Proteinele se caracterizează printr-o mare diversitate structurală determinată de:-numărul aminoacizilor constituenţi; -- tipurile aminoacizilor constituenţi; - secvenţa aminoacizilor componenţi; - organizarea spaţială configuraţională a macromoleculei respective. Structura proteinelor- structura primară- structura secundară- structura terţiară- structura cuaternară

structura primară

structura secundară

structura terţiară

structura cuaternară

Structura primară- reprezintă organizarea catenei macromoleculare, respectiv numărul şi secvenţa aminoacizilor legaţi prin legături peptidice.

În proteinele naturale legătura peptidică se stabileşte între gruparea carboxilică de la un aminoacid şi gruparea aminică de la alt aminoacid, încît lanţul peptidic va fi format dintr-o succesiune de unităţi -CO-NH-CH-, legate cap-cap.

-legatura amidica are caracter partial de dubla legatura si nu permite rotatia, de aceea ea se va afla totdeauna intr-un plan.

C

O

NCH

CH

HR'

R''

C

O

NCH

CH

HR'

R''

C

O-

NCH

CH

HR'

R''

-carbonul -CH- se poate roti, putînd să apară în planuri diferite. -datorită lungimii relativ mici a catenelor laterale, ele se pot aranja de o parte şi de alta a lanţului proteic, astfel că lanţul proteic nu este ramificat.

Structura secundară

-se referă la forma şi la lungimea lanţurilor polipeptidice, proprietăţi induse de legăturile de hidrogen.

Cele mai întîlnite tipuri de structura secundară: Structura în foaie pliantă (β-pliat)

-Plierea catenei are loc prin formarea legăturilor de hidrogen între gruparea carboxilică a unui aminoacid şi gruparea aminică a aminoacidului vecin.

-Lanţul polipetidic pliat se prezintă ca o panglică îndoită alternativ la dreapta şi la stînga, plierea avînd loc în dreptul atomilor de carbon metinici.

Antiparalel Paralel

5

-In modelul paralel, caracteristic β-keratinei (in piele, unghii, etc.) lanţurile peptidice sunt situate paralel, cu resturile -R orientate în acelaşi sens.

-in modelul antiparalel, caracteristic fibroinei din mătasea naturala lanţurile peptidice sunt faţă în faţă (antiparalele), cu resturile -R orientate în direcţii opuse.

2. Structura α elicoidală-Modelul spiralat, helicoidal sau α-helix, presupune răsucirea în spirală a lanţului polipeptidic (grilajului peptidic).

-Acesta este format din catene polipeptidice între care se stabilesc legături de hidrogen (între grupa C=O) a unei legături peptidice dintr-o catenă şi grupa –NH– a legăturii peptidice din catena vecină) în jurul unui cilindru imaginar.

-Numele de α-helix a fost utilizat de Pauling care a recunoscut prima dată această structură în α-keratină.

-Sensul de orientare a α-helixului poate fi spre dreapta sau spre stânga, însă toţi aminoacizii participanţi în ambele cazuri aparţin seriei L, iar resturile R ale aminoacizilor sunt proiectate spre exteriorul spiralei (α-helixului).

În cazul L-aminoacizilor din proteinele naturale, răsucirea spre dreapta a helixului conferă structurii mai multă stabilitate decât răsucirea spre stânga.

Elicea are forma unei scări în spirală, în care fiecărei trepte îi corespunde un aminoacid.

Înălţimea unei trepte este de 1,5 Å şi fiecărei spire îi corespund 3,6 aminoacizi (trepte), iar distanţa dintre spire este de 5,4 Å. (3,6 × 1,5).

Catenele laterale în modelul α-helix sunt orientate în afară, putând reacţiona cu moleculele solventului sau cu alte catene polipeptidice.

Natura radicalului -R legat la Cα influenţează formarea α-helixului, favorizând sau nu, răsucirea lanţului peptidic.

De exemplu: valina, izoleucina, şi treonina, datorită substituenţilor voluminoşi, nu favorizează răsucirea catenei polipeptidice iar prolina este un întrerupător al helixului, datorită faptului că neavând atom de H la atomul de N nu poate forma legături de hidrogen.

1.5 Å

5.4 Å

Colagenul –un grup de proteine ce se gaseste in organismul animal, in special in tesuturile de legatura, constituind cam 25-35% din totalul de proteine.-contine circa 35% glicina, 11% alanina si 21% prolina si 4-hidroxiprolina.-structura sa este repetitiva fiind formata majoritar din secvente Gly-Pro-HO-Pro.-are o structura formata din 3 α-catene rasucite intr-o elice spre stanga.

