https://bioc.gnomio.com/

Creare cont!

Cheie de inrolare: bioc-bbtc

Platforma MoodleBiochimie-Capitole speciale

Proprietăţi chimice ale aminoacizilor determinate de prezenţa simultană a celor două grupări funcţionale –COOH şi –NH2

- reacţia de condensare intermoleculară – cu formare de dipeptide, tripeptide, etc. - doi sau mai mulţi aminoacizi reacţionează între ei cu eliminare intermoleculară de apă între o grupare –COOH a unui aminoacid şi o grupare –NH2 a altui aminoacid. - legătura peptidică formată -CO-NH- stă la baza structurii peptidelor, polipeptidelor şi proteinelor.

-H2O

HN

CH

COH

H O

R'

HN

CH

COH

H O

R''

+H

N

CH

C

H O

R'

HN

CH

COH

O

R''

Aminoacid DipeptidaAminoacid

HN

CH

COH

H O

R

+

Aminoacid

-H2O

HN

CH

COH

O

R

HN

CH

C

H O

R'

HN

CH

C

O

R''

Tripeptida

Polipeptida

Peptidele sunt substanţe naturale sau sintetice constituite dintr-un număr restrâns de aminoacizi care se condensează intermolecular la nivelul grupării α-carboxil a unui aminoacid şi a grupării α-amino a altui aminoacid, cu formare de legături peptidice.

Peptidele reprezintă compuşi intermediari între aminoacizi şi proteine.

Peptidele constituite din 2-10 aminoacizi se numesc oligopeptide.

Cele a căror structură este formată din 10-100 aminoacizi se definesc ca polipeptide.

La capetele lanţului peptidic rămâne o grupare amino liberă şi o grupare carboxilică liberă. Aceste două grupări neimplicate în fomarea legăturilor peptidice se numesc grupări carboxil C-terminale (aminoacid C-terminal) şi respectiv grupări amino-N-terminale (aminoacid N-terminal). Prin convenţie aminoacidul N-terminal dintr-un lanţ polipeptidic sau proteic se consideră ca fiind primul aminoacid din structura respectivă.

Denumirea peptidelor se formează din numele radicalilor aminoacizilor constituenţi, cu excepţia aminoacidului care are gruparea carboxilică liberă, ultimul din lanţul polipetidic.

H3N C

CH2OH

H

C

O

N CH2

H

C N

O

C

H

H

CH2

C

OH

O

N

H

C

H

CH3

C N

O

C

H

COO-

H

CH2

CH

CH3H3C

Serina Glicina Tirosina Alanina Leucina

Seril-glicil-tirozil-alanin-leucina

SER-GLY-TYR-ALA-LEU

H-SER-GLY-TYR-ALA-LEU-OH

5

Proprietăţi fizico-chimice ale oligopeptidelorPeptidele prezintă proprietăţi intermediare între cele ale aminoacizilor şi cele ale proteinelor.

Peptidele cu masă moleculară mare sunt solubile în apă şi insolubile în alcool, solubilitatea scăzând odată cu creşterea masei moleculare.

Sub acţiunea căldurii nu coagulează şi nu sunt denaturate.

Hidroliza enzimatică a peptidelor (sub influenţa enzimelor peptidaze) conduce, în cazul homopeptidelor, la aminoacizii din care s-au format, iar în cazul heteropeptidelor, se obţine, pe lângă aminoacizi, şi o componentă neproteică (componentă prostetică).

sunt răspândite atât în regnul vegetal cât şi în cel animal, unde îndeplinesc un anumit rol fiziologic;

se formează în metabolism ca faze intermediare;

intră în compoziţia unor hormoni, antibiotice, etc.

H3N CH C N

O

C

H

H

CH2

C

OH

O

CH2

COO-

OCH3

Aspartam (esterul metilic al aspartil-fenilalaninei)

CH

COO-

NH3+

CH2 CH2 C

O

NH CH

CH2

C

SH

O

NH CH2 COO-

Glutationul (glutamil-cisteinil-glicina)-se gaseste in seminte si embrioni ai plantelorImportant rol in procese redox, antioxidant, rol de protectie a unor substraturi

N

SCH(CH2)3CONH

H H

O

CH3

CH3

COOH

H2N

HOOC

Penicilina

7

Proteidele-sunt compuşi cu structură macromoleculară, complexă, esenţiali pentru organismele vii atât din punct de vedere funcţional cât şi structural. -În această categorie intră holoproteidele (proteinele propriu-zise) alcătuite exclusiv din aminoacizi, cât şi heteroproteidele (proteinele conjugate) alcătuite din aminoacizi şi o componentă neproteică (prostetică). Holoproteidele (proteinele) reprezintă substanţe complexe cu caracter macromolecular şi cu un înalt grad de organizare structurală. Proteinele sunt alcătuite numai din aminoacizi, având mase moleculare de 1x103 –1x105 Daltoni.

