SADRAJ
BIOHEMIJSKA
GENETIKA....................................................................................................2
OSNOVE MOLEKULSKE STRUKTURE I FUNKCIJE
GENA.................................2 STRUKTURA
DNK.......................................................................................................2
DNK I
GENI...................................................................................................................6
STRUKTURA I TIPOVI
RNK......................................................................................8
REPLIKACIJA
DNK...............................................................................................................12
PROMENE U GRAI
DNK....................................................................................................13
DNK I GENETIKA KONTROLA METABOLIKIH
PROCESA......................................14 GENETIKI
KOD...................................................................................................................14
TRANSKRIPCIJA....................................................................................................................16
TRANSLACIJA.......................................................................................................................21
LITERATURA
........................................................................................................................27
Maturski rad
evrljakovi Iva
BIOHEMIJSKA GENETIKABiohemijska genetika ima zadatak da objasni
osnovne procese ivota, njihovu prirodu i povezanost. Poto u ivim
sistemima prirodu i specifinost svakog hemijskog procesa determiniu
geni, zadatak je biohemijske genetike da tumaenjem mehanizama
regulacije i ekspresije gena objasni procese metabolizma, koji vode
ka ostvarenju specifinih svojstava u okviru fenotipa. Poetne
procese na molekulskom nivou izuava molekularna genetika, iji je
cilj da utvrdi strukturu gena, kako se geni reprodukuju, koji su
primarni produkti funkcije gena to omoguuje da se sagleda kako se
funkcija gena fenotipski ispoljava.
OSNOVE MOLEKULSKE STRUKTURE I FUNKCIJE GENASve do kraja
etrdesetih godina naeg veka smatralo se da se geni sastoje iz
proteina. Caspersson ( 1941 ) i Brachet ( 1942 ) otkrili su da
nukleinske kiseline imaju ulogu u sintezi proteina. Tada se mislilo
da je funkcija nukleinskih kiselina vezana sa replikacijom
proteinskih niti u hromozomu. Tek 1944. godine, Avery, MacLeod i
McCarty su, vrei eksperimente sa bakterijama, definitivno dokazali
da naslednu materiju predstavlja dezoksiribonukleinska kiselina (
DNK ). Da bi se jedna materija mogla nazvati naslednom supstancijom
na kojoj poivaju osnove ivota sa svim svojim specifinostima, ona
mora imati sledea svojstva: 1. sposobnost samoreprodukcije ( tj.
sposobnost da smu sebe stvara ); 2. sposobnost da nosi genetiku
informaciju, tj. da kontrolie prirodu i specifinost biohemijskih
procesa koji omoguavaju razvie pojedinih karakteristika organizma;
3. sposobnost promenljivosti svoje strukture i funkcije, ime se moe
objasniti varijabilnost organizma u prirodi i njihova
evolucija.
STRUKTURA DNKU toku 50-tih godina prikupljen je itav niz
eksperimentalnih dokaza o genetikim karakteristikama DNK. U tome
periodu otkriveno je : 1. da je sadraj DNK u jednoj garnituri
hromozoma postojan; 2. sastav DNK u elijama organizma iste vrste je
takoe postojan; 3. data je pretpostavka da je genetika informacija
sadrana u sloenom rasporedu etiri nukleotida u polinukleotidnom
lancu DNK; 4. hemiari su pokazali da DNK predstavlja polimer u kome
su 3' - 5' C vezama naizmenino povezane fosfatna grupa i
dezoksiriboza; 5. mada postoje velike razlike u rasporedu baza kod
raznih DNK, u svakoj odreenoj DNK koliina adenina (A) jednaka je
koliini timina (T), a takoe koliina guanina (G) jednaka je koliini
citozina (C); 6. dokazano je da DNK prenosi genetiku informaciju
virusa od roditelja ka potomstvu.
2
Maturski rad
evrljakovi Iva
Svi ovi podaci omoguili su da Watson i Crick (1953) predlae
model o strukturi molekula DNK, na osnovu koga je bilo mogue
shvatiti na koji nain ovaj molekul moe da ispuni sva tri gore
navedena uslova, tj. da predstavlja naslednu supstanciju. Prema
predloenom modelu Uotsona i Krika molekul DNK sastoji se iz dva
komplementarna polinukleotidna lanca, koji se meusobno uvijaju u
vidu spirale, povezani vodoninim vezama. Svaki od dva spiralizovana
lanca sastoji se iz niza nukleotida postavljenih naspramno jedan
prema drugome. Nukleotid ( molekulske teine oko 330 ) se sastoji iz
jednog pentoznog eera ( dezoksiriboze ), iz fosforne grupe i iz
jedne od etiri azotne baze ( A, T, G ili C ). Veliina molekula DNK
moe se meriti brojem parova nukleotida u njegovom lancu. Molekul
DNK kod bakterije Escherichia coli sadri nekoliko miliona parova
nukleotida, dok je kod sisara za oko hiljadu puta vei. Spoljnu
stranu dvojno spiralizovanog lanca DNK ini tzv. skeletni deo, koji
se sastoji iz eera dezoksiriboze i fosforne grupe ( PO4 ). Ovi se
naizmenino smenjuju i povezuju tako, da ine spiralnu formaciju.
Naime, fosforna grupa se vezuje za prethodni petougljenini eer
preko ugljenika na poloaju 5a za sledei - preko ugljenika na
poloaju 3 ( Slika
Slika 1: Vezivanje i graa nukleotida koji ulaze u sastav DNK (
gore ) i RNK ( dole ) 3
Maturski rad
evrljakovi Iva
Po deset pentoza i fosfornih grupa se nadovezuje dok se ne
oformi puna spirala ( tj. jedanaesta pentoza se nae u osi prve ), a
duina jednog takvog zavoja iznosi 3,4 nm. Upravo na pravac
prostiranja skeleta polaze azotne baze, koje povezuju naspramno
postavljene pentoze i to preko vodonikovih atoma koji se nalaze
izmeu njih. Ako sa jedne strane lanca polazi dvoprstenasti purin (
adenin ili guanin ), sa naspramne pentoze za njega e se preko
Hatoma vezati jednoprstenasti jednoprstenasti pirimidin ( timin ili
citozin ), i obratno ( Slika 2).
Slika 2 : Nain vezivanja nukleotida koji se nalaze naspramno
jedan prema drugom na dvojnoj spirali molekula DNK Na taj nain se
odrava stalno rastojanje meu komplementarnim bazama dveju niti koje
iznosi oko 0,29 nm a ceo prenik dvojnog heliksa iznosi 2 nm. Treba
rei da molekul DNK moe biti sastavljen izuzetno iz samo jednog
lanca , npr. kod izvesnih faga ( X 174 ), ali onda ima prstenast (
cirkularni ) oblik.
4
Maturski rad
evrljakovi Iva
Razlike meu pojedinim molekulima DNK zasnivaju se, dakle, na
razlikama u broju i redosledu nukleotida, kojih ima ukupno etiri
tipa. Uvek se za adenin vezuje dvojnom Hvezom timin ( A = T ), a
naspram citozina je vezan preko tri vodonikova atoma guanin ( C G
). Grejanjem supstrata u kome se nalazi izolovana DNK, moe da doe
do njenog razlaganja (denaturacije ), odnosno do razdvajanja dva
polinukleotidna lanca iz koji se ona sastoji. Pri tome je utvreno
da su na delovanje temperature otpornije trostruke veze citozina i
guanina, od dvostrukih veza timina i adenina. Proces je
reverzibilan i postepenim hlaenjem se moe uspostaviti normalna
struktura molekula DNK. U uslovima in vitro moe se izvesti spajanje
pojedinih delova rastavljenog lanca DNK koji vode poreklo od
razliitih organizama, pa se tako stvara hibridni molekul DNK.
Primera radi, kada se ova hibridizacija izvede sa DNK oveka i mia,
do uspostavljanja meusobnih veza dolazi na povrini od oko 13 %,
izmeu oveka i bakterije manje od 0,01 %, oveka i ribe lososa oko 5
% i izmeu oveka i majmuna impanze oko 95 % ! Potrebno je istai da
je poreenje vreno sa tzv. neponovljivom klasom DNK, o kojoj emo
neto vie rei u sledeem poglavlju. Metod hibridizacije DNK moe
efikasno da se koristi za utvrivanje stepena genetike slinosti
izmeu pojedinih taksonomskih grupa, a takoe, mogue je da se proceni
brzina nastanka novih rasporeda nukleotida ( novih gena! ) u toku
cele evolucije. Tako npr., Kohne ( 1970 ) je izraunao da se u
proseku kod primata za jednu godinu menja od 2 do 7 nukleotidnih
parova u neponovljivom delu DNK, a za isti period kod glodara
izvrila se zamena kod oko 33 para nukleotida. Naravno, te procene o
brzini promena u nukleotidnom sastavu DNK su minimalne
vrednosti,pre svega jer su zasnovane na podacima dobijenim na
vrstama koje su posle dejstva prirodne selekcije opstale u prirodi.
