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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS
BIOLOGÍA REPRODUCTIVA (CALIDAD ESPERMÁTICA Y REGENERACIÓN DEL
ESPERMATÓFORO) DEL LANGOSTINO DE RÍO Macrobrachium americanum ALIMENTADO
CON DIFERENTES DIETAS
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS EN MANEJO DE RECURSOS MARINOS
PRESENTA:
BIOL. JUAN CARLOS PÉREZ RODRÍGUEZ
LA PAZ, B.C.S., MÉXICO, DICIEMBRE, 2017
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AGRADECIMIENTOS
Extiendo mi agradecimiento al Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas del
Instituto Politécnico Nacional (CICIMAR-IPN) por permitirme realizar el programa de
Maestría en Ciencias en Manejo de Recursos Marinos y realizar la investigación del
presente trabajo en sus instalaciones y análisis en sus laboratorios.
A mis directores de tesis Dr. Edilmar Cortés Jacinto (CIBNOR) y Dr. Jaime Gómez
Gutiérrez por su incondicional apoyo para la realización de la presente investigación
experimental, así como a los miembros del Comité Tutorial por su orientacion e ideas
aportadas: Dr. Victor Manuel Gómez Muñoz, Dr. Marcial Arellano Martínez y Dra.
Laura Susana López Greco (Universidad de Buenos Aires, Argentina). Estoy
profundamente agradecido por el total apoyo y permiso de la Dra. Silvie Dumas para
la realización del trabajo experimental en la Unidad Piloto de Maricultivos (UPIMA)
del CICIMAR-IPN así como al M. en C. Mauricio Contreras Olguín por su inestimable
ayuda, consejos e ideas para la realización del experimento.
Agradezco al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR) por
permitirme realizar análisis de muestras en distintos laboratorios. A la Dra. María del
Carmen Rodríguez Jaramillo y a María Eulalia Meza Chávez (Laboratorio de
Histología e Histoquímica) por su apoyo en el análisis de muestras histológicas de la
gónada masculina de langostinos de río; al M. en C. Roberto Hernández Herrera
(Laboratorio de Bioquímica Fisiológica) por los análisis bromatológicos del alimento
usado en los experimentos y al Biol. Mar. Ariel Arturo Cruz Villacorta (Laboratorio de
Microscopia Electrónica) por su ayuda y disposición para los análisis de espermas de
langostino de río de la presente tesis. A los Proyectos SIP-IPN titulados “Estudio
comparativo de parásitos helmintos tróficamente transmitidos de ballena azul y
ballena de aleta en áreas de alimentación invernal (SIP-IPN 20150113, 20160495)” y
“Detección de periodos de desove de peces mediante métodos moleculares y
estructura de la comunidad de zooplancton en el Parque Nacional Cabo Pulmo SIP-
IPN 20171275” otorgaron apoyo financiero complementario para la realización y
análisis de muestras biológicas de la presente investigación. Agradezco al Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo financiero a través de los
5
proyectos: CONACyT CB2010/156252, de Infraestructura 2014/ 227565, y proyecto
bi-nacional AMEXCID CTC/06038/14 a cargo de los Drs. Laura Susana López Greco
y Edilmar Cortés Jacinto. Estoy agradecido por la beca de CONACyT para maestría
otorgada al Biólogo Juan Carlos Pérez Rodríguez (740720/596715).
La presente investigación no podría haber sido realizada sin el apoyo del señor
Guadalupe Talamantes y su familia que habitan en San Pedro de la Presa, Baja
California Sur por la colecta de los langostinos de río utilizados en la presente
investigación. A los doctores Dr. Stig Yamasaki Granados, Dr. Yuniel Méndez
Martínez, la Biol. Maritza L. Soberanes Yepiz y al Ing. Rafael Ernesto Caneva Silva
por su apoyo para la captura, alimentación, mantenimiento y toma de muestra de los
especímenes experimentales.
6
ÍNDICE GENERAL
GLOSARIO.........................................................................................................................................7ÍNDICE DE FIGURAS......................................................................................................................9ÍNDICE DE TABLAS.....................................................................................................................12RESUMEN........................................................................................................................................13INTRODUCCIÓN............................................................................................................................15
Antecedentes............................................................................................................................................18Justificación..............................................................................................................................................21Objetivos....................................................................................................................................................22
General........................................................................................................................................................................22Específicos................................................................................................................................................................22
METODOLOGÍA.............................................................................................................................23Trabajo de campo..................................................................................................................................................23Dietas experimentales.........................................................................................................................................26Extracción de espermatóforos y conteo espermático.........................................................................27Producción de espermatóforos.......................................................................................................................29Crecimiento...............................................................................................................................................................30Histología de langostinos macho...................................................................................................................30Microscopía electrónica de barrido...............................................................................................................31Análisis estadísticos.............................................................................................................................................31
RESULTADOS................................................................................................................................32Aspectos generales de reproducción............................................................................................32
Producción de espermatóforos.......................................................................................................................32Composición bioquímica (proteínas, lípidos y carbohidratos) del espermatóforo...............36Efecto de método de extracción de espermatóforo.............................................................................37Calidad espermática.............................................................................................................................................39
Efecto de las dietas................................................................................................................................43Síntesis del análisis de la calidad espermática......................................................................................44Crecimiento...............................................................................................................................................................45Histología del tracto reproductivo en machos.........................................................................................47Morfología fina del espermatóforo y del espermatozoide.................................................................50
DISCUSIÓN.....................................................................................................................................53Biología reproductiva de M. americanum.....................................................................................53
Producción de espermatóforos.......................................................................................................................53Composición bioquímica (proteínas, lípidos y carbohidratos) del espermatóforo...............57Calidad espermática.............................................................................................................................................57Histología del tracto reproductivo en machos y morfología de alta resolución del espermatóforo y espermatozoides................................................................................................................60
Efecto de dietas.......................................................................................................................................61Calidad espermática.............................................................................................................................................61Crecimiento...............................................................................................................................................................62
REFERENCIAS..............................................................................................................................65ANEXOS...........................................................................................................................................70
7
GLOSARIO
Abdomen: Parte posterior del cuerpo a continuación del cefalotórax de los
crustáceos decápodos.
Atarraya: Red con forma redonda para pescar en aguas poco profundas.
Caridea: Infraorden de los crustáceos decápodos conocidos comúnmente
como camarones.
Cefalotórax: Parte del cuerpo de los crustáceos formada por la fusión de la cabeza y
el tórax.
Células de Sertoli: Células ubicadas en los túbulos seminíferos de los testículos,
que brindan soporte estructural y metabólico a las células durante
la espermatogénesis.
Cromatina: Forma en la que se presenta el ADN en el núcleo celular. Es la sustancia
de base de los cromosomas, que corresponde a la asociación de ADN, ARN y
proteínas que se encuentran en el núcleo interfásico de las células y que constituye
el genoma.
Eucromatina: Forma de la cromatina ligeramente compactada (menos que la
heterocromatina) con una gran concentración de genes y a menudo (aunque no
siempre) se encuentra en transcripción activa.
Gonoporo: abertura genital.
Hembra ovígera: Hembra que porta los huevos adheridos a los pleópodos.
8
Hepatopáncreas: Glándula digestiva que realiza funciones semejantes al páncreas e
hígado de los mamíferos.
Heterocromatina: Forma inactiva condensada de la cromatina localizada sobre todo
en la periferia del núcleo que se tiñen fuertemente con coloraciones para ADN.
Larva: Fase de desarrollo posterior a la eclosión del embrión de los animales que
experimentan desarrollo indirecto (con metamorfosis) y que tienen morfología,
anatomía, fisiología y ecología diferente a la del adulto.
Pellet: Nombre genérico para referirse a una mezcla previamente acondicionada
(humedad y temperatura) a través de un molde o matriz con orificios que da forma
cilíndrica a un alimento comprimido.
Pleópodos: Apéndices abdominales de los crustáceos.
Postlarva: Fase ontogenética posterior a la larva y previo a la metamorfosis a
juvenil.
Télico: Modificación de la parte ventral del cefalotórax de la hembra de decápodos
localizado entre el 3° al 5° par de pereiópodos, encontrándose las coxas de estos
dos últimos pares de apéndices más separadas que el resto; en esta estructura es
donde el macho deposita su espermatóforo.
Telson: Segmento ubicado en la parte terminal posterior del abdomen de la mayoría
de los artrópodos.
9
ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. A. Espermatóforo de M. americanum. B. Hembra con espermatóforo
adherido al télico. Tomado de Hernández-Valencia (2010). ............................... 19
Figura 2. San Pedro de la Presa (24º 50’ 53” n, -110º 59’ 38” w; triangulo negro),
municipio de La Paz, Baja California Sur. ........................................................... 24
Figura 3. Dendrograma de clasificación de los 29 langostinos recolectados con corte
a nivel de tres grupos: pequeños (15-45 g) grupo central, medianos (46-80 g)
grupo de la izquierda y grandes (81-130 g) grupo de la derecha. ....................... 25
Figura 4. A. Tanque circular de 600 l de agua dulce donde fueron cultivados 29
langostinos de río machos de M. americanum. B. Tubos de pvc como refugio
para cada individuo. ............................................................................................ 26
Figura 5. Extracción de espermatóforo mediante técnica de electro estimulación. .... 27
Figura 6. Criterios para la clasificación de espermatozoides normales y anormales. 29
Figura 7. Distribución de frecuencia de pesos de 29 machos de Macrobrachium
americanum capturados en el oasis de San Pedro de la Presa, B.C.S., México
utilizados para el experimento de biología reproductiva masculina. ................... 32
Figura 8. Distribución de frecuencia del periodo de formación del espermatóforo por
individuo de M. americanum durante el tiempo experimental de 244 días. ........ 33
Figura 9. A. Porcentaje de producción de espermatóforos y supervivencia de M.
americanum a lo largo del tiempo experimental. B. Valores mínimo, máximo y
promedio del peso de los espermatóforos obtenidos del medio natural (control) y
a lo largo del experimento de 244 días de cultivo. C. Distribución de frecuencia
del peso del espermatóforo de todos los especímenes experimentales. ............ 35
10
Figura 10. Distribución de frecuencia de la proporción del peso del espermatóforo
con respecto al peso total del macho de M. americanum. .................................. 36
Figura 11. Variación de la composición bioquímica promedio del espermatóforo de
macrobrachium americanum en términos de porcentaje de proteínas, lípidos y
carbohidratos totales estimados a lo largo del periodo experimental (combinando
todos los especímenes de cada tratamiento por fecha de extracción). .............. 37
Figura 12. Melanización del espermatóforo. A. Espermatóforo normal. B.
Espermatóforo melanizado. C. Perforación (p) del caparazón en la región de la
cámara branquial de M. americanum. ................................................................. 38
Figura 13. A. Distribución de frecuencia del número de espermatozoides estimado
por cada espermatóforo de M. americanum durante el experimento. B.
Comparación del número de espermatozoides por espermatóforo de M.
americanum registrados en el experimento con respecto al observado en
especímenes recién recolectados en la naturaleza (grupo control). ................... 40
Figura 14. A. Distribución de frecuencia del porcentaje de espermatozoides
anormales observados en el espermatóforo de M. americanum. B. Valores
máximos, mínimos y comparación del porcentaje promedio de espermatozoides
anormales, registrados durante el experimento, con el de langostinos recién
colectados de su medio natural (control), no hubo diferencias significativas entre
promedios. ........................................................................................................... 41
Figura 15. A. Distribución de frecuencia del porcentaje de espermatozoides muertos
observados en el espermatóforo de M. americanum. B. Comparación del
porcentaje de espermatozoides muertos en los espermatóforos de los
langostinos alimentados durante el experimento con los de langostinos recién
colectados del campo (control). ........................................................................... 43
11
Figura 16. Ajuste del modelo potencial de peso-longitud (W=a*Lb) de langostinos
macho de M. americanum. .................................................................................. 47
Figura 17. A. Fotografía de microscopio óptico de testículo de M. americanum teñido
con hematoxilina y eosina mostrando los túbulos seminíferos que lo componen.