Proteinele se caracterizează printr-o mare diversitate structurală determinată de:-numărul aminoacizilor constituenţi; -- tipurile aminoacizilor constituenţi; - secvenţa aminoacizilor componenţi; - organizarea spaţială configuraţională a macromoleculei respective. Structura proteinelor- structura primară- structura secundară- structura terţiară- structura cuaternară

structura primară

structura secundară

structura terţiară

structura cuaternară

Structura primară- reprezintă organizarea catenei macromoleculare, respectiv numărul şi secvenţa aminoacizilor legaţi prin legături peptidice.

În proteinele naturale legătura peptidică se stabileşte între gruparea carboxilică de la un aminoacid şi gruparea aminică de la alt aminoacid, încat lanţul peptidic va fi format dintr-o succesiune de unităţi -CO-NH-CH-, legate cap-cap.

-legatura amidica are caracter partial de dubla legatura si nu permite rotatia, de aceea ea se va afla totdeauna intr-un plan.

C

O

NCH

CH

HR'

R''

C

O

NCH

CH

HR'

R''

C

O-

NCH

CH

HR'

R''

-carbonul -CH- se poate roti, putînd să apară în planuri diferite. -datorită lungimii relativ mici a catenelor laterale, ele se pot aranja de o parte şi de alta a lanţului proteic, astfel că lanţul proteic nu este ramificat.

-prima structura elucidata a fost a insulinei in 1953 (51 de aminoacizi), urmata de cea a ribonucleazei (124 aminoacizi) -astazi se cunosc structurile primare a zeci de mii de proteine.

Structura secundară-se referă la forma şi la lungimea lanţurilor polipeptidice, proprietăţi induse de legăturile de hidrogen intre gruparile peptidice. Pauling a postulat existenta a doua astfel de structuri care permit formarea unui numar cat mai mare de legaturi de hidrogen intre gruparile peptidice: -structuri de tip elice α (α-helix)-structuri de tip foaie pliată (β-pliata)

A. Structura α elicoidală-Modelul spiralat, helicoidal sau α-helix, presupune răsucirea în spirală a lanţului polipeptidic (grilajului peptidic).

-Numele de α-helix a fost utilizat de Pauling care a recunoscut prima dată această structură în α-keratină –aproape 100% structura α-helix .

-Sensul de orientare a α-helixului poate fi spre dreapta sau spre stânga, însă toţi aminoacizii participanţi în ambele cazuri aparţin seriei L, iar resturile R ale aminoacizilor sunt proiectate spre exteriorul spiralei (α-helixului).

-Cele mai stabile structuri sunt cele cu sensul de orientare spre dreapta.

-Acesta este format din catene polipeptidice între care se stabilesc legături de hidrogen (între grupa C=O) a unui aminoacid si grupa –NH– a altui aminoacid situat 4 reziduuri mai incolo) în jurul unui cilindru imaginar.

În cazul L-aminoacizilor din proteinele naturale, răsucirea spre dreapta a helixului conferă structurii mai multă stabilitate decât răsucirea spre stânga.

Elicea are forma unei scări în spirală, în care fiecărei trepte îi corespunde un aminoacid.

Înălţimea unei trepte este de 1,5 Å şi fiecărei spire îi corespund 3,6 aminoacizi (trepte), iar distanţa dintre spire este de 5,4 Å. (3,6 × 1,5).

Catenele laterale în modelul α-helix sunt orientate în afară, putând reacţiona cu moleculele solventului sau cu alte catene polipeptidice.

Natura radicalului -R legat la Cα influenţează

formarea α-helixului, favorizând sau nu, răsucirea lanţului peptidic.

De exemplu: valina, izoleucina, şi treonina, datorită substituenţilor voluminoşi, nu favorizează răsucirea catenei polipeptidice iar prolina este un întrerupător al helixului, datorită faptului că neavând atom de H la atomul de N nu poate forma legături de hidrogen.

1.5 Å

5.4 Å

Un lant polipeptidic cu structura de elice α are forma unui bastonas cu diametrul de 10.1Å.

Problema:Care este inaltimea unui segment proteinic cu cu structura de elice α ce contine 300 de aminoacizi?