Danas se, takoe zna da je u molekulu DNK kvantitativna
zastupljenost parova nukleotida G + C u odnosu na A + T
karakteristina za svaku grupu organizama ( Slika 3 ).Udeo GC parova
u DNK viih organizama varira u veoma uskim granicama, tako da moemo
rei da vie biljke i ivotinje u proseku imaju tzv. AT -tip DNK, jer
se kod njih procenat GC parova nukleotida kree u granicama izmeu
35-50 %. Sa slike 3 se moe videti da, to je nii evolucioni status
grupe organizama, to je vea varijabilnost u nukleotidnom sastavu
DNK. Kod protozoa i gljiva opseg variranja u procentu GC-parova ide
od 28-70 %, a kod bakterija i virusa, od 25 do 75 %. Danas nije jo
sasvim objanjena ova zakonomernost u nukleotidnom sastavu DNK
razliitih taksonomskih grupa. Ipak, smatra se da je poveanje broja
AT-parova u evoluciji viih organizama vezano sa razvitkom tzv.
regulatornih oblasti u DNK ( regulatornih gena ) za koje je
utvrdjeno da u veem stepenu sadre te parove nukleotida.
5
Maturski rad
evrljakovi Iva
Slika 3: Grafiki prikaz odnosa GC i AT parova nukleotida kod
razliitih grupa organizama ( Prema: Strickberger, W. A.,Genetics,
MacMillan Co., N. Y.,1968 ).
DNK I GENI
Geni predstavljaju pojedine delove molekula DNK, pa prema tome
imaju odreeno mesto u hromozomu. Veliina ovih delova iznosi od
nekoliko stotina do nekoliko hiljada parova nukleotida, a proseno
se moe uzeti da duina dela DNK koji predstavlja jedan genski lokus
iznosi od 600 - 1800 pari nukleotida, tako da njegova molekulsta
teina iznosi negde oko 500 000. Svaki gen ima sasvim specifinu
primarnu strukturu, koja je uslovljena rasporedom etiri pomenuta
tipa nukleotida u okviru tok dela lanca DNK. Ako se npr. gen
sastoji iz 1000 nukleotida kojih moe biti etiri tipa, ukupno je
mogue da se stvori 41000 kombinacija. Ovo predstavlja ogromnu
cifru, tako da, primera radi, vie puta prevazilazi broj atoma kojih
moe da bude u celom univerzumu! Prema tome, genetika informacija
koju sadri svaki gen vodi poreklo iz sasvim jedinstvenog redosleda
nukleotida u odgovarajuem delu DNK.
6
Maturski rad
evrljakovi Iva
Do skora je postojalo vrlo raireno miljenje da organska
evolucija predstavlja iskljuivo proces koji dovodi do progresivnog
poveanja veliine genoma ( broja gena ). Generalno govorei to je
tano. Uporeujui , na primer, sadraj DNK bakterije E. coli ( oko 2
200000 nukleotidnih parova ), kvasca ( oko 62 miliona nukleotidnih
parova ), morskog jea ( 800 miliona ), maku ( 2,5 milijarde ) i
oveka ( oko 3 milijarde nukleotidnih parova ), dolazimo do jasnog
zakljuka. Isto tako u grupi Vertebrata, prohordate - kao to su
tunikate i amfioksus imaju samo 6 %, odnosno 17 % od veliine genoma
sisara. Ptice, u proseku imaju samo 1/3 genoma koji sadre sisari.
Svi ti navodi su u skladu sa naom predstavom o evoluciji genetikog
materijala: vea kompleksnost organizacije zasnovana je na veoj
koliini genetike informacije sadrane u genomu. Na bazi razmatranja
da broj gena proporcionalno raste sa veliinom genoma, lako se moglo
izraunati koliko u proseku gena sadri koji organizam. Na primer,
poto ovek sadri oko 3 x 109 nukleotidnih parova, s tim da u proseku
jedan gen ima oko 1000 nukleotida, dolazilo se do cifre od 3 x 106
koja bi trebalo da predstavlja broj gena kiji sadre jedinke nae
vrste. Na prvi pogled taj broj sasvim odgovara naim oekivanjima.
Meutim, jo u vreme kada su naa znanja o organizaciji eukariotskih
genoma bila srazmerno mala, broj od 3 miliona gena zbunjivao je
naunike. Naime, uzimajui u obzir prosenu stopu mutacije po genskom
lokusu po generaciji ( oko 10-5 ) moe relativno lako da se izrauna
da populacije organizama koje sadre 3 miliona funkcionalnih gena po
jedinki, jednostavno zbog velike koliine tzv. mutacionih optereenja
ne bi mogle opstati u prirodi. Pod pretpostavkom da je celokupna
DNK sisarskih genoma aktivna, Kimura ( 1968 ) i Kimura i Ohta (
1971 ) su izraunali da bi se zadrala stabilna veliina populacija
potrebno je da svaki par roditelja produkuje 1078 zigota i to da bi
samo nekoliko od njih preivelo! Meutim, ako se poe od stvarne stope
tetnih mutacija kod oveka Crow i Kimura ( 1970 ) su izraunali da bi
na genom sadravao svega oko 4 x 104 gena, ili oko 3 % stvarne
koliine DNK u genomu. Poslednjih nekoliko godina ustanovilo se da
postoji odreena funkcionalna deferencijacija du DNK molekula kod
viih organizama i da je prethodno navedena cifra ( 40 000 gena kod
ljudi ) po svoj prilici tana, bar kad su u pitanju tzv.strukturni
geni . Naime, intenzivna istraivanja strukture genoma eukariota
pokazala su da, u principu, DNK moemo podeliti, prema rasporedu
sekvenci nukleotida, u tri velike klase: 1. Tzv. neponovljive
delove DNK,kod kojih postoji samo jedna kopija svake sekvence
nukleotida u haploidnom broju hromozoma. Ovi delovi DNK verovatno
predstavljaju gene odgovorne za determinaciju polipetida. 2. Druga
klasa DNK predstavlja 102 - 104 puta multipliciranu jednu osnovnu
sekvencu nukleotida. Za razliku od tree klase, ovi delovi DNK sadre
i sekvence koje imaju znaajne funkcije u odganizmu. Pretpostavlja
se da geni koji determiniu razliite klase rRNK, tRNK i histona
imaju takvu organizaciju. 3. Kod viih organizama regioni hromozoma
u blizini centromere i verovatno drugim delovima hromozoma sa
konstitutivnim heterohromatinom, sadre blokove visoko repetitivne
DNK, koji se u vrlo prostim sekvencama ponavljaju stotinu, pa ak i
milion puta. U mnogim sluajevima raspored baza u takvoj DNK
razlikuje se od rasporeda baza ostale DNK. To omoguuje da se ove
sekvence vrlo jednostavno razdvoje centrifugiranjem. Na taj nain
razdvojena DNK naziva se satelitna DNK. 7
Maturski rad
evrljakovi Iva
U okviru iste vrste organizama moe da postoji vie tipova
satelitne DNK. Tako npr. kod vinske muice D. virilis nalaze se tri
grupe satelitnih DNK. Kod prve se ponavlja sekvenca 5 ACAAACT3 ;
kod druge 5 ATAAACT3 . Razlike u satelitnoj DNK izmeu srodnih vrsta
su esto mnogo vee nego u ostalom delu DNK. Briten i Kohne ( 1970 )
navode da vii eukarioti imaju i do 80-90% repetitivne DNK. Kako se
takva DNK ne transkribuje, postavlja se pitanje njene uloge.
Britten ( 1972 ) ukazuje na mogue uloge ove visoko repetitivne DNK,
kao to su: regulacija genske aktivnosti,regulacija sinapsisa
hromozoma, potencijalna mesta za stvaranje novih strukturnih i
regulatornih gena. Oigledno je da u procesu evolucije nastala i
odreena diferencijacija funkcije DNK. Nastanak sloenih procesa
vezanih za razmnoavanje elija eukariota, za replikaciju hromozoma i
druge funkcije tih elija, dovela je do obrazovanja satelitnih DNK.
Ove DNK izgleda da ne sadre genetike informacije, ve najee imaju
opdreene mehanike ili hemijske funkcije. Iz gore iznetog moe se
videti da se informaciono bogatstvo ivih sistema ne postie samo
poveanjem broja informacionih jedinica ( gena ) ve i novom
organizacijom genetikog materijala.
