ADNului in vitro - reactia PCR

Reacția PCR este constituită din serii de trei pași esențiali care definesc un ciclu

PCR: denaturarea ADN-ului matriță dublu catenar, alinierea perechilor de primeri la

matrițele de ADN monocatenar și extinderea enzimatică a primerilor, prin care se produc

copii care servesc drept matrițe în ciclurile ulterioare. ADN-ul matriță este suspendat într-


9

un amestec alcătuit din apă distilată sterilizată (fără ARN), soluție tampon (ce conține

clorura de magneziu), polimeraza (Taq, Pfu sau Pwo polimeraza respectiv un amestec de

polimeraze) și cele patru dNTP. De asemenea există o pereche de primeri a căror

secvențe sunt complementare cu cele ale ADN-ului care flanchează regiunea țintă.

Pentru construirea primerilor se iau în considerare următoarele criterii:

- trebuie să aibă un conținut de baze în jur de 50% GC;

- lungimea trebuie sa fie între 15-30 pb;

- cei doi primeri trebuie să nu formeze duplexuri între ei;

- trebuie evitați primerii care conțin bucle;

- capătul 3’ trebuie să prezinte o complementaritate perfectă cu a ADN-ului țintă;

- temperatura de aliniere a primerilor sa fie între 50-64 ºC;

- temperatura la care jumătate din molecule sunt monocatenare și cealaltă jumă-

tate bicatenare este temperatura de topire (Tm). Temperatura de topire poate fi

aproximată după formula:

Tm = 2 ∙ (număr de baze A/T) + 4 ∙ (număr de baze C/G)

Temperatura de aliniere a primerilor este de obicei aleasă cu 5 ºC mai scăzută

decât temperatura de topire a ADN-ului. Din acest motiv este foarte importantă alegerea

temperaturii de topire a celor doi primeri.

Figura 9. Etapele reacției PCR


10

Amestecul de reacție este mai întâi încălzit la temperatura de 94 ºC pentru

denaturarea (separarea) celor două catene de ADN (Figura 9) și apoi răcit la o

temperatură optimă care facilitează alinierea (alipirea acestora la secvența de ADN)

primerilor.

Primerii sunt orientați unul în amonte și unul în aval față de regiunea ce urmează

a fi amplificată, ambii cu capătul 3’ spre interiorul secvenței țintă. Poziția relativă a

regiunilor complementare ale acestor primeri determină lungimea secvenței de ADN care

va fi copiată.

În timpul extinderii primerilor ADN polimeraza adaugă progresiv dNTP-urile

complementar cu secvența matriță, la capătul 3’ al fiecărui primer, generându-se asftel o

nouă copie. Astfel prin cicluri repetate de răcire și încălzire se poate forma o cantitate

semnificativă de ADN a cărui secvență este identică cu aceea a ADN-ului matriță.

Rezultatul, după 20 de cicluri de amplificare, este producerea a 220 (peste un milion) copii

ale ADN-ului matriță.

Inițial exista un impediment legat de stabilitatea polimerazei care era utilizată la

replicarea ADN-ului. Enzima respectivă se degrada în momentul încălzirii amestecului la

temperatură optimă neceară pentru separara lanțurilor ADN-ului dublu-catenar. Din

fericire, biologii au extras diverse polimeraze din bacterii termofile, care traiau în medii

la temperaturi extreme. Prin această strategie s-au izolat polimeraze rezistente la

temperaturi mari. Taq polimeraza este o polimerază termostabilă care a fost extrasă din

bacteria Termus acvaticus (bacterie care trăiește în izvoarele calde). Unul dintre

dezavantajele folosirii Taq polimerazei este acela al fidelității scăzute (o eroare de

copiere la aproximativ 9000 de nucleotide), fapt datorat lipsei activității exonucleazice. În

schimb Pfu polimeraza, o polimerază termostabilă (enzima care are în componență

tungsten) numită după specia hipertermofilă anaerobă Pyrococcus furiosus (acest

organism se dezvoltă la temperaturi de 100 ºC), posedă și activitate de verificare a

corectitudinii polimerizării realizând astfel o amplificare cu o acuratețe ridicată a

secvenței ADN dorite. Pwo polimeraza a fost izolată din archeobacteria hipertermofilă

Pyrococcus woesei.