R. Înălţimea unei trepte este de 1,5 Å şi fiecărei spire îi corespund 3,6 aminoacizi (trepte), iar distanţa dintre spire este de 5,4 Å. (3,6 × 1,5).

Pentru 300 de aminoacizi vom avea inaltimea: =numar aminoacizi x 1.5 Å= 450 Å

Structura α-helix a fost gasit in multe proteine in proportii mai mari sau mai mici:-mioglobina -70%-insulina – 38%-ovalbumina -31%

Colagenul –un grup de proteine ce se gaseste in organismul animal, in special in tesuturile de legatura, constituind cam 25-35% din totalul de proteine.-contine circa 35% glicina, 11% alanina si 21% prolina si 4-hidroxiprolina.-structura sa este repetitiva fiind formata majoritar din secvente Gly-X-Pro- si Gly-X-HO-Pro-, unde X este un alt aminoacid decat glicina si prolina.-are o structura formata din 3 α-catene rasucite intr-o elice spre stanga. -nu se formeaza legaturi de hidrogen intre grupele peptidice din acelasi lant.

O

NNH

O

NH O

NH

R

O

O

NNH

O

NH O

NH

R

O

OH

Structura în foaie pliată (β-pliata)-Plierea catenei are loc prin formarea legăturilor de hidrogen între gruparea carboxilică a unui aminoacid şi gruparea aminică a aminoacidului vecin din alta catena polipeptidica. -Lanţul polipetidic pliat se prezintă ca o panglică îndoită alternativ la dreapta şi la stînga, plierea avînd loc în dreptul atomilor de carbon metinici.-distanta axiala intre 2 aminoacizi vecini este de 3.5Å fata de 1,5Å in α-helix.

Antiparalel Paralel

18

-In modelul paralel, caracteristic β-keratinei (in piele, unghii, etc.) lanţurile peptidice sunt situate paralel, cu resturile -R orientate în acelaşi sens.

-in modelul antiparalel, caracteristic fibroinei din mătasea naturala lanţurile peptidice sunt faţă în faţă (antiparalele), cu resturile -R orientate în direcţii opuse.

19

- Structura terţiarăPrin intermediul cristalografiei cu raze X s-a dovedit faptul că macromoleculele proteice au o conformaţie tridimensională, realizată de obicei prin intermediul cuplării mai multor lanţuri polipeptidice scurte între ele, cuplare care duce la formarea fibrelor proteice; -reprezintă rezultatul interacţiilor dintre resturile –R ale aminoacizilor din catenele polipeptidice.-se pot forma următoarele tipuri de legături: • legături de hidrogen (altele decât cele peptidice) între grupele –OH ale hidroxiaminoacizilor şi restul imidazolic (de exemplu, al histidinei) sau grupa –OH fenolică a tirozinei şi un rest carboxilic (-COOH);

• legături covalente de tip disulfuric stabilite la nivelul grupelor -SH din tioaminoacizii cisteină, metionină;

-legături fosfodiesterice, stabilite la nivelul grupelor -OH esterificabile ale hidroxiaminoacizilor (de exemplu, serina) cu acid fosforic:

-legături ionice între resturile carboxilat (-COO-) de la aminoacizii dicarboxilici (acidul aspartic, acidul glutamic) şi grupările amoniu (–NH3

+) ale aminoacizilor diaminici (lisină, arginină); - legături nepolare prin forţe van der Waals (legături hidrofobe) realizate între catenele laterale ale valinei, leucinei, izoleucinei, fenilalaninei. Legăturile hidrofobe apar şi acţionează mai ales în interiorul moleculelor proteice, minimalizând interacţiile părţilor hidrofobe cu apa şi maximalizând forţele van der Waals între grupele hidrofobe.

21

Structura cuaternarăStructura cuaternară a proteinelor reprezintă cel mai înalt grad de organizare a acestora şi rezultă din interacţiunea lanţurilor polipeptidice independente, care au deja o structură primară, secundară, şi terţiară bine definită. Suprastructura cuaternară are specifică asocierea unor catene polipeptidice individuale (protomeri) într-un agregat denumit oligomer (multimer sau proteine multisubunitare).

Proteine care au structura cuaternară: hemoglobina, ADN polimeraza.

Proprietăţi fizice ale proteinelor Proteinele izolate din diferite surse sunt substanţe solide, în general amorfe, care prin purificare avansată pot fi obţinute în stare cristalină.

Solubilitatea proteinelor în apă -este foarte diferită: proteinele globulare sunt mai mult sau mai puţin solubile, pe când cele fibrilare sunt insolubile.

