Bioensaios celulares: Princípios e Aplicações

Letícia Veras Costa Lotufo Laboratório de Oncologia Experimental

Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC

lvcosta@secrel.com.br

PROGRAMA: •  11/02

– aula 1 - Princípios básicos – Ensaios de citotoxicidade

– aula 2 –Aplicações no estudo de novas drogas anticâncer

•  12/02 – aula 3 – Aplicações no estudo de novas drogas

anticâncer – aula 4 - Morte celular: apoptose versus necrose

CITOESQUELETOMicrotúbulos(Tubulina)ActinaProteínasmotoras Aurora, Póloquinases Quinesinas

MICROTÚBULOS

Segregaçãocromossômica

Aurorapapelcentralnaorientaçãodos

cromossomos

Mayeretal.,1999,Science286,971.

BIOENSAIOS: •  Polimerizaçãodetubulinainvitro

•  Ensaiosdeligação(“binding”)–sítios:taxol,alcalóidesdavincaecolchicina

• Microscopiaconfocal

Polimerização/despolimerizaçãoTubulina

Ensaio clássico – baseia-se na leitura de absorbância a 340 nm

Atualmente pode ser realizado a partir da incorporação de um marcador fluorescentes na tubulina

EnsaiosdeLigação

EnsaiosdeLigação

EnsaiosdeLigação

Ensaiosdesaturação

Ensaiosdecompetição

Log [Ligante] M

Liga

ção

ImunofluorescênciaparacitoesqueletoMicroscopiaconfocal

24hAdiçãodasdrogas

24h

PBSFixadasePermeabilizadas

α‐tubulina24hAc‐Cy53hFaloidina‐FICT

RNAsePI

ZeissLSM510

VIAS DE MORTE CELULAR

Apoptose vs. Necrose

APOPTOSEDefinição

•  Descrita em 1972 e denominada seguindo o termo grego “cair fora”.

•  Termo “ morte programada da célula ( PCD ) ”

Apoptose Apoptose-like PCD Necrose-like PCD

APOPTOSEDefinição

•  “É uma forma de morte celular destinada a eliminar células indesejáveis, do hospedeiro, através da ativação de uma série coordenada e programada de eventos executados por um conjunto exclusivo de produtos gênicos”. ( Robbins, 2000).

APOPTOSE

1.  Durante o desenvolvimento

2.  Mecanismo homeostático para manter as populações celulares nos tecidos

3.  Mecanismo de defesa, como nas reações imunes

4.  Quando as células são lesadas por uma doença ( corpúsculos de Councilman) ou agentes nocivos ( calor, radiação, hipóxica, drogas anti-câncer citotóxicas)

5.  Envelhecimento

MECANISMOS MOLECULARES Via Intrínseca:

MECANISMOS MOLECULARES •  Via extrínsica Ativação de pro-caspases pelo TNF-α e Fas ligante. Receptores da superfície celular associa-se com uma proteína adaptadora com domímio de morte.

•  Apoptose mediada por Fas-Fas ligante ( eliminação de linfócitos ativados de uma reação imune)

MECANISMOS MOLECULARESVia extrínsica

•  ApoptoseinduzidaporTNF TNF–R1TRADDFADD

Ativaçãodofatordetranscriçãonuclear‐κBao estimularadegradaçãodoseuinibidor(IκB)

MECANISMOS MOLECULARES

•  ApoptoseestimuladaporlinfócitosTcitotóxicos

LTC–estimulaasecreçãodeperfurina

Serina‐proteasegranzimaB–clivaproteínascomresíduosde aspartatoe ativacaspases.

•  Apoptoseapósprivaçãodefatordecrescimento

Bcl‐2movem‐separaocitosol

Aumentodapermeabilidadedamembrana

•  ApoptosemediadaporlesãodeDNA

DNAlesado–acúmulodep53–interrompeociclocelularnafaseG1. Falhadoreparoapoptose.

Vias não-apoptóticas de morte celular

•  Necrose•  Mortecelularautofágica•  Mortecelularindependentedecaspase

AtivaçãodecaspasesClivagemdabombadecálcio

FragmentaçãodeDNAporcaspases

Análise morfológica – Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina

Montar placa

24h

Incubar com droga

BE LA

Núcleo

Contagem

Célula viável Célula apoptótica Célula necrótica

MCGAHON et al., 1995

Amostra

Lixo

Fluxo de

Tampão

Laser Filtros Ópticos

Foward Angle Light Scatter

Side Angle Light

Scatter

Green Flourescence (FL1

) Orange

- Red Flourescence (FL2

)

Red Flourescence (FL3

)

Detectores

Sistema Óptico e Eletrônico

Sistema de Luzes

Sistema Fluídico

Sistemas de Controle e Arquivo de Dados

Amostra

Lixo

Fluxo de Amostra

Tampão

Laser

Tampão Tampão

Laser Laser Filtros Ópticos

Side Angle Light

Scatter

Green Flourescence (FL1

) Orange

- Red Flourescence (FL2

)

Red Flourescence (FL3

)

Detectores

Sistema Óptico e Eletrônico

Sistema de Luzes

Sistema Fluídico

Sistemas de Controle e Arquivo de Dados

Fluorescência

Forward Angle Light Scatter

Forward Angle Light Scatter

Side Angle Light Scatter

Green fluorescence

FL1

Red-Orange fluorescence

FL2

Red fluorescence

FL3

Citometria de fluxo

Visão dos Dados •  HISTOGRAMA:

–  Intensidade de fluorescência x número de células

FITC FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

Intensidade de Fluorescência

Num

ber o

f Eve

nts

100 101 102 103 104

Cou

nts

FL-2

Positive cells

INTEGRIDADE DA MEMBRANA CELULAR CITOMETRIA DE FLUXO

Montar placa Incubar

com droga

24h

PI centrifuga

PBS

Fragmentação do DNA Citometria de fluxo

Montar placa Incubar

com droga

24h

PI + tampão de lise

centrifuga

30 mim

DNALadder

Potencial transmembrânico da mitocôndria - Citometria de fluxo

Montar placa Incubar

com droga

24h

Rodamina

centrifugar

15 mim

centrifugar

PBS

Identificação de fosfotidilserina externalizada - Anexina V

+

AtivaçãodeCASPASES

•  Citometriadefluxo

•  WesternBlot(Eletroforese)

•  Kitscolorimétricos•  Kitsfluorimátricos