BIOLOGIA MOLECULARBIOLOGIA MOLECULAR2007/20082007/2008

Gabriela RodriguesGabriela RodriguesDBA DBA -- FCULFCULmgrodrigues@fc.ul.ptmgrodrigues@fc.ul.pt

Técnicas de Análise da Expressão Técnicas de Análise da Expressão GénicaGénica

Aplicações em Biologia Animal Aplicações em Biologia Animal biologia celularbiologia celularbiologia do desenvolvimentobiologia do desenvolvimento……

ExpressãoExpressão génicagénica diferencialdiferencial

TranscriçãoTranscrição génicagénica diferencialdiferencial

ProcessamentoProcessamento selectivoselectivo de RNA nuclearde RNA nuclear

TraduçãoTradução selectivaselectiva de mRNAde mRNA

Processamento/modificaçãoProcessamento/modificação diferencialdiferencial de de proteínasproteínas

Reguladores Reguladores ciscis(promotores, (promotores, enhancersenhancers//silencerssilencers))

Reguladores Reguladores transtrans (factores (factores de transcrição)de transcrição)

TransporteTransporte diferencialdiferencial de mRNAde mRNASplicingSplicing alternativoalternativo

Degradação/estabilizaçãoDegradação/estabilização de mRNAde mRNA

TransporteTransporte diferencialdiferencial de mRNAde mRNA

Activação/Activação/inactivaçãoinactivação Formação de Formação de dímerosdímeros ou ou unidades funcionaisunidades funcionais

Expressão Expressão GénicaGénica: : Como estudáComo estudá--la?la?

DetecçãoDetecção de mRNA:de mRNA:-- Northern blottingNorthern blotting-- Reverse transcriptionReverse transcription--PCRPCR(Real Time(Real Time--PCR)PCR)-- ““MicroarraysMicroarrays””-- HibridaçãoHibridação in situ (mRNA)in situ (mRNA)

DetecçãoDetecção de de proteínasproteínas::-- Western blottingWestern blotting-- ImunoImuno--histoquímicahistoquímica

Northern blottingNorthern blotting

RTRT--PCR (PCR (transcriçãotranscrição reversareversa))

Western blot

Western blottingWestern blotting

Protein

Protein

Protein

antibody

Protein

Protein

enzymatic reaction

ImunoImuno--histoquímicahistoquímica-- FixarFixar-- PermeabilizarPermeabilizar-- ColocarColocar anticorpoanticorpo contra a contra a proteínaproteína ememestudoestudo ((anticorpoanticorpo primárioprimário))-- LavarLavar-- ColocarColocar anticorpoanticorpo contra o contra o anticorpoanticorpoprimárioprimário ((anticorpoanticorpo secundáriosecundário), e ), e esteeste é é marcadomarcado com com verdeverde ouou vermelhovermelho

FotoFoto: Marta Luz: Marta Luz

Myf5Myf5LamininaLaminina

Foto: Fernanda Foto: Fernanda BajancaBajanca

Técnica de Técnica de imunoimuno--histoquímicahistoquímica indirectaindirecta

Células Vero Células Vero –– HistonaHistona H3 H3 fosforiladafosforiladamarcador de mitosesmarcador de mitoses

Mais exemplos…Mais exemplos…

Embrião de Embrião de DrosophilaDrosophila melanogastermelanogasterImunoImuno--histoquímicahistoquímica -- genes genes gapgap

hunchbackhunchback krüppelkrüppel

(1mm)

100µm

Embrião de galinha inteiro

Fusão de imagens de diferentes componentes

Mic. confocal (imunofluorescência in toto)D

ICN

-cad

Fibr

onec

tin

Fatias ópticas

Imun

o-flo

ures

cênc

ia

CabeçaCauda

Material e imagens: Gabriel MartinsMaterial e imagens: Gabriel Martins

Tratamento de imagem: Tratamento de imagem: confocalconfocal, sobreposição de sinais, sobreposição de sinais

Material e imagens: Gabriel MartinsMaterial e imagens: Gabriel Martins

Tratamento de imagem: reconstrução 3D, cortes ópticosTratamento de imagem: reconstrução 3D, cortes ópticos

HibridaçãoHibridação in situin situPax3Pax3FotoFoto: Lara : Lara CarvalhoCarvalho

HIBRIDAÇÃO IN SITUHIBRIDAÇÃO IN SITU

Várias modalidades:Várias modalidades:WISH WISH –– wholewhole mountmount inin situsitu hybridisationhybridisationFISH FISH –– fluorescentfluorescent inin situsitu hybridisationhybridisationEm cortesEm cortes……

EstudarEstudar o o padrãopadrão de de expressãoexpressão de um genede um gene

Ser Ser expressoexpresso significasignifica estarestar activoactivo num num determinadodeterminado tecidotecido

Active Inactive

As As célulascélulas de um de um mesmomesmo indivíduoindivíduo possuempossuem osos mesmosmesmos genesgenesmasmas o o conjuntoconjunto de genesde genes activosactivos emem cadacada tipotipo celularcelular é é diferentediferente

HibridaçãoHibridação==

EmparelhamentoEmparelhamento entreentre 2 2 cadeiascadeias complementarescomplementaresde de ácidoácido nucleiconucleico

HíbridosHíbridos::

-- DNA/ DNADNA/ DNA-- RNA/RNARNA/RNA-- DNA/RNADNA/RNA

*Os *Os híbridoshíbridos RNA/ RNA RNA/ RNA sãosão osos maismais estáveisestáveis , , têmtêm umauma temperaturatemperatura de de desnaturaçãodesnaturação superior superior aosaos outrosoutros híbridoshíbridos

HibridaçãoHibridação in situin situ

RNA probe completentary to

A A técnicatécnica de de hibridaçãohibridação in situin situ baseiabaseia--se no se no emparelhamentoemparelhamento de de duasduas sequênciassequências de de ácidosácidosnucleicosnucleicos complementarescomplementares entreentre sísí, no , no casocaso dada nossanossa experiênciaexperiência o mRNA e o mRNA e umauma sondasonda RNA RNA marcadamarcada com com DigoxigeninaDigoxigenina, , permitindopermitindo a a visualizaçãovisualização de de umauma sequênciasequência nucleotídicanucleotídica específicaespecífica ememcélulascélulas e e tecidostecidos

HibridaçãoHibridação in situ in situ emem embriõesembriões inteirosinteiros -- WISHWISH

PermitePermite a a visualizaçãovisualização espacialespacial (3 (3 dimensõesdimensões) do mRNA ) do mRNA estudadoestudado semsem necessidadenecessidade de de seccionarseccionar osos embriõesembriõesparapara posteriormenteposteriormente reconstruirreconstruir tridimensionalmentetridimensionalmente a a marcaçãomarcação

EstádiosEstádios de de desenvolvimentodesenvolvimento maismais avançadosavançados: : problemasproblemas de de penetraçãopenetração dada sondasonda ((muitasmuitas camadascamadas de de célulascélulas!) !) sendosendo necessárionecessário hibridarhibridar secçõessecções de de embriõesembriões ouou partespartes de de embriõesembriões ((troncotronco, , membrosmembros))

A A hibridaçãohibridação emem embriõesembriões inteirosinteiros usausa--seseparapara termostermos umauma panorâmicapanorâmica geralgeral rápidarápida

dos dos estádiosestádios do do desenvolvimentodesenvolvimentoe das e das estruturasestruturas ondeonde o gene é o gene é expressoexpresso;;

A A hibridaçãohibridação emem seccõesseccões utilizautiliza--se se parapara terter umauma ideiaideia detalhadadetalhada

dos dos tipostipos de de célulascélulas ondeonde o gene se o gene se expressaexpressa

R

A HIS passo a passo…IA HIS passo a passo…I

1. 1. ColheitaColheita do material do material biológicobiológico:: CuidadoCuidado com as com as RNAsesRNAses!!QueremosQueremos detectardetectar o mRNA o mRNA EsteEste é é bastantebastante instávelinstável ((sujeitosujeito àà acçãoacção ribonucleasesribonucleases= = RNAsesRNAses))

A A manipulaçãomanipulação dos dos embriõesembriões atéaté àà etapaetapa de de hibridaçãohibridação devedeve ser ser realizadarealizadaemem condiçõescondições RNAseRNAse free: material free: material estérilestéril, , evitarevitar o o contactocontacto dasdas mãosmãos com com as as soluçõessoluções ouou com com osos embriõesembriões ((existemexistem RnasesRnases nana nossanossa pelepele))

2. 2. FixaçãoFixação e e lavagemlavagemFixadorFixador WISH WISH o.no.n. 4ºC . 4ºC –– crosscross--linking linking entreentre proteínasproteínas e mRNAe mRNALavarLavar emem PBS com PBS com detergentedetergente (Triton) (Triton) –– PBT PBT –– permeabilizapermeabiliza osos embriõesembriões

2’. 2’. DesidrataçãoDesidratação ((facultativofacultativo))MetanolMetanol, , sósó se se fazfaz parapara guardarguardar material material porpor períodoperíodo longolongo antes de antes de seguirseguir

3. 3. PermeabilizaçãoPermeabilização e e fixaçãofixação(se o material (se o material foifoi desidratadodesidratado, tem , tem queque se rese re--hidratarhidratar))ProteinaseProteinase K K –– enzimaenzima proteolíticoproteolítico: : permeabilizapermeabiliza osos tecidostecidos do do embriãoembrião --

tempo de tempo de incubaçãoincubação dependedepende do do tamanhotamanho do do tecidotecidoLavarLavar emem PBTPBTPósPós--fixaçãofixação emem fixadorfixador forte forte –– voltavolta a a dardar consistênciaconsistência aoao embriãoembrião fragilizadofragilizado

4. 4. PreparaçãoPreparação parapara a a hibridaçãohibridaçãoPassarPassar porpor PBT:HibmixPBT:Hibmix ((quentequente) ) IncubarIncubar emem HibmixHibmix (70ºC)(70ºC)

5. 5. HibridaçãoHibridação in situin situColocarColