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7/28/2019 Biolog for Legionella
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7/28/2019 Biolog for Legionella
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3 3 4 6 MAUCHLINE AND KEEVILa n d t h e q u i c k e s t r e a c
t i o n s a n d t h e m o s t d i v e r s e m e t a b o l i ca c t
i v i t i e s o c c u r r e d d u r i n g i n c u b a t i o n i n a
l o w - o x y g e n a t m o -s p h e r e . T y p e s t r a i n s d
i d n o t c r o s s - i d e n t i f y w i t h a n y o f t h es t r
a i n s a l r e a d y i n t h e m a n u f a c t u r e r ' s d a t a
b a s e , i n d i c a t i n gt h a t t h i s m o d i f i e d s y s
t e m h a s v a l u e i n b e i n g a b l e t o i d e n t i f yl e
g i o n e l l a e t o t h e s p e c i e s l e v e l .
MATERIALS AND METHODSS t r a i n s a n d c u l t i v a t i o n .
T h e s t r a i n s u s e d were a l l l a b o r a -t o r y s t o c
k s w h i c h were m a i n t a i n e d on g l a s s b e a d s a t -
7 0 C .T h e y were a l l o r i g i n a l l y o b t a i n e d f r o
m t h e U n i t e d K i n g d o mN a t i o n a l C o l l e c t i o
n o f T y p e C u l t u r e s , C o l i n d a l e , L o n d o n ,U
n i t e d K i n g d o m . T h e c u l t u r e s u s e d were s i n
g l e s t r a i n s o f L .p n e u m o p h i l a s e r o g r o u p
s 1 t h r o u g h 1 4 ( e x c l u d i n g 4 a n d 9 )a n d e i g h
t t y p e s t r a i n s o f o t h e r L e g i o n e l l a s p p . P
r i o r t oi n o c u l a t i o n o f t h e BIOLOG p l a t e , a l l
i s o l a t e s were g r o w n onb u f f e r e d c h a r c o a l -
y e a s t e x t r a c t ( B C Y E ) a g a r ( 2 1 ) a t 3 7 C f o
r7 2 h . S i n c e t h e BIOLOG s y s t e m r e q u i r e s m e t a
b o l i c a l l ya c t i v e c e l l s , i t i s c o n s i d e r e
d n e c e s s a r y t o u s e c u l t u r e s t h a ta r e a s y o
u n g a s p o s s i b l e . I t wa s p o s s i b l e t o g e t s u
f f i c i e n tg r o w t h on BCYE p l a t e s a f t e r 2 4 h when
t h e y were i n o c u -l a t e d h e a v i l y f r o m a p r i m a
r y p l a t e , i t s e l f i n o c u l a t e d f r o m t h ef r e
e z e r s t o c k . When t h e s e y o u n g c u l t u r e s were u
s e d t oi n o c u l a t e t h e BIOLOG p l a t e s , i t was f o u
n d t h a t s l i g h t l y mores u b s t r a t e s were u t i l i
z e d . H o w e v e r , i t w as d i f f i c u l t t o o b t a i ns
u f f i c i e n t g r o w t h f o r some o f t h e s t r a i n s ,
p a r t i c u l a r l y t h o s en o t b e l o n g i n g t o L . p
n e u m o p h i l a ; i n some i n s t a n c e s , t h eg r o w t h
o n t h r e e BCYE p l a t e s was b a r e l y a d e q u a t e t op
r o v i d e a s u f f i c i e n t i n o c u l u m , e s p e c i a l
l y when t h e h i g h e r c e l lc o n c e n t r a t i o n ( d e s
c r i b e d l a t e r ) was u s e d . S i n c e i t a p p e a r e
dt h a t t h e r e wa s l i t t l e t o g a i n b y t h i s e x t r
a s t e p , a n d t o a l l o wt h e d e v e l o p m e n t o f a s
t a n d a r d p r o t o c o l ( w i t h a co m m o ni n c u b a t i
o n t i m e ) f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f a l l L e
g i o n e l l a s p p . ,BCYE p l a t e s were i n c u b a t e d a
t 3 7 C f o r 7 2 h t o p r o v i d ei n o c u l a f o r t h e i d
e n t i f i c a t i o n o f l e g i o n e l l a e .BIOLOG i n o c u
l a t i o n a n d i n c u b a t i o n . C e l l s u s p e n s i o n
swere m a d e a s d e s c r i b e d i n t h e m a nu f a c tu r e r
' s m a n u a l . T h i sr e q u i r e s a c e l l d e n s i t y i
n a t u r b i d i t y r a n g e s e t b y u s i n gt h e m i l k o
f m a g n e s i a s t a n d a r d s s u p p l i e d b y BIOLOG a tt
h a t t i m e , w h i c h w as e q u i v a l e n t t o A 5 9 0 o f
0 . 5 t o 0 . 6 5 ,a s m e a s u r e d on an SP 5 0 0 s p e c t r o
p h o t o m e t e r ( P y e U n i c a m ,C a m b r i d g e , U n i
t e d K i n g d o m ) . ( T h e s e t u r b i d i t y s t a n d a r
d sa r e n o l o n g e r r e c o m m e n d e d b y BIOLOG s i n c e
t h e y weref o u n d t o l a c k c o n s i s t e n c y . T h e s t
a n d a r d s n o w s u p p l i e db y BIOLOG h a v e A 5 9 0 o f 0
. 3 4 t o 0 . 3 9 . ) I n an e f f o r t t o u s ea u n i f o r m c
e l l d e n s i t y t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t s
, a ni n o c u l u m i n t h e r a n g e o f 0 . 5 5 t o 0 . 6 was
u s e d ( a p p r o x i m a t e -l y 1 . 3 x 1 0 9 t o 1 . 7 x 1 0
9 CFU m l - ' ) , e x c e p t t h a t P a g e ' sa m o e b a l s a
l i n e ( P A S ) ( 2 0 ) was u s e d i n p l a c e o f 0 . 8 5 %(
w t / v o l ) N a C I , a s t h i s c o n c e n t r a t i o n o f N
a C l h a s b e e nr e p o r t e d , t o i n h i b i t g r o w t h
o f s e v e r a l l e g i o n e l l a s t r a i n s ( 1 ) .B a c t
e r i a l s u s p e n s i o n s u s e d t o i n o c u l a t e t h e
BIOLOG p l a t e swere s t r e a k e d o n t o BCYE a g a r m i n u
s L - c y s t e i n e t o t e s t t h ep u r i t y , s i n c e l e
g i o n e l l a e c a n n o t g r o w w i t h o u t c y s t e i n e
. T h eBIOLOG m u l t i w e l l p l a t e s were i n o c u l a t e
d a s d e s c r i b e d i nt h e BIOLOG U s e r ' s M a n u a l ( B
i o l o g I n c . , H a y w a r d , C a l i f . ) .M u l t i w e l
l p l a t e s were i n c u b a t e d a t 3 7 C i n e i t h e r a i
r o r al o w - o x y g e n a t m o s p h e r e , s i n c e i t i s
known t h a t l e g i o n e l l a ea r e s e n s i t i v e t o l o
w l e v e l s o f h y d r o g e n p e r o x i d e a n d s u p e r
-o x i d e r a d i c a l s ( 1 2 , 1 5 ) . T h i s was a c h i e v
e d b y e v a c u a t i n g a na n a e r O b i c j a r , b l e e d
i n g i n 0 . 2 b a r o f a i r , a n d f i l l i n g t h er e m a
i n i n g v o l u m e w i t h a n a n a e r o b i c g a s m i x t u
r e ( 9 5 %N 2 - 5 % C 0 2 ) -M e t a b o l i c p r o f i l e s a n
d d a t a b a s e c o m p a r i s o n . A p u r p l ef o r m a z a
n f o r m e d i n t h o s e w e l l s i n w h i c h t h e s u b s t
r a t e was
m e t a b o l i z e d , a n d t h e c o l o r d e v e l o p m e
n t i n t h e m u l t i w e l lp l a t e s w a s r e a d b y e y e
a t 2 4 - h i n t e r v a l s u p t o 7 2 h . A l t e r n a -t i v
e l y , t h e m u l t i w e l l p l a t e s w e r e r e a d a u t o
m a t i c a l l y i n aM e t e r t e c h M i c r o p l a t e R e a
d e r ( A t l a s B i o s c a n , B o g n o r R e g i s ,U n i t e
d K i n g d o m ) w i t h a f i l t e r c u t o f f o f 6 0 0 n m .
