Bioinformatik-Seminar 12.5.04 Multiples Sequenz-Alignment Phylogenie

Bioinformatik-Seminar12.5.04

Multiples Sequenz-AlignmentPhylogenie

Multiple Sequenz-Alignments

Multiples Alignment: Gleichzeitiger Vergleich mehrerer Sequenzen


Multiples Alignment: Gleichzeitiger Vergleich mehrerer Sequenzen

Anwendungen:

• Funktionsvorhersage, Suche nach konservierten Motiven• Datenbanksuche (z. B. PSI-BLAST: Position-Specific Iterated BLAST;

zuerst wird ein Profil erstellt)

• Phylogenie

• Sequenzassemby (Sequenzierprojekte)

Vorteile:

• ähnliche Bereiche (Motive) können herausgearbeitet werden

• Unähnlichkeiten können für die Rekonstruktion phylogenetischer Zusammenhänge

verwendet werden

Global:

Lokal:


Für L=300 bedeutet das:

Sequenzzahl Zahl der Zellenin der Matrix

Speicherbedarf(4 byte/Zelle)

Zeitbedarf(106 Op./s)

2 3002=90000 351 kb 0,36 s

3 3003=27000000 105 MB 216 s

4 3004=8,1 x 109 30,2 GB 36 h

5 3005=2,4 x 1012 9052 GB 900 d

Optimale Lösungsansätze (dynamisches Programmieren):

Zeit- und Speicherbedarf wächst ins Unermessliche

Bei einer Sequenzlänge L und n Sequenzen: Speicherbedarf: O(Ln), Zeitbedarf: O(2nLn). Das Problem ist NP-vollständig.


Optimierungsmöglichkeiten durch z.B. divide and conquer


Heuristische Ansätze:

Halten Aufwand in Grenzen, bei akzeptabel guten Ergebnissen

- PileUp (GCG)

- CLUSTALW

- Lösungen basierend auf Hidden Markov Modellen

- PSI-BLAST


1. Beispiel für globale multiple Alignments:

Progressives Alignment nach Feng und Doolittle (1987)

Beispiel: PileUp in GCG

• Iterativer Ansatz mit paarweisen globalen Alignments (ergibt jeweils einen score S)

• Berechnung jeweils eines korrigierten score Seff und daraus eines „Unähnlichkeitsscores“ D (difference score)

• Erzeugung einer Matrix mit diesen Abweichungs-Scores der paarweisen Alignments als Basis für den guide tree

• Alignment der Sequenzen dem guide tree folgend (progressiv)


Die difference score-Matrix beinhaltet für n Sequenzen (n-1) x n/2 Felder.

Die Matrix ist spiegelsymmetrisch, d. h. es genügt der Informationsgehalt einerDiagonalhälfte.

Seq1 Seq2 Seq3 Seq4

Seq1 0

Seq2 12 0

Seq3 24 19 0

Seq4 41 43 33 0

Beispiel:

- Für 4 Sequenzen entsteht eine Matrix mit 10 Feldern.

- Aus dieser Matrix wird der guide tree erstellt, bei dem ähnliche Sequenzen

in Clustern zusammengefaßt werden.

Seq 1

Seq 2Seq 3

Seq 4

1. Cluster

2. Cluster3. Cluster


Progressives Alignment:UPGMA-Methode: unweighted pair-group method using arithmetic averages

Annahme: alle Sequenzen evolvieren gleichmäßig und mit konstanterGeschwindigkeit

- Sequenzen je einer Verzweigung ergeben Alignment, arithmetische Mittelung ihrer Distanzen

- Alignments der benachbarten Äste werden in neues Alignment gefaßt

- Weitere Alignments bis letzte Einzelsequenz oder Ast-Alignment erfaßt ist


Probleme:

- Fehler am Anfang (bei den paarweisen Alignments) bleiben erhalten; "once a gap, always a gap", z. B. bei mehreren Möglichkeiten:

x: ACTTA y: AGTA

x ACTTA ACTTA ACTTAy A-GTA AG-TA AGT-A

- Nicht-überlappende Fragmente können gesamtes MSA ins Chaos stürzen (zerstört guide tree, da die paarweisen Distanz-Scores nicht stimmen)


2. Beispiel für globale multiple Alignments:

Progressives Alignment nach Thompson, Higgins und Gibson (1994)

ClustalW

Besonderheiten:- beachtet differenzierte Lückenfunktionen und Matrizenauswahl- Auswahl, ob dynamic programming oder Heuristik bei der Erstellung der paarweisen Alignments