STRUKTURA I TIPOVI RNKStruktura RNK u osnovi je slina onoj kod
DNK, jer se takoe radi o lancu ije su karike - nukleotidi. Za
razliku od dvolane DNK, molekul RNK se sastoji iz samo jednog lanca
koji sadri eer ribozu umesto dezoksiriboze, a baza - timin - je
zamenjena uracilom, koji je takoe pirimidin (Slika 1 ). Svaka elija
sadri tri osnovna tipa RNK, i to: 1. Informacionu ( mesender ) -
iRNK ( mRNA ), 2. Transportnu ( transfer ili solubilnu) - tRNK (
tRNA, sRNA ) , 3. Ribozomnu - rRNK ( rRNA). Sva tri tipa RNK
predstavljaju primarni produkt dezoksiribonukleinske kiseline
odnosno gena. Mogu se izolovati, kao i DNK, putem centrifugiranja
homogenizovanih elija zajedno sa cezijum-hloridom, to se pokazalo
boljim od ekstrakcije uz korienje fenola ( Gliin, Crkvenjakov i
Byus, 1974). Informaciona RNK ( iRNK ) predstavlja jednu od
osnovnih molekulskih struktura koja slui za prenos genetike
informacije. Koristei sistem fag T2 - bakterija E. coli, Astrachan
i Volkin ( 1948 ) su prvi odredili prisutnost jedne nestabilne RNK,
za koju je kasnije utvreno da predstavlja iRNK. Dounc ( 1952 ) je
formulisao pretpostavku da DNK stvara RNK, a RNK stvara protein to
je dugo vremena predstavljalo tzv. centralnu dogmu molekularne
biologije. Spirin ( 1957 ) je prvi dokazao da razliite bakterije
sadre manje koliine RNK, iji sastav vema podsea na strukturu DNK
istih bakterija. Informaciona RNK predstavlja vezu izmeu DNK i
proteina i, za razliku od drugih tipova RNK, veoma varira po
nukleotidnom sastavu u zavisnosti od vrste organizma i stupnja
njegovog razvia. Svaki od molekula iRNK predstavlja direktan
produkt gena, tj. odreenog segmenta DNK. Na najveem delu DNK se
stvara iRNK, koja ima osnovnu
8
Maturski rad
evrljakovi Iva
funkciju u preslikavanju nukleotidne strukture gena i u
odreivanju redosleda razliitih aminokiselina ( u ribozomima ) pri
formiranju molekula specifinog proteina. Veliina molekula iRNK
varira u zavisnosti od veliine gena sa koga je komplementarno
prepisana, a to moe ii od nekoliko stotina do preko 26000
nukleotida. Molekul informacione RNK se brzo vezuje za ribozome i
ima relativno kratko vreme postojanja. Kod E. coli moe da se stvori
molekul iRNK od oko 1000 nukleotida za svega 1 sekundu. Obino je
nestabilan i lako se raspada, mada to ne mora uvek da bude sluaj,
npr. kod iRNK retikulocita kod kojih ostaje stabilna u toku
nekoliko minuta ( informaciona RNK izolovana iz E. coli se razlae
na 370 C za svega 1-2 minuta ). Poto se u citoplazmi sinteza manjeg
polipeptida na osnovi molekula iRNK izvri za svega desetak sekundi,
ini se da je ivot molekula iRNK dovoljan da on obavi svoju
funkciju. Treba rei, meutim, da funkcionalni kompleks molekula iRNK
sa ribozomima i tRNK u citoplazmi elija viih organizama, moe da
bude aktivan i nekoliko dana. Furuichi i saradnici ( 1975 ) su
ustanovili da se 5 kraj veine iRNK kod eukariota blokira posle
transkripcije pomou metilovanog guanina. U tome procesu GTP reaguje
5 krajem na 5 kraj lanca iRNK, i ostvaruju se neobine kondenzacije
5 - 5 , umesto 5 - 3. Uloga toga bloka za sada nije poznata. Takoe,
jo uvek je nerazjanjeno prisustvo vee sekvence poli - A ( oko 200
A-nukleotida ) na 3 kraju iRNK kod eukariota. Ova sekvenca sa
adeninima nije odreena jedarnom DNK, ve se dodaje posle
transkripcije. Funkcija ove ponovljene sekvence nukleotida se
verovatno sastoji u regulaciji kretanja iRNK kroz jedarnu membranu
( Watson, 1976 ). Izmeu iRNK eukariota i prokariota postoji jo
jedna razlika. Naime, za iRNK eukariota se vezuju dva tipa
proteina. Prvi protein ( molekulske teine oko 22000 ) vezuje se za
5 kraj, dok se drugi, znatno vei, vezuje za 3 kraj ( molekulska
teina mu je oko 52000 ). Najverovatnije se ti proteini vezuju za
iRNK na njenom prelasku iz jedra u citoplazmu ( tj. u jedarnoj
membrani ) i imaju zatitnu funkciju. Transportna RNK ( tRNK ) je
daleko manje sloena od prethodne i moe da sadri svega 70-90
nukleotida, sa molekulskom teinom od oko 2500. Crick ( 1956 ) je
prvi pretpostavio postojanje ovoga tipa RNK dajui adaptornu
hipotezu, a Hoagland ( 1958 ) je dokazao njenu funkciju.
Transportna RNK je jedini tip nukleinskih kiselina ija je struktura
poznata. Za molekul tRNK je karakteristino da pored prisustva
tipinih nukleotidnih baza (A, G, U, C ), sadri i itav niz neobinih
ili tzv. minornih baza kao to su pseudouridin, inozin,
dihidrouridin i drugih, najee metilovanih baza. Struktura tRNK je
povezana sa njenom veoma vanom funkcijom, koja se sastoji u
vezivanju slobodnih aminokiselina u spoljnim delovima citoplazme i
njihovim prenoenjem u endoplazmu gde one slue kao gradivni
materijal za stvaranje polipeptidnih lanaca u ribozomima. Holley (
1964 ) je opisao taan raspored nukleotida i sekundarnu strukturu
alaniltRNK iz elija kvasca. Iz tih elija upoznata je i graa tRNK
koje prenose druge aminokiseline. Tako npr. tRNK serina sadri 84
nukleotida, fenil-alaninova 76, tirozinova 78, alaninova 77 itd.
Broj minornih baza iznosi kod alanil-tRNK 9, kod tRNK serina i
fenilalanina - 12, a kod tirozil-tRNK - 15. Danas se dosta zna i o
sekundarnoj strukturi tRNK. U prostoru, tRNK formira zvezdastu
formaciju ( neto nalik na list deteline), u kojoj su na sekundarno
nastalim 9
Maturski rad
evrljakovi Iva
kracima komplementarne baze povezane preko H-veza, tako da grade
helikoidnu strukturu. Baze na krajevima krakova su bez H-veza. Na
tako graenoj tRNK razlikujemo nekoliko vanih regiona ( Slika br. 4
). 1. Mesto za koje se vezuje aminokiselina je kod svih tRNK
triplet nukleotida CCA. Aminokiselina je privrena estarskom vezom
za dve ili tri OH grupe riboze terminalnog adenozina. 2. Mesto koje
prepoznaje enzim aminoacil-tRNK-sintetaza.Specifino vezivanje
enzima je, po svoj prilici, vezano za raspored nukleotida. 3. Mesto
za interakciju sa ribozomima. 4. Antikodon - specifian triplet
nukleotida, koji prepoznaje odgovarajui triplet nukleotida na iRNK,
tj. kodon.
Slika 4: Sekundarna struktura tRNK, DHU - oznaava
dihidrouracilnu petlju koja sadri 8-12 nukleotida; T C - oznaava
timidin-pseudouracil-citozinsku petlju koja kod svih tRNK sadri 7
nukleotida; AK - aminokiselina. Transportna RNK se stvara na
specifinim genima i njena graa je takoe uslovljena rasporedom
nukleotidnih baza na odgovarajuim segmentima DNK.Giacomoni i
Spiegelman ( 1962 ) su uspeli da utvrde kod E. coli da tRNK
hibridizira na temperaturi od 70 - 750 C sa sebi odgovarajuim
delovima DNK iste vrste. Ti delovi, meutim, predstavljaju samo
0,023% celokupne povrine DNK. Ovo ini 1/4000, deo molekula DNK, ija
ukupna molekulska teina kod E. coli iznosi oko 4 x 109 . S obzirom
da molekulska teina tRNK iznosi oko 2,4 x 104 , izraunato je da u
formiranju tRNK kod E. coli uestvuje oko 40 gena. Kod aba je
utvreno da haploidna garnitura hromozoma sadri oko 8000 gena
odgovornih za 10
Maturski rad
evrljakovi Iva
determinaciju 56 do sada poznatih tipova tRNK, tako da je u
proseku po 140 gena odgovorno za svaki od tipova tRNK. Ribozomna
RNK ( rRNK ) je ralativno dobro opisana kako kod prokariota tako i
kod eukariota. Kod svih tipova ribozoma u maloj subjedinici
ribozoma postoji samo jedan RNK molekul. Kao i ribozomne
subjedinice i ovi molekuli opisuju se preko S-vrednosti
(sedimentacionih konstanti). Manja subjedinica prokariota sadri 16S
RNK molekul. Ove rRNK predstavljaju jednolanane polinukleotide, ali
u okviru kojih se mogu nai i kratki dvolani regioni nastali putem
obrazovanja vodoninih veza izmeu komplementarnih baza. Na osnovu
njihove molekulske teine izraunat je broj nukleotida koji ulaze u
sastav rRNK malih subjedinica ribozoma. Tako se procenjuje da 16S
rRNK ima oko 1650 nukleotida, dok 18S rRNK sadri oko 2100
nukleotida. Vea subjedinica ribozoma kod prokariota ( 50S ) sadri
jedan molekul 23S rRNK i jedan molekul 5S rRNK. Za 23S rRNK je
izraunato da ima oko 3300 nukleotida i da predstavlja jednolanani
molekul. Kod bakterije E. coli 5S rRNK ima 120 nukleotida. Kod
vieelijskih ivotinja 60S subjedinica ribozoma ima jedan 28S rRNK
molekul, dok biljke, protozoe i neke gljive sadre 25-26S molekul
rRNK u veoj subjedinici. Svi eukarioti pored toga sadre u veoj
subjedinici ribozoma jedan molekul 5S rRNK, isto kao i prokarioti.