The 9 5s u b s t r a t e w e l l s w e r e r e a d a g a i n s t a
s u b s t r a t e b l a n k w e l l . TheBIOLOG m a n u f a c t u r
e r recommends f o r a p o s i t i v e r e s u l t am i n i m u m r
e a d i n g o f 40% o f t h e h i g h e s t p o s i t i v e s u b s
t r a t er e s p o n s e , b u t e x p e r i e n c e l e d t o t h
e s e l e c t i o n o f a minimumr e a d i n g o f 2 0 % . T h e s
u b s t r a t e u t i l i z a t i o n p r o f i l e o f e a c hs t
r a i n w a s r e c o r d e d a n d u s e d t o c o n s t r u c t a
s p e c i f i c L e g i o n -e l l a d a t a b a s e . T h e f i l
e s i n t h i s d a t a b a s e w e r e c o m p a r e da g a i n s
t , a n d u s e d t o i d e n t i f y , s u b s e q u e n t known s
t r a i n s a n dr e p l i c a t e e x p e r i m e n t s o f t h e
s a m e p r e v i o u s l y i d e n t i f i e ds t r a i n s . T h
e d a t a w e r e a l s o c o m p a r e d w i t h t h e c u r r e n
t l ya v a i l a b l e BIOLOG d a t a b a s e o f e n v i r o n m e
n t a l a n d m e d i c a lb a c t e r i a . A d d i t i o n a l s
o f t w a r e w h i c h g e n e r a t e d s p r e a d s h e e t sa
l l o w i n g e a s i e r c o m p a r i s o n s o f s u b s t r a t
e u t i l i z a t i o n b e t w e e ns t r a i n s was w r i t t e
n i n t h e l a b o r a t o r y .P u r i f i c a t i o n a n d a n
a l y s i s o f p u t a t i v e p o l y h y d r o x y b u t y r a t
ef r o m L . p n e u m o p h i l a . L y o p h i l i z e d L . p n
e u m o p h i l a c e l l s w e r ee x t r a c t e d w i t h b o i
l i n g c h l o r o f o r m , a n d t h e e x t r a c t w a sp u r
i f i e d b y b e i n g w a s h e d w i t h v o l u m e s o f i c e
- c o l d a b s o l u t ee t h a n o l a n d d i e t h y l e t h e
r . T h e p u r i f i e d m a t e r i a l was i n v e s t i -g a t
e d b y " 3 C n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e (NMR)
s p e c t r o s -c o p y , a n d t h e r e s u l t a n t 1 3 C NMR
s p e c t r u m was c o m p a r e dw i t h t h a t o f a n A l c a
l i g en es s p . p o l y h y d r o x y b u t y r a t e ( P H B )(
S i g m a , P o o l e , U n i t e d K i n g d o m ) . G a s c h r o
m a t o g r a p h y -m a s s s p e c t r o m e t r y was u s e d t
o a n a l y z e a m e t h a n o l y s a t e o ft h e m a t e r i a
l .
RESULTSG e n u s m e t a b o l i s m . An i m p o r t a n t a t
t r i b u t e o f t h e BIOLOGs y s t e m i s t h a t r e c o v e r
e d b a c t e r i a d o n o t n e e d t o g r o ws u b s e q u e n
t l y i n t h e a s s a y ; t h e y h a v e o n l y t o b e m e t a
b o l i -c a l l y a c t i v e t o r e d u c e t h e t e t r a z o
l i u m v i o l e t . L e g i o n e l l a e ,h o w e v e r , h a v
e b e e n s h o w n t o b e s e n s i t i v e t o h y d r o g e
n
p e r o x i d e a n d s u p e r o x i d e ( 1 2 , 1 5 ) , a n d
we h a v e d e m o n s t r a t e dp r e v i o u s l y t h a t a s t
r a i n o f L . p n e u m o p h i l a s e r o g r o u p 1b e h a v
e d a s a m i c r o a e r o p h i l e when g r o w i n g i n l a b
o r a t o r ym e d i a ( 2 7 ) . T h i s p h y s i o l o g i c a l
r e s p o n s e was f o u n d t o a f f e c tt h e r a t e o f f o
r m a z a n f o r m a t i o n i n t h e BIOLOG s y s t e m whens t
r a i n s w e r e i n c u b a te d i n a i r ; o n l y P - h y d r
o x y b u t y r a t e a n dm e t h y l p y r u v a t e w e r e r e
c o r d e d a s g i v i n g p o s i t i v e r e a c t i o n sw i t
h i n 2 4 h f o r t h e v a r i o u s L . p n e u m o p h i l a s e
r o g r o u p s . I n a l ls u b s e q u e nt e x pe r i m en ts ,
t h e s e s u b s t r a t e s w e r e c o n s i s t e n t l yt h e
m o s t r a p i d l y m e t a b o l i z e d , a s i n d i c a t e d
b y t h e f o r m a t i o no f a d e e p e r - c o l o r r e a c t
i o n t h a n t h a t p r o d u c e d b y a n y o f t h eo t h e r
c o m p o u n d s i n t h e p a n e l . A f t e r 7 2 h o f i n c u
b a t i o n , morep o s i t i v e r e s u l t s were o b s e r v e
d b y e i t h e r t h e e y e o r u s i n g t h em i c r o p l a t
e r e a d e r .When t h e m u l t i w e l l p l a t e s w e r e i n
c u b a t e d a e r o b i c a l l y ,some o f t h e c o l o r r e a
c t i o n s w e r e n o t v i s i b l e a f t e r 2 4 h a n db e c
a m e a p p a r e n t o n l y a f t e r l o n g e r i n c u b a t i
o n . F o r e x a m p l e ,i n c u b a t i n g L . p n e u m o p h
i l a s e r o g r o u p 1 NCTC 1 1 1 9 2 a t t h em a n u f a c t u
r e r ' s r e c o m m e n d e d c o n c e n t r a t i o n i n t h e
m u l t i w e l lp l a t e s t o o k 7 2 h i n a i r t o g i v e 1
5 p o s i t i v e r e a c t i o n s . T h i sn u m b e r i s c o n
s i d e r e d b y t h e m a n u f a c t u r e r t o b e r a t h e r
l o wf o r a n a c c u r a t e r e s o l u t i o n o f s p e c i e
s ; a l s o 7 2 h o f i n c u b a t i o ni s c o n s i d e r e d b
y t h e m a n u f a c t u r e r t o b e u n a c c e p t a b l y l o
n g ,a s t h e m u l t i w e l l p l a t e s a r e n o t p a c k a
g e d a s e p t i c a l l y a n d ,t h u s , s p u r i o u s p o s
i t i v e r e s u l t s may o c c u r w i t h p r o l o n g e di n
c u b a t i o n . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h
i s l o w l e v e l o fm e t a b o l i c a c t i v i t y i s t h a
t L e g i o n e l l a s pp . a r e s e n s i t i v e t o l o wl e v
e l s o f h y d r o g e n p e r o x i d e a n d s u p e r o x i d e
r a d i c a l s ( 1 2 , 1 4 ) ;
A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .
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7/28/2019 Biolog for Legionella
3/5
BIOCHEMICAL IDENTIFICATION OF LEGIONELLAE 3 3 4 7a l s o , we h
a v e f o u nd t h a t L . p n e u m o p h i l a appears t o b em i
c r o a e r o p h i l i c i n l a b o r a t o r y m e d i a s i n c
e i t grows b e s t i nour c o n t i n u o u s c u l t u r e system
when t h e d i s s o l v e d oxygent e n s i o n i s s t r i c t l
y c o n t r o l l e d t o 4 % o f a i r s a t u r a t i o n ( 1 6 )
.C o n s e q u e n t l y , r e s u s p e n d e d l e g i o n e l l
a e were i n c u b a t e d i nt h e BIOLOG system i n a l o w - o x
y g e n e n v i r o n m e n t b y d e g a s -s i n g a n a e r o b
i c j a r s a n d r e g a s s i n g w i t h 0 . 2 b a r o f a i r a
n d t h e nw i t h 0 . 8 b a r o f 5% ( v o l / v o l ) c a r b o n
d i o x i d e i n n i t r o g e n . T h i sg a ve a f i n a l
oxygen c o n c e n t r a t i o n o f a p p r o x i m a t e l y 4 %(
v o l / v o l ) . M u l t i w e l l p l a t e s i n c u b a t e d i
n t h i s e n v i r o n m e n tg a v e d e f i n i t e r e a c t i
o n s w i t h i n o n l y 2 4 h , w h i c h , a l t h o u g hw e a
k e r , were c o n s i s t e n t w i t h r e s u l t s o b t a i n
e d d u r i n g t h e 7 2h o f i n c u b a t i o n i n a i r . H o
w e v e r , t h e r e were now 2 0 p o s i t i v ea n d 2 v a r i a
b l e r e a c t i o n s . An e x t r a seven s u b s t r a t e s
gavep o s i t i v e r e a c t i o n s , i n c l u d i n g Tween 4 0
( p o l y o x y e t h y l e n e s o r -b i t a n m o n o p a l m i
t a t e ) , Tween 8 0 ( p o l y o x y et h yl e n es o r b i t a nm
o n o o l e a t e ) , m o n o m e t h y l s u c c i n a t e , a c e
t a t e , L - a s p a r t a t e ,g l y c y l - L - a s p a r t a t
e , a n d u r o c a n a t e ; t w o s u b s t r a t e s , s u c c i
n a t ea n d y - a m i n o b u t y r a t e , gave v a r i a b l e r
e a c ti o ns i n r e p l i c a t es a m p l e s . O n l y L - a l
a n y l g l y c i n e was no l o n g e r m e t a b o l i z e d .R e
p r e s e n t a t i v e s o f o t h e r L . p n e u m o p h i l a
serogroups a n d ara n ge o f type s t r a i n s o f o t h e r L e
g i o n e l l a spp. were i n v e s t i -g a t e d b y t h i s m o
d i f i e d BIOLOG p r o c e d u r e . A l l o f t h e L .p n e u m
o p h i l a s t r a i n s i n v e s t i g a t e d were s i m i l a
r l y a f f e c t e d b yt h e c o n c e n t r a t i o n o f oxygen
i n a i r a n d gave t h e l a r g e s tn u m b e r o f p o s i t i
v e r e s u l t s i n a 4 % ( v o l / v o l ) oxygen e n v i r o n
-m e n t . The serogroup 7 s t r a i n was t h e l e a s t r e a c
t i v e o f t h e L .p n e u m o p h i l a s t r a i n s t e s t e
d . N e v e r t h e l e s s , even t h i s s t r a i nm e t a b o l
i z e d 1 5 s u b s t r a t e s , w h i c h gave s u f f i c i e n
t r e s o l u t i o n ,i n t h i s s t u d y , t o d i f f e r e n
t i a t e i t t o t h e s p e c i e s l e v e l . A l l o f t h eL
. p n e u m o p h i l a s t r a i n s c o n s i s t e n t l y m e t
a b o l i z e d Tween 4 0 ,Tween 8 0 , m e t h y l p y r u v a t e
, , 3 - h y d r o x y b u t y r a t e , a . - k e t o b u -t y r a
t e , o x - k e t o v a l e r a t e , a l a n i n a m i d e , L - a
l a n i n e , L - g l u t a m a t e ,g l y c y l - L - g l u t a m
a t e , L - l e u c i n e , L - pr o l i n e, L - s e r i ne , L -
t h r e o -n i n e , a n d urocanate ( T a b l e 1 ) . The a b i l
i t y t o u t i l i z e Tween 4 0a n d Tween 8 0 s u g g e s t s t
h a t L . p n e u m o p h i l a possessese s t e r a s e a c t i v
i t y s i m i l a r t o t h a t r e p o r t e d b y M u l l e r ( 1
8 ) a n dN o l t e e t a l . ( 1 9 ) , except t h a t o ur d a t a
s u g g e s t t h a t t h e s t r a i n swe i n v e s t i g a t e d
a re a b l e t o s p l i t e s t e r s o f h i g h e r f a t t y a
c i d s ,as i n d i c a t e d b y t h e m e t a b o l i s m o f
Tween 4 0 a n d Tween 8 0 .I n t e r e s t i n g l y , a l t h o u
g h u r o c a n a t e i s a n i n t e r m e d i a t e i n h i s t i
-d i n e m e t a b o l i s m , o n l y one o f t h e s t r a i n s
t e s t e d , t h e sero-group 5 s t r a i n (NCTC 1 1 4 0 5 ) ,
was a b l e t o m e t a b o l i z e h i s t i -d i n e w i t h i n
t h e 2 4 - h i n c u b a t i o n p e r i o d . T h e s t r a i n s
NCTC1 2 0 0 0 a n d NCTC 1 1 9 8 4 , w h i c h b e l o n g t o
serogroups 1 0 a n d1 3 , r e s p e c t i v e l y , t o o k 4 8 h i
n 4 % ( v o l / v o l ) oxygen t o m e t a b -o l i z e h i s t i d
i n e .S i m i l a r m e t a b o l i c p r o f i l e s were n o t e
d f o r t h e o t h e r L e g i o n -e l l a spp., except t h a t t
h e y g e n e r a l l y gave f e w e r p o s i t i v er e a c t i o
n s t h a n d i d t h e L . p n e u m o p h i l a s t r a i n s .
Th e mostm e t a b o l i c a l l y v e r s a t i l e i s o l a t e
was t h e t y p e s t r a i n o f L .l o n g b e a c h a e , w h i
c h g a ve 1 8 p o s i t i v e r e a c t i o n s ( T a b l e 1 ) .
Byc o n t r a s t , L . h a c k e l i a e g ave o n l y seven p o s
i t i v e r e a c t i o n s . Oft h e 9 5 s u b s t r a t e s i n t
h e BIOLOG p a n e l , 2 6 d i f f e r e n t s u b -s t r a t e s
were m e t a b o l i z e d b y one or more L e g i o n e l l a s p
e c i e s ,w i t h a l l t h e s t r a i n s t e s t e d m e t a b
o l i z i n g m e t h y l p y r u v a t e ,0 - h y d r o x y b u t
y r a t e , a n d L - p r o l i n e . The m a j o r i t y o f t h e
spe-c i e s i n c u b a t e d i n 4 % ( v o l / v o l ) oxygen m e
t a b o l i z e d t h e f o l -l o w i n g w i t h i n 2 4 h :
Tween 4 0 ( e x c e p t L . r u b r i l u c e n s ) ,o x - k e t o
b u t y r a t e ( e x c e p t L . i s r a e l e n s i s ) , a - k e
t o v a l e r a t e ( e x -c e p t L . h a c k e l i a e a n d L .
m i c d a d e i ) , a l a n i n a m i d e ( e x c e p tL . h a c k
e l i a e ) , L - a s p a r a g i n e ( e x c e p t L . h a c k e l
i a e a n d L .m i c d a de i ) , L - g l u t a m a t e ( e x c e p
t L . m i c d a d e i ) , L - s e r i n e ( e x -c e p t L . d u m
o f f i i a n d L . h a c k e l i a e ) , a n d L - t h r e o n i n
e ( e x c e p tL . d u m o f f i i a n d L . r u b r i l u c e n s
) . U n l i k e t h e L . p n e u m o p h i l as t r a i n s , none
o f t h e s p e c i e s m e t a b o l i z e d a c e t a t e , p r o
p i o n a t e ,
TABLE 1 . S u b s t r a t e m e t a b o l i s m p r o f i l e s
o f L e g i o ne l l a s p p .i n c u b a t e d i n 4% ( v o l / v
o l ) o x y g e n a t 3 7 C f o r 2 4 hw i th P a g e' s a m o e b
a l s a l i n e a s d i l u e n tP r o f i l e o f L e g i o n e l
l a a :
S u b s t r a t e . g -
Tween 4 0 + b + + + V + + +Tween 8 0 + + + + +M e t h y l p y r
u v a t e + + + + + + + + +M o n o m e t h y l s u c c i n a t e +
+ + VA c e t a t e V, - H y d r o x y b u t y r a t e + + + + + + +
+ +a - K e t o b u t y r a t e + + + + + + + +o t - K e t o v a l e
r a t e + + + + + + +P r o p i o n a t e VS u c c i n a t e + +A l
a n i n a m i d e + + + + + + + +L - A l a n i n e + + + + V +L - A
l a n y l g l y c i n e + + VL - A s p a r a g i n e + + + + + V VL
- A s p a r t a t e VL - G l u t a m a t e + + + + + + + +G l y c y
l - L - a s p a r t a t e VG l y c y l - L - g l u t a m a t e + +L
- H i s t i d i n e VL - L e u c i n e + + +L - O r n i t h i n e
+L - P r o l i n e + + + + + + + + +L - S e r i n e + + + + + + VL
- T h r e o n i n e V + + + + + +- y - A m i n o b u t y r a t e VU
r o c a n a t e + + + + + +
a L . b o z e m a n i i ( N C T C 1 1 3 6 8 ) ; L . d u m o f f
i i ( N C T C 1 1 3 7 0 ) ; L . f e e l e i i ( N C T C1 2 0 2 2 )
; L . h a c ke l i ae s e r o g r o u p 1 (NCTC 1 1 9 7 9 ) ; L . i
s r a e l e n s i s (NCTC 1 2 0 1 0 ) ;L . l o n g b e a c h a e s
e r o g r o u p 1 (NCTC 1 1 4 7 7 ) ; L . m i c d a d e i (NCTC 1 1
3 7 1 ) ;p o o l e d r e s u l t s f o r L . p n e u m o p h i l a
s e r o g r o u p s 1 (NCTC 1 1 1 9 2 ) , 2 (NCTC1 1 2 3 0 ) , 3 (
N C T C 1 1 2 3 2 ) , 5 (NCTC 1 1 4 0 5 ) , 6 (NCTC 1 1 2 8 7 ) , 7
(NCTC 1 1 9 8 4 ) ,8 ( N C T C 1 1 9 8 5 ) , 1 0 ( N C T C 1 2 0 0
0 ) , 1 1 ( N C T C 1 2 1 7 9 ) , 1 2 ( N C T C 1 2 1 8 0 ) , 1 3(
N C T C 1 2 1 8 1 ) , a n d 1 4 (NCTC 1 2 1 7 4 ) ; L . r u b r i l
u c e n s (NCTC 1 1 9 8 7 ) .b + a n d V d e n o t e p o s i t i v
e a n d v a r i a b l e r e a c t i o n s , r e s p e c t i v e l y
, i n r e p l i c a t es a m p l e s .
