BIOKEMISKA SEPARATIONSMETODER - EN ÖVERSIKT

Jan-Christer Janson

Institutionen för Kemi

Uppsala Biomedicinska Centrum

Uppsala Universitet

Uppsala

2

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

1. INLEDNING ..................................................................................................................... 3

2. ALLMÄNT OM SEPARATION AV MOLEKYLER ...................................................... 4

3. GELMATERIAL FÖR SEPARATIONSÄNDAMÅL ...................................................... 5

3.1. Varför gelmaterial? ..................................................................................................... 5

3.2. Molekylsiktande geler ................................................................................................. 6

3.3. Makroporösa geler ...................................................................................................... 7

4. EXTRAKTION OCH FÖRBEREDANDE SEPARATION ........................................... 7

5. INTERMEDIÄRA OCH HÖGUPPLÖSANDE SEPARATIONSMETODER ................ 9

5.1. Separation efter molekylernas storlek och form ....................................................... 10

5.1.1. Molekylsiktande elektrofores ............................................................................ 10

5.1.2. Molekylsiktande kromatografi: Gelfiltrering ..................................................... 11

5.2. Separation efter molekylernas elektriska laddning ................................................... 13

5.2.1. Elektrofores ........................................................................................................ 13

5.2.2. Isoelektrisk fokusering ....................................................................................... 14

5.2.3. Jonbyteskromatografi ......................................................................................... 17

5.2.4. Kromatofokusering ............................................................................................ 20

5.3. Separation efter molekylernas funktion .................................................................... 21

5.3.1. Affinitetskromatografi av enzymer .................................................................... 21

5.3.2. Immunosorption ................................................................................................. 22

5.3.3. Affinitetskromatografi av glykoproteiner .......................................................... 23

5.3.4. Exempel på affinitetskromatografi av transportproteiner och receptorer .......... 24

5.3.5. Bindning av IgG till Protein A från Staphylococcus aureus ............................. 25

5.4. Hydrofob adsorptionskromatografi ........................................................................... 26

5.5. Kemisorption ("Kovalent kromatografi") ................................................................. 27

5.6. Övriga separationsmetoder ........................................................................................ 28

5.6.1. Metallchelataffinitetskromatografi ..................................................................... 28

6. REFERENSER ................................................................................................................ 29

3

1. INLEDNING

"Den gren av kemin som syftar till ett utforskande av livsprocessernas mekanism - alltså

biokemien - har haft och kommer alltid att ha som en av sina viktigaste uppgifter att ur

biologiskt material isolera ämnen som på ett eller annat sätt spela en väsentlig roll i det

komplexa fenomen som kallas för liv. Detta problem har kommit i förgrunden icke minst

därför, att många av de ämnen det här gäller genom sin molekylstorlek, sin komplicerade

byggnad och sin ömtålighet för vanliga kemiska operationer erbjuder alldeles speciella

problem. Dessutom förekommer många av de viktigaste substanserna i ytterst små

mängder".

Ovanstående citat utgör inledningen till ett föredrag hållet av professor Arne Tiselius

(Nobelpris 1948) i september 1961 (1) och är idag alltjämt lika aktuellt. Tiselius var elev

till professor The Svedberg (Nobelpris 1926) och dessa båda vetenskapsmäns inflytande på

den biokemiska forskningen vid flera svenska universitet kan knappast överskattas. De har

dessutom haft ett avgörande inflytande på utvecklingen av den svenska biokemiskt

inriktade industrin. Utan deras pionjärinsatser skulle vi idag knappast ha ett företag som

GE Healthcare Biosciences AB i Uppsala. Detta företag betyder, med någon överdrift, för

världens biokemister vad COOP eller ICA betyder för Sveriges dagligvarukonsumenter.

Tiselius ägnade hela sin aktiva forskarkarriär åt att utveckla nya separationsmetoder för

biomolekyler, främst äggviteämnen (proteiner) och var en av de ivrigaste förespråkarna för

milda metoder, baserade mer på fysikalisk-kemiska skillnader mellan molekylerna än på de

rent kemiska. Dit hör t.ex. skillnader i storlek och form samt skillnader i elektrisk laddning.

Biokemisk separationsteknik används rutinmässigt av forskare inom de flesta livsveten-

skapliga ämnesområden: Biokemi, molekylärbiologi, mikrobiologi, immunologi, genetik,

farmakognosi etc.. De hämtar sina studieobjekt från levande celler eller deras utsöndrings-

produkter. Förr var djurorgan eller växtmaterial de vanligaste utgångsmaterialen men idag

är det främst rekombinanta proteiner producerade i mikroorganismer som studeras.

Levande celler innehåller utomordentligt komplexa blandningar av tusentals olika

substanser där de enstaka komponenterna sällan förekommer i en procentuell andel över-

stigande 0,01 % av den totala substansmängden. Rekombinanta proteiner däremot når ofta

koncentrationer överstigande flera procent av den totala proteinmängden i utgångsmaterial-

et. Dock måste man komma ihåg att samma typ och antal av värdorganismens proteiner

måste avlägsnas under den följande reningsprocessen oavsett uppnådd expressionsnivå.

Ett typiskt biokemiskt forskningsprojekt har för många forskarstuderande inneburit att

inledningsvis åtskilliga månader ägnats åt att utveckla ett förfarande för renframställning av

det protein vars egenskaper, struktur eller funktion skall studeras. Det kan t.ex. gälla ett

enzym eller ett hormon, ur ett organ, en körtel eller från en bakterie som Escherichia coli,

eller en jästsvamp som Pichia pastoris, i de fall det handlar om ett rekombinant protein.

Ofta har resultatet blivit något eller några få milligram rent protein som sedan undersökts.

Ibland har syftet varit att undersöka proteinets biologiska funktion, ibland att bestämma

dess tredimensionella struktur genom röntgendiffraktion efter kristallisering. Genom att

sålunda studera de enskilda cellkomponenternas egenskaper hoppas man så småningom,

steg för steg, kunna förstå hur den levande cellen fungerar. Många enzymer renas idag för

att användas som verktyg av molekylärbiologer och mikrobiologer, t.ex. vid selektiv ned-

4

brytning och syntes av nukleinsyror. Det är då synnerligen angeläget att dessa inte är

förorenade av andra typer av nukleinsyranedbrytande enzymer, och man driver därför

reningen av sådana enzymer så långt tillgängliga analysmetoder tillåter.

Det är här lämpligt att citera Nobelpristagaren Arthur Kornberg som vid ett seminarium vid

Uppsala Biomedicinska Centrum hösten 1980 yttrade: "There is no point in wasting clean

thinking on dirty enzymes", vilket kan fritt översättas: "Det är bortkastad tid att försöka

tolka resultat som baseras på försök med orena enzymer".

Andra områden där biokemisk separationsteknik används rutinmässigt är inom klinisk

diagnostik, t.ex. vid analys av proteinsammansättningen i blodserum. och inom läke-

medelsindustrin, t.ex. vid renframställning av insulin och humant serumalbumin. Protein-

rening har traditionellt betraktats som ett mycket svårt forskningsområde och anses av

många fortfarande vara mer en konst än en vetenskap. Kanske var det så för några decen-

nier sedan, idag är situationen emellertid en helt annan. Det finns på marknaden ett stort

antal instrument och andra hjälpmedel för renframställning och analys av proteiner och en

mycket rikhaltig litteratur inom området står till biokemisternas förfogande. Med hjälp av

datasökningsmetoder kan man på några minuter få fram en aktuell lista på artiklar som

behandlar rening och isolering av ett speciellt protein, t.ex. ett enzym eller hormon. Saknas

information i litteraturen om det protein man avser isolera, kan ofta värdefull vägledning i

reningsarbetet erhållas från artiklar som beskriver isolering av närbesläktade proteiner.

Vad gäller rekombinanta proteiner kan värdefull information, t.ex. rörande molekylvikten,

primärstrukturen och den teoretiska isoelektriska punkten (det pH där proteinets nettolad-

dning är noll), erhållas ur den till en polypeptidkedja översatta cDNA-sekvensen.

Varför har proteinrening traditionellt betraktats som ett svårt forskningsområde? Den

väsentligaste anledningen, och som redan delvis nämnts i inledningen, är att proteiner dels

är utomordentligt olika till sina egenskaper, dels mycket instabila och känsliga för varia-

tioner i såväl den kemiska som fysikaliska miljön och dels att de har en tendens att binda

sig till andra komponenter såsom nukleinsyror, kolhydrater och lipider. Dessutom binds de

ibland till varandra under de betingelser de tvingas in i under reningsproceduren.

2. ALLMÄNT OM SEPARATION AV MOLEKYLER

Molekyler i blandning kan separeras enligt flera olika huvudprinciper. Inom bioveten-

skaperna, där man arbetar med komplexa blandningar i vattenlösning, kan de flesta

separationsmetoderna inordnas i någon av följande tre kategorier. Inom den första faller

alla förfaranden som baseras på att miljön förändras så att vissa ämnen ej längre kan

existera i lösning utan kristalliserar eller aggregerar. De bildade partiklarna kan sedan

avlägsnas eller tillvaratas genom sedimentation eller filtrering. Hit hör de för alla bio-

kemister välkända s.k. fällningsmetoderna där man stegvis ökar koncentrationen av ett

neutral salt eller ett organiskt lösningsmedel. Till den andra kategorin hör metoder som

utnyttjar skillnader i löslighet hos olika molekyler i de vätskor (lösningsmedel) som ingår i

flytande två-fassystem, och som används i olika motströmsextraktionsprocesser. Den tredje

och sista kategorin innefattar alla metoder som baseras på förutsättningen att två olika

molekyler i lösning reagerar olika med avseende på rörelseriktning och/eller rörelsehastig-

5

het när de utsätts för ett yttre kraftfält. Till denna kategori hör de flesta moderna biokem-

iska separationsmetoder. De olika krafterna illustreras schematiskt i Fig. 1.