Za razliku od prokariota, eukarioti imaju u veoj subjedinici
ribozoma i trei tip molekula RNK, tzv. 28S-asociranu rRNK koja je
uvek u asocijaciji sa 28S rRNK i ima sedimentacionu konstantu od
5,5 S. Kod prokariota sva tri tipa rRNK transkribuju se
koordinirano sa tri blisko locirana gena. Tako npr. kod E. coli je
utvreno da je raspored tih gena sledei: 16S - 23S - 5S. Takoe je
utvreno da se vri istovremeno transkripcija sva tri gena, meutim,
zbog dejstva specifinih enzima koji odmah posle izvrene
transkripcije seku u prevom enzimatskom procesu 16S, a u drugom 23S
od 5S rRNK, nisu utvreni nikada tzv. prekursori vee sedimentacione
konstante. Sa druge strane, kod eukariota postoji 45S rRNK koja se
transkribuje samo sa jednog genskog lokusa - koji sadri, kako se
smatra, najmanje 50 do 1000 identinih kopija, i koji je prekursor
za 28S i 18S rRNK. Za ove gene je utvreno da se nalaze u regionima
hromozoma koji se oznaavaju kao organizatori jedarca. 5S rRNK kod
eukariota odreuje drugi genski lokus, koji nije postavljen blizu uz
genski lokus koji uslovljava sintezu 28S i 18S rRNK. Watson ( 1976
) navodi da se kod abe iz roda Xenopus geni koji odreuju 5S rRNK
nalaze u telomernim delovima duih krakova veine hromozoma. tavie,
verovatno postoje dve razliite grupe gena koje kodiraju 5S rRNK:
jedni su aktivni u oocitama ( sa oko 24000 kopija istog gena, dok
su drugi prisutni u somatikim elijama - sa oko 450 kopija. Svi
tipovi RNK u ribozomima sadre etiri uobiajene baze, rasporeene u
jednolanani molekul. Manji deo tih nukleotida medifikovan je metil
grupom. Kod E. coli metil grupase moe nai samo na nukleotidnim
bazama, dok kod eukariota rRNK imaju metilovanu ribozu, ali ne i
baze. Takve modifikacije mogu da se ostvare iskljuivo na rRNK vee
sedimentacione konstante, metilacija nije nikada primeena na 5S
rRNK. Do danas nije uoeno funkcionalno znaenje metilacije
nukleotida, mada je zapaeno da su takve sekvence nukleotida vrlo
specifine i da su se malo menjale u toku evolucije - nasuprot
ostalom delu rRNK molekula.
11
Maturski rad
evrljakovi Iva
Funkcija rRNK nije poznata,mada postoje indikacije da 3 kraj 16S
molekula rRNK moe da ima ulogu u vezivanju iRNK i tRNK za ribozome.
Ribozomna RNK je najzastupljenija u elijama organizama - ona
predstavlja oko 80% ukupne koliine RNK.
REPLIKACIJA DNKSavremene tehnike biohemije ( npr. denaturacija
linearnih molekula DNK ) omoguuju razlikovanje krajeva linearnih
DNK i precizno definisanje mesta sa koga poinje replikacija,to se
jasno moe videti i pod elektronskim mikroskopom. Prvi takav
eksperiment nainjen je sa linearnom DNK T7 faga. Protivno
oekivanju, replikacija DNK nije poela sa krajeva DNK lanca, ve na
udaljenosti od oko 17% od jednog kraja lanca ( tzv. levi kraj na
denaturacionoj mapi ).Posle takvog poetka replikacije, pod
elektronskim mikroskopom viene su formacije u vidu soiva, a
Y-formacije postaju vidljive posle zavretka replikacije na levom
kraju DNK lanca Slika br. 5. Ovi podaci odbacuju pretpostavku da
dolazi do potpunog rasplitanja DNK lanca na osnovu kojih se kasnije
obrazuju novi nizovi nukleotida.
Slika 5: Formiranje replikacione viljuke kod T7 faga . Za
replikaciju DNK je neophodno prisustvo itavog niza enzima:
nukleaza, ligaza i DNK - polimeraza. Nukleaze su enzimi koji seku
fosfoestarske veze polinukleotidnih lanaca. Egzonukleaze
rasparavaju polinukleotidne veze DNK poev od terminalnog dela,
a
12
Maturski rad
evrljakovi Iva
endonukleaze prekidaju veze unutar polinukleotidnog lanca. Dugo
se smatralo da su endonukleaze relativno nespecifini enzimi. Danas
se, meutim, zna da postoji klasa endonukleaza ija je aktivnost
strogo ograniena specifinom sekvencom nukleotidnih parova u DNK. Ta
grupa specifinih nukleaza nazivaju se restrikcioni enzimi i oni vre
prekide u dvolanom molekulu DNK iskljuivo u regionima koji imaju
neku vrstu bilateralne simetrije. Tako npr. iz E. coli izolovana je
endonukleaza nazvana EcoRI ija je aktivnost vezana za sledeu
sekvencu nukleotidnih parova:
Ligaze su enzimi ija je funkcija suprotna od endonukleaza, tj.
oni vezuju delove skeleta DNK. Najbolje je prouena DNK-ligaza
izolovana iz bakterije E. coli, koja katalizira reakciju
obrazovanja veza izmeu 3OH i 5-fosforilnih grupa dva
polidezoksiribonukleotidna lanca. Po pravilu ligaze vezuju samo
prekide koji postoje na jednom od komplementarnih lanaca
dvospiralnog molekula DNK, mada je poslednjih godina opisana
sposobnost ligaza da vezuju i takve fragmente DNK. DNK-ligaze su
vrlo znaajni enzimi koji uestvuju u procesu replikacije DNK.
Bakterija E. coli, na primer, sadri oko 2000 molekula ligaza po
eliji. DNK - polimeraze predstavljaju najznaajniju grupu enzima u
replikaciji DNK. Njihova osnovna funkcija je stvaranje novog lanca
DNK, tj. polimerizovanje pojedinanih dezoksinukleozid-trifosfatnih
molekula, koji su pripojeni H-vezama za nukleotide naspramnih niti
raspletenog molekula DNK. Do sada su poznata tri razliita tipa
DNK-polimeraza (Kornberg, 1974): Pol I, Pol II i Pol III. Sva tri
enzima vre polimerizaciju novog lanca iskljuivo u 5 - 3 pravcu i,
to izgleda udno, imaju egzonukleaznu aktivnost u 3 - 5 pravcu. Ova
sposobnost svih DNK-polimeraza omoguuje da se pogreno vezan
nukleotid isee u isto vreme kada se doda novi, ime se postie
izvanredno visok stepen tanosti replikacije (greka se deava na
jednom od 108 do 109 nukleotida). Osim toga, samo DNK Pol III, a da
DNK - Pol I ima znaajnu ulogu u polimerizaciji samo manjih
fragmenata DNKlanca, koji se normalno javljaju prilikom replikacije
DNK. Takoe, smatra se da je DNK - Pol I ukljuena i u procese
reparativne sinteze DNK posle UV- ili jonizujueg zraenja. Specifina
uloga Pol II do sada nije ustanovljena. Polazei od injenice da sve
DNK- polimeraze vre svoju funkciju u 5 - 3 pravcu, kao i od toga da
je dokazano ( Okazaki i dr., 1968 ) da se sinteza DNK odvija u
kratkim sekvencama, Kornberg ( 1974 ) i Watson ( 1976 ) objanjavaju
kako se na oba raspletena lanca stare DNK, od kojih jedna ima
pravac 5 -3 a drugi 3 - 5, vri sinteza novih lanaca DNK.
PROMENE U GRAI DNK
13
Maturski rad
evrljakovi Iva
U toku udvajanja molekula DNK, naspram razdvojenih lanaca
staroga molekula pripajaju se sa vrlo velikom tanou odgovarajui
komplementarni nukleotidi, tako da se za purine uvek vezuju
pirimidini i obratno. Mada se ovaj proces odigrava sa skoro
nepogreivom tanou, utvreno je ipak da doe i do greke, tako da
postoji mogunost da dva novostvorena molekula ne budu apsolutno
identina. Greka ili mutacija se, meutim, deava izvanredno retko, pa
je naeno da do neodgovarajueg spajanja dolazi u proseku tek na
svakom stomilionitom ili milijarditom nukleotiodu ( 10-8 do 10-9
).