B. Túbulos seminíferos, algunos con espermatogonias (Sg) en la periferia. C.
Túbulo seminífero con espermatocitos (Sc) en diversas fases de división celular.
D. Túbulos seminíferos en la parte próxima al conducto deferente (cd) con
espermátidas (St) y los primeros espermatozoides en testículo (Sz). E.
Espermatozoides en testículo (material genético teñido de azul) en forma
semicircular. F. Sección del conducto deferente con espermatozoides maduros
(Sz) de base “aplanada” y rodeados de una secreción protectora (Sp), el epitelio
(Ep) y la capa muscular externa (Mu). H. Conducto deferente con epitelio
columnar (Ec). I. Ámpula terminal y sus dos capas gruesas de músculo liso: una
transversal (Mt) y otra longitudinal (Ml) en el centro epitelio (Ep). ...................... 50
Figura 18. A. Imagen de microscopía electrónica de barrido (MEB) que muestra la
sección ventral y sección dorsal del espermatóforo. B. Sección ventral del
espermatóforo mostrando placas cuadradas. C. Envoltura degradada del
espermatóforo que muestra las fibras transversales que la constituyen. D. Corte
transversal del espermatóforo que muestra el grosor de la envoltura (Ev) que
protege a la masa espermática (Me). E. Vista de masa espermática compuesta
de espermatozoides (Sz). F. Espermatozoide con morfología normal, base (Ba),
espina (Es) y radios (ra). ..................................................................................... 52
12
ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Composición proximal de las dietas ofrecidas diariamente al langostino de
río M. americanum durante el periodo experimental. .......................................... 43
Tabla 2. Valores promedio y error estándar de las variables de calidad espermática
del langostino de río M. americanum alimentado con tres diferentes dietas.
Valores dentro de las columnas con superíndices iguales no son
significativamente diferentes (p >0.05). ............................................................... 44
Tabla 3. Valores promedio y error estándar de las variables de calidad espermática
de los tres intervalos de peso de langostino de río M. americanum utilizados en
este experimento, pequeños (15-45 g), medianos (46-80 g) y grandes (81-130
g). Valores dentro de las columnas con superíndices iguales no son
significativamente diferentes (p >0.05). ............................................................... 44
Tabla 4. Valores promedio y error estándar del incremento de peso en porcentaje y
tasa de crecimiento y el valor final de supervivencia observadas en langostinos
de M. americanum alimentados con cada tipo de dieta experimental. Valores
dentro de las columnas con superíndices iguales no son significativamente
diferentes (p >0.05). ............................................................................................ 46
Tabla 5. Valores promedio y error estándar del incremento de peso en porcentaje y
tasa de crecimiento obtenidos por cada intervalo de peso de adultos (chicos 15-
45 g, medianos 46-80 g y grandes 81-130 g), también se muestra el valor final
de supervivencia de los machos de M. americanum utilizados en este
experimento. Valores dentro de las columnas con superíndices iguales no son
significativamente diferentes (p >0.05). ............................................................... 46
13
RESUMEN Macrobrachium americanum es un langostino de agua dulce, actualmente consumida
y valorada en mercados locales de varios estados de México, sin embargo, el cultivo
experimental y comercial aún no ha podido ser implementado debido a la falta de
conocimientos sobre su biología reproductiva y sobre los requerimientos nutricionales
de los reproductores de M. americanum. Se investigó el efecto de tres dietas (100%
alimento comercial pelletizado Camaronina 35 Purina®; 50:50% de alimento
pelletizado-alimento fresco sardina y calamar y 100% alimento fresco) en la
formación y producción del espermatóforo, así como en la calidad espermática de 29
langostinos macho (15–130 g) recolectados en el oasis de San Pedro de la Presa,
Baja California Sur. Los especímenes fueron cultivados durante 244 días bajo
condiciones controladas de laboratorio, alimentándolos diariamente. La calidad
espermática fue evaluada en promedio cada 24 días mediante el peso del
espermatóforo, la cantidad de espermatozoides; y el porcentaje de espermatozoides
vivos:muertos y con morfología normal:anormal. La calidad espermática de 17
langostinos recién capturados (julio 2017) fue comparada con la obtenida de los
especímenes del presente experimento. No existieron diferencias significativas entre
los promedios de las variables de calidad espermática de las tres dietas. Se
evidenció un agotamiento reproductivo a lo largo del experimento (disminución del
peso del espermatóforo, del porcentaje de espermatóforos producidos y del aumento
del promedio de espermatozoides muertos). Los promedios de las variables de
calidad espermática fueron significativamente más altos en especímenes silvestres
que en los especímenes del experimento. Debido a que no se observaron diferencias
significativas de la calidad espermática entre los tres tipos de dietas, y que el pellet
es menos costoso y más fácil de administrar, se recomienda el uso de alimento
pelletizado para el mantenimiento de machos reproductores de M. americanum.
14
ABSRACT Macrobrachium americanum is a freshwater prawn currently consumed and valued in
several states of Mexico. However, experimental and commercial aquaculture of M.
americanum has not yet been successfully achieved because reproductive biology
and nutritional requirements of broodstock males of M. americanum have been little
studied. The present study investigated the effect of three diets (100% commercial
pellet Camaronina 35 Purina®; 50: 50% pellet-sardine and squid muscle (fresh food)
and 100% fresh food) on the formation and production of spermatophore of 29 prawn
individuals (15-130 g). M. americanum sperm quality was measured from specimens
caught on the oasis San Pedro de la Presa, Baja California Sur (September 2016)
and cultured for 244 days under controlled laboratory conditions. Specimens were fed
daily and sperm quality was measured on average every 24 d by the production of
spermatophores, weight, sperm count and percentage of live/dead spermatozoa and
normal/abnormal morphology. The average sperm quality of 17 recently caught prawn
(control, July 2017) was compared to those obtained from the specimens fed with
three feeding treatments. There were no significant differences of means of the sperm
quality variables among the three diets. Only the spermatophore weight had
significant differences between control individuals and prawns fed with fresh food.
Reproductive depletion was evidenced throughout the experiment (decreasing the
spermatophore weight, percentage of spermatophores produced and increase in the
proportion of dead sperms). Average sperm quality was higher in wild specimens than
in specimens fed under experimental diets. Because no significant differences were
observed in reproductive variables among diets and because pellet is cheaper and
easier to use, it is highly recommended the use of pelletized camaronina for the
maintenance of M. americanum broodstock males.
15
INTRODUCCIÓN En México se han registrado doce especies nativas de langostinos del género
Macrobrachium (Spence Bate, 1868) más una especie introducida desde el Indo-
Pacífico, Macrobrachium rosenbergii (de Man, 1879). Cinco de estas especies
habitan en cuerpos de agua dulce de cuencas cercanas a las costas del Océano
Pacífico: M. americanum, M. tenellum (Smith, 1871), M. digueti (Bouvier, 1895), M.
occidentale Holthuis, 1950, y M. hobbsi (Villalobos Hiriart & Nates Rodríguez, 1990)
(Álvarez, 1997). Las otras seis especies que habitan las costas del Golfo de México y
Océano Atlántico son: Macrobrachium carcinus (Linnaeus, 1758), M. acanthurus
(Wiegmann, 1836), M. heterochirus (Wiegmann, 1836), M. olfersii (Wiegmann,
1836), M. villalobosi H.H. Jr. Hobbs, 1973 y M. acherontium Holthuis, 1977 (Álvarez,
1997).
El langostino de río M. americanum es actualmente consumido de manera
regional y valorado en mercados locales de varios estados de México. Esta especie
es capturada con trampas, atarrayas y de forma manual por los pobladores ribereños
para consumo personal, para venta local en fresco o congelado (Pérez et al., 2006).
M. americanum es también comúnmente incluida en platillos gastronómicos servidos
en restaurantes y hoteles, incluso existen registros de su venta en mercados de
Guatemala y El Salvador (Díaz-Monge, 2011).
El valor comercial y gastronómico atribuido a M. americanum se debe a que es
una de las especies del género Macrobrachium que alcanza mayor talla (<290 mm
del rostro al telson) llegando a pesar hasta 0.5 kg (Arana-Magallón & Ortega-Salas,
2004). M. americanum es una especie ampliamente distribuida a lo largo de la costa
del Pacífico de América, desde el norte de México hasta el norte de Perú (Arana-
Magallón & Ortega-Salas, 2004). Esta especie tiene alta producción de huevos
(900,000 huevos por año en promedio) (Cabrera-Jiménez et al., 1979). Los machos
poseen quelas grandes y robustas haciéndolos más apetecibles y valorados por los
comensales. El abdomen de M. americanum de ambos sexos es proporcionalmente
más grande en relación con el cefalotórax de otras especies del género
Macrobrachium, los cuales usualmente tienen un abdomen menor a un tercio de su
longitud total (De la Cruz, 1968).
16
El cultivo experimental y comercial de M. americanum aún no ha sido
implementado con éxito debido al desconocimiento de varios aspectos básicos de su
biología, ecología y fisiología. Los esfuerzos realizados para su cultivo bajo
condiciones controladas han resultado, hasta ahora, en deficientes tasas de
supervivencia larval (García-Guerrero et al., 2013; Yamasaki-Granados et al., 2013).
De la Cruz (1968) indicó que uno de los principales impedimentos para realizar
cultivo experimental y comercial de M. americanum era el escaso suministro de
postlarvas. Los primeros intentos por resolver este problema aún dependen de la
obtención de larvas a partir de hembras ovígeras silvestres. Esta es una solución
impráctica debido a la lejanía de su hábitat natural y porque esta extracción puede
afectar a las poblaciones naturales. Lo cierto es que hasta ahora aún no existe
solución al problema de la alta mortalidad larval en los cultivos.
Adquirir mayor información y comprensión de la biología reproductiva y de la
condición de los reproductores posiblemente ayude a mejorar la condición y tasa de
supervivencia de las larvas. Racotta et al. (2003) concluyeron que la condición de las
larvas de camarón está estrechamente relacionada con la condición de salud y
fisiología de sus progenitores. Una alimentación balanceada y condiciones favorables
de cultivo posiblemente favorezcan la obtención de lotes más grandes y homogéneos
en tamaño de larvas con los cuales realizar adicionales investigaciones de biología
larval para posteriormente desarrollar técnicas adecuadas de cultivo para M.
americanum.
La nutrición es uno de los principales factores que influencian la condición de
los reproductores porque promueve la maduración sexual, e influye en la condición
morfológica y fisiológica de los gametos. La formación de gametos conlleva la
síntesis y movilización de nutrientes, principalmente del hepatopáncreas a la gónada.
Debido a que las hembras realizan una mayor movilización e inversión de energía y
biomasa en el desarrollo de la gónada durante la reproducción que los machos, la
oogénesis y producción de huevos ha sido el objetivo de la mayor parte de los
esfuerzos de investigación sobre el efecto de la nutrición en la oogénesis. Esta
argumentación ha pospuesto los esfuerzos de investigación sobre el efecto de la
nutrición en el desarrollo gonádico de los reproductores machos.
17
La dieta usualmente utilizada para mantenimiento de reproductores de
camarón en cautiverio incluye alimento fresco, con o sin la adición de alimento
pelletizado comercial. Existe evidencia experimental de que el uso exclusivo del
alimento pelletizado durante la maduración gonádica causa baja producción de
huevos en comparación con la maduración obtenida mediante el uso de dietas
compuestas de alimento fresco con alto contenido en proteínas y ácidos grasos
poliinsaturados (Wouters et al., 2001). Como resultado de estas experiencias, en
varias especies de camarones actualmente se proveen dietas mixtas de alimento
pelletizado y alimento fresco con las cuales se han podido obtener mejores
rendimientos de las hembras reproductoras (Harrison, 1990; Wouters et al., 2001;
New, 2002).