Fig. 1. Krafter som kan utnyttjas för att påverka en molekyl i en separationskammare (utrymmet mellan de

båda horisontella linjerna). ”Impelling force” = framdrivande kraft. ”Retarding force”= bromsande kraft.

”FFF” står för ”Field-Flow Fractionation” en teknik där man kombinerar en axiell framdrivande kraft med en

radiell dito.

Det finns flera sätt att åstadkomma riktad rörelse hos en molekyl. Ett av dessa gäller endast

laddade molekyler och innebär att de placeras i ett elektriskt kraftfält. Beroende på typ och

storlek av molekylernas laddning kommer de att röra sig i en viss riktning med en viss

hastighet. På detta fenomen baseras en separationsteknik som kallas elektrofores. Ett annat

innebär att molekylerna placeras i en flödande vätska som rör sig längs ett stillastående fast

eller flytande ämne. Beroende på molekylernas olika förmåga att fördela sig mellan den

flödande och den stillastående vätskan, eller att binda sig olika starkt till det fasta ämnet

kommer de att transporteras av den flödande vätskan med olika hastighet. På detta fenomen

baseras en teknik som kallas kromatografi. Ett tredje sätt innebär att molekylerna placeras i

ett gravitationsfält, t.ex. i en ultracentrifug. Molekyler med höga molekylvikter kommer här

att sedimentera snabbare än de med låga dito. Metoden har ej använts så mycket för isoler-

ing av proteiner i ren form. En fjärde metod utnyttjar molekylernas egenrörelse, diffusion-

en. Den kallas för dialys och innebär att små molekyler tillåts diffundera genom ett s.k.

semipermeabelt membran, en tunn hinna som innehåller porer vars tvärsnitt är för litet för

att tillåta passage av högmolekylära substanser, t.ex. proteiner. Ett specialfall av dialys är

s.k. ultrafiltrering. Genom att applicera ett hydrostatiskt tryck på ena sidan av det semi-

permeabla membranet åstadkommer man här ett vätskeflöde genom detsamma som

snabbare än diffusionen transporterar små molekyler och salter genom membranet.

Metoden används mest för koncentrering av proteinlösningar. Med speciella membraner

kan man emellertid separera proteiner i storleksklasser.

3. GELMATERIAL FÖR SEPARATIONSÄNDAMÅL

3.1. Varför gelmaterial?

De viktigaste biokemiska separationsmetoderna är elektrofores och kromatografi. Båda kan

betraktas som allmänna begrepp under vilka ett stort antal olika specialtekniker inryms.

Gemensamt för alla (dock med ett par undantag) är att man för att förhindra att redan sepa-

rerade molekyler åter blandas genom oönskade vätskeströmningar, s.k. konvektion, orsak-

ade av skillnader i densitet i olika delar av separationsmediet, eller av virvelbildning, låter

6

separationen äga rum i ett poröst medium, en gel. En gel är en olöslig polymerprodukt vars

förnämsta egenskap är dess förmåga att binda stora mängder lösningsmedel. En bra beteck-

ning är att den sväller i lösningsmedlet. Torrsubstanshalterna i typiska svällda geler ligger

normalt vid 2-10 %. Det viktigaste lösningsmedlet inom biokemin är naturligtvis vatten och

detta leder till att det i första hand är hydrofila (vattenälskande) gelmaterial som kommer

ifråga. Dessa är uppbyggda av polymerer som innehåller polära grupper, t.ex. hydroxyl-

grupper eller amidgrupper.

Varför är nu gelmaterialen så viktiga inom biokemisk separationsteknik? Det finns flera,

vitt skilda orsaker till detta. Den viktigaste är kanske den stora yta. som exponeras inuti ett

gelmaterial och som ger en hög kapacitet per volymsenhet för de reversibla bindningsfeno-

men mellan till gelpolymeren kovalent kopplade, funktionella grupper och de olika mole-

kyler från provblandningen som skall separeras. En annan viktig orsak är den stora volym

av stillastående lösningsmedel, här alltså vatten, som tillåter utnyttjande av ett antal olika

fysikaliska fenomen för separation utan störande inflytande från de svårkontrollerbara

vätskerörelser molekyler utsätts för ute i en fri lösning.

Vid gelelektrofores använder man en homogen gel och de molekyler som skall separeras

befinner sig hela tiden inne i det tredimensionella polymernätverket. Vid kromatografi

använder man en sedimenterad bädd av små gelpartiklar (ofta tillverkade i pärlform och

med diametrar som varierar i storleksintervallet 0,005-0,1 mm) som packas i ett rör av glas,

plast eller stål. Molekylerna som skall separeras transporteras med hjälp av en flödande

vätska som rör sig i det fina kapillärsystemet mellan gelkornen. Separationen åstadkommes

sedan genom att molekylerna genom sin egenrörelse (diffusionen) transporteras in i den

stillastående vätskan i gelkornen, där olika mekanismer för olika kromatografiska tekniker

leder till att vissa molekyler kvarhålles under ett längre tidsintervall än andra innan de åter

kommer att diffundera tillbaka ut i den strömmande vätskan. Beroende på vilken teknik

som tillämpas, används en av två principiellt helt olika geltyper.

3.2. Molekylsiktande geler

Den ena geltypen är uppbyggd av tvärbundna (förnätade), linjära, hydrofila polymerer där

graden av tvärbindning kan varieras och därmed porstorleken i det tredimensionella poly-

mernätverket. Porstorleken hos dessa gelmaterial är av samma storleksordning som de

molekyler som ska separeras vilket leder till molekylsiktningsfenomen som utnyttjas för

separation i storleksklasser. När en sådan geltyp används vid elektrofores kommer större

molekyler att röra sig långsammare genom gelén då de på grund av polymernätverket

tvingas att vandra en längre sträcka än mindre molekyler. Vid kromatografi med sådana

geler kommer tvärtom större molekyler att transporteras snabbare genom kolonnen på

grund av att en mindre delvolym av vätskan i gelkornen är tillgänglig för dem än för

mindre molekyler. Den viktigaste molekylsiktande geltypen för elektrofores av proteiner

och nukleinsyrafragment är uppbyggd av tvärbunden polyakrylamid. Kromatografisk

molekylsiktning brukar kallas gelfiltrering och de viktigaste gelmaterialen är baserade på

tvärbundet dextran och/eller tvärbunden polyakrylamid samt agaros. De förra tillverkas av

GE Healthcare Biosciences i Uppsala under benämningarna Sephadex® och Sephacryl®

samt Sepharose®, Superose®och Superdex®.

7

3.3. Makroporösa geler

Den andra geltypen skiljer sig från den förra främst med avseende på porositet vilket fram-

går av den schematiska illustrationen av de båda geltyperna i Fig. 2. Det inom biokemisk

forskning viktigaste makroporösa gelmaterialet är agaros, en naturligt gelbildande polysac-

karid som framställs ur agar som i sin tur extraherats från vissa marina rödalger. Agaros

används både inom elektrofores och kromatografi i de fall man önskar ett icke siktande

gelmaterial. T.ex. vid olika typer av immunoelektrofores och vid affinitetskromatografi.

Vid agaroskoncentrationer i området 2-4 % erhålles geler vars porositet avsevärt överstiger

diametrarna hos de flesta proteinmolekyler. För de mer högmolekylära nukleinsyrorna är

sådana geler lämpliga för såväl siktande elektrofores som gelfiltrering.

Fig.2. Schematisk framställning av skillnaderna mellan en siktande geltyp (vänstra skissen), uppbyggd av

tvärbundna, linjära polymerer (typ Sephadex), och en makroporös geltyp, här exemplifierad av hur man

tänker sig en agarosgel uppbyggd. (Figuren från Arnott, S. et al., J. Mol. Biol. 90(1974)269-284).

4. EXTRAKTION OCH FÖRBEREDANDE SEPARATION

Ett försök till renframställning av ett protein, t.ex. ett enzym, kan indelas i fyra stadier,

extraktion, förberedande separation (ofta kombinerat med koncentrering), intermediär

separation och avslutande högupplösande separation (i engelskspråkig litteratur används

ofta begreppen ”capturing”, ”purification” och ”polishing” för de tre sistnämnda stadierna).

Vart och ett av dessa stadier kan i sin tur inbegripa flera steg. Extraktionen är helt naturligt

det inledande steget i reningsprocessen och syftar till att frigöra enzymerna från celler eller

cellbeståndsdelar till vilka de uppvisar en starkt varierande bindningstendens. För intra-

cellulära enzymer fordras som regel att cellvägg och cellmembran först sprängs fysikaliskt

eller kemiskt. För animala och vegetabiliska celler utgör detta i allmänhet inget problem.

Animala celler är särskilt lättsönderdelade och oftast räcker det med en passage genom en

köttkvarn, följt av behandling i turmix, d.v.s. ett kärl med roterande knivar i botten.

