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IFTAB BIOCHIMIE STRUCTURALE Les PROTIDES Christine CHEVALIER Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 1 2005-2006

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IFTAB

BIOCHIMIE STRUCTURALE

Les PROTIDES

Christine CHEVALIER

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 12005-2006

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BIOCHIMIE STRUCTURALE PROTIDES

Compétences attendues à l’issue du cours et des travaux dirigés

Décrire les caractéristiques des acides aminés naturels

Donner leur classification en fonction de la nature de leur radical et illustrer à l'aide d'exemples.

Décrire leurs propriétés physiques et chimiques en soulignant les propriétés originales dues à la

présence simultanée des fonctions amine et acide carboxylique.

Dégager les propriétés présentant un intérêt analytique.

Définir ion mixte, pH isoélectrique

Préciser les caractéristiques géométriques de la liaison peptidique.

Exposer les propriétés physiques et chimiques des peptides intéressantes pour l'analyse.

Donner un exemple de peptides d'intérêt biologique : ( glutathion, peptides hormonaux,

antibiotiques..)

Hiérarchiser et reconnaître les différents niveaux de structure des peptides et des protéines :

structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire.

Illustrer les différents niveaux de structure par des exemples simples

Définir les protéines fibreuses et les protéines globulaires.

Indiquer les liaisons chimiques faibles participant à la stabilisation des structures

tridimensionnelles.

Décrire schématiquement deux types de structure secondaire : hélice alpha et feuillet plissé

bêta.

Montrer le rôle des liaisons peptidiques et des liaisons hydrogènes dans ces architectures.

Mettre en évidence la relation entre l'intégrité de l'activité spatiale et l'activité biologique

Indiquer les principaux agents dénaturants

Décrire les propriétés exploitables dans la préparation et l'analyse des protéines : solubilité,

absorption de la lumière, diffusion, ionisation, réactions colorées, propriétés immunologiques.

Connaître les principes, l'intérêt et les limites des méthodes d'extraction, de fractionnement, de

purification, d'identification et de dosage appliqué aux protéines.

Définir holoprotéines et hétéroprotéines.

Donner des exemples de protéines globulaires et fibreuses.

Montrer à l'aide d'exemples la diversité des hétéroprotéines.

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Introduction........................................................................................................ 5

1 Les acides aminés .................................................................................. 5

1.1 Propriétés des acides aminés ...............................................................................8 1.1.1 Propriétés physiques ............................................................................................................... 8

1.1.1.1 Solubilité.............................................................................................................................. 8 1.1.1.2 Propriétés optiques : le pouvoir rotatoire ............................................................................ 8 1.1.1.3 Absorption lumineuse dans l’ultraviolet............................................................................... 9

1.1.2 Propriétés ioniques.................................................................................................................. 9 1.1.2.1 Cas des acides aminés neutres: ......................................................................................... 9 1.1.2.2 Cas des acides aminés acides:......................................................................................... 12 1.1.2.3 Cas des acides aminés basiques:..................................................................................... 13

1.1.3 Propriétés chimiques communes à tous les acides aminés.................................................. 16 1.1.3.1 Propriétés de la fonction acide carboxylique -COOH ....................................................... 16 1.1.3.2 Propriétés de la fonction amine primaire –NH2 ................................................................. 16 1.1.3.3 Propriétés des fonctions –COOH et -NH2 conjointes........................................................ 18

1.1.4 Propriétés chimiques des chaînes latérales.......................................................................... 18

1.2 Méthodes de dosage et d’analyse des acides aminés ........................................19 1.2.1 Méthodes de dosage total ..................................................................................................... 19

1.2.1.1 Méthode de Kjeldahl ......................................................................................................... 19 1.2.1.2 Méthode de Sörensen....................................................................................................... 20 1.2.1.3 Dosage spectrophotométrique à la ninhydrine ................................................................. 20

1.2.2 Méthodes de dosage spécifiques de certains acides aminés ............................................... 20 1.2.2.1 Dosage spectrophotométrique dans l’ultraviolet ............................................................... 20 1.2.2.2 Dosage spectrophotométrique dans le visible .................................................................. 20

1.2.3 Techniques de séparation des acides aminés ...................................................................... 20 1.2.3.1 l’électrophorèse................................................................................................................. 20 1.2.3.2 La chromatographie .......................................................................................................... 20

1.2.3.2.1 Chromatographie papier des acides aminés .....................................................21 1.2.3.2.2 Chromatographie sur couche mince des acides aminés (CCM) ......................22 1.2.3.2.3 Chromatographie ionique des acides aminés ...................................................22 1.2.3.2.4 La chromatographie gazeuse (CG) ..................................................................23

1.2.3.3 L’électrochromatographie.................................................................................................. 23

2 les peptides ........................................................................................... 24

2.1 Propriétés de la liaison peptidique et des peptides..............................................24 2.1.1 Séquence d’un peptide.......................................................................................................... 25

2.2 Détermination de la séquence d’un peptide ........................................................25 2.2.1 Détermination de la composition brute d’un peptide ............................................................. 25 2.2.2 Détermination de l’acide aminé N terminal............................................................................ 26 2.2.3 Détermination de l’acide aminé C terminal............................................................................ 26 2.2.4 Coupures spécifiques internes .............................................................................................. 26

2.3 Quelques peptides d’intérêt biologique ou alimentaire ........................................27 2.3.1 Peptides hormonaux.............................................................................................................. 27 2.3.2 Glutathion .............................................................................................................................. 28 2.3.3 Peptides antibiotiques ........................................................................................................... 28 2.3.4 Peptides d’intérêt alimentaire ................................................................................................ 29

3 Les protéines ........................................................................................ 29

3.1 Structure des protéines .......................................................................................29 3.1.1 La structure primaire.............................................................................................................. 30 3.1.2 La structure secondaire ......................................................................................................... 30

3.1.2.1 L’hélice alpha .................................................................................................................... 31

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 32005-2006

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3.1.2.2 Le feuillet β ........................................................................................................................ 33 3.1.3 La structure tertiaire............................................................................................................... 33

3.1.3.1 Maintien de la structure..................................................................................................... 34 3.1.3.2 Protéines globulaires......................................................................................................... 34 3.1.3.3 Protéines fibreuses............................................................................................................ 35

3.1.4 La structure quaternaire ........................................................................................................ 35

3.2 Propriétés des protéines......................................................................................36 3.2.1 Solubilité ................................................................................................................................ 36 3.2.2 Dénaturation .......................................................................................................................... 36 3.2.3 Propriétés optiques................................................................................................................ 37 3.2.4 Propriétés ioniques................................................................................................................ 37 3.2.5 Propriétés chimiques ............................................................................................................. 37 3.2.6 Propriétés antigéniques......................................................................................................... 37

3.3 Méthodes de séparation des protéines................................................................37 3.3.1 Précipitation des protéines .................................................................................................... 37 3.3.2 Dialyse- Ultrafiltration ............................................................................................................ 37

3.4 Electrophorèse ....................................................................................................38 3.4.1 Electrophorèse en veine liquide ............................................................................................ 38 3.4.2 Electrophorèse de zone......................................................................................................... 38 3.4.3 La focalisation isoélectrique (IEF) ......................................................................................... 38 3.4.4 Electrophorèse bidimensionnelle........................................................................................... 39 3.4.5 L’isotachophorèse (ITP) ........................................................................................................ 39

3.5 Chromatographie.................................................................................................39 3.5.1 Chromatographie hydrophobe............................................................................................... 39 3.5.2 Chromatographie d’échange d’ions....................................................................................... 39 3.5.3 Chromatographie d’exclusion-diffusion ou Chromatographie de filtration sur gel................. 39 3.5.4 Chromatographie d’affinité .................................................................................................... 40

3.6 Analyse des protéines .........................................................................................40 3.6.1 Détermination du poids moléculaire ...................................................................................... 40

3.6.1.1 Méthode chimique............................................................................................................. 40 3.6.1.2 Chromatographie d’exclusion-diffusion............................................................................. 40 3.6.1.3 Electrophorèse en gel natif ............................................................................................... 41 3.6.1.4 Electrophorèse SDS-PAGE .............................................................................................. 41 3.6.1.5 Spectrométrie de masse ................................................................................................... 42

3.6.2 Détermination du pHi: Isoélectrofocalisation ......................................................................... 42

3.7 Méthodes de dosages des protéines...................................................................42 3.7.1 Méthodes non spécifiques..................................................................................................... 42 3.7.2 Méthodes spécifiques............................................................................................................ 43

3.8 Les hétéroprotéines.............................................................................................43

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Introduction Le terme protide regroupe des molécules de fonctions biologiques diverses mais possédant une structure, une organisation proche. Chimiquement les protides sont caractérisés par la présence d’azote en proportion importante(± 16 %) et d’un peu de soufre. Ils réagissent spécifiquement à la réaction du biuret et à la réaction xanthoprotéique. L’hydrolyse (coupure par l’eau) des molécules protidiques libère toujours un mélange de composés à structure caractéristique : les acides aminés. Le terme protide désigne donc l’ensemble des acides aminés naturels et de leurs combinaisons chimiques qui sont les peptides (enchaînement d’un petit nombre d’acides aminés, structure simple) et les protéines (enchaînement d’un grand nombre d’acides aminés, architecture complexe). Une molécule protidique peut s’associer avec d’autres molécules (ions métalliques, glucides, lipides ou autres) par des liaisons covalentes ou de faible énergie. Une protéine formée exclusivement d’acides aminés est une holoprotéine, si un composé, appelé groupement prosthétique, est lié à la chaîne protéique, la protéine est une hétéroprotéine.

Acides aminés Peptides Protéines (polypeptides) n ≥ 100

Oligo Peptide n ≤ 10

Holo protéines

Hétéro protéines

Acides aminés

Hydrolyse

Groupement prosthétique

Hydrolyse HydrolyseHydrolyse

Peptide n ≤ 100

Composés protidiques

1 Les acides aminés Un acide aminé ou aminoacide est un composé comportant toujours une chaîne carbonée plus ou moins longue, une fonction acide carboxylique (-COOH) et une amine qui, à une exception près, est une amine primaire (-NH2). Dans les acides aminés naturels, qui constituent les peptides et protéines, ces deux fonctions sont supportées par le même carbone, noté carbone α, d’où le terme d’acides α aminés. La formule générale est donc:

R-CH-COOH | NH2 Les 20 acides aminés naturels se distinguent entre eux par la structure de R qui est nommé radical ou chaîne latérale. R peut être un radical purement hydrocarboné ou comporter un groupement fonctionnel.