9

- Structura terţiară

Prin intermediul cristalografiei cu raze X s-a dovedit faptul că macromoleculele proteice au o conformaţie tridimensională, realizată de obicei prin intermediul cuplării mai multor lanţuri polipeptidice scurte între ele, cuplare care duce la formarea fibrelor proteice;

-reprezintă rezultatul interacţiilor dintre resturile –R ale aminoacizilor din catenele polipeptidice.-se pot forma următoarele tipuri de legături: • legături de hidrogen (altele decât cele peptidice) între grupele –OH ale hidroxiaminoacizilor şi restul imidazolic (de exemplu, al histidinei) sau grupa –OH fenolică a tirozinei şi un rest carboxilic (-COOH);

• legături covalente de tip disulfuric stabilite la nivelul grupelor -SH din tioaminoacizii cisteină, metionină;

-legături fosfodiesterice, stabilite la nivelul grupelor -OH esterificabile ale hidroxiaminoacizilor (de exemplu, serina) cu acid fosforic:

-legături ionice între resturile carboxilat (-COO-) de la aminoacizii dicarboxilici (acidul aspartic, acidul glutamic) şi grupările amoniu (–NH3

+) ale aminoacizilor diaminici (lisină, arginină); - legături nepolare prin forţe van der Waals (legături hidrofobe) realizate între catenele laterale ale valinei, leucinei, izoleucinei, fenilalaninei. Legăturile hidrofobe apar şi acţionează mai ales în interiorul moleculelor proteice, minimalizând interacţiile părţilor hidrofobe cu apa şi maximalizând forţele van der Waals între grupele hidrofobe.

11

- - structura cuaternarăstructura cuaternarăStructura cuaternară a proteinelor reprezintă cel mai înalt grad de organizare a acestora şi rezultă din interacţiunea lanţurilor polipeptidice independente, care au deja o structură primară, secundară, şi terţiară bine definită. Suprastructura cuaternară are specifică asocierea unor catene polipeptidice individuale (protomeri) într-un agregat denumit oligomer (multimer sau proteine multisubunitare).

Proteine care au structura cuaternară: hemoglobina, ADN polimeraza.

Proprietăţi fizice ale proteinelor Proteinele izolate din diferite surse sunt substanţe solide, în general amorfe, care prin purificare avansată pot fi obţinute în stare cristalină.

Solubilitatea proteinelor în apă -este foarte diferită: proteinele globulare sunt mai mult sau mai puţin solubile, pe când cele fibrilare sunt insolubile.

-Solubilitatea în apă depinde de mai mulţi factori: natura, numărul şi aşezarea în catenă a aminoacizilor care compun macromolecula, de existenţa grupelor funcţionale hidrofile (carboxil, hidroxil), de pH şi de concentraţia în săruri a soluţiei.

-Prezenţa grupelor funcţionale polare (-OH, -NH2, -COOH,-SH) favorizează dizolvarea în apă, deoarece moleculele polare ale apei sunt atrase electrostatic de grupele funcţionale polare ale proteinei, ceea ce duce la legarea moleculelor solvatului de moleculele solventului, adică la fenomenul de solvatare (hidratare în cazul apei) indispensabil dizolvării.

Natura solventului are un rol mare în procesul de solubilitate a proteinelor.

Solubilitatea proteinelor este influenţată şi de pH-ul mediului. La pH izoelectric, moleculele proteinelor devin perfect neutre, nu mai leagă moleculele polare ale apei în jurul lor, în consecinţă, nu mai are loc fenomenul de hidratare şi dizolvare.

-La pHi (corespunzator punctului izoelectric), solubilitatea proteinei devine minimă şi din această cauză proteina precipită uşor, particulele proteice găsindu-se sub formă de amfioni. Prezenţa ionilor de semn contrar influenţează solubilitatea proteinelor, deoarece macromoleculele posedă la suprafaţă grupări ionizate şi reţin selectiv diferite substraturi cu molecule mici.

-Solvenţii organici produc o scădere a constantei dielectrice a mediului apos şi în consecinţă, fenomenul de hidratare se reduce odată cu solubilitatea. O cantitate prea mare de solvent organic poate produce pierderea sarcinilor electrice şi o deshidratare a proteinei care poate duce la denaturarea ei (modificarea structurii şi proprietăţilor iniţiale).