Det största problemet är närvaron av fettvävnad i utgångsmaterialet och för vissa lipidrika

organ, t.ex. hjärna och lever, framställs ofta acetonpulver, dvs. den restprodukt som erhålles

sedan de homogeniserade vävnaderna befriats från lipider genom extraktion med aceton vid

låg temperatur. Vad beträffar vegetabilisk vävnad, utgör frömaterialen inget större problem

om man undantar de oljerika fröerna. Det finns en rad olika typer av kvarnar i såväl labora-

torie- som storskaleutförande. De oljerika fröerna klarar man ofta genom valsning och

8

skonsam oljeextraktion, t.ex. med n-hexan. Gröna växtdelar går ej att sönderdela i normala

kvarnar eftersom dessa snabbt kloggar ihop. I laboratorieskala använder man ofta en

turmix. Den numera kanske viktigaste råvarukällan för enzymer är mikroorganismer av

olika slag, t.ex. bakterier, jäst och mögelsvampar. Många enzymer av praktiskt intresse,

t.ex. tvättmedelsenzymerna, är extracellulära, d.v.s. de utsöndras av mikroorganismerna i

det omgivande odlingsmediet och behöver oftast bara koncentreras innan de används. De

flesta mikrobiella enzymer av intresse som verktyg för forskning, t.ex. de s.k. restriktions-

endonukleaserna som används för specifik klyvning av DNA-molekyler inom rekombina-

tions-DNA-teknologin, är emellertid intracellulära och för att komma åt dem måste cell-

väggarna slås sönder. Detta åstadkommes t.ex. med hjälp av u1traljudbehandling eller

genom skakning tillsammans med små glaspärlor. I större skala används ofta modifierade

mjölkhomogenisatorer (t.ex. av fabrikatet APV-Gaulin). Den tillförda energin omvandlas i

samtliga fall huvudsakligen i värme varför det är viktigt att kyla ned suspensionen före och

efter behandlingen så att inte känsliga substanser, t.ex. enzymer, förstörs (denatureras).

Efter extraktionssteget, vilket oftast sker i närvaro av en lämplig buffertsaltlösning,

eventuellt med tillsats av löslighetsbefrämjande ämnen, t.ex. vissa detergenter, vidtar ett

tekniskt viktigt steg, nämligen avskiljandet av de extraherade fasta cellbeståndsdelarna.

Detta sker i laboratorieskala oftast med hjälp av kylda snabbcentrifuger med hastigheter

upp till c:a 25.000 varv per minut. Fibrösa material filtreras oftast genom en silduk,

eventuellt i en s.k. korgcentrifug (liknar en vanlig tvättcentrifug), varefter filtratet befrias

från mindre partiklar genom snabbcentrifugering. I vissa fall är det mycket svårt att uppnå

helt partikelfria extrakt. Det gäller t.ex. för aceton-pulverhomogenat, bakteriehomogenat

och jästautolysat. Sådana extrakt kan i de flesta fall ej direkt användas till kolonnkromato-

grafiska försök utan förbehandling, d.v.s. man sätter in ett eller flera förberedande

fraktioneringssteg. Det klassiska inledande steget vid proteinrening är utfällning med

neutralsalt, särskilt ammoniumsulfat, (NH4)2SO4. Andra proteinfällningsreagens med

vidsträckt användning är etanol samt polymerer som polyetylenglykol och polyetylenimin.

Andra klassiska inledande fraktioneringssteg är värmedenaturering, utfällning genom

tillsats av syra samt utfällning av nukleinsyror med hjälp av spermin, streptomycinsulfat

eller protaminsulfat.

En preparativ teknik för initial provbehandling är adsorption i expanderade partikelbäddar

(”Expanded Bed Adsorption”, ”EBA”). Denna teknik baseras på en ny typ av kolonn och

nya typer av adsorbentmaterial. Tekniken baseras på användning av adsorbentpartiklar av

sfärisk tvärbunden agaros vars densitet höjts genom tillsats av kvartspartiklar eller av

partiklar av en inert metallegering. Adsorbentpartiklarnas storleksfördelning ger upphov till

en stabil, expanderad svävbädd när dessa utsätts för ett homogent linjärt flöde underifrån

genom kolonnen. I den expande-rade bädden kommer de största partiklarna i fördelningen

att anrikas vid kolonnens botten-platta och de minsta att anrikas i den svävande bäddens

toppskikt. Varje adsorbentpartikel finner sin plats i storleksgradienten där det föreligger en

jämvikt mellan dess tendens att sedimentera och att lyftas av vätskeflödet. Det stora

avståndet mellan de svävande partik-larna gör att det är möjligt att använda prover som

innehåller hela celler eller cellfragment. Det lösliga målproteinet i provet kommer att

bindas vid adsorbentpartiklarna under dess transport upp genom den svävande bädden

medan hela celler, cellfragment och icke bundna substanser kommer att tvättas ut genom

kolonnens övre utlopp. När uttvättningen är klar packas bädden och de adsorberade

proteinerna kan frigöras från adsorbentpartiklarna genom att en förträngande

9

buffertsaltlösning pumpas in i kolonnen uppifrån. Detta kan utföras antingen stegvis eller

med hjälp av en koncentrationsgradient. Mer att läsa i ref. (5).

Som sista steg bland de förberedande separationerna har det blivit allt vanligare att använda

avsaltning genom gelfiltrering snarare än dialys. Avsaltning är en sammanfattande term för

den operation där man överför proteiner i en ny miljö med känd sammansättning. Man kan

således byta buffertsaltlösning för att nå lämplig jonstyrka och lämpligt pH som förbered-

else för de intermediära och högupplösande separationsstegen under det sista stadiet av

reningsproceduren. I de fall ändringar i saltkoncentration och/eller pH leder till utfällning

av vissa proteiner i provet, är avsaltning genom dialys att föredra framför gelfiltrering

eftersom de utfällda proteinerna annars fastnar i gelfiltreringskolonnen och hindrar det

normala vätskeflödet.

5. INTERMEDIÄRA OCH HÖGUPPLÖSANDE SEPARATIONSMETODER

De viktigaste reningsstegen utgörs som regel av kromatografiska tekniker. Vid en klassi-

ficering av dessa är det lämpligt att utgå från de egenskaper hos molekylerna som varierar

tillräckligt mycket för att kunna utgöra en bas för deras separation. Alla proteiner är poly-

peptider, uppbyggda av ett tjugotal olika aminosyror. Proteinernas molekylvikter, d.v.s.

summan av de ingående aminosyraresternas molekylmassor, varierar starkt (från c:a

10.000 upp till c:a 1.000.000) liksom de olika proteinernas form. Eftersom aminosyrorna

kan vara såväl positivt som negativt laddade, eller neutrala, kommer antal och typ av

laddade grupper, liksom fördelningen av dessa, på proteinernas yta att variera starkt.

Skillnader i elektrisk laddning och andra egenskaper, t.ex. graden av hydrofobicitet och

biologisk funktion, utgör basen för de separationsmetoder som kommer att beskrivas nedan.

De presenteras översiktligt i Tabell 1.

Tabell 1. SEPARATIONSMETODER INOM BIOKEMIN

Skillnader i egenskaper mellan olika molekyler som kan utnyttjas för separationsändamål.

Molekylstorlek och –form .........

Nettoladdning ............................

Isoelektrisk punkt .......................

Biologisk funktion .....................

Hydrofobicitet ...........................

Innehåll av fri -SH-grupp ..........

Löslighet ...................................

Metall bindande förmåga ..........

Förmåga att bilda charge- .........

transferkomplex

Gelfiltrering, ultrafiltrering, ultracentrifugering,

porgradientgelelektrofores, SDS-gelelektrofores

Jonbyteskromatografi

Zonelektrofores i agarosgel

Isoelektrisk fokusering

Kromatofokusering

Affinitetskromatografi

Affinitetsfördelning

Hydrofob adsorptionskromatografi, omvänd-fas

kromatografi (RPC)

Kemisorption ("kovalent kromatografi")

Utfällning med t.ex. (NH4)2SO4, etanol

eller polyetylenglykol, kristallisering

Metallchelatkromatografi (IMAC),(16)

Charge-transferkomplexkromatografi (17}

10

5.1. Separation efter molekylernas storlek och form

Separation av molekyler i storleksklasser kan åstadkommas både genom elektrofores och

genom kromatografi. Den förra tekniken utnyttjas huvudsakligen för analys av proteiner

medan den senare i första hand är en preparativ metod.

5.1.1. Molekylsiktande elektrofores

Vid elektrofores används oftast en homogen polyakrylamidgel som framställts i form av en

platta, ett tunt skikt eller en smal cylinder. Provlösningen med proteinblandningen läggs på

gelén vid dess ena kant och proteinerna får vandra in i gelén som ett tunt band. Separation-

en sker inuti gelén genom att större molekyler kommer att vandra långsammare då de på

grund av polymernätverket tvingas att vandra en längre sträcka än mindre molekyler. Man

brukar säga att molekylerna vandrar med en hastighet som är omvänt proportionell mot

deras molekylvikter. Det senare gäller speciellt i det fall man förbehandlat proteinmole-

kylerna med natriumdodecylsulfat, ett ämne som binder sig till dessa och gör dem starkt

negativt laddade. I engelskspråklig litteratur används ofta benämningen SDS-PAGE för

denna teknik.