-Solubilitatea în apă depinde de mai mulţi factori: natura, numărul şi aşezarea în catenă a aminoacizilor care compun macromolecula, de existenţa grupelor funcţionale hidrofile (carboxil, hidroxil), de pH şi de concentraţia în săruri a soluţiei.

-Prezenţa grupelor funcţionale polare (-OH, -NH2, -COOH,-SH) favorizează dizolvarea în apă, deoarece moleculele polare ale apei sunt atrase electrostatic de grupele funcţionale polare ale proteinei, ceea ce duce la legarea moleculelor solvatului de moleculele solventului, adică la fenomenul de solvatare (hidratare în cazul apei) indispensabil dizolvării.

Natura solventului are un rol mare în procesul de solubilitate a proteinelor.

Solubilitatea proteinelor este influenţată şi de pH-ul mediului. La pH izoelectric, moleculele proteinelor devin perfect neutre, nu mai leagă moleculele polare ale apei în jurul lor, în consecinţă, nu mai are loc fenomenul de hidratare şi dizolvare.

-La pHi (corespunzator punctului izoelectric), solubilitatea proteinei devine minimă şi din această cauză proteina precipită uşor, particulele proteice găsindu-se sub formă de amfioni. Prezenţa ionilor de semn contrar influenţează solubilitatea proteinelor, deoarece macromoleculele posedă la suprafaţă grupări ionizate şi reţin selectiv diferite substraturi cu molecule mici.

-Solvenţii organici produc o scădere a constantei dielectrice a mediului apos şi în consecinţă, fenomenul de hidratare se reduce odată cu solubilitatea. O cantitate prea mare de solvent organic poate produce pierderea sarcinilor electrice şi o deshidratare a proteinei care poate duce la denaturarea ei (modificarea structurii şi proprietăţilor iniţiale). Starea coloidală a proteinelor în soluţie -le conferă proprietăţile caracteristice sistemelor coloidale: presiune osmotică mică, putere de difuziune redusă, ultrafiltrare, efectul Tyndall (fenomen de dispersie a luminii incidente de către niște particule macroscopice având dimensiuni comparabile cu lungimea de undă a luminii), etc.

Din cauza dimensiunilor mari ale macromoleculelor, proteinele nu difuzează prin membrane ale căror pori sunt de ordinul milimicronilor (membrane de celofan, pergament, colodiu etc.), proprietate pe care se bazează separarea lor de sărurile prezente în soluţie şi ai căror ioni trec prin membranele de dializă.

Formare de geluri-Soluţiile proteice pot forma geluri în care proteina şi solventul formează o masă omogenă, cu particularităţi specifice substanţelor solide.

Fenomenul este important pentru realizarea reţelei tridimensionale a scheletului protoplasmei, care este insolubilă în apă, pe care o reţine datorită procesului de imbibiţie. Imbibiţia gelului, însoţită de creşterea considerabilă a volumului este utilizată în industria alimentară (gelifierea alimentelor prin adăugare de gelatină, imbibiţia proteinelor din făină la prepararea aluatului etc.).

Precipitarea proteinelor-poate fi: reversibilă si inreversibila;-Precipitarea reversibila: -are loc în prezenţa soluţiilor concentrate de electroliţi tari (săruri ale metalelor alcaline, alcalino-pământoase, (NH4)2SO4

sau a solvenţilor miscibili cu apa (alcool, acetonă).

-se explică prin fenomenul de salifiere, care constă în deshidratarea parţială a proteinelor, datorită competiţiei pentru moleculele de apă dintre ionii electroliţilor folosiţi la precipitare şi grupele polare sau ionice ale proteinelor.

-Macromoleculele proteice deshidratate parţial, se aglomerează şi precipită. La adăugarea unui exces de apă, precipitatul se dizolvă, ceea ce dovedeşte că la precipitarea reversibilă, proteinele suferă unele modificări fizico-chimice, dar nu se produce denaturarea structurilor moleculare.

Precipitarea ireversibilă -se produce în prezenţa sărurilor metalelor grele (Cu, Pb, Hg, Fe, Ni etc.), a acizilor tari (HCl, HNO3, H2SO4), a bazelor alcaline (NaOH, KOH), a acidului picric, sau cu unii acizi anorganici complecşi (acid fosfomolibdenic, acid fosfowolframic etc.).

-mai poate avea loc la încălzire puternică (coagulare), sub acţiunea razelor X, UV, etc.