a s p a r t a t e , g l y c y l - L - a s p a r t a t e , h i s
t i d i n e , L - o r n i t h i n e , o r y -a m i n o b u t y r a
t e . O n l y L . f e e l e i i m e t a b o l i z e d g l y c y l -
L - g l u t a -m a t e , L . l o n g b e a c h a e m e t a b o l i
z e d s u c c i n a t e , L . b o z e m a n i ia n d L . l o n g b
e a c h a e m e t a b o l i z e d L - l e u c i n e , a n d L . b o
z e m a -n i i , L . i s r a e l e n s i s , a n d L . l o n g b e
a c h a e m e t a b o l i z e d m o n o -m e t h y l s u c c i n a
t e . A l t h o u g h t h e BIOLOG p a n e l o f s u b s t r a t e
sc o n t a i n s a n u m b e r o f s u g a r s , e . g . , g l u c
o s e , f r u c t o s e , g a l a c -t o s e , a n d m a l t o s e
, n o n e o f t h e s t r a i n s t e s t e d r e a c t e d p o s i
-t i v e l y w i t h a n y o f t h e m . T h i s i s n o t u n e x
p e c t e d s i n c ep r e v i o u s r e p o r t s i n d i c a t e
t h a t l e g i o n e l l a e h a v e l o w l e v e l s o fg l u c
o s e u p t a k e a n d c a t a b o l i s m ( 1 3 , 2 5 ) . A l t h
o u g h W e i s s e ta l . ( 2 6 ) r e p o r t e d t h a t t h e P
h i l a d e l p h i a 2 s t r a i n o f L . pneumo-p h i l a u t i
l i z e d g l u c o s e - i - p h o s p h a t e , n o n e o f t h e
s t r a i n s i n t h i ss t u d y s h o w e d a n y i n d i c a t
i o n o f u t i l i z i n g e i t h e r g l u c o s e - i -p h o s
p h a t e o r g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e ; h o w e v e r
, t h i s may b ed u e t o i n s u f f i c i e n t r e d u c i n g
p o w e r b e i n g g e n e r a t e d t o c a u s ed e t e c t a b
l e r e d u c t i o n o f t h e t e t r a z o l i u m d y e .S p e
c i f i c i t y a n d s e n s i t i v i t y . T h e m e t a b o l i
c p r o f i l e s o f a l l o ft h e s t r a i n s , w h i c h h a
d b e e n i n c u b a t e d i n 4 % ( v o l / v o l ) o x y g e nf
o r 2 4 h , were c o m p a r e d w i t h t h e m a n u f a c t u r
e r ' s d a t a b a s ea n d t h e n e n t e r e d i n t o a n ew L
e g i o n e l l a c o m p u t e r d a t a b a s e .None o f t h e l
e g i o n e l l a e t e s t e d were i d e n t i f i e d a s c l o
s e l y
VOL. 5 7 , 1 9 9 1
-
7/28/2019 Biolog for Legionella
4/5
3 3 4 8 MAUCHLINE AND KEEVILm a t c h i n g a n y o t h e r o f
t h e 4 3 4 s t r a i n s o f b a c te r i a i n t h eBIOLOG d a t
a b a s e , i n d i c a t i n g t h a t t h e p r o f i l e s o b t
a i n e dwere s p e c i f i c t o t h i s genus. E n v i r o n m e
n t a l i s o l a t e s w h i c hh a d b e e n p r o v i s i o n a
l l y i d e n t i f i e d b y s e r o l o g y a s L e g i o n e l l
aspp. ( k i n d l y p r o v i d e d b y J o h n K u r t z , O x f o
r d , U n i t e d K i n g -d o m ) were t y p e d b y u s i n g o
ur m o d i f i e d BIOLOG s y s t e m .T h e r e s u l t s were c o
m p a r e d w i t h a c o m b i n a t i o n o f t h em a n u f a c
t u r e r ' s d a t a b a s e a n d o ur L e g i o n e l l a d a t
a b a s e . T h ei d e n t i f i c a t i o n t h a t we o b t a i n
ed a g r ee d w i t h t h a t o f K u r t z t ot h e s pe ci e s l
e v e l . E n v i r o n m e n t a l i s o l a t e s o f
Pseudomonasf l u o r e s c e n s , P . p a u c i m o b i l i s , P
. v e s i c u l a r i s , K l e b s i e l l a spp.,A l c a l i g e
n e s s p . , A c h r o m o b a c t e r s p . , a n d o t h e r w a
t e r i s o -l a t e s were n o t i d e n t i f i e d as c l o s e
l y m a t c h i n g a n y o f t h eL e g i o n e l l a p r o f i l
e s .E f f e c t o f i n c r e a s e d b i o m a s s on m e t a b o
l i s m . One p o s s i b l emeans o f e n c o u r a g i n g g r o
w t h a n d m e t a b o l i s m o f m i c r o a e r o -p h i l i c
b a c t e r i a i s t o i n c r e a s e t h e i r c e l l mass so t
h a t t h e h i g h e rr e s p i r a t i o n r a t e h e l p s t o
m a i n t a i n a l o w e r oxygen c o n c e n t r a -t i o n d i f
f u s i n g i n t o s t a t i c c u l t u r e s . When t h e c o n
c e n t r a t i o n o ft h e L . p n e u m o p h i l a serogroup 1
s t r a i n was d o u b l e d ( a p p r o x -i m a t e l y 2 . 3 x
1 0 9 t o 3 . 0 x 1 0 9 CF U m l - ' ) a n d t h e m u l ti w el lp
l a t e s were i n c u b a t e d i n a i r , 2 4 s u b s t r a t e
s were m e t a b o l i z e da n d g a v e p o s i t i v e r e s u l
t s w i t h i n 2 4 h . A s i m i l a r e f f e c t wasn o t e d w
i t h L . m i c d a d e i , w h i c h m e t a b o l i z e d 1 8 s u
b s t r a t e sc o m p a r e d w i t h o n l y 9 a t t h e p r e s
c r i b e d c o n c e n t r a t i o n .S i m p l i f i c a t i o n
o f d i l u e n t . The p r e v i o u s e x p e r i m e n t s d e
-s c r i b e d d a t a o b t a i n e d w i t h l e g i o n e l l a
e r e s u s p e n d e d i n P A S ,s i n c e t h e p h y s i o l o
g i c a l s a l i n e d i l u e n t r e c o m m e n d e d b y t h
em a n u f a c t u r e r , w h i c h h a s a s o d i u m c o n c e
n t r a t i o n o f 1 4 6 mM,may b e i n h i b i t o r y t o some s
t r a i n s . H o w e v e r , PAS i s l o w i ns o d i u m ( 4 m M)
a n d h a s b e e n s h o w n t o p r o v i d e a g o o dd i l u e
n t a n d t r a n s p o r t medium f o r l e g i o n e l l a e ( 1
4 ) . I n a na t t e m p t t o s i m p l i f y t h i s d i l u e n
t , w h i c h a l s o c o n t a i n s 1 mMK + , 2 mM p h o s p h a
t e , 2 7 , u M C a 2 + , a n d 1 6 p . M M g 2 + ,l e g i o n e l
l a e were r e s u s p e n d e d a n d i n c u b a t e d i n d e i
o n i z e dw a t e r . T h i s was c a r r i e d o u t w i t h b a
c t e r i a l s u s p e n s i o n s a td o u b l e t h e c o n c e
n t r a t i o n d e s c r i b e d i n t h e m a n u f a c t u r e r
' sm a n u a l . By t h i s m e t h o d , r e s u l t s w i t h d e
i o n i z e d w a t e r as t h ed i l u e n t were s i m i l a r t
o t h o s e o b t a i n e d b y u s i n g P A S .When t h e l a t t
e r two m o d i f i c a t i o n s were u s e d , t h e p r o f i l
e so b t a i n e d f o r t h e s t r a i n s i n v e s t i g a t e
d were s i m i l a r t o t h o s er e c o r d e d i n t h e i n i t
i a l e x p e r i m e n t s w i t h a l o w - o x y g e n i n c u
-b a t i o n a n d P AS a s t h e d i l u e n t . S u f f i c i e n
t n u m b e r s o f p o s i t i v er e a c t i o n s c o u l d b e
o b t a i n e d w i t h i n 2 4 h b y u s i n g d i s t i l l e dw
a t e r as t h e d i l u e n t a n d a n o r m a l a e r o b i c a
t m o s p h e r e t oa l l o w a c c u r a t e i d e n t i f i c a
t i o n o f t h e s t r a i n s t e s t e d . T h u s , t h em o di
f i e d p r o t o c o l was c o n s i d e r a b l y s i m p l i f i
e d f o r r o u t i n el a b o r a t o r y use.I d e n t i f i c a
t i o n o f p u ta t i ve PHB. T h e 1 3 C NMR spectrum o ft he m
at er i a l e x t r a c t e d f r o m L . p n e u m o p h i l a was
c o n s i s t e n tw i t h t h a t o f P HB a n d was i d e n t i c
a l t o t h a t o f a u t h e n t i c P HBf r o m a n A l c a l i g
e n e s s p . A n a l y s i s o f a m e t h a n o l l y s a t e o f
t h ep u r i f i e d m a t e r i a l b y g a s c h r o m a t o g r
a p h y - m a s s spectrometryd e m o n s t r a t e d t h a t 3 - h
y d r o x y b u t y r a t e was t h e p r e d o m i n a n th y d r
o x y a l k a n o i c a c i d monomer o f t h e m a t e r i a l . T
h e s e d a t ai n d i c a t e t h a t t h e m a t er i a l e x tr
a c t e d f r o m L . p n e u m o p h i l awas PHB.