Hasta ahora el langostino malayo, M. rosenbergii, es la especie mejor
estudiada en relación a su mantenimiento en cultivo y biología reproductiva debido a
que ha sido cultivada comercialmente en numerosos países. A pesar de que M.
americanum está filogenéticamente próxima a M. rosenbergii, ambas especies
parecen tener comportamiento y biología reproductiva suficientemente distinta que
no permite aplicar directamente el conocimiento generado de M. rosenbergii a M.
americanum. Los machos de M. americanum parecen ser más agresivos y caníbales
que M. rosenbergii. Actualmente no existe información publicada sobre la
espermatogénesis y la calidad reproductiva de M. americanum. New (2002)
recomendó que la mitad de la ración del alimento de especímenes reproductores de
M. rosenbergii debe ser pellet comercial y la otra mitad, hígado de res o calamar
suministrado al menos dos veces por semana. Existe una equivalencia de consumo
de un kilogramo de alimento fresco y 200 g de alimento pelletizado debido al alto
porcentaje de agua en el alimento fresco. De esta forma es imprescindible obtener la
calidad reproductiva de los crustáceos hembras y machos mediante dietas
específicas, debido a que existe evidencia en camarones, que individuos de cada
sexo tienen distintos requerimientos nutricionales (Racotta et al., 2003).
Una manera indirecta de inferir los requerimientos nutricionales de los
reproductores es mediante el análisis de la composición bioquímica de órganos
implicados en la transferencia y acumulación de nutrientes asociados al proceso
18
reproductivo (Racotta et al., 2003). Por ejemplo, la composición bioquímica del
espermatóforo del macho de M. americanum. La producción del espermatóforo y la
calidad espermática (número total de espermatozoides, proporción de vivos:muertos
y con morfología normal:anormal) son indicadores cuantitativos para evaluar la
eficiencia del alimento para promover el rendimiento reproductivo de machos. Estas
variables reproductivas han sido previamente evaluadas en algunas especies de
camarones peneidos: Penaeus monodon Fabricius, 1798, Penaeus vannamei Boone,
1931, Penaeus schmitti Burkenroad, 1936 y Penaeus paulensis (Pérez-Farfante,
1967) (Ceballos-Vázquez, 2003; Coman et al., 2007; Meunpol et al., 2005; Pérez-Jar,
2005).
En el presente trabajo se investigó si la composición de tres distintas dietas
influencia o no en la formación y producción del espermatóforo, el número y la
proporción de espermatozoides deformes de M. americanum que pudieran afectar la
eficiencia reproductiva. Estos aspectos básicos de la biología reproductiva de M.
americanum permanecen, hasta ahora, prácticamente desconocidos.
Antecedentes
La morfología del sistema reproductor masculino y el proceso de
espermatogénesis de M. americanum aún no ha sido estudiado. Sin embargo, como
en la mayoría de los crustáceos, la gónada masculina se posiciona dorsalmente y
consta de testículos pares parcialmente unidos y un par de conductos genitales que
conducen a los gonoporos. Los testículos de M. rosenbergii tienen numerosos
túbulos seminíferos que contienen células similares a las células de Sertoli y células
germinales en diversas etapas de desarrollo (McLaughlin, 1983; Alfaro-Montoya,
2013). Cada conducto genital está compuesto por el túbulo colector, un conducto
deferente y un conducto eyaculador. Los túbulos seminíferos de los testículos se
fusionan para formar conductos colectores que conectan al conducto deferente, y a
su vez dan origen al conducto eyaculador. El conducto eyaculador tiene un mayor
diámetro que el conducto deferente para la formación y almacenamiento del
espermatóforo localizado justo antes de la salida al exterior del gonoporo. Esta
región es conocida generalmente como ámpula terminal (Krol et al., 1992).
19
Castille & Lawrence (1989) concluyeron que las concentraciones promedio de
los lípidos totales en conductos deferentes, ámpulas terminales y hepatopáncreas no
son significativamente diferentes entre los diferentes estadios del desarrollo gonádico
de machos del camarón Penaeus aztecus Ives, 1891. Ellos también observaron que
las proteínas son el componente predominante en los testículos y en los conductos
deferentes y ámpulas terminales de P. aztecus y P. setiferus (Linnaeus, 1767)
evidenciado por las mayores concentraciones de proteínas en machos maduros en
comparación con los machos inmaduros.
El ámpula terminal, localizada en la parte teminal del conducto deferente,
presenta una capa muscular interna con arreglo longitudinal de sus capas y otra capa
muscular externa con arreglo circular (Poljaroen et al., 2010) involucradas en la
expulsión del espermatóforo durante la transferencia. Los espermatóforos son
estructuras que permiten el empaquetamiento de los espermatozoides dentro de
componentes de protección y adherencia secretados por el epitelio del conducto
deferente, y son transferidos a la hembra durante el proceso de apareamiento. El
espermatóforo es adherido al télico de la hembra, ubicado en la región ventral del
cefalotórax (entre el cuarto y quinto par de pereiópodos) (Figura 1).
Figura 1. A Espermatóforo de M. americanum. B Hembra con espermatóforo
adherido al télico. Tomado de Hernández-Valencia (2010).
20
El desove de los huevos (oocitos fecundados) ocurre entre 6-20 h después del
apareamiento. La hembra encorva el cuerpo hacia adelante para tener mayor
contacto con la porción ventral de la región torácica. Los oocitos descienden de los
ovarios a través de los oviductos y posteriormente son fecundados por los
espermatozoides liberados del espermatóforo que esta adherido al télico con ayuda
del primer par de pereiópodos. Los huevos son adheridos a las sedas del primero al
cuarto par de pleópodos donde los embriones se desarrollan hasta la eclosión. Los
huevos adheridos a los pleópodos son ventilados constantemente por vigorosos
movimientos de los pleópodos de la hembra (Diarte-Plata et al., 2012).
En M. rosenbergii se han descrito 12 etapas de la espermatogénesis. Estas
etapas se identifican de acuerdo a la forma, tamaño y organización de la cromatina.
La espermatogénesis comienza con las espermatogonias que se dividen por mitosis
para posteriormente diferenciarse en espermatocitos primarios. Los espermatocitos
primarios se subdividen en seis fases de espermatocitos secundarios (leptoteno,
zigoteno, paquiteno, diploteno, diacinesis y metafase) y posteriormente en tres
etapas de espermátidas denominadas temprana, media y tardía. Las espermátidas
se diferencian por el grado de condensación de la cromatina previo al desarrollo de
los espermatozoides maduros.
Las células espermatogénicas y las células nodrizas son los dos principales
tipos de células del epitelio de los túbulos seminíferos. Los espermatozoides
maduros se encuentran en la luz de los túbulos seminíferos (Poljaroen et al., 2010).
Los espermatozoides maduros de M. rosenbergii son inmóviles y tienen una forma
similar a un paraguas invertido del cual emerge una larga espina anterior (12-14 µm)
compuesta principalmente de proteínas. El cuerpo principal del espermatozoide tiene
forma cóncava y contiene el núcleo, con cromatina altamente dispersa, en la parte
interna de su base. La parte externa del cuerpo presenta una superficie irregular con
14–20 radios que convergen en la base del cuerpo principal desde donde se
proyecta la espina (Leung-Trujillo & Lawrence, 1987; Poljaroen et al., 2010).
Las proteínas son el componente predominante en los testículos, conductos
deferentes y ámpulas terminales de los decápodos (Castille & Lawrence, 1989). Los
espermatozoides contienen una notable concentración de polisacáridos (Pochon-
21
Masson, 1983). Sasikala & Subramoniam (1987) caracterizaron bioquímicamente
varios mucopolísacáridos del espermatóforo de los camarones Penaeus indicus (H.
Milne Edwards, 1837 [in Milne Edwards, 1834-1840]) y Metapenaeus monoceros
(Fabricius, 1798). El sulfato de condroitina y ácido hialurónico son los principales
componentes estructurales del espermatóforo de los camarones. Durante la
oogénesis y la espermatogénesis del camarón Parapenaeopsis hardwickii (Miers,
1878) existe un notable consumo de glucógeno y lípidos del hepatopáncreas, y un
incremento de éstos en los ovarios y testículos evidenciando una movilización de
nutrientes para la reproducción (Nagabhushanam & Kulkarni, 1981).
Justificación
Actualmente se desconoce el efecto que el alimento ejerce en el rendimiento
reproductivo de los machos de M. americanum. En el presente estudio se investigó el
efecto de tres dietas (alimento pelletizado, fresco y 50:50% de ambas dietas) en la
calidad espermática y la condición celular del sistema reproductor de M. americanum
bajo condiciones de cautiverio para obtener información biológica que contribuya a
diseñar técnicas de cultivos eficientes y económicamente rentables para el cultivo
comercial que beneficie la conservación de M. americanum.
Hipótesis Debido a que las proteínas, carbohidratos y lípidos influencian en la calidad
reproductiva en el cultivo de M. rosembergii, se propone la hipótesis de que los
machos de M. americanum alimentados con una dieta combinada (alimento
pelletizado camaronina y fresco) tendrán una mejor condición, cantidad y calidad
espermática bajo condiciones de cultivo, que las dos dietas (pelletizado y fresco) por
separado.
22
Objetivos
General
Investigar la biología reproductiva de machos de langostino de río
Macrobrachium americanum mediante evaluación de la calidad espermática,
regeneración de espermatóforo; y condición celular del ámpula terminal, conductos
deferentes y testículos de especímenes alimentados con tres dietas diferentes y
comparados con especímenes silvestres recién colectados.
Específicos 1) Comparar la calidad espermática de los espermatóforos de M. americanum
extraídos de especímenes silvestres (grupo control) con la de especímenes
alimentados con tres dietas diferentes, cultivados bajo condiciones
experimentales.
2) Comparar la calidad espermática de los espermatóforos extraídos a lo largo del
experimento para evaluar si existe agotamiento reproductivo bajo condiciones
experimentales.
3) Comparar la composición bioquímica (proteínas, lípidos y carbohidratos) de las
tres dietas utilizadas contra la composición bioquímica de los espermatóforos
extraídos de los especímenes alimentados con cada tipo de dieta.
4) Determinar mediante técnicas histológicas las características y la condición celular
de los testículos, conductos deferentes y del espermatóforo de langostinos
silvestres y langostinos al final de la experimentación con cada una de las tres
dietas experimentales para evaluar si existen diferencias morfológicas asociadas
con el tipo de dieta.
23
METODOLOGÍA
Trabajo de campo Veintinueve langostinos machos de M. americanum fueron recolectados en el
oasis de San Pedro de la Presa en septiembre 2016 mediante trampas para
langosta, cebadas con hígado de pollo, y con una red de mano (Figura 2). A Cada
espécimen se le midió la longitud total y se estimó su peso corporal con una balanza
analítica (Metler Toledo ME, precisión 0,001 g).
Los langostinos fueron transportados a la Unidad Piloto de Maricultura
(UPIMA) del Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas del Instituto Politécnico
Nacional (CICIMAR-IPN) localizada en La Paz, Baja California Sur, México. El
transporte se realizó en hieleras con agua del oasis bajo condiciones de oscuridad y
con oxigenación constante a temperatura ambiente.
Además a 13 langostinos capturados en julio del 2017 se les determinó la
calidad espermática inmediatamente después de su recolección. Estos especímenes
fueron sacrificados para realizar análisis histológicos y análisis bioquímicos
proximales en el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR)
para inferir la calidad espermática y morfología de los espermatozoides. Estos
organismos silvestres fueron considerados el grupo de control.
24
Figura 2. San Pedro de la Presa (24º 50’ 53” N, -110º 59’ 38” W; Triangulo negro),
municipio de La Paz, Baja California Sur.
Debido a la heterogeneidad de la longitud total y peso de los 29 langostinos
recolectados, éstos fueron separados en tres grupos de tamaños mediante un
análisis de conglomerados (cluster analysis en inglés). El peso y la longitud total
fueron las variables de clasificación analizados mediante el método de distancia
euclidiana y método de agrupación por enlace completo o distancia más lejana
(Figura 3).
25
Figura 3. Dendrograma de clasificación de los 29 langostinos recolectados con corte
a nivel de tres grupos: pequeños (15-45 g) grupo central, medianos (46-80 g) grupo
de la izquierda y grandes (81-130 g) grupo de la derecha.