-la încetarea acţiunii agenţilor precipitanţi, proteinele nu revin la forma iniţială, deoarece structura spaţială a proteinelor (secundară, terţiară) suferă o depliere, o dezorganizare, care însă nu afectează şi structura primară. Caracterul amfoter al proteinelor-se datorează prezenţei în molecula lor a grupărilor acide (-COOH) sau bazice (-NH2) libere ale resturilor aminoacizilor dicarboxilici sau diaminici din constituţia proteinelor.

-Caracterul amfoter al proteinelor este influenţat şi de resturile unor aminoacizi cu grupări ionizabile (-OH din tirozină, resturile bazice ale histidinei, argininei). Datorită sarcinilor electrice, proteinele migrează în câmp electric spre anod în soluţie bazică şi spre catod în soluţie acidă. Fenomenul stă la baza separării şi purificării proteinelor prin metoda numită electroforeză.

-Activitate opticaProteinele prezintă activitate optică, datorită atât aminoacizilor constituenţi care conţin atomi de carbon asimetrici, cât şi asimetriei întregului agregat macromolecular. Orice modificare a structurii proteinei este însoţită de schimbarea rotaţiei specifice, care indică denaturarea proteinei.

Proprietăţi chimice ale proteinelor -Proteinele prezintă (asemănător aminoacizilor) reacţii chimice corespunzătoare grupelor funcţionale: -NH2

şi -COOH libere, precum şi reacţii ale radicalilor -R pe care îi conţin.

-Sunt caracteristice de asemenea o serie de reacţii de culoare, care servesc la identificarea lor (reacţia biuretului, reacţia xantoproteică, reacţiile: Millon, Liebermann, Sakaguchi etc.). Reacţia biuretului-culoare violet

Reacţia cu ninhidrina

NH2CH

COOH

R

O

O

OH

OH

+

O

O

N

O

O

+ RCHO + CO2 + H2O

-HidrolizaSub influenţa acizilor, bazelor sau a enzimelor proteolitice catena polipeptidică se scindează cu formarea unor fragmente polipeptidice, care în final hidrolizează, punând în libertate toţi aminoacizii constituenţi.

Reactia Millon. HgNO3 in acid azotic cu urme de acid azotos reactioneaza cu tirozina conducand la precipita rosu.

Reactia xantoproteica. Acidul azotic concentrat reactioneaza cu inelul benzenic conducand la nitroderivati de culoare galbena.

Reactia Hopkins-Cole. Acidul glioxilic (OHC-COOH) in H2SO4 reactioneaza cu triptofanul conducand la un precipitat violet.

Reactia Folin-Ciocalteu. Acidul fosfomolibdowolframic reactioneaza cu tirozina rezultand un produs albastru.

Reactia Sakaguchi : α-naftolul si hipocloritul de sodiu reactioneaza cu arginina conducand la un produs rosu.

Reactia Sullivan : sarea de sodiu a acidului 1,2 naftochinon-4-sulfonic si hidrosulfitul de sodiu reactioneaza cu cisteina rezultand un produs rosu.

Denaturarea. -Sub acţiunea unor agenţi fizici şi chimici proteinele sunt modificate structural, cu păstrarea masei moleculare, si pierderea activităţii fiziologice. Denaturarea poate fi reversibilă sau ireversibilă.

-Agenţii denaturanţi pot fi clasificaţi astfel: • agenţi fizici: temperaturile ridicate, radiaţii UV, razele X, ultrasunetele , etc.; • agenţi chimici: soluţii concentrate de acizi şi baze tari, sărurile unor metale grele (Hg, Pb, Cd etc.), compuşi ai arsenului, solvenţi organici etc.

-Denaturarea proteinelor reprezintă un proces complex, care implică modificări ale structurii secundare şi terţiare a proteinelor (desfacerea sau modificarea legăturilor de hidrogen, a legăturilor disulfurice, ionice etc.), însoţite de deplierea catenelor şi modificarea arhitecturii moleculare.

-Denaturarea determină scăderea solubilităţii şi a capacităţii proteinelor de a absorbi apa, modifică viscozitatea, presiunea osmotică, activitatea optică şi gradul de hidroliză, ca şi activitatea fiziologică. Denaturarea ireversibilă a proteinelor joacă un rol important în fenomenele vitale, de exemplu, îmbătrânirea seminţelor şi pierderea capacităţii de germinare, fenomenul de îmbătrânire la oameni, animale etc.

În industria alimentară denaturarea proteinelor este utilizată la prepararea produselor alimentare prin coacere, uscarea legumelor, fabricarea laptelui praf etc.