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Structure et classification des 20 acides aminés naturels: Suivant la nature du radical R et les propriétés qui en découlent plusieurs critères de classification des acides aminés (AA) peuvent être retenus:

• Structure linéaire ou cyclique de R - AA aliphatiques (R non cyclique) - AA aromatiques (R cyclique de type benzénique) - AA hétérocycliques (R cyclique avec un atome autre que le carbone dans le cycle)

• Présence ou non dans R d’un groupement pouvant prendre une charge électrique - AA neutres - AA acides (charge potentielle négative) - AA basiques (charge potentielle basique)

• Présence ou non dans R d’un groupement polaire - AA polaires - AA non polaires

• Présence ou non d’un groupement fonctionnel dans R - AA hydrocarbonés (pas de groupement fonctionnel dans R, chaîne aliphatique ou cycle

aromatique) - AA hydroxylés (présence d’un groupement alcool ou phénol dans R) - AA soufrés (présence d’un groupement thiol ou thiol-éther dans R) - AA hétérocycliques (R est un hétérocycle) - AA acides (présence d’un groupement acide carboxylique dans R) - AA amide (dérivent des précédents par amidification) - AA basiques (présence d’un groupement azoté, amine ou autre, dans R) - AA particulier : fonction amine en α est une fonction amine secondaire

Les AA sont symbolisés soit par un code à trois lettres (en général les trois 1ères du nom) commençant par une majuscule soit par un code à une seule lettre. Il est important de noter que 8 de ces acides aminés sont indispensables chez l’adulte et 9 chez l’enfant, ce sont : histidine (enfant), leucine, isoleucine, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, tryptophane, valine. Il existe une phrase mnémotechnique pour se souvenir des 8 AA indispensables chez l’adulte: Le très lyrique Tristan fait vachement méditer Iseult, ce qui donne : Leucine, Thréonine, Lysine, Tryptophane, Phénylalanine, Valine, Méthionine, et enfin Isoleucine. Liste des 20 acides aminés naturels avec leurs symboles:

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1.1 Propriétés des acides aminés

1.1.1 Propriétés physiques

1.1.1.1 Solubilité Les AA sous forme solide sont en général des poudres blanches cristallisées. Ils ont une solubilité plus ou moindre dans l'eau et dans les solvants organiques selon la nature du radical R. Si R est polaire ou ionique la solubilité dans l’eau est importante, si R est apolaire la solubilité dans l’eau est plus faible.

1.1.1.2 Propriétés optiques : le pouvoir rotatoire Tous les acides aminés sauf le glycocolle possèdent au moins un carbone asymétrique C*, qui est le carbone α. Les acides aminés existent donc sous forme de plusieurs stéréoisomères, dont deux énantiomères symétriques l’un par rapport à l’autre.

CH3

En projection de Fischer:

P P

NH2

H

CH3

C

COOH

basculer

C

H

Perspective de Cram Dans cette représentation plane : - C* n'est pas représenté, - le groupe carboxyle -COOH est obligatoiremdonc NH2 et H sont à gauche ou à droite. L’énantiomère où le NH2 est à gauche en prest à droite appartient à la série D

CH3

HH2N

COOH

C

L-Alanine

α

La plupart les acides aminés naturels sont de

Cours biochimie Protides IFTAB 2005-2006

Ex : L’alanine: CH3 – CH(NH2) – COOH

COOH

H

NH2C

CH3HOOC

H

NH2C

COOH

CH3

H

P H3

C

NH2

COOH

projeter dans (P)

NH2

Représentation de Fischer

ent projeté en haut et le résidu R- (ici –CH3) en bas,

ojection de Fischer appartient à la série L, celui où il

CH3

NH2H

COOH

C

D-Alanine

α

la série L.

Christine CHEVALIER 8

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1.1.1.3 Absorption lumineuse dans l’ultraviolet Tous les acides aminés absorbent les radiations ultraviolettes à des longueurs d’ondes inférieures à 230 nm. Les acides aminés ayant un radical aromatique (Tyr, Trp, Phe) absorbent vers 280 nm.

1.1.2 Propriétés ioniques

La présence dans la même molécule d’ au moins deux groupements fonctionnels antagonistes, l’un acide : -COOH, l’autre basique : -NH2, donne des propriétés très particulières aux acides α aminés. La forme acide du groupement acide carboxylique est –COOH, sa forme basique est –COO-

La forme acide du groupement amine est –NH3+, sa forme basique est –NH2

Rappel un groupement est d’autant plus acide donc perd plus facilement son proton que son pKa est faible. Pour les acides aminés c’est le groupement -COOH qui est le plus fort (pKa ≈ 2), le groupement -NH3

+ est un acide très faible (pKa ≈ 9)

1.1.2.1 Cas des acides aminés neutres: • En milieu très acide :

Le groupement acide –COOH est presque entièrement protoné, donc pratiquement pas ionisé, l’équilibre:

R-COOH + H2O ⇔ R-COO- + H3O+

est presque totalement déplacé vers la gauche en présence d’ions H3O+ Le groupement amine -NH2 est lui aussi presque entièrement protoné, donc pratiquement totalement ionisé, l’équilibre:

R’-NH3+ + H2O ⇔ R’-NH2 + H3O+

est presque totalement déplacé vers la gauche en présence d’ions H3O+

Donc en milieu acide, l’acide aminé existe essentiellement sous forme de cation :

• En milieu très basique :

Le groupement acide –COOH perd son proton par réaction pratiquement totale avec les ions hydroxydes HO-, il est donc pratiquement totalement ionisé, l’équilibre :

R-COOH + HO- ⇔ R-COO- + H2O est presque totalement déplacé vers la droite en présence d’ions OH- Le groupement amine –NH3

+ perd lui aussi son proton par réaction pratiquement totale avec les ions hydroxydes HO-, il n’est donc pratiquement pas ionisé, l’équilibre:

R’-NH3+ + OH- ⇔ R’-NH2 + H2O

est presque totalement déplacé vers la droite en présence d’ions OH-

En milieu très basique, l’acide aminé existe essentiellement sous forme d’anion :

• En milieu intermédiaire :

Les deux groupes fonctionnels antagonistes échangent un proton, Le groupement acide –COOH cède son proton tandis que le groupe amine -NH2 le capte. Il s’agit donc d’une réaction acido-basique intramoléculaire. Dans le milieu il existe alors un équilibre entre la forme moléculaire de

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 92005-2006

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l’acide aminé et une forme doublement ionisée globalement neutre que l’on appelle ion mixte ou amphion ou encore zwitterion :

Remarques : 1- Cette double ionisation permet d’expliquer la grande solubilité des acides aminés polaires et ioniques dans l’eau, l’équilibre ci-dessus étant très déplacé vers la droite. En solution aqueuse ils existent sous la forme d’ amphions. 2- Inversement la solubilité dans les solvants organiques est faible. 3- En solution aqueuse les acides α -aminés se comportent comme des ampholytes, ils ont des propriétés amphotères.

⇔ Ka1

AA+ AA±

[AA±].[H3O+] Ka1 = ---------------------- pKa1 = - log Ka1 [AA+] Si Ka1 = [H3O+], alors [AA±] = [AA+], c’est la ½ dissociation du premier équilibre et pH = pKa1.

AA-

⇔ Ka2

AA±

[AA-].[H3O+] Ka2 = ---------------------- pKa2 = - log Ka2

[AA±] Si Ka2 = [H3O+], alors [AA±] = [AA-], c’est la ½ dissociation du deuxième équilibre et pH = pKa2. Donc les formes prépondérantes en fonction du pH sont données par le schéma suivant: pH: pka1 pKa2

forme [AA+] [AA±] [AA-] majoritaire [AA+] = [AA±] [AA±] = [AA-]

• Point isoélectrique : Le passage d’un milieu très acide à un milieu très basique par augmentation progressive du pH provoque le passage de la forme cationique à la forme d’amphion puis à la forme anionique. Il existe donc, pour chaque acide α aminé, une valeur du pH pour laquelle l’amphion est majoritaire et sa concentration maximale, la charge nette globale de l’acide aminé est donc nulle. Ce pH particulier, compris entre pKa1 et pKa2, est appelé point isoélectrique ; il se note pHi. Il est caractéristique de chaque acide α -aminé et sa valeur est donnée par la relation :

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 102005-2006

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)pKa(pKa21pHi 21 +=

Donc: Si pH = phi, la charge de l’acide aminé est nulle Si pH < phi, la charge de l’acide aminé est positive Si pH > phi, la charge de l’acide aminé est négative La charge (+ ou-) est d’autant plus forte que l’on s’éloigne du pHi.

• Dissociation en fonction du pH

100

50

% des ≠ formes

pKa1 pKa2pHi

AA+ AA± AA-

• Courbe de titration d’un acide aminé neutre : l’alanine

pH

2ème zone tampon

1ère zone tampon

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 112005-2006

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1.1.2.2 Cas des acides aminés acides: Les deux acides aminés : acide aspartique et acide glutamique possèdent un groupement acide carboxylique dans le radical R, ils ont donc trois groupements ionisables. C’est le groupement -COOH en α qui est le plus fort (pKa ≈ 2), puis vient le groupement –COOH du radical R (pKa ≈ 4), le groupement -NH3

+ est l’acide le plus faible (pKa ≈ 9,7) L’ordre d’ionisation est donc le suivant: +H3N-CH-COOH +H3N-CH-COO-

[AA±].[H3O+] Ka1 = ---------------------- [AA+]

| | (CH2)n + H2O ⇔ (CH2)n + H3O+

Ka1

| | COOH COOH

AA+ AA±

+H3N-CH-COO- +H3N-CH-COO-

[AA-].[H3O+] Ka2 = ---------------------- [AA±]

| | (CH2)n + H2O ⇔ (CH2)n + H3O+

Ka2

| | COOH COO-

AA± AA-

+H3N-CH-COO- H2N-CH-COO-

[AA2-].[H3O+] Ka3 = ---------------------- [AA-]

| | (CH2)n + H2O ⇔ (CH2)n + H3O+

Ka3

| | COO- COO-

AA2-AA-

La forme amphionique neutre se situe entre la première et la deuxième ionisation donc:

)pKa(pKa21pHi 21 +=

Donc les formes prépondérantes en fonction du pH sont données par le schéma suivant: pH: pka1 pka2 pKa3

forme [AA+] [AA±] [AA-] [AA2-] majoritaire

[AA+] = [AA±] [AA±] = [AA-] [AA-] = [AA2-]

• Dissociation en fonction du pH:

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 122005-2006

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100

50

pKa1 pKa3pKa2

AA+ AA± AA- AA2-

% des ≠ formes

pH

pHi

• Courbe de titration d’un acide aminé acide

3ème zone tampon

2èmre zone tampon

1ère zone tampon

pKa3

pKa2

pHi pKa1

0 0,5 1 0,5 1 1,5 2

équivalents H3O+ OH-

pH

1.1.2.3 Cas des acides aminés basiques: Trois acides aminés, lysine et arginine et histidine possèdent un groupement azoté dans le radical R, ils ont donc également trois groupements ionisables. C’est le groupement -COOH en α qui est le plus fort (pKa ≈ 2), puis vient le groupement -NH3

+ en α (pKa ≈ 9), le groupement azoté du radical R est l’acide le plus faible (10 <pKa > 13), sauf pour l’histidine où le groupement azoté du radical R est plus fort (pKa ≈ 6) que le groupement -NH3

+ en α (pKa ≈ 9).

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER

132005-2006

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L’ordre d’ionisation est donc le suivant (exemple de la lysine): +H3N-CH-COOH +H3N-CH-COO-

[AA2+].[H3O+] Ka1 = ---------------------- [AA+]

| | (CH2)4 + H2O ⇔ (CH2)4 + H3O+

pKa1

| | NH3

+ NH3+

AA+

AA2+

+H3N-CH-COO- H2N-CH-COO-

[AA±].[H3O+] Ka2 = ---------------------- [AA+]

| | (CH2)4 + H2O ⇔ (CH2)4 + H3O+

pKa2

| | NH3

+ NH3+

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 14

AA+ AA±

H2N-CH-COO- H2N-CH-COO-

| | (CH2)4 + H2O ⇔ (CH2)4 + H3O+

pKa3 [AA-].[H3O+] Ka3 = ---------------------- [AA±] | |

NH3+ NH2

AA-AA±

La forme amphionique neutre se situe entre la deuxième et la troisième ionisation donc:

)pKa(pKa21pHi 32 +=

Donc les formes prépondérantes en fonction du pH sont données par le schéma suivant: pH: pka1 pka2 pKa3

forme [AA2+] [AA+] [AA±] [AA-] majoritaire

[AA2+] = [AA+] [AA+] = [AA±] [AA±] = [AA-]

• Dissociation en fonction du pH:

2005-2006

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100

50

pKa1 pKa3pKa2

AA2+ AA+ AA± AA-

% des ≠ formes

pH

pHi

• Courbe de titration d’un acide aminé basique

3ème zone tampon

2èmre zone tampon

1ère zone tampon

pKa3

pKa2

pHi

pKa1

1 1,5 2 0,5 0 0,5 1

équivalentsH3O+ OH-

pH

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 152005-2006

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1.1.3 Propriétés chimiques communes à tous les acides aminés

1.1.3.1 Propriétés de la fonction acide carboxylique -COOH • Formation de sels

Les acides aminés réagissent avec les bases en formant des sels. Le groupement carboxyle perd un proton.

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 16

Ce sel a pour nom : (nom de l’acide aminé terminé par ate) de sodium, ex glycinate de sodium.

+CH

OH

O

NH2

CR CH

O-

O

NH2

CR Na+NaOH +

A l’inverse la fonction -COO- réagit avec un acide pour redonner -COOH

• Réduction La fonction acide peut être réduite en fonction alcool

R CH CH2OH

NH2

NaBH4+CH C

NH2

O

OH

Fonction alcool Iaire

R • Estérification

Les acides aminés réagissent avec les alcools en formant des esters.

• Action des amines primaires:

Cette réaction aboutit à la formation d’amides.

R CH C

NH2

O

NH-R’’

CH

NH2

C

O

O-R’

H2O +

H2O +

Fonction amide

Fonction ester

RCH

OH

O

NH2

CR + R’-OH

• Décarboxylation

CH

OH

O

NH2

CR H2N-R’’ +

Cette réaction est intéressante d’un point de vue biochimique. Elle aboutit à la formation d’une amine.

CH C

NH2

O

OH

R CH2 NH2R

CO2+ Cette décarboxylation peut se faire par: - voie chimique : chauffage de l’AA dans une solution inerte - Voie enzymatique : sous l’action d’enzymes, les décarboxylases.

1.1.3.2 Propriétés de la fonction amine primaire –NH2 • Formation de sels

Les acides aminés réagissent avec les acides en formant des sels. Le groupement amine capte un proton.

Ce sel a pour nom : chlorhydrate d’acide aminé.

CH

OH

O

NH2

CR CH C

N 3H + OH

O

R Cl-+ HCl +

2005-2006

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A l’inverse la fonction –NH3

+ réagit avec une base pour redonner –NH2 • Substitution par un radical R

Les hydrogènes portés par la fonction amine peuvent être remplacés par un radical organique.

- Substitution par le Dinitrofluorobenzène (DNFB)

NO2F

NO2 +

NO2CH NH

Dinitrophényl acide aminé

DNP-AA OH

O

C

R

NO2

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 17

+CH NH2

OH

O

C

R HF

Dinitrofluorobenzène DNFB

- Substitution par le Phénylisothiocyanate (PITC)

CH NHO

C S

NHOH

C

R

Phénylisothiocyanate PITC

S=C=N +

CH NH2

OH

O

C

RAcide

phénylthiohydantoïque aminoacide

CH NH

C

O

C S

N

Phénylthiohydantoïne aminoacide

PTH-AA

R

- Substitution par le Chlorure de Diméthyl Amino1 Sulfonyl 5 Naphtalène (Chrorure de DANSYL)

R CH NH

S O O

DANSYL-aminoacide

N

CH3 CH3

OH

O

C

S

Cl

O O

N

CH3 CH3

CH NH2

OH

O

C

R +

- Substitution par le formaldéhyde (formol)

R CH C

N OH

CH2OH CH2OH

O+

CH C

NH2 OH

O

R 2 HCHO

Cette réaction permet de bloquer la fonction amine.

2005-2006

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• Action des acides carboxyliques :

Cette réaction aboutit à la formation d’amides.

• Désamination L’acide nitreux réagit sur les acides aminés en libérant du diazote qui peut être dosé.

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 18

Une désamination existe également par voie biochimique, elle est enzymatique.

1.1.3.3 Propriétés des fonctions –COOH et -NH2 conjointes • Réaction avec la ninhydrine

Le composé formé : Pourpre de Ruhemann présente une coloration violette sauf avec la proline avec laquelle il sera jaune.

1.1.4 Propriétés chimiques des chaînes latérales

• Acides aminés aromatiques - Absorption en UV:

Les acides aminés aromatiques absorbent les radiations lumineuses dans l’UV Les λmax des trois acides aminés aromatiques (Trp, Tyr, Phe) sont différentes.

R CH C

OH

O

OH

HNO2 N2+ + + H2O R CH C

NH2 OH

+ H2O

R-CHO +CO2+

Absorbance

Trp

PheTyr

O

2005-2006

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- Réaction de Folin L’acide phosphotungstomolybdique est réduit par la tyrosine et le tryptophane et forme différents composés colorés en bleu violacé.

- Réaction xanthoprotéique

Les noyaux aromatiques forment des dérivés nitrés jaunes avec l’acide nitrique.

• Acides aminés soufrés Ils réagissent avec l’acétate de plomb en milieu alcalin pour former du sulfure de plomb noir.

• Cystéine Les groupements thiol de la cystéine s’oxydent facilement en créant un pont disulfure formant la cystine:

2 cystéines ⇒ cystine + 2H+ + 2é

+ 2H+ + 2è 2

• Tyrosine Les groupements phénoliques substitués réagissent avec le mercure en donnant une coloration rouge (Réaction de Millon).

• Tryptophane Les aldéhydes réagissent avec le noyau indole du tryptophane pour former des composés violets. (Réaction d’Adamkiéwich-Hopkins).

• Arginine L’α-naphtol en présence d’hybobromite et en milieu basique réagit avec le groupement guanidine (NH=C⎯NH2) pour former un composé rouge (Réaction de Sakaguchi).

• Proline Donne une coloration particulière avec la ninhydrine Réagit avec l’isatine pour former un composé bleu intense.

1.2 Méthodes de dosage et d’analyse des acides aminés

1.2.1 Méthodes de dosage total

Ces méthodes permettent de doser tous les acides aminés, quelle que soit la nature du radical R.

1.2.1.1 Méthode de Kjeldahl Les acides aminés sont minéralisés totalement par oxydation en milieu sulfurique concentré et chaud. Il se forme du sulfate d’ammonium, acide faible qui peut être dosé par une base forte.

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 192005-2006

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1.2.1.2 Méthode de Sörensen La réaction employée est la substitution par le formaldéhyde, le composé qui en résulte est une amine tertiaire, qui est une base plus faible (donc un acide plus fort sous la forme protonée)que l’amine primaire initiale. Le dosage de la molécule est donc plus aisé par une base en présence d’un indicateur coloré. Cette méthode a pour nom ‘’formol-titration de Sörensen’’

1.2.1.3 Dosage spectrophotométrique à la ninhydrine Les acides aminés sont dosables spectrométriquement après dérivation à la ninhydrine car cette réaction entraîne la formation d’un composé de couleur violette ou jaune (proline) (cf. propriétés chimiques), qui absorbe fortement dans le visible. La loi de Beer-Lambert : Absorbance = ε.l.[c], montre que l’absorption lumineuse est proportionnelle à la concentration molaire, à condition de travailler à la longueur d’onde d’absorption maximum de la molécule ou λmax et avec une solution limpide et suffisamment diluée.

1.2.2 Méthodes de dosage spécifiques de certains acides aminés

1.2.2.1 Dosage spectrophotométrique dans l’ultraviolet Les acides aminés aromatiques absorbent les radiations lumineuses dans l’UV, l’absorption répond à la loi de Beer-Lambert.