Una vez clasificados y separados por talla y peso, fueron redistribuidos en los
tres grupos de dietas experimentales. Cada grupo experimental fue definido por la
dieta a consumir y a su vez cada grupo experimental incluyó langostinos de los tres
tamaños con la finalidad de homogenizar la distribución de tallas y disminuir en lo
posible un sesgo por efecto de desarrollo ontogenético. Se utilizaron tres tanques
circulares de 600 L de capacidad para el cultivo de los tres grupos experimentales.
Cada langostino fue mantenido en una jaula rectangular de 40×15×15 cm forrados
con luz de malla de 1 cm2 para evitar canibalismo. La temperatura varió durante el
periodo de cultivo (244 días) de 24.8 a 28.9ºC (rango 4.1ºC). Cada tanque tuvo
aireación constante y cada jaula rectangular fue provista con un tubo de PVC
(policloruro de vinilo) como refugio (Figura 4). Cada langostino fue alimentado
Id Langostinos152822 5 3 1721 8 232419261011251416 6 1329 9 2720 7 18 1 2 4 12
Dis
tanc
ia e
uclid
iana
0
20
40
60
80
100
120
26
diariamente con un peso de alimento de aproximadamente el 5% del peso del
animal.
Diariamente se extrajo el alimento no ingerido del día anterior y las heces
mediante sifonado del fondo del tanque y un recambio de agua del 30% del volumen
de agua del tanque. Se registraron los parámetros de calidad de agua: temperatura,
pH, conductividad, solidos disueltos y salinidad, utilizando una sonda
multiparámetros (SmarTROLL™ MP Instrument, CO. USA).
Figura 4. A. Tanque circular de 600 L de agua dulce donde fueron cultivados 29
langostinos de río machos de M. americanum. B. Tubos de PVC como refugio para
cada individuo.
Dietas experimentales Las dietas experimentales con las que se alimentaron a los tres grupos de
langostinos fueron las siguientes:
Dieta 1: 100% de alimento fresco (50% de carne de calamar, Dosidicus gigas
(d'Orbigny, 1835) y 50% músculo de sardina, Sardinops sagax caeruleus (Jenyns,
1842)).
Dieta 2: 50% de alimento fresco y 50% de alimento pelletizado marca Camaronina
Purina® de 30% de proteína.
Dieta 3: 100% de alimento pelletizado Camaronina Purina® de 30% de proteína.
27
Para cuantificar la proporción de proteínas, carbohidratos y lípidos de cada
tipo de dieta se realizaron análisis proximales del alimento fresco y pelletizado de
acuerdo con los métodos definidos por la Association of Official Agricultural Chemists
(A.O.A.C., 1995).
Extracción de espermatóforos y conteo espermático
Los espermatóforos de M. americanum fueron extraídos en promedio cada 24
días (rango 20-28 días) mediante electro estimulación con una pila alcalina tipo D de
9 V y dos cables, cada uno conectado al polo positivo o negativo de la pila. El circuito
eléctrico se cierra al introducir uno de los dos cables en la cámara branquial del
langostino y tocando brevemente con el otro cable la base muscular del quinto par de
pereiópodos, cerca del ámpula terminal y los dos grupos musculares que la rodean
(Figura 5). Cuando el langostino recibe el estímulo eléctrico los músculos se contraen
rápidamente causando la expulsión de los espermatóforos a través de los gonoporos
(Díaz et al., 2002).
Figura 5. Extracción de espermatóforo mediante técnica de electro estimulación.
28
Debido a que de cada langostino se pueden obtener dos espermatóforos
durante cada extracción (derecho e izquierdo), uno de los espermatóforos extraídos
fue usado para la medición de la calidad espermática y el otro para realizar el análisis
químico proximal de proteínas, lípidos y carbohidratos. Cuando se extrajo sólo un
espermatóforo por langostino se priorizó el conteo y calidad espermática. La longitud
total (punta del rostro a la punta del telson), el peso de los langostinos y el peso de
los espermatóforos (en miligramos) fueron medidos en cada extracción de
espermatóforos.
El conteo espermático y la estimación del porcentaje de espermatozoides
muertos y anormales se realizó macerando un espermatóforo en 0.5 ml de agua
destilada y tiñendo los espermas con eosina-nigrosina en tubos tipo Eppendorf de
1.5 ml siguiendo el método descrito por Viana da Costa et al. (2016). Posteriormente
se realizaron los conteos espermáticos con una cámara de Neubauer y un
microscopio óptico con aumento de 10, 20, 40 y 100x. Se estimó el número de
espermatozoides contenidos en cada espermatóforo observado, así como el
porcentaje de espermatozoides anormales PA y porcentaje de espermatozoides
muertos PM mediante las siguientes fórmulas:
𝑃𝑀 =𝐸𝑚𝐸𝑡 ×100
Donde Em es el número de espermatozoides muertos contabilizados y Et el
número de espermatozoides totales contabilizados.
𝑃𝐴 =𝐸𝑎𝐸𝑡 ×100
Donde Ea es el número de espermatozoides anormales contabilizados y Et el
número de espermatozoides totales contabilizados.
Los espermatozoides normales tienen forma de “paraguas invertido” y una
espina recta y alargada. Los espermatozoides con la base de forma del paraguas
invertido inusual; espina ausente, espina corta o doblada fueron considerados
espermatozoides con morfología anormal (Figura 6).
29
Normal
Base con forma inusual
Base ausente
Espina ausente
Espina corta
Espina doblada
Figura 6. Criterios para la clasificación de espermatozoides normales y anormales.
Producción de espermatóforos
La producción de espermatóforos se calculó como el porcentaje de
espermatóforos producidos en cada extracción. Como cada organismo es capaz de
30
formar dos espermatóforos, el porcentaje de espermatóforos producidos POR se
calculó de la siguiente manera:
𝑃𝑂𝑅 =𝐸𝑝2𝑛 ×100
Donde Ep es el número de espermatóforos producidos, n es el número de
especímenes sobrevivientes. Este valor se multiplica por dos, debido a la formación
de dos espermatóforos, para estimar la producción total de espermas por extracción.
Crecimiento
Se calculó el incremento de peso en porcentaje IP% por cada grupo de peso y
por cada tipo de dieta mediante la siguiente fórmula:
𝐼𝑃% = (Pf− Pi)×100
Donde Pf es el peso final del espécimen, Pi es el peso inicial del espécimen.
Adicionalmente se calcularon las tasas de crecimiento por día (TC) por cada
grupo de peso y por cada tipo de dieta de la siguiente manera:
𝑇𝐶 = Pf− Pi
𝑡 ×100
Donde Pf es el peso final del espécimen, Pi es el peso inicial del espécimen y t
tiempo experimental en días.
Por último, se ajustó el modelo de peso-longitud a todos los valores de peso y
talla de los 29 langostinos macho registrados durante el experimento para inferir si el
patrón de crecimiento de los organismos experimentales es isométrico o alométrico.
El modelo W=a*Lb fue ajustado a los datos de peso y longitud.
donde W es el peso en gramos, a es el valor de la ordenada al origen, b es la
pendiente de la curva y L la longitud total del organismo en milímetros.
Histología de langostinos macho
Diecisiete organismos recién recolectados del Oasis San Pedro de La Presa
(grupo control) y tres organismos de cada tratamiento experimental (n=18), obtenidos
al final del experimento fueron analizados histológicamente (preservados en solución
Davidson por 48 h y después transferidos a etanol 70% para posteriormente ser
31
embebidos en parafina). De cada langostino preservado se realizaron múltiples
cortes de 4 µm de grosor del tejido conteniendo testículos, conductos deferentes y
espermatóforo. Los tejidos fueron teñidos usando procedimientos histológicos
estándar, montados en portaobjetos y cubiertos con cubreobjetos (Anexo 1). Cada
corte histológico fue examinado con microscopio óptico y fotografiado con una
cámara digital (Cool SNAP-Pro, Photometrics, Tucson, AZ, USA).
Microscopía electrónica de barrido
Los espermatóforos de M. americanum fueron deshidratados de forma gradual
en etanol (70, 80, 96%) y secados hasta el punto crítico mediante CO2 (Polaron
E3000). Los espermatóforos fueron cortados para poder visualizar los
espermatozoides contenidos en el interior y colocados en placas metálicas con
superficie adherente. Los espermatóforos y espermatozoides fueron cubiertos con
oro (Polaron E5100) y observados usando un microscopio electrónico de barrido a
20kv (SEM Hitachi S-3000N) en el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste
en la cuidad de La Paz, BCS, México.
Análisis estadísticos
Se realizó un análisis de normalidad a los datos de todas las variables
medidas. La distribución de la frecuencia de los datos de las variables de peso del
espermatóforo, proporción de espermas normales y anormales, número de espermas
en los espermatóforos y tasa de crecimiento tuvieron una distribución normal. Con
estos datos se realizó un Análisis de Variancia (ANDEVA) de dos factores para
probar si existen diferencias significativas entre las medias debidas al efecto de cada
dieta experimental, de la longitud total de los organismos o de la interacción del
efecto combinado de ambos factores. La prueba de Friedman se realizó para la
proporción de espermatozoides vivos y muertos, única variable que no tuvo una
distribución normal. El nivel de significación para todas las comparaciones
estadísticas de las variables fue de p = 0.05 (Zar, 1998)
32
RESULTADOS Los 29 especímenes macho de M. americanum capturados para el presente
experimento tuvieron un rango de peso corporal de 15.5–130.0 g. Un alto porcentaje
de los machos (58.6%) pesaron entre 40 y 80 g. La moda fue de siete machos
(24.1%) con un peso entre 70 y 80 g. El primer grupo de tallas quedó compuesto por
ocho langostinos pequeños (rango 15-45 g). El segundo grupo estuvo compuesto de
17 langostinos medianos (rango 46-80 g) y el tercer grupo tuvo cuatro langostinos
grandes (rango 81-130 g) (Figura 7).
Figura 7. Distribución de frecuencia de pesos de 29 machos de Macrobrachium
americanum capturados en el Oasis de San Pedro de La Presa, B.C.S., México
utilizados para el experimento de biología reproductiva masculina.
Aspectos generales de reproducción
Producción de espermatóforos
El experimento se realizó entre octubre 2016 y julio 2017 (244 días)
alimentando y observando cada langostino diariamente. Sin embargo, la extracción
de los espermatóforos se realizó entre los 20 y 28 días, en promedio cada 24 días.
En total se obtuvieron 138 espermatóforos. El éxito de extracción de los
Peso (g)0 20 40 60 80 100 120 140
Frec
uenc
ia
0
1
2
3
4
5
6
7
33
espermatóforos varió de manera individual con un rango de periodo de producción de
espermatóforo de entre 20 y 115 días. La mayoría de los espermatóforos extraídos
se formaron entre 20 y 30 días (77.7%; 108 de 138 casos registrados) (Figura 8).
Figura 8. Distribución de frecuencia del periodo de formación del espermatóforo por
individuo de M. americanum durante el tiempo experimental de 244 días.
El porcentaje de espermatóforos producidos disminuyó a lo largo del
experimento evidenciando un proceso de agotamiento reproductivo. No se
detectaron diferencias significativas entre los promedios de las variables de
porcentaje de espermatóforos de los langostinos alimentados con las tres distintas
dietas experimentales (p<0.05) (Figura 9A). La supervivencia final de los
especímenes experimentales fue del 62% causada principalmente por canibalismo
entre individuos que escaparon de su jaula y desoxigenación accidental del tanque
de cultivo. La mayor mortalidad de los organismos sucedió en la primera mitad del
experimento, aproximadamente en el día 140 dejó de registrarse la mortalidad y el
número de especímenes en el experimento permaneció constante.
El peso promedio de los espermatóforos disminuyó durante la parte final del
experimento. Se observaron diferencias significativas entre el peso promedio durante
el experimento y el peso promedio del grupo control (naturaleza) en los días 20 y
162-244. El día 115 (apróximadamente cuatro meses) fue cuando se registró el peso
Tiempo (Día)0 20 40 60 80 100 120
Frec
uenc
ia
0
20
40
60
80
100
120
34
promedio más alto del espermatóforo durante el periodo del experimento 19 ± 11 mg.
A partir de ese momento comenzó el decrecimiento promedio del peso y los
promedios calculados fueron estadísticamente más pequeños con respecto al
promedio del grupo control (silvestres) (Figura 9B). El peso de los espermatóforos
extraídos durante todo el experimento varió de 3 a 47 mg (n=138 espermatóforos). El
peso promedio general observado durante el experimento fue de 10 mg, esto
representa la mitad del peso promedio observado en los langostinos silvestres (20
mg). Los langostinos silvestres tuvieron un rango de peso corporal de 31 a 314 g.
La moda registrada fue 5 mg con una frecuencia de 56 espermatóforos (46%
del total de espermatóforos). La moda y promedio experimental estuvieron
influenciadas por un decrecimiento de la producción de espermatóforos a lo largo del
experimento (Figura 9C). La proporción del peso del espermatóforo con respecto al
peso total del macho de M. americanum es sumamente pequeño. La proporción del
peso del espermatóforo varió de 0.0005% a 0.2%. La moda calculada fue de 0.025%
con una frecuencia de 87 (72%) (Figura 10).
35
Figura 9. A. Porcentaje de producción de espermatóforos y supervivencia de M.
A
B
C
Peso de espermatóforo (10-3 g)0 10 20 30 40 50
Frec
uenc
ia
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (Día)20 48 69 91 115 142 162 189 216 244
Peso
(10-3
g)
0
5
10
15
20
25
30
35
40Media experimentalMedia naturalDiferencia entremedias (p<0.05)Valor mínimoValor máximo
Tiempo (Día)0 50 100 150 200 250
Prop
orci
ón (%
)
20
30
40
50
60
70
80
90
100Producción de espermatóforosSupervivencia
36
americanum a lo largo del tiempo experimental. B. Valores mínimo, máximo y
promedio del peso de los espermatóforos obtenidos del medio natural (control) y a lo
largo del experimento de 244 días de cultivo. C. Distribución de frecuencia del peso
del espermatóforo de todos los especímenes experimentales.
Figura 10. Distribución de frecuencia de la proporción del peso del espermatóforo
con respecto al peso total del macho de M. americanum.
Composición bioquímica (proteínas, lípidos y carbohidratos) del espermatóforo.
Debido al limitado tamaño y biomasa de los espermatóforos de. M
americanum y al mínimo tamaño de muestra necesaria (5 mg, peso seco) para la
confiabilidad del resultado del método de determinación bioquímica se realizó
únicamente una determinación para cada fecha de muestreo (combinando todos los
espermatóforos disponibles de cada fecha ).
Los promedios de cada componente a lo largo de todo el experimento fueron:
36.3% de proteínas, 25.8% de carbohidratos y 4.6% de lípidos. No existieron
diferencias estadísticas significativas de estos porcentajes a través del tiempo. La
figura 11 muestra las tendencias de éstos tres componentes de la dieta a lo largo del
tiempo experimental. Las proteínas del espermatóforo tuvieron una variabilidad del
Porcentaje (%)0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Frec
uenc
ia
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
37
33.5–41.5% (rango=8%) durante el periodo experimental, sin patrón claro de
disminución o aumento durante el periodo experimental. Los carbohidratos variaron
del 18.7–31.3% (rango=4.3%) con una ligera tendencia de disminución a lo largo del
periodo experimental. Los lípidos variaron del 3.3–6.3% (rango=3%) del peso del
espermatóforo, también, sin una tendencia clara de aumento o disminución a lo largo
del experimento.
Figura 11. Variación de la composición bioquímica promedio del espermatóforo de
Macrobrachium americanum en términos de porcentaje de proteínas, lípidos y
carbohidratos totales estimados a lo largo del periodo experimental (combinando
todos los especímenes de cada tratamiento por fecha de extracción).
Efecto de método de extracción de espermatóforo
La extracción de espermas mediante electro estimulación mostró ser
sumamente efectivo a lo largo del experimento. Sin embargo, la electro estimulación
periódica con un promedio de 24 días tuvo un efecto negativo en los machos de M.
americanum. En algunos especímenes se encontró melanización del tejido, necrosis
parcial y perforación del caparazón en la región de la cámara branquial (en el lugar
Tiempo (Día)0 50 100 150 200 250
Porc
enta
je (%
)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45ProteínaCarbohidratosLípidos
38
de la descarga eléctrica) que probablemente tuvo influencia en el agotamiento
reproductivo observado durante 244 días de duración.
En ocho machos se observó una melanización en la base del quinto par de
pereiópodos y en sus espermatóforos. La melanización del espermatóforo
generalmente fue en una pequeña o moderada fracción de la parte más distal del
espermatóforo (Figura 12). Solamente en dos ocasiones se observó una
melanización de todo el espermatóforo asociada con el mayor número de
espermatozoides anormales (18%) y los mayores porcentajes de espermatozoides
muertos (>70%).
Figura 12. Melanización del espermatóforo. A. Espermatóforo normal. B.
Espermatóforo melanizado. C. Perforación (P) del caparazón en la región de la
cámara branquial de M. americanum.
39
Calidad espermática
El número total estimado de espermatozoides por espermatóforo varió de 3 a
66 millones por individuo (n = 94 conteos espermáticos). La media estimada para la
población experimental fue de 12.1 ± 13.5 millones de espermatozoides contenidos
por espermatóforo. Cada macho produce simultáneamente dos espermatóforos
(derecho e izquierdo). Por lo tanto, la cantidad total de espermas por cada macho es
aproximadamente el doble de la previamente mencionada. El 68% de los
espermatóforos contuvieron entre 3.6 y 10 millones de espermatozoides (Figura
13A). El mayor número promedio de espermatozoides por espermatóforo observado
durante el experimento fue registrado durante el día 115 con (25.5 millones de
espermatozoides casi cuatro meses después de iniciado el experimento). A partir de
esa fecha se observó un declive en la producción de espermatozoides del que ya no
se recuperó la población experimental. Durante los días 216 y 244 se observaron
números de espermatozoides significativamente menores (<1 millón de
espermatozoides por espermatóforo) que el grupo control (17.7 ± 18 millones)
(p<0.05) (Figura 13B).
A
B Número de espermatozoides (x106)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Frec
uenc
ia
0
5
10
15
20
25
30
40
Figura 13. A. Distribución de frecuencia del número de espermatozoides estimado
por cada espermatóforo de M. americanum durante el experimento. B. Comparación
del número de espermatozoides por espermatóforo de M. americanum registrados en
el experimento con respecto al observado en especímenes recién recolectados en la
naturaleza (grupo control).
El porcentaje promedio de espermatozoides con morfología anormal
contenidos en el espermatóforo fue <18% (n=126 conteos). El 80% de los
espermatóforos tuvieron entre 0 y 2% de espermatozoides anormales indicando que
ésta no es una condición frecuente en espermas de M. americanum ni una condición
particularmente relevante para disminuir el vigor reproductivo de los machos.
De los tipos de morfología anormal identificadas se encontraron casi en su
totalidad los espermatozoides con base inusual y sólo algunos casos de espina
doblada (no contabilizados). No se observó ningún caso de espermatozoides con
base o espina ausente ni espina corta.
Los espermatóforos melanizados fueron los que presentaron el máximo
porcentaje de espermas anormales (dos de ellos con 18%) (Figura 14A). Durante los
días 69 (2.8% ± 5.04%) y 115 (2.7 ± 5.20%) se registraron los valores de
espermatozoides anormales más altos. El valor promedio del porcentaje de
espermatozoides anormales en el grupo control de langostinos fue 1.5% ± 1.02%
(Figura 14B). El porcentaje promedio de espermatozoides con morfología anormal no
Tiempo (Día)20 48 69 91 115 142 162 189 216 244
Espe
rmat
ozoi
des
(106 )
0
10
20
30
40
50
60
70Media experimentalMedia naturalDiferencia entre medias (p<0.05)Valor mínimoValor máximo
41
presentó diferencias significativas entre el grupo control y el grupo experimental, ni
entre grupos de dietas (p>0,05).
A
B
Figura 14. A. Distribución de frecuencia del porcentaje de espermatozoides
anormales observados en el espermatóforo de M. americanum. B. Valores máximos,
mínimos y comparación del porcentaje promedio de espermatozoides anormales,
registrados durante el experimento, con el de langostinos recién colectados de su
medio natural (control), no hubo diferencias significativas entre promedios.
Esperma anormal (%)0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Frec
uenc
ia
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (Día)20 48 69 91 115 142 162 189 216 244
Porc
enta
je (%
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20Media experimentalMedia naturalValor mínimoValor máximo
42
El porcentaje de espermatozoides muertos observados por espermatóforo
varió del 5 al 95% (n=126 conteos). El 82% de los especímenes observados tuvieron
entre 10-50% espermatozoides muertos. El promedio de espermatozoides muertos
fue de 35% ± 21% (Figura 15A). Esto indica que, aunque la mayoría de los
espermatozoides tengan morfología normal (baja proporción de espermatozoides
anormales) al menos una tercera parte de los espermatozoides de M. americanum
no sobrevive.
Conforme transcurrió el tiempo del experimento se evidenció una tendencia al
incremento del porcentaje de espermatozoides muertos. El mayor porcentaje de
espermatozoides muertos (52.3% ± 23.2%) se registró durante el día 142. Este valor
fue significativamente mayor que el valor promedio del porcentaje de
espermatozoides muertos observado en especímenes recién colectados (control,
33.7% ± 12.1%) (Figura 15B).
A
B Esperma muerto (%)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100100
Frec
uenc
ia
0
5
10
15
20
25
30
43
Figura 15. A. Distribución de frecuencia del porcentaje de espermatozoides muertos
observados en el espermatóforo de M. americanum. B. Comparación del porcentaje
de espermatozoides muertos en los espermatóforos de los langostinos alimentados
durante el experimento con los de langostinos recién colectados del campo (control).
Efecto de las dietas
En la Tabla 2 se presentan los valores promedio del porcentaje de
carbohidratos, proteínas y lípidos de las tres dietas utilizadas durante el experimento.
La dieta conformada por pellet comercial Camaronina 30 Purina® fue la dieta con
mayor porcentaje de carbohidratos y lípidos, pero el valor más bajo de contenido de
proteínas. La dieta de alimento fresco tuvo el mayor porcentaje de proteínas, pero el
menor de lípidos de las tres dietas. La dieta conformada por la mezcla de ambos
insumos presentó, como era de esperar, los valores intermedios para proteínas,
lípidos y carbohidratos.
Tiempo (Día)20 48 69 91 115 142 162 189 216 244
Porc
enta
je (%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100Media experimentalMedia naturalDiferencia entre medias p<0.05Valor mínimoValor máximo
44
Tabla 1. Composición proximal de las dietas ofrecidas diariamente al langostino de
río M. americanum durante el periodo experimental.
Carbohidratos (%) Proteína (%) Lípidos (%)
Alimento fresco 0.35 ± 0.003 97.46 ± 0.019 2.19 ± 0.019
Mezcla 50:50 18.06 ± 0.245 61.25 ± 0.245 20.69 ± 0.134
Pellet comercial 26.34 ± 0.094 47.13 ± 0.309 26.54 ± 0.385
Síntesis del análisis de la calidad espermática
Los valores promedio y error estándar de las seis variables de calidad
espermática en langostinos alimentados con cada tipo de dieta experimental (Tabla
3) y por tamaño del macho (Tabla 4) no tuvieron diferencias estadísticas
significativas (ANOVA de dos vías, p >0.05).
Tabla 2. Valores promedio y error estándar de las variables de calidad espermática
del langostino de río M. americanum alimentado con tres diferentes dietas.