DISCUSSIONThe r e s u l t s o b t a i n e d i n t h i s s t u d
y s u g g e s t t h a t when t h i sm o d i f i e d p r o c e d u r
e i s e m p l o y e d , t h e BIOLOG b a c t e r i a li d e n t i f
i c a t i o n system h a s t h e a b i l i t y t o i d e n t i f y
l e g i o n e l l a e a tl e a s t t o t h e s p e c i e s l e v e
l . A l s o , t h e r e s u l t s o b t a i n e d so f a r
s u g g e s t t h a t b o t h t h e s p e c i f i c i t y a n d
s e n s i t i v i t y a re g o o d . I no r d e r t o c r e a t e s
t a b l e d a t a b a s es , i t w i l l b e necessary t o
c h a r a c t e r i z e m u l t i p l e s t r a i n s f r o m a
l l known s p e c i e s . A l -t h o u g h o u r d a t a b a s e i
s d e r i v e d f r o m r e a c t i o n d a t a f o r o n l y as m
a l l n u m b e r o f p r ev i o u s l y i d e n t i f i e d t y p
e s t r a i n s , we h a v es h o w n t h a t i t i s n ow p o s s
i b l e w i t h t h i s m o d i f i e d s y s t e m t oi d e n t i
f y l e g i o n e l l a e b y p h e n o t y p i c m e a n s , a n d
we h a v eo b t a i n e d a c c u r a t e i d e n t i f i c a t i o
n o f n o n t y p e s t r a i n s , w h i c hh a d p r e v i o u s
l y b e e n i d e n t i f i e d b y s e r o l o g y , b y u s i n g
t h i ss y s t e m . W i t h t h i s m o d i f i e d s y s t e m ,
w h i c h p r o v i d e s a s i m p l e ,r a p i d , a n d s t a n
da r d i z e d p r o c ed u r e, i t i s now p o s s i b l e t oa d
d r e s s t h e p o i n t s t h a t B r e n n e r ( 3 ) made i n h
i s r e v i e w o f t h ec l a s s i f i c a t i o n o f L e g i o
n e l l a c e a e : " R e p r e s e n t a t i v e n u m b e r so f
s t r a i n s f r o m a l l s p e c i e s m u s t b e s y s t e m a
t i c a l l y s t u d i e d b ya l l t h e p h e n o t y p i c m e
t h o d s a v a i l a b l e . . . t o d e t e r m i n ew h e t h e
r a m e a n s o f p h e n o t y p i c a l l y s p e c i a t i n g l
e g i o n e l l a e i sa c h i e v a b l e " a n d i f s o t o d e
c i d e i f t h e r e a r e v a l i d p h e n o t y p i cg r o u n
d s f o r m o r e t h a n o n e g e n u s i n t h e f a m i l y L e
g i o n e l -l a c e a e .T h e L e g i o n e l l a c e a e h a v e
p r e v i o u s l y b e e n c o n s i d e r e d t ob e f a s t i d
i o u s b e c a u s e o f t h e i r i n a b i l i t y t o m e t a b
o l i z e c a r b o -h y d r a t e s o r t o g r o w o n a r a n g
e o f r o u t i n e l a b o r a t o r y m e d i a .T h e p r e s e
n t s t u d y s h o w e d , a s was e x p e c t e d , t h a t t h e
l e -g i o n e l l a e i n v e s t i g a t e d w e r e m o s t m e
t a b o l i c a l l y a c t i v e t o -w a r d s a m i n o a c i d
s a n d t h e i r d e r i v a t i v e s i n t h e BIOLOGp a n e l o
f s u b s t r a t e s , r e s u l t s w h i c h a g r e e w i t h p
r e v i o u s w o r ko n t h e m e t a b o l i s m o f t h i s g e
n u s ( 7 , 1 3 , 2 2 , 2 5 ) , a n d w e r e , i na d d i t i o n
, a b l e t o m e t a b o l i z e a r a n g e o f c a r b o x y l i
c a c i d s a n dt h e i r d e r i v a t i v e s , i n c l u d i n
g a c e t a t e , p r o p i o n a t e , s u c c i n a t e ,m o n o
m e t h y l s u c c i n a t e , a n d m e t h y l p y r u v a t e .
O u r r e s u l t sa g r e e d w i t h t h o s e o f T e s h e t a
l . ( 2 5 ) , who f o u n d t h a t t h ea d d i t i o n o f p y r
u v a t e , s u c c i n a t e , a n d a c e t a t e s t i m u l a t
e d o x -y g e n u p t a k e b y s u s p e n s i o n s o f w a s h
e d c e l l s o f L . p n e u m o -p h i l a b u t t h a t a - k e
t o g l u t a r a t e d i d n o t . A l t h o u g h c e l l e x t r
a c t so f L . p n e u m o p h i l a h a v e a - k e t o g l u t a
r a t e d e h y d r o g e n a s e a c -t i v i t y ( 1 1 , 1 3 , 2
5 ) , w h o l e c e l l s f a i l t o o x i d i z e t h i s s u b s
t r a t e t oa n y a p p r e c i a b l e l e v e l ( 1 3 , 2 5 ) .