Porgradientelektrofores innebär att separationen får äga rum i en polyakrylamidgel vars

siktande egenskaper, d.v.s. porstorleken, förändras i proteinernas vandringsriktning. Olika

storleksklasser av proteinmolekyler kommer att anrikas vid vissa pordiametrar där de inte

har möjlighet att tränga fram med samma hastighet som tidigare. Fördelen med en sådan

porgradientgel är att proteinerna efter infärgning framträder som mycket tunna band, d.v.s.

upplösningsförmågan är mycket hög, och att deras vandringssträcka är korrelerad till

molekylvikten. En kalibreringskurva kan framställas med hjälp av proteiner med kända

molekylvikter. I Fig. 3 (a) och 3 (b) visas principen för gelelektrofores och i Fig. 4 visas ett

exempel på porgradientelektrofores av serum proteiner. Mer att läsa om gelelektrofores

finner Du i referenserna (2) och (6).

Fig.3(a). Principen för gelelektrofores. Vid elektrofores i homogen gel (vänstra skissen) vandrar små

molekyler snabbare än de större, då de i mindre grad bromsas av polymernätverket (de svarta punkterna). Vid

porgradientgelelektrofores (högra figuren) fångas molekylerna upp av polymernätverket vid vissa gelkoncen-

trationer varvid deras vandringshastighet starkt reduceras. Detta leder till smala zoner (hög upplösning).

11

Fig.3(b) Gelkoncentrationsgradientens form påverkar

upplösningsgraden vid porgradientgelelektrofores.

Fig.4. Porgradientgelelektrofores av humant

serum (olika patientsera).

5.1.2. Molekylsiktande kromatografi: Gelfiltrering

Kromatografisk separation av molekyler efter storlek brukar kallas gelfiltrering. I engelsk-

språklig litteratur används ofta även benämningen ”Size Exclusion Chromatography”

(”SEC”) för denna teknik. De nämnda siktande geltyperna används då i form av små

sfäriska partiklar med diametrar i området 0,05-0,2 mm. Gelpartiklarna blandas med en

lämplig buffertsaltlösning och packas till s.k. kolonnbäddar i rör av glas eller plast.

Kolonnrören är som regel försedda med adaptorer så att man lätt kan tillföra provlösning

och samla upp den vätska som passerat igenom gelpartikelbädden. I ett typiskt

gelfiltreringsförsök i laboratorieskala används en kolonn med längden 60-90 cm och med

en diameter på en till fem centimeter. Provvolymen är normalt en till tre procent av

gelbäddens total volym och vätskeflödet genom kolonnen brukar ligga från tre till trettio

milliliter per kvadratcentimeter kolonntvärsnittsyta per timme. Normalt hålls flödet

konstant med hjälp av en slangpump eller kolvpump. Provet kommer att pumpas in i

gelpartikelbädden som en smal zon, omgiven av flödande buffertsaltlösning.

De molekyler i provet som på grund av sin storlek inte kan tränga in i gelpartiklarna

kommer att transporteras oseparerade genom kolonnen med samma hastighet som

buffertsaltlösningen och kommer att lämna kolonnen efter en volym lika stor som

kolonnvätskevolymen mellan gelpartiklarna, den s.k. voidvolymen. De molekyler som är

tillräckligt små för att kunna tränga in i den stillastående vätskan mellan polymerkedjorna i

gelpartiklarna kommer alltså att kunna fördela sig en större volym i varje gelbäddsegment.

Ju mindre molekylerna är, desto större blir den tillgängliga vätskevolymen för dem inuti

gelén och desto större andel av det totala antalet molekyler av varje molekylslag kommer

att befinna sig i den stillastående vätskan i gelkornen, och desto mindre andel kommer att

befinna sig i vätskan mellan gelkornen, som ju hela tiden rör sig med konstant hastighet.

För varje molekylslag gäller att de kommer att lämna kolonnen efter att en vätskevolym har

passerat som är lika stor som summan av vätskan mellan gelpartiklarna, V0, och den

vätskevolym inuti gelpartiklarna som är tillgänglig för molekylslaget i fråga, Vr. Oavsett

12

hur små molekylerna är kan de inte lämna kolonnen efter en volym som är större än sum-

man av vätskan mellan gelpartiklarna och den totala vätskevolymen i gelpartiklarna, Vt.

Om en molekyl lämnar kolonnen efter en volym som är större än kolonnens sammanlagda

vätskevolym är det ett tecken på att den på ett eller annat sätt står i bindningsjämvikt med

polymerkedjorna och/eller tvärbindningsbryggorna i gelmaterialet. Tvärbundet dextran,

Sephadex®, har en tendens att svagt binda molekyler med aromatiska grupper. Graden av

bindning kan man påverka genom att variera t.ex. ättiksyrakoncentrationen (3). Fig. 5 visar

principen för gelfiltrering och Fig. 6 en schematisk skiss över en typisk kromatografi

uppställning. Fig. 7 visar separationsmönstret för blodserum efter gelfiltrering på Sephacryl

S-300. Detaljerad information om gelfiltrering erhålls i referenserna (2) och (4).

Fig 5 Principen för gelfiltrering. De små molekylerna (•) tränger in i de molekyl siktande gelpartiklarna och

fördröjs relativt de större molekylerna (O). Pilarna till höger symboliserar vätskeflödet genom kolonnen, vars

"tvärsnitt" avbildats vid försökets start och efter två olika långa tidsintervall därefter.

Prov Buffert Pump Kolonn Fraktionssamlare

Fig.6. Skiss över en typisk apparatuppställning för kromatografi. Vid gelfiltrering med små provmängder

brukar provpåsättningsventilen placeras efter den peristaltiska pumpen, ofta i kombination med en s.k. loop.

13

200 250 300 ml

Fig.7. Gelfiltrering av humant serum på Sephacryl S-300 Superfine. Kolonn: 2.6 x 94 cm, provvolym: 2 ml,

elueringsbetingelser: buffert 0,1 M Tris-HCI pH 8.0 innehållande 0.5M NaCl, flöde: 2.3 ml/cm2/tim.

5.2. Separation efter molekylernas elektriska laddning

De viktigaste separationsmetoderna där man utnyttjar skillnader i storlek och typ av

elektrisk laddning hos molekylerna är elektrofores och jonbyteskromatografi.

5.2.1. Elektrofores

Elektrofores innebär laddade partiklars och molekylers vandring i ett elektriskt fält. Den

elektroforetiska vandringshastigheten är direkt proportionell mot laddningens storlek och

omvänt proportionell mot molekylradien. Ett normalvärde för proteiner är 5-10-5 cm/s vid

fältstyrkan en volt per centimeter. Antal och typ av laddade grupper på proteinernas yta

varierar starkt och har lett till att man talar om sura, neutrala och basiska proteiner, beroen-

de på vid vilket pH-värde proteinerna har sin isoelektriska punkt ,(pI), dvs. det pH-värde

där nettoladdningen är noll och proteinet således ej vandrar i ett elektriskt fält. Fig. 8 visar

hur vandringshastigheten i ett elektriskt fält med styrkan 1 V/cm, mobiliteten, för ett antal

olika serumproteiner ändras med pH-värdet hos den lösning där proteinerna befinner sig.

PROTEINERS ELEKTROFORETISKA MOBILITET SOM FUNKTION AV pH

Fig.8. Mobiliteten för olika serumproteiner som funktion av pH. Skärningspunkten vid mobiliteten noll är

identisk med proteinernas pI.

14

I föregående stycke beskrevs elektrofores i polyakrylamid och den molekylsiktande

egenskapen hos denna geltyp. Elektrofores användes där enbart som ett sätt att "transpor-

tera" molekylerna. Separationen åstadkoms av polymernätverket. I ren elektrofores, där

separationen beror på skillnader i vandringshastighet betingad av skillnader i nettoladdning

mellan olika molekyler, väljer man en icke siktande geltyp, t.ex. agarosgel av låg koncen-

tration (2-4 %). Elektrofores i agarosgel har framför allt blivit en viktig klinisk analys-

metod för proteiner i t.ex. blodserum och ryggmärgsvätska. En intressant utveckling av

metoden innebär att man efter avslutad elektrofores låter de separerade proteinerna

elektroforetiskt vandra, i 90 graders riktning mot den ursprungliga, in i ett agarosgelskikt

som innehåller en lösning av antikroppar mot alla eller vissa proteiner i provet. Alltefter-

som de vandrande proteinerna möter sina antikroppar så kommer de, där koncentrations-

förhållandet är optimalt, att reagera med dessa och bilda en olöslig fällning. Detta inträffar i

koncentrationsgradienten i kanten på den vandrande proteinzonen och leder till att den

successivt minskar i omfattning för att till sist helt försvinna i spetsen på den mer eller

mindre Gausskurveformade linje som utfällningslinjerna bildade längs båda sidorna på den

vandrande proteinzonen. Ytan innanför utfällningslinjen är ett mått på mängden protein i

zonen. Metoden kallas korsad immunoelektrofores och resultatet av ett sådant försök med

blodserum som prov visas i Fig. 9.

En mer detaljerad beskrivning av denna och andra agarosgelelektroforetiska analysmetoder

återfinns i boken "Plasmaproteiner", se (18). Ingående presentationer av elektroforetisk

teori och praktik finner Du i referenserna (2) och (6).

Fig.9. Korsad immunoelektrofores av humant serum i agarosgel innehållande kaninantikroppar mot helt

humanserum. Provet (2u1) sattes på gelén i den lilla runda brunnen till höger i bildens nedre kant.

5.2.2. Isoelektrisk fokusering

En annan viktig elektroforetisk separationsmetod som främst används analytiskt i poly-

akrylamidgel är isoelektrisk fokusering. Metoden bygger på det i början av detta stycke

omnämnda förhållandet att många biomolekyler, främst proteinerna, är amfolyter (d.v.s. de

kan vara både positivt och negativt laddade) med väl definierade isoelektriska punkter,

d.v.s. pH-värden där de ej vandrar i ett elektriskt fält. Vid pH-värden under den isoelektri-

ska punkten är amfolyterna positivt laddade och vandrar mot den negativt laddade

15

elektroden, katoden. Vid pH-värden över isoelektriska punkten är amfolyterna negativt

laddade och vandrar mot den positiva elektroden, anoden. Om man skapar en stabil pH-

gradient mellan de båda elektroderna, så kommer en amfolyt med en väldefinierad

isoelektrisk punkt, oavsett var den placeras i gradienten, att vandra mot och stanna vid

motsvarande pH-värde. Principen framgår av skissen i Fig. 10.

Fig.10. Principen för isoelektrisk fokusering. I läge A är proteinet negativt laddat och vandrar mot anoden. I

läge B är proteinet positivt laddat och vandrar mot katoden. Vid pI är nettoladdningen noll och proteinzonen

skärps stationärt. Den heldragna linjen visar den stabila pH-gradienten.

Stabila pH-gradienter kan erhållas med hjälp av s.k. bäraramfolyter, dvs. lågmolekylära

substanser med hög buffertkapacitet vid sina isoelektriska punkter. En bra bäraramfolyt-

blandning skall dessutom ha jämn elektrisk ledningsförmåga över hela pH-intervallet.

Avsnitt med låg ledningsförmåga kan ge överhettningsproblem och begränsar den totala

effekt man annars skulle kunna tillföra hela separationskammaren. Avsnitt med hög

ledningsförmåga ger spänningsfall och dålig fokusering. Det finns flera olika fabrikat av

bäraramfolyter på marknaden. De ger i de flesta fall fullt likvärdiga resultat. Skillnader kan

upptäckas först när man pressar betingelserna, t.ex. när de används i mycket tunna gelskikt

och med fältstyrkor upp till 300 volt/cm. Orsaken till att höga fältstyrkor är önskvärda inom

isoelektrisk fokusering beror på att det föreligger ett direkt samband mellan zonbredden hos

ett "fokuserande" protein och den elektriska fältstyrkan. Sambandet framgår av följande

formel:

= mått på zonskärpan, motsvarar c:a 1/4 av proteinets zonbredd

D = diffusionskoefficienten för proteinet

E = fältstyrkan (V/cm)

du/dpH = lutningen hos mobilitetskurvan vid proteinets pI

dpH/dx = lutningen hos pH-gradienten

Bland dessa variabler är D och du/dpH inneboende egenskaper hos det speciella proteinet,

varför endast E och dpH/dx kan varieras experimentellt. En ökning av dpH/dx skärper

visserligen proteinzonen men leder samtidigt till att zoner tillhörande olika proteiner i

prover kommer närmare varandra, varför nettoupplösningen ej påverkas i praktiken. Fig. 11

visar separationsmönstret efter isoelektrisk fokusering av olika muskelproteiner i ett tunt

polyakrylamidgelskikt. Fig. 12 visar ett exempel på 2-dimensionell gelelektrofores där

isoelektrisk fokusering använts i första dimensionen och SDS polyakrylamidgelelektrofores

16

i den andra dimensionen. Konsultera referenserna (2), (6), (7) och (8) för ytterligare

information om isoelektrisk fokusering.

Fig.11. Isoelektrisk fokusering i tunnt polyakrylamidskikt. Prover från vänster: muskelpro-

teiner från gädda, linslektin (isolektiner), muskelproteiner från regnbågsforell och beta-

laktoglobulin. Samma prover återkommer sedan till höger i gelen. Försöksbetingelser:

Bäraramfolyt Pharmalyte 3-10, fältstyrka 300 V/cm.

Fig. 12. 2-dimensionell elektrofores av bagerijästproteiner (Saccharomyces cereviciae) i ett

tunt skikt av polyakrylamidgel. Första dimensionen: IEF i närvaro av urea. Andra dimensi-

onen: SDS-porgradientgelelektrofores. Vänstra gelen färgad med Coomassie Brilliant Blue.

Högra gelen färgad med silver-reagens som ger c:a 10 ggr högre känslighet än färgning

med Coomassie Brilliant Blue.

17

5.2.3. Jonbyteskromatografi

Jonbyteskromatografi är en separationsmetod som bygger på användningen av gelpartiklar

som innehåller kovalent bundna laddade grupper. Dessa laddade grupper är införda genom

en kemisk reaktion i en från början neutral, porös gel. Varje laddad grupp i gelen neutrali-

seras med hjälp av en jon med motsatt laddning, en motjon, som hålls kvar i dess närhet på

grund av elektrostatisk attraktion. Motjonen är alltså ej bunden utan rörlig och kan lätt

bytas ut mot en annan jon med samma laddning. Kloridjonen, Cl-, är en vanlig motjon till

en positivt laddad jonbytargel och natriumjonen. Na+, är en vanlig motjon till en negativt

laddad jonbytare. Positivt laddade jonbytare brukar kallas anjonbytare och negativt laddade

jonbytare katjonbytare. Man brukar dessutom skilja mellan svaga och starka jonbytare. En

svag jonbytare innehåller laddade grupper vars laddning är beroende av den omgivande

lösningens pH-värde. En stark jonbytare är laddad vid alla pH-värden. Exempel på svaga

jonbytare är de som innehåller karboxylgrupper. De blir oladdade, och således oanvändbara

vid pH-värden under c:a 5. Jonbytare innehållande tertiära aminogrupper, t.ex. dietylamino-

etyl (DEAE-) förlorar sin laddning genom protolys vid pH-värden över c:a 8-9. Exempel på

starka jonbytare är de som innehåller sulfonsyragrupper och kvaternära ammoniumgrupper.

Fig. 13 visar exempel på olika typer av jonbytande grupper.

Fig. 13. Exempel på jonbytande grupper i moderna jonbytare för proteiner.

En jonbytare befinner sig i dynamisk jämvikt med jonerna i sin omgivning och är mycket

känslig även för små skillnader i protolyseringsgrad hos olika motjoner. Detta förhållande

insågs mycket tidigt av forskare framförallt i USA och den kanske elegantaste praktiska

tillämpningen av detta fenomen kom i början på 1950-talet i form av aminosyraanalysatorn,

18

en maskin som bygger på användningen av starka katjonbytare och noggrant utprovade

buffertsaltlösningar. Jonbyteskromatografi av proteiner ställer stora krav på gelmaterialets

egenskaper. Proteiner har utvecklats i en vattenmiljö och deras struktur är ofta mycket

känslig för påverkan av hydrofoba grupper. De första användbara jonbytarna för protein-

separation var därför tillverkade av hydrofila gelmaterial baserade på cellulosa, tvärbundet

dextran (Sephadex®) och agaros (t.ex. Sepharose® Fast Flow). Under de senaste

decennierna har emellertid nya jonbytare utvecklats som bygger på syntetiska organiska

polymerer såsom polystyren-divinylbensen. Dessa har högre rigiditet än de ovan nämnda

materialen och kan därför tillverkas med avsevärt mindre partikeldiametrar. Vissa av dessa

har framställts i monodispers pärlform (se Fig. 14). Den hydrofoba polystyrenytan har först

hydrofiliserats och sedan substituerats med laddade grupper. En viktig faktor vid

proteinkromatografi är jonbytarmaterialets porositet. Makroporositet ger hög bind-

ningsförmåga per volymsenhet för proteiner och dessutom snabb jämviktsinställelse, d.v.s.

effektivare separation. Agarosbaserade jonbytare har här stora fördelar framför de som

baseras på siktande geltyper; speciellt för högmolekylära proteiner. Även för nukleinsyror,

oligonukleotider och nukleotider är idag jonbyteskromatografi en ofta använd separations-

metod.

Fig. 14. Monodispersa gelmaterial baserade på polystyren-divinylbensen. Används av GE Healthcare

Biosciences i Uppsala som utgångsmaterial för framställning av olika typer av jonbytare för

proteinseparation.

Det finns två principiellt olika förfaranden vid jonbyteskromatografi. Vid det ena anpassar

man betingelserna med avseende på saltkoncentration och pH så att de komponenter som

skall separeras aldrig helt fastnar på jonbytaren utan alla molekylerna rör sig samtidigt på

samma sätt som beskrevs i föregående kapitel för gelfiltrering. D.v.s. för varje molekylslag

existerar en unik jämvikt mellan bundna och fria molekyler och där proportionen fria

molekyler bestämmer den hastighet med vilken molekylslaget rör sig genom jonbytar-

kolonnen. De molekyler som är för stora för att ens penetrera gelpartiklarna och som ej

visar någon tendens att binda till de laddade grupperna vandrar snabbast och bland dessa

molekyler sker ingen separation alls. De molekyler som helt penetrerar gelpartiklarna (icke

siktande geltyp) men ej binds till de laddade grupperna i gelen vandrar också tillsammans

oseparerade från varandra men långsammare än, och således separerade från, de förra. Alla

övriga molekyler, d.v.s. de som mer eller mindre starkt binder till de laddade grupperna

kommer mer eller mindre fullständigt att separera från varandra under sin vandring genom

jonbytarkolonnen. Ju längre kolonnen är, desto bättre separation får man. Dock blir inte

separationen dubbelt så bra med dubbelt så lång kolonn. Enligt den grundläggande kroma-

tografiteorin blir separationen endast kvadratroten ur 2, d.v.s. c:a 1,4, gånger så bra vid en

fördubbling av kolonnlängden vid den här speciella varianten av jonbyteskromatografi.