Peso del
espermatóforo
(mg)
Esperma
muerto (%)
Esperma
anormal (%)
Número de
espermas
(x106)
Producción de
espermatóforos
(%)
Control 17.5 ± 2.5b 26.3 ± 5.0 1.6 ± 0.6 17.7 ± 3.9 - Pellet 9.1 ± 1.6 a 36.8 ± 3.1 a 1.0 ± 0.4 a 16.5 ± 2.7 a 48 ± 6.45 Mezcla 7.9 ± 1.7 a 33.8 ± 3.3 a 1.4 ± 0.4 a 11.6 ± 2.7 a 49 ± 6.45 Fresco 12.2 ± 1.6 ab 34.3 ± 3.2 a 1.5 ± 0.4 a 9.6 ± 2.2 a 48 ± 6.45
Valores dentro de las columnas con superíndices iguales no son significativamente
diferentes (p >0.05).
45
Tabla 3. Valores promedio y error estándar de las variables de calidad espermática
de los tres intervalos de peso de langostino de río M. americanum utilizados en este
experimento, pequeños (15-45 g), medianos (46-80 g) y grandes (81-130 g).
Peso del
espermatóforo
(mg)
Esperma
muerto (%)
Esperma
anormal (%)
Número de
espermas
(x106)
Producción de
espermatóforos
(%)
Pequeños 7.8 ± 1.6 a 34.5± 3.3 a 1.9 ± 0.4 a 11.1 ± 2.4b 50.1 ± 7.6 Medianos 10 ± 1.1 a 36.5 ± 2.5 a 1.0 ± 0.3 a 10.5 ± 1.8b 51.2 ± 7.6 Grandes 13.5 ± 2.4 a 29.3 ± 5.4 a 1.2 ± 0.7 a 23.4 ± 3.9a 37.5 ± 7.6
Valores dentro de las columnas con superíndices iguales no son significativamente
diferentes (p >0.05).
Crecimiento
El incremento porcentual del peso y la tasa de crecimiento se calcularon para
los especímenes de cada dieta experimental (pelletizado, fresco o 50:50) y cada
intervalo de peso (chicos, medianos y grandes). No existieron diferencias
significativas en la tasa de crecimiento entre los tres tipos de dietas.
La dieta de mezcla del alimento fresco y pelletizado, y el grupo de langostinos
pequeños fueron las categorías con mayores porcentajes de incremento de peso, por
consecuencia mayores tasas de crecimiento. Los langostinos alimentados con pellet
camaronina 30 Purina® y los langostinos con tamaño grande tuvieron los menores
porcentajes de incremento de peso y tasas de crecimiento (Tablas 5 y 6).
Los datos de peso-longitud de machos de M. americanum se ajustaron al
modelo de regresión lineal tipo potencial con un índice de determinación de R2=0.83:
a = 0.012 y b = 3.1 (W=0.012*L3.1). El exponente cercano a tres indica que los
machos de M. americanum tienen un patrón de crecimiento somático ontogenético
isométrico en el rango de longitud total observado (9-18 cm). El Análisis de Variancia
de la regresión correspondiente (prueba para determinar si el modelo utilizado es
adecuado para los datos de estudio) resultó en una F =439 y un valor de p=0 (Figura
16). Este resultado demuestra que es adecuado usar este modelo de regresión lineal
potencial para el grupo de datos de peso y talla analizados de M. americanum.
46
Tabla 4. Valores promedio y error estándar del incremento de peso en porcentaje y
tasa de crecimiento y el valor final de supervivencia observados en langostinos de M.
americanum alimentados con cada tipo de dieta experimental.
Dieta Incremento
de peso (%)
Tasa de crecimiento
(% day-1)
Supervivencia
(%)
Pellet 21 ± 10 a 0.03 ± 0.03 a 78 Mezcla 61 ± 12 a 0.07 ± 0.03 a 50 Fresco 52 ± 12 a 0.07 ± 0.03 a 60
Valores dentro de las columnas con superíndices iguales no son significativamente
diferentes (p >0.05).
Tabla 5. Valores promedio y error estándar del incremento de peso en porcentaje y
tasa de crecimiento obtenidos por cada intervalo de peso de adultos (chicos 15-45 g,
medianos 46-80 g y grandes 81-130 g), también se muestra el valor final de
supervivencia de los machos de M. americanum utilizados en este experimento.
Intervalo de peso Incremento de
peso (%)
Tasa de crecimiento
(% day-1)
Supervivencia
(%)
Pequeños (15-45 g) 68 ± 12 a 0.07 ± 0.03 a 62 Medianos (46-80 g) 31 ± 9 a 0.06 ± 0.02 a 59 Grandes (81-130 g) 29 ± 19 a 0.02 ± 0.04 a 75
Valores dentro de las columnas con superíndices iguales no son significativamente
diferentes (p >0.05).
47
Figura 16. Ajuste del modelo potencial de peso-longitud (W=a*Lb) de langostinos
macho de M. americanum.
Histología del tracto reproductivo en machos
Los testículos de M. americanum están compuestos de dos lóbulos
testiculares, cada uno constituido a su vez de numerosos túbulos seminíferos (Figura
17A). El testículo y cada túbulo seminífero se encuentran rodeados de una delgada
capa de tejido conectivo. En la periferia de los túbulos seminíferos se localizan las
espermatogonias que son células ovaladas con núcleos principalmente compuestos
de eucromatina a partir de las cuales comienza la espermatogénesis (Figura 17B).
Las espermatogonias se dividen por mitosis para posteriormente diferenciarse en
espermatocitos primarios. Éstos a su vez se diferencian en espermatocitos
secundarios y se localizan en el centro del túbulo seminal en sus seis fases de
división celular (leptoteno, zigoteno, paquiteno, diploteno, diacinesis y metafase)
(Figura 17C).
Durante la espermiogénesis las espermátidas se transforman en
espermatozoides. Éstos derivan de los espermatocitos secundarios y se caracterizan
por tener un tamaño más pequeño que en las fases predecesoras, abundantes
Longitud total (mm)9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Peso
(g)
0
50
100
150
48
ribosomas, mitocondrias en el citoplasma y su núcleo contiene una proporción
variable de heterocromatina y eucromatina (Figura 17D).
Los espermatozoides en el testículo presentan una proyección conocida como
espina (spike en inglés) y una base semicircular, similar a un paraguas invertido, que
contiene el material genético que usualmente se tiñe de azul (Figura 17E). Los
espermatozoides recién formados se encuentran en la luz de los túbulos conectados
a la parte proximal del conducto deferente. Los espermatozoides del conducto
deferente están más desarrollados que los testiculares, su base en forma aplanada
asemeja una “tachuela” más que un paraguas; además, se encuentran rodeados de
una secreción producida por tejido epitelial que funciona como envoltura (Figura
17F). En algunas regiones del conducto deferente donde el tejido epitelial es
columnar la cantidad de secreción del epitelio es abundante (Figura 17H). El
conducto deferente se encuentra rodeado por una delgada capa muscular externa.
El ámpula terminal está rodeada de dos capas de músculo liso, una
transversal y otra longitudinal. Estas capas musculares y la capa de tejido epitelial
presente son más gruesas que las que usualmente se observan en la mayoría del
conducto deferente. En el ámpula termina se segregan las sustancias protectoras y
adherentes de los espermatóforos, éstas secreciones harán posible la sobrevivencia
de los espermatozoides y la adhesión al télico de la hembra (Figura 17I).
49
50
Figura 17. A. Fotografía de microscopio óptico de testículo de M. americanum teñido
con Hematoxilina y Eosina mostrando los túbulos seminíferos que lo componen. B. Túbulos seminíferos, algunos con espermatogonias (Sg) en la periferia. C. Túbulo
seminífero con espermatocitos (Sc) en diversas fases de división celular. D. Túbulos
seminíferos en la parte próxima al conducto deferente (Cd) con espermátidas (St) y
los primeros espermatozoides en testículo (Sz). E. Espermatozoides en testículo
(material genético teñido de azul) en forma semicircular. F. Sección del conducto
deferente con espermatozoides maduros (Sz) de base “aplanada” y rodeados de una
secreción protectora (SP), el epitelio (Ep) y la capa muscular externa (Mu). H. Conducto deferente con epitelio columnar (Ec). I. Ámpula terminal y sus dos capas
gruesas de músculo liso: una transversal (Mt) y otra longitudinal (Ml) en el centro
epitelio (Ep).
Morfología fina del espermatóforo y del espermatozoide
La estructura del espermatóforo y del espermatozoide se observó con mayor
detalle mediante el uso de microscopía electrónica de barrido (MEB). El
espermatóforo tiene claramente definidas la sección ventral y dorsal (Figura 18A). La
zona ventral que se fusiona con el otro espermatóforo parece tener una superficie
más lisa y con menor cantidad de secreción mucosa. En la zona dorsal la mucosidad
parece estar estructurada en “placas cuadradas” que rodean casi todo el
espermatóforo, semejante al cuerpo septado de una oruga (Figura 18B). La envoltura
está organizada en secciones rectangulares compuestas por fibras de
mucopolisacáridos que se orientan de manera transversal en la región dorsal del
espermatóforo. La Figura 18C muestra una sección del espermatóforo con la
envoltura degradada a tal grado que permite observar las fibras transversales que las
constituyen.
Dentro del espermatóforo, la masa espermática está protegida con una capa
de 30 a 100 µm de grosor (Figura 18D). Todo este material se mueve a través del
conducto deferente embebida en lo que parece una matriz que la cubre y protege. En
esta sección existe una concentración alta de espermatozoides aglomerados sin
orden específico (Figura 18E).
51
Los espermatozoides con forma de paraguas invertido son altamente flexibles
de la espina y de la base (Figura 18F). La base tiene entre 21 y 25 radios que corren
desde la periferia convergiendo hacia la base de la espina. La espina es una
proyección de aproximadamente 13-15 µm de longitud y el núcleo se encuentra
específicamente dentro de la región cóncava de la base de la espina.
52
Figura 18. A. Imagen de microscopía electrónica de barrido (MEB) que muestra la
sección ventral y sección dorsal del espermatóforo. B. Sección ventral del
espermatóforo mostrando placas cuadradas. C. Envoltura degradada del
espermatóforo que muestra las fibras transversales que la constituyen. D. Corte
transversal del espermatóforo que muestra el grosor de la envoltura (Ev) que protege
a la masa espermática (ME). E. Vista de masa espermática compuesta de
espermatozoides (Sz). F. Espermatozoide con morfología normal, base (Ba), espina
(Es) y radios (ra).
53
DISCUSIÓN
La presente investigación demostró que las seis variables de calidad
espermática evaluadas en M. americanum no tuvieron diferencias significativas en
función del tipo de dietas ni de los intervalos de peso. Los 29 organismos capturados
tuvieron un rango de peso relativamente amplio. Esta heterogeneidad entre los
organismos permitió investigar si existe alguna relación entre las variables de calidad
espermática en función de la variabilidad ontogenética de los adultos. Debido a que
se conoce que las tasas metabólicas y el desarrollo de la gónada masculina varía en
función de la longitud total (Harrison, 1990) se esperaban diferencias en la calidad
espermática en función del tamaño de los organismos. Sin embargo, los tres grupos
de tamaños (chicos 15-45 g, medianos 46-80 g y grandes 81-130 g) formados a partir
del análisis de conglomerados no mostraron diferencias significativas entre las
variables medidas de calidad reproductiva. Tampoco se evidenció una relación entre
el tamaño de los organismos con las variables medidas. A continuación se discuten,
de manera general, aspectos de la biología reproductiva masculina de M.
americanum. Este conocimiento fue obtenido a partir de los datos de 29
especímenes con peso corporal entre 15.5-130 g y longitud total entre 9.5-17.5 mm.
Biología reproductiva de M. americanum
Producción de espermatóforos
Debido a que 108 de los 138 espermatóforos obtenidos se formaron entre 20-
30 días (Figura 7) se infiere que este es el periodo que la mayoría de los machos
adultos de M. americanum tarda en formar un nuevo espermatóforo. En camarones
peneidos, la renovación del espermatóforo puede producirse cíclicamente
aproximadamente cada quince días (Alfaro-Montoya, 2010) , lo que nos hace pensar
que el tiempo de formación inferido en el presente experimento es razonable.
Es probable que M. americanum pueda producir espermatóforos en un periodo
menor a la frecuencia mínima de extracción de espermatóforos de 20 d. A partir de
un experimento piloto, electro estimulando a los langostinos cada 10, 15 y 20 días, se
concluyó que el periodo de 20 días resultó en mayor número de extracciones
consecutivas exitosas de espermatóforos, pero es posible encontrar organismos con
54
producción de espermatóforos de 10 días (Cortés-Jacinto, com. pers.). Dado que
observamos un efecto negativo de la electro-estimulación con un intervalo promedio
de 24 días, no es recomendable realizar electro estimulación en intervalos < 20 días.
Evidencia experimental obtenida en el langostino M. rosenbergii muestra la
extracción de espermatóforos en periodos considerablemente más cortos (Harris &
Sanducera, 1986) que los reportados para M. americanum en el presente trabajo.
Doce machos de M. rosenbergii fueron electro-estimulados con una pila de 4V
durante un mes (cada 24, 30, 36 y 48 h para cada una de las cuatro semanas del
mes) y se obtuvo un promedio de éxito en extracción del espermatóforo de 93.5%.
En el presente trabajo se utilizaron 9V de corriente para electro-estimular a M.
americanum. De acuerdo con Harris & Sanducera (1986) M. rosenbergii produce un
par de espermatóforos cada uno o dos días. Otra diferencia entre los experimentos
en ambas especies es que el peso promedio del espermatóforo de M. americanum
es aproximadamente cinco veces mayor (10 mg) que el de M. rosenbergii (2 mg), lo
que sugiere un mayor tiempo de producción de espermatóforo en M. americanum. Se
asume que el voltaje es directamente proporcional a la contracción muscular y que
provoca una mayor fuerza de expulsión y cantidad de espermatóforo. Una electro
estimulación de 9V posiblemente extrae más biomasa espermática en el ámpula
terminal del organismo que una estimulación con cuatro volts, por lo que la
extracción con 4 V causa extracción de porciones de espermatóforo más pequeñas y
expulsión de espermatóforos más frecuente. Si éste razonamiento es correcto, el
éxito de electro estimulación depende directamente de la intensidad de corriente
utilizada e indirectamente de la frecuencia con la que se aplica. Aún no existe
consenso sobre cuál es el voltaje y frecuencia adecuados en la electro estimulación a
reproductores de M. americanum. Viana da Costa et al. (2016) evaluaron el efecto de
4.5 V y 6 V sobre el éxito de producción de espermatóforos en M. acanthurus sin
encontrar diferencias significativas en la producción o supervivencia espermática
evaluada, concluyendo que debido a que observaron un menor porcentaje de
mortalidad, el uso de 6 V posiblemente sea la mejor decisión. Cabe señalar que
fueron utilizados organismos más pequeños (rango de peso de 2 a 29 g) que los
utilizados en el presente experimento (rango de peso de 15 a 130 g).
55
Aún se requiere realizar un experimento dirigido a probar con diferentes
intensidades de corriente y tiempos de extracción de espermatóforos de M.
americanum para inferir si, al igual que M. rosenbergii, puede expulsar
espermatóforos cada uno o dos días, o si se pueden usar menores voltajes como en
el caso de M. acanthurus. Este conocimiento sería más útil y aplicable si además se
conociera el peso promedio del espermatóforo que el macho expulsa en una cópula
de manera natural (sin electro estimulación).
Durante el presente experimento se efectuó electro estimulación en promedio
cada 24 días. Esto es tiempo suficiente para que se forme el espermatóforo y se
recupere el organismo. En general, es deseable que especímenes reproductores
bajo cultivo se reproduzcan naturalmente (sin extraer espermatóforos por ningún
método invasivo). Aunque la electro estimulación es un método efectivo, las heridas
que produce en el animal podrían derivar en infecciones bacterianas si existe mala
calidad del agua. Las heridas y melanización causadas por electro estimulación
disminuyen la calidad espermática de los especímenes (Fontaine & Lightner, 1973).
El proceso de agotamiento reproductivo fue evidenciado con la disminución en
la producción y peso del espermatóforo durante el transcurso del experimento
(Figura 8A). Esto puede atribuirse al efecto del estrés producido por el encierro, el
cambio de alimentación o ausencia de estímulo hormonal de las hembras. Aunque la
mortalidad de los organismos se detuvo aproximadamente a la mitad del
experimento, el porcentaje de producción continuó disminuyendo con los
especímenes sobrevivientes. Es importante considerar que en la naturaleza puede
haber algún efecto inductor por parte de la hembra sobre la producción de
espermatóforo del macho. En ausencia de hembras podría afectarse la producción
de espermatóforo (hipótesis a ensayar).
Los alimentos utilizados en el presente experimento son distintos de los que
M. americanum consume en su hábitat natural, sin embargo, éstos alimentos son
utilizados frecuentemente en la acuicultura de camarón y de M. rosenbergii (de
ambos sexos). Conocer el tipo de alimento que ingieren los especímenes silvestres
durante el periodo reproductivo puede ser útil para aumentar el rendimiento y la
56
formulación de dietas acorde a los requerimientos nutricionales de los reproductores
machos de M. americanum.
El peso promedio del espermatóforo tendió a incrementar durante la primera
parte del experimento alcanzando su máximo durante el día 115. Después de esa
fecha el peso promedio del espermatóforo disminuyó progresivamente, siendo
estadísticamente más pequeño a partir del día 162 en comparación con los
observados en especímenes silvestres. Esto implica que el uso de reproductores
machos de M. americanum en cultivo no debiera exceder a más de 162 días
(aproximadamente cinco meses) como máximo (Figura 8B).
Aunque el peso del espermatóforo tuvo una moda de 5 mg (Figura 8C) y un
promedio de 9 mg consideramos, por los inusuales bajos valores observados al final
del experimento, que estas estimaciones subestiman el peso del espermatóforo (los
últimos cuatro muestreos, 40% del tiempo experimental). A pesar del bajo número de
muestras de especímenes silvestres, la media obtenida en la naturaleza (20 mg)
parece ser una aproximación más precisa del tamaño usual del espermatóforo de M.
americanum. El promedio de peso de espermatóforo está dentro del rango
observado en la langosta americana Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837
(3-32 mg), el camarón P. paulensis (Pérez Farfante, 1967) (22-27 mg para machos
de 20 g) (Braga et al., 2010); M. rosenbergii (1-3 mg) (Harris & Sanducera, 1986) y 9
mg (Claudet et al., 2016). El peso reportado por Claudet et al. (2016) es similar a lo
estimado para M. americanum en el presente estudio. Para el caso de M. acanthurus
se reportó un rango de peso del espermatóforo de 0.1–2 mg para organismos con
peso promedio de 10 ± 5 g (Viana da Costa et al., 2016).
La proporción del peso del espermatóforo con respecto al peso corporal en M.
americanum es despreciable (promedio= 0.02%, Figura 9). La inversión energética
del macho es considerablemente menor a la invertida por las hembras en la
producción de gametos. Las hembras de crustáceos como el krill pueden derivar de
10 al 40% de su peso corporal en producción de huevos (Gómez-Gutiérrez et al.,
2007). Las hembras de M rosenbergii pueden disminuir su tasa de crecimiento o
incluso dejar de crecer cuando inicia la gametogénesis, derivando energía a la
reproducción cuando alcanzan la fase adulta (Ra’Anan, 1987). Aunque la media y la
57
moda del peso del espermatóforo fue influenciada por el agotamiento reproductivo, si
tomáramos en cuenta sólo el valor máximo obtenido (0.2%), la proporción de
biomasa aún seguiría siendo virtualmente despreciable. Aunque la inversión
energética y la biomasa del macho sea considerablemente menor al de la hembra,
no es acertado asumir que el macho no tiene influencia en la calidad de los
embriones fecundados y en la producción de huevos viables en las puestas de las
hembras. La calidad espermática (porcentaje de vivos:muertos, normales:anormales)
puede tener considerable influencia en el éxito reproductivo de los machos, incluso
mayor influencia que la concentración de espermatozoides en el espermatóforo por
sí misma.
Composición bioquímica (proteínas, lípidos y carbohidratos) del espermatóforo.
No se evidenciaron tendencias claras en la variación de las proteínas o los
lípidos durante el experimento, pero sí una pequeña tendencia al decremento de los
carbohidratos. De acuerdo con lo indicado por Racotta (2003): “una manera indirecta
de inferir los requerimientos nutricionales de los crustáceos reproductores es
mediante el análisis de la composición bioquímica de órganos implicados en la
transferencia y acumulación de nutrientes asociados al proceso reproductivo”,
suponemos que la proporción en la dieta ideal de los reproductores machos de M.
americanum sería similar al promedio general determinado en este experimento
(36.3% de proteína, 4.6% de lípidos y 25.8% de carbohidratos), teniendo en cuenta
que el nivel de carbohidratos óptimo podría ser un valor unas cuantas unidades
porcentuales más arriba que el de este experimento. De las dietas suministradas, el
pellet comercial tuvo la proporción de proteínas, lípidos y carbohidratos más parecida
a la determinada para el espermatóforo de M. americanum en el presente
experimento.
Calidad espermática
La calidad espermática de M. americanum no varió en función del peso de los
machos, ni fue significativamente influenciada por las tres dietas utilizadas. De
manera general, los valores de calidad espermática registrados en especímenes
58
recién colectados de la naturaleza fueron mejores que los de especímenes cultivados
durante el experimento.
El número promedio de espermatozoides de especímenes silvestres (control)
fue de 17 ×106 espermatozoides (Figura 12). La calidad espermática, y no la cantidad
de espermatozoides, parece ser la característica más influyente en el éxito
reproductivo de M. americanum. Las hembras de ésta especie puede producir hasta
900,000 óvulos por hembra (Cabrera et al., 1979). Aún si tomamos como referencia
el valor más pequeño de número de espermas por espermatóforo registrados en el
presente experimento, sería al menos el triple de la cantidad de producción de
oocitos reportada en hembras.
Otras especies de crustáceos también producen elevadas cantidades de
espermatozoides. Por ejemplo, machos de 22.4 g del camarón rosa P. paulensis
producen en promedio 3-6×106 espermatozoides por espermatóforo (Braga et al.,
2010). Machos de 21 g de camarón P. schmitti (Burkenroad, 1936) producen en
promedio 10-16×106 espermatozoides por espermatóforo (Pérez-Jar 2005). Sin
embargo, M rosenbergii tiene reportes de 6×106 espermatozoides por espermatóforo
en machos con peso promedio de 16 g (Revathi et al., 2012), 5.2-5.8×108
espermatozoides por espermatóforo para machos de 24±10 g (Harris & Sanducera,
1986) y 6±4×109 espermatozoides por espermatóforo para machos con peso
promedio de 45±4 g (Claudet et al., 2016).
Es evidente que M. rosenbergii tiene notable variabilidad en producción de
espermatozoides (hasta tres órdenes de magnitud) cuando se compara la producción
de espermatozoides en función de la longitud total de los machos. Es decir, M.
rosenbergii tiene una relación directa de tamaño corporal del macho y el número de
espermatozoides contenidos en el espermatóforo. Ésta tendencia no fue observada
en machos de M. americanum de 9-18 cm de longitud total.
La proporción de espermatozoides con morfología anormal observada durante
el presente estudio fue relativamente baja. Esta variable se incrementó hacia el final
del periodo experimental pero no mostró diferencias significativas con respecto al
promedio observado en especímenes silvestres (control) (Figura 13B). La proporción
de espermatozoides con morfología anormal parece ser más alta en otras especies
59
de crustáceos. M. malcolmsonii (H. Milne Edwards, 1844) aumentó la proporción de
espermatozoides anormales de 20% a 80% en 70 días de cultivo (Kannupandi &
Soundarapandian, 1999). El camarón P. schmitti tuvo proporciones de 10-16%
espermatozoides anormales durante un experimento de 60 días (Pérez-Jar, 2005). El
camarón blanco Penaeus vannamei (Boone, 1931) tiene valores de 20-35% de
espermatozoides anormales durante tres regeneraciones consecutivas del
espermatóforo (Ceballos-Vázquez, 2003).