T h i s l e d T e s h e t a l . ( 2 5 ) t op o s t u l a t e t h a
t L . p n e u m o p h i l a was u n a b l e t o t r a n s p o r t t
h i sc o m p o u n d . O u r r e s u l t s seem t o s u p p o r t t
h i s , a s we f o u n d n om e t a b o l i s m o f a - k e t o g l
u t a r a t e , a l t h o u g h t h e o t h e r k e t o - a c i d
si n t h e p a n e l w e r e m e t a b o l i z e d b y a l m o s t
a l l o f t h e s t r a i n si n v e s t i g a t e d . A l l t h e
s t r a i n s t e s t e d m e t a b o l i z e d m e t h y l p y r u
-v a t e a n d , - h y d r o x y b u t y r a t e , a n d m o s t m
e t a b o l i z e d Tween4 0 a n d Tween 8 0 , s u g g e s t i n g
t h a t t h e y p o s s e s s e s e s t e r a s ea c t i v i t y ,
a s r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( 1 8 , 1 9 ) . H o w e v e
r , t h i s ma yn o t b e d u e t o s p e c i f i c e s t e r a s e
a c t i v i t y b u t may b e d u e t op r o t e a s e a c t i v i
t y ( 2 4 ) . S p e c i f i c a m i n o p e p t i d a s e a c t i v
i t i e s f o rL . p n e u m o p h i l a h a v e b e e n r e p o r
t e d b y M u l l e r ( 1 8 ) ; i n o u rs t u d y , we f o u n d t
h a t s e v e r a l d i p e p t i d e s w e r e m e t a b o l i z e
d b yl e g i o n e l l a e .Many r e s e a r c h e r s h a v e r e
p o r t e d t h e p r es e n c e o f e l e c t r o nt r a n s l u c
e n t g r a n u l e s i n L e g i o n e l l a s p p . T h e a p p e
a r a n c e a n ds t a i n i n g p r o p e r t i e s o f t h e s e
g r a n u l e s h a v e l e d t h e a u t h o r s o ft h e s e r e
p o r t s t o s u g g e s t t h a t t h e i n c l u s i o n s r e s
e m b l e P HBg r a n u l e s ( 6 , 2 3 ) . O u r f i n d i n g t h
a t L . p n e u m o p h i l a c o n t a i n e dP HB p r o v i d e s
d i r e c t e v i d e n c e f o r P HB a c c u m u l a t i o n b yl
e g i o n e l l a e ( 1 7 ) . S i n c e a l l t h e s t r a i n s i
n v e s t i g a t e d i n t h i ss t u d y m e t a b o l i z e d t
h e m o n o m e r , , B - h y d r o x y b u t y r a t e , P HBmay p
l a y a s i g n i f i c a n t r o l e a s a c a r b o n a n d e n e
r g y s t o r a g ec o m p o u n d f o r s u r v i v a l i n o l i
g o t r o p h i c e n v i r o n m e n t s .S i n c e s l i g h t l
y m o r e s u b s t r a t e s w e r e u t i l i z e d when t h
eBIOLOG p l a t e s w e r e i n o c u l a t e d w i t h c u l t u r
e s g r o w n o nBCYE f o r 2 4 h , u s e o f a s h o r t e r i n c
u b a t i o n t i m e f o r t h ei n o c u l u m may b e a d v i s
a b l e when t h e s y s t e m i s b e i n g u s e d t oi n v e s t
i g a t e t h e p h y s i o l o g y o f s t r a i n s . I n t h e i
n t e r e s t o fs t a n d a r d i z a t i o n a n d s i m p l i c
i t y , h o w e v e r , i n o c u l u m g r o w nf o r 7 2 h s e e
m s s u i t a b l e when t h e s y s t e m i s u s e d t o i d e n
t i f yi s o l a t e s . I n c u b a t i n g t h e t e s t p l a t
e s i n a l o w - o x y g e n a t m o -
A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .
-
7/28/2019 Biolog for Legionella
5/5
BIOCHEMICAL IDENTIFICATION OF LEGIONELLAE 3 3 4 9s p h e r e o r
a t h i g h c e l l d e n s i t y a l l o w s much more r a p i dd
e v e l o p m e n t o f p o s i t i v e t e s t s a n d , t h u s ,
f a c i l i t a t e s i d e n t i f i -c a t i o n a f t e r o n l
y 2 4 h o f i n c u b a t i o n . To i n c r e a s e t h e a b i l
i t y o ft h e s y s t e m t o d i f f e r e n t i a t e b e t w e
e n L e g i o n e l l a s p p . , i t ma yb e d e s i r a b l e t o
i n c r e a s e t h e number o f s u b s t r a t e s w h i c h c a
nb e p o t e n t i a l l y u s e d b y a L e g i o n e l l a i s o
l a t e . S i n c e l e g i o n e l l a ea r e a s a c c h a r o l
y t i c , t h e r e p l a c e m e n t o f t h e c a r b o h y d r a
t es u b s t r a t e s w i t h s u b s t r a t e s t h a t c a n b
e u t i l i z e d b y t h e s eb a c t e r i a s h o u l d i n c r
e a s e t h e s y s t e m ' s r e s o l v i n g power f o rL e g i
o n e l l a c e a e .
ACKNOWLEDGMENTST h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y P r o
j e c t G r a n t G 8 8 2 3 6 9 8 S B f r o m t h eM e d i c a l R
e s ea r c h C o u n c i l o f G r e a t B r i t a i n . M a t e r
i a l a s s i s t a n c e w a sr e c e i v e d f r o m B i o l o g
I n c . , H a y w a r d , C a l i f . , a n d A t l a s B i o s c a
n L t d . ,B o g n o r R e g i s , U n i t e d K i n g d o m .We t
h a n k R . K n o w l e s f o r h i s a s s i s t a n c e w i t h t
h e c o m p u t i n g a n dR . W a i t f o r t h e NMR s p e c t r
o s c o p y a n d m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y -s e s
.
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n n e r , D . J . , A . G . S t e i g e r w a l t , G . W. G o r m
a n , H . W.W i l k i n s o n , W. F . B i b b , M. H a c ke l , R
. L . T yn da l l , J . C a m p b e l l ,J . C . F e e l e y , W. L
. T h a c k e r , P . S k a l i y , W. T . M a r t i n , B . J .B r
a k e , B . S . F i e l d s , H . V . M c E a c h e r n , a n d L .
K . C o r c o r a n . 1 9 8 5 .T e n new s p e c i e s o f L e g i
o n e l l a . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3 5 : 5 0 -
5 9 .5 . B r e n n e r , D . J . , A . G . S t e i g e r w a l t ,
a n d J . E . M c D a d e . 1 9 7 9 .C l a s s i f i c a t i o n o
f t h e L e g i o n n a i r e s ' d i s e a s e b a c t e r i u m :
L e g i o n -e l l a p n e u m o p h i l a , g e n u s n o v u m ,
s p e c i e s n o v a o f t h e f a m i l yL e g i o n e l l a c e
a e , f a m i l i a n o v a . A n n . I n t e r n . M e d . 9 0 : 6
5 6 - 6 5 8 .6 . C h a n d l e r , F . W . , J . A . B l a c k m o
n , M. D . H i c k l i n , R . M. C o l e ,a n d C . S . C a l l a
w a y . 1 9 7 9 . U l t r a s t r u c t u r e o f t h e a g en t o
f L e g i o n -n a i r e s ' d i s e a s e i n t h e human l u n g
. Am . J . C l i n . P a t h o l . 7 1 : 4 3 - 5 0 .7 . F r a n z u
s , M. J . , B . G . M a l c o l m , a n d L . P i n e . 1 9 8 4 .
T a x o n o m i ce v a l u a t i o n o f a m i n o a c i d m e t a
b o l i s m i n L e g i o n e l l a . C u r r . M i -c r o b i o l
. 1 1 : 7 3 - 8 0 .8 . F r a s e r , D . W . , T . R . T s a i , W.
O r e n s t e i n , W. E . P a r k i n , H . J .B e e c h a m , R .
G . S h a r r e r , J . H a r r i s , G . F . M a l l i s o n , S .
M. M a r t i n ,J . E . M c D a d e , C . C . S h e p p a r d , P .
S . B r a c h m a n , a n d t h e F i e l dI n v e s t i g a t i o
n T e a m . 1 9 7 7 . L e g i o n n a i r e s ' d i s e a s e : d e
s c r i p t i o n o fa n e p i d e m i c o f p n e u m o n i a . N
. E n g l . J . M e d . 2 7 9 : 1 1 8 9 - 1 1 9 7 .9 . G a r r i t
y , G . M . , A . B r o w n , a n d R . M. V i c k e r s . 1 9 8 0
. T a t l o c k i aa n d F l u o r i b a c t e r : t w o new g e n
e r a o f o r g a n i s m s r e s e m b l i n gL e g i o n e l l a
p n e u m o p h i l a . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3
0 : 6 0 9 - 6 1 4 .1 0 . H a r r i s o n , T . G . , a n d A . G .
