Biocider Miljøneutral vandbehandling i akvakultur...5 1. Forord Dette projekt om miljøneutral vandbehandling i akvakultur (MST-667-00199) blev gennemført i perioden juli 2015 til

Biocider Miljøneutral

vandbehandling i akvakultur

Bekæmpelsesmiddel-forskning nr. 178 November 2018

2 Miljøstyrelsen. Biocider / Miljøneutral vandbehandling i akvakultur

Udgiver: Miljøstyrelsen

Forfattere: Lars-Flemming Pedersen,

Aleix Pinyol Gallemí, Paula Rojas-Tirado,

Marja Koski.

DTU Aqua

ISBN: 978-87-7038-010-2

Miljøstyrelsen offentliggør rapporter og indlæg vedrørende forsknings- og udviklingsprojekter inden for miljøsektoren,

som er finansieret af Miljøstyrelsen. Det skal bemærkes, at en sådan offentliggørelse ikke nødvendigvis betyder, at

det pågældende indlæg giver udtryk for Miljøstyrelsens synspunkter. Offentliggørelsen betyder imidlertid, at Miljøsty-

relsen finder, at indholdet udgør et væsentligt indlæg i debatten omkring den danske miljøpolitik.

Må citeres med kildeangivelse.

Miljøstyrelsen / Emne / Titel på rapport 3

Indhold

1. Forord 5

2. Sammenfatning 6

3. Extended Summary 9

4. Introduktion 12

4.1 Baggrund: Pereddikesyre forekomst og virkemåde 12

4.2 Pereddikesyre og vandbehandling i akvakultur 13

4.3 Formål og hypoteser 14

4.4 Forsøgstilgang og arbejdspakker 15

5. Sammenligning af puls-dosering og kontinuerlig dosering af

pereddikesyre 19

5.1 Indledning 19

5.2 Materialer og metoder 19

5.3 Resultater 20

5.4 Diskussion 21

6. PES dosering i tankforsøg med RAS vand 22

6.1 Indledning 22


6.3 Resultater og diskussion 26

6.4 Konklusioner 33

7. Dosis-respons forsøg med heterotrofe dinoflagellater 34

7.1 Indledning 34


7.3 Resultater 35

7.4 Diskussion 35

8. Undersøgelser af pereddikesyre toksicitet 37

8.1 Baggrund 37

8.2 Materialer og Metoder 37

8.3 Resultater og diskussion 40

9. Mesocosm experiment 43

9.1 Background and objectives 43

9.2 Material and methods 43

9.3 Results 46

9.4 Conclusions 51

10. Kontinuerlig dosering af pereddikesyre på kommercielle dambrug 52

10.1 Indledning 52

10.2 Traditionelt dambrug med kontinuerlig PES dosering i fødekanalen 52

10.3 Model 3 dambrug med kontinuerlig PES dosering i en produktionsenhed 53


10.4 Konklusioner 55

11. Biological control of toxic microalgae 56

11.1 Background and hypothesis 56

11.2 Material and methods 56

11.3 Results 57

11.4 Conclusions 60

12. Konklusioner 61

13. Perspektivering 63

14. Referencer 64

5

1. Forord

Dette projekt om miljøneutral vandbehandling i akvakultur (MST-667-00199) blev gennemført i

perioden juli 2015 til september 2017 og er finansieret af Miljøstyrelsens program for forskning

i bekæmpelsesmidler.

Projektet blev udført som et samarbejde mellem DTU Aqua, sektionen for Akvakultur (Hirts-

hals) og DTU Aqua, sektionen for Oceaner og Arktis (Charlottenlund).

Forsøgene er udført ved DTU Aquas faciliteter i Hirtshals og i Charlottenlund.

Tak til følgende personer der har været involveret i projektets gennemførelse ved DTU Aqua:

Ole Madvig Larsen, Rasmus Frydenlund Nielsen, Dorthe Frandsen, Ulla Sproegel, Brian

Møller samt Dibo Liu (IGB; Berlin), og tak til Henrik R. Andersen for muligheden for at lave

toksicitetstest på DTU Miljø, Lyngby.

Tak til medlemmerne af følgegruppen ”Pesticider og genteknologi” for kommentarer og forslag

i projektperioden: Henrik Frølich Brødsgaard (Miljøstyrelsen) Pia Haugaard Jensen (Miljøsty-

relsen), Kristian Koefoed Brandt (Institut for Plante- og Miljøvidenskab, Københavns Universi-

tet) og Jes Vollertsen (Institut for Byggeri og Anlæg, Aalborg Universitet).


2. Sammenfatning

Denne rapport indeholder resultater fra en række forsøg hvor effekt og konsekvenser af bru-

gen af pereddikesyre (PES) inden for akvakultur er blevet undersøgt. PES er et antimikrobielt

biocid der indgår som den aktive bestanddel i pereddikesyreholdige desinfektionsmidler. PES

anvendelsen i akvakultur har de seneste år vundet betydelig udbredelse herhjemme og i ud-

landet. PES-produkter er et effektivt desinfektionsmiddel til vandbehandling ved lave doser, let

nedbrydeligt og er på områder som miljøpåvirkning og arbejdssikkerhed mere fordelagtig end

formalin, der i dag er det primært anvendte desinfektionsmiddel.

PES kan være mere vanskeligt at anvende, og almene retningslinjer for ideel dosering (hvor

meget, hvor ofte og hvor i anlægget) er fortsat under udarbejdelse. Erhvervet anvender for-

skellige praktiske løsninger, blandt andet automatisk, kontinuerlig dosering af PES i en meget

lav koncentration. De praktiske erfaringer er generelt positive, men der foreligger ikke doku-

mentation om eventuelle utilsigtede bivirkninger ved denne relativt nye praksis.

I projektet er der lavet forskellige undersøgelser med PES og akvakulturvand, men forsøg i

kolber, i mesokosmos anlæg med zooplankton og i gennemstrømningsanlæg med fisk. Fælles

for forsøgene har været, at undersøge effekt, toksicitet, omsætning og effekt på den resulte-

rende vandkvalitet af PES ved forskellige doseringsformer, særlig med henblik på, at vurdere

betydning af kontinuerlig PES-dosering ved lav dosering.

Rapporten indeholder også resultater af PES dosering på dambrug, og om PES toksicitet på

tre trofiske niveauer. Endeligt er der resultater fra forsøg med zooplankton som alternativ bio-

logisk bekæmpelse af giftige mikroalger. Nedenfor er de væsentligste resultater fra delprojek-

terne opsummeret.

1) Et sammenlignende PES doseringsstudie i 200 liters tanke med fisk under kontrolle-

de betingelser viste, at PES puls-dosering og kontinuerlig dosering med PES ikke

påvirkede regnbueørreders vækst eller overlevelse negativt i forhold til en ikke be-

handlet kontrolgruppe (Kap. 5). Forsøget viste, at pulsdosering med PES udløste

større initial stress respons hos fiskene sammenlignet med kontrol fisk og fisk konti-

nuerlig eksponeret for lav PES dosering. Forsøget viste også, at lavkoncentreret kon-

tinuerlig PES dosering tilsyneladende fremmede biofilm vækst i bunden af karret.

Den observerede biofilm tilvækst har ikke entydigt kunnet eftervises i senere forsøg,

og skyldes sandsynligvis, at den doserede PES mængde var for lavt til at opretholde

en antimikrobiel effekt (Kap. 5).

2) Et forsøg med vand fra et recirkuleret akvakultur system (RAS) overført til 12 statiske

tanke viste, at PES doseringsformen havde afgørende effekt på den bakterielle aktivi-

tet i vandfasen og i biofilmen. Forsøget bestod af 4 behandlingsgrupper: daglig puls-

dosering (1,05 mg PES/l), kontinuerlig lav dosering (0,35 mg PES/l); kontinuerlig høj

dosering (1,05 mg PES/l) og kontrol (Milli Q). Forsøget varede i 18 dage og viste sig-

nifikante effekter af PES doseringsformen på den resulterende vandkvalitet (Kap. 6).

Efter 2 uger var vandets indhold af mikropartikler signifikant forhøjet (p <0,001) i de

tre tanke der modtog høj kontinuerlig PES dosering i forhold til de øvrige tre grupper

der var på sammen niveau. Der var en fordobling i antallet af mikropartikler mellem 1-

2 µm som følge af bakteriel vækst.

7

Tilsvarende var den bakterielle aktivitet i vandfasen og i biofilmen signifikant højere i

de samme 3 tanke (p < 0,01) der dagligt modtog en dosis på 1,05 mg PES·l-1

·dag-1

kontinuerlig doseret PES sammenlignet med de 3 andre behandlingsgrupper. Desin-

fektionsbehovet (illustreret ved hurtig omsætning af hydrogen peroxid (HP) målt ved

HP spikeforsøg i tankene) var også højst i disse tre tanke (p<0,001) der gennem 18

dage havde modtaget kontinuerlig PES svarende til 1,05 mg·l-1

pr dag (Kap. 6.2).

Resultaterne viser, at der kan opstå uhensigtsmæssige forandringer i vandfase og i

biofilmen ved kontinuerlig PES dosering i stillestående anlæg med minimal vandskif-

te, og at tilsætningen af desinfektionsmidlet kan føre til øget bakteriel vækst og aktivi-

tet.

3) Et dosis-respons forsøg med 3 niveauer af PES eksponering af heterotrofe dinofla-

gellater (HD) viste, at der skulle en høj dosis (7,5 mg PES /l som enkelt pulsdosering)

eller daglige gentagne doser af 1.5 mg PES/l for at holde antallet af levende HD nede

(Kap. 7). Det blev også vist, at HD laver beskyttende hvilecyster som tilsyneladende

kan ligge i dvale ved ugunstige betingelser (PES og fødeknaphed) for sidenhen at

blomstre op (Kap. 7). Forsøget viste, at HD kontrol med PES umiddelbart er vanske-

ligt at udføre i RAS da de nødvendige effektive PES koncentrationer ikke er foreneligt

med normal drift af RAS (hensyn til fisk og biofilter)

4) Delprojekt 4 belyste toksiciteten af PES og HP ud fra standardiserede PES ekspone-

ringsforsøg med bakterier, alger, vandlopper og dafnier med sammenhørende data

for hæmning og overlevelse, hhv. EC50 og LC50. Det blev vist, at PES er mere potent

sammenlignet med HP på alle tre trofiske niveauer; EC50 for bakterierne var 0,08 mg

PES/l mens den tilsvarende subletale effekt (EC50) ved HP eksponering indtrådte ved

10 mg H2O2/l (faktor 125). For fersk og saltvandsalgerne var EC50 hhv. 0,25 og 1,38

mg PES/l. Den letale effekt af PES over for zooplankton-arterne vandloppe og dafnie

(LC50) var 0,47 og 0,77 mg PES/l, til sammenligning med værdier for brintoverilte på

hhv. 2,94 og 3,44 mg HP/l (Kap. 8).

5) To statiske tankforsøg (mesokosmos forsøg, Kap. 8) med algeholdigt vand fra en

akvakultur plantelagune viste, at puls og kontinuerlig PES dosering påvirkede forhol-

det mellem autotrofe og heterotrofe mikroorganismer. Det ene forsøg viste, at PES

omsætningshastigheden blev forøget over tid ved gentagne doseringer i de lukkede

forsøgstanke.

6) Delprojekt 6 omhandlede to undersøgelser af kontinuerlig PES dosering på kommer-

cielle dambrug (et traditionelt jorddambrug og et recirkuleret model 3 anlæg). I begge

eksempler var det muligt at dosere PES i den anbefalede koncentration (ca. 0,15 mg

PES/l) til effektiv bekæmpelse af parasitter. I begge anlæg blev der dokumenteret be-

tydelig PES omsætning i dammene/raceways og der skete ikke en ophobning af PES

i løbet af doseringsperioden. Forsøgene viste også, at langtidsdosering (4 uger) kun-

ne opretholde konstante PES niveauer, uden at påvirke biofiltrene (uændret nitrifika-

tion og PES nedbrydning).

7) Delprojekt 7 bestod af forsøg med dafnie og vandlopper med henblik på at undersø-

ge potentialet for alternativ biologisk bekæmpelse af giftige mikroalger. Forsøgene vi-

ste, at zooplankton (ZP) kunne trives under realistiske betingelser og samtidig redu-

cere antallet af mikroalger, såvel harmløse som giftige heterotrofe dinoflagellater.


I rapporten diskuteres betydningen af de nye resultater, sammenholdt med andre nye under-

søgelser. Pulsdosering med PES, som kan være tidskrævende og kan påføre fiskene forbigå-

ende stress (Liu et al., 2017), har vist sig fortsat at være en effektiv metode til vandbehandling,

hvor risikoen for overdosering efterhånden er reduceret. Kontinuerlig PES dosering har en

række fordele og er praktisk muligt i forskellige anlægstyper (Pedersen og Henriksen, 2017).

Der er dog en risiko for underdosering hvis doseringskoncentrationen er for lav, og derved

ophører den forventede effekt og kan i særlige tilfælde tilsyneladende øge den bakterielle

vækst og aktivitet (i vandfasen og i biofilmen).

Anvendt korrekt er pereddikesyre i mange henseender et godt alternativ til formalin. Fisk og

biofiltre sætter en naturlig øvre grænse for doseringsmængden af PES og det indebærer også

at de anvendte koncentrationer (typisk < 1 mg PES/l) ikke umiddelbart forekommer problema-

tisk for vandmiljøet når opholdstid og omsætning tages i betragtning. Vandbehandling med

PES kan imidlertid ikke kontrollere alle parasitter, hvor især gælleamøber, costia og visse

heterotrofe dinoflaggellater, som alle typisk optræder ved høj forekomst af organisk materiale,

fortsat er vanskelige at få bugt med. Denne udfordring kræver forbedrede vandbehandlings-

strategier eventuelt med supplerende brug af brintoverilte eller ozon, men kan også imødegås

ved at teste og implementere anden renseteknologi (eks. proteinskimmere til reduktion af

suspenderet stof) eller udvikle potentialet for biologisk kontrol i større skala.

9

3. Extended Summary

This report describes results from various aquaculture related experiments where effects and

consequences of the use of peracetic acid (PAA) were investigated.

PAA is an antimicrobial biocide and the main active agent in peracetic acid disinfection prod-

ucts (acidic mixtures of hydrogen peroxide, acetate, PAA and water). PAA application in aqua-

culture has increased extensively in recent years both in volume and scope in Denmark. PAA

is an effective disinfectant at low doses and used for several water treatment purposes and as

it degrades easily and is relative safe work wise, is possesses important abilities to replace

formalin (formaldehyde) which is today the primary aquaculture disinfectant used. In some

situations, PAA is more complicated or less efficient to use than formalin and general guide-

lines for ideal PAA dosage (how much, how often and where in the plant) are still being devel-

oped. The aquaculture industry applies various practical solutions, including pulse dosing and

automatic, continuous dosing of PAA at a very low concentration. Practical experiences with

pulse dosing of PAA are positive, but there is still limited documentation of any potential unin-

tended side effects in this fairly new water treatment practice.

In the project, various controlled studies were carried out with PAA and aquaculture water,

both batch scale experiments, static mesocosmos trials with zooplankton as well as investiga-

tions with fish in flow-through experimental set up. Investigations of PAA toxicity, degradation

fate, effect and consequences on the water quality were made in regards to different modes of

dosing, particularly in relation to continuous PAA dosing at low concentration. The report also

contains results from PAA dosing studies on two commercial fish farms and data of PAA in

vitro toxicity at three trophic levels. Finally, experiments were performed to investigate the

potential of zooplankton as alternative biological control of toxic microalgae. The most im-

portant results and conclusions are summarized below.

1) A comparative PAA dosing study in 200 liter tanks with controlled conditions showed

that PAA pulse dosing or continuous dosing with PAA did not adversely affect rain-

bow trout growth or survival compared to an untreated control group (Chapter 4). The

trial showed that the stress response (cortisol excretion) was significantly elevated

among the fish in the PAA pulse dosing groups compared to the stress response

from control fish and fish continuously exposed to low dosage PAA. The experiment

also indicated that continuous PAA dose apparently enhanced biofilm growth at the

surface of the experimental tanks. The observed biofilm growth has not been clearly

demonstrated in previous trials, but may be a result of bacterial regrowth opportuni-

ties at PAA concentrations insufficient to pose an antimicrobial effect (Chapter 4).

2) An experiment with water from a recirculating aquaculture system (RAS) divided into

12 static tanks showed that mode of PAA application had a significant decisive effect

on bacterial activity in the water phase and in the biofilm. The trial consisted of 4

treatment groups according to PAA application mode: Daily pulse dosing (1.05 mg

PAA/L), continuous low dose (0.35 mg PAA/L); continuous high dose (1.05 mg

PAA/L) and control (Milli Q) as described in Chapter 5. After 2 weeks, the number of

micro-particles in the water was significantly elevated (p <0.001) in the three tanks

receiving high continuous PAA doses compared to the other three groups which were

at equal level. There number of micro-particles (1-2 μm) doubled in the same treat-

ment group due to bacterial (re)growth.


Correspondingly, the bacterial activity in the water phase and in the biofilm from the 3

three tanks receiving continuous high dose of PAA was significantly higher (p <0.01)

than in the 3 other treatment groups. The disinfection demand (illustrated by the rapid

degradation of hydrogen peroxide (HP) in the tank spiking experiments) was highest

in these three tanks (p <0.001) that had received continuous PAA equivalent to 1.05

mg/l per day for 18 days (Chapter 5). The results showed that unintentional changes

in water phase and biofilm can occur atcontinuous PAA dosing in closed systems

with minimal water change and that the addition of the disinfectant can lead to in-

creased bacterial growth and activity.

3) A dose-response trial with 3 concentration levels of PAA exposure to heterotrophic

dinoflagellates (HD) showed that single high dose pulse (7.5 mg/l PAA) or daily re-

peated doses of 1.5 ppm PAA / l kept the number of live HD suppressed (Chapter 6).

During unfavorable conditions (PAA and food shortages), HD was found to form new

protective resting cysts that were able to withstand transient PAA water treatment

and hence revitalize.

The experiment showed that HD control of PAA is very complicated, if at all possible,

in RAS as the effective PAA concentrations needed exceeds the safety threshold for

fish and biofilters.

4) Toxicity results of PAA and hydrogen peroxide (HP) based on standardized PAA ex-

posure tests with bacteria, algae, copepods and daphnia are presented in Chapter 7.

It was shown that PAA is more potent compared to HP at all three trophic levels; EC50

for the bacteria was 0.08 mg PAA/l whereas the corresponding sub-lethal effect

(EC50) at HP exposure occurred at 10 mg H2O2 / l (factor 125). Growth inhibition EC50

for freshwater and saltwater algae was 0.25 and 1.38 mg PAA / L, respectively. The

lethal concentration (LC50) of PAA on the two zooplankton species, copepods and

daphnia, was 0.47 and 0.77 mg PAA/l respectively, significantly lower compared to

hydrogen peroxide (LC50) values of 2.94 and 3.44 mg H2O2 /l (Chapter 7).

5) Two static tank mesocosmos experiments (Chapter 8) with natural occurring algae

communities from an aquaculture constructed wetland showed that pulse and contin-

uous PAA dosage affected the autotrophic and heterotrophic relationship. One of the

trials showed that the PAA degradation rate was increased over time after repeated

PES dosing in the closed test tanks.

6) Chapter 9 dealt with studies of continuous PAA on two commercial fish farms (a tradi-

tional flow-through farm and a so-called model 3 trout farm with water reuse). In both

systems, it was found that PAA could be continuously dosed and maintain the rec-

ommended concentration (~ 0.15 mg PAA / L) to achieve effective parasitic control.

Significant PAA degradation was recorded in the ponds and raceways and no accu-

mulation of PAA occurred during the dosing periods. The investigations also showed

that long-term dosing (4 weeks) could maintain constant PAA levels without affecting

biofilters (unchanged nitrification and PAA degradation).

7) Finally, Chapter 10 includes exploratory trials with daphnia and copepods in order to

investigate the potential of biological control of toxic microalgae as alternative to

chemical disinfection. The experiments showed that zooplankton could thrive under

simulated aquaculture conditions and at the same time reduce the number of micro-

algae, both harmless and toxic heterotrophic dinoflagellates.

11

The report discusses the importance of the new results combined with other new published

studies. Pulse dosing of PAA, has proven to be an effective method of water treatment where

the likelihood of overdosing has reduced markedly. Continuous PAA dosing has a number of

advantages and is practically possible in different types of rearing systems (Pedersen and

Henriksen, 2017). However, there is a risk of under-dosing if the quantity applied is too low or

the unintended degradation is too high, potentially leading to increased bacterial growth and

activity (in the water phase and in the biofilm) in exceptional cases.

When correctly applied, peracetic acid is in many respects a good alternative to formalin. Fish

and biofilters set a natural upper limit for the amount of PAA to be dosed. The low actual con-

centrations (typically <1 mg PAA / L) in combination with some retention time and fast degra-

dation of PAA, minimize the risk of potential release of residual PAA to the receiving water

bodies. However, water treatment with PAA cannot sufficiently control certain parasites (gill

amoebae and costia) and specific heterotrophic dinoflagellates, which typically occur at subop-

timal conditions with high levels of organic matter. This challenge requires improved water

treatment strategies, potentially addressed using supplementary HP or ozone. The challenge

can also be met by testing and implementing other treatment technologies (e.g. protein skim-

mers to remove suspended solids) or by further testing and developing the potential of large-

scale biological control using zooplankton.


4. Introduktion

4.1 Baggrund: Pereddikesyre forekomst og virkemåde

Pereddikesyre (PES) er et antimikrobielt biocid der indgår som den aktive bestanddel i pered-

dikesyre-holdige desinfektionsmidler der anvendes i en række forskellige industrier (Stampi et

al. 2001, Gehr et al., 2002; Wagner et al., 2002; Caretti and Lubello, 2003; Vinnerås et al.

2003; Kitis, 2004; Luukonen and Pehkonen, 2017). PES er godkendt under biocidforordningen

pr. 1/10-2017 til forskellige former for anvendelse (European Chemical Agency1)

PT1,2,3,4,5,6,11,12; alene i Europa produceres der langt over 1000 tons PES årligt (EU Che-

mical Agency, 2013a; ifølge Wessels and Ingmer, 2013). På globalt plan angives PES forbru-

get tilbage i 2013 at udgøre hhv 29·103 og 55·10

3 tons PES til hhv. spildevandsrensing og

fødevareindustrien ifølge Luukonen & Pehkonen,(2017).

PES er et kraftigt oxiderende biocid med en bred antimikrobiel effekt, høj reaktionsvillighed,

dannelse af frie radikaler som hydroxyl (OH•) og hurtig nedbrydning til CO2 og vand. PES fås

ikke i ren form, men findes udelukkende i syrestabiliserede blandingsprodukter af eddikesyre

og hydrogen peroxid (HP):

CH3COOH + H2O2 ← → CH3COOOH + H2O

EDDIKESYRE + HYDROGEN PEROXID PEREDDIKESYRE + VAND

I disse blandinger er PES koncentrationen fra 5-40 w/w % (typisk 10-15 %), mens brintoveril-

ten udgør 15-30w/w % og eddikesyren 10-30w/w% (Kitis, 2004; Muñio and Poyatos, 2010; Liu

et al.,2015,). PES produkter har været anvendt i mere end 60 år (Greenspan and MacKellar,

1951), og en lang række undersøgelser har dokumenteret høj desinfektionseffektivitet overfor

protozoer, skimmelsvampe, alger, bakterier, vira, sporer, cyster (Baldry, 1983; Baldry et al,

1991; Liberti and Notarnicola, 1999; Kitis, 2004; Muñio and Poyatos, 2010). PES er et langt

kraftigere biocid end det andet let nedbrydelige hjælpestoffer brintoverilte, er ligeledes virk-

somt ved lav temperatur og behøver betydelig mindre dosering sammenlignet med HP for at

opnå samme hæmningsgrad (Rajala-Mustonen et al., 1997; Finnegan et al, 2010; Flores et al.,

2014).

PES omsætning er ren kemisk (abiotisk) og påvirkes af tilstedeværelsen af organisk materiale,

pH og over-gangsmetaller (Yuan et al., 1997; Liu et al, 2014, Luukonen and Pekhonen, 2017).

PES virker både bakterie-dræbende og bakterievæksthæmmende og forskellige virkemåder er

belyst af Wessels & Ingmer (2013).

PES danner frie radikaler ved kontakt med organisk materiale og overgangsmetaller, og da

disse radikaler er meget reaktive er PES virkningen u-specifik, hvoraf følger at resistens mod

PES ikke er sandsynligt (EU 528/2012). Den celledræbende effekt er således en kombination

af den direkte oxidation af PES på cellemembran og spaltningen af sulfhydryl og disulfid grup-

per (hhv. -SH og S-S grupper) og C-C dobbelt-bindinger (Dröge, 2002; Wessels & Ingmer,

2013) samt de frie radikalers ødelæggelse af proteiner, enzymer og strukturer i cellemembra-

nen (; Block, 1991; Kerkaert et al., 2011). Særligt ødelæggelsen af enzymet katalase har væ-

ret foreslået som forklaring på PES og HP´s synergetiske effekt (Flores et al., 2014).

1 European Chemical Agency-LINK; http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX:32016R0672

https://echa.europa.eu/da/information-on-chemicals/biocidal-active-substances?p_p_id=echarevbiocides_WAR_echarevbiocidesportlet&p_p_lifecycle=0&p_p_col_id=column-1&p_p_col_pos=1&p_p_col_count=2&_echarevbiocides_WAR_echarevbiocidesportlet_rml_id=100.001.079

http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX:32016R0672

13

TABEL 1. Pereddikesyre (fra EU reg. 528/2012 Peracetic acid as-

sessment report, product- types 1-6)

CAS-No. 79-21-0

CAS name Ethaneperoxoic acid

EINECS-No. 201-186-8

Other No. (CIPAC, ELINC) Not available

IUPAC name, synonyms Common name: Peracetic acid

Synonyms: Acetyl hydroperoxide,

Ethaneperoxoic acid, Peroxyace-

tic acid

Molecular formula C2H4O3

Structural formula

Molecular weight (g/mol) 76.05 g/mol

4.2 Pereddikesyre og vandbehandling i akvakultur

Produktionsrelaterede fiskesygdomme og dødelighed kan ikke forhindres, men kan begræn-

ses ved sikring af god vandkvalitet. Udover mekanisk rensning og biologisk filtrering kan effek-

tive vandbehandlingsrutiner være med til at sikre en god, stabil vandkvalitet. Vandbehandling,

hvor desinfektionsmidlet tilføres vandfasen, kan være en regelmæssig, forebyggende strategi

der sikrer, at bakterier, skimmelsvampe, alger og parasitter kan holdes på et acceptabelt ni-

veau (Pedersen et al., 2013a; Murray et al., 2014; Verner-Jeffreys & Taylor, 2015).

Desinfektionsmidler kan også anvendes i perioder hvor produktionsbetingelserne ændres,

typisk i perioder hvor vandtemperaturen og indfodringen stiger. Eksempelvis kan en given

parasit have fået gunstige betingelser som funktion af temperaturen og niveauet af nærings-

stoffer og skal dermed kontrolleres. Forringet vandkvalitet kan også påføre miljøbetingede

gener eksempelvis gælleirritationer og forøget slimdannelse som kan afhjælpes med vandbe-

handling med desinfektionsmidler.

Til disse formål er desinfektionsmidlet formalin (indeholdende biocidet formaldehyd) meget

velegnet; det har en rigtig god effekt mod uønskede mikroorganismer og fiske-patogener

(Fish, 1940; Heinecke et al., 2009), virker bredspektret (Noble and Summerfelt, 1996), påvir-

ker ikke fiskene i de anvendte doser og er forenelig med drift af biofiltre (Pedersen et al, 2009).

Formalin er med et årligt forbrug på ≥ 250.000 liter på danske dambrug det mest udbredte

desinfektionsmiddel der anvendes til vandbehandling på dambrug (Miljø- og Fødevareministe-

riet, 2017). Dette forbrug ønskes reduceret eller ophørt af hensyn til arbejdssikkerhed 2F

2 og miljø

(Masters, 2004; Wooster et al., 2005, EU Biocidforordning, 528/2012; Henriksen, 2015).

Her kommer det let nedbrydelige desinfektionsmiddel – pereddikesyre ind i billedet som et

muligt alternativt vandbehandlingsmiddel. PES har veldokumenteret antimikrobiel virkning

(Kitis, 2004), og er prismæssigt (18-20 kr./liter) et billigere alternativ til mere avancerede for-

mer for vandbehandling som UV og ozon (Janning et al., 2012).

2 PES Arbejdssikkerhed

Pereddikesyre produkterne er klassificeret som værende ætsende og er farlig ved indånding, ved hudkontakt og ved indtagelse. Brug af handsker og værn i forbindelse med påfyldning er obligatorisk. I tilfælde af stoffet kommer i kontakt med øjnene skylles med rigelige mængder vand og lægen kontaktes. Sikkerheds blade følger enkelte pro-dukters. Se endvidere Peckacek et al, 2015.


I traditionelle dambrug (gennemstrømningsanlæg) er det typisk gælle- og hudsnyltere (Hei-

necke et al., 2009) der kan holdes nede med desinfektionsmidler. I lavteknologiske åbne recir-

kulerede anlæg såvel som i de mest avancerede recirkulerede anlæg kan der være problemer

med forskellige fiskeparasitter (Jørgensen et al., 2009; Jokumsen & Svendsen, 2010; Martins

et al., 2010; Jafar et al., 2015), forhøjet og svingende indhold af bakterier og udbrud af giftige,

heterotrofe dinoflagellater, såkaldte giftige ”mikroalger” (Moestrup et al., 2014). Flere af forhol-

dene har vist sig delvist, at kunne kontrolleres med pulsdosering eller kontinuerlig dosering af

pereddikesyre.

Pereddikesyre har en række velegnede egenskaber, der gør det til et interessant vandbehand-

lingsmiddel i akvakultur. Som følge af den relativt korte årrække produktet har været anvendt

til akvakultur, er erfaringsgrundlaget fortsat begrænset, dog langt overvejende positiv i op-

drætserhvervet og blandt de praktiserende dyrlæger. Det forventes dog, at en yderligere øget

procesforståelse vil kunne medvirke til udvikling af endnu bedre vandbehandlingsrutiner og

sikre at der ikke udledes restmængder der kan påvirke recipienten negativt.

4.3 Formål og hypoteser

Formålet med projektet var, at generere ny viden omkring pereddikesyrens virkemåde i akva-

kultur sammenhænge, og undersøge om der er risiko for uhensigtsmæssige effekter ved nye

former for PES anvendelse. Ligeledes at vurderetoksikologiske effekter af PES i fersk- og

saltvandved hjælp af kontrollerede forsøg sammenholdt med nyere litteratur. Med baggrund i

den ny viden, vil det på et mere sikkert grundlag kunne lade sig gøre, at identificere de bedst

egnede doseringsformer der er effektive, sikre og har mindst mulig negativ effekt på fiskevel-

færd og vandmiljø. Projektets formål var ligeledes at undersøge nye biologiske metoder til at

sikre stabil, god vandkvalitet i intensivt recirkulerede anlæg, der vil kunne reducere det samle-

de forbrug af biocider.

Med projektet ønskes det, at belyse forhold omkring doseringsformen og brugen af pereddike-

syre. Engangstilsætning (puls -dosering) sammenlignes med kontinuerlig pereddikesyre dose-

ring. Her vil forhold omkring ændringer i PES omsætningen og effekter af PES på den resulte-

rende vandkvalitet blive undersøgt.

PES koncentrationen i udledningen fra dambrug forventes at være lave som følge af PESs

hurtige omsætning og opholdstiden i anlæggene. I stedet for at anvende PES vil det blive

undersøgt om biologisk kontrol (græsning af giftige alger og heterotrofe dinoflagellater) kan

være en isoleret eller supplerende løsning, der vil kunne nedbringe behovet for brug af biocid i

situationer med heterotrofe dinoflagellater, der er vanskelige at kontrollere med PES i recirku-

lerede akvakultur systemer (RAS).

Pereddikesyre minder om ozon, begge med et højt oxidationspotentiale; begge biocider er

væsentlig mere potente end brintoverilte, og fælles for de stoffer er, at de alle tre er relativ let-

nedbrydelige. Forskellen mellem PES og de to biocider er imidlertid, at den aktive komponent

nedbrydes til acetat der samtidig følger med handelsvaren i en ikke ubetydelig koncentration.

PES produkter indeholder således både 2 antimikrobielle komponenter (PES og HP) men

også let-omsættelig, energirigt substrat (eddikesyre/ acetat) med genvækstpotentiale. Der er

således paralleller til både methanol og formalin som også er antimikrobielle og kan fungere

som substrat for bakterier i vandfase og biofiltre (Hamlin et al., 2008; Pedersen et al., 2009).

Såfremt der doseres i tilstrækkelig høj dosis vil den antimikrobielle effekt af PES (og HP) med-

føre en eliminering af bakterierne, hvilket er tilfældet når stoffet doseres i større mængder på

en gang (pulsdosering). Det samme gør sig gældende ved kontinuerlig PES dosering, såfremt

der kan opretholdes residual-niveauer af PES og HP i den behandlede volumen. Det er imid-

lertid ikke undersøgt om PES underdosering (for lav dosis og/eller for høj utilsigtet omsætning

15

på grund af organisk materiale) kan føre til en situation hvor sub-inhibitorisk PES dosering

kommer til at favorisere bakterier, der kan udnytte acetat og dermed føre til bakteriel vækst.

Projektets primære hypoteser var:

1) At kontinuerlig dosering med PES kan påvirke den resulterende vandkvalitet på flere

måder (uændret; reduceret eller øget bakteriel forekomst og aktivitet samt PES kon-

centration; se Fig. 1).]

2) At PES’s kraftige oxidative virkning ved pulsdosering hæmmer bakterievæksten, men

ikke har en længerevarende effekt i lukkede anlæg med lang opholdstid;

3) At PES inducerer ændringer i den mikrobielle samfundsstruktur over tid;

4) At zooplankton kan anvendes til græsning af uønskede mikroalger og heterotrofe di-

noflagellater som et alternativ til desinfektionsmidler.

FIGUR 1. Hypotetiske scenarier for PES koncentrationen ved kontinuerlig lavdosering af PES.

Såfremt PES oxiderer og forbruger dele af den organiske pulje bliver omsætningsraten lang-

sommere over tid og PES konventrationen stiger (rødt kurveforløb). Ved underdoseringsker

der en bakteriel vækst som følge af utilsigtet substrattilskud og derved øges mængden af

bakterier og/eller aktiviteten heraf som øger desinfektionsbehovet og får omsætningen af PES

til at foregå hurtigere (grøn kurve).

4.4 Forsøgstilgang og arbejdspakker

Projektets forskellige delprojekter indeholdt 5 forsøg med puls- og kontinuerlig dosering af

PES i akvakulturvand (Tabel 2). Hertil kom forsøg med PES dosis-respons forsøg med forskel-

lige trofiske niveauer samt separate forsøgsrækker med zooplankton som alternativ til PES.


De 3 arbejdspakker (Fig. 2) bestod af 7 afgrænsede del-projekter som var lavet i direkte eller

delvis tilknytning til indeværende projekt, og som er afrapporteret enkeltvis.

FIGUR 2. Projektets arbejdspakker; delprojekter er gengivet i tabel 2.

Metodevalget til vurdering af PES effekter på den resulterende vandkvalitet omfattede kemiske

og biologiske mål.

Analysemetoderne til at bestemme vandets indhold af organisk materiale som kemisk og bio-

logisk iltforbrug (COD og BI5) samt tørstof-bestemmelser bestod af traditionelle analyser.

Målinger omfattede også bestemmelse af antal og fordeling af mikropartikler (partikler mellem

1 og 50 µm) og nye hurtigmetoder til kvantificering af den mikrobielle vandkvalitet (produkt af

den bakterielle forekomst og aktivitet i vandet) og aktivitet i biofilm.

Metoder til bestemmelse af bakteriel aktivitet i opdrætsvand

Den ene metode – BactiQuant® er en patenteret og ISO godkendt hurtigmetode til bestemmel-

se af vandets bakterielle aktivitet (Rojas-Tirado et al. 2017). Princippet bag metoden er føl-

gende: en veldefineret vandvolume filteres gennem at 0,2 µm filter. Filterkagen, med de tilba-

geholdte frie og partikelbundne bakterier eksponeres for en kendt mængde fluorescerende

substrat der omdannes som funktion af enzymaktiviteten (hydrolase) og eksponeringstid. Fluo-

rescens intensiteten måles og ved at korrigere for baggrundsfluorescens, temperatur, prøve-

volumen og eksponeringstid fås en kvantitativ værdi – BactiQuant-værdi – der repræsenterer

summen af vandprøvens bakterier og deres aktivitet. Ud over at være hurtig (ca. 30 minutter

fra prøveudtagning til måleresultat) i forhold til BI5 analyser og traditionel pladespredning, har

metoden den fordel at der fås et udtryk for den samlede bakterielle aktivitet.

Metoden inkluderer summen af enkelt-bakterier og bakterie på partikeloverflader som plade-

spredning ikke tager højde for. Rent, næringsfattigt vand har således få partikler/bakterier og

får derved en lav BQV (Pedersen et al., 2017). Nedenfor ses et eksempel på BQV-målinger på

akvakulturvand (Fig.3).

AP 1 AP 1

Pulsdosering og kontinuerlig pereddikesyre-dosering (vandkvalitet og bakteriel aktivitet)

AP 2 AP 2

Miljømæssige konsekvenser og økotoksikologi (alge/protozoa)

AP 3 AP 3

Potentiale for biologisk kontrol af mikroorganismer

17

FIGUR 3. Eksempel på bestemmelse af bakteriel aktivitet i vand fra et recirkuleringsanlæg

målt med BactiQuant.

Førprøver blev udtaget til tiden 0 og 2 timer fra begge grupper. TDen ene gruppe udsættes for

PES pulsdosering (tilsat ved T= 3 timer) svarende til 8 mg PES/l , mens der i kontrolgruppen

tilsættes samme mængde destilleret vand. Den stiplede kurve angiver koncentrationsforløb af

PES i kolben.

En anden metode, brintoverilte-assay, er baseret på tilsvarende antagelse om måling af en-

zymatisk aktivitet som udtryk for en given prøves bakterieindhold og aktiviteten heraf (Iwase et

al., 2013; Arvin and Pedersen, 2015). Metoden kræver en kendt vandvolumen og en fast inku-

beringstemperatur (20 °C) hvortil der tilsættes veldefineret mængde brintoverilte svarende til

en nominal koncentration på 10 mg H2O2/l. Herefter udtages der delprøver til bestemmelse af

henfaldet af HP over tid. En volumen på 2,7 ml vandprøve overføres til 10 ml kuvette påfyldt

300 µl reagens der fikserer brintoverilten og given og farvedannelse der måles spektrofotome-

trisk. Reagenset består af pyridin-2,6-dicarboxylsyre og vanadium i sur opløsning (PVD) som

ved reaktion med H2O2 danner det farveabsorberende molekyle oxo-peroxo-pyridine-,6-

dicarboxylato-vanadate (OPDV) (Tanner & Wong, 1998). Der udtages en førmåling til korrekti-

on for baggrundsfarve, og prøver umiddelbart efter tilsætning og opblanding (1 min) og med

10-15 min intervaller i 45-60 minutter efter HP tilsætningen. Omsætningsforsøgene kan laves i

kolber med magnetomrøring eller beluftning eller i plastrør med omrøring på vandbad.

Henfaldsforløbet aftager eksponentielt (1°orden reaktion) og ratekonstanten k anvendes som

værdi for den bakterielle aktivitet. Metoden er ikke publiceret, men er testet og valideret i for-

skellige vandmatricer der viser, at henfaldsraten er stærkt korreleret til mængden af organisk

materiale målt som CODtotal og CODpart (Fig. 4).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

0 4 8 12 16 20 24

PA

A m

g/L

BQ

V

Hours

BQV -A - Control BQV - D - PAA mg PAA/L


FIGUR 4. Eksempel på H2O2 henfald i vandprøver med forskelligt indhold af organisk materia-

le målt som CODTOTAL.

Brintoverilte assayet er også testet på biofilm elementer med visse modifikationer. 5 bioele-

menter blev overført til 50 plastrør med 40 ml Milli-Q vand ved 20 °C. Der blev målt absorbans

med vand og reagenser forud for tilsætningen af HP (spike med C0 = 10 ppm H2O2) hvorefter

røret blev den faktiske HP start koncentration blev målt efter opblanding. Rørene blev herefter

centrifugeret(150 RPM) kun afbrudt ved prøvetagningerne til HP koncentrationsbestemmelse

efter 15, 30 og 45 min.

TABEL 2. Oversigt over arbejdspakker og del-projekter i projekt ”Miljøneutral vandbehandling”

Arbejdspakke Forsøgstilgang Behandling Måleparametre Aktivitet

1. Doseringsform,

vandkvalitet og mi-

krobiel respons

PES dosering i gennem-

strømstanke med regn-

bueørreder

Puls og kontinuerlig

(4+6 uger)

Fiske performance, vand-

kvalitet og biofilm

Delprojekt 1A

(Kap 5)

PES dosering i tanke med

vand fra akvakulturanlæg

Puls og kontinuerlig

(18 dage)

Bakteriel aktivitet i vand-

fase og i biofilm

Delprojekt 2

(Kap. 6)

Dosis-respons forsøg

med heterotrofe dinofla-

gellater

Pulsdoseringer

(6 dage)

Mortalitet Delprojekt 3B

(Kap. 7)

2. Miljømæssige kon-

sekvenser, meso-

cosmos og økotoksi-

kologi

Toksikologi-assays Pulsdosering

EC50 og LC50 Delprojekt 4

(Kap. 8)

Mesocosmos med alger Puls og kontinuerlig

(7 dage)

Autotrofe og heterotrofe

alger

Delprojekt 5

(Kap. 9)

Måling på dambrug Kontinuerlig dosering Residual koncentrationer Delprojekt 6C

(Kap. 10)

3. Potentiale for bio-

logisk kontrol af mi-

kroorganismer

Græsningsforsøg med

dafnier og vandlopper og

5 alge-arter

Biologisk kontrol Græsningsrater og

overlevelse

Delprojekt 7

(Kap. 11)

A: Liu, D., Straus, D. L., Pedersen, L. F., & Meinelt, T. (2017). Pulse versus continuous peracetic acid applications: Effects on rainbow trout performance, biofilm formation and water quality. Aquacultural Engineering, 77, 72-79. B: Pinyol-Gallemí, A. Koski, M. and Pedersen, L-F. Towards control of unwanted cyst-forming dinoflagellates in aquaculture systems: Knockout and recovery of Pfiesteria sp. after peracetic acid exposure (Manuskript) C: Pedersen, L. F., & Henriksen, N. H. (2017). Semi-continuously addition of peracetic acid to a flow-through fish farm. Journal of Cleaner Production, 142, 2606-2608.

19

5. Sammenligning af puls-dosering og kontinuerlig dosering af pereddikesyre

5.1 Indledning

Der findes endnu ikke studier der har undersøgt hvordan gentagen dosering af ensartede

mængde pereddikesyre (PES) kan påvirke opdrætsfisk og den resulterende vandkvalitet.

Denne viden kan have betydning for valg af vandbehandlingsstrategi og medvirke til bedre

forståelse af PES’s samlede virkning.

Pulsdosering omfatter en vandbehandlingsform hvor en veldefineret mængde PES hældes

direkte i anlægget på én gang. Mængden kan evt. deles og tilsættes flere steder, men behand-

lingen er karakteriseret ved at foregå hurtigt og hvor en puls af PES føres med vandet gennem

kummen/dammen. Ulempen med denne metode er at kontakttiden er kort; at dele af anlægget

risikerer, ikke at modtage den tilsatte mængde PES og, at fiskene kan reagere voldsomt ved

lokalt høje PES koncentrationer. Alternativt til dette kan være at tilsætte PES kontinuerlig via

en pumpe og et reservoir. Herved udjævnes koncentrationen af PES, med den risiko, at den

resulterende PES koncentration ikke er utilstrækkelig (subinhibitorisk effektiv).

I dette forsøg blev fiskenes respons overfor de to nævnte doseringsmetoder sammenlignet

gennem en 10 uger periode hvor 6 uger var med PES eksponering (Liu et al., 2017). Udvalgte

vandkvalitetsparametre (ilt, pH, ammonium, nitrit og nitrat) blev sammen med målinger af

fiskenes stress respons fulgt gennem perioden.

5.2 Materialer og metoder

Der blev anvendt ni ens 180 liters gennemstrømningstanke (fordøjelighedsanlæg) hver med et

vandskifte på 20 liter ferskvand i timen. I hvert anlæg blev der isat 18 regnbueørreder (110-

125 g/styk) svarende til en tæthed på ca. 12 kg/m3. Hver dag under forsøgets 10 uger blev der

dagligt fodret 0,8 % foder i forhold til fiskebiomassen. Fiskene havde forinden været i salt-

vandskarantæne, før de blev overført til tankene og ydermere akklimatiseret i 4 uger før ek-

sponering til PES . Der blev etableret tre grupper (N=9):

Puls dosering af PES: 2 gange ugentlig blev der tilsat PES svarende til 1 mg PES/l

Kontinuerlig dosering af PES: kontinuerlig tilsætning af 0,2 mg PES/l til indløbsvandet

(20 l/time)

Kontrolgruppe (modtog Milli-Q uden PES)

Disse grupper blev herefter fulgt gennem en 6 ugers periode med ovennævnte PES tilsætning,

med fastlagte målinger af vandkvalitet og stressmarkører herunder kortisol i vandfasen (Liu et

al., 2017).


5.3 Resultater Forsøget viste helt overordnet, at begge PES doseringsformer ikke påvirkede fiskene sam-

menlignet med fiskene i kontrolgruppen. Fiskenes tilvækst var ens (foderkonvertering på 0,70

kg foder pr. kg fisk) og i alle tankene var der 100 % overlevelse. Pulsdosering med PES havde

en mærkbar effekt på fiskenes adfærd og stress respons idet kortisol udskillelse (op til 30 ng/l

kortisol målt i vandet) var væsentlig forhøjet i forhold til kontrol-gruppen (5-6 ng/l kortisol) og

gruppen med ørreder der modtog kontinuerlig PES (5-7 ng/l kortisol). Udskillelsen af stress-

hormonet var imidlertidig forbigående og allerede efter 3 uger var kortisoludskillelsen ens i alle

grupperne.

Der var også indikationer på utilsigtede følgevirkninger af længerevarende PES dosering.

Mens pulsdosering med PES reducerede og næsten forhindrede biofilm dannelsen (visuel

sammenligning med kontrol gruppen), var det modsatte tilfældet i anlæggene med kontinuerlig

PES eksponering: her blev der observeret øget biofilmdannelse på overflader (se Fig. 5).

FIGUR 5. Repræsentative billeder af biofilm dannet på plaststivere i bunden af tanke efter 6

ugers forsøg med pereddike-syredosering. Control = kontrol gruppe der ikke modtog PES;

Pulse treatment = gruppe der 2 gange ugentlig fik tilsat 180 mg PES pr. tank (svarende til 1

mg PES/l) som pulsdosering; Continuous treatment = gruppe der kontinuerligt fik tilført 0,20

mg PES/l friskvand, svarende til 96 mg PES pr. tank pr. dag. (Liu et al., 2017).

21

5.4 Diskussion

Forsøget viste, at de benyttede doseringsmængder af PES var praktisk mulige ouden at påfø-

re målbare negative effekter på fiskene. Den kontinuerlige dosering med PES, indebar at PES

i den opblandende vandfase var < 0,05 mg PES/l. Det medførte, at den tilførte PES mængde

tilsyneladende stimulerede bakteriel vækst., som har været nævnt som en potential sideeffekt

(Sanchez-Ruiz et al., 1995; Kitis, 2004).

Der er forskellige faktorer, der spiller ind, særligt vandets og anlæggets indhold af organisk

materiale, der reducerer effekten af desinfektionsmidlet (Pedersen et al., 2013; Luukonen og

Pehkonen, 2017) og opholdstiden i tankene. Disse forhold kan have betydning for dynamikken

af bakterier i vandfasen (opportunister; r-strateger;Blancheton et al., 2013; Attramadal et al.,

2014) og kolonisering på faste overflader/i biofilm (specialister; K strateger). Den observerede

tilvækst af biofilm stiller også spørgsmål ved under hvilke betingelser kontinuerlig PES dose-

ring er hensigtsmæssig.

Det bør således undersøges om hurtig omsætning af de antimikrobielle aktive bestanddele

(PES og H2O2) kan opstå mens acetatdelen (i PES produktet og nedbrydningsprodukt ved

PES omsætning) kommer til at virke som et utilsigtet substrat for bakteriel vækst i vand eller i

biofilm på faste overflader. Pågående undersøgelser af effekter ved kontinuerlig PAA dosering

på fisk, vandkvalitet og bakteriel genvækst forventes, at føre til bedre vandbehandlingsstrate-

gier (Rojas-Tirado, ikke. publ.; Davidson et al, 2017).


6. PES dosering i tankforsøg med RAS vand

6.1 Indledning

I kapitel 4 var der tegn på, at kontinuerlig dosering af pereddikesyre (PES) i akvakulturvand

tilsyneladende fremmer bakterievæksten (Liu et al., 2017). Ved forsøget over 10 uger blev der

observeret betydelig biofilm vækst på indvendige overflader i de kar der modtog en ganske

lav, kontinuerlig dosering af pereddikesyre. Kontrol kar uden vandbehandling havde en mode-

rat mængde biofilm, mens kar der fik tilført PES i form af pulsdosering havde mindst biofilm.

Sidstnævnte er også erfaret på kommercielle dambrug, hvor dambrugere har god erfaring med

rene sider på kummerne så længe PES doseres med en høj puls en gang dagligt (pers. obs).

Formål med dette forsøg var at undersøge om kontinuerlig PES dosering ændrer den bakteri-

elle aktivitet sammenlignet med kontrol grupper og grupper med to niveauer af puls dosering

af PES. Omsætningen af PES og brintoverilte foregår både i vandfasen og på overflader. Til at

undersøge PES og brintoverilte omsætningen i biofilm og eventuelle ændringer heraf over tid,

blev 40 biofilter-elemeter overført til 12 forskellige tanke. Til forsøget blev der anvendt næ-

ringsrigt og ensartet vand fra et recirkuleringsanlæg med regnbueørreder. Forsøgsopstillingen

blev tilrettelagt med henblik på at teste følgende 0-hypoteser

Den bakterielle aktivitet i vandfasen og i biofilmen påvirkes ikke af forskellige PES

behandlinger

Omsætningen af H2O2 i vandfase og i biofilm er konstant over tid

Omsætning af PES i vandfase og i biofilm konstant over tid


RAS anlæg

Der blev anvendt akvakulturvand fra et 8.5 m3 recirkuleret ferskvandssystem med ca. 150 kg

af 500 grams regnbueørreder (Fig. 6). Anlægget var stabilt og karakteriseret ved at have en

fast daglig foder mængde og et konstant vandskifte hhv. 1000 g foder og 1000 liter frisk-

vand/dag. Disse betingelser indebar at vandkvaliteten var stabil med hensyn til organisk ma-

teriale (opløst og partikulært COD), næringssalte (ammonium, nitrit og nitrat), pH, ilt og tempe-

ratur. De målte driftsværdier (se figurtekst til Fig. 6) var i samme størrelsesorden som værdier

målt på danske, kommercielle recirkulerede anlæg med høj grad af recirkulering.

23

FIGUR 6. Skitse af recirkuleret akvakultur anlæg der forsynede tankforsøget med næringsrigt

vand og aktive biofilteelementer. Ved forsøget var vandtemperaturen 8 °C, pH 7,4-7,6; alkali-

nitet ca. 100 mg CaCO3/l, mens total ammonium/ammoniak-N og nitrit-N var < 0,3 mg N/l;

nitrat-N 40-45 mg N/l og CODTOTAL ca. 50 mg O2/l. For oplysning om flow og rense-

komponenter, se Fernandes m.fl. (2017).

12 tanks opstilling

PES-eksponeringsforsøget bestod af 12 ens 30 liters plastbeholdere (Fig. 7). Tankene var

koniske med kuglehane i bunden som dagligt blev anvendt til vandskifte og tømning af sedi-

menteret organisk materiale. I alle tank var der isat en beluftersten i bunden med individuel

regulering af luft flow. Øverst i tankene var der placeret et metalkryds hvorpå der blev placeret

8 sæt af 5 aktive, koloniserede biofilter elementer fra RAS anlæggets moving bed biofiltre (Fig.

7). Bioelementerne var af typen RP Plast Neutral (www.rkbioelements.dk) med et overfla-

de:volumen forhold på 750 m2/m

3.

FIGUR 7. Opstilling med 12 individuelle 30-liters tanke med vand fra recirkuleret anlæg. Til

højre ses ophæng af RK Plast bioelementer (light) samt tilsvarende bioelementer overført til

50 ml plastrør®.

http://www.rkbioelements.dk/


Bioelementer var monteret på på vægtbelastede nylontråde. I alt blev 96 tråde med fem bio-

elementer lavet 2 dage før selve doseringsforsøget opstart (Dag 0) og opbevaret i RAS an-

lægget. Dagen før pereddikesyre doseringen blev de 12 tanke tilført 25 liter RAS vand og

bioelementerne blev overført.

Fra dag 0 til dag 14 blev der hver morgen aftappet 5 liter af vandet (svarende til 20 % af den

samlede volumen; opholdstid på 5 døgn) fra hver af de 12 tanke, efterfulgt af tilsætning af 4

liter nyt, ”frisk” vand fra det recirkulerede anlæg. Herefter blev yderligere 1 liter Milli-Q vand

tilsat, enten direkte (kontrolgruppe og gruppen med puls dosering af PES), eller tilsat kontinu-

erlig i løbet af 24 timer i de to forsøgsgrupper med hhv. lav og høj PES dosering. Efter vand-

skiftet blev PES tilsat direkte ned i de tre tanke med puls dosering, eller tilsat pumpereservoi-

ret til de 2x3 tanke der modtog kontinuerlig PES dosering (Tabel 3). Vandtemperatur, relativ

iltmætning og pH blev registreret dagligt ved brug af Hach Lange HQ40 multimeter (Tabel 4).

TABEL 3. Behandlingsgrupper bestående af tanke med RAS vand og bioelementer (N=12)

Behandlingsgruppe Pereddikesyre

koncentration..

Daglig dosering af Aqua Oxides

(4 l RAS vand)

Doseringsform

Kontrol 0 ppm 1000 ml MQ Puls (kl. 08:30)

Puls dosering 1,05 ppm 150 l Aqua Oxides + 1000 ml MQ Puls (kl. 08:30)

Lav kontinuerlig 0,35 ppm 50 l Aqua Oxides + 1000 ml MQ Kontinuerlig

Høj kontinuerlig 1,05 ppm 150 l Aqua Oxides + 1000 ml MQ Kontinuerlig

Prøveudtagning

Der blev udtaget vandprøver og biofilter elementer fra alle 12 tanke før (Dag 0) og hhv. 1 og 2

uger efter konstant dosering (se Tabel 4). Vandprøverne blev udtaget på en ens, standardise-

ret måde fra toppen af tankene. Bioelementer blev udtaget ved at klippe trådene over og for-

sigtigt overføre de 5 elementer til et 50 ml rør med 40 ml tempereret Milli-Q vand og deri fjerne

vægt og plastadskillere. Ved forsøgets afslutning (Dag 18) blev der tilsat H2O2 direkte i tanke-

ne med tilhørende vandprøvetagning.

Analyser

Vandets indhold af organisk materiale blev analyseret som hhv. kemisk og biologisk iltforbrug,

med måling af totalt indhold på ufiltrerede prøver og opløst indhold på filtrerede prøver. Parti-

kulært COD og BI5 er herefter beregnet som CODPART = CODTOT - CODDISS og tilsvarende for BI5-PART

= BI5-TOT – BI5-DISS Vandets partikelantal og fordeling blev målt på Beckman MultiSizer 4e Coulter

counter ved brug af et 1-50 µm apartur. Prøvevolumen blev fortyndet 1:15 og målt i triplikat.

Bactiquant® (Mycometer, Hillerød, Dk) er en standardiseret hurtig metode som udtrykker van-

dets indhold af bakterier og aktiviteten heraf. En konstant vandvolumen på 10 ml blev filtreret

gennem et 0,2 µm filter, og de tilbageholdte frie og partikel bundne bakterier på filtreret blev

herefter eksponeret i 30 minutter med et fluorescerende substrat som blev kvantificeret spek-

trofotometrisk og korrigeres efter temperatur (Reeslev et al, 2011).

Vandets bakterielle aktivitet blev også målt ud fra en nyudviklet metode der er baseret på

sammenhæng mellem bakteriel aktivitet og brintoverilte henfald som beskrevet i Arvin og Pe-

dersen (2015). Her blev 40 ml vandprøve overført til et 50 ml plastrør og placeret på vandbad

ved 22 °C.

25

Brintoverilte blev herefter tilsat i en koncentration på 10 mg H2O2/l. Nedbrydningen af brint-

overilten blev bestemt ved at udtage delprøver (2,7 ml i kuvette med 300 µl 4A reagens; Tan-

ner og Wong, 1998) efter ½, 15, 30 og 45 minutter og analysere koncentrationen spektrofoto-

metrisk ved 432 nm med korrektion for vandets egenfarve (førprøve). Omsætningsraterne blev

beregnet som 1. ordens ratekonstant k ud fra CT = C0*e-kT

, hvor CT = er koncentrationer efter

tiden T, og C0 er initialkoncentrationen.

Samme princip blev benyttet til kvantificering af biofilm aktivitet. Her blev 5 biofilter elementer

overført til 50 ml plastrør med 40 ml Milli-Q vand. Røret med bioelementer blev opbevaret på

vandbad ved 22 °C med omrøring på 150 rpm. På tilsvarende vis blev der udtaget vandprøver

til bestemmelse af brintoverilte (til tiden 1-15-30 og 45 min) til bestemmelse af ratekonstanten

k.

PES omsætningen i vandfasen blev estimeret ved at spike med 1.0 mg PES/l og udtage del-

prøver over tid (t= 1-10-20-30 og 45 min). Omsætningen af PES i biofilmen blev undersøgt, på

samme måde som ved brintoverilte, ved at overføre 5 bioelementer til et 50 ml rør med Milli-Q

vand og i tilsætte PES svarende til 1 ppm. Bioelementernes tørstof indhold blev målt ved at

udtage 5 bioelementer fra hver tank, overføre dem til 50 ml rør og gennemgå en oprensnings-

procedure med gentagen ultralydsbad og centrifugering, med opsamling af pellet i en kendt

volumen til efterfølgende opvarmning af mærkede, forvejede vials ved 105°C i 6 timer efter-

fulgt af tørring i eksikator og genvejning.

TABEL 4. Oversigt over målinger og analyser af vandprøver og bioelementer.

Parameter Enhed Behandling af vandprøve Analyse metode Måle periode Prøve- antal (N)

Temp. iltmætning og pH °C, %, pH Direkte måling Hach HQ40d Dagligt 168

Kemisk iltforbrug COD (total, opløst, partikulært)

mg O2/L Ufiltreret råprøve samt 0.22 µm filtreret prøve; syrekons. ved 4°C.

LCK 914, Hach Lange

Dag 0-7-14 2*36

Biologisk iltforbrug (5 dage) (total,opløst, partikulært)

mg O2/L Ufiltreret råprøve (total) samt 1,6 µm filtreret prøve (opløst)

WTW Oxi 340i Dag 0-7-14 2*36

BactiQuant BQV Måling på ubehandlede vandprøver

Mycometer Dag 0-7-14 36 serier

H2O2 omsætning i vand H2O2

decay

Måling af henfald over tid på ubeh. vandprøver

Arvin& Pedersen, mod.

Dag 0-7-14 36 serier

H2O2 omsætning i biofilm H2O2

decay

Bioelementer overført til rør HP henfald Dag 0-7-14

H2O2 omsætning i tank H2O2

decay

HP direkte i tank HP henfald Dag 18 12 serier

PES henfald i vandprøve PES

decay

Vandprøve overført til rør PES henfald Dag 0-7-14 36 serier

Partikel indhold # / ml Forfiltrering med 50 µm filter; fortynding af præve1:AA

Coulter counter Dag 0-7-14 36

Tørstof indhold i biofilm mg Ultralyd og centrifugering + varmeskab

Varmeskab Dag 14 12

EN 1899-2 CODPART = CODTOT - CODDISS


6.3 Resultater og diskussion

Bakteriel aktivitet og omsætning i vandfasen

I alle vandprøverne blev der målt et eksponentielt omsætningsforløb. Dagen før PES dosering

(dag 0) faldt brintoverilte koncentrationen fra ca. 10 mg H2O2/ liter til 7,9-8.3 mg H2O2/l i løbet

af 45 min i de 12 tanke. De omregnede omsætningsrater i vandet fra de 12 tanke lå mellem

0,275 og 0,283 time-1

, svarende til halveringstider på ca. 2½ time. Disse ensartede omsæt-

ningsrater var i samme størrelsesorden som i vand fra andre akvakulturanlæg med tilsvarende

relativt højt indhold af (partikulært) organisk materiale (Arvin og Pedersen, 2015) og indikerede

en ensartet opblanding og fordeling mellem de 12 tanke.

Efter 7 dage med 4 forskellige behandlinger med pereddikesyre var den bakterielle aktivitet

forandret. I de 3 kontroltanke som ikke modtog PES var den gennemsnitlige omsætningen

svagt reduceret (0,258 time-1

) og en større indbyrdes variation (fra 0,24-0,31 time-1

) var ind-

trådt. Dette gjorde sig også gældende for de 3 tanke med høj kontinuerlig RAS dosering, mens

den gennemsnitlige omsætningsrate var signifikant reduceret i gruppen med puls-dosering af

PES. Gruppen med lav PES dosering afveg ved at have en signifikant højere omsætningsrate

på 0,52 ± 0,02 time-1

).

Efter 2. uge blev der observeret en yderligere reduceret aktivitet i kontrol og puls doserings-

grupperne, mens gruppen med høj kontinuerlig dosering blev målt signifikant højere i forhold til

de øvrige tanke (p<0.001). Med omsætningsrater på > 0,7 time-1

(halveringstid på < 1 time)

var den bakterielle aktivitet i vandet i den gruppe således ca.3 gange større i forhold til værdi-

en på Dag 0 og fem gange større sammenlignet med omsætningsraterne i kontrolgrupperne.

Der ses endvidere en vis variation mellem de tre ens behandlede tanke (Fig. 8).

FIGUR 8. Bakteriel aktivitet i vandfasen angivet som ratekonstant for H2O2 (middelværdi ± st.

afv.) omsætning. Vandprøver er udtaget fra 4 grupper med følgende behandling i triplikat

(N=12); kontrol= ingen pereddikesyre; lav kontinuerlig PES dosering = 0,35 mg PES/l pr. dag;

kontinuerlig PES dosering = 1,05 mg PES/l pr. dag; puls= 1,05 mg PES/l tilsat en gang dagligt.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

Kontrol Lav kont. Høj kont. Puls

H2O

2 r

ate

konsta

nt

(tim

e -

1)

Behandling

Bakteriel aktivitet i vandfasen Dag 0

Dag 7

Dag 14

27

Resultaterne, baseret på middelværdierne fra 3 sande replikate tanke viste, at der skete mar-

kante ændringer i den bakterielle aktivitet efter både 1 og 2 uge. Det er en dynamisk proces,

hvor det først var de 3 tanke der modtog lav PES dosering der blev fundet at have en signifi-

kant forøgede aktiviteten; den efterfølgende uge var aktiviteten signfikant forøget i de 3 tanke

der modtog høj dose kontinuerlig PES dosering. Den forøgende aktivitet skete enten som

følge af en øget enzymatisk aktivitet (øget katalase aktivitet) eller som følge af bakteriel vækst

som et resultat af den kontinuerlige lettilgængelige kulstofkilde – acetat- som fulgte med desin-

fektionsproduktet.

Indeværende forsøg har ligheder med om nyt svensk studie, hvor actetat er doseret som puls

eller kontinuerligt til kolber med planktoniske bakterier fra søvand (Canelhas et al, In press).

Det svenske forsøg viser, at doseringsformen har afgørende betydning for udviklingen og

aktiviteten af bakterierne i vandfasen, og viser også at omsætningshastigheden af acetat er

forskellig. I vores forsøg, hvor vi både har PAA (som nedbrydes til acetat) og acetat og både

vand og biofilm er der således flere faktorer i spil, hvilket vanskeliggør en forklaring af indevæ-

rende resultater.

Den bakterielle aktivitet i vandfasen målt med BactiQuant viste ens værdierne før PES dose-

ring (Dag 0) indenfor og imellem behandlingsgrupperne (p>0,05). Niveauet afspejler et relativt

højt indhold af biologisk tilgængeligt materiale og bakteriel aktivitet (Rojas-Tirado et al, 2017;

Pedersen et al, 2017).

Efter den første uge blev der målt et generelt aktivitetsfald i alle 12 tanke (Fig. 9), sandsynlig-

vis foranlediget af en begrænset næringsstoftilførsel (20% vandskifte/dag med tilførsel af or-

ganisk materiale). Den efterfølgende uge (uge 2) var den bakterielle aktivitet reduceret yderli-

gere, med undtagelse af gruppen med høj kontinuerlig PES. Her måltes forøget bakterieaktivi-

tet på samme niveau som de ubehandlede tanke. Den forventede, inhiberende effekt af PES

var således ikke længere målbar ved kontinuerlig PES dosering efter 14 dage.


FIGUR 9. Måling af bakteriel aktivitet med BactiQuant i vandprøver fra 12 tanke inddelt i fire

forskellige typer behandling. Se Fig 8. for information ombehandlingsgrupper.

De to forskellige mål for bakteriel enzymaktivitet (Fig. 8 og 9) viste i begge tilfælde en forøget

aktivitet i de tre tanke med høj kontinuerlig dosering i uge 2. Dette underbygges også af parti-

kelmålinger af samme vandprøver (se Fig. 14).

FIGUR 10. Bakteriel aktivitet i biofilm er angivet som ratekonstant for H2O2 (middelværdi ± st.

afv.) omsætning. Biofilter elementerne (5 stk. RK plast) er udtaget fra alle 12 tanke med de 4

behandlinger, hvor kontrol= ingen pereddikesyre; lav kontinuerlig PES dosering = 0,35 mg

PES/l pr. dag; høj kontinuerlig PES dosering = 1,05 mg PES/l pr. dag; puls= 1,05 mg PES/l

tilsat en gang dagligt.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000


BactiQ

uant

(BQ

V)

Behandling

Bakteriel aktivitet i vandfasen (BactiQuant)

Dag 0

Dag 7

Dag 14

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0


H2O

2 ra

tekonsta

nt

(tim

e-1

)

Behandling

Bakteriel aktivitet i biofilm Dag 0 (før)

Dag 7

Day 14

29

Bakteriel aktivitet og omsætning i biofilm

Den bakterielle aktivitet var ens i biofilmprøverne, estimeret ud fra omsætningen af H2O2 under

standard betingelser ses i Fig. 10. Der var ensartet omsætning i alle 4 grupper før PES tilsæt-

ning (Dag 0) med 8-10 gange højere omsætningsrater sammenlignet med omsætningen i

vandfasen (Fig. 8). På Dag 0 (før-værdier) er den gennemsnitlige ratekonstant 2,7 time-1

,

svarende til en halveringstid på 15 minutter. Denne størrelsesorden var stort set uændret i

kontrolgrupper over 14 dage. I de tre tanke der modtog høj kontinuerlig PES dosering blev der

målt en kraftig og signifikant forøget omsætning på dag 7. Den efterfølgende uge var værdier-

ne atter tilbage på niveau med de øvrige behandlinger. Der blev ikke observeret målbar hæm-

ning i nogle af biofilter prøverne gennem hele perioden, hvilket indikerer at de anvendte desin-

fektionsmængder (normal til høj anbefalet dosis) ikke hæmmer bakterierne i større omfang i

biofilmen. Der er velkendt, at desinfektion af bakterier i biofilm kræver kraftigere PES dosering

(Sanchez-Vizuete et al., 2015), men bortset fra studiet af Liu et al (2017; kap. 4) er det er ikke

tidligere vist, at kontinuerlig PES dosering kan øge den bakterielle katalaseaktivitet i biofilmen.

FIGUR 11. Bakteriel aktivitet målt som H2O2 omsætning (mg H2O2 /l/time) ved spikeforsøg i

tanke (middelværdi ± st. afv.) udsat for 4 forskellige behandlinger, hvor kontrol= ingen pered-

dikesyre; lav kontinuerlig PES dosering = 0,35 mg PES/l pr. dag; høj kontinuerlig PES dose-

ring = 1,05 mg PES/l pr. dag; puls= 1,05 mg PES/l tilsat en gang dagligt.

Gruppen med høj kontinuerlig PES dosering har en signifikant (p < 0.001) højere enzymaktivi-

tet sammenlignet med de øvrige 3 grupper.

Ved forsøgets afslutning (Dag 18) blev der lavet H2O2 spike-forsøg i samtlige 12 tanke. Resul-

tater ses i Fig. 11, der viser, at tanke der gennem 2½ uge dagligt havde modtaget høj, konti-

nuerlig PES dosering gennem 18 dage havde en signifikant højere omsætning af HP (p <

0,01) i forhold til kontrol gruppen og de to øvrige behandlingersgrupper med PES.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00


H2O

2 o

msæ

tnin

g (

mg H

2O

2/l/tim

e)

Behandling



Resultatet viste, at gentagen vandbehandling i anlæg med lang opholdstid kan få en utilsigtet

effekt i form af øget bakteriel aktivitet og dermed større desinfektionsbehov. Da betingelserne

for alle 12 tanke var ens, kan den observerede forskel udelukkende tillægges PES tilsætning.

Ved den anvendte PES koncentration og vandets sammensætning indtrådte en situation, hvor

den tiltænkte inhiberende effekt blev opvejet af den utilsigtede substrat effekt som pereddike-

syre produktet ligeledes bidrager med. Det dynamiske samspil mellem biofilm og vandfase er

sandsynligvis forklaring på, at biofilter omsætningen aftager ved Dag 14 og øges i vandfasen,

om end dette ikke entydigt er eftervist her.

Omsætningen af pereddikesyre blev målt før PES dosering (Dag 0) og efter 1 og 2 uger med

daglig PES dosering (Fig. 12). Omsætningen foregik hurtigst på Dag 0 (1,95-2,05 time-1

) og

aftog ved efterfølgende målinger.

Det bemærkes, at der i gruppen med PES pulsdosering opstod stor variation indenfor de tre

ens behandlingstanke. I Puls-gruppen steg den gennemsnitlige omsætning af PES i vandfa-

sen på Dag 14; i 2 af tankene fordobles omsætningshastigheden, mens der i den tredje måltes

et fald på 10 %. Det ses også, at den første måling af PES koncentrationen efter PES spike er

konstant i kontrolgruppen, mens der i de tre PES grupper blev målt langsommere PES om-

sætning.

FIGUR 12. Omsætning af PES i vandfasen (ratekonstant; middel ± std. afv.) beregnet ved

tilsætning af 1 ppm PES til vandprøver fra 12 tanke over 14 dage.

Resultaterne for PES omsætningen i biofilmen viste var forbundet med en betydelig måleusik-

kerhed,da overførslen af bioelementer til plastrør medførte frigørelse af ”løs” biofilm der inter-

fererede med den benyttede PES analysemetode (måling af farvedannelse 20 sek. efter rea-

gens-tilsætning og omrystning).

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00


PE

S o

msæ

tnin

gsra

te (

tim

e-1

)

Behandling

Pereddikesyre omsætning i vandfasen

Dag 0

Dag 7

Dag 14

31

Organisk materiale

Vandets indhold af organisk materiale blev analyseret som kemisk og biologisk tilgængeligt

indhold, hhv. kemisk iltforbrug (COD) og biologisk iltforbrug over 5 døgn (BI5); Fig. 13. Puljede

vandprøver før PES tilsætning viste total COD på 31±1 mg O2/l, opløst COD på ca. 27±1 mg

O2/l, og partikulært COD på 4±1 O2/l, mens BI5-total var 2,9 O2/l, BI5-opløst var O2/l 1.1 og BI5-

partikulær var 1,8 mg O2/l.

FIGUR 13. Vandets indhold af organisk materiale målt i 3 fraktioner, hhv. total, opløst og parti-

kulært materiale.

Øverst er kemisk iltforbrug (COD) vist for de 4 behandlingsgrupper, og nederst det biologiske

iltforbrug (BI5).

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0


CO

D (

mg O

2/l)

COD-fraktioner - dag 14 Total

Opløst

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Kontrol Lav Høj Puls

BI 5

(m

g O

2/l)

BI5-fraktioner - dag 14 Total

Opløst


Partikelindhold

Vandets partikel indhold og fordeling blev målt i ved forsøgets begyndelse og ved afslutningen

(Dag 0 og 14).

Partikelfordeling på dag 0 viste, at > 93 % af alle partikler var < 2 µm og > 99,5% mindre end 5

µm. Dette forhold er velkendt fra recirkuleringsanlæg der på grund af den lange opholdstid og

intern partikelfjernelse med tromlefiltret medfører ophobning af såkaldte mikropartikler der ikke

kan fjernes (Patterson & Watts, 2003; Pedersen et al., 2017; Fernandes et al, 2017).

Figur 14 viser partikelantallet i de 12 tanke før (Dag 0) og efter daglige PES doseringer (Dag

14). I gruppen med høj kontinuerlig PES dosering ses en fordobling i partikelantal fra ca.

2,5*106 op til 4.1-5.5*10

6 stk/ml. I de tre tanke med PES pulsdosering (i samme mængde som

tilført ved Høj kontinuerlig PES) er der en yderst begrænset tilvækst i partikelantallet, hvilket

også blev fundet i 2 ud af de 3 vandprøver fra kontroltanke. Tankene med lav kontinuerlig PES

dosering lander tilsyneladende på et mellemniveau, hvor der i alle tre tanke er en målbar for-

øgelse på ca. 20 %.

FIGUR 14. Data for partikelindhold i vandprøver fra 12 tanke med akvakulturvand udsat for

forskellige pereddikesyre doseringer i 2 uger med hhv. lav kontinuerlig dosering (0,35 ppm

PES/døgn), høj kontinuerlig dosering (1,05 ppm PES/døgn), samt puls dosering (1,05 ppm

PES tilsat på en gang, hver formiddag, samt kontrol gruppen som ikke modtog PES). ** angi-

ver p< 0,001.

Partikelanalysen viste en signifikant (p < 0,001) tilvækst i små partikler, ssv. nydannede bakte-

rier i gruppen med høj kontinuerlig PES. Dette ses også i de tilhørende vandprøvers indhold i

form af partikulært BI5 (Fig. 13).

0,E+00

1,E+06

2,E+06

3,E+06

4,E+06

5,E+06

6,E+06

Part

ikel anta

l /m

l (#

> 1

µm

)

Dag 0

Dag 14**

33

På Fig. 15 ses biofilter elementernes tørstof indhold, som viser, at bioelementerne fra de tre

tanke med høj kontinuerlig PES dosering havde mere biofilm pr. biofilter element sammenlig-

net med de øvrige tre grupper, (p=0.16).

FIGUR 15. Tørstofindhold i biofilter elementer efter 2 ugers forskellig behandling i tanke med

akvakulturvand.

6.4 Konklusioner

Der blev fundet signifikante forskelle i omsætningen af brintoverilte som følge af PES dose-

ring. Forøget HP omsætning opstår ved øget enzymatisk aktivitet som kan skyldes tilpasning

på bakterieniveau og/eller en samlet vækst i bakterieantallet. Begge dele er uhensigtsmæssi-

ge konsekvenser af vandbehandlingen.

Omsætningen af brintoverilte (og dermed den bakterielle enzymaktivitet) var signifi-

kant højere i de tre tanke der dagligt havde modtaget kontinuerlig PES dosering i for-

hold til kontrol tanke uden PES dosering og tanke med puls dosering af PES.

Kontinuerlig PES dosering over 14 dage medførte forøget biofilm dannelse og signifi-

kant flere mikro-partikler sammenlignet med vandprøver fra kontroltankene ved for-

søgets afslutning.

Kontinuerlig dosering med PES førte i indeværende forsøg med statiske tanke (20%

vandskifte/dag) og akvakulturvand til øget bakteriel vækst i løbet af 14 dage.

Der foregår komplicerede dynamikker mellem bakterierne i vand og i biofilmen i for-

bindelse med PES dosering selv under kontrollerede betingelser. Det er derfor van-

skeligt at klarlægge mekanismerne under praktiske betingelse hvor faktorer som do-

seringsmængde, doseringsform, vandtype og opholdstid interagerer.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00


Mg t

ørs

tof per

bio

ele

ment

Biofilm på bioelementer - dag 14

Kontrol

Lav kont.

Høj kont.

Puls


7. Dosis-respons forsøg med heterotrofe dinoflagellater

7.1 Indledning

I recirkulerede brak- og saltvands akvakultur anlæg har der været eksempler på forekomst og

opblomstring af giftige mikroalger, såaldte heterotrofe dinoflagellater (Moestrup et al., 2014).

Da heterotrofe dinoflagellater (HD) som Pfiesteria er af en beskeden størrelse (10-15 µm) kan

anlæggenes mekaniske rensning (tromle-filtre med 40-60 my maskestørrelse) ikke fjerne disse

uønskede pathogener som findes i vandfasen.

Opblomstring af heterotrofe dinoflagellater kan føre til betydelige driftstab og derfor ønskes

metoder der dels kan forebygge men også kontrollere antallet af HD. Blandt de få anvendte

antimikrobielle biocider er pereddikesyre og kloramin-T (N-kloro para-toluenesulfonylamid)

forsøgt afprøvet (Moestrup et al., 2014).

Dette del-projekt belyste effekter og mekanismer af forskellige pereddikesyre doseringer over-

for en Pfiesteria stamme udført som in vitro forsøg over 6 døgn. Nærmere detaljer kan ses i

manuskript-udkast.


Den heterotrofe dinoflagellat Pfiesteria sp stamme CCMP2303 blev dyrket ved en salinitet på

12 ‰ og holdt i mørke ved 18°C. To gange ugentlig blev Pfiesteria sp kulturen beriget med

Rhodomonas salina som fødekilde i en koncentration på ca. 5000 celler per ml.

Selve eksponeringsforsøget foregik over en 5-døgn periode hvor Pfiesteria blev fordelt i 12

styk 75 ml inkubationsflasker og inddelt i 4 grupper. De 4 grupper afspejlede forskellige reali-

stiske PES doseringer, hhv. engangs- støddosering på 1.5 mg PES/l, daglig pulsdosering på

1.5 mg PES/l, engangs- støddosering på 7.5 mg PES/l og kontrol grupper uden PES ekspone-

ring.

Forud for PES eksponeringen og med veldefinerede intervaller under PES eksponeringen

(T=0, ½, 2, 24, 48, 72, 96, 120 timer) blev der udtaget delprøver fra samtlige flasker til kvantifi-

cering af antallet af hvilecyster samt levende og døde flagellater. Efter 5 døgn uden føde blev

der tilført Rhodomonas (t=120) hvorefter udviklingen blev fulgt til forsøgets afslutning ved

t=168 timer.

I effektvurderingen blev Trypan blå anvendt som indfarvningsteknik () der gjorde det muligt, at

skelne mellem hele, intakte individer, døde celler og cyster ved mikroskopering.

35

7.3 Resultater

Resultaterne af PES eksponeringsforsøget ses i Fig. 16. Ved den første dosering af PES blev

der registreret en kraftig effekt, med størst effekt ved den højeste dosis. Antallet af overleven-

de celler i den højeste PES eksponeringsgruppe lå lavt i hele perioden, mens antallet af over-

levende celler faldt i de grupper der blev udsat for daglig pulsdosering. Der var fra forsøgets

start et vis niveau af hvilecyster, som gennem eksponeringsperioden tiltog. Forsøget viste, at

en gang PES dosering på 1.5 mg PES/l var utilstrækkeligt, og at gentagne doseringer forstær-

kede inhiberingen af HD. Samtidig viste forsøget også, at de encysterede hvileceller vågnede

op når de rette betingelser indtræder – hvilket ses mest tydeligt i Fig. 16B og 16C efter 168

timer hvor antallet af levende celler steg sammenfaldende med en reduktion i antallet af hvile-

cyster på et tidspunkt hvor forholdene atter bliver gunstige (ingen PES og tilgængeligt føde

efter 5 døgns faste).

7.4 Diskussion

Det ses af figur 16, at 7,5 ppm PES er nødvendigt for at eliminere levende HD. I akvakultur

sammenhæng er dette en meget høj PES dosering (normalt doseres 0,2-1,5 ppm PES), og

såfremt der er biofiltre i anlæggene hvor store vandmængder cirkulerer henover, er der en

risiko for at de nitrificerende bakterie hæmmes ved denne dosering (Pedersen et al., 2009;

2013B).

Tilstedeværelsen af heterotrofe dinoflagellater (HD) er vanskelige at forhindre i åbne recirkule-

rede anlæg, og selv med forholdsregler og biosikkerhed kan de blomstre op i anlæg. HD kan

således vokse med og uden lys, i fersk, brak og saltvand og formår tillige, at have overlevel-

sesmekanismer i form af hvile cystedannelse mod ugunstige betingelser som fødeknaphed

eller ændringer i vandkvalitet. HD er ofte kendetegnende ved at være i anlæg med højt orga-

nisk stofindhold (partikulært organisk materiale), og under disse betingelse er anvendelsen af

kemiske hjælpestoffer vanskeligt. PES reagerer hurtigt ved kemisk oxidation med organisk

materiale så den aktive PES koncentration og kontakttiden vil være lav. Lignende forsøg med

at kontrollere opblomstringer af giftige alger i en fjord er lavet med høje koncentrationer af

brintoverilte (50 mg/l) hvor effektiv eliminering blev påvist men også periodisk forrøget dannel-

se af hvilecyster (Burson et al., 2014).

Såfremt fiskene kan tåle en øget dosering, kan længerevarende eller kontinuerlig PES dose-

ring måske være en mulighed og det bør ligeledes afprøves om PES dosering sammen med

supplerende HP dosering kan være en effektiv behandlingsstrategi mod HD (Burson et al.,

2014; Leggett et al., 2016). Pereddikesyre omsættes relativt hurtigt ved kemisk oxidation,

mens brintoverilte omsættes af bakterierne i biofilmen og i vandfasen. Pereddikesyre hæmmer

algernes katalaseaktivitet som på et tidspunkt vil ophøre. Herfra sker der ingen yderligere

omsætning af brintoverilte, og der vil derfor ske en ophobning i takt med en kontinuerlig per-

eddikesyredosering (som indeholder både pereddikesyre og brintoverilte).

Således kan der (periodisk) opretholdes en vis mængde desinfektionsmiddel i hele systemet,

og en praktisk sikkerhed vil være at overvåge brintoverilteniveauet med brintoverilte-sticks.

Alternativt til desinfektionsmidlerne kan målrettet partikelfjernelse (hvilket kunne ske i form af

proteinskimmere med ozon), eller biologisk kontrol være en fremtid mulighed (se kap. 10).


FIGUR 16. Antallet (antal celler/ml; gnsn. ± std. afv) af levende celler (grøn), døde celler (rød)

og hvilecyster (blå) af Pfiesteria sp. ved et 5-døgns eksponeringsforsøg med pereddikesyre.

Pereddikesyre er tilsat på fire forskellige måder: A) – Control (ingen PES tilsætning), B) – Puls

dosering på 1.5 mg·l-1

(Doseret på Dag 1), C) – Daglig puls dosering 1.5 mg·l-1

(Doseret på

Dag 1-2-3-4-5), og D) – Puls dosering på 7.5 mg·l-1

(Doseret på Dag 1). Den grå lodrette linje

ved 120 timer indikerer tidspunkt for fødeberigelse (R. salina). I kontrolgruppen blev der ikke

observeret døde celler. Bemærk, at x-aksen ikke er lineær.

37

8. Undersøgelser af pereddikesyre toksicitet

8.1 Baggrund

Når et desinfektionsmiddel anvendes i en industri med udledning til en recipient, skal det sik-

res, at udledningen ikke indeholder eventuelle restprodukter i en koncentration der kan udgøre

en risiko for vandmiljøet. For at kunne vurdere eventuelle negative miljøeffekter af et givent

biocid er det derfor nødvendigt, at 1) kende værdierne for toksiske effekter på forskellige trofi-

ske niveauer, 2) kende til stoffets omsætning og nedbrydelighed.

Der skal tages forskellige hensyn ved anvendelse af desinfektionsmidler til vandbehandling på

dambrug. Set ud fra dambrugerens synsvinkel er det nødvendigt at kende til stoffets effektivi-

tet og giftighed overfor den uønskede parasit der ønskes reduceret uden samtidig at påvirke

opdrætsfisken. Disse forhold definerer behandlingsråderummet (terapeutisk vindue) som er

afgørende for en vellykket desinfektion. Set fra den regulerende myndigheds perspektiv, er

oplysninger om toksiske effekter (EC50 og LC50) på laverestående trofiske niveauer af interes-

se, for derved at kunne fastsætte grænseværdier for tilladelige udlednings-værdier. Det er

også relevant, at vide om toksiciteten af biocidet er ens i fersk og saltvand.

I dette delprojekt er der lavet dosis-respons forsøg, ud fra standardiserede toksicitetstest som

gengivet i tabel 5. Data omfatter båderesultater af undersøgelser på effekt-niveau og giftighed,

hhv. EC50 og LC50. Der er lavet forsøg på bakteries lysudsendelse (EC50), algers vækst (EC50;

fersk-og saltvand) og zooplankton mortalitet (LC50 fersk- og saltvand).

Øvrige dosis-responsforsøg med PES på akvakultur-patogener, er f.eks. lavet på Tricodi-

na/Costia (Jaafar et al, 2013), skimmelsvamp Saprolegnia parasitica (Marchand et al., 2012),

bakterier Aeromonas salmonicida og Yersinia ruckeri (Meinelt et al., 2015); ciliate fiskedræber;

Ichthyophthirius multifiliis (Pedersen et al., 2013; Jørgensen, 2017) og juvenile ferskvandsfisk

(Straus et al. 2017), som angiver omtrentlige effektkoncentrationer men som ikke er udført

som standardiserede toksicitetstest.

8.2 Materialer og Metoder

Bakterie – test

For at vurdere giftvirkningen af PES og HP blev toksicitetstest udført på marine og ferskvand

organismer med forskellige trofiske niveauer – nedbrydere (bakterier), producenter (mikroalge)

og prædatorer/ græssere (zooplankton) (Tabel 5).


TABEL 5. Oversigt over toksicitetstest med PES og HP

Trofisk niveau/ testorganisme FV SV Reference metode

Bakterie (Vibrio fischeri) + ISO 11348-3:2007

Mikroalge (Skeletonema costatum) + ISO 10253:1995

Mikroalge (Pseudokirch. subcapitata) + ISO 8692:2012

Vandloppe (Acartia tonsa) + ISO 14669:1999

Dafnie (Daphnia magna) + ISO 6341:1989

(+ Mikroalge (Pseudokirch. subcapitata), ISO 8692 (2012), mod. Chhetri et al., 2016)

Biotox luminiscens testen blev anvendt (ISO 11348-3:2007) til at evaluere PES og HP giftig-

heden på bakterierved at bruge den marine bakterie Vibrio fischeri. Bakterien Vibrio fischeri er

bio-luminiscerende ved hjælp af enzymet luciferase. Testens biomarkør og princippet for må-

lingerne er detektion af lysreduktion af bakterien ved en given eksponering til et kemikalie. I

dette forsøg blev pereddikesyre (PES) og brintoverilte (HP) testet. Testproceduren er gengivet

i Fig. 17.

FIGUR 17. Skitse af toksicitetstest af bakterier med brug af Vibrio fischeri. Ud fra en frysetørret

bakteriekultur overføres ens mængde bakterier til vials i 20 ‰ saltvand hvorefter de blev ek-

sponeret for forskellige koncentrationer af PES med sammenhørende luminescens målinger

efter hhv. 5, 15 og 30 minutter efter PES tilførsel.

39

Toksicitets test af alger

Toksiciteten af PES og HP på mikroalger blev undersøgt ved at måle væksthæmning som

funktion af eksponeringskoncentration. Biomarkøren i form af hæmningsgraden af biomasse-

tilvækst – blev vurderet på saltvands mikroalgen Skeletonema costatum (ifølge ISO

10253:1995) og ferskvands mikroalgen Pseudokirchneriella subcapitata under statiske forhold

(ifølge ISO 8692:2012). Testens varighed var 48 timer, og der blev målt i intervaller af 24 ti-

mer. Testproceduren er skitseret på Fig. 18, hvor både PES og HP blev testet på begge arter.

FIGUR 18. Skitse af procedure til bestemmelse af væksthæmning af alger. To forskellige al-

gekulturer blev dyrket i 3 dage og i den eksponentielle vækstfase blev en given algetæthed

(104 celler/ml) eksponeret for forskellige PES koncentration (0 - 1,0 mg/l) med måling af kloro-

fyl aktivitet efter 48 timer.

Test af PES giftighed overfor zooplankton

Den akutte toksicitet af PES og af HP overfor 2 forskellige zooplankton arter blev bestemt

udfra ISO 14669:1999 og ISO 6341:1989. Toksicitetstestens biomarker er mortalitet. Testor-

ganismerne var saltvand vandloppen Acartia tonsa og ferskvand krebdyret Daphnia magna.,

holdt under kontrollerede betingelser i hhv. 10 dage og 24 timer før eksponering. Testprocedu-

ren er vist i Fig. 19, hvor både giftvirkningen af pereddikesyre (PES) og brintoverilte (HP) blev

testet på begge arter.

Pseudokirchneriellasubcapitata

Skeletonemacostatum


FIGUR 19. Forsøgsopstilling til bestemmelse af LC50 af PES og HP overfor 2 renkulturer med

hhv. vandloppe og dafnier. Testindividerne var forud for PES ekponeringerne holdt under

konstante betingelser med daglig tilførsel af algekultur (R. salina). PES koncentrationer var

geometrisk fordelt på 9 koncentrationer mellem 0 og 5 mg PES/l.

8.3 Resultater og diskussion

Det generelle billede viste, at PES er mere potent end hydrogen peroxid for alle testorganis-

mer. Resultaterne fra eksponeringsforsøgene er vist i Fig. 20. For bakterierne var der en 50 %

reduktion i effekt biomarkøren ved 0,08 mg PES/l mens den tilsvarende subletale effekter ved

HP eksponering indtrådte ved 10 mg H2O2/l (faktor 125). For algerne opstod 50 % hæmningen

i vækst ved højere PES koncentrationer, hhv. 0,25 og 1,38 mg PES/l for salt og ferskvand. De

tilsvarende værdier for HP ca. 5 og 2 gange højere, hhv. 1,18 og 2,9 mg HP/l. Giftigheden af

PES (den letale effekt LC50) overfor zooplankton var 0,47 og 0,77 mg PES/l; for HP 2,94 og

3,44 mg HP/l (faktor 5-6). PES toksiciteten for ferskvandsfisk er for nyligt undersøgt. De letale

koncentrationer (LC50) for 10 forskellige arter blev fundet til at være i området fra 2.8 mg PES/l

til 9,3 mg PES/l (Straus et al., 2017) (Tabel 6 og 7).

De fundne værdier ligger i størrelsesordenen med de doserings niveauer der benyttes i pro-

duktionsvandet i akvakulturanlæg, hvor kortvarig pulsdosering med PES koncentrationer på <

0,1-0,5 ppm tilstræbes (Pedersen et al., 2013A; Jafar et al, 2013). Doseringen for kontinuerlig

PES dosering til reduktion af coliforme bakterier i spildevand fra renseanlæg (2° og 3° afløbs-

vand) er samlet af Luukonen og Pekhonen (2017) og her er doseringerne i størrelsesordenen

1-10 mg PES/l ved kontakttider på 10-30 minutter. De faktiske PES koncentrationer er som

beskrevet meget afhængige af vandets beskaffenhed (Pedersen et al., 2013A), hvilket gør

kontinuerlige toksicitets test med PES (Meinertz et al., 2008) særligt relevante. Ligeledes tyder

nye studier på at toksikologiske effekter af PES på bakterier afhænger af næringsstofbetingel-

serne (Turolla et al.,2017).

De i kapitel 9 beskrevne PES udledningskoncentrationer ligger på et niveau (hovedparten

under detektionsgrænsen < 0,01 mg PES/l med en måling op til 0,027 mg PES/l) der er væ-

sentlig under de fundne LC50 værdier. Såfremt der måtte være enkeltstående dambrug (rent

vand, gennemstrømningsanlæg, kort opholdstid og høj PES pulsdosering) hvor PES koncen-

trationen i udløbsvandet er detekterbart, kan foranstaltninger som for eksempel en plantelagu-

ne eller anvendelse af kontaktfilter eller træflis-filter være en måde at fjerne den resterende

PES mængde før udledning.

41

En mulig måde fremover at nedbringe PES forbruget, kunne være at kombinere PES med

yderligere dosering af brintoverilte, da nyere undersøgelser har vist at PES og HP har en

synergetisk effekt (Reichwaldt et al., 2011; Flores et al., 2014; Leggett et al., 2016).

FIGUR 20. Dosis responskurver for bakterier, alger og zooplankton ved eksponering til PES og HP.


TABEL 6. Sammenligning af toksokologiske PES data for alger

Alge art EC50 Varighed PES H2O2 Reference

mg/L Timer % %

Pseudokirchneriella subcapitata 8,89 48 15 23 Antonelli et al., 2009

Pseudokirchneriella subcapitata 0,18 120 5.2 20 ECETOC, 2001

Pseudokirchneriella subcapitata < 1,0 72 18 0.3 ECETOC, 2001

Pseudokirchneriella subcapitata 1,28 72 30-40% - Chhetri et al, 2016

Desmodesmus subspicatus 0,5 – 1,4 72 32 - 36 5 - 12 Kouba et al., 2012

Skeletonema costatum 0,25 48 12 20 Rojas-Tirado, 2013

TABEL 7. Sammenligning af toksikologiske PES data for zooplankton

Zooplankton art LC50 Test duration PAA H2O2 Reference

mg/L Hours % %

Daphnia magna 0,15 48 15 23 Antonelli et al., 2009

Daphnia magna 0,69 48 15,5 22 ECETOC, 2001

Daphnia magna 0,73 48 5,2 20 ECETOC, 2001

Daphnia magna 1,1 48 4,5 27,5 ECETOC, 2001

Daphnia magna 0,4 – 0,7 48 32 - 36 5 - 12 Kouba et al., 2012

Daphnia magna 0,77 24 12 20 Rojas-Tirado, 2013

Acartia tonsa 0,44 24 12 20 Rojas-Tirado, 2013

FIGUR 21. Koncentration-respons kurver for P. subcapitata der viser væksthæmning 3 døgn

efter PES og HP eksponering (fra Chhetri et al., 2016). EC50 (72 timer) for PES og brintoverilte

er hhv. 1,38 mg PES/l og 2,90 mg H2O2/l

De ovenstående resultater er nye i forhold til EU evalueringsrapporten om pereddikesyre (EU,

528/2012). I nævnte rapport er der angivet EC50 (72 timer) værdier for de mest følsomme alger

(Selenastru capricornutum) på 0,16 mg PES/l. For dafnier (Daphnia magna) er der beskrevet

EC50 værdier på 0.73 mg PES/l hvor biomarkøren var bevægelighed, mens der for bakterier i

aktivt slam er refereret til effekt på respirations raten ved EC50 = 5,1 mg PES/l.

43

9. Mesocosm experiment

9.1 Background and objectives

Accumulation of peracetic acid (PAA) residuals and its effects to plankton community were

investigated in mesocosm experiments. In contrast to incubations with single species, meso-

cosm experiments typically include complete communities of micro-organisms, which can be

manipulated under controlled conditions (Stewart et al., 2013). The mesocosm experiments

were focused on the effects of PAA on the species composition of plankton, with the expecta-

tion that the residual PAA would add a carbon source that would benefit heterotrophic organ-

isms and result in a shift in the autotroph to heterotroph ratio.

This type of change could influence the whole food-web by changing the species composition

at the bottom of the food web and by modifying the number of trophic levels due to increased

diversity of heterotrophic organisms. Since the food web efficiency - the proportion of primary

production reaching the top predators - is influenced by the species interactions and by the the

number of trophic levels, changes in size, biochemical and mineral quality of the micro-

organisms and an increase in the number of trophic levels, would likely reflect in the produc-

tivity of the higher trophic levels. In addition, increase in the bacterial production and abun-

dance of small heterotrophic flagellates could promote blooms of heterotrophic algae, many of

which are toxic (see Moestrup et al., 2014).

We hypothetized that:

PAA residuals will induce a shift from a community dominated by large autotrophic

phytoplankton to a community dominated by smaller heterotrophic cells, with a higher

concentration of protozoans (ciliates) and a higher heterotrophic activity.

The change in the community composition will depend on the concentration and fre-

quency of PAA.

9.2 Material and methods

Initial conditions

We conducted two mesocosm experiments in April 2016: 8-15.4 and 20-26.4. In both experi-

ments, the mesocosm water originated from an eutrophicated lagoon where the overflow water

from a model recirculating aquaculture system of DTU Aqua is led out. The water in the lagoon

is a mixture of outflow water from the marine RAS system and rainwater, with a salinity of ca.

10 PSU. Temperature in the lagoon at the start of the first experiment was 7°C, and at the start

of the second experiment 8°C.

The algae concentrations in the lagoon at the start of both experiments were high. At the start

of the first experiment, the chl-a was 10.8 ± 0.8 µg l-1

, consisting mainly of diatoms and dino-

flagellates. At the start of the second experiment, algae biomass had tripled to 32 ± 2.5 µg chl-

a l-1

.


Although diatoms had also doubled in abundance between the two experiments, by far the

most abundant algae in the beginning of the second experiment were small flagellates in the

size range of < 5 µm. Similarly, the abundance of ciliates had increased from 2200 ± 670 cells

ml-1

to 13 000 ± 2100 cells ml-1

between the two experiments. The mesocosm water thus con-

tained high concentrations of micro-organisms in both experiments, with the concentrations

during the second mesocosm run corresponding to an eutrophic lake (Kasprzak et al. 2008),

or to DTU Aqua’s model RAS at the time of the peak abundance of algae (Oosterveld et al.,

manuscript).

Mesocosm set up and measured variables

Twelve mesocosm tanks of 30 l were set up in a DTU Aqua facility, with no direct sun light and

temperature of 16-18 °C (Table 8). The light above each mesocom tank was measured using

a light meter. The lagoon water was first sampled into a 1 m3 container using a hose connect-

ed to a pump, from where it was evenly distributed to the mesocosm tanks. An even distribu-

tion was ensured by regular mixing, and by filling the tanks in three rounds of 10 l. The lagoon

water was first filtered through 200 µm net, to remove large zooplankton from the mesocosms

experiments. The tanks were gently aerated from below, and the light was provided from

above with a 12 h light: 12 h dark cycle (Table 8). The experiments were continued for 6-7

days.

All mesocosms tanks were measured daily for temperature, oxygen and pH, using a hand-held

Hach 40D meter with sensors. Also, daily 100 ml samples were taken for chl-a measurements

and daily 50 ml samples for phytoplankton and ciliate counts. Every 2nd

day, the mesocosm

were sampled for bacterial activity indicated by bactiquant. In the end of the experiments,

samples were taken for H2O2 measurements, as well as for measurements of turbidity and

chemical oxygen demand (second experiment only). Chl-a samples were filtered onto GF/F

filters (Whatman) and frozen at -20 °C until analysis. Phytoplankton samples were preserved

in 2% acid Lugol’s solution and kept in cool and dark.

Treatments

The four treatments with triplicates were randomly distributed among the tanks. Mesocosms

tanks were treated with: 1) a continuous dose of peracetic acid at a concentration of 0.3 mg l-1

,

2) a daily pulse addition of 0.3 mg l-1

and 3) a daily pulse addition of ca. 1.8 mg l-1

(2nd

experi-

ment only). In addition, both experiments included a control, without any water treatment (Ta-

ble 8). These treatments will from now on be labelled continuous, low pulse, high pulse and

control. In the continuous treatment, a concentrated PAA solution was first prepared to clean

water with a salinity of ca. 10 PSU (first experiment) or Milli-q water (second experiment) in a

1-l beaker, and was pumped to the mesocosm from there using peristaltic pumps. In the first

experiment, however, significant PAA decay in the brackish PAA reservoir led to PAA con-

sumption with correspondingly reduced PAA addition (≤ 0.08 mg l-1

).

Degradation of PAA in the pulsed treatments of both experiments were measured in days 0, 3,

6 and 9 (first experiment only; Fig. 22). PAA degraded fast in the pulsed treatments, with ca.

50% of the PAA left after 30-40 min, and most of the PAA degraded after 2 h in the low pulse

treatment. Particularly in the second experiment, the degradation was substantially higher

towards the end of the experiment. The slope of the degradation was lower in the high pulse

treatments and, particularly during the first days of the experiments, 25% of the PAA was still

left 3 hours after addition (Fig. 22).

45

Exp. 1: Low pulse

Time (min)

0 50 100 150 200

PA

A (

mg l-1

)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Day 0

Day 3

Day 6

Day 9

Exp. 2: Low pulse

0 50 100 150 200

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Day 0

Day 1

Day 3

Day 6

Exp. 2: High pulse

Time (min)

0 50 100 150 200

PA

A (

mg l-1

)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Day 0

Day 3

Day 6

FIGUR 22. Decrease in PAA concentration (mg l-1

) after the daily pulse addition as a function

of time (min). Different shades of the circles indicate different experimental days.

Analysis

Chl-a was extracted in ethanol overnight and measured using a spectrophotometer. Micro-

organisms were counted using Sedgewick rafter counting chambers and an inverted micro-

scope, and grouped into diatoms (mainly Thalassiosira spp. and Skeletonema spp.), dinoflag-

ellates and ciliates (Strombidium sp. and an unidentified large ciliate). The abundances were

based on two replicate counts of > 200 cells each. Since the dinoflagellates were not identified

to species, and only light microscopy was used, we could not distinguish between auto- and

heterotrophic forms. Therefore, for comparisons between auto- and heterotrophs, half of the

dinoflagellates were assumed autotrophs, half heterotrophs. This was based on an estimate

that approximately 50% of the marine dinoflagellates are heterotrophic (Godhe et al., 2008).

Quantification of bacteria was done by bactiquant analysis from Mycometer. A 10 mL sample

was incubated in a substrate for 30 minutes; afterwards fluorescence was measured and cor-

related to a bactiquant value. Turbidity and chemical oxygen demand were measured using a

portable turbidity meter and Merck test kit, respectively. Hydrogen peroxide (H₂O₂) degradation

was measured after addition of H₂O₂ in a beaker containing mesocosm water. H₂O₂ degrada-

tion was measured over a period of half an hour according to a modified version of Tanner and

Wong (1998).

Chl-a and abundances of diatoms, dinoflagellates and ciliates were tested for differences be-

tween the treatments, separately for each experimental day, using a 1-way analysis of vari-

ance (ANOVA).


Chl-a and micro-organism abundances in mesocosms receiving PAA were also tested against

the abundances in the control treatment, using a one-sample t-test. To compare against the

control, chl-a and micro-organism abundances in treatments were calculated as a percentage

from the control treatment.

TABEL 8. List of the treatments, perasetic acid doses (mg l-1

d-1

), temperature (°C) and light

(lx) conditions in the mesocosms during the two experiments (mean SD), as well as list of

the measured variables. All treatments included triplicate mesocosm tanks.

Treatment PAA (mg l-1d

-1) T (˚C) Light (lx) Measurements

Daily Every 2nd

day Final

Exp. 1 (8-15.4.)

Control 0 17.8 0.7 114 25 T, O2, pH,

chl-a, algae

Bact. H2O2

Pulsed 0.21 ± 0.05 17.8 0.7 125 23 T, O2, pH,

chl-a, algae

Bact., PAA degr. H2O2

Continuous << 0.3 18.0 0.6 116 29 T, O2, pH,

chl-a, algae

Bact. H2O2

Exp. 2 (20.-26.4.)

Control 0 16.9 0.3 114 25 T, O2, pH,

chl-a, algae

Bact. Turbidity, COD,

H2O2

Pulsed 0.28 ± 0.01 17.1 0.3 125 23 T, O2, pH,

chl-a, algae

Bact., PAA degr. Turbidity, COD

H2O2

5 x Pulsed 1.8 ± 0.05 16.9 0.3 113 39 T, O2, pH,

chl-a, algae

Bact., PAA degr. Turbidity, COD

H2O2

Continuous 0.3 17.0 0.3 116 29 T, O2, pH,

chl-a, algae

Bact. Turbidity, COD

H2O2

9.3 Results

pH and oxygen concentration

Both pH and O2 concentration in the first experiment remained relatively constant, at 7.9-8.3

and 7.9-8.2 mg l-1

, respectively. In contrast, pH at the start of the second experiment was

extremely high, up to 9, probably due to the extremely high chl-a concentration (see below). In

the course of the experiment, pH decreased in all treatments, although most in the high pulse

treatment. In fact, pH was significantly lower in the high pulse treatment than in other treat-

ments during all experimental days (ANOVA; p < 0.01). O2 concentration in the experiment 2

was mostly relatively stable between 7 and 8 mg l-1

, with the exception of the last three days

where the O2 concentration in the high pulse treatment dropped down to 3-6 mg l-1

(Fig. 23).

47

Exp. 1

0 2 4 6 8

pH

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

Exp. 2

0 2 4 6 8

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

Control

Continous

Pulsed

5 x Pulsed

Exp. 1

Days

0 2 4 6 8

O2 (

mg l

-1)

0

2

4

6

8

10

Exp. 2

Days

0 2 4 6 8

0

2

4

6

8

10

a) pH

b) Oxygen

FIGUR 23. a) pH and b) oxygen concentration (mg l-1

) in the two mesocosms experiments

over the 6-7 days (mean ± SD). (Black circle) control, (white circle) continuous treatment, (grey

circle) low pulse treatment and (black triangle) high pulse treatment.

Autotrophic algae

Chl-a decreased in all treatments and in both experiments throughout the experimental period

(Fig. 24a), probably due to the change in the light intensity (70-163 lux in the mesocosms)

compared to the lagoon. In the first experiment, there was a linear correlation between the chl-

a and counts of autotrophic cells (R2 = 0.56; p < 0.001; data not shown), indicating that most of

the chl-a was due to the relatively large cells which could be identified and counted using light

microscopy. Diatoms were the dominant group of algae, with concentrations up to 5000 cells

ml-1

. In the second experiment, chl-a and algae counts were not related (data not shown),

probably due to the dominance of small unidentified autotrophic flagellates, which were not

counted in the samples. The ratio of large autotrophic algae to heterotrophic ciliates (in abun-

dance) did not change consistently according to the treatment, but was between 2 and 3 in the

first and between 0.5 and 1 in the second experiment.

There were no significant differences in the concentration of chl-a or in the algae abundance

between the treatments in any of the experimental days in neither of the experiments (ANOVA;

p > 0.05). In the first experiment, the chl-a concentrations in the mesocosms treated with PAA

did not significantly differ from the control in any of the days (1-sample t-test; p > 0.05), alt-

hough the concentrations in the continuous treatment were higher than in the control towards

the end of the experiment (Fig. 24b).


In the second experiment, the chl-a concentrations in the low pulse and continuous treatments

were significantly higher than the control in day 3 (1-sample t-test; p < 0.05), but not different

in any other day (Fig. 24b). In general, the changes in the abundances of diatoms of dinoflag-

ellates over the experiments were small, and not different from the fluctuations in the controls

(Fig. 25). Addition of PAA thus did not appear to have any effect on the abundance of auto-

trophic algae.

Exp. 1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Chl-a (

g l-1

)

2

4

6

8

10

12

Exp. 2

Days

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Chl-a (

g l-1

)

10

15

20

25

30

35

40

45

Control

Continous

Pulsed

5 x Pulsed

Exp. 1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

% F

rom

contr

ol

40

60

80

100

120

140

160

180

Exp. 2

Days

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

% F

rom

contr

ol

40

60

80

100

120

140

160

180

FIGUR 24. Changes in the a) chl-a concentration (µg l-1

) in all treatments and b) chl-a concen-

tration in the PAA treatments in relation to control (%) over the course of the two experiments

(mean ± SD). In Exp. I, 5 x pulse treatments were not performed. The line in (b) indicates the

control. Symbols as in Fig. 23.

49

Control

0 2 4 6 8

Ce

lls

ml-

1

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Au

totr

.: H

ete

rotr

.

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Diatom

Dinoflag

Ciliate

Aut: Het

Low pulse

0 2 4 6 8

Ce

lls

ml-

1

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Au

totr

.: H

ete

rotr

.

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Continous

Time (days)

0 2 4 6 8

Ce

lls

ml-

1

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Au

totr

.: H

ete

rotr

.

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Control

0 1 2 3 4 5 6

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Low pulse

0 1 2 3 4 5 6

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Continous

0 1 2 3 4 5 6

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

High pulse

Time (days)

0 1 2 3 4 5 6

Ce

lls

ml-1

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

a) Experiment 1 b) Experiment 2

FIGUR 25. Abundance of diatoms, dinoflagellates and ciliates (cells ml-1

) in the mesocosm

experiments, as well as the autotroph to heterotroph ratio in the first experiment (mean ± SD).

(Black circles) diatoms, (grey circles) ciliates, (white circles) dinoflagellates. The dark triangles

and dotted line indicate the autotroph to heterotroph ratio.

Heterotrophs

Concentration of ciliates did not substantially change due to PAA treatment, and neither their

abundance nor development over the 6-7 days differed from the control (Fig. 25). However,

bacterial quantification, chemical oxygen demand and the degradation of H2O2 all suggested

increased heterotrophic activity in the PAA treatments compared to the control (Fig. 26, Table

9).


The slope of the H2O2 degradation was significantly higher in the PAA treatments than in the

control at the end of both treatments (ANCOVA; p < 0.05), and the chemical oxygen demand

in the high pulse treatment was one third higher than in the control (Table 9).

Exp. 1

0 1 2 3 4 5 6 7

Bactiquant

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Exp. 2

Time (days)

0 1 2 3 4 5 6 7

Bactiquant

0

2e+4

4e+4

6e+4

8e+4

1e+5

Control

Continous

Low pulse

High pulse

FIGUR 26. Bacterial activity measurements by Bactiquant® value in the two experiments

(mean ± SD).

51

TABEL 9. Linear degradation rate of H2O2 (mg H2O2 min-1

) in the end of both experiments, as

well as turbidity (FNU) and chemical oxygen demand (COD; mg l-1

) in the end of the second

experiment (mean SD). The H2O2 degradation is based on the measurements from one (first

experiment) or two (second experiment) randomly chosen replicate mesocosms per treatment;

the slopes in the two high pulse mesocosms are presented separately since they differed

substantially from each other. Turbidity and COD were measured in all triplicate mesocosms.

(N) Number of replicates.

Treatment Exp. 1 (15.4) Exp. 2 (27.4)

H2O2 (Slope ± SD) R2

(N) Slope ± SD R2 Turbidity COD

Control -0.018 ± 0.001 0.98 (9) -0.026 ± 0.001 0.95 (18) 17.3 5.2 35 2.6

Continuous -0.053 ± 0.003 0.98 (9) -0.045 ± 0.002 0.98 (18) 14.6 1.0 41 1.4

Low pulse -0.055 ± 0.003 0.98 (9) -0.045 ± 0.002 0.98 (18) 16.9 1.0 41 8.5

High pulse 1 - - -0.040 ± 0.002 0.99 (9) 13.2 0.5 45 0.8

High pulse 2 - - -0.050 ± 0.007 0.89 (9)

9.4 Conclusions

Our mesocosm experiments did not indicate any substantial effect of PAA treatments on the

algae, but the algae biomass (measured as chl-a) and abundance of large cells were only

affected by the reduction of light in the mesocosms, not by the PAA treatment. This would

suggest that PAA is not very effective in removing large biomass of microalgae. Also, it ap-

peared that PAA treatments induced increased heterotrophic activity, although that was not

visible in the abundance of protozoans. It could be that the mesocosm experiments did not

continue long enough to detect changes in the ciliates, but that the increased activity was

mainly due to bacteria. Although the short-term increase in heterotrophic activity did not reflect

in the food web, the increased community respiration following from increased heterotrophic

activity could induce a reduction and higher fluctuation in pH. The large diurnal fluctuations in

pH in turn could influence the organisms at the higher trophic levels. The future experiments

should consider the potential food-web effects of PAA in more controlled conditions, particular-

ly considering the extremely high biomass of algae in the present experiments, which might

have masked any short-term effects of PAA treatments on the primary producers.


10. Kontinuerlig dosering af pereddikesyre på kommercielle dambrug

10.1 Indledning

Vandbehandling med pereddikesyre på kommercielle opdrætsanlæg foregår på forskellig vis,

både med hensyn til mængde, hyppighed og doseringssted. Af hensyn til optimering af tid,

arbejdssikkerhed og på baggrund af positive erfaringer med effekten på vandkvaliteten vælger

nogle dambrugere at dosere produktet over en længere periode med drypspande eller med

forskellige pumpeløsninger (Henriksen, 2015; Henriksen and Pedersen, 2015).

Indenfor de seneste få år er det også forsøgt at desinficere indtags vandet ved kontinuerlig

PES dosering eller dosere PES i en del af vand-flowet. Den anbefalede doseringsmængde er

ca. 1 ml produkt /m3 flow (svarende til 0,1-0,2 ppm PES/l). Typisk er det kortvarige doserings

perioder (få timer) i dagtimerne. I recirkulerede anlæg med biofiltrene er det også kortvarige

PES doseringer af hensyn til biofilter.

Nedenfor er en kort gengivelse af resultater og erfaringer fra to feltforsøg hvor PES blev tilført

kontinuerligt over en længere periode, og hvor PES fordelingen og PES restkoncentrationer

blev målt (Pedersen & Henriksen, 2017).

10.2 Traditionelt dambrug med kontinuerlig PES dosering i fødekanalen

På dette dambrug var der behov for at finde et alternativ til formalin til kontrol af parasitter og

forebygge hud- og gællelidelser (EU, 2009; Larsen et al., 2015; Pedersen & Henriksen, 2017).

Det blev forsøgt at dosere PES kontinuerligt i fødekanalen så der i dammene ville blive tilført

en meget lav dosis (ca. 0,15 mg PES/l) som er effektiv mod fiskedræber svævere i vandfasen

(Jafar et al, 2013). Fiskemesteren anvendte en doseringspumpe hvor 5 liter 15 % pereddike-

syre blev blandet med 150 l vand i en doseringsbeholder og herfra kontinuerlig tilført til føde-

kanalen fra kl. 7.30 og 10 timer frem. Det samlede flow til de 14 damme var ca. 130 l/s. Un-

dersøgelsen gik ud på, at dokumentere de faktiske, realiserede PES koncentrationer i indlø-

bet, i dammen og videre gennem anlægget, idet det forud for forsøget var uvist om PES blev

omsat for hurtigt og dermed ikke ville opnå den forventede behandlingseffekt. Tilsvarende

kunne en manglende PES omsætning medføre en målbar udledning til recipienten.

Resultaterne af feltundersøgelse viste, at PES når frem med indløbsvandet til dammene i en

koncentration svarende til den forventede dosering (~1 ml 16 % produkt/m3 ~ca. 0,16 mg

PES/l). Omsætningen af PES foregik i dammen, hvor 50-75% af det aktive stof blev reduceret

(Fig. 27). Opholdstiden på dambruget var få timer. Der foregik en begrænset yderligere ned-

brydning af PES gennem bundfældningsbassinet; i udløbet fra dambruget kunne der ikke

måles PES (PES < 0,01) om formiddagen, mens der om eftermiddagen blev målt op til 0,027

mg PES/l. Målemetoden i felten havde en detektionsgrænse på 0,009 mg PES/l svarende til

en absorbansværdi på 0,001.

53

Målingerne dokumenterede en signifikant intern omsætning af PES, som er i overensstem-

melse med andre undersøgelser der viser at PES nedbrydning ved reaktion med organisk

materiale, fisk og kontakt med overflader (Pedersen et al., 2009). På det pågældende dam-

brug var vandet meget rent, og alligevel skete der en betragtelig omsætning af PES ved pas-

sage gennem i dammene. PES niveauerne i udløbet fra dambruget var under detektionsgræn-

sen, men kunne i et tilfælde måls (0,027 mg PES/l). Denne PES restmængde vil om nødven-

digt kunne bringes yderligere ned, såfremt der efter udløbet fra dammene sikres en øget op-

holdstid eller yderligere kontakt mellem vand og kontaktflader..

FIGUR 27. PES koncentration (mg PES/l) målt forskellige steder på et dambrug i forbindelse

med kontinuerlig PES dosering (1 ml produkt/m3 fra kl. 07 – 17) (Larsen et al, 2015).

I dette eksempel lykkedes det dambrugeren at udskifte formalin forbruget (adskillige liter pr.

daglig behandling) med et let nedbrydeligt PES produkt i størrelsesordene 5 liter/dag (Peder-

sen & Henriksen, 2017).

10.3 Model 3 dambrug med kontinuerlig PES dosering i en produktionsenhed

Et tilsvarende forsøg med kontinuerlig PES dosering i væsentlig større skala blev afprøvet og

dokumenteret på et model dambrug (Henriksen & Pedersen, 2015). Her var formålet, at erstat-

te pulsdoseringer af formalin og NaCl med kontinuerlig dosering af PES. Formålet med forsø-

get var at undersøge PES’s skæbne og forbedre vandkvaliteten ved at reducere bakteriefore-

komsten i vandfasen, nedbringe antallet af parasitter, og samtidig undersøge driftsmæssige

fordele og ulemper ved denne praksis.

Det pågældende anlæg var et model 3 dambrug med airlift, tromlefiltre og biofiltre. Den benyt-

tede opdrætssektion var på ca. 1000 m3 med et recirkulations flow på ca. 400 l/s og et frisk-

vandsskifte på 30 l/s. Doseringen var tilrettelagt således, at PES blev tilsat i udløbet fra biofil-

ter sektionen svarende til indløbet til den første af 6 serieforbundne raceway.

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18

Afløb til å

Bundfæld

Udløb dam

Indløb dam

Indtag Å

Afløb til å Bundfæld Udløb dam Indløb dam Indtag Å

Formiddag 0,000 0,027 0,027 0,171 0,000

Eftermiddag 0,027 0,036 0,045 0,105 0,009


Her blev der tilsat PES svarende til 1 ml pr. m3 svarende til 1,4 l PES produkt/time over en

sammenhængende periode på 4 uger.

Det valgte doseringssted var længst væk fra biofiltret, og valgt så den tilsatte PES mængde

var virksom i produktionsenhederne (raceways) før den tiloverblevne aktive del blev ledt til

biofiltret og atter recirkuleret til produktionsenhederne igen. PES koncentrationen blev målt

nedstrøms doseringsstedet (efter biofiltret) og ved indløbet til biofiltret. Målingerne af PES

koncentrationen gengivet på Fig. 28 viser, at der blev opretholdt en ensartet PES koncentrati-

on på målepositionen 5 meter nedstrøms doseringsstedet gennem hele perioden.

Resultatet af doseringsforsøget viste således, at:

1) den anvendte dosering giver meget stabil PES koncentration i produktionsanlægget gen-

nem hele perioden;

2) omsætningen af PES er konstant i produktionsenheden, idet forskellen mellem de to må-

lepositioner ikke forandres over den fire uger lange periode;

3) der ikke sker nogen ophobning af PES i anlægget;

4) biofiltreret fjerner PES ved kortvarig passage;

5) biofiltret påvirkes ikke negativt ( ammonium og nitrit omsætning forblev uændret (TAN og

nitrit data ikke vist);

6) doseringsudstyret fungerede fint;

7) behandlingseffektiviteten af PES var vanskelig at vurdere (ingen direkte sammenlignelig

kontrol).

FIGUR 28. Eksempel på kontinuerlig pereddikesyre dosering på et stort kommercielt recirkule-

ret opdrætsanlæg. Figuren viser koncentrationsværdier af PES målt direkte på vandprøver fra

anlægget. Måleværdierne før den 22/4 viser PES fordeling i forbindelse med kraftig pulsdose-

ring af PES, mens data fra den 22/4 til den 11/5 er fra perioden med kontinuerlig PES dose-

ring. ”Nedstrøms dosering” er ved indløbet til produktionsenhederne (efter biofiltret), mens

”Indløb biofilter” er målt efter produktionsenhederne (modificeret efter Henriksen og Pedersen,

2015).

55

10.4 Konklusioner

Ovenstående 2 eksempler illustrerer, at det i praksis er muligt at tilsætte PES kontinuerligt. I

det ene tilfælde viste det sig muligt at erstatte formalin. I begge tilfælde kunne den ønskede

PES koncentration opretholdes på omkring 0,1-0,15 mg PES/l. Omsætningen af PES foregik

hurtig, og det ses af Fig. 28 at omsætningen af PES ved blot en enkelt passage igennem an-

læggets raceways var betydelig (opholdstid < 45 min). Omsætningen i biofiltret var stor som

følge af en stor mængde organisk materiale og den direkte kontakt mellem vandfase og over-

flade. På det traditionelle dambrug blev der målt PES i udløbsvandet ved en enkelt måling,

mens dette ikke vil være sandsynligt på model dambruget, hvor produktionsvandet ledes gen-

nem en plantelagune med opholdstid på mere end 1 døgn. I forsøg som disse er det vanske-

ligt at dokumentere effekten på fiskene og ligeledes på vandkvaliteten da mange forskellige

faktorer er uden for kontrol.

Fordelen ved PES doseringen er, at hele systemet (inkl. biofiltret) eksponeres for PES og at

det er muligt at dosere i en lav, effektiv koncentration. Lav dosering sikrer ligeledes, at fiskene

reagerer mindre på selve vandbehandlingen og at der ikke kan opstå pulser med højt PES og

lav pH.

Ulemper ved den kontinuerlige dosering fra én position er, at fiskene i de første raceways

modtager relativt mere PES end fiskene i de efterfølgende raceways (hvor en del aktivt PES er

omsat). Dette kunne løses ved at ændre doseringsstedet, men det kan omvendt give proble-

mer med biofiltret.


11. Biological control of toxic microalgae

11.1 Background and hypothesis

In this work package we wanted to investigate whether zooplankton – the natural grazer of

algae – could be used to replace or reduce chemical control. Some zooplankton species can

feed on toxic algae (Rosetta and McManus, 2003; Gustafsson and Hansson, 2004), and zoo-

plankton such as the cladoceran Daphnia spp. can be used in lake restauration (Hansson et

al. 1998), since their high grazing rates can reduce the abundance of e.g., cyanobacteria

(Chislock et al., 2013).

In a similar way could Daphnia or other zooplankton potentially reduce the amount of algae in

recirculating aquaculture systems. This is particularly advantageous with cyst-forming micro-

organisms that are able to endure chemical treatment. We investigated the potential of two

zooplankton species to eliminate toxic or harmful algae, and conducted preliminary experi-

ments to study whether biological control could be feasible in recirculating aquaculture.

We hypothesized that:

Some zooplankton species can feed on toxic algae at high rates without suffering

from elevated mortality;

The high feeding rates result in zero or negative growth (removal) of the algae;

The high feeding rates can be maintained in a flow rate that corresponds to the water

exchange in RAS.

11.2 Material and methods

Three experiments were performed: One to measure the feeding and mortality rates of the two

zooplankton species, Daphnia magna and an unidentified cyclopoid copepod, on diverse toxic

alga; one to measure the feeding and mortality rates of D. magna in combination of toxic algae

and peracetic acid; and one to investigate the effect of flow velocity on D. magna.

The toxic algae used in experiments were the cyanobacterium Microcystis aeruginosa, the

prymnesiophyte Prymnesium parvum and the heterotrophic dinoflagellate Pfiesteria sp., as

well as the non-toxic control species the green alga Scenedesmus sp. (Daphnia) and the cryp-

tophyte Rhodomonas sp. (cyclopoid). For simplicity, all toxic species are referred to as ‘algae’

although M. aeruginosa is actually a cyanobacteria, and Pfiesteria sp. is heterotrophic, and

thus not in fact an alga.

Both D. magna and the algae were cultured in the laboratory at DTU Aqua, while the cyclopoid

was collected from the bio-filter of an experimental RAS tank, and used in experiments imme-

diately afterwards. The experiments are summarized in Table 10. For origin of the algae and

zooplankton and details of the culture methods, see Pinyol Gallemi 2016.

57

TABEL 10. List of the experiment: zooplankton and algae species, treatments, measured

variables and numbers of replicate observations.

Zooplankton Algae Treatment Measurement N

Daphnia magna

and cyclopoid

sp.

Scenedesmus sp. /

Rhodomonas sp.

400 µg C l-1 of the al-

gae

Grazing, mortality, algae

growth rate

6

Microcystis sp. 6

P. parvum 10-18

Pfiesteria sp. 10-18

D. magna Scenedesmus 3 concentrations of

PAA: 0.5, 0.75 and 1

mg l-1 + 400 µg C l

-1 of

the algae

Grazing, mortality, algae

growth rate

6

Pfiesteria sp. 18

D. magna Scenedesmus sp. 4 current velocities: 0,

3.5, 7 and 10.5 m h-1 +

400 µg C l-1 of the al-

gae

Grazing, algae growth

rate, flush-out rate

3

Zooplankton feeding rates were measured in standard bottle incubations (e.g., Koski et al.

1998). In short, algae concentrations in the cultures were measured using an electronic parti-

cle counter for oval cells and an inverted microscope for colonial cells, a food suspension

containing 400 µg C l-1

was prepared and added to the different bottles, and zooplankton was

added individually to most of the bottles. Triplicate controls for algae growth in the absence of

grazers were set up without zooplankton.

The algae concentrations were measured at the start and end of the incubations, and clear-

ance (volume that zooplankton has searched for particles) and ingestion rates of zooplankton

and algae growth rates were calculated based on the disappearance of particles in the bottles

containing zooplankton compared to the control bottles where only algae were present (Frost

1972). After incubations were terminated, the condition (dead, alive and inactive, alive and

active) of zooplankton was checked under a binocular microscope. Clearance, ingestion and

mortality rates of both zooplankton species and algal growth rates were tested for differences

between algal species using a 1-way analysis of variance (ANOVA), and a Tukey HSD post

hoc test.

Similar set up was used to test the effect of PAA on Daphnia magna feeding and mortality, to

evaluate whether a combination of chemical and biological control would be feasible. Since D.

magna had a higher clearance rate than the cyclopoid (Fig. 11.1), this species was also used

to investigate the effect of flow velocity. These experiments tested both the ability of D. magna

to remain in the system when the flow velocity was increased, and its ability to feed, using a

specially designed set up simulating a small-scale RAS. For details of all experiments, see

Pinyol Gallemí (2016).

11.3 Results

Both Daphnia magna and the unidentified cyclopoid fed on all toxic algae, at rates which for D.

magna were similar or higher, and for the cyclopoid up to 50% lower, than the rates on non-

toxic algae (Fig. 29). Both species were able to reduce the concentrations of algae to induce

negative growth rates, which suggested that these species could potentially control the popu-

lation growth of the algae (Fig. 29). However, feeding on P. parvum and Pfiesteria sp. resulted

in elevated mortality, ranging from 10-20% for the cyclopoid to 30-40% for D. magna (Fig. 30).


The mortality of D. magna could be reduced to < 10% when 0.5-1 mg PAA l-1

was added to the

incubations, without any substantial effect of the chemical on D. magna feeding rate (Pinyol

Gallemí, 2016).

Algae growth

Specifi

c g

row

th (

h-1)

-0,030

-0,025

-0,020

-0,015

-0,010

-0,005

0,000

Algae growth

-0,030

-0,025

-0,020

-0,015

-0,010

-0,005

0,000

Clearance rate

Ml in

d.-1

h-1

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Clearance rate

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Ingestion rate

Skeletonema

Microcystis

Prymnesium

Pfiesteria

g C

(g C

)-1 h

-1)

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

Ingestion rate

Skeletonema

Microcystis

Prymnesium

Pfiesteria

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

a) Daphnia magna b) Cyclopoid sp.

FIGUR 29. a) Daphnia magna and b) cyclopoid copepod grazing performance depicted as

growth reduction of algae (h-1

; mean; SD; top panel), clearance rate (mL·ind-1

·h-1

; mean; SD;

center panel) and weight-specific carbon ((μg C)-1

h-1

; mean; SD; lowest panel) ingestion. Note

different scales of the y-axis. Algae include Scenedesmus, Microcystis, Prymnesium and

Pfiesteria.

Based on the clearance rates of D. magna on toxic algae, we could calculate that ca. five D.

magna individuals l-1

could result in a zero growth rate of the algae (Fig. 31). Supplementary

trials operated with increased flow rates of 7 and 10.5 m h-1

, common for RAS, induced a

reduction in Daphnia magna feeding rate, and resulted in a loss of up to 80% of the individuals

over a 24-h period (Table 11).

TABEL 11. The effect of flow velocity on Daphnia magna survival (flush- out rate) and clearance rates.

Flow (m h-1

) Percentage (%) flushed out Clearance rate

(ml ind.-1

h-1

)

1-h incubation 24-h incubation

0 0 0 6 ± 0.05

3.5 0 40 6.2 ± 1.1

7 10 60 3.5 ± 0.6

10.5 20 80 3.2 ± 0.4

59

FIGUR 30. Average mortality (mean % ± SD) observed after the 24 – hour grazing experiment.

The zeros (0) indicates “no mortality”.

FIGUR 31. Relation between Daphnia density (ind·L-1

) and the algae growth (h-1

) in different

experiments. Pfiesteria appears in grey and Prymnesium in yellow.


11.4 Conclusions

Our preliminary study on the biological control indicated that there is a potential for developing

zooplankton grazing on toxic algae as an alternative or supplement for chemical treatment.

This would be particularly beneficial if the toxic species consist of cyst-forming algae (see also

chapter 6), or if the environmental regulation of PAA discharge is increased (Pinyol Gallemí,

2016). Although the number of D. magna which is needed per volume of water to induce nega-

tive growth of the algae is feasible, the flow velocity in RAS will pose a challenge. However,

effective removal of toxic algae could be obtained by adding a ‘Daphnia component’ in terms

of a plug-and-play zooplankton unit that can be inserted in the RAS loop to further treat the

water to the present RAS (Pinyol Gallemí, 2016).

Although our preliminary study has shown that there is potential for biological control of toxic

algae in RAS, much remained to be investigated. For instance, Daphnia spp. are known to be

able to adapt to toxic algae (Hairston et al. 1999; Gustafsson and Hansson, 2004), as well as

to metabolize and breakdown the toxins (Teegarden et al. 1996; Wojtal-Frankiewicz et al.

2013), and the biological control could thus be optimized in terms of high feeding rate and low

mortality of Daphnia, but could also include an element of toxin breakdown in the organism.

Also, since Daphnia spp. are freshwater organisms, a corresponding zooplankton species for

brackish and marine aquaculture should be identified. Finally, biological control needs to be

tested in a more realistic setting (small-scale RAS), and the technical and feasibility challenges

need to be addressed.

61

12. Konklusioner

I dette projekt blev effekten af forskellige pereddikesyre (PES) doseringsformer undersøgt ved

at anvende lave, realistiske doseringsmængder i forskellige typer forsøg og vandmatricer.

Hverken pulsdosering eller kontinuerlig PES dosering påvirkede fiskenes vækst og overlevel-

se, men pulsdosering medførte en forbigående stress-respons hos ørreder. Forsøget indike-

rede også, at en udjævnet tilførsel af PES ikke førte til en forventet antimikrobiel effekt – men

tilsyneladende førte til biofilm tilvækst.

Efterfølgende viste PES doseringsforsøg i statiske tanke med RAS vand, at kontinuerlig PES

tilførsel medførte øget bakteriel aktivitet i vandfasen og i biofilmen. I begge ovenstående for-

søg var den kontinuerlige tilførte lave mængde PES blev omsat så der ikke kunne måles aktivt

PES i det opblandende vand.

To forskellige undersøgelser med kontinuerlig PES dosering på kommercielle anlæg viste et

andet mønster. Her var hovedkonklusionen, at den ønskede PES koncentration (ca. 0,15 mg

PES/l) kunne leveres centralt og opretholdes ved indløbet til dammene hvori der foregik en

betydelig omsætning af PES. På recirkulerede anlæg var det også muligt at dosere PES i den

ønskede koncentration hvor der foregik en kraftig omsætning af PES gennem produktionsen-

hederne så PES ikke blev akkumuleret. Sidstnævnte form for vandbehandling var mulig over

en 4 ugers periode hvor al PES blev omsat i anlægget uden at hæmme aktiviteten af biofiltre-

nes nitrificerende bakterier.

Kontinuerlig PES dosering på kommercielle ferskvandsanlæg viste sig således mulig, mens

kontinuerlig PES dosering i lukkede/statiske opstillinger indikerede, at PES kan øge den bak-

terielle forekomst og aktivitet. For at der indtræder en reel antimikrobiel effekter, er det nød-

vendigt, at dosere PES i en tilstrækkelig høj dosering (> 0,05 mg PES/l i den behandlede

vandfase). Ved kontinuerlig dosering med for lave doser (underdosering), bliver den aktive

PES opbrugt hvorved acetatdelen (fra produktet og ved omsætning af PES) sandsynligvis

kommer til at indgå som et biotilgængeligt substrat der fremmer den bakterielle vækst. Sidst-

nævnte mekanisme er illustreret i en statisk forsøgsopstilling, hvor kontinuerlig PES førte til en

forøgelse i mikro-partikulært indhold (nydannede bakterier) i forhold til ikke behandlede kon-

trolgrupper.Et dosis-responsforsøg med PES mod giftige heterotrof dinoflagellat viste, at PES

kunne reducere antallet af celler, men at hvilesporerne var i stand til at komme sig efter ophørt

PES eksponering.

En alternativ behandling til lignende uønskede og komplicerede mikro-alger blev forsøgt løst

ved biologisk kontrol. Her viste forsøg under kontrollede betingelser, at såvel vandlopper som

dafnier var i stand til at leve af og græsse på 5 forskellige mikroalger, herunder den pågæl-

dende giftige dinoflagellat.

PES omsætningen foregår hurtig (halveringstider på < 1 time), og det har en række drifts-

mæssige fordele blandt andet at biofiltre kan skånes og PES udledningen kan forhindres. Der

er efterhånden kendskab til øvre doseringsgrænser i forskellige anlægstyper, hvor fisk, biofilter

og vandmiljøet potentielt kan beskadiges. Men, der er forsat udfordringer ved at anvende PES,

og indeværende projekt peger på, at det ikke kun er den øvre tilladelige PES grænse i stoffets

behandlingsråderum der er nødvendig at fastlægge.


Ved for lav PES dosering kan der opstå en på flere måder uhensigtsmæssig underdosering.

Der er fortsat vanskeligt, at fastlægge en margen for korrekt PES dosering, idet der er en

række praktiske forhold der gør moniteringen af PES vanskeligt, eksempelvis at, i) stoffet

doseres i meget små doser (1-10 ml/m3); residual-koncentrationer typisk er << 0,5 mg PES/l;

ii) PES nedbrydningen foregår hurtigt og forstærkes af tilstedeværelsen af organisk materiale

(i vandfasen og ved kontakt med overflader) og overgangsmetaller (Fe, Co og Mn i saltvand);

iii) der mangler nemt og pålideligt udstyr til at måle den faktiske PES koncentration i felten, og

iv) at den tiltænkte effekt kan være vanskelig at bekræfte eller kvantificere under industribetin-

gelser.

I tilfælde hvor vandbehandling er symptombehandling på tilstedeværelsen af for høje mæng-

der biologisk tilgængeligt organisk materiale, vil indsatsen med fordel kunne rettes mod drifts-

optimering eksempelvis metoder og rutiner til effektivt at fjerne opløst og partikulært organisk

stof.

63

13. Perspektivering

Pereddikesyre (PES) har vist sig, at være et velegnet desinfektionsmiddel der i mange situati-

oner kan erstatte formalin i akvakultur. Begge desinfektionsmidler anvendes i betydelige

mængder, men mens der er årtiers praktisk erfaring med brugen af formalin er kendskabet til

PES’s potentiale – fordele som ulemper – ikke belyst i samme omfang.

Med den nuværende udvikling af opdrætssektoren, tilgængelig teknologi og produktionsom-

kostninger in mente, er det ikke sandsynligt, at behovet for vandbehandling og desinfektion vil

aftage. Snarere tværtimod. Opdræt af fisk er støt stigende og udviklingen går kun i en retning

– herimod flere recirkulerede anlæg og højere grad af genbrug af vandet. Der vil således

komme flere anlæg med lang opholdstid, gunstige næringsbetingelser for bakterier og parasit-

ter og dermed et vedvarende behov for kemisk kontrol af vandkvaliteten.

Med den nuværende viden er det ikke afklaret om langvarig kontinuerlig PES dosering samlet

set er en bedre løsning end daglige PES pulsdoseringer. Vandbehandling med PES pulsdose-

ring fungerer i både mindre og større skala, og tilsvarende er der gode erfaringer med konti-

nuerlig dosering på kommercielle ferskvandsdambrug. Resultaterne fra indeværende projekt

viser, at PES dog kan doseres i for lave mængder i lukkede anlæg og dermed have uhen-

sigtsmæssige konsekvenser i form af manglende effektivitet og indirekte substratberigelse.

Overordnet set, er brug af desinfektionsmidler ikke ideel, men er et af de få vigtige og konkrete

praktiske værktøjer der kan anvendes når vandkvaliteten skal sikres. Ved at gå et skridt tilba-

ge og fokusere indsatsen på mekanisk fjernelse af mikropartikler (membranfiltrering, luftflotati-

on eller proteinskimning med ozon) og derved reducere fødegrundlaget for mikroorganismer,

er der måske her en mulig kommende vej mod mindre brug af desinfektionsmidler. En anden

vej kunne teoretisk set være, at lade biologisk kontrol (græsning af mikroalger med zooplank-

ton) være styrende for opretholdelse af vandkvaliteten i visse RAS. Dette projekt har med

simple forsøg illustreret, at såvel vandloppe som dafnie kan reducere forekomsten af giftige

alger og der foreligger muligvis et uudnyttet potentiale for miljøvenlig vandrensning.

Det forventes, at PES fremover med fordel vil kunne blive brugt til terminal desinfektion (ideelt

sterilisation; total bakteriedrab og eliminering af sporer og vira) af RAS anlæg. Nuværende

begyndende praksis omfatter typisk brug af lud til at hæve vandets pH > 12, og lade vandet

cirkulere i et døgn. PES og HP kunne her supplere desinfektionsprocessen, alternativt helt

erstatte lud eller formalin til denne proces. Udledningen af PES i disse situationer vil i så fald

kunne kontrolleres ved at lade overskydende PES passere en plantelagune, et kontaktfilter

eller et træflisfilter hvorved komplet omsætning kan sikres.

Såvel i produktionen som i udløbsvandet er der behov for (online) målemetoder eller sticks der

kan måle den faktiske PES koncentration. Udvikling af denne type målinger vil være kraftigt

medvirkende til yderligere implementering af bedre vandbehandlingsprocedurer i akvakultur-

erhvervet.


14. Referencer

Antonelli, M., Mezzanotte, V., Panouillères, M. 2009. Assessment of peracetic acid disinfected

effluents by microbiotest. Environ. Sci. Technol. 43: 6579 – 6584.

Arvin, E., Pedersen, L. F. (2015). Hydrogen peroxide decomposition kinetics in aquaculture

water. Aquacultural Engineering, 64: 1-7.

Attramadal, K.J.K., Truong, T.M.H., Bakke, I., Skjermo, J., Olsen, Y., Vadstein, O., 2014. RAS

and microbial maturation as tools for K-selection of microbial communities improve survival in

cod larvae. Aquaculture 432, 483-490.

Baldry, M. G. C., French, M. S., & Slater, D. (1991). The activity of peracetic acid on sewage

indicator bacteria and viruses. Water Science and Technology, 24(2), 353-357.

Baldry, M.G.C., (1983). The bactericidal, fungicidal and sporicidal properties of hydrogen per-

oxide and peracetic acid. J. Appl. Bacteriol., 54: 417–423.

Blancheton, J. P., Attramadal, K. J. K., Michaud, L., d'Orbcastel, E. R., Vadstein, O. (2013).

Insight into bacterial population in aquaculture systems and its implication. Aquacultural Engi-

neering, 53: 30-39.

Block, S.S. (2001). Peroxygen compounds. In Disinfection, sterilization, and preservation; Ed.

S. S. Block, 5th edition, pp. 1482. Lea & Febiger, Philadelphia, Pa. ISBN 0-683-30740-1.

Burson, A., Matthijs, H.C.P., de Bruijne, W., Talens, R., Hoogenboom, R., Gerssen, A., Visser,

P.M., Stomp, M., Steur, K., van Scheppingen, Y. (2014). Termination of a toxic Alexandrium

bloom with hydrogen peroxide. Harmful Algae, 31: 125–135.

Canelhas, M.R., Andersson, M., Eiler, M., Lindström, E.S, Bertilsson, S. (In Press) Influence

of pulsed and continuous substrate inputs on freshwater bacterial community composition and

functioning in bioreactors. Environmental Microbiology, ‘Accepted Article’, doi: 10.1111/1462-

2920.13979.

Chhetri, R.K., Baun, A., Andersen, H.R. (2016). Algal toxicity of the alternative disinfectants

performic acid (PFA), peracetic acid (PAA), chlorine dioxide (ClO2) and their by-products hy-

drogen peroxide (H2O2) and chlorite (ClO2−). International Journal of Hygiene and Environ-

mental Health, 220, 3: 570-574

Chislock, M. F., Sarnelle, O., Jernigan, L. M., Wilson, A. E. (2013). Do high concentrations of

microcystin prevent Daphnia control of phytoplankton? Water Research, 47, 6: 1961–1970.

Clay,J.W. 2008. The role of better management practices in environmental management. In

Environmental best management practices for aquaculture; Eds. C.S. Tucker & J.A. Har-

greaves. Blackwell Publishing, pp. 592. ISBN-13: 978-0-8138-2027-9.

Davidson, J.Good, C., Straus, D. Schrader, K. & Summerfelt, S. 2017. Is continuous peracetic

acid dosing in RAS really as good as ozone? Presentation at the 2017 Aquaculture Innovation

Workshop (AIW), Vancouver, B.C., Nov. 2017.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/14384639


65

DeMott, W, R. 1986: The role of taste in food selection by freshwater zooplankton. Oecologia

69: 334-340.

DeMott, W, R. 1989: Optimal foraging theory as a predictor of chemically mediated food selec-

tion by suspension-feeding copepods. Limnol. Oceanogr. 34: 140-154.

Drábková, M., Admiraal, W., & Maršálek, B. 2007. Combined exposure to hydrogen peroxide

and light selective effects on cyanobacteria, Green Algae, and diatoms. Environmental science

& technology, 41(1), 309-314.

Dröge, W. (2002). Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82:

47–95.

ECETOC, 2001. Joint Assessment of Commodity Chemicals (JACC) report No. 40. Peracetic

Acid (CAS No. 79-21-0) and its Equilibrium Solutions.

EU Biocidforordning, 528/2012. Regulation (EU) No 528/2012 concerning the making available

on the market and use of biocidal products Evaluation of active substances Assessment Re-

port Peracetic acid Product-types 1-6.

http://dissemination.echa.europa.eu/Biocides/ActiveSubstances/1340-02/1340-

02_Assessment_Report.pdf

EU, 2009. EU Commission Regulation (EC) No.710/09 of 5 August 2009 Amending Regulation

(EC) No 889/2008 Laying Down Detailed Rules for the Implementation of Council Regulation

(EC) No 834/2007, as Regards Laying Down Detailed Rules on Organic Aquaculture Animal

and Seaweed Production. Accessed November, 2016. http://eur-lex.europa.eu/legal-

content/EN/TXT/? qid¼1478071607821&uri¼CELEX:32009R0710

European Chemicals Agency (2013a). HPV-LPV Chemicals Information System. Available

[Online]: http://esis.jrc.ec.europa.eu/index.php?PGM=hpv [Accessed on]: June 14, 2013. Da-

tabase: HPVCs (High Production Volume Chemicals) and LPVCs (Low Production Volume

Chemicals).

Fernandes, P. M., Pedersen, L. F., Pedersen, P. B. (2017). Influence of fixed and moving bed

biofilters on micro particle dynamics in a recirculating aquaculture system. Aquacultural Engi-

neering, 78 A: 32-41.

Finnegan, M., Linley, E., Denyer, S.P., McDonnell, G., Simons, C., Maillard, J.Y. (2010) Mode

of action of hydrogen peroxide and other oxidizing agents: differences between liquid and gas

forms. J. Antimicrob. Chemother, 65: 2108–2115.

Fish, F. F. (1940). Formalin for External Protozoan Parasites: A Report on the Prevention and

Control of Costia Necatrix. The Progressive Fish-Culturist, 7, 48: 1-10.

Flores, M.J., Lescano, M.R., Brandi, R.J., Cassano, A.E., Labas, M.D., (2014). A novel ap-

proach to explain the inactivation mechanism of Escherichia coli employing a commercially

available peracetic acid. Water Sci. Technol., 69: 358–63. doi:10.2166/wst.2013.721

Frost B.W. (1972) Effects of size and concentration of food particles on the feeding behaviour

of the marine planktonic copepod Calanus pacificus. Limnol Oceanogr 17:805-815

Gallemi Pinyol, A. 2016. Testing biological methods to control harmful algae in recirculating

aquaculture systems. Master Thesis, DTU Aqua, p. 82.

http://dissemination.echa.europa.eu/Biocides/ActiveSubstances/1340-02/1340-02_Assessment_Report.pdf

http://dissemination.echa.europa.eu/Biocides/ActiveSubstances/1340-02/1340-02_Assessment_Report.pdf


Gehr, R., Cochrane, D., 2002. Peracetic acid (PAA) as a disinfectant for municipal

wastewaters: encouraging performance results from physicochemical as well as biological

effluents. Proceedings of the Water Environment Federation. 182-198.

Godhe, A., Asplund, M., Härnström, E., Saravanan, K., Tyagi, V., Karunasagar, A. (2008)

Quantification of Diatom and Dinoflagellate Biomasses in Coastal Marine Seawater Samples

by Real-Time PCR. Appl. Environ. Microbiol., 74: 7174–7182.

Greenspan, F.P., MacKellar, D.G. (1951). The application of peracetic acid germicidal washes

to mold control of tomatoes. Food Technology, 5: 95-97.

Gustafsson, S., Hansson, L. A. (2004). Development of tolerance against toxic cyanobacteria

in Daphnia. Aquatic ecology, 38, 1: 37-44.

Hairston, N. G., Holtmeier, C. L., Lampert, W., Weider, L. J. (1999). Natural selection for graz-

er resistance to toxic cyanobacteria: Evolution of phenotypic plasticity. Evolution, 55: 2203-

2214.

Hamlin, H.J. Michaels, C.M. Beaulaton, W.F. Graham, W. Dutt, P. Steinbach, T.M. Losordo,

K.K. Schrader, K.L. Main. 2008. Comparing denitrification rates and carbon sources in com-

mercial scale upflow denitrification biological filters in aquaculture. Aquacultural Engineering,

Vol. 38, 79-92.

Heinecke, R.D., Buchmann, K. (2009). Control of Ichthyophthirius multifiliis: dose response

trials using sodium percarbonate and water filtration. Aquaculture 288: 32-35.

Henriksen, N. H., Pedersen, L. F. 2015. Netværk for formalinudfasning. Faglig rapport 2015-10

fra Dansk Akvakultur, 63 sider.

Henriksen, N.H. 2015. Optimeret Arbejdsmiljø på dambrug Faglig rapport 2015-1 fra Dansk

Akvakultur,

30 sider.

ISO 10253:1995. Water quality – Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costa-

tum and Phaeodactylum tricornutum. International Standard Organization. Geneva Switzer-

land.

ISO 11348-3:2007. Water quality – Determination of the inhibitory effect of water samples on

the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) – Part 3: Method using freeze-

dried bacteria. International Standard Organization. Geneva Switzerland.

ISO 14669:1999. Water quality – Determination of acute lethal toxicity to marine copepods

(Copepoda, Crustacea). International Standard Organization. Geneva Switzerland.

ISO 6341:1989. Water quality – Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia

magna Straus (Cladocera, Crustacea). International Standard Organization. Geneva Switzer-

land.

ISO 8692, 2012. Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with unicellular green

algae. International Standard Organization. Geneva Switzerland.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Godhe%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18849462

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Asplund%20ME%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18849462

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=H%26%23x000e4%3Brnstr%26%23x000f6%3Bm%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18849462

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Saravanan%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18849462

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tyagi%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18849462

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Karunasagar%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18849462

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2592920/

67

Iwase, T., A. Tajima, S. Sugimoto, K. Okuda, I. Hironaka, Y. Kamata, K. Takada & Y. Mizunoe.

2013. A simple assay for measuring catalase activity: a visual approach. Sci. Rep., 3: 3081-

3058.

Jaafar, R.M., J.A. Kuhn, J.K. Chettri, and K. Buchmann. 2013. Comparative efficacies of sodi-

um percarbonate, peracetic acid, and formaldehyde for control of Ichthyobodo necator—an

ectoparasitic flagellate from rainbow trout Acta Ichthyol. Piscat., 43 (2013), pp. 139-143

Janning, K. Heldbo, J., Heinicke, G., Klausen, M.M. (2012). Teknisk udfasning af formalin:

Udredning af muligheder for: Hygiejnisering af dambrugsvand ved anvendelse af UV- og

Ozonteknologier. DHI rapport, 90 sider.

Jokumsen, A., Svendsen, L. M. (2010). Opdræt af regnbueørred i Danmark. DTU Aqua. Insti-

tut for Akvatiske Ressourcer. Oversigtsrapport, 47 sider.

Jørgensen, L. von G. (2017). The fish parasite Ichthyophthirius multifiliis – Host immunology,

vaccines and novel treatments. Fish & Shellfish Immunology, 67, 586–595.

Jørgensen, T. R., Larsen, T. B., Buchmann, K. (2009). Parasite infections in recirculated rain-

bow trout (Oncorhynchus mykiss) farms. Aquaculture 289:91–94.

Jaafar, R.M., Kuhn, J.A., Chettri, J.K., Buchmann, K. (2013). Comparative efficacies of sodium

percarbonate, peracetic acid, and formaldehyde for control of Ichthyobodo necatordan ecto-

parasitic flagellate from rainbow trout. Acta Ichthyol. Piscat., 43: 139-143.

Kasprzak, P., Padisák, J., Koschel, R., Krienitz, L., Gervais, F. (2008) Chloro-

phyll a concentration across a trophic gradient of lakes: An estimator of phytoplankton bio-

mass? Limnologica - Ecology and Management of Inland Waters, 38: 327-338.

Kerkaert, B., Mestdagh, F., Cucu, T., Aedo, P. R., Ling, S. Y., De Meulenaer, B. (2011). Hypo-

chlorous and peracetic acid induced oxidation of dairy proteins. Journal of agricultural and

food chemistry, 59, 3: 907-914.

Kitis, M. 2004. Disinfection of wastewater with peracetic acid: a review. Environment Interna-

tional, 30: 47-55.

Kouba, A., Kuklina, I., Niksirat, H., Máchová, J., Kozák, P. 2012. Tolerance of signal crayfish

(Pacifastacus leniusculus) to Persteril 36 supports use of peracetic acid in astaciculture. Aq-

uaculture 350 – 353: 71 – 74.

Koski, M., Klein Breteler, W.C.M., and Schogt, N. (1998). Effect of food quality on rate of

growth and development of the pelagic copepod Pseudocalanus elongatus (Copepoda, Cal-

anoida). Mar Ecol Prog Ser 170:169–187.

Larsen, V. J., Henriksen, N. H., Pedersen, L. F., & Jokumsen, A. (2015). Udvikling af dansk

økologisk yngelopdræt. Faglig rapport.

Leggett, M. J., Schwarz, J. S., Burke, P. A., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y.

(2016). Mechanism of sporicidal activity for the synergistic combination of peracetic acid and

hydrogen peroxide. Applied and environmental microbiology, 82, 4: 1035-1039.

Liberti,L. & M. Notarnicola. 1999. Advanced treatment and disinfection for municipal

wastewater reuse in agriculture Water Sci. Technol., 40 pp. 235-245

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0075951108000406#!







Liu, D., Steinberg, C.E.W., Straus, D.L., Pedersen, L.-F., Meinelt, T. (2014). Salinity, dissolved

organic carbon and water hardness affect peracetic acid (PAA) degradation in aqueous solu-

tions. Aquacultural Engineering. 60, 35-40.

Liu, D., Straus, D. L., Pedersen, L. F., & Meinelt, T. (2017). Pulse versus continuous peracetic

acid applications: Effects on rainbow trout performance, biofilm formation and water quali-

ty. Aquacultural Engineering, 77: 72-79.

Liu, D., Straus, D. L., Pedersen, L.-F., Meinelt, T. (2015). Comparison of the Toxicity of

Wofasteril Peracetic Acid Formulations E400, E250, and Lspez to Daphnia magna, with Em-

phasis on the Effect of Hydrogen Peroxide. North American Journal of Aquaculture.

Luukkonen, T., Pehkonen, S. O. (2017). Peracids in water treatment: A critical review. Critical

Reviews in Environmental Science and Technology, 47, 1: 1-39.

Marchand, P.-A., Phan, T.-M., Straus, D.L., Farmer, B.D., Stüber, A., Meinelt, T., 2012.

Reduction of in vitro growth in Flavobacterium columnare and Saprolegnia parasitica by

products containing peracetic acid. Aquac. Res. 43, 1861–1866.

Martins, C.I.M., Eding, E.H., Verdegem, M.C.J., Heinsbroek, L.T.N., Schneider, O., 2010. New

developments in recirculating aquaculture systems in Europe: A perspective on environmental

sustainability. Aquacultural Engineering, Vol.43, 83–93.

Masters, A.L. (2004). A review of methods for detoxification and neutralization of formalin in

water. North American Journal of Aquaculture 66: 325-333.

Meinelt, T., Phan, T.M., Behrens, S., Wienke, A., Pedersen, L.F., Liu, D., Straus, D.L., 2015.

Growth inhibition of Aeromonas salmonicida and Yersinia ruckeri by disinfectants containing

peracetic acid. Dis. Aquat. Org. 113, 207–213.

Meinertz, J. R., Greseth, S. L., Gaikowski, M. P., & Schmidt, L. J. (2008). Chronic toxicity of

hydrogen peroxide to Daphnia magna in a continuous exposure, flow-through test sy-

stem. Science of the total environment, 392(2), 225-232.

Miljø-og Fødevareministeriet, 2017. Punktkilder 2015. Rapport fra MFVM, Styrelsen for vand –

og naturforvaltning, ISBN 978-87-7175-570-1, 114 sider.

Moestrup, Ø., Hansen, G., Daugbjerg, N., Lundholm, N., Overton, J., Vestergård,

M.,Steenfeldt, S.J., Calado, J.C., Hansen, P. J. (2014). The dinoflagellates Pfiesteria shum-

wayae and Luciella masanensis cause fish kills in recirculation fish farms in Denmark. Harmful

Algae, 32: 33-39.

Muñío, M. M., Poyatos, J. M. (2010). Water disinfection using peracetic acid. In: Water Recy-

cling and Water Management. Editor: Daniel M. Carrey. ISBN 978-1-61761-305-0, p. 1-24

Murray, F., Bostock, J., Fletcher, D. (2014). Review of recirculation aquaculture system tech-

nologies and their commercial application. Report from University of Stirling, p. 75.

Noble, A.C., Summerfelt, S.T. (1996). Diseases encountered in rainbow trout cultured in recir-

culating systems. Annu. Rev. Fish Dis. 6: 65-92.

69

Oosterveld, R., Koski, M., Pedersen, L.-F., Pedersen, B.P. The Swarm revisited – A case

study on seasonal development of microalgae blooms in a saltwater recirculating aquaculture

system. Unpubl. Manuscript.

Patterson, R.N., Watts, K.C., 2003. Micro-particles in recirculating aquaculturesystems: parti-

cle size analysis of culture water from a commercial Atlanticsalmon site. Aquacultural Engi-

neering, Vol. 28: 99–113

Pechacek, N., Osorio, M., Caudill, J., Peterson, B. 2015. Evaluation of the toxicity data for

peracetic acid in deriving occupational exposure limits: a mini review. Toxicol Lett. Vol.

233:45–57.

Pedersen, L.-F., Pedersen, P.B. Nielsen, J.L., Nielsen, P.H. (2009). Peracetic acid degrada-

tion and effects on nitrification in recirculating aquaculture systems. Aquaculture 296: 246-254.

Pedersen, L. F., Buchmann, K., Clausen, T., & Henriksen, N. H. (2013A). Introduktion og ny

viden om hjælpestoffer i danske akvakultur. Ministeriet for Fødevarer, Landbrug og Fiskeri.

Faglig rapport fra dansk Akvakultur nr. 2013-1; 57 sider.

Pedersen, L. F., Meinelt, T., & Straus, D. L. (2013B). Peracetic acid degradation in freshwater

aquaculture systems and possible practical implications. Aquacultural engineering, 53, 65-71.

Pedersen, L. F., & Henriksen, N. H. (2017). Semi-continuously addition of peracetic acid to a

flow-through fish farm. Journal of Cleaner Production, 142: 2606-2608.

Pedersen, P. B., von Ahnen, M., Fernandes, P., Naas, C., Pedersen, L. F., Dalsgaard, J.

(2017). Particle surface area and bacterial activity in recirculating aquaculture sys-

tems. Aquacultural Engineering. Vol. 78: 18-23

Pedersen, P. O., E. Brodersen, D. Cecil. (2013). Disinfection of tertiary wastewater effluent

prior to river discharge using peracetic acid; treatment efficiency and results on by-products

formed in full scale tests. Water Science & Technology 68, 8: 1852-1856.

Pinyol-Gallemí, A. Koski, M., Pedersen, L-F. (in prep.). Towards control of unwanted cyst-

forming dinoflagellates in aquaculture systems: Knockout and recovery of Pfiesteria sp. after

peracetic acid exposure.

Pinyol-Gallemí, A. (2016). Testing biological methods to control harmful algae blooms in recir-

culating aquaculture systems. Master Thesis at Technical University of Denmark, DTU Aqua,

p. 82.

Rajala-Mustonen, R. L., Toivola, P. S., Heinonen-Tanski, H. (1997). Effects of peracetic acid

and UV irradiation on the inactivation of coliphages in wastewater. Water science and technol-

ogy, 35, 11-12: 237-241.

Reeslev, M., Nielsen, J., Rogers, L. (2011). Assessment of the bacterial contamination and

remediation efficacy after flooding using fluorometric detection. J. ASTM Int. 8, 10: 1-5.

Reichwaldt, E. S., Zheng, L., Barrington, D. J., Ghadouani, A. (2011). Acute toxicological re-

sponse of Daphnia and Moina to hydrogen peroxide. Journal of Environmental Engineer-

ing, 138, 5: 607-611.

http://www.aqua.dtu.dk/Service/Telefonbog.aspx?lg=showcommon&id=39745&type=person


Rojas-Tirado, P.A. 2013. Toxic effects on marine organisms of peroxygen compounds used in

aquaculture. Master Thesis at Technical University of Denmark, DTU Aqua, p. 56.

Rojas-Tirado, P., Pedersen, P. B., Pedersen, L. F. (2017). Bacterial activity dynamics in the

water phase during start-up of recirculating aquaculture systems. Aquacultural Engineer-

ing, 78: 24-31.

Rosetta, C. H., McManus, G. B. (2003). Feeding by ciliates on two harmful algal bloom spe-

cies, Prymnesium parvum and Prorocentrum minimum. Harmful Algae, 2, 2: 109-126.

Sanchez-Ruiz C, Martinez-Royano S, Tejero-Monzon I. 1995. An evaluation of the efficiency and impact of raw wastewater disinfection with peracetic acid prior to ocean discharge. Water Sci Technol Vol.32:159–66.

Sanchez-Vizuete, P., Orgaz, B., Aymerich, S., Le Coq, D., Briandet, R. (2015). Pathogens

protection against the action of disinfectants in multispecies biofilms. Frontiers in Microbiology.

https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00705.

Stampi, S., De Luca, G., Zanetti, F., 2001. Evaluation of the efficiency of peracetic acid in the

disinfection of sewage effluents. Journal of Applied Microbiology, 91: 833-838

Stewart, R.I.A., Dossena, M., Bohan, D.A., Jeppesen, E., Kordas, R.L., Ledger, M.E., Meer-

hoff, M., Moss, B., Mulder, C., Shurin, J.B., Suttle, B., Thompson, R., Trimmer, M., Woodward,

G. (2013) Mesocosm Experiments as a Tool for Ecological Climate-Change Research. Adv.

Ecol. Res., 48: 71-181.

Straus, D.L; T. Meinelt, D. Liu, & L.-F. Pedersen. 2017. Toxicity of peracetic acid to fish: varia-tion among species and impact of water chemistry Journal of World Aquaculture Society. 10.1111/jwas.12475

Tanner, P. A., Wong, A. Y. S. (1998). Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide

in rainwater. Analytica Chimica Acta, 370, 2: 279-287.

Teegarden, G. J., Cembella, A. D. (1996). Grazing of toxic dinoflagellates, Alexandrium spp.,

by adult copepods of coastal Maine: Implications for the fate of paralytic shellfish toxins in

marine food webs. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 196, 1-2: 145–176.

Tucker, C. S., & Hargreaves, J. A. (2008). Environmental Best Management Practices for

Aquaculture Environmental Best Management Practices for Aquaculture Edited by.

Turner, J. 2014: Planktonic marine copepods and harmful algae. Harmful algae 32: 81-93.

Turolla, A., Sabatino, R., Fontaneto, D., Eckert, E.M., Colinas, N., Corno, G., Citterio, B.,

Biavasco, F., Antonelli, M., Mauro, A., Mangiaterra, G., Di Cesare, A. (2017). Defence strate-

gies and antibiotic resistance gene abundance in enterococci under stress by exposure to low

doses of peracetic acid. Chemosphere, 185, 480-488.

Verner-Jeffreys, D.W., Taylor, N.J., (2015). Review of freshwater treatments used in the Scot-

tish freshwater rainbow trout aquaculture industry. In: Scottish Aquaculture Research Forum

Report SARF100.

Vinnerås, B., Holmqvist, A., Bagge, E., Albihn, A., & Jönsson, H. (2003). The potential for

disinfection of separated faecal matter by urea and by peracetic acid for hygienic nutrient re-

cycling. Bioresource Technology, 89, 2: 155-161.

https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00705

71

Wagner,M., Brumelis,D., and Gehr,R. 2002. Disinfection of wastewater by hydrogen peroxide

or peracetic acid: Development of procedures for measurement of residual disinfectant and

application to a physicochemically treated municipal effluent. Water Environment Research,

74: 33-50.

Wessels, S., Ingmer, H. (2013). Modes of action of three disinfectant active substances: A

review. Regulatory Toxicology and Pharmacology. https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2013.09.006

Wojtal-Frankiewicz, A., Bernasińska, J., Jurczak, T., Gwoździński, K., Frankiewicz, P., & Wie-

lanek, M. (2013). Microcystin assimilation and detoxification by Daphnia spp. in two ecosys-

tems of different cyanotoxin concentrations. Journal of Limnology, 72, 1: 13.

Wooster, G.A., Martinez, C.M., Bowser,P.R. (2005). Human health risks associated with for-

malin treatments used in aquaculture: Initial study. North American Journal of Aquaculture 67:

111-113.

Yuan, Z., Ni, Y., Van Heiningen, A.R.P., 1997. Kinetics of the peracetic acid decomposition:

part II: pH effect and alkaline hydrolysis. Can. J. Chem. Eng. 75 (1), 42-47.

https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2013.09.006

Miljøstyrelsen

Haraldsgade 53

2100 København Ø

www.mst.dk

Biocider - Miljøneutral vandbehandling i akvakultur

I denne rapport undersøgte forskere, hvordan biocidet og desinfektionsmidlet, pered-

dikesyre, bedst kan anvendes til vandbehandling på dambrug. Pereddikesyre er et

alternativ til det mest anvendte desinfektionsmiddel formalin, hvor stoffet er mere

fordelagtigt i forhold til arbejdssikkerhed og påvirkning af miljøet. Desinfektionsmid-

lerne anvendes forebyggende til vandbehandling på dambrug. Det sikrer, at mæng-

den af bakterier, skimmelsvampe, alger og parasitter i vandet holdes på et accepta-

belt niveau. Rapporten peger på områder, hvor der kræves opmærksomhed ved

anvendelse af pereddikesyre inden for akvakultur. Hvis der kontinuerligt tilføres van-

det en lav mængde pereddikesyre, kan det medføre uønsket bakterievækst og bio-

filmdannelse – altså modsat den ønskede effekt ved en desinfektion. Forsøg viste

desuden, at det var vanskeligt at kontrollere alle former for parasitter i vandet ved

brug af pereddikesyre. Som muligt alternativ/supplement til pereddikesyre blev der i

rapporten vist et potentiale for at anvende vandlopper og dafnier til at holde mæng-

den af giftige mikroalger i vandet nede. Samlet bidrager rapporten til at kunne fast-

lægge en effektiv strategi for vandbehandlingen i dambrug ved brug af pereddikesy-

re.

Documents

Biocider Miljøneutral vandbehandling i akvakultur...5 1. Forord Dette projekt om miljøneutral vandbehandling i akvakultur (MST-667-00199) blev gennemført i perioden juli 2015 til