Los resultados indican que M. americanum es una especie con bajo
porcentaje de espermatozoides con morfología anormal en comparación con otras
especies de crustáceos. Los tipos de malformaciones observadas en M. americanum
fueron: base con forma inusual y espina doblada. La evidencia obtenida hasta ahora
indica que las malformaciones de los espermatozoides no son una causa relevante
para explicar el agotamiento reproductivo de los machos, por lo que no se esperaría
una alta proporción de espermatozoides con morfología anormal en condiciones
naturales o en cultivo, además la dieta no parece influenciar de manera significativa
este porcentaje.
El porcentaje de espermatozoides muertos por espermatóforo de M.
americanum está dentro del rango reportado en otras especies crustáceos (Figura
14). P. vannamei tendió a disminuir su porcentaje inicial de 48% de espermatozoides
muertos a 20% en la tercera regeneración del espermatóforo (Ceballos-Vázquez,
2003). Pérez-Jar (2005) reportó porcentajes del 3.7-4.3% de espermatozoides
muertos en machos de P. schmitti durante 60 días de cultivo. M. malcolmsonii
aumentó aproximadamente del 10% al 100% en cuatro semanas de cultivo
(Kannupandi & Soundarapandian, 1999). Los camarones P. setiferus (Linnaeus,
1767), P. vannamei, y P. stylirostris Stimpson, 1871, al igual que M. americanum,
tienen porcentajes de espermatozoides muertos relativamente bajos (4-8%). De esta
forma, aunque M. americanum tiene un porcentaje de espermas anormales
relativamente bajo al compararla con otras especies, el porcentaje de
espermatozoides muertos parece estar limitando el éxito reproductivo de los machos
y explicar en parte el agotamiento reproductivo.
60
Histología del tracto reproductivo en machos y morfología de alta resolución del
espermatóforo y espermatozoides
Los resultados de este trabajo no presentan diferencias morfológicas a nivel
de grandes rasgos del sistema reproductor de M. americanum de acuerdo a
revisiones previas de otras especies de crustáceos (López-Greco, 2012). Sucede lo
mismo para la fase temprana de la espermatogénesis. Es en la espermiogénesis que
se presentan algunas diferencias cuando se desarrolla el espermatozoide. Los
espermatozoides de M. americanum son semejantes a la morfología previamente
reportada para otras especies de palemónidos (Poljaroen et al., 2010),
particularmente parecidos a los de M. rosenbergii debido a la cercanía filogenética. El
espermatozoide normal de M. rosenbergii tiene entre 15 a 20 radios en la base. La
espina mide de 10 a 15 µm de largo con un diámetro de la base de 10 µm. Los
espermatozoides de M. americanum tienen entre 21-25 radios en la base (22.9 ± 1.5,
n=30). La espina mide de 13-15 µm de largo (14 ± 0.8, n=30) con un diámetro de la
base promedio de 9.1 ± 0.8 µm, n=30. De esta forma, el espermatozoide de M.
americanum a diferencia de M. rosenbergii parece tener, en promedio, un diámetro
menor en la base (1 µm), más radios (6 aproximadamente) y la espina un poco más
grande (1.5 µm).
Es claro que mientras los espermatozoides maduros recorren el conducto
deferente, el epitelio suministra nutrientes y material de adherencia a los
espermatozoides para mantenerlos con vida hasta su salida. La capa muscular que
rodea al conducto deferente probablemente es la responsable de hacer avanzar la
masa espermática y su matriz hasta la zona del ámpula terminal mediante
movimientos peristálticos. Al llegar a la zona del ámpula terminal el espermatóforo se
acumula hasta el momento de su transferencia al exterior de la hembra, en el
momento de la ovulación de la misma, como sucede en otras especies de crustáceos
(López-Greco, 2012). La gruesa doble capa muscular es la encargada de expulsar al
espermatóforo formado hacia el exterior mediante una fuerte contracción.
61
Efecto de dietas
Calidad espermática
Las dietas proporcionadas a M. americanum en este experimento tuvieron
proporciones considerablemente distintas de carbohidratos, proteínas y lípidos (Tabla
2). A pesar de las diferencias en la composición bioquímica de las tres dietas no se
presentaron diferencias significativas en la calidad espermática de los langostinos
alimentados con cada dieta. El supuesto inicial era que el alimento fresco constituido
en su mayoría de proteína (97%) y con una cantidad de lípidos y carbohidratos
considerablemente baja, podría afectar negativamente la producción de
espermatozoides o la formación del espermatóforo debido a la relevante función de
los carbohidratos como precursores de intermediarios metabólicos, componentes
lipoproteícos que facilitan el transporte de nutrientes del hepatopáncreas a la gónada
a través de la hemolinfa y la síntesis de los ácidos nucleicos (Harrison, 1990).
Aunque las tres dietas fueron distintas en composición bromatológica, y los
carbohidratos, proteínas y lípidos tienen diferente función en la síntesis de los
gametos y del espermatóforo, en el presente experimento no existió evidencia que
indique diferencias estadísticamente significativas de las dietas en la calidad
espermática (Tabla 3). Debido a que el alimento pelletizado camaronina 30 Purina®
es de menor costo y es fácil de proporcionar a los langostinos se recomienda
alimentar a los reproductores macho únicamente con alimento pelletizado.
Tampoco se encontró evidencia de que el tamaño de los organismos cause
diferencias significativas en la calidad espermática (Tabla 4). Los langostinos más
grandes tuvieron, en general, mayores valores promedio de tres de las cinco
variables de calidad espermática utilizadas (peso del espermatóforo, número de
espermatozoides y porcentaje de espermas muertos). Sin embargo, los valores de
error estándar estimados para las medias de los especímenes grandes también
fueron los mayores (n=4). En general, no se encontró una relación significativa entre
la longitud total del langostino y las variables de calidad espermática, como también
fue observado en M. acanthurus (Viana da Costa et al., 2016).
Aunque los resultados de la presente investigación no demostraron una
relación entre el tamaño del langostino y la calidad espermática, tampoco es
62
evidencia inequívoca de que esta relación no existe. Es evidente que se debe
investigar la talla de primera madurez de machos de M. americanum, es decir, en
especímenes más pequeños de 8 cm LT. La expectativa es que los especímenes
más jóvenes y más viejos (los más pequeños y grandes) tuvieran los valores de
calidad espermática más bajos, y que hubiera un intervalo de peso o longitud total
intermedio donde la calidad espermática de los langostinos alcance su máximo
potencial durante su desarrollo ontogenético.
Crecimiento
Aunque el objetivo del presente trabajo no fue estrictamente evaluar el
crecimiento corporal y no se detectaron diferencias significativas en crecimiento en
relación a las dietas suministradas. El alimento combinado fue el que tuvo el valor
más alto del porcentaje de incremento en peso (10% más que el alimento fresco).
Con esta dieta también se observó la mayor tasa de crecimiento, por lo que
podríamos suponer que esta dieta podría cubrir de manera efectiva las necesidades
de los machos de M americanum para la síntesis de gametos y espermatóforos.
Tampoco se detectó una diferencia significativa de crecimiento en función del peso.
Se esperaba que los langostinos de menor tamaño tuvieran las mayores tasas
metabólicas y altos valores del porcentaje de incremento de peso en comparación
con los langostinos más grandes. El exponente del modelo de regresión potencial
ajustado tuvo un valor cercano a 3 (W=0.012*L3.1), esto indica que los langostinos
crecieron de manera isométrica durante el periodo experimental. Este patrón es
característico de organismos adultos jóvenes. Los valores > 3 son característicos en
adultos viejos que han dejado de crecer en longitud pero tienden a ser más robustos.
El registro de M. americanum más pesado hasta ahora fue de 500 g (Arana-Magallón
& Ortega-Salas, 2004). El espécimen más grande colectado en el presente estudio
fue de 130 g. Es decir que el rango de 9-18 cm de longitud total podría no ser
representativo de la variabilidad ontogenética de esta especie en su fase adulta. Es
posible que al trabajar con especímenes de un más amplio espectro de tallas se
pueda observar una relación entre el tamaño y la calidad espermática en un
experimento diseñado específicamente para ello.
63
CONCLUSIONES 1) Los valores de calidad espermática fueron significativamente mayores en
especímenes silvestres que en especímenes cultivados alimentados con las dietas
experimentales.
2) Se evidenció agotamiento reproductivo mediante el declive de la producción de
espermatóforos, el peso del espermatóforo, el número de espermatozoides por
espermatóforo y el aumento del porcentaje de espermatozoides muertos y anormales
de los espermatóforos extraídos consecutivamente durante el experimento.
3) La composición bioquímica general del espermatóforo fue de 36.3% de proteínas,
4.6% de lípidos y 25.8% de carbohidratos y el pellet comercial tiene la proporción
más parecida.
4) El análisis histológico no reveló ninguna diferencia atribuible a las dietas o los
tamaños de los individuos, sin embargo, se describió por primera vez el tamaño y la
morfología fina típica del espermatozoide de M. americanum.
5) El tiempo recomendable de mantenimiento de los reproductores machos de M.
americanum bajo cautiverio sería de un máximo de cuatro meses (120 días) debido a
que después de ese periodo los langostinos mostraron evidencia de agotamiento
reproductivo mediante la disminución en la calidad espermática y de la producción
del espermatóforo.
6) No se detectaron diferencias significativas de los indicadores de calidad
espermática en función de las tres dietas provistas y por lo tanto se recomendaría
alimentar a los reproductores macho con alimento pelletizado pues es de menor
costo y más fácil de proporcionar a los langostinos que el alimento fresco.
64
7) Se evidencio un daño físico por la electro estimulación, se deben probar distintos
voltajes e intervalos de extracción de espermas que permita llegar a una eficiente
obtención de espermas con el mínimo daño posible a los machos reproductores.
65
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70
ANEXOS A.TECNICA DE INCLUSIÓN EN
PARAFINA
Fijación de tejidos:
-Los tejidos se fijan en solución Davidson
durante 48 h. Se cambian a alcohol etílico
al 70% transcurridas 48 h.
Deshidratación:
-Alcohol etílico 70% I y II durante una
hora en c/u
-Alcohol etílico 80°( 1 hora )
-Alcohol etílico 90° (1 hora)
-Alcohol etílico 96° I y II (una h c/u)
-Alcohol etílico 100 I, II, III (1 h en c/u)
-Mezcla de alcohol etílico absoluto-xilol (
1:1) 20 minutos.
-Xilol absoluto (100 %) 5-10 minutos.
Tiempo total de deshidratación: Tejidos
9.5 h.
Infiltración en parafina
-Parafina-xilol (1:1) 30 minutos
-Parafina (Paraplast) I (1 a 2 h)
-Parafina (Paraplast) II (1 a 2 h)
-Pafafina (Paraplast) III ( 1 a 2 h)
-Parafina (Paraplast) IV (1 a 2 h)
Tiempo total de infiltración en parafina: 8.5
h.
B. CORTE EN MICROTOMO DE
ROTACION A 4 MICRAS
C. TECNICA DE TINCION
HEMATOXILINA EOSINA (de Harris).
1.-Xilol I, II y III-(10 min en cada uno).
2.-Alcohol etílico 96% (2 min).
3.- Alcohol etílico 70% I y 70% II- 2 min c/u
4.-Agua destilada 5 min.
5.-Hematoxilina de Harris 4 min
(hematoxilina natural, le damos 4 min)
6.-Agua corriente 5 min y agua destilada 5
min
7.-Alcohol ácido 10-15 segundos (1 lt
alcohol 96% con 5 gotas de ácido
clorhídrico)
8.- Agua destilada 5 min
9.- Agua amoniacal (hidróxido de amonio,
5 gotas por caja de tinción)10-15
segundos
10.-Agua destilada 5 min
11.-Alcohol etílico 50% 2 min
12.- Alcohol etílico al 70% 2 min
13.- Eosina 3 min
14.- Alcohol 96% I y II, 1-2 min c/u
15.- Alcohol 100% I y II, 1 min c/u
16.- Citrisolv l I, II, III 5 min c/u.
17.- Montar en resina sintética o Entellan.
Los núcleos quedan teñidos de color azul
a morado y los citoplasmas de naranja,
rojo o rosa.