Vid den andra jonbyteskromatografiska metoden väljer man betingelser där den kompo-

19

nent man vill renframställa (alternativt, i vissa fall föroreningarna), fastnar på jonbytaren

och inte lossnar förrän man på något sätt förändrat sammansättningen hos den buffert-

saltlösning som provet och jonbytaren från början befann sig i. Genom att ändra t.ex.

saltkoncentrationen eller pH i buffertsaltlösningen stegvis eller kontinuerligt (gradient-

eluering) kommer de olika komponenterna att lossna en efter en och transporteras av den

flödande vätskan genom och ut ur kolonnen. Vid denna typ av kromatografi är man oftast

ej betjänt av långa kolonner, tvärtom får man i de flesta fall bättre separation ju kortare

kolonnerna är. I Fig. 15 visas resultatet av en jonbyteskromatografisk separation av

proteinerna i giftet av kungskobra och i Fig. 16 visas resultatet av jonbyteskromatografisk

renframställning av humant serumalbumin i stor skala. Jonbyteskromatografi, eller oftast

endast adsorption av proteiner till en jonbytargel som blandas med provet och sedan

frånskiljs genom filtrering, har blivit en mycket viktig teknik för renframställning av

proteiner i industriell skala av vissa kliniskt viktiga proteiner, t.ex. serumalbumin,

gammaglobulin och olika blodkoaguleringsfaktorer. Närmare information om detta kan

inhämtas i boken "Plasmaproteiner", se (18). Ytterligare referenser till jonbyteskromato-

grafiska arbeten kan extraheras ur referenserna (2) och (9).

Fraktionsnummer

Fig.15. Jonbyteskromatografi med gradienteluering av kobragift på CM-Sephadex C-50.

Fig.16. Jonbyteskromatografi med stegvis eluering av humant serumalbumin från ett försök med DEAE-

Sepharose CL-6B i stor skala (16 liter gel i en 37 cm diameter och 15 cm hög kolonn, Pharmacia KS370/15)

utgående från 16 liter humanserum.

20

5.2.4. Kromatofokusering

En intressant variant av jonbyteskromatografi är kromatofokusering. Tekniken bygger på

användningen av en speciell jonbytare vars grupper har hög buffertkapacitet över ett brett

pH-intervall. Närvaron av kvaternära ammoniumgrupper garanterar proteinbindnings-

kapacitet även vid höga pH-värden. Eluering sker med pH-gradient. Jonbytaren jämviktas

med en lämplig buffertsaltlösning vid det högre pH-värdet i det valda intervallet. Prov-

lösningen, som innehåller proteiner med isoelektriska punkter inom det valda intervallet är

som regel jämviktad vid samma pH eller i elueringsbuffert. Efter provpåsättningen pumpas

en speciell elueringsbuffert, kallad "Polybuffer", in i kolonnen. Polybufferlösningens pH är

justerat till det lägsta värdet i intervallet. Polybufferlösningen har jämn och hög buffert-

kapacitet över hela det valda intervallet vilket leder till att en jämn och stabil pH-gradient

kommer att utvecklas i den flödande vätskan i kolonnen på grund av att Polybuffer-

lösningen långsamt kommer att titreras av jonbytaren. Proteinerna i provet är vid försökets

början adsorberade som ett smalt band vid kolonnens övre del. I och med att Polybuffer-

lösningen börjar pumpas in i kolonnen sjunker sakta pH-värdet i vätskan kring de

adsorberade proteinerna. När pH-värdet sjunker under den isoelektriska punkten för ett

visst protein lossnar det från jonbytaren och transporteras nedåt i kolonnen med den

flödande Polybufferlösningen. Polybufferlösningens pH i det volymavsnitt där proteinet

befinner sig är emellertid inte konstant utan ändras kontinuerligt genom titrering på grund

av jonbytargruppernas höga buffertkapacitet. Efter en kort stund har pH-värdet passerat

proteinets isoelektriska punkt igen men nu från andra hållet, proteinet blir negativt laddat

och fastnar på jonbytarens positivt laddade grupper. Gradienten rör sig emellertid hela tiden

nedåt i kolonnen och samma procedur upprepas om och om igen. Resultatet blir att varje

protein kommer att anrikas, fokuseras, till en mycket smal zon som kommer att lämna

kolonnens utlopp vid ett pH-värde nära dess isoelektriska punkt. I kolonnen utbildas

således en stabil pH-gradient som hela tiden rör sig framåt, men, vilket har avgörande

betydelse, med en hastighet som är c:a 10 gånger lägre än den hos den flödande vätskan.

Fig. 17 visar schematiskt principen för kromatofokusering och i Fig. 18 visas resultatet av

kromatofokusering av ett älgmuskelproteinextrakt. Mer information om kromatofokusering

kan inhämtas i referenserna (2) och (10).

Fig.14. Den fokuserande effekten vid kromatofokusering beror på att vätskeflodet genom kolonnen (den långa

pilen) är avsevärt högre än den hastighet med vilken pH-gradienten, och således en amfolyt med

isoelektrisk punkt inom gradienten, rör sig genom kolonnen (den korta pilen). Figuren är hämtad ur (10).

21

Fig.18. Kromatofokusering av ett proteinextrakt från älgmuskel. Kolonn: 1 x 45 cm PBE 94, prov: 5 ml,

elueringsbetingelser: startbuffer 0.025M etanolamin-HCI pH 9.4, elueringsbuffert: 0.0075 mmol/pH-enhet/ml

Polybuffer 96, flöde: 20 m1/cm2/timme. (Ur referens (10)).

5.3. Separation efter molekylernas funktion

5.3.1. Affinitetskromatografi av enzymer

Alla proteiner har en specifik biologisk funktion. Den största gruppen är enzymerna,

biokatalysatorerna, som ombesörjer att alla de tusentals olika kemiska reaktionerna i en

levande cell kan fortgå vid de låga fysiologiska temperaturerna. Karakteristiskt för

enzymerna är deras ofta höga specificitet, d.v.s. de katalyserar reaktioner mellan endast

enstaka eller ett fåtal s.k. substrat. På enzymernas yta finns s.k. aktiva ytor där själva

katalysen äger rum. Vid katalystillfället binds substratet till den aktiva ytan, för att

omedelbart efter reaktionen frigöras. Vissa substanser har stor likhet med substratet, men

kan inte omsättas av enzymet. De fortsätter således att vara bundna till den aktiva ytan och

förhindrar substratet att nå fram. Dessa substanser kallas för hämmare eller inhibitorer och

bindningen mellan dem och enzymet kan utnyttjas för separationsändamål under förutsätt-

ning att bindningen är reversibel. En stor grupp enzymer behöver för sin funktion s.k. co-

faktorer. Även co-faktorerna binds vid katalystillfället tillsammans med substratet till

enzymets aktiva yta för att omedelbart därefter frigöras. Det har visat sig att substanser som

liknar co-faktorer också fungerar som hämmare och kan således utnyttjas för separations-

ändamål.

Sättet att utnyttja biologisk parbildning for separationsändamål kallas för affinitetskromato-

grafi och tillgår så att den ena molekylen i paret, i exemplet ovan hämmaren, kemiskt

kopplas till en bärare, oftast en makroporös gelpartikel t.ex. 4 % agaros. Gelpartiklarna

innehållande bundna hämmare packas till en bädd i ett rör av glas eller plast varefter en

provlösning innehållande det enzym man vill renframställa pumpas igenom bädden. Endast

det enzym eller de enzym som hämmas av den bundna molekylen kommer att fastna i

gelbädden, de övriga tvättas ut ur densamma med en lämplig buffertsaltlösning. Genom att

sedan ändra sammansättningen hos buffertsaltlösningen, t.ex. genom att sätta till en

substans som binder till samma ställe på enzymet som hämmaren d.v.s. substratet eller co-

faktorn, eller genom att ändra lösningens pH, kommer enzymet att lossna och kan tas

tillvara från den lösning som lämnar kolonnen. På denna princip bygger ett mycket stort

antal effektiva isoleringsförfaranden för olika enzymer som publicerats sedan tekniken

22

infördes omkring 1970. I Fig. 19 visas som exempel 5'AMP-Sepharose 4B för isolering av

NAD+-beroende dehydrogenaser. Ytterligare information i referenserna (2), (11) och (12).

Volym (ml)

Fig.19. Diagrammet visar separation av laktatdehydrogenasisoenzymer genom förträngning med en konkav

NADH-gradient på 5'AMP-Sepharose 4B. Mer information och original referensen finner Du i referens (11).