1.2.2.2 Dosage spectrophotométrique dans le visible Les réactions spécifiques à certains acides aminés produisant des composés colorés (cf.; propriétés chimiques du radical R) dont l’absorption répond à la loi de Beer-Lambert peuvent être utilisées pour doser ces AA par colorimétrie.

1.2.3 Techniques de séparation des acides aminés

1.2.3.1 l’électrophorèse Rappel: cette technique sépare les acides aminés selon leur charge électrique. Une solution aqueuse d'un mélange d'AA est placée sur un papier spécial ou un gel d’électrophorèse Un champ électrique de haut-voltage est appliqué à ce gel placé dans une solution tampon de pH fixe. A cause de leurs différents pHi, les AA possèdent des charges distinctes et migrent dans des directions et à des vitesses différentes selon le pH du système tampon et le type de support. Pour établir leur localisation caractéristique, des échantillons d'AA témoins sont traités dans les mêmes conditions. Le support est ensuite coloré à la ninhydrine.

1.2.3.2 La chromatographie Généralités: La chromatographie, méthode d'analyse physico-chimique, sépare les constituants d'un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le long d'une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la (ré)partition sélective des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention exercée par la phase stationnaire et une force de mobilité due à la phase mobile. Les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules à séparer entre les phases fixe et mobile sont : la solubilité dans un solvant liquide, la taille (la forme), la polarité, la charge électrique, la présence de groupements d'atomes formant des sites particuliers. Les différents types de chromatographie résultent du fait que l'on a privilégié l'effet de l'un ou l’autre de ces facteurs, mais l'exclusivité d'un mécanisme n'est jamais totale au cours d'une séparation chromatographique.

• Chromatographies en phase liquide (CPL) : la phase mobile est un liquide. Selon la nature de la phase stationnaire, on distingue :

les chromatographies de partage :

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 202005-2006

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- la chromatographie de partage :c'est une chromatographie liquide-liquide. La phase stationnaire est un liquide fixé sur un support inerte. Cette chromatographie est ainsi dénommée car elle est basée sur le partage du soluté dans les deux phases liquides.

- la chromatographie d'exclusion :elle est encore appelée chromatographie d'exclusion-diffusion, tamisage moléculaire, gel-filtration, perméation de gel. La phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase fixe, en revanche les petites particules incluses diffusent dans les pores du gel.

les chromatographies d'adsorption : - la chromatographie d'adsorption :c'est une chromatographie liquide-solide. la

phase stationnaire est un adsorbant solide polaire. - la chromatographie d'adsorption en phase inverse :c'est une chromatographie

liquide-solide dans laquelle la phase stationnaire est apolaire - la chromatographie sur échangeurs d'ions :la phase stationnaire est un échangeur

d'ions constitué par une résine porteuse de groupements ionisés négativement ou positivement, exerçant des interactions de type électrostatique avec les solutés ioniques du milieu.

- la chromatographie d'affinité : la phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique (bio-affinité) pour un soluté de l'échantillon à analyser (affinité enzyme-substrat, ligand-récepteur, antigène-anticorps).

- • chromatographies gazeuses (CG) : la phase mobile est un gaz vecteur. On distingue dans

ce cas : - la chromatographie gaz-liquide :c'est une chromatographie de partage. La phase

stationnaire est un liquide fixé par imbibition d'un support inerte. - la chromatographie gaz-solide :c'est une chromatographie d'adsorption. La phase

stationnaire est un solide adsorbant. Si la phase stationnaire se présente sous forme de microbilles contenues dans un tube de verre ou de métal on parle de chromatographie colonne, si elle est sur un support plan on parle de chromatographie de surface ou planaire.

Phase mobile

Mélange à séparer Phase stationnaire

Pour les acides aminés, peuvent mettre en œuvre:

• les chromatographies de surface: - sur papier - sur couche mince

• les chromatographies sur colonne • les chromatographies en phase gazeuse (CPG)

1.2.3.2.1 Chromatographie papier des acides aminés

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 212005-2006

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C’est une chromatographie de partage entre l’eau (phase stationnaire) retenue sur le papier et un solvant organique (phase mobile) qui monte par capillarité le long de la phase fixe, entraînant plus ou moins les AA en fonction de leur polarité. Les AA à séparer sont chromatographiés en présence de témoins. Après migration et coloration la référence frontale (Rf) de chaque AA inconnu ou témoin est calculée.

Rf = Déplacement du composé / déplacement du solvant La Rf est une caractéristique d’un composé dans un système donnée pour des conditions opératoires définies. La Chromatographie papier peut être bidimensionnelle:le dépôt du mélange à analyser se fait dans un angle, sans témoin, la migration dans la 1ère dimension se fait avec un premier solvant organique puis le papier est tourné d’ un ¼ de tour et une nouvelle migration se fait avec un autre solvant organique de polarité différente.

1.2.3.2.2 Chromatographie sur couche mince des acides aminés (CCM)

C’est une chromatographie d’adsorption avec une phase stationnaire polaire (cellulose ou silice) étalée en fine couche sur un support rigide inerte (verre ou feuille de métal) et une phase mobile qui est un solvant organique moins polaire. Les AA à séparer sont chromatographiés en présence de témoins. Après migration et coloration la référence frontale (Rf) de chaque AA inconnu ou témoin est calculée. La Chromatographie couche mince peut être également bidimensionnelle

1.2.3.2.3 Chromatographie ionique des acides aminés

C'est le procédé le plus utilisé pour séparer, identifier et quantifier chaque AA dans un mélange. Elle est basée sur les différences de comportement acido-basique des AA. La colonne de chromatographie est un long tube rempli d'une résine synthétique sur laquelle sont fixés des groupements chargés : Une résine avec des groupements anioniques est un échangeur de cations. Une résine avec des groupements cationiques est un échangeur d'anions. Les groupements anioniques sont en général: Résine carboxylique Résine sulfonique

particule

COO-

COO-

COO-

particule

SO3H-

SO3H-

SO3H- Les groupements cationiques sont en général: Résine ammonium

particule

NH3+

NH3+

NH3+

Pour la séparation des AA, une résine échangeuse de cations est généralement utilisée. A pH = 3*, on place un mélange d'AA au sommet de la colonne. * à pH = 3, la plupart des AA sont sous-forme de cations, mais diffèrent par leur degré d'ionisation.

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 222005-2006

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SO3-

SO3-

SO3-

SO3-

SO3- (groupements sulfonates)

+ 2 Na+

+NH3-CHR-COOH

+NH3-CHR-COOHEchange de cations

+NH3-CHR-COOH+

Sites

Na+

Na+

Ex : les AA (His, Lys, Arg) déplacent en premier Na+ et seront solidement fixés. Les AA (Glu, Asp) seront les moins fixés. Les AA seront ensuite élués par changement de pH. Ces AA sont ensuite collectés à la sortie de la colonne , colorés à la ninhydrine, leur absorbance est mesurée, le chromatogramme se présente sous forme d’un graphe présentant des pic lors de la sortie d’un AA.

Cette méthode est à la fois qualitative et quantitative car la surface d’un pic est proportionnelle à la concentration de l’acide aminé.

1.2.3.2.4 La chromatographie gazeuse (CG)

Pour pouvoir être séparés par CG les composés doivent pouvoir être entraînés par la phase mobile gazeuse, ils devront donc être volatils. Ce n’est pas le cas pour les acides aminés, il faudra donc les rendre volatils par transformation chimique. Ils seront ensuite séparé par passage à travers une colonne capillaire (2m de long, 0,1mm de diamètre) dont l’intérieur est recouvert d’un film liquide. Cette colonne est chauffée entre 100 et 200°C. Les AA sont partiellement solubles dans cette phase liquide stationnaire non volatile et partiellement vaporisés. Ils sont alors entraînés par le gaz vecteur à des vitesses différentes qui dépendent de leur solubilité dans le film liquide. Il s’agit donc d’une chromatographie de partage liquide-gaz.

1.2.3.3 L’électrochromatographie Il s’agit d’un couplage sur un support adéquat d’une CCM dans une première dimension et d’une électrophorèse dans la dimension perpendiculaire.

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2 les peptides Un peptide est une molécule résultant de la condensation d’acides aminés liés les uns autres par des liaisons peptidiques. Cette liaison résulte de la réaction entre la fonction -COOH du 1er AA et la fonction –NH2 du 2ème AA avec élimination d’eau.

R1

CH C NH2

O

OH R2

CH NH2+

O

OH R1

CH C NH2

O

R1

CH CNH

O

OH

Liaison peptidique = Fonction amide

+ H2O C

On appelle résidus les AA engagés par leur –COOH dans une liaison peptidique, leurs noms se terminent par le suffixe ‘’yl’’, ex. alanyl, prolyl…. Dans les peptides le nombre d’AA est < à 100, un petit peptide (AA<10) est un oligopeptide, dans les protéines, qui sont des polypeptides, le nombre d’AA est < à 100.. Exemple d’un tétrapeptide: O H O H O H || | || | || |

NH2—CH—C—N—CH—C—N—CH—C—N—CH—COOH | | | |

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 24

R1 R2 R3 R4

Extrémité N terminale Extrémité C terminale

2.1 Propriétés de la liaison peptidique et des peptides

• Le caractère de la liaison peptidique est légèrement acide, ce qui contribue à créer de nouvelles propriétés, différentes celles des acides aminés.

• La liaison peptidique est hydrolysable en milieu acide concentré et à chaud. • Un peptide possède de nombreux groupements ionisables libres (extrémités N et C

terminales, groupements ionisables des groupements latéraux R), il va donc exister sous de nombreuses formes ioniques différentes, il possède un pHi. Le pHi est, comme pour les AA, la demie somme des pKa qui entourent la forme amphionique.

• Les peptides à partir de 4 AA peuvent être mis en évidence par la réaction du biuret, qui est caractéristique de la liaison peptidique. Le peptide, en milieu très alcalin, réagit avec le cuivre Cu2+ pour donner un complexe rose.

2005-2006

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• L’angle des liaisons autour des atomes fait que la chaîne peptidique n’est pas plane mais possède une structure spatiale du type:

CH N

CH

CH

O

C

R2

H

C

O

N

R3

H

R1

N

CH

O

C

R4

H

La chaîne peptidique est donc une succession des groupements -CH, -C=O, -NH, les groupements R des résidus d’acides aminés sont rejetés à l’extérieur.