- Neighbor Joining-Verfahren für die Erstellung des guide tree (statt UPGMA wie bei PileUp)-> verschiedene Gewichtung der Äste; Wurzel in der Mitte des Baumes-> Abstand durch Summe der Astlängen definiert (zusätzlich wird durch die Anzahl der

Sequenzen, die sich diesen Ast teilen, dividiert)


Darstellung von MSA:

Darstellung der Konsensus-Sequenz:

- Pretty (GCG)- GeneDoc (Windows)- Sequenzlogo (http://www.lecb.ncifcrf.gov/~toms/sequencelogo.html)


http://www.lecb.ncifcrf.gov/~toms/sequencelogo.html














Stammbaumberechung (Phylogenie)

Grundlage:

gutes multiples Sequenzalignment

wichtig also:

- Sorgfalt bei der Auswahl der Sequenzen (1 nicht passende Sequenz macht das Alignment kaputt)

- manuelle Nachbearbeitung/Überprüfung des Alignments bei Bedarf Miteinbeziehen weiterer Sequenzen

Definitionen:

• Phylogramm: Darstellung der verwandtschaftlichen Beziehungen in einem Baum

• Dendrogramm: Astlängen haben keine Ausagekraft

• Cladogramm: Astlängen spiegeln evolutionären Abstand wider

• rooted: Baum mit Wurzel

• unrooted: Sterntopologie ohne Wurzel


nur Topologie Miteinbeziehung evolutionärer Abstände

aus: Burmester & Hankeln, Genomforschung und Sequenzanalyse, Uni Mainz


ungewurzelter Baum





Baumberechnungsmethoden:

1. Distanz-Methoden:

- Für die Berechnung werden (normalerweise) nur Positionen ohne Lücken herangezogen- Berechnung einer Distanzmatrix (ähnlich wie bei MSA) Es gibt dafür verschiedene Berechnungs-Modelle:

- Kimura-Distanz: Zahl der Substitutionen- basierend auf PAM-Matrix: Konservative Substitutionen werden anders bewertet als nicht-konservative- Kimura-2-Parameter-Modell und Kategorien-Modell: für Nukeotid-Alignments, unterschiedl. Bewertung v. Transition u. Transversion

- auf Basis der Distanzmatrix UPGMA oder Neighbor-Joining für Baumerstellung


2. Parsimony-Methoden:

- Parsimony (engl.): Sparsamkeit- aus allen theoretisch möglichen Bäumen wird der Baum gesucht, der mit wenigsten Substitutionen die Sequenzunterschiede erklärt- dazu wird pro Baum ein Score berechnet- Nur bestimmt Positionen sind informativ: es muß einen Baum geben, der sich durch weniger Austausche erklären lässt als andere.- nicht informativ sind demnach: * Positionen mit nur gleichen AS/Nucl. * Positionen mit nur verschiedenen AS/Nucl.


1 2 3 4 5Seq 1 C G T A ASeq 2 G G C C ASeq 3 G G T T CSeq 4 G G A G C

nur Pos. 5 ist informativ

Seq 1

Seq 3

Seq 2

Seq 4

Seq 1

Seq 2

Seq 3

Seq 4

Seq 1

Seq 4

Seq 2

Seq 3

3. Maximum-Likelihood-Methoden:

- Matrix mit Übergangswahrscheinlichkeiten der AS/Codons- Annahme: Mutationen erfolgen unabhängig von ihrer Position in der Sequenz- wiederum werden alle theoretisch möglichen Bäume durchgerechnet- für jeden Baum wird die Wahrscheinlichkeit (L) berechnet, daß er für die zugrundeliegenen Sequenzdaten und die Matrix richtig ist.

Ziel ist es, den Baum mit der höchsten Wahrscheinlichkeit zu finden.


Statistische Signifikanz: Bewertung von Bäumen

Bootstrapping:

Alignment, das dem Baum zugrunde liegt, wird durch "Ziehen und Zurücklegen"permutiert.

Aus den permutierten Alignments werden Bäume berechnet.

Ein Baum, der trotz des Mischens immer gleich berechnet wird, gilt als statistisch signifikant.



vorgestellte Software:

- ClustalW: http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/Top.html

- SequenceLogo: http://www.bio.cam.ac.uk/seqlogo/

- GeneDoc: http://www.psc.edu/biomed/genedoc/

- (Phylip: http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)

- Phylip Online: http://bioportal.bic.nus.edu.sg/phylip/

- (PAUP: http://paup.csit.fsu.edu [kommerziell]

- MEGA: http://www.megasoftware.net/

Phylip und PAUP gelten als Standardprogramme in der Phylogenie

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