Starea coloidală a proteinelor în soluţie -le conferă proprietăţile caracteristice sistemelor coloidale: presiune osmotică mică, putere de difuziune redusă, ultrafiltrare, efectul Tyndall (fenomen de dispersie a luminii incidente de către niște particule macroscopice având dimensiuni comparabile cu lungimea de undă a luminii), etc.

Din cauza dimensiunilor mari ale macromoleculelor, proteinele nu difuzează prin membrane ale căror pori sunt de ordinul milimicronilor (membrane de celofan, pergament, colodiu etc.), proprietate pe care se bazează separarea lor de sărurile prezente în soluţie şi ai căror ioni trec prin membranele de dializă.

Formare de geluri-Soluţiile proteice pot forma geluri în care proteina şi solventul formează o masă omogenă, cu particularităţi specifice substanţelor solide.

Fenomenul este important pentru realizarea reţelei tridimensionale a scheletului protoplasmei, care este insolubilă în apă, pe care o reţine datorită procesului de imbibiţie.

Imbibiţia gelului, însoţită de creşterea considerabilă a volumului este utilizată în industria alimentară (gelifierea alimentelor prin adăugare de gelatină, imbibiţia proteinelor din făină la prepararea aluatului etc.).

Precipitarea proteinelor-poate fi: reversibilă si ireversibila;-Precipitarea reversibila: -are loc în prezenţa soluţiilor concentrate de electroliţi tari (săruri ale metalelor alcaline, alcalino-pământoase, (NH4)2SO4

sau a solvenţilor miscibili cu apa (alcool, acetonă).

-se explică prin fenomenul de salifiere, care constă în deshidratarea parţială a proteinelor, datorită competiţiei pentru moleculele de apă dintre ionii electroliţilor folosiţi la precipitare şi grupele polare sau ionice ale proteinelor.

-Macromoleculele proteice deshidratate parţial, se aglomerează şi precipită. La adăugarea unui exces de apă, precipitatul se dizolvă, ceea ce dovedeşte că la precipitarea reversibilă, proteinele suferă unele modificări fizico-chimice, dar nu se produce denaturarea structurilor moleculare.

Precipitarea ireversibilă -se produce în prezenţa sărurilor metalelor grele (Cu, Pb, Hg, Fe, Ni etc.), a acizilor tari (HCl, HNO3, H2SO4), a bazelor alcaline (NaOH, KOH), a acidului picric, sau cu unii acizi anorganici complecşi (acid fosfomolibdenic, acid fosfowolframic etc.).

-mai poate avea loc la încălzire puternică (coagulare), sub acţiunea razelor X, UV, etc.

-la încetarea acţiunii agenţilor precipitanţi, proteinele nu revin la forma iniţială, deoarece structura spaţială a proteinelor (secundară, terţiară) suferă o depliere, o dezorganizare, care însă nu afectează şi structura primară.

Caracterul amfoter al proteinelor-se datorează prezenţei în molecula lor a grupărilor acide (-COOH) sau bazice (-NH2) libere ale resturilor aminoacizilor dicarboxilici sau diaminici din constituţia proteinelor.

-Caracterul amfoter al proteinelor este influenţat şi de resturile unor aminoacizi cu grupări ionizabile (-OH din tiroxină, resturile bazice ale histidinei, argininei). Datorită sarcinilor electrice, proteinele migrează în câmp electric spre anod în soluţie bazică şi spre catod în soluţie acidă. Fenomenul stă la baza separării şi purificării proteinelor prin metoda numită electroforeză.

-Activitate opticaProteinele prezintă activitate optică, datorită atât aminoacizilor constituenţi care conţin atomi de carbon asimetrici, cât şi asimetriei întregului agregat macromolecular. Orice modificare a structurii proteinei este însoţită de schimbarea rotaţiei specifice, care indică denaturarea proteinei.

Proprietăţi chimice ale proteinelor -Proteinele prezintă (asemănător aminoacizilor) reacţii chimice corespunzătoare grupelor funcţionale: -NH2

şi -COOH libere, precum şi reacţii ale radicalilor -R pe care îi conţin.

-Sunt caracteristice de asemenea o serie de reacţii de culoare, care servesc la identificarea lor (reacţia biuretului, reacţia xantoproteică, reacţiile: Millon, Liebermann, Sakaguchi etc.). Reacţia biuretului-culoare violet

Reacţia cu ninhidrina

Reactia Millon. HgNO3 in acid azotic cu urme de acid azotos reactioneaza cu tirozina

conducand la precipitat rosu.

Reactia xantoproteica. Acidul azotic concentrat reactioneaza cu inelul benzenic conducand la nitroderivati de culoare galbena.