2.1.1 Séquence d’un peptide

La séquence d’un peptide est l’ordre d’enchaînement des AA. Par convention un peptide s’écrit en commençant par l’extrémité N terminale, (groupement –NH2 libre) et en terminant par l’extrémité C terminale (groupement –COOH libre). Exemple : écriture du tétrapeptide:glutamyl⎯cystényl⎯lysyl⎯glycine O H O H O H || | || | || |

NH2—CH—C—N—CH—C—N—CH—C—N—CH—COOH | | | | (CH2)2 CH2 (CH2)4 H | | | COOH SH NH2 Pour une écriture simplifiée, les acides aminés peuvent être représentés par leur symbole à trois lettres ( Glu-Cys-Lys-Gly) ou à une lettre (E-C-K-G).

2.2 Détermination de la séquence d’un peptide Pour déterminer la structure d’un peptide, il faut connaître sa composition brute en acides aminés, puis en déterminer sa séquence. Pour déterminer la structure d’un peptide, il faut connaître sa composition brute en acides aminés, puis en déterminer sa séquence.

2.2.1 Détermination de la composition brute d’un peptide

Le peptide est d'abord réduit, ou oxydé, afin d'éliminer les liaisons disulfure. Méthode de Stein et Moore. Elle comprend plusieurs étapes :

– Hydrolyse acide ( HCl 6 mol.L-1, 24h à 72h, 110°C) pour couper les liaisons peptidiques (! l’hydrolyse acide détruit le tryptophane)

– Séparation des AA libérés par chromatographie ionique – Détection dans le visible après dérivation à la ninhydrine – Identification des AA par leur temps de rétention – Quantification en % par mesure de la surface des pics

Méthode des PTC acides aminés

– Hydrolyse acide – Réaction avec le phénylisothiocyanate PTC (cf. propriétés chimiques § 1.2.3.2.) – Séparation par HPLC d’adsorption en phase inverse – Détection dans l’UV – Identification des AA par leur temps de rétention – Quantification par mesure de la surface des pics

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 252005-2006

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2.2.2 Détermination de l’acide aminé N terminal

Il existe plusieurs méthodes chimiques et une méthode enzymatique La dégradation de Sanger utilise le 1-Fluoro-2,4dinitrobenzène comme réactif (cf. propriétés chimiques § 1.2.3.2.). Ce composé favorise une substitution sur le groupement -NH2 de l’AA.. Sur un peptide, il réagit avec l'extrémité aminée libre (N terminale)en donnant :

L'hydrolyse suivante coupe les liaisons peptidiques mais pas la liaison DNP-NH. Ainsi le premier acide aminé modifié est récupéré et identifié par chromatographie. Cette réaction a ouvert la voie de l'analyse, mais le reste de la chaîne n'est plus relié et l'information sur sa structure est perdue. Le Chlorure de DANSYL (cf. propriétés chimiques § 1.2.3.2.) peut être utilisé de manière identique avec l’avantage que le DANSYL-AA libéré est naturellement fluorescent. La dégradation récurrente d'Edman fait appel au phénylisothiocyanate PITC (cf. propriétés chimiques § 1.2.3.2.). Le composé formé se cyclise spontanément en un cycle à 5 éléments, cela entraîne la rupture d'une seule liaison peptidique et permet de réitérer l'opération sur la partie restante. Ce procédé a pu être automatisé et autorise en routine des séquençages de 50 acides aminés.

L’aminopeptidase est une enzyme de la famille des exopeptidases, c’est à dire qu’elle catalyse l’hydrolyse des liaisons peptidiques en commençant par une extrémité, en l’occurrence l’extrémité N terminale. Son fonctionnement est récurrent donc pour libérer seulement le premier AA, l’enzyme doit agir pendant un temps très court. L’AA libéré est identifié par chromatographie.

2.2.3 Détermination de l’acide aminé C terminal

Les carboxypeptidases A et B sont des enzymes de la famille des exopeptidases, elles catalysent l’hydrolyse des liaisons peptidiques l’extrémité C terminale. La carboxypeptidase A catalyse la coupure de la liaison C terminale sauf celle de Gly et des AA basiques à condition que l’avant dernier AA ne soit pas Pro. La carboxypeptidase B catalyse la coupure de la liaison C terminale des AA basiques à condition que l’avant dernier AA ne soit pas Pro. Leur fonctionnement est récurrent donc pour libérer seulement le dernier AA, l’enzyme doit agir pendant un temps très court. L’AA libéré est identifié par chromatographie.

2.2.4 Coupures spécifiques internes

Si le peptide à étudier comporte plus de 50 AA il sera réduit en peptides plus courts par coupures spécifiques avant d’être séquencé par la méthode d’Edman. Des endopeptidases ou des composés chimiques possédant des sites de coupure spécifique seront alors employés. La trypsine est une endopeptidase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans lesquelles un acide aminé basique (Lys, Arg) engage sa fonction acide L'α-chymotrypsine est une endopeptidase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans lesquelles un acide aminé aromatique (Tyr, Trp, Phe ainsi que Met) engage sa fonction acide. La pepsine est une endopeptidase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans lesquelles un acide aminé aromatique (Tyr, Trp, Phe) engage sa fonction amine.

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 262005-2006

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Le bromure de cyanogène coupe les liaisons peptidiques dans lesquelles une Met engage sa fonction acide, elle est transformée en HSL homosérine lactone..

2.3 Quelques peptides d’intérêt biologique ou alimentaire

2.3.1 Peptides hormonaux

De nombreuses hormones synthétisées par diverses glandes sont de nature peptidique, voici quelques exemples : La Vasopressine, synthétisée par l’hypophyse, est une hormone diurétique, dont l'extrémité se termine par une fonction amide -CO-NH2 sur la glycine et non par un acide libre -COOH.

L’angiotensine II une hormone du sang d’origine hépatique qui régule la pression sanguine :

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

Le glucagon est une hormone pancréatique hyperglycémiante comportant 29 AA

L’insuline est une hormone pancréatique hypoglycémiante comportant 51 AA en deux chaînes unies par un pont disulfure.

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 272005-2006

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2.3.2 Glutathion

Le glutathion est un tripeptide comprenant trois acides aminés : acide glutamique, cystéine et glycocolle. La cystéine et le glycocolle sont liés par une liaison peptidique. La liaison entre l'acide glutamique et la cystéine est une liaison amide entre la fonction acide du radical de l'acide glutamique et la fonction amine de la cystéine. En somme le glutathion est le γ-glutamyl-cystéinyl-glycocolle. Par la fonction thiol du radical de la cystéine, le glutathion peut exister sous une forme réduite (représentée ici) ou sous une forme oxydée dans laquelle deux molécules de glutathion sont liées par un pont disulfure.

-OOC—CH—CH2—CH2—CO—NH—CH—CO—NH—CH2—COO-

| | NH2 CH2 | SH

2.3.3 Peptides antibiotiques

La gramicidine S est un peptide cyclique formé de dix acides aminés, de structure :

Val

Pro

D-Phe

LeuOrn

Val

Pro

D-Phe

LeuOrn

La bacitracine A est un peptide partiellement cyclique formé de douze acides aminés

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 28

Ile⎯Cys⎯Leu⎯Glu⎯Ile⎯Lys

Orn Ile

Phe

Asp

Asp

His La tyrocidine est également un peptide cyclique formé de dix acides aminés

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2.3.4 Peptides d’intérêt alimentaire

Les édulcorants de synthèse à haut pouvoir sucrant sont souvent de nature peptidique. Exemple : structure de l'aspartame : c’est un dipeptide méthylé : l’aspartyl-phénylalanine méthyl

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 29

O O || || 2HN⎯CH⎯C⎯NH⎯CH⎯C-O⎯CH3 | | CH2 CH2 | | COOH C6H5

3 Les protéines Les protéines sont des constituants fondamentaux des organismes vivants, ce sont des polymères d’acides aminés (nombre d’AA <100), de haut poids moléculaire pouvant atteindre 1000 000 D, (la plupart entre 25000 D et 200000 D). Une protéine peut être formée d’une seule chaîne polypeptidique (monomère) ou de plusieurs (dimère, tétramère, …) Suivant leur composition se distingue :

• Les holoprotéines qui sont formées uniquement d’unité(s) polypeptidique(s) • Les hétéroprotéines auxquelles un groupement prosthétique non protidique est associé. Il

peut être constitué par un enchaînement glucidique, des lipides, un ion métallique, un acide nucléique, un coenzyme, un hème ….

Suivant leur forme se distingue: • Les scléroprotéines ou protéines fibreuses, de forme allongée, peu solubles, très

résistantes, ce sont des molécules de structure. • Les sphéroprotéines ou protéines globulaires, de forme compacte, solubles, fragiles, ce

sont des molécules possédant une fonction biologique active. Les protéines ont des fonctions très diverses :

• Enzymes :Ce sont les catalyseurs des réactions biologiques et permettent à ces réactions, de la plus simple à la plus compliquée, de se produire à 37°C. Chaque cellule vivante contient des milliers d'enzymes, chacune catalysant une seule réaction chimique bien précise. Citons la chymotrypsine enzyme pancréatique constituée par une séquence de 246 aminoacides.

• Protéines de structure: Elles constituent la charpente des tissus vivants (peau, cheveux, muscles). Citons les collagènes, les kératines et la myosine.

• Protéines de défense: Citons les immunoglobulines, protéines de la coagulation (fibrinogène, thrombine).

• Protéines régulatrices: exemple de certaines hormones telles que l'insuline, hormone du pancréas, avec une séquence de 51 aminoacides, qui régule le taux de sucre dans le sang ou l'ocytocine (polypeptide avec une séquence de 9 acides aminés) qui régule les contractions utérines lors de l'accouchement. Citons aussi comme protéines régulatrices, les cytosines de l'immunité....

• Protéines de transport: Protéines du plasma fixant et transportant des molécules ou des ions d'un organe à un autre, comme par exemple l'hémoglobine des érythrocytes, le sérumalbumine....

• Protéines contractiles ou motrices: Elles peuvent se contracter et modifier leur forme. (actine et myosine dans les fibres musculaires).

• Protéines de stockage : l'ovalbumine, principale protéine du blanc d’œuf, caséines, principales protéines du lait, et des protéines existant dans les graines de nombreux végétaux (blé, maïs, riz).