Proprietăţi biochimice ale proteinelor Organismele vii prezintă proprietatea specifică de a putea sintetiza proteine proprii din aminoacizii preluaţi prin alimentaţie sau rezultaţi la hidroliza enzimatică a proteinelor alimentare.

-Proteinele au proprietatea de a fi organ-specifice, deoarece fiecare organ al aceleiaşi plante sau al aceluiaşi animal conţine proteine specifice, diferite de proteinele altor organe ale aceluiaşi individ.

-Proteinele sunt totodată şi specie-specifice, deoarece acelaşi organ de la diferite specii, animale sau vegetale, conţine proteine specifice, diferite de ale aceluiaşi organ al unui individ din altă specie.

Specificitatea proteinelor se manifestă şi prin proprietăţile lor imunologice: inocularea unei proteine străine în organismul unui animal provoacă apariţia în serul acestuia a unei substanţe capabile să precipite numai proteina care a fost inoculată. Substanţele inoculate se numesc antigeni şi pot fi: proteine, poliglucide, asociaţii complexe glucide-lipide-poliprotide, care sunt străine pentru organismul în care au pătruns şi declanşează în consecinţă biosinteza unor proteine specifice de apărare, denumite anticorpi. Antigenul reacţionează cu anticorpii formaţi, determinând reacţia antigen-anticorp, prin care este anihilată acţiunea nocivă a antigenului.

Formarea anticorpilor coincide cu instalarea în organism a unei rezistenţe specifice (imunitate) faţă de agentul patogen. Reacţiile imunologice stau la baza preparării şi utilizării serurilor şi vaccinurilor în vederea imunizării organismelor contra infecţiilor microbiene.

Analiza proteinelor incearca sa studieze modul cum secventele de aminoacizi conduc la o anume structura a proteinei, cum se leaga aceste proteine de substrat sau alte molecule pentru indeplinirea functiilor lor.

Analiza proteinelor permite intelegerea rolului functional al acestora pe baza structurii.

Analiza proteinelor

Etape in analiza proteinelor Extractia proteinelor. Purificarea proteinelor. Caracterizarea structurala a proteinelor.

1. Extractia proteinelorImplică extragerea eficientă a proteinelor şi peptidelor într-o formă biologic activa din ţesut sau celulele microbiene.În timpul acestui proces, inactivarea enzimelor proteolitice (cele care scindeaza proteinele) este necesară, ca să nu provoace degradarea proteinelor conţinute în ţesut.Extractia proteinelor: se omogenizeaza tesutul in solutie tampon fiziologica (0.05M Na2HPO4, pH 7.4) in prezenta de inhibitori proteolitici (EDTA, Pepstatina).

Extractia peptidelor: se fierbe tesutul cu solutie de acid acetic 1m timp de 5 min apoi se omogenizeaza tesutul in solutie etanol:sol. HCl 0.1M la 0°C. Acest lucru va duce la deschiderea veziculelor si trecerea peptidelor in solutie.PepstatinaIsovaleril-Val-Val-AAHMH-Ala-AAHMH unde AAHMH= acid (3S, 4S)-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanoic

2. Purificarea proteinelor

Proteinele pot fi purificate avand in vedere proprietatile lor fizico-chimice. Aceste proprietati au condus la dezvoltarea unor tehnici specifice.

Proprietatea proteinelor Tehnica de purificare

Solubilitate Precipitare fractionata

Marimea moleculei Cromatografia de excluziune moleculară (de gel permeabil sau de filtrare cu gel).

Sarcina electrica a moleculei Cromatografia de schimb ionic

Hidrofobicitate HPLC (cromatografie de lichide de inalta performanta) in faza inversa

Activitate biologica Cromatografie de afinitate

Precipitare diferentiata

-se realizeaza prin adaos de saruri anorganice sau de solventi organici.

Cel mai des se utilizeaza sulfatul de amoniu.

-precipitatul obtinut se separa prin centrifugare;

-cresterea concentratiei de sare conduce la cresterea cantitatii de precipitat.

Cromatografia de excluziune moleculară (de gel permeabil sau de filtrare cu gel).-se realizeaza pe o coloana umpluta cu gel poros.Această tehnică separă moleculele după mărimea moleculelor. Moleculele mici intra in gel in timp ce moleculele de dimensiuni mari raman in spatiile dintre particulele de gel si elueaza primele.Avantaje: permite separarea unor cantitati mari de proteine;Dezavantaje: -are o rezolutie de separare scazuta.