Reactia Hopkins-Cole. Acidul glioxilic (OHC-COOH) in H2SO4 reactioneaza cu

triptofanul conducand la un precipitat violet.

Reactia Folin-Ciocalteu. Acidul fosfomolibdowolframic reactioneaza cu tirozina rezultand un produs albastru.

Reactia Sakaguchi : α-naftolul si hipocloritul de sodiu reactioneaza cu arginina conducand la un produs rosu.

Reactia Sullivan : sarea de sodiu a acidului 1,2 naftochinon-4-sulfonic si hidrosulfitul de sodiu reactioneaza cu cisteina rezultand un produs rosu.

-HidrolizaSub influenţa acizilor, bazelor sau a enzimelor proteolitice catena polipeptidică se scindează cu formarea unor fragmente polipeptidice, care în final hidrolizează, punând în libertate toţi aminoacizii constituenţi.

Denaturarea. -Sub acţiunea unor agenţi fizici şi chimici proteinele sunt modificate structural, cu păstrarea masei moleculare, si pierderea activităţii fiziologice. Denaturarea poate fi reversibilă sau ireversibilă.

-Agenţii denaturanţi pot fi clasificaţi astfel: • agenţi fizici: temperaturile ridicate, radiaţii UV, razele X, ultrasunetele , etc.; • agenţi chimici: soluţii concentrate de acizi şi baze tari, sărurile unor metale grele (Hg, Pb, Cd etc.), compuşi ai arsenului, solvenţi organici etc.

-Denaturarea proteinelor reprezintă un proces complex, care implică modificări ale structurii secundare şi terţiare a proteinelor (desfacerea sau modificarea legăturilor de hidrogen, a legăturilor disulfurice, ionice etc.), însoţite de deplierea catenelor şi modificarea arhitecturii moleculare.

-Denaturarea determină scăderea solubilităţii şi a capacităţii proteinelor de a absorbi apa, modifică viscozitatea, presiunea osmotică, activitatea optică şi gradul de hidroliză, ca şi activitatea fiziologică. Denaturarea ireversibilă a proteinelor joacă un rol important în fenomenele vitale, de exemplu, îmbătrânirea seminţelor şi pierderea capacităţii de germinare, fenomenul de îmbătrânire la oameni, animale etc.

În industria alimentară denaturarea proteinelor este utilizată la prepararea produselor alimentare prin coacere, uscarea legumelor, fabricarea laptelui praf etc.

Proprietăţi biochimice ale proteinelor Organismele vii prezintă proprietatea specifică de a putea sintetiza proteine proprii din aminoacizii preluaţi prin alimentaţie sau rezultaţi la hidroliza enzimatică a proteinelor alimentare.

-Proteinele au proprietatea de a fi organ-specifice, deoarece fiecare organ al aceleiaşi plante sau al aceluiaşi animal conţine proteine specifice, diferite de proteinele altor organe ale aceluiaşi individ.

-Proteinele sunt totodată şi specie-specifice, deoarece acelaşi organ de la diferite specii, animale sau vegetale, conţine proteine specifice, diferite de ale aceluiaşi organ al unui individ din altă specie.

Specificitatea proteinelor se manifestă şi prin proprietăţile lor imunologice: inocularea unei proteine străine în organismul unui animal provoacă apariţia în serul acestuia a unei substanţe capabile să precipite numai proteina care a fost inoculată.

Substanţele inoculate se numesc antigeni şi pot fi: proteine, poliglucide, asociaţii complexe glucide-lipide-poliprotide, care sunt străine pentru organismul în care au pătruns şi declanşează în consecinţă biosinteza unor proteine specifice de apărare, denumite anticorpi. Antigenul reacţionează cu anticorpii formaţi, determinând reacţia antigen-anticorp, prin care este anihilată acţiunea nocivă a antigenului.

Formarea anticorpilor coincide cu instalarea în organism a unei rezistenţe specifice (imunitate) faţă de agentul patogen. Reacţiile imunologice stau la baza preparării şi utilizării serurilor şi vaccinurilor în vederea imunizării organismelor contra infecţiilor microbiene.

Analiza proteinelor incearca sa studieze modul cum secventele de aminoacizi conduc la o anume structura a proteinei, cum se leaga aceste proteine de substrat sau alte molecule pentru indeplinirea functiilor lor.

Analiza proteinelor permite intelegerea rolului functional al acestora pe baza structurii.

Analiza proteinelor

Etape in analiza proteinelorExtractia proteinelor.Purificarea proteinelor.Caracterizarea structurala a proteinelor.