3.1 Structure des protéines Pour les protéines la relation structure-fonction est très forte, le rôle biologique de ces molécules ne peut être maintenu que si l’organisation tridimensionnelle est respectée. Il existe quatre niveaux structuraux chez les protéines, de la structure primaire à la structure quaternaire.

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• Structure primaire : ordre des acides aminés le long de la chaîne polypeptidique. • Structure secondaire : repliement local des acides aminés en hélices, en feuillets, ou en

d'autres formes similaires. • Structure tertiaire : agencement stable dans l'espace de ces hélices et feuillets. • Structure quaternaire : agencement des sous-unités entre elles, quand la protéine est

constituée de plusieurs sous-unités indépendantes.

3.1.1 La structure primaire

La structure primaire est la séquence peptidique. C’est la seule structure à être codée génétiquement, elle détermine les trois autres niveaux structuraux. La conformation privilégiée de la liaison peptidique entre les résidus est en trans. Cette conformation est généralement plus stable car elle positionne les chaînes latérales loin l'une de l'autre.

3.1.2 La structure secondaire

Un effet de résonance cause le partage d'électrons entre les atomes du groupe carboxylique d'un résidu et l'azote du groupe aminé du résidu suivant. Cet effet de résonance fige la liaison peptidique en une structure planaire, le plan amide.

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Chaque liaison peptidique est donc rigide, mais de part et d'autre les liaisons peuvent effectuer une rotation. L'angle de rotation d'un plan amide par rapport au carbone alpha suivant' est noté angle ψ; l'angle entre le plan amide précédent et ce même carbone alpha est noté angle φ:

C'est la succession de ce genre de structures régulières, hélices, feuillets ou tours qu'on appelle la structure secondaire d'une protéine. Le biologiste G.N. Ramachandran, se rendit compte en travaillant avec des modèles de polypeptides que certains angles ψ et φ ne pouvaient pas être combinés à cause de l’encombrement stérique Les structures secondaires les plus souvent retrouvées dans les protéines sont l'hélice alpha et le feuillet bêta

3.1.2.1 L’hélice alpha Une hélice alpha résulte de la succession d'angles φ de -57o et d'angles ψ de -47o. Cette hélice est droite.

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L'hélice alpha s'élève 0,54 nm à chaque tour. Elle compte 3,6 résidus par tour. Elle est stabilisée dans sa forme hélicoïdale par des ponts hydrogènes établis entre l'hydrogène d'un groupement aminé -NH et l'oxygène d'un groupement carboxylique -C=O et situé quatre résidus plus loin. Comme ces ponts hydrogènes vont dans la même direction que l'hélice, celle-ci est élastique : les ponts hydrogènes brisés lors de l'étirement de l'hélice se reformeront facilement quand la tension sera relâchée. Les chaînes latérales des résidus dans une hélice alpha pointent à l'extérieur de la structure. Une telle hélice peut facilement avoir une nature amphipathique si les chaînes latérales se trouvant toutes du même côté ont une nature hydrophile et que celle se trouvant de l'autre côté ont une nature hydrophobe. Vue plongeante d'une hélice alpha amphipathique. Les résidus chargés ou polaires sont en noir, les résidus hydrophobiques en gris et les petits résidus en blanc. Même si la structure primaire ne révèlerait pas de région particulièrement hydrophile ou hydrophobe, cette vue de l'hélice nous

montre qu'une de ses faces est plus hydrophile et l'autre face plus hydrophobe. La proline n'ayant pas d'hydrogène sur son groupe aminé, elle ne peut pas contribuer au pontage hydrogène. La proline déstabilise donc l'hélice alpha, et il est rare qu'on retrouve un résidu proline dans une telle hélice. L’hélice alpha est représentée par une spirale.

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3.1.2.2 Le feuillet β Les feuillets bêta (β-sheet en anglais) se forment quand des parties de la longue chaîne polypeptidique se replient et se longent l'une l'autre, côte à côte, en formant des pont hydrogènes avec la voisine. On parle de feuillets bêta parallèles quand les chaînes vont dans le même sens et d'antiparallèles quand elles vont dans des directions opposées. La direction des angles Φ et Ψ alterne dans un feuillet bêta (un positif, l'autre négatif), donnant à la chaîne une allure en zigzag.

On peut se représenter un feuillet bêta comme une tôle ondulée, avec des chaînes latérales pointant en alternance en haut et en bas. La distance entre deux résidus est de 0,335nm; chaque chaîne est séparée de sa voisine de 0,465nm. Un feuillet bêta est représenté, dans les modèles structuraux, par une grosse flèche plate qui indique sa direction. Puisque les ponts hydrogènes des feuillets bêta pointent perpendiculairement à l'axe de la chaîne polypeptidique, ils ne donnent pas d'élasticité à la structure. On retrouve beaucoup de feuillets bêta dans la soie de ver (Bombyx mori) et la toile d'araignée.

3.1.3 La structure tertiaire

La structure tertiaire est la disposition tridimensionnelle des structures secondaires et des chaînes latérales d’une protéine. En d’autres mots, l’assemblage des structures secondaires et la disposition spatiale arrangée des chaînes latérale déterminent la conformation native de la protéine.

Certains assemblages de structures secondaires sont connus sous le nom de superstructures. Les plus connues sont : Motif βαβ : Deux feuillets bêta parallèles reliés par une hélice alpha. Motif en épingle à cheveux : Un feuillet bêta antiparallèle formé de chaînes polypeptidiques et relié par des tournants en épingle à cheveux.

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Motif αα : Deux hélices alpha antiparallèles reliées ensemble ayant un axe incliné afin de favoriser des interactions. Barils β : Feuillets bêta qui s’enroulent pour former des structures cylindriques.

3.1.3.1 Maintien de la structure Plusieurs interactions entre différents résidus de la chaîne polypeptidique repliée dans l'espace maintiennent la structure de la protéine.

• Interactions électrostatiques : on les distingue en...

- interactions charge-charge entre résidus de charge inverse ( -NH3+ contre COO

-).

Quand une telle interaction est enfouie dans une protéine globulaire, à l'abri de l'eau, on dit qu'il s'agit d'un pont de sel (salt bridge).

- Interactions charge-dipôle quand une chaîne latérale ionisée interagit avec le dipôle d'une molécule d'eau. Cette interaction aide aussi à l'hydratation et à la solubilisation de la protéine.

- Pont hydrogène entre H d'une part et O ou N d'autre part. Les protéines peuvent bien sûr former des ponts hydrogènes avec des molécules de solvant comme l'eau, et de telles interactions peuvent aussi contribuer à la stabilité de la structure globale.

• Interactions hydrophobes : entre groupes hydrophobiques comme les groupements cycliques de la phénylalanine et de la tyrosine. De telles interactions excluent les molécules d'eau.

• Forces de Van der Waals : il s'agit de dipôle temporaires de faible force.. Ceux-ci peuvent se former parce que les nuages électroniques des atomes individuels peuvent fluctuer, donnant naissance à des dipôles temporaires.

• Ponts disulfures : Nous l'avons vu dans le §114 : une cystéine oxydée peut former un lien covalent avec une autre cystéine.

On sépare souvent les protéines globulaires des protéines fibreuses

3.1.3.2 Protéines globulaires Les protéines globulaires ont une forme compacte, où on peut distinguer une surface en contact avec le solvant et un cœur qui en est isolé. Les résidus hydrophiles se retrouvent souvent à la surface; les résidus hydrophobes le plus souvent à l'intérieur. Les ponts disulfures peuvent se former plus facilement à l'intérieur des protéines globulaires, parce qu'ils nécessitent des conditions oxydantes et que le cytoplasme est généralement réducteur à cause de la présence de glutathion. À l'abri des molécules d'eau qui les hydrateraient, les acides aminés chargés enfouis

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dans les protéines globulaires peuvent former des ponts de sel entre eux. Les acides aminés hydrophobes peuvent aussi plus facilement s'y empiler pour former des régions dépourvues d'eau.

3.1.3.3 Protéines fibreuses Puisque toutes les protéines sont à la base une longue chaîne polypeptidique, on peut se les représenter comme des spaghettis. Alors qu'une protéine globulaire est une boule de spaghettis refroidis et figée, une protéine fibreuse s'étire en longueur. Voici quelques protéines fibreuses typiques: Le tropocollagène, la composante de base du collagène, qui est la protéine la plus abondante du corps humain. La structure secondaire la plus présente dans le tropocollagène est l'hélice de collagène, qui est gauche. Cette hélice n'est pas stabilisée par des ponts hydrogènes internes. La kératine et la tropomyosine, retrouvées dans la peau et les muscles, respectivement. Les deux consistent enhélices alpha, qui sont droites, et sont stabilisées par des ponts hydrogènes internes orientés dans le même sens que la fibre, ce qui leur permet d'être étirées. Les ponts hydrogènes des hélices peuvent se briser sous la traction sans qu'il y ait de bris de liens covalents; quand la tension se relâche les ponts hydrogènes se reforment. Suffisamment étirée, la kératine peut aussi adopter une structure en feuillet bêta. Une protofibrille de kératine est formée par l'enroulement de deux ou trois hélices alpha les unes autour des autres, en tournant de façon gauche. 11 protofibrilles forment une microfibrille de kératine; un grand nombre de telles microfibrilles forment une fibre de kératine. La fibroïne de la soie est composée de régions très rigides et riches en feuillets β antiparallèles. Ces régions sont séparées par des régions moins structurées conférant une certaine élasticité à la soie. On peut retrouver dans la fibroïne une répétition du genre Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser (avec la chaîne latérale de Gly = un atome d'hydrogène) occupant entièrement l'une surface du feuillet: Les régions rigides riches en feuillets β de la fibroïne sont peu élastiques parce que leurs nombreux ponts hydrogènes sont perpendiculaires à la direction de la chaîne polypeptidique. L’élasticité de la soie est conférée par les domaines amorphes séparant les feuillets bêta.

3.1.4 La structure quaternaire

Il existe des protéines complexes formées de plusieurs chaînes polypeptidiques. L'assemblage de ces sous-unités entre elles constituent la structure quaternaire de la protéine. L'hémoglobine est la molécule qui, présente dans les globules rouges, permet le transport de l'oxygène vers les tissus. Elle contribue aussi, dans une moindre mesure, à l'évacuation des ions H+ et du CO2.Chez l'adulte, elle est constituée de deux sous-unités d'α-globine et de deux sous-unités de β-globine. Ces sous-unités sont assemblées de telle façon qu'elles laissent une cavité au centre du tétramère. Chaque unité globine est associée à un groupe hème, qui contient un atome de fer capable de s'associer à l'oxygène.