Cromatografia de schimb ionicSepara moleculele de proteine pe baza sarcinii electrice.-umplutura coloanei este incarcata electric la randul sau fie cu sarcini pozitive (dietilamino etilceluloza), fie negative (carboximetilceluloza).

-umplutura utilizata difera in functie de incarcarea electrica a proteinei ce se doreste a fi separata.

De exemplu, daca proteina de interes este incarcata negativ se utilizeaza o umpluta incarcata pozitiv (dietilamino etilceluloza ).

Proteina se va lega de centrii cationici ai umpluturii.Ea este apoi pusa in libertate prin utilizarea unei solutii saline (de obicei de NaCl), cand anionii de Cl- se leaga de centrii cationici iar proteina este eliberata.

-modificarea incarcarii electrice a proteinei se poate realiza si prin utilizarea unor solutii cu pH diferit.

HPLC (cromatografie de lichide de inalta performanta) in faza inversa

Aceasta tehnica purifica proteinele pe baza hidrofobicitatii lor.Faza inversa este o forma de cromatografie in care faza stationara este hidrofoba iar faza mobila este mult mai hidrofila decat faza stationara.

Solutia de proteine este introdusa intr-o coloana ce contine silice substituita cu lanturi lungi de hidrocarbura (octacetil, butil, propil, fenildimetil).Grupele hidrofobe ale proteinelor se vor lega de umplutura.

Proteinele hidrofile vor elua primele.

Solventii utilizati: Apa+ 0.1%Acid trifluoracetic, acetonitril.

Cromatografia de afinitate-este cea mai performanta metoda de purificare a proteinelor-are avantajul unei afinitati ridicate a multor proteine pentru o molecula sau grupare chimica specifica.Exemplu:

Concavalina A este o proteina care se leaga de obicei de un rest de glucoza. Ea poate fi purificata prin trecerea pe o coloana ce are ca umplutura un polimer sintetic substituit cu resturi de glucoza. Concavalina A se leaga de umplutura in timp ce alte proteine nu.Prin eluarea cu o solutie de glucoza se poate separa concavalina A in stare pura.

Caracterizarea proteinelor si peptidelor

-implica trei procese: Determinarea compozitiei aminoacizilor (structura si numarul lor) Determinarea secventei de aminoacizi (ordinea lor in lantul

macromolecular) Determinarea masei moleculare a proteinei.

Determinarea compozitiei aminoacizilorPeptidele sunt mai intai hidrolizate in aminoacizii constituenti prin incalzire cu solutie de HCl 6M la 1100C timp de 24 ore, de obicei in atmosfera de argon.Aminoacizii sunt separati prin HPLC.

Analiza cantitativa se poate realiza prin masuratori spectrofotometrice prin reactia cu ninhidrina (aminoacizii dau culoare violet, iminoacizii-prolina, hidroxiprolina –dau culoare galbena).

Analiza structurala a proteinelor

Determinarea secventei de aminoacizi

-aminoacidul N-terminal se poate identifica prin tratare cu 2,4-dinitrofluorbenzen urmata de hidroliza

totala a proteinei si identificarea aminoacizilor constituenti prin HPLC.

O

NH2

R

NH

OR1

NH

OR2

NH

OR3

OH +

F

NO2

NO2

O

NH

R

NH

OR1

NH

OR2

NH

OR3

OH

NO2

O2N

O

NH

R

NO2

O2N OHNH2

OR2

OH

NH2

OR1

OHNH2

OR3

OH+ + +

Determinarea secventei de aminoacizi

- se realizeaza prin metoda Edman (elaborata de Pehr Edman).

-Metoda indeparteaza cate un rest de aminoacid o singura data de la capatul peptidei

ce contine restul aminic.

-Fenil izotiocianatul reactioneaza cu grupa amino terminala cu formarea unui derivat

fenil tiocarbamoil;

-In conditii acide acest derivat ciclizeaza la o fenil-tiohidantoina (PTH) si o peptida

mai scurta cu un rest de amino acid.

Fenil-tiohidantoina poate fi identificata prin HPLC.

Degradarea poate continua, fiecare aminoacid fiind identificat pe rand.

Se pot identifica lanturi de pana la 50 de aminoacizi, folosind un secventiator automat.

H2N LYS SER TYR LEU ALA COOH

N C S

HN LYS SER TYR LEU ALA COOHNH C

S

H+

NH

N

CHO

CH2

S

CH2 CH2 CH2 NH2

+ H2N SER TYR LEU ALA COOH

N C S

SER TYR LEU ALA COOHHNNH C

S

NH

N

CHO

CH2

S

OH

H+

+ TYR LEU ALA COOHH2N

PTH-Lizina

PTH-Serina

Lanturile lungi de polipeptide sunt rupte in lanturi mai scurte pentru analiza prin utilizarea unor enzime specifice care rup lantul in anumite puncte.