Cele aproximativ 30 de cicluri sunt realizate într-un aparat optimizat să oscileze

temperatura pe diferite intervale de timp, numit thermal cycler. Numărul de cicluri PCR

trebuie optimizat în functie de numărul de copii țintă dorit. Pornindu-se de la o singură

copie, cea mai eficientă reacție de PCR atinge în câteva ore un platou după 40 de cicluri

de amplificare. Acest proces este denumit PCR deoarece în decursul fiecărui ciclu

cantitatea de ADN se dublează. Mărimea fragmentului de ADN copiat rezultat în urma

PCR este controlată prin intermediul unei tehnici de separare numită electroforeză în

geluri de agaroză.

Aplicații ale tehnicii PCR

Unul din exemplele elocvente ale aplicabilității PCR-ului are rezonanță istorică.

Această tehnică a permis demascarea unui impostor care pretindea a fi membru al

familiei imperiale ruse. În anul anul 1918, Nicolae Romanov II, ultimul țar al Rusiei,

împreună cu familia au fost asasinați în timpul revoluției bolșevice. Ei au fost înhumați

într-un loc nemarcat. În 1993, oasele lor au fost supuse testului de identificare a ADN-

ului. Acest lucru a fost posibil prin comparerea secvențelor de ADN ale soției țarului

Romanov cu acelea ale prințului Philip de Edinburg, soțul regiei Elizabeta II. Interesant,

la scurt timp după asasinarea familiei regale, au circulat zvonuri referitoare la


11

supraviețuirea unei fiice a țarului, Anastasia, în urma asasinatului. O persoană a convins o

parte din nobilimea rusă din Berlin de apartenența sa la familia regală. Mai târziu, această

persoană a emigrat în SUA unde a decedat în 1984. Prin intermediul unei probe de țesut

care era depozitată într-un spital unde aceasta a fost supusă unei intervenții, ADN-ului

acesteia a putut fi amplificat. În urma investigațiilor s-a demonstrat faptul că împărăteasa

Alexandra și printul Filip nu sunt rude cu această persoană.

Mai mult, aplicațiile Reacției PCR sunt diverse:

- în criminalistică;

- manipularea genetică;

- detecția HIV (ADN-ul este izolat din celulele roșii și amplificat cu primeri

corespunzători secvențelor HIV);

- diagnosticare prenatală a bolilor genetice.

Balizele moleculare (BM)

Tehnologia balizelor moleculare a fost introdusă începând cu anul 1996 de către

Tyagi şi Kramer. În această tehnică o probă fluorescentă (etichetată la unul din capete cu

un fluorofor și la altul cu un stingător) a fost utilizată pentru a dovedi prezenţa unor

secvenţe complementare atribuite unor acizi nucleici din soluţie. O baliză moleculară este

o oligonucleotidă sub formă de ac conţinând o secvenţă ţintă specifică flancată de două

secvenţe complementare care pot hibridiza pentru a forma o tijă. Majoritatea probelor au

25-40 nucleotide; tija poate conţine 5-10 pb. Un fluorofor şi un stingător adecvat sunt

plasaţi la capetele 3’ şi 5’ ale tijei şi semnalul fluorescenţei este mediat de transferul de

energie prin rezonanţă. În absenţa secvenţei complementare, fluorescenţa fluoroforului

de pe tija balizei (BM) este stinsă de către stingătorul adiacent. Legarea unei BM la

secvenţa ţintă induce o disociere a tijei, fapt care determină o creştere a distanţei dintre

fluorofor şi stingător, conducând la o creştere a intensităţii fluorescenţei.

O BM se poate lega reversibil sau să disocieze de secvenţa ţintă, şi acestă

reversibilitate poate afecta sensibilitatea si selectivitatea detecţiei. Performanţa tehnicii

este dictată de o serie de factori (temperatură, pH sau conţinutul secvenţei tijei şi buclei).

La o temperatură scăzută, o BM este caracterizată prin stabilitate ridicată a intra-

duplexului chiar în prezenţa secvenţei ţintă. Din acest motiv fluorescenţa este scăzută

datorită stingerii intramoleculare a BM care nu hibridizează cu secvenţa ţintă (Figura 10).

Figura 10. Tehnica hibridizării ADN-ului

La o temperatură optimă, BM va fi instabilă şi va hibridiza cu secvenţa de interes,

rezultând un semnal puternic pentru fluorescenţă. În final, la o temperatură mai mare,


12

porţiunile de pe tija BM şi complexul BM-ADN ţintă sunt instabile dat fiind faptul că

BM rămâne într-o conformaţie liniară.

BM pot fi folosite în numeroase aplicaţii: detecţia agenţilor patogeni şi la

stabilirea genotipului alelelor.

Documents

Biochimie - Curs 12 - 2019 Structura acizilor nucleici · Biochimie - Curs 12 - 2019 1 Structura acizilor nucleici În orice organism acizii nucleici constituie o sursă care codează