Suite au déplacement des sous-unités, le mouvement de différentes hélices alpha de l'hémoglobine fait que l'atome de fer se déplace par rapport au groupement hème et vient se positionner sur le même plan (voir figure ci-bas). Cette configuration est propice à l'association du fer à une molécule de O2. Quand le pH baisse, la réaction inverse se produit : les hélices

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reprennent leur position typique de la forme T, la cavité centrale grandit, et l'atome de fer est déplacé par rapport au groupe hème. Il relâche alors son oxygène.

3.2 Propriétés des protéines

3.2.1 Solubilité

Les protéines fibrillaires sont généralement peu solubles dans l’eau et les protéines globulaires solubles. Cette solubilité est fonction de la composition du milieu en particulier du pH et de la force ionique. Influence du pH: la solubilité d’une protéine est minimale au voisinage de son pHi

pHi pH

solubilité

Influence de la force ionique: les sels neutres interviennent sur la solubilité des protéines en fonction de la concentration et de la charge en ions c’est à dire la force ionique µ.L’augmentation de la force ionique provoque dans un premier temps un effet dissolvant (salting in) puis au-delà d’une limite variable selon la protéine un effet inverse qui fait précipiter la protéines.(relargage ou salting out)

-2

+1

-1

LogS/S0Zone d’effet dissolvant

Zone d’effet de relargage

0

µ

3.2.2 Dénaturation

Le maintient des structures secondaire, tertiaire, quaternaire des protéines est responsable de leur activité biologique, il est assuré par des liaisons de faible énergie. Si ces liaison sont rompues , la protéine va perdre son activité et certaines propriétés: elle est dénaturée. Cette dénaturation entraîne souvent la précipitation des protéines, elle peut être réversible ou irréversible. Les principaux agents dénaturants sont:

• La chaleur: les températures élevées détruisent les liaisons hydrogènes et hydrophobes • Les acides et les bases qui agissent sur les liaisons électrostatique en introduisant des

charges nouvelles. • Les solvants organiques qui détruisent les liaisons hydrophobes

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• Les détergents anioniques qui forment des liaisons électrostatiques avec les groupements –NH3

+ et des liaisons hydrophobes avec les chaînes latérales non polaires. • L’urée qui forme de nombreuses liaisons hydrogènes avec les liaisons peptidiques • Les agents réducteurs ou oxydant qui provoque la rupture des ponts disulfure • Les sels de métaux lourds • Les rayons UV • Les ultrasons

3.2.3 Propriétés optiques

Les protéines absorbent dans l’UV lointain à cause des liaison peptidique (≈ 190 nm) et à 280 nm si les contiennent des AA aromatiques en particulier du tryptophane. Les protéines sont douées de pouvoir rotatoire. Les protéines diffusent la lumière, ainsi leur solution sont souvent troubles.

3.2.4 Propriétés ioniques

Les protéines, comme les peptides possèdent de nombreux groupements ionisables libres (extrémités N et C terminales, groupements ionisables des groupement latéraux R), qui leur confèrent un caractère amphotère. Lorsque le nombre de groupement chargés positivement est égal au nombre de ceux chargés négativement la protéines est au point isoionique; ce point isoionique est voisin du point isoélectrique où la charge totale de la protéines est nulle 0en tenant compte des autres ions en solution.

3.2.5 Propriétés chimiques

Les protéines possèdent les propriétés des liaisons peptidiques (cf.; § 2.1.) et des chaînes latérales des résidus d’acides aminés (cf.; § 1.1.4.)

3.2.6 Propriétés antigéniques

Les protéines animales, végétales, bactériennes ou virales possèdent des propriétés antigéniques, c’est à dire que lorsqu’elle sont injectées à un organisme étranger, elles provoquent chez cet organisme la fabrication d’anticorps. Les protéines étant de grosses molécules, elles possèdent plusieurs épitopes ou sites antigéniques capable chacun d’induire la fabrication d’un type d’anticorps. Il est à noter que les anticorps sont eux mêmes de nature protéique.

3.3 Méthodes de séparation des protéines

3.3.1 Précipitation des protéines

Les protéines peuvent être précipitées par ajout de solvant organique (précipitation irréversible), par modification de pH ou de température (précipitation irréversible) ou par modification de la force ionique par ajout de sel neutre. Le sel le plus utilisé est le sulfate d’ammonium (NH4)2SO4. Les protéines précipitent à des forces ioniques différentes. Il existe deux manières d’utiliser cette méthode:

• ajout de sulfate d’ammonium suffisamment concentré, généralement à 70% de saturation : précipitation de toutes les protéines d’un mélange (phénomène relargage)..

• ajout de sulfate d’ammonium à des concentrations croissantes : précipitation fractionnée, les protéines précipitent séparément (phénomène relargage).

Lorsque la protéine précipitée est replacée dans un milieu de force ionique convenable elle se redissout (phénomène de salting in)

3.3.2 Dialyse- Ultrafiltration

La dialyse est une méthode de séparation des molécules en fonction de leur taille. On utilise une membrane semi-perméable qui laisse passer l’eau et les petites molécules mais pas les protéines. Si le boudin de dialyse est mis en agitation dans un milieu moins concentré les petites molécules sortent ce qui purifie en partie la solution protéique.

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L’ultrafiltration consiste à pousser sous forte pression la solution protéique contre une membrane poreuse, seules l’eau et les petites molécules passent au travers de la membrane, les protéines restent sur la membrane. Ceci concentre et purifie partiellement la solution protéique.

3.4 Electrophorèse

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 38

⇒ ⇒ ⇒

L’électrophorèse est une technique de séparation utilisant la migration des molécules chargées dans un champs électrique. Les protéines possédant de nombreux groupements ionisables sont des molécules amphotères : leur charge dépend du pH du milieu ainsi que de leur propre pHi.

Si pH < pHi la charge nette est positive Si pH = pHi la charge nette est neutre Si pH > pHi la charge nette est négative

La protéine est d’autant plus chargée que la différence entre pH du milieu et pHi est importante. De nombreuses méthodes utilisent ce principe, elles peuvent être analytiques (but : séparation des molécules) ou préparatives (but : obtention d’une quantité plus ou moins importante d’un mélange)

3.4.1 Electrophorèse en veine liquide

C’est type d’électrophorèse le plus ancien, mis au point par Tisellius. La migration s’effectue au sein d’un liquide de composition déterminé. Abandonnée pendant un temps cette technique est réactualisée pour la technique d’électrophorèse capillaire. Un détecteur optique est placé à la sortie du tube d’électrophorèse. La séparation s’effectue selon la charge des protéines.

3.4.2 Electrophorèse de zone

La migration est réalisée également dans une phase liquide mais celle ci imprègne un support solide poreux ou un milieu gélifié; Les supports les plus courants sont : le papier, l’acétate de cellulose, et les gels (agarose, gélose, amidon, polyacrylamide …) La séparation s’effectue selon la charge et plus ou moins selon le support utilisé la masse des protéines. Après migration les protéines sont fixées par précipitation puis colorées. Exemple d’utilisation de routine en biochimie clinique : séparation des protéines sériques sur gel d’amidon.

L’électrophorèse de zone peut aussi s’appliquer à des protéines dénaturées. Dans l’électrophorèse SDS-PAGE le support est un gel de polyacrylamide réticulé présentant un effet filtrant sur les protéines. Le βmercaptoéthanol, le chauffage et le SDS dénaturent les protéines qui perdent leur configuration spatiale. Le SDS, détergent anionique, se lie aux protéines par des liaisons hydrophobes et leur confèrent à toutes une même charge négative. La migration ne s’effectue alors qu’en fonction de la taille des molécules, les plus grosses étant rapidement arrêtées par les mailles du gel.

3.4.3 La focalisation isoélectrique (IEF)

Ici, la séparation des molécules de l’échantillon se fait dans un gradient de pH. Les molécules se déplacent sous l’effet d’un champ électrique uniforme jusqu’à ce qu’elles aient atteint un pH égal à leur pHi. Cette méthode présente l’avantage de lutter contre la diffusion de l’échantillon hors de sa zone de pHi. En effet, si elles diffusent hors de la zone de pH correspondant à leur pHi, elles sont

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aussitôt chargées et donc ramenées par l’effet du champ électrique dans leur zone de pHi. Les méthodes permettant d’obtenir le gradient de pH indispensable à cette technique sont principalement au nombre de deux : en utilisant des molécules amphotères (ampholines) de masse inférieure à 3000 Da et de pHi compris entre 2 et 11, ou en réalisant un greffage, dans un gel de polyacrylamide, de monomères d’acrylamide modifiés chimiquement portant des groupements ionisables de pK acides ou basiques(immobilines).

3.4.4 Electrophorèse bidimensionnelle

Une IEF est effectuée dans un sens sur un boudin de polyacrylamide lâche puis, sans fixer les protéines, ce boudin est déposé sur un gel polyacrylamide à mailles plus serrées et une électrophorèse SDS-PAGE est réalisée perpendiculairement à l’IEF. Les protéines sont ainsi séparées en fonction de leur pHi puis de leur PM. Chaque protéine apparaît comme un spot sur le gel. Cette méthode est purement analytique.

3.4.5 L’isotachophorèse (ITP)

Cette méthode est fondée exclusivement sur la séparation des molécules suivant leur mobilité électrophorétique. Les anions se déplacent tous vers l’anode, les plus mobiles en tête et les plus lents en queue. Ceci est possible grâce à un gradient de champ électrique, un champ faible étant appliqué aux ions lents, alors qu’un champ fort est appliqué aux ions rapides. Ce dispositif favorise la ségrégation et la répulsion mutuelle des ions de mobilité différente.

3.5 Chromatographie La chromatographie est une méthode de séparation des protéines en fonction de leur affinité pour une phase stationnaire solide ou liquide et une phase mobile liquide. Pour les protéines plusieurs types de chromatographies peuvent être utilisés.