Enzima Punct de rupere a lantului

Tripsina Lys, Arg (C)

Chimotripsina Phe,Trp, Tyr (C)

Pepsina Phe, Trp, Tyr (N)

CNBr Met (C)

Polipeptida hidro liza to ta laanaliza aminoacizi

38 aminoacizi

+

F

NO2

NO2 Aminoacid N -terminal G lu

hidro liza cu tripsinaseparare fragmentesecventiere Edman

G lu G ly Ala Ala Tyr His Asp Phe G lu Pro Ile Asp Pro Arg

G ly Ala Ser M et Ala Leu Ile Lys

Tyr Leu Ile Ala Cys G ly Pro M et Thr Lys

Asp Cys Val His Ser Asp

G lu G ly Ala Ala Tyr His Asp Phe G lu Pro Ile Asp Pro Arg G ly Ala Ser M et

Ala Leu Ile Lys Tyr Leu Ile Ala Cys G ly Pro M et

Thr Lys Asp Cys Val His Ser Asp

Hidro liza cu CNBrseparare fragmentesecventiere Edman

T1T2

T3

T4

C1

C2

C3

Concluzii:-aminoacidul N-terminal este acidul glutamic-dupa hidroliza cu tripsina:

-fragmentul T1 include N-aminoacidul terminal;-fragmentul T4 include acidul C-terminal (acid aspartic Asp) pentru ca nu

are un rest de arginina sau lisina

-fragmentul C3 confirma ca acidul C-terminal este acidul aspartic

Structura peptidei este:

G lu G ly Ala Ala Tyr His Asp Phe G lu Pro Ile Asp Pro Arg G ly Ala Ser Met Ala Leu Ile Lys Tyr Leu Ile Ala Cys G ly Pro Met Thr Lys Asp Cys Val His Ser Asp

Tripsina Tripsina TripsinaCNBr CNBr

Tema de casa1. Scrieti tripeptidele posibile ce se pot forma din glicina, cisteina si α-alanina, in care fiecare aminoacid apare o singura data.

2. Un grup de peptide care influenteaza transmisiile nervoase in unele parti ale creierului a fost izolat din tesutul cerebral. Aceste peptide sunt cunoscute ca opioide pentru ca se leaga de receptorii specifici care leaga de asemenea si droguri opioide precum morfina si naloxona. Folosind informatiile de mai jos determinati structura primara a neurotransmitatorului leucin-encefalina.

(a) Hidroliza completa cu HCl 6M la 1100C urmata de analiza aminoacizilor rezultati indica prezenta Gly, Leu, Phe si Tyr, in raport molar 2:1:1:1.(b) Tratarea cu 2,4-dinitrofluorbenzen urmata de hidroliza completa si cromatografie indica prezenta derivatului 2-4-dinitrofenil al tirozinei. Analiza cromatografica indica absenta tirozinei libere in amestecul de aminoacizi.(c) Tratarea peptidei cu pepsina urmata de cromatografie indica prezenta unei dipeptide ce contine Phe si Leu si a unei tripeptide ce contine Tyr si Gly in raport molar 1:2.

3. Studiind enzimele ce se gasesc in celulele unei plante reusiti sa separati un extract care contine enzimele A, B si C. Enzimele A si B au masa moleculara de 60.000 Da iar enzima C de 100.000 Da. Enzima A are punctul izoelectric la 6.5 in timp ce enzimele B si C au punctul izolelectric la 7.5. Propuneti o schema de separare utilizand doua tehnici din cele prezentate pentru a separa cei 3 compusi.

4. Solutia unei proteine se imparte in doua parti. Prima parte se trateaza cu pepsina cand rezulta in urma analizei urmatoarele fragmente:

Asn─Thr ─ Trp ─ Met ─ Ile ─ Lys Gly ─ Tyr ─ Met ─ Gln ─ PheVal ─ Leu ─ Gly ─ Met ─ Ser ─ Arg

Cea de a doua parte se trateaza cu BrCN cand rezulta urmatoarele fragmente:Gln ─ PheVal ─ Leu ─ Gly ─ MetIle ─ Lys ─ Gly ─ Tyr ─ MetSer ─ Arg ─ Asn ─ Thr ─ Trp ─ Met

Pe baza acestor teste determinati structura primara finala a proteinei analizate.