T a y l o r . 1 9 8 8 . P h e n o t y p i c c h a r a c t e r -i s
t i c s o f l e g i o n e l l a e , p . 4 5 -5 6 . I n T. G . H a r
r i s o n a n d A . G .T a y l o r ( e d . ) , A l a b o r a t o r
y m a n u a l f o r L e g i o n e l l a . J o h n W i l e y
&
S o n s L t d . , C h i c h e s t e r , U n i t e d K i n g d o
m .1 1 . H o f f m a n , P . S . , a n d L . P i n e . 1 9 8 2 . R
e s pi r a t o r y p h ys i o l o g y a n dc y t o c h r o m e c o
nt en t o f L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a . C u r r . M
i c r o -b i o l . 7 : 3 5 1 - 3 5 6 .1 2 . H o f f m a n , P . S .
, L . P i n e , a n d S . B e l l . 1 9 8 3 . P r o d u c t i o n o
fs u p e r o x i d e a n d h y d r o g e n p e r o x i d e i n
medium u s e d t o c u l t u r eL e g i o n e l l a p n e u m o p h
i l a : c a t a l y t i c d e c o m p o s i t i o n b y c h a r c o
a l .A pp l . E nv i r o n . M i c r o b i o l . 4 5 : 7 8 4 - 7 9
1 .1 3 . K e e n , M. G . , a n d P . S . H o f f m a n . 1 9 8 4 .
M e t a b o l i c p a t h w a y s a n dn i t r o g e n m e t a b o
l i s m i n L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a . C u r r . M
i c r o -b i o l . 1 1 : 8 1 - 8 8 .1 4 . K e e v i l , W. C . , J
. T . W a l k e r , J . M c E v o y , a n d J . S . C o l b o u r n
e .1 9 8 9 . D e t e c t i o n o f b i o f i l m s a s s o c i a t
ed w i t h p i t t i n g c o r r o s i on o fc o p p e r p i p e w
o r k i n S c o t t i s h h o s p i t a l s , p . 9 9 - 1 1 7 . I n
C . C .G a y l a r d e a n d L . H . G . M o r t o n ( e d . ) , B
i o c o r r o s i o n . B i o d e t e r i -o r a t i o n S o c i e
t y , K e w , U n i t e d K i n g d o m .1 5 . L o c k s l e y , R
. M . , R . F . J a c o b s , C . B . W i l s o n , W. M. W e a v e
r , a n dS . J . K l e b a n o f f . 1 9 8 2 . S u s c e p t i b i
l i t y o f L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l at o o x y g e
n - d e p e n d e n t m i c r o b i c i d a l s y s t e m s . J . I
m m u n o l . 1 2 9 :2 1 9 2 - 2 1 9 7 .1 6 . M a u c h l i n e ,
W. S . , e t a l . 1 9 9 0 . A b s t r . 1 5 t h A n n u . S c i .
C o n f .P u b l i c H e a l t h L a b . S e r v . U n i t e d K i
n g d o m , p . 7 9 .1 7 . M a u c h l i n e , W. S . , e t a l . 1
9 9 0 . A b s t r . 1 1 5 t h M e e t . S o c . G e n .M i c r o b
i o l . , p . M 4 5 .1 8 . M u l l e r , H . E . 1 9 8 1 . E n z y
m a t i c p r o f i l e o f L eg i o ne l l a pneumo-
p h i l a . J . C l i n . M i c r o b i o l . 1 3 : 4 2 3 - 4 2
6 .1 9 . N o l t e , F . S . , G . E . H o l l i c k , a n d R . G
. R o b e r t s o n . 1 9 8 2 . E n z y -m a t i c a c t i v i t i
e s o f L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a a n d L e g i o n
e l l a - l i k eo r g a n i s m s . J . C l i n . M i c r o b i o
l . 1 5 : 1 7 5 - 1 7 7 .2 0 . P a g e , F . C . 1 9 6 7 . T a x o
n o m i c c r i t e r i a f o r l i m a x a m o e b a w i t hd e s
c r i p t i o n o f t h r e e new s p e c i e s o f H a r t m a n n
e l l a a n d t h r e e o fV o h l k a m p f i a . J . P r o t o z
o o l . 1 4 : 4 9 9 - 5 2 1 .2 1 . P a s c u l l e , A . W . , J .
G . F e e l e y , R . J . G i b s o n , L . G . C o r d e s , L . R
.M ye r o wi t z , C . M. P a t t o n , G . W. Gorman, C . L . C a
r m a c k , J . W.E z z e l l , a n d J . N . D o w l i n g . 1 9 8
0 . P i t t s b u r g h p n e u m o n i a a g e n t :d i r e c t i
s o l a t i o n f r o m human l u n g t i s s u e . J . I n f e c t
. D i s . 1 4 1 : 7 2 7 -7 3 2 .2 2 . P i n e , L . , J . R . G e o
r g e , M. W. R e e v e s , a n d W. K . H a r r e l l . 1 9 7 9 .D
e v e l o p m e n t o f a c h e m i c a l l y d e f i n e d l i q u
i d medium f o r g r o w t ho f L e g i o n e l l a p n e u m o p h
i l a . J . C l i n . M i c r o b i o l . 9 : 6 1 5 - 6 2 6 .2 3 .
R o d g e r s , F . G . , a n d M. R . D a v e y . 1 9 8 2 . U l t
r a s t r u c t u r e o f t h e c e l le n v e l o p e l a y e r s
a n d s u r f a c e d e t a i l s o f L e g i o n e l l a p n e u m
o p h i l a .J . G e n . M i c r o b i o l . 1 2 8 : 1 5 4 7 - 1 5
5 7 .2 4 . S t r y e r , L . 1 9 8 1 . B i o c h e m i s t r y , 2
n d e d . , p . 1 0 4 . W. H . F r e e m a n& C o . , New Y o r
k .2 5 . T e s h , M. J . , S . A . M o r s e , a n d R . D . M i l
l e r . 1 9 8 3 . I n t e r m e d i a t em e t a b o l i s m i n L
e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a : u t i l i z a t i o n o f
a m i n oa c i d s a n d o t h e r c o m p o u n d s a s e n e r g
y s o u r c e s . J . B a c t e r i o l .1 5 4 : 1 1 0 4 - 1 1 0 9
.2 6 . W e i s s , E . , M. G . P e a c o c k , a n d J . C . W i l
l i a m s . 1 9 8 0 . G l u c o s e a n dg l u t a m a t e m e t a
b o l i s m o f L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a . C u r r
. M i c r o -b i o l . 4 : 1 - 6 .2 7 . W e s t , A . A . , R . A r
a u j o , P . L . J . D e n n i s , a n d C . W. K e e v i l . 1 9
8 9 .C h e m o s t a t m o d el s o f L e g i o n e l l a p n e u m
o p h i l a , p . 1 0 7 - 1 1 6 . I nB . F l a n n i g a n ( e d .
) , A i r b o r n e d e t e r i o g e n s a n d p a t h o g e n s .
B i o d e -t e r i o r a t i o n S o c i e t y , K e w , U n i t e
d K i n g d o m .
VOL. 5 7 , 1 9 9 1