5.3.2. Immunosorption

En annan affinitetskromatografisk variant bygger på att de flesta proteiner är immunogena,

d.v.s. de ger upphov till antikroppsbildning i de djur i vilka de injicerats. Om man blandar

antikroppar från blodserum från de djur som immuniserats med en lösning av det injicerade

proteinet, som nu kallas antigen, bildas om proportionerna är lämpliga, ett s.k. precipitat

(fällning), en olöslig reaktionsprodukt som uppkommit genom att antikropparna och anti-

genmolekylerna bundit sig till varandra i ett tredimensionellt nätverk. Denna bindnings-

reaktion mellan en antikropp och ett antigen är ofta mycket specifik och kan användas som

bas för ett separationsförfarande där antikroppen kemiskt kopplas in i en 4 % agarosgel

med bibehållen antigenbindande förmåga. Den kopplade antikroppen kommer sedan att

effektivt kunna fånga upp och binda till sig motsvarande antigen även om det förekommer

i mycket låga koncentrationer och i närvaro av hundratals eller tusentals andra olika

23

proteiner. Högsta tänkbara specificitet erhålles med s.k. monoklonala antikroppar som är

riktade mot endast en s.k. antigen determinant på proteinets yta. En antigen determinant

utgörs av ett begränsat avsnitt av proteinytans strukturmönster och ett och samma protein

kan således innehålla ett stort antal olika antigena determinanter. Från klassisk immunodif-

fusionsanalys vet man att olika proteiner kan ha gemensamma antigena determinanter,

emellertid finns det alltid unika sådana för varje protein och monoklonala antikroppar mot

dessa kan användas för konstruktion av mycket specifika isoleringsförfaranden. Det finns

idag metoder för framställning av monoklonala antikroppar med hjälp av s.k. hybridom,

d.v.s. hybridcellinjer framställda genom sammansmältning av antikroppsbildande celler

(mjältceller) med tumörceller (myelom). Dessa hybridom kan, till skillnad från normala

antikroppsproducerande celler, hållas vid liv under mycket lång tid och man kan använda

denna teknik för framställning av monoklonala (d.v.s. från en enda celltyp härledda)

antikroppar i stor skala. Det bör tilläggas att det framför allt är hybridom från vit mus man

arbetar med. Den starka bindningen mellan en antikropp och dess antigen är en förutsätt-

ning för att man skall kunna isolera de proteiner som förekommer i koncentrationer under

c:a 10-8 M, men utgör samtidigt ett problem vid försöken att lösgöra proteinet från den

kopplade antikroppen. Det enda sättet går ut på att förändra antikroppens och/eller det till

antikroppen adsorberade proteinets rymdstruktur så att förutsättningarna för adsorptionen

upphör och proteinet lossnar. Bland de strukturförändrande substanser som prövats med

varierande framgång hör syror (d.v.s. pH-sänkning till c:a 3), urinämne, guanidinium-

hydroklorid samt chaotropa joner t.ex. SCN-, J-, ClO4-, Cl3CCOO- och F3CCOO-. Det är

viktigt att omedelbart efter det att proteinet lossnat återföra detsamma och den kopplade

antikroppen i den ursprungliga fysiologiska miljön. Det finns annars risk för att både

proteinet och antikroppen ej kan återställas i sin ursprungliga form. De blir "irreversibelt

denaturerade", och förlorar sin biologiska funktion. Återförandet kan ske antingen genom

dialys eller, snabbare, genom gelfiltrering. Den kopplade antikroppen förs snabbt över i

"rätt" miljö genom tvättning av gelbädden med fysiologisk buffertsaltlösning. Referens

(13) ger mer information om denna teknik.

5.3.3. Affinitetskromatografi av glykoproteiner

Vissa proteiner, s.k. glykoproteiner, bär kovalent bundet kolhydrat (oftast heterologa

oligosackarider) på ytan. Med speciell teknik, en variant av affinitetskromatografi, baserad

på användningen av till agarosgelpärlor kovalent kopplade, kolhydratbindande proteiner,

s.k. lektiner, kan man effektivt separera glykoproteiner från proteiner som saknar kolhydrat.

Genom att koppla lektiner med olika specificitet erhålles adsorbent som dessutom separerar

olika glykoproteiner från varandra under förutsättning att de innehåller olika sockerarter i

sina kolhydratdelar. Lektinbaserade adsorbent har en mycket tilltalande egenskap, nämligen

den för det adsorberade glykoproteinet mycket skonsamma desorptionsmetoden. Proteinet

lösgörs nämligen från lektinet genom tillsats av en lösning av den sockerart som ingår i

proteinets kolhydratdel och som binder till lektinet. Principen framgår av innehållet i Fig.

20. Metoden är så skonsam att man med framgång använt den för separation av olika

levande celler. Således kan T- och B-lymfocyter separeras på en agarosgel innehållande

kopplat lektin från vinbergssnäckan, He1ix pomatia. Detta lektin är specifikt mot kolhydrat

innehållande N-acetyl--D-galaktosamin. Det mest kända och använda lektinet är

Concanavalin A från jackböna, Canavalia ensiformis. Det binder till bl.a. mannos, en

sockerart som finns i många glykoproteiner t.ex. i blodplasma. Concanavalin A kopplat till

agarospärlor har därför blivit ett mycket populärt separationshjälpmedel för de forskare

24

som studerar blodplasmaglykoproteiner. Referenserna (2), (11) och (14) ger ytterligare

information om lektiner och lektinadsorbent.

Fig.20. Förenklad framställning av principen för affinitetskromatografi av glykoproteiner med hjälp av lektin

kopplat till agarosgel. Det på bilden kopplade lektinet binder proteiner innehållande galaktos (G), övriga

glykoproteiner (t.ex. mannosinnehållande (M)) och proteiner som saknar kolhydrat, binder ej och kan tvättas

bort. Det adsorberade glykoproteinet kan sedan förträngas med hjälp av överskott galaktos.

5.3.4. Exempel på affinitetskromatografi av transportproteiner och receptorer

En del proteiner har specifik transportfunktion, t.ex. för hormoner och vissa vitaminer.

Andra fungerar som receptorer för hormoner på ytan av vissa celler. Genom att koppla

vitamin B12 till agarosgelpärlor (se Fig. 21) får man ett adsorbent som kan fånga upp det

vitamin B12-transporterande proteinet i blodplasma, transcobalamin II

Fig.21. Strukturen för det vitamin B12-adsorbent som användes vid den i Tabell 3 redovisade reningen av

transcobalamin II.

Koncentrationen av detta protein i plasma är mycket låg, man har uppskattat att det finns en

molekyl transcobalamin II per två miljoner serumalbuminmolekyler. Talesättet att hitta en

nål i en höstack är mycket passande i detta fall. Alla försök att renframställa detta protein

med konventionella metoder hade misslyckats. Det var först i och med utvecklingen av den

affinitetskromatografiska tekniken i början på 1970-talet som detta blev möjligt. I Tabell 2

visas en uppställning av de olika stegen i reningen av transcobalamin II. Det framgår klart

25

att affinitetskromatografi steget är direkt avgörande för isoleringen av detta protein.

Tabell 2. Rening av transcobalamin II frän human plasma

RENINGSSTEG VOLYM (ml) PROTEIN (mg)

Human plasma 1.400.000 98.000.000

Cohn fraktion III 372.000 5.280.000

CM-Sephadex® C-50 19.700 760.000

Vitamin B12-kopplad

Sepharose® 4B 62 25

DEAE-cellulosa 61 11

3,3’-diaminodipropylamin-

kopplad Sepharose 4B 82 10

Sephadex G-150 9 6

Ett annat anmärkningsvärt exempel på användningen av affinitetskromatografi för att lösa

ett svårt reningsproblem är isolering av insulinreceptorn från fettcellplasmamembraner i

råttlever. Insulinkoncentrationen i blod är mycket låg, c:a 10-10 M, och det krävs därför en

hög bindningskonstant för komplexet mellan hormonet och dess receptor. Receptorkoncen-

trationen är också mycket låg, man har uppskattat att det endast finns c:a tiotusen receptor-

molekyler per fettcell, varför en hög bindningskonstant underlättar möjligheten att med

hjälp av ett adsorbent bestående av agarosgelpärlor innehållande kovalent bundet insulin

specifikt fånga upp de fåtaliga receptormolekylerna i ett detergentextrakt av råttleverfett-

cellmembraner. Receptorerna är normalt bundna till membranytan men kan överföras i

löslig form med hjälp av ett icke-joniskt detergent. Den på så sätt lösliggjorda insulin-

receptorn visar samma bindningsegenskaper till insulin som den intakta receptorn. Sedan

receptordetergentkomplexet adsorberats till det kopplade insulinet och övriga substanser i

provet tvättats ut ur get bädden kunde receptorn lösgöras från insulinet genom en kombina-

tion av pH-sänkning och tillsats av 4,5 M urinämne. Reningsfaktorn i detta steg blev c:a

8000 och totalt för hela proceduren från leverhomogenat till den renade receptorn blev

reningsfaktorn c:a 250 000.

5.3.5. Bindning av IgG till Protein A från Staphylococcus aureus

Ett mycket speciellt fall av bindningsbenägenhet som fått stor praktisk användning är här

värt att beskrivas. Bundet till cellväggen hos bakterien Staphylococcus aureus finns ett

protein som har egenskapen binda till immunglobuliner av typ G, d.v.s. IgG, de proteiner

man normalt förknippar med begreppet antikroppar. Bakterieproteinet brukar kallas Protein

A och dess bindning till antikropparna beror ej på en vanlig immunkemisk reaktion mellan

de senare och ett antigen. Protein A binder nämligen till den s.k. Fc-delen av antikroppen

och lämnar den antigenbindande s.k. Fab-delen fri. Genom att kovalent binda Protein A till

agarosgelpärlor får man ett specifikt adsorbens för IgG-molekyler och således ett utomor-

dentligt bekvämt separationshjälpmedel för alla de forskare som önskar isolera IgG från

olika serumprover. Komplexet mellan den bundna Protein A-molekylen och antikroppen

spjälkas normalt genom sänkning av pH till c:a 3,0. Efter uttvättning justeras pH omedel-

bart till det fysiologiska för att undvika irreversibel denaturering av proteinerna. Fig. 22

visar principen för rening av IgG med Protein A Sepharose. Se även referens (2) och (11)

26

för närmare information. Det bör nämnas att ett liknande protein från streptokocker, Protein

G, också har fått vidsträckt användning för samma ändamål.