3.5.1 Chromatographie hydrophobe

Le support (souvent silice) a été modifié par un greffage hydrophobe qui peut dont interagir avec les parties hydrophobes des protéines. Pour les protéines deux types de greffes sont couramment employés: - les amines aliphatiques (C4 C10) - Les amines aromatiques La phase mobile contient du (NH4)2SO4 qui favorise les liaisons hydrophobes entre la phase stationnaire et les protéines. L’élution peut se faire en diminuant la charge en (NH4)2SO4 ou en ajoutant un détergent qui solubilise les liaisons hydrophobes. ((NH4)2SO4 et détergent sont ensuite éliminés par dialyse ou ultrafiltrafiltration.

3.5.2 Chromatographie d’échange d’ions

La séparation se fait en fonction de la charge de la protéine Les échangeurs d’ions sont des substances hautement polymérisées constituant un réseau tridimensionnel et portant des groupements ionisables acides (-COO-H+, -SO3

-H+) ou basiques (-NH4

+). Les protéines sont dissoutes dans un tampon de pH donné et se chargent différemment en fonction de leur pHi. Suivant leur charge elles seront plus ou moins retenues sur l’échangeur. L’élution se fait ensuite par un gradient de pH et/ou de force ionique. Un détecteur optique à 280 placé en sortie de colonne permet de tracer le profil d’élution.

3.5.3 Chromatographie d’exclusion-diffusion ou Chromatographie de filtration sur gel

Dans cette technique la solution de protéines traverse par gravité une colonne contenant des billes tassées poreuses. Les molécules protéiques de dimensions supérieures aux plus gros pores des billes ne peuvent pénétrer dans le gel et sont exclues du gel, elles sont éluées rapidement avec le volume mort. Les molécules moins grosses pénètrent dans les billes par les pores et leur élution est retardée. Les molécules les plus petites diffusent entièrement dans le gel et sortent en dernier. Ceci n’est exact que pour des protéines globulaires de formes sensiblement identiques. Chaque gel possède donc un intervalle de poids moléculaires à l’intérieur duquel les protéines peuvent être séparées en fonction de leur taille. Cette technique est principalement utilisée pour:

Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 392005-2006

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Cours biochimie Protides IFTAB Christine CHEVALIER 40

⇒ ⇒

le dessalage des solutions protéiques La détermination du poids moléculaire

3.5.4 Chromatographie d’affinité

Dans ce type de chromatographie la phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité pour une protéine de l’échantillon à analyser. Plusieurs types d’affinité peuvent être utilisés:

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Affinité enzyme-substrat Affinité ligand-récepteur Affinité antigène-anticorps Affinité moins spécifique

Très souvent l’effecteur fixé à la phase stationnaire sera le substrat, le ligand ou l’anticorps, ce qui permettra de purifier l’enzyme le récepteur ou l’antigène. La Chromatographie se fait en trois étapes: Etape de fixation : Le mélange contenant la protéine à purifier est chargé sur la colonne d’affinité. Seule la protéine présentant une affinité pour la phase stationnaire sera retenue par liaison avec l’effecteur greffé. Etape de purification : En continuant à faire passer du tampon sur la colonne toutes les molécules contaminantes sont éliminées. Etape d’élution : Elle peut être réalisée de différentes façons:

par changement de pH du tampon d’élution, par changement de la force ionique du tampon d’élution Par compétition avec un ligand libre

Cette méthode est surtout préparative. Toutes ces techniques de chromatographie sont transposables en HPLC où la phase mobile liquide est soumise à une forte pression et où la phase stationnaire se présente sous forme de micrograins. Ceci permet une meilleure sélectivité et un temps d’analyse plus court; les colonnes ont également pu être réduites en taille. L’informatique permet de contrôler tous ces paramètres.

3.6 Analyse des protéines

3.6.1 Détermination du poids moléculaire

3.6.1.1 Méthode chimique Cette méthode permet de déterminer un poids moléculaire minimal; Un élément minoritaire et particulier de la protéine est dosé et sa concentration est rendue de manière relative en % de poids dans la protéine. Le postulat est qu’il ni ait qu’un exemplaire de cet élément par chaîne polypeptidique. Ex: le dosage du fer de l’hémoglobine donne un résultat de 0,34%, la masse atomique molaire du fer étant 55,8 g.mol-1, le poids moléculaire minimal de l’hémoglobine est:

16400D0,34

55,8x100PM ==

qui est le poids moléculaire d’une chaîne de globine, comme il y en a 4, le poids moléculaire exact sera 65600 D

3.6.1.2 Chromatographie d’exclusion-diffusion Afin de déterminer le PM d’une protéine d’intérêt, celle-ci est chromatographiée parallèlement à des protéines de poids moléculaire connu. Le graphe : Log de la masse moléculaire en fonction du volume d’élution ou du Kav est tracé grâce à ces étalons. Ainsi, d'après le Kav de la protéine d'intérêt, on peut calculer sa masse moléculaire.

Vm-V Vm- VeKav

T=

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3.6.1.3 Electrophorèse en gel natif La migration est rendue seulement dépendante du poids moléculaire en réalisant un gradient de polyacrylamide; La protéine va migrer jusqu’à trouver une position où elle ne pourra plus bouger car les pores du gel se resserrent. Un étalonnage du gel avec des protéines de PM connus permet de tracer la courbe : distance de migration = fonction (PM) et ainsi de déterminer le PM de la protéine d’intérêt.

3.6.1.4 Electrophorèse SDS-PAGE C'est la technique la plus utilisée. Afin de déterminer le PM d’une protéine d’intérêt, celle-ci migre parallèlement à des protéines de poids moléculaire connu. Le graphe Une gamme étalon est réalisée en traçant cette fois ci le log de la masse moléculaire en fonction du Rf qui est la distance de migration de la bande divisée par la distance de migration du front de migration. Etant donné que le SDS dissocie la protéine, on ne va plus observer la migration de la protéine entière, comme dans le cas de l'électrophorèse en gel natif, mais celle des différentes sous unités. On va donc pouvoir comparer la masse moléculaire de la protéine native d'une part et celle des sous unités, s’il y en a plusieurs, d'autre part. Ainsi, si par filtration sur gel on a un poids moléculaire de 50 KDa et sur gel SDS un poids de 25 KDa, on en conclue que la protéine est constituée de deux sous unités identiques.

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3.6.1.5 Spectrométrie de masse C'est une nouvelle technique utilisée pour les petites molécules et qui est très puissante. Cela consiste à vaporiser le composé à étudier, à le bombarder d'ions à l'aide d'un faisceau et à le soumettre à un champ magnétique. Ainsi, les composés sont séparés, avec une résolution de 1 Da, selon le rapport m/z. La technique de l'electrospray permet de vaporiser les protéines et on peut déterminer leur masse moléculaire jusqu’au moins 30 KDa

3.6.2 Détermination du pHi: Isoélectrofocalisation

Pour déterminer le pHi grâce à l’IEF le gel en polyacrylamide poreux et lâche est étalonné avec des marqueurs de pHi c’est à dire avec des protéines de pHi connus. Ensuite le graphe; distance de migration (depuis l’un des pôles) = fonction (pHi) est tracé. La distance de migration de la protéine d’intérêt permet ainsi de déterminer son pHi.

3.7 Méthodes de dosages des protéines

3.7.1 Méthodes non spécifiques

Ces méthodes ne permettent pas de faire la distinction entre les différentes protéines d’un mélange, par contre toutes les protéines ne réagissent pas forcément avec la même sensibilité ce qui peut poser des problèmes de choix pour la protéines servant à l’étalonnage. Ces méthodes sont:

• Méthode réfractométrique: l’indice de réfraction d’un milieu est proportionnel à sa concentration en protéines totales

• Méthode de Kjeldahl • Méthodes spectrophotométriques

• En UV - Mesure de l’absorbance à 280 nm

• Dans le visible (colorimétrie) - Méthode de Gornall basée sur la réaction du biuret (utilisée pour le dosage des

protéines sériques) - Méthode de Lowry qui combine la réaction du biuret et celle de Folin (très sensible,

elle est très utilisée pour le dosage dans les milieu pauvres en protéines) - Méthodes qui utilise la fixation d’un colorant sur les protéines (bleu de coomassie,

rouge de pyrogallol…) - Etc.

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3.7.2 Méthodes spécifiques

Ces méthodes permettent de doser une protéine d’intérêt dans un milieu riche en protéines totales, elles font toutes appel à la spécificité de la réaction Antigène-anticorps, l’antigène étant ici la protéine d’intérêt. Ce sont des immunométhodes. Certaines d’entre elles utilisent la propriété du complexe Ag-Ac à précipiter, certaines sont également couplées avec une électrophorèse (immunoélectrophorèse)

3.8 Les hétéroprotéines Ce sont des protéines dites complexes ou conjuguées : Dans de telles protéines il existe deux parties:

• la partie protéique :apoprotéine. • la partie non protéique : groupement prostéthique: il est fortement lié à l'apoprotéine,

souvent par liaison covalente et joue un rôle important dans la fonction de la protéine. Les hétéroprotéines sont classées en fonction de la nature chimique de leur groupement prosthétique.

• Glycoprotéines: Le groupement prosthétique est un groupement glucidique plus ou moins important appelé glycanne qui a un rôle structural ou de reconnaissance. Ces protéines sont largement répandues dans le monde vivant. Exemples : de nombreuses hormones, les protéines des liquides biologiques (salive, larmes, sang,....). Presque toutes les protéines du sang sont des glycoprotéines (Anticorps, fibrinogène,...).

• Protéolipides : Le groupement prosthétique est un groupement lipidique dont le rôle est l'ancrage des protéines aux membranes. Ne pas confondre avec les lipoprotéines, qui sont des assemblages non covalents impliqués dans le transport des lipides dans l'organisme.

• Chromoprotéines : Ce sont des hétéroprotéines colorées. Exemples: les myoglobines ou les hémoglobines où une seule chaîne peptidique (la globine) est combinée à un groupement prosthétique (hème) logé dans un repliement de la structure tertiaire de la globine. Remarque: L'hème est constitué d'un noyau porphyrine (structure plane) et d'un atome de fer (II); ce complexe est rouge et donne sa couleur au sang:

• Phosphoprotéines: le groupement prosthétique est un groupement phosphate lié par une liaison ester-phosphate aux fonctions alcools des résidus sérines et thréonines.

• Nucléoprotéines : le groupement prosthétique est un acide nucléique (ARN ou ADN) Exemples :la chromatine (ADN) ou les ribosomes (ARN) • Métalloprotéines : le groupement prosthétique est un métal (Mg2+, Zn2+ ), indispensable à

l’activité.

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