DNK I GENETIKA KONTROLA METABOLIKIH PROCESA
Pored sposobnosti da reprodukuje samu sebe i da se u izvesnom
stepenu menja, DNK raspolae i sposobnou genetike determinacije
fenotipa. Ve je ranije reeno, da DNK ostvaruje ovu svoju sposobnost
tako to kontrolie sintezu proteina. Genetika informacija za sintezu
specifinih polipeptida zapisana je u rasporedu nukleotida DNK, koja
je lokalizovana, kao to znamo, pre svega u jedru elije, dok se
mesta sinteze specifinih proteina nalaze u ribozomima koji su
smeteni u citoplazmi. Ova injenica, kao i niz drugih ( DNK npr. ima
vrlo visoku metaboliku stabilnost ) dovela je do postavke da DNK
poseduje sposobnost kontrole metabolikih procesa u organizmu putem
prenoenja genetike informacije preko svoga primarnog produkta -
RNK. Danas postoje dosta jasne predstave o putu od gena ( sekvence
DNK ) do proteina, i ustanovljeno je da se sinteza proteina sastoji
iz niza biohemijskih reakcija. Sumarno moemo rei da se prenoenje
genetike informacije odvija kroz dve kompleksne etape. U prvoj
etapi informacije o grai odreene sekvence DNK prenose se na
informacionu RNK, i druge tipove RNK. Taj proces naziva se
trenskripcija. U drugoj etapi dolazi do prevoenja ifre koju kroz
specifian raspored nukleotida nosi iRNK u odgovarajue strukture
molekula proteina. Pri tome se formira molekul polipeptida iji
raspored aminokiselina zavisi od redosleda nukleotida u iRNK,
odnosno od informacije koju je molekul iRNK primio od odgovarajueg
gena. Proces formiranja polipeptidnih lanaca na osnovu strukture
molekula i RNK, naziva se translacija. Pre nego to preemo na
analizu procesa transkripcije i translacije genetike informacije,
potrebno je da definiemo jezik pomou koga se ostvaruje genetika
kontrola metabolikih procesa.
GENETIKI KODWatson i Crick ( 1953 ) su svojim modelom molekula
DNK dali mogunost da se objasni priroda genetike ifre ili koda.
Elementarna jedinica genetikog koda je jedna od etiri azotne baze.
Gamow ( 1954 ) je pokuao da objasni strukturu genetikog koda, tj.
da 14
Maturski rad
evrljakovi Iva
odredi broj nukleotida u kodu. Poao je od pretpostavke da se
umesto svake aminokiseline u proteinskom lancu odreuje ( kodira )
kroz kombinacijunekoliko nukleotida iz lanca DNK. Po struci
astrofiziar, Gamov je dao samo teorijsku pretpostavku, polazei od
broja aminokiselina u ivom svetu ( 20 ) i broja azotnih baza u
lancu DNK ( 4 ). Jednostavnim preraunavanjem doao je do zakljuka da
je najmanji broj nukleotida koji moe da kodira jednu aminokiselinu
- tri. Naime, to je prvi najmanji broj koji moe da od etiri
raspoloive baze na DNK d dovoljan broj njihovih kombinacija za
odreivanje primarne strukture proteina, jer 43 daje 64 kombinacije,
a potrebno je najmanje 20 kombinacija za 20 razliitih
aminokiselina. Tripleti nukleotida na DNK nazvani su genetiki kod,
dok se njima komplementarni tripleti nukleotida na iRNK nazivaju
kodoni. Sve do 1961. godine tana graa genetikog koda nije bila
poznata. Te godine, ameriki naunici Nirenberg i Matthei uspeli su
da utvrde tanu strukturu tripleta nukleotida koji su odgovarali
aminokiselini - fenilalaninu. Do zakljuka o prirodi ovoga kodona
oni su doli posrednim putem, preko sinteze in vitro
poliribonukleotida poznatog sastava. Njihova prva sintetika matrica
bila je RNK koja je sadravala samo jednu vrstu baza - to je bio
uracil. Kao odgovor na takvu matricu dobili su polipeptid koji je
sadrao samo aminokiseline tipa fenilalanina. Poto je kodon
komplementaran kodu, zakljuili su da triplet AAA na DNK odgovara
fenilalaninu. Relativno kratko vreme posle toga, radei na
sintetikim matricama RNK koje su sadrale i vie od jednog tipa
nukleotida, u laboratorijama Nirenberga, Ochoa, Khoranae, Yanovskog
i Wittmanna data su znaenja svih 64 kodona Tabela 1. Tabela 1:
Kombinacije po tri nukleotida u informacionoj RNK ( kodoni ) za
koje se u procesu translacije vezuju odgovarajue aminokiseline
Tada je bilo mogue videti da veina kodona odgovara odreenim
aminokiselinama. Svega tri: UAA ( ochre ), UAG ( amber ) i UGA (
opal ) su tzv. nonsense ( ili besmisleni) kodoni, jer ne nose
informaciju ni za jednu aminokiselinu. Ta tri kodona,
15
Maturski rad
evrljakovi Iva
videemo malo kasnije, igraju znaajnu ulogu u procesima sinteze
proteina, jer predstavljaju tzv. terminacione ( zavrne ) kodone.
Potrebno je takoe da navedemo neke osnovne karakteristike genetikog
koda. Pre svega kod je specifian; tj. samo jedan kodon odgovara
samo jednoj aminokiselini. Samo dva kodona - jedan za aminokiselinu
metionin ( AUG ), a drugi za aminokiselinu valin ( GUG )
predstavljaju donekle odstupanje od tog pravila. Naime, ako se bilo
koji od ta dva kodona nalazi na samom poetku iRNK za njih e se
vezati tRNK koja nosi aminokiselinu formilmetionin. Meutim, kada se
ti kodoni nalaze na nekom drugom mestu u lancu iRNK tada odreuju
poloaj aminokiselina metionina, odnosno valina. Zbog tih svojih
osobenosti kodoni AUG i GUG nazvani su inicijalnim kodonima. Druga
karakteristika genetikog koda je njegova tzv. degenerativnost
(izroenost) odnosno da je poloaj mnogih aminokiselina u
polipeptidnim lancima odreen sa vie nego jednim kodonom na iRNK.
Degenerativnost genetikog koda je pravilo, a ne izuzetak. Sa Tabele
1 se moe videti da zamena tree baze kod 32 kodona uopte ne menja
njihov smisao i da su samo dva kodona jedinstvena, tj. da postoji
samo jedan kod za jednu aminokiselinu - to su aminokiseline
triptofan i metionin. Samo jedan od kodona koji odreuje mesto
aminokiseline izoleucina ( AUA ) menja svoje znaenje ako se izvri
zamena tree baze ( adenina ) sa guaninom. Kod ostalih 26 kodona
zamena tree baze - ako je to purin - purinom, a ako je pirimidin -
pirimidinom, takoe ne menja njihov smisao. Pojava degeneracije
kodona doprinosi veoj stabilnosti genetikih sistema jer se na taj
nain spreava ekspresija odreenog broja nukleotidnih zamena u DNK, a
takoe, kako emo kasnije videti, degenerativni kodoni uestvuju u
mehanizmima regulacije sinteze proteina. Sa mehanizmima translacije
genetike informacije vezana je i trea karakteristika kodona -
odsustvo preklapanja nukleotida. Naime, elementi jednog kodona (
nukleotidi ) nisu u isto vreme i elementi nekog drugog kodona, to
znai da tripleti nukleotida uestvuju kao celina u procesima
translacije. Takoe, vano je napomenuti da izmeu dva kodona ne
postoje nukleotidi koji ne nose genetiku informaciju ( ne postoje
tzv. kodoni sa zapetom ). Znaenje tripleta nukleotida je, po svoj
prilici, univerzalno za sve forme ivota na zemlji, to ukazuje na
njhovo monofiletiko poreklo.
TRANSKRIPCIJA
Transkripcija ( ili prepisivanje odnosno preslikavanje genetikog
koda ) sastoji se u stvaranju produkata na delu molekula DNK koji
sadri vernu kopiju rasporeda nukleotida u tom delu. Primarni
produkt molekula DNK ( odnosno gena ) je jedan od tipova RNK. U
najveem delu genoma to je informaciona RNK ( iRNK ). Pri tome,
svaki gen stvara naspram sebe poseban molekul iRNK, iji redosled
nukleotida u potpunosti odgovara ( tj. komplementaran je redosledu
na DNK ).
16
Maturski rad
evrljakovi Iva
Sutinska razlika izmeu procesa transkripcije ( naziva se jo i
matrina sinteza RNK ) i procesa replikacije ( matrina sinteza DNK
),sastoji se u tome to sinteza RNK poinje sa reakcijom izmeu dva
mononukleotida. Znai za razliku od matine sinteze DNK, za
transkripciju je karakteristino prisustvo sloenog mehanizma
inicijacije, odnosno prepoznavanja i poetka sinteze RNK. Danas je
ustanovljeno da najvaniju ulogu u procesima transkripcije ima enzim
RNK- polimeraza, ( transkriptaza ), iju emo grau ukratko opisati.
RNK - polimeraza ima vrlo kompleksnu strukturu. Aktivna forma,
naszvana holoenzim, kod bakterije E. coli sastoji se najmanje iz
dve grupe subjedinica: tela enzima koji se sastoji iz pet
polipeptidnih lanaca, dva alfa lanca identine molekulske teine
(39.000), dva beta lanca koji se razlikuju po molekulskoj teini (
jedan ima M.T. od 160.000, a drugi 150.000 ) i omega lanca ( Slika
6 ). Ovaj deo enzima je nespecifian i moe sam da otpone sintezu
RNK, ali pri tome se transkribuje bilo koji od dva lanca DNK, a i
veliina prepisanog dela varira. Drugi deo RNK-polimeraze obezbeuje
intenzivnu i specifinu transkripciju samo jednog od lanaca DNK, i
naziva se sigma faktor ( Slika br. 6 ). Taj faktor predstavlja
jedan polipeptidni molekul ija je molekulska teina oko 90.000.
Vezivanje sigma faktora sa drugim polipeptidnim lancima enzima nije
vrsto i on se vrlo lako odvaja od tela enzima. Postoje podaci (
Haseltin, 1972 ) da kod gena kod kojih postoji intenzivna
transkripcija ( npr. lokusi koji odreuju rRNK ) zajedno sa sigma
faktorom deluju i drugi proteinski faktori, naravno koji ne ulaze u
sastav tela enzima.
Slika 6: Struktura RNK-polimeraze (Watson, J. D., Molecular
Biology of gene, Benjamin, N. Y., 1970 ) Struktura RNK-polimeraze
elija eukariota mnogo je manje poznata. Do danas je utvreno da
elije eukariota imaju najmanje tri razliita tipa RNK-polimeraza, to
su: RNKpolimeraza I - koja se nalazi u oblasti nukleolusa i koja
obezbeuje sintezu rRNK; RNKpolimeraza II - iz nukleoplazme,
specijalizovana za transkripciju hromatina; RNK-polimeraza III-
koja se nalazi u mitohondrijama. Proces transkripcije moemo
podeliti u etiri faze :
17
Maturski rad 1. 2. 3. 4. Prepoznavanje i vezivanje
RNK-polimeraze za DNK, Inicijacija sinteze RNK molekula, Rast
polinukleotidnog lanca RNK - elongacija i Zavretak sinteze RNK -
terminacija.
evrljakovi Iva
1. Prva faza predstavlja vezivanje samo jednog lanca DNK, koji
ima specifinu sekvencu nukleotida, sa enzimom RNK-polimerazom. Deo
nukleotida koji prepoznaje sigma faktor RNK-polimeraze nije veliki,
a nalazi se u regionu DNK koji se oznaava kao promotor. Na Slici
br. 7 je prikazano jedno takvo mesto prepoznavanja kod bakterije E.
coli u tzv. laktoznom promotoru. Taan sastav nukleotida na mestima
prepoznavanja danas je odreen kod svega nekoliko organizama, ali
izgleda da su ona specifina za svaku vrstu, a takoe da variraju u
okviru istog genoma. Mesta prepoznavanja sadre daleko vei broj AT
nego GC parova nukleotida. Ova pojava verovatno je vezana sa
injenicom da AT parovi nukleotida u DNK znatno lake raskidaju
meusobne veze nego GC parovi, to omoguuje RNK-polimerazi, koja
dovodi do lokalnih denaturacija DNK, da lake prepozna ta mesta.
Baze koje prepoznaje RNK-polimeraza ne transkribuju se u lance RNK.
Desetak nukleotida ( ine ih uglavnom GC parovi ) posle mesta
prepoznavanja dolazi druga sekvenca nukleotida bogata AT-parovima
baza. Ta druga sekvenca naziva se mesto vezivanja RNK-polimeraze,
jer je utvreno da tu dolazi do formiranja vrih jonskih veza izmeu
enzima i jednog lanca DNK. Mesto vezivanja sadri uvek po sedam
nukleotidnih parova.
18
Maturski rad
evrljakovi Iva
Slika 7: Deo laktoznog operona E. coli, sa promotorom i
operonom. Prikazana je sekvenca nukleotida ( samo jednog lanca DNK
) koja predstavlja mesto vezivanja za RNK-polimerazu. 2. Druga faza
sinteze RNK odigrava se 6-7 nukleotida ( oko 2 nm ) posle mesta
vezivanja RNK-polimeraze. Prva faza od koje poinje transkripcija je
neki od purina - A ili G. Pored prisustva specifinog nukleotida za
poetak sinteze RNK potrebno je prisustvo sigma faktora
RNK-polimeraze. Po zavretku inicijacije - sigma faktor se odvaja od
tela enzima i dalje ne uestvuje u procesima rasta
poliribonukleotidnog lanca. Proces inicijacije takoe karakterie
prisustvo na prvoj pirimidinskoj fazi trifosfatne grupe. Ova baza
moe u nekim sluajevima biti, posle zavretka transkripcije, iseena
dejstvom enzima nukleaza, npr. kod nekih tRNK. 3. Trea faza. Sledea
faza sinteze RNK naziva se elongacija. Telo enzima, osloboeno sigma
faktora, kree se u pravcu rasta poliribonukleotidnog lanca ( 5 - 3
) i to tako to se na poloaj 3 riboze vezuje poloajem 5 svaki sledei
nukleozid. Brzina 19
Maturski rad
evrljakovi Iva
vezivanja nukleotida je vrlo velika, oko 500 - 1500 baza u
minutu. Vei deo obrazovanog molekula RNK ostaje u privremenoj vezi
sa DNK - matricom. Jo uvek nije tano utvren mehanizam odvajanja RNK
od lanca DNK. 4. etvrta faza. Poslednja faza sinteze RNK naziva se
terminacija. Smatra se da zavretak procesa transkripcije moe da se
odigra na dva naina. U nekim sluajevima dovoljno je prisustvo samo
tela enzima i specifine terminalne sekvence tipa AAAAAA. Meutim,
veina naunika smatra da samo prisustvo terminacione sekvence u DNK
nije dovoljno da se okona proces transkripcije. Nedavno je otkriven
proteinski faktor - ro - za koji je utvreno da uestvuje u
terminaciji . Smatra se da je taj faktor u stanju da direktno
deluje na DNK ( iako nema nukleaznu aktivnost ) prepoznajui
simetrine sekvence DNK - slino kao i restrikcioni enzimi ( strana
11 ). Meutim, ima miljenja da ro-faktor menja konfiguraciju
RNK-polimeraze i na taj nain omoguuje tarminaciju transkripcije. U
nekim sluajevima RNK moe prenositi naslednu informaciju. - Ve se
oko dvadeset godina zna da je genetika informacija kod ogromne
veine organizama zapisana u vidu rasporeda etiri nukleotida u
molekulima dvolane dezoksiribonukleinske kiseline; da se genetika
poruka prenosi na jednolanani molekul RNK time to se on formira
tako da ima komplementarnu grau jednome od gena u DNK; da ovakav
molekul RNK ( iRNK ) slui za formiranje odgovarajueg polipeptida, u
kome su aminokiseline rasporeene adekvatno rasporedu ( redosledu )
tripleta nukleotida na molekulu informacione RNK. Prenos
informacije sa DNK preko iRNK na primarnu grau odgovarajueg
proteina, oznaava se danas kao centralna dogma molekularne
biologije, nauke koja u detalje izuava ove procese. Utoliko je bilo
vee iznenaenje kada su se sredinom 1970. godine pojavila
istovremeno dva lanka u engleskom asopisu Nature ( Temin i
Mizutani, 1970, i Baltimore, 1970 ), u kojima je izneto da je mogue
da se genetika informacija prenosi i u obratnom pravcu, tj. sa RNK
na DNK. Do ovih se podataka dolo ispitivanjem jednog o virusa koji
moe da izazove rak ( tzv. Rausov sarcoma virus ), kod koga se geni
sastoje iz segmenta RNK. Na kalupu RNK kod ovoga se virusa pri
transkripciji moe da stvara dezoksiribonukleinska kiselina, ija se
sinteza ostvaruje uz prisustvo enzima RNK zavisne DNK-polimeraze.
Tek na osnovu ovih DNK-molekula formiraju se ponovo DNK ili RNK
lanci, pri emu samo ovi drugi ( iRNK ) mogu da poslue da se na
osnovu njihove grae formiraju proteini. Prema tome, viruse prema
nainu prenoenja genetike informacije moemo podeliti u tri grupe (
Temin, 1972 ), to je i na Slici 8 grafikim putem prikazano.
20
Maturski rad
evrljakovi Iva
Slika 8: Tri naina prenoenja genetike informacije kod virusa (
Prema: Temin, H. N., Scientific Am., N. Y., 1972 ) U prvu grupu bi
spadali virusi iji se geni sastoje iz sekvenci DNK-molekula ( npr.
Pox-virus) i kod kojih je centralna dogma vaea u pravom smislu rei
( DNK - RNK Protein ). Kod drugih se geni sastoje iz segmenta
RNK-molekula, i na njihovoj se osnovi transkribuju novi molekuli
RNK, koji slue kao kalup za sintezu proteina ( to je sluaj, na
primer, kod poliovirusa ). Kod treih je put neto sloeniji ( RNK -
DNK - RNK - Protein ) i predstavlja delimino odstupanje od
centralne dogme ( primer za ovaj tip je, kao to je ve reeno, Rausov
sarcoma virus ). Do sada nije dokazano da DNK molekuli, stvoreni
kao primarni produkat DNK, mogu da poslue kao kalup za sintezu
proteina. Centralna dogma, dakle, u svojoj osnovi nije poremeena.
Sinteza DNK pod kontrolom RNK mogla bi,meutim da ima znaaj u
normalnim elijskim procesima. Tako stvoreni molekuli ( ili delovi
molekula ) mogu se ugraditi u neke druge regione DNK-molekula i
time dovesti do umnoavanja pojedinih grupa gena, to moe naroito da
bude od vanosti u procesima diferencijacije elija.
TRANSLACIJATranslacija ( lat. translatio - prevoenje )
predstavlja sloen proces u toku koga se, na osnovu molekula
informacione RNK koji su stvoreni u procesu transkripcije, stvaraju
molekuli polipeptida. Redosled aminokiselina u ovim polipeptidnim
lancima tano odgovara redosledu uzastopnih grupa od po tri
nukleotida koji ine grau molekula iRNK. Translacija, dakle,
predstavlja proces polimerizacije aminokiselina u polipeptidne
lance. Mada se odigrava u ribozomima, proces translacije obuhvata i
sloene procese aktivacije i prenoenja aminokiselina. Svi procesi
koji su ukljueni u transkripociju DNK na RNK i translaciju RNK u
proteine u osnovi su isti kod svih elija. Meutim, prostorne i
vremenske relacije razliitih delova ovih procesa razlikuju se kod
eukariotskih elija, kod kojih se osnovna koncentracija DNK nalazi u
jedru i prokariota, koje nemaju diferencirano jedro. Kod prokariota
( to je pokazano pre svega kod bakterija ) transkripcija i
translacija iRNK odigravaju se na istom mestu i u isto vreme. Kod
eukariota, od jednoelijskih do vieelijskih, ova dva procesa
odvojena su i prostorno i vremenski: transkripcija DNK u razliite
tipove RNK odigrava se u jedru, iz koga RNK odlaze, kroz jedarnu
membranu, u citoplazmu u kojoj se odigravaju procesi sinteze
proteina. Sinteza proteina je znatno komplikovaniji proces od
sinteze DNK i RNK u tom smislu to se istovremeno odigrava niz
biohemijskih procesa. Mada je to kontinuiran proces, on se ipak moe
podeliti na nekoliko faza: 1. Aktivacija aminokiselina i njihovo
prenoenje do ribozoma ( aktivacija) ; 2. Poetak polimerizacije
aminokiselina ( inicijacija ) ;
21
Maturski rad
evrljakovi Iva
3. Obrazovanje peptidnih veza i poveanje polipeptidnog lanca (
elongacija ) ; 4. Zavretak sinteze i oslobaanje polipeptidnog lanca
( terminacija ) . Sinteza polipeptidnih lanaca poinje fazom
inicijacije, lanac se povea u toku faze elongacije, a zavretak
sinteze i oslobaanje lanca deava se u toku faze terminacije. 1.
Aktivacija aminokiselina - predstavlja proces vezivanja pojedinih
aminokiselina za odgovarajue molekule transportne RNK.Jo je Crick (
1958 ) pretpostavio da tRNK imaju ulogu adaptornog molekula, tj. da
slue kao posrednik u prenoenju aminokiselina. Ve smo ranije istakli
da tRNK imaju sposobnost da se jednim svojim krajem veu za
odgovarajuu aminokiselinu, a drugim krajem ( antikodonom ) za
odgovarajuu jedinicu na informacionoj RNK ( kodon ). Izmeu
adenozina koji se nalazi na kraju molekula svake tRNK ( videti
sliku br. 4 ) i aminokiselina obrazuju se kovalentne veze ( to su
tzv. jake hemijske veze, jer je za odvajanje molekula potrebno oko
100 kcal ). Ove veze se stvaraju izmeu karboksilne grupe (COOH)
aminokiselina i terminalne riboze, koja je komponenta tRNK. Poto je
veza izmeu tRNK i odgovarajue aminokiseline visoko energetska,
stvaranje ovoga kompleksa predstavlja aktivaciju. Energija u
hemijskoj vezi aminokiselina-tRNK se moe, znai koristiti kasnije u
formiranju peptidnih veza ( izmeu pojedinih aminokiselina ) koje su
energetski slabije. Vanu ulogu u procesu aktivacije aminokiselina
imaju enzimi aminoacil - tRNK sintetaze, koje su specifine za svaku
aminokiselinu. Prema tome, ovih enzima postoji najmanje dvadesetak
vrsta, koliko ima i aminokiselina. Za normalnu aktivnost ovih
sintetaza vano je prisustvo pored specifinih aminokiselina, jona
Mg++ i ATP-molekula. Pri tome se aminokiselina prvo vezuje sa
enzimom i ATP ( uz oslobaanje pirofosfata ) a zatim aktivirajui
enzim prebacuje aminokiselinu na terminalni kraj molekulas tRNK,
pri emu se oslobaa AMP i enzim: aminokiselinax + ATP + Ex Mg++
aminoacilx ~ AMP ~ Ex + PP aminoacilx ~ AMP ~ Ex + tRNKx Mg++
aminoacil - tRNKx + Ex + AMP. Proces prepoznavanja odgovarajuih
aminokiselina i tRNK veoma je precizan. Glavnu ulogu u tom procesu
imaju enzimi aminoacil - tRNK -sintetaze. Posebno je interesantno
pitanje kako ovi enzimi prepoznaju aminokiseline koje su po svojoj
strukturi vrlo sline. Na primeru izoleucil-sintetaze, koja vrlo
precizno razlikuje izoleucin od valina pokazaemo kako se taj proces
odvija. Aminokiseline izoleucin i valin razlikuju se samo po jednoj
metil grupi, tako da je razlika u njihovoj energiji vezivanja za
enzim izoleucil-sintetazu vrlo mala -2 do 3 kcal, to na prvi pogled
nije dovoljno da sprei odigravanje greaka. Vreni su eksperimenti u
kojima je izoleucil-sintetazi dodavana ekvimolarna koliina
izoleucina i valina - u takvoj smei na svakih 100 korektno
aktiviranih 22
Maturski rad
evrljakovi Iva
izoleucin ~ AMP komleksa dolazila je priblino jedna aktivacija
valin ~ AMP. Ako bi se svi ovako aktivirani molekuli valina
vezivali za izoleucil-tRNK dolazilo bi do estih greaka. Meutim, do
takvog vezivanja veoma retko dolazi, jer se odmah po vezivanju
molekula izoleucil-tRNK raspada kompleks valin ~ AMP. Na taj nain,
do diskriminacije izmeu valina i izoleucina dolazi na dva mesta,
tako da je krajnja veliina greaka u ovom procesu srazmerno mala (
10-2 x 10-2 = 10-4 ), ali ipak prisutna. 2. Poetak sinteze
polipeptida ( inicijacija ) kod bakterija je povezan sa formiranjem
kompleksa izmeu manje - 30S - subjedinice ribozoma, tRNK koja nosi
formilmetionin, i informacione RNK. Drugim reima, aminokiselina
koja se nalazi na poetku svih polipeptida kod bakterija je tzv.
N-formil metionin. To je modifikovani metionin; on ima formil grupu
koja je vezana za njegovu amino grupu. Formil grupa se dodaje uz
pomo enzima na metionin i to tek poto je metionin vezan za
specifinu tRNK. Ne vri se se kod svih kompleksa metionin-tRNK
formulacija. Postoje dva tipa met-tRNK, samo jedna od njih (
tRNKfmet ) omoguava reakciju formilacije, ali ne i drugi tip
met-tRNK ( tRNKmet ). Svaka informaciona RNK sadri jedan ili
nekoliko regiona za koji se vezuju 30S subjedinice ribozoma. Danas
su kod niza prokariota odreene sekvence nukleotida na iRNK za koje
se vezuju 30S partikule ribozoma ( to su tzv. mesta vezivanja
ribozoma ). Skoro sva mesta vezivanja ribozoma imaju AGGA sekvencu
nukleotida na iRNK, i ta sekvenca je za 8 do 13 nukleotida udaljena
od tzv. inicijalnog kodona ( AUG ). Neki najnoviji podaci ukazuju
da molekuli 16S rRNK imaju komplementarne sekvence nukleotida koji
mogu da prepoznaju mesto vezivanja ribozoma za iRNK. Pored
nabrojanih komponenti za inicijaciju sinteze proteina potrebno je
prisustvo odreenih proteina, koji su nazvani inicijalni faktori (
IF ). Inicijalni faktori se nalaze u asocijacijama sa ribozomima (
ali nisu normalno sastavni delovi ribozoma ). U njihovom odsustvu
ribozomi nisu u stanju da se veu za iRNK. Poznate su fizike
karakteristike tri inicijalna faktora ( IF1, IF2 i IF3 ), meutim,
njihova funkcija jo uvek nije sasvim jasna. Najverovatnije proces
inicijacije poinje vezivanjem inicijalnog faktora IF3 sa slobodnom
30S subjedinicom ribozoma. Mada se svi naunici ne slau kako se
dalje ovaj proces odvija, najverovatnije je da se agregat IF3-30S
vezuje za iRNK. Na taj nain formira se tzv. komleks I, koji se
oznaava kao IF-3-30S- ribo-iRNK. Za ovaj kompleks se vezuje
tRNKfmet . Vezivanje tRNKfmet povezano je sa drugim inicijalnim
faktorom, IF2 i GTP, tako da se svara kompleks II,
IF-2-30S-ribo-iRNK-tRNKfmet -GTP. Sledei korak u sintezi proteina
je vezivanje za kompleks II 50S subjedinice ribozoma. Ovo vezivanje
je povezano sa prisustvom IF1 faktora i pretvaranjem GTP i GDP. Na
taj nain stvara se kompleks III, tj. 70S-ribo-iRNK-tRNKfmet . U tom
kompleksu tRNKfmet se nalazi na peptidilnom mestu ( tzv. P-mesto )
na 50S subjedinici ribozoma. Gore navedene serije reakcija
predstavljaju inicijaciju sinteze proteina. Sumarno, inicijaciju
moemo predstaviti na sledei nain: kompleks I IF-3-30S ribozom-iRNK
tRNKfmet + IF2 + GTP kompleks II IF-2-30S ribozom-iRNK-tRNKfmet
-GTP + 50S ribozom + IF1 kompleks III 70S ribozom-iRNK-tRNKfmet
23
Maturski rad
evrljakovi Iva
Kod bakterija, poetni kodoni informacione RNK ( AUG i GUG )
vezuju za sebe iskljuivo formilmetionin-tRNK. Ti isti kodoni, ako
se nalaze na nekom drugom mestu u lancu iRNK, imaju drugo znaenje.
AUG tada vezuje metionin-tRNK, a GUG vezuje tRNK sa aminokiselinom
valinom. Smatra se, mada jo uvek nije sasvim pouzdano utvreno da
inicijalni faktori ( IF ) i susedni kodoni odreuju funkciju
inicijalnim kodonima. Naime, kod E. coli i nekoliko RNK faga je
utvreno da svi proteini koji se nalaze na poetku polipeptidnih
lanaca imaju iste sekvence aminokiselina, fMetionin-Alanin-Serin. U
stvari, zbog delovanja enzima u nekim sluajevima dolazilo je do
odsecanja pojedinih aminokiselina. Tako je kod E. coli utvreno da
oko 45% proteina imaju na svom poetku fMetionin ( tj. metionin sa
CHO grupom ), oko 30% imali su na poetku Alanin, i oko 15% bilo je
sa Serinom na poetnom delu polipeptidnog lanca. Kako se odigrava
proces inicijacije sinteze proteina kod eukariota jo uvek se ne zna
u svim detaljima kao kod prokariota. Smatra se da i ovde sinteza
proteina poinje sa metioninom ( tj. da iniciojalni kodon AUG ), ali
ovde, kako danas izgleda, metionin nije formilovan ( tj. nema CHO
grupu ). 3. Faza uveanja polipeptidnog lanca ( elongacija ). Poto
je formiran kompleks III stvoreni su uslovi za poetak uveanja (
elongacije ) polipeptidnih lanaca. AUG je inicijalni kodon a odmah
do njega na molekulu iRNK se nalazi drugi kodon za koji se, kod
bakterija, vezuje tRNK koja nosi aminokiselinu Alanin. Ova druga
tRNK se vezuje za aminoacilno mesto ( A-mesto ) na 50S subjedinici
ribozoma. Za ovo vezivanje potrebno je prisustvo tzv. elongacionog
faktora, EF-T, i molekula GTP. Kada se na oba mesta vee subjedinice
ribozoma, A i P-mestu, nalaze tRNK sa odgovarajuim aminokiselinama,
enzim peptidil sintetaza, koja je konstituent 50S partikule
ribozoma prebacuje aminokiselinu koja se nalazi na P-mestu. Drugim
reima, formira se peptidna veza izmeu COOH grupe formilmetionina i
NH2 grupe alanina. Kada se to desi, prazna tRNK na P-mestu se
oslobaa od molekula iRNK koja se zatim pomera za jedan kodon u 5 3
pravcu. Transportna RNK sa dve aminokiseline se premeta na P-mesto
( translokacija ), ime se stvara mogunost da se na A-mesto vee nova
tRNK sa aminokiselinom. Na isti nain dolazi do poveanja lanca sa
dve na tri aminokiseline , a kasnije na vie; na taj nain se formira
polipeptid odreene grae i veliine. Premetanje peptidil-tRNK sa A na
P-mesto omogueno je prisustvom elongacionog faktora G ( EF-G ),
koji se esto naziva translokaza. U ovom procesu (translokacija)
prvo se formira kompleks EF-G-GTP-ribozom. Translokacija je
povezana sa hidrolizom GTP i GDP, i osloboenjem EF-G faktora.
24
Maturski rad
evrljakovi Iva
Shematski prikaz poetnih stupnjeva procesa elongacije dat je na
Slici 9
Slika 9 : Opta shema procesa transkripcije i translacije (
Prema: Wainwright, 1972). Molekul iRNK moe da se vee ne samo za
jedan, ve i za vie ribozoma, inei tzv. poliribozom, ili polizom (
Slika br. 9 ). Na svakih priblino 80 nukleotida moe da se u
polizomu po jedan ribozom, u kome se vri sinteza istog polipeptida.
Na primer, polipeptidni lanac hemoglobina se sintetie istovremeno u
4-6 ribozoma, kroz koje prolazi isti molekul RNK. Ako se
polipeptidi sastoje iz 300-500 aminokiselina, njegova se sinteza
vri na istom kalupu iRNK, u 12-20 ribozoma. U svakom od ovih
ribozoma, 300-400 aminokiselina moe da se ugradi za 10-20 sekundi,
to znai da se u svakoj sekundi ( kod E. coli ) polimerizuje 14-17
aminokiselina. 4. Zavretak sinteze polipeptida ( terminacija )
sledi poto se u polipeptidni lanac ugradi onoliko aminokiselina
koliko je potrebno da se kompletira njegova struktura. Naime,
ulaskom u ribozom jednog od zavrnih kodona iRNK ( a to su UAA, UAG
i UGA ), sinteza polipeptidnog lanca prestaje, jer se za ove kodone
ne vezuje ni jedan od postojeih AK-tRNK molekula. U ribozomu ( tj.
na P-mestu vee subjedinice ) odigrava se hidroliza estarske veze
izmeu C-kraja peptida i tRNK. U katalizi ovoga procesa uestvuju
proteinski faktori R-1 i R-2. Kada na A-mesto ribozoma doe zavrni
kodon, umesto tRNK sa odgovarajuom aminokiselinom vezuju se R-1ili
R-2 faktori, i to prvi za UAA ili UAG kodone, a drugi za UAA ili
UGA kodone. Aktivnost ovih proteinskih faktora zavisi od prisustva
GTP. Posle razdvajanja polipeptida od molekula tRNK dolazi i do
razdvajanja molekula tRNK od kompleksa ribozom-iRNK. ta uslovljava
odvajanje molekula tRNK od kompleksa jo uvek nije sasvim jasno, ali
odmah posle ovoga procesa dolazi do
25
Maturski rad
evrljakovi Iva
raspada ribozoma na dve subjedinice, koje kasnije mogu da budu
ukljuene u neki drugi ciklus sinteze proteina.
26
Maturski rad
evrljakovi Iva
LITERATURA
[1] Dikli V., Kosanovi M., S., Duki : Biologija sa humanom
genetikom, Grafopan, 2001. [2] Marinkovi D., Tuci N., Keki V. :
Genetika, Nauna knjiga, Beograd, 1982. [3] Marinkovi D., Savi I.,
uri B., Terzija V., : Biologija za IV razred gimnazije, Zavod za
udbenike i nastavna sredstva , Beograd, 1994.
27