Steg 1. Provpåsättning

Steg 2. Adsorption av IgG och uttvättnmg av

icke adsorberade proteiner (t.ex. IgA, IgD och

övriga serumproteiner).

Steg 3. Desorption av IgG genom pH-sänkning

till ca 3, t.ex. med 1M ättiksyra. IgG överförs

omedelbart i fysiologisk miljö genom gelfiltrer-

ing.

Fig.22. Principen för isolering av IgG från andra immunglobuliner (och övriga serumproteiner) genom

adsorption till Protein A Sepharose®.

5.4. Hydrofob adsorptionskromatografi

Vissa proteiner exponerar på sin yta mer eller mindre lättillgängliga hydrofoba ytor eller

klyftor. Denna skillnad i hydrofobicitet mellan olika proteiner kan utnyttjas för separation

genom s.k. hydrofob adsorptionskromatografi. Tekniken baseras på att man inför hydrofoba

grupper t.ex. fenylgrupper eller oktylgrupper i den normalt helt hydrofila agarosgelen.

Adsorption av proteiner till dessa grupper underlättas av hög saltkoncentration och vid elu-

eringen av de adsorberade proteinerna brukar man använda en kombination av kontinuerligt

minskande saltkoncentration och en på samma sätt ökande koncentration av etylenglykol.

Fig. 23. Principen för s.k. hydrofob adsorption (”Hydrophobic Interaction Chromatography”, HIC). Den

välkända formeln för ändringen av den fria energin för en isotermisk process kan här användas för att förklara

varför adsorptionen sker spontant. För att erhålla den nödvändiga minskningen av Gibbs fria energi måste

systemets entropi öka. Detta sker genom att ordnat vatten kring de hydrofoba ytorna på adsorbentet och på

proteinet övergår till att bli oordnat i och med att adsorptionen äger rum.

27

Fig. 24. Elueringsdiagrammet från ett försök att rena -amylas från ett kornmjölsextrakt genom kromatografi

på Phenyl Sepharose. I referens (15) finner Du mer data om denna teknik.

5.5. Kemisorption ("Kovalent kromatografi")

En grupp proteiner innehåller fria sulfhydrylgrupper (tiol-grupper) härrörande från

aminosyran cystein. Denna egenskap kan utnyttjas för separation genom s.k. kovalent

kromatografi där -SH-innehållande proteiner lätt kan avskiljas från övriga proteiner i ett

prov. Tekniken bygger på att till agarosgelpärlor kovalent bundna tiolgrupper överförs till

aktiverade disulfider genom reaktion med föreningen dipyridyldisulfid. Den till agaros-

gelen bundna, aktiverade, blandade disulfiden kommer så snart den kommer i kontakt med

en molekyl innehållande en fri tiolgrupp att omedelbart reagera med denna genom tiol-

disulfidutbyte. Den tidigare fria, tiolhaltiga molekylen kommer därvid att ersätta den

aktiverade, lämnande gruppen och kovalent bindas till gelen via en disulfidbrygga. Övriga,

icke tiolhaltiga, molekyler i provet kan nu tvättas ut ur gelbädden varefter den bundna

molekylen kan elueras genom ett nytt tiol-disulfidutbyte. Detta åstadkommes genom tillsats

av lågmolekylära, enkla tioler som t.ex. merkaptoetanol. Tioladsorbentet kan sedan åter

aktiveras med hjälp av dipyridyldisulfid. Reaktionen mellan en tiol och den aktiverade,

blandade disulfiden går praktiskt taget stökiometriskt eftersom den frigjorda pyridyltiolen

omedelbart omlagras till en tiopyridon. Den senare har ett karakteristiskt absorptionsmaxi-

mum vid 343 nm varför det är lätt att kvantitativt mäta mängden inkopplad tiol. Bland de

proteiner som med framgång renats med denna teknik kan nämnas ureas från jackböna och

papain från papayafrukter. Fig. 25 visar principen för kemisorption (kovalent kromatogra-

fi). Ytterligare information och fler referenser kan inhämtas ur referenserna (2) och (11) .

He's The world expert on isolation of Axolotl toe-nail proteins!

28

Fig.25. Principen för kemisorption ("kovalent kromatografi"). Reaktionsförlöppet kommenteras i texten.

5.6. Övriga separationsmetoder

5.6.1. Metallchelataffinitetskromatografi

I engelskt språkbruk kallas denna metod ”Immobilized metal ion affinity chromatography”

eller IMAC. Den bygger på egenskapen hos vissa proteiner att binda till sig vissa

övergångsmetalljoner såsom Cu2+, Zn2+ och Ni2+. Man har visat att det är på proteinets yta

exponerade imidazolgrupper tillhörande aminosyran histidin som i första hand är ansvariga

för denna bindning. Bindningsförmågan bibehålls när metalljonen delvis kelateras, t.ex. till

en till en agarosgel bunden iminodiättiksyragrupp (IDA) (se Fig. 25). På detta faktum

bygger metoden att rena histidinhaltiga proteiner med hjälp av IMAC. I de allra flesta fall

fungerar IDA-substituerade geler mycket bra på grund av att man kan påverka

bindningsstyrkan genom att välja olika metalljoner. Således binder kopparjoner starkare än

zink- och nickeljoner. Som en tumregel prövar man först zinkjonmättade IDA-geler och

prövar sedan kopparjonen om bindningen är för svag.

Hög selektivitet kan ibland erhållas med nickeljonmättade geler. Ett speciellt fall av stor

betydelse är den upptäckt som Eric Hochuli och medarbetare vid Hoffman LaRoche gjorde

i mitten på 80-talet, nämligen att Ni2+-joner bundna till immobiliserade nitrilotriacetat-

grupper (NTA) (se Fig. 25 och läs referens 19), ej band ”normala” histidinhaltiga proteiner

men däremot rekombinanta proteiner som försetts med en s.k. ”His-tag”, dvs. En N- eller

C-terminalt fuserad oligo-His-peptid med 6-8 His-rester. Denna upptäckt gjorde det möjligt

att mycket effektivt, direkt från råextrakt av rekombinanta colibakterier, isolera de

rekombinanta proteinerna i mycket ren form. Det bör dock sägas att metoden inte fungerar i

samtliga system men bör alltid prövas som ett alternativ till traditionella reningsförfaranden

om förutsättningarna i övrigt är tillhanda.

Det bör även sägas att det inte alltid är nödvändigt att använda NTA-geler för att isolera

His-taggade proteiner. Ni2+-mättade IDA-geler (t.ex. Chelating Sepharose FF och andra)

fungerar lika bra i de flesta fall. För mer läsning rekommenderas kapitlet om IMAC av

Lennart Kågedal i referens (2).

29

Fig. 25 Strukturerna för immobiliserade IDA- och NTA-grupper.

6. REFERENSER

1. A. Tiselius, "Kemisk analys och biologisk struktur". Föredrag vid presidiets nedläggande den 29

sept. 1961, Kungl. Vetenskaps Societetens i Uppsala årsbok 1961.

2. J.-C. Janson, ed. "Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications", 3:rd

edition, John Wiley & Sons Inc., New York, 2011, pp. 1-517

3. J.-C. Janson, "Adsorption Phenomena on Sephadex", J. Chromatography, 28 (1967) 12-20.

4. Gel Filtration: Principles and Methods. Handbok från GE Healthcare Biosciences AB.

5. Expanded Bed Adsorption Handbook. Handbok från GE Healthcare Biosciences AB.

6. R. Westermeier, “Electrophoresis in Practice”, VCH Weinheim, 1993, 1-277.

7. P.G. Righetti and J.W. Drysdale, "Isoelectric focusing", paper back i serien "Laboratory Techniques in

Biochemistry and Molecular Biology (T.S. Work and E. Work), Vol. 5, part 2, North Holland,

Amsterdam 1976, 341-590.

8. P.G. Righetti, E. Gianazza and K. Ek, "New Developments in Isoelectric Focusing, J. Chromatography

184:4 (1980) 415-456.

9. Ion Exchange Chromatography: Principles and Methods. Handbok från GE Healthcare Biosciences

AB.

10. Chromatofocusing with PBE. Handbok från GE Healthcare Biosciences AB.

11. Affinity Chromatography: Principles and Methods. Handbok från GE Healthcare Biosciences AB.

12. C.R. Lowe, "An Introduction to Affinity Chromatography", paperback i serien "Laboratory Techniques

in Biochemistry and Molecular Biology (T.S. Work and E. Work), Vol 7, part 2, North Holland,

30

Amsterdam 1979, 269-522.

13. T. Kristiansen, "Matrix bound antigens and antibodies", i "Affinity Chromatography" (0. Hoffman-

Ostenhof et al.), Pergamon Press, Oxford 1978, 191-206.

14. P. Vretblad, "Lektiner - proteiner på frammarsch inom cellbiologin". Kemisk Tidskrift (1977), 36-38.

15. Hydrophobic Interaction Chromatography: Principles and Methods. Handbok från GE Healthcare

Biosciences AB.

16. J. Porath, "Metal chelate affinity Chromatography, a new approach to protein fractionation", Nature,

Vol 258, No 5536 (1975) 598-599.

17. J. Porath, "Explorations into the field of charge-transfer adsorption", J. Chromatography 159 (1978)

13-24.

18. B. Blombäck och L.A. Hansson, "Plasmaproteiner", AB Kabi och AWE/Gebers, Stockholm 1976, 1-

385.

19. E. Hochuli, W. Bannwart, H. Döbeli, R. Gentz and D. Stüber, Biotechnology Nov. 1988, 1321-1325.