1. Extractia proteinelorImplică extragerea eficientă a proteinelor şi peptidelor într-o formă biologic activa din ţesut sau celulele microbiene.În timpul acestui proces, inactivarea enzimelor proteolitice (cele care scindeaza proteinele) este necesară ca să nu provoace degradarea proteinelor conţinute în ţesut.Extractia proteinelor: se omogenizeaza tesutul in solutie tampon fiziologica (0.05M NaH2PO4, pH 7.4) in prezenta de inhibitori proteolitici (EDTA,

Pepstatina).

Extractia peptidelor: se fierbe tesutul cu solutie de acid acetic 1m timp de 5 min apoi se omogenizeaza tesutul in solutie etanol:sol. HCl 0.1M la 0°C. Acest lucru va duce la deschiderea veziculelor si trecerea peptidelor in solutie.

PepstatinaIsovaleril-Val-Val-AAHMH-Ala-AAHMH unde AAHMH= acid (3S, 4S)-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanoic

2. Purificareaa proteinelor

Proteinele pot fi purificate avand in vedere proprietatile lor fizico-chimice. Aceste proprietati au condus la dezvoltarea unor tehnici specifice.

Proprietatea proteinelor Tehnica de purificare

Solubilitate Precipitare fractionata

Marimea moleculei Cromatografia de excluziune moleculară (de gel permeabil sau de filtrare cu gel).

Sarcina electrica a moleculei Cromatografia de schimb ionic

Hidrofobicitate HPLC (cromatografie de lichide de inalta performanta) in faza inversa

Activitate biologica Cromatografie de afinitate

Precipitare diferentiata

-se realizeaza prin adaos de saruri anorganice sau de solventi organici.

Cel mai des se utilizeaza sulfatul de amoniu.

-precipitatul obtinut se separa prin centrifugare;

-cresterea concentratiei de sare conduce la cresterea cantitatii de precipitat.

Cromatografia de excluziune moleculară (de gel permeabil sau de filtrare cu gel).

-se realizeaza pe o coloana umpluta cu gel poros.

Această tehnică separă moleculele după mărimea moleculelor.

Moleculele mici intra in gel in timp ce moleculele de dimensiuni mari raman in spatiile dintre particulele de gel si elueaza primele.

Avantaje: permite separarea unor cantitati mari de proteine;

Dezavantaje: -are o rezolutie de separare scazuta.

Cromatografia de schimb ionicSepara moleculele de proteine pe baza sarcinii electrice.-umplutura coloanei este incarcata electric la randul sau fie cu sarcini pozitive (dietilaminoceluloza), fie negative (carboximetilceluloza).

-umplutura utilizata difera in functie de incarcarea electrica a proteinei ce se doreste a fi separata.

De exemplu daca proteina de interes este incarcata negativ se utilizeaza o umpluta incarcata pozitiv (dietilaminoceluloza ).

Proteina se va lega de centrii cationici ai umpluturii.Ea este apoi pusa in libertate prin utilizarea unei solutii saline (de obicei de NaCl), cand anionii de Cl- se leaga de centrii cationici iar proteina este eliberata.

-modificarea incarcarii electrice a proteinei se poate realiza si prin utilizarea unor solutii cu pH diferit.

HPLC (cromatografie de lichide de inalta performanta) in faza inversa

Aceasta tehnica purifica proteinele pe baza hidrofobicitatii lor.Faza inversa este o forma de cromatografie in care faza stationara este hidrofoba iar faza mobila este mult mai hidrofila decat faza stationara.

Solutia de proteine este introdusa intr-o coloana ce contine silice substituita cu lanturi lungi de hidrocarbura (octacetil, butil, propil, fenildimetil).

Grupele hidrofobe ale proteinelor se vor lega de umplutura.

Proteinele hidrofile vor elua primele.

Solventii utilizati: Apa+ 0.1% Acid trifluoracetic, acetonitril.

Cromatografia de afinitate-este cea mai performanta metoda de purificare a proteinelor-are avantajul unei afinitati ridicate a multor proteine pentru o molecula sau grupare chimica specifica.Exemplu:

Concavalina A este o proteina care se leaga de obicei de un rest de glucoza. Ea poatge fi purificata prin trecerea pe o coloana ce are ca umplutura un polimer sintetic substituit cu resturi de glucoza. Concavalina A se leaga de umplutura in timp ce alte proteine nu.Prin eluarea cu o solutie de glucoza se poate separa concavalina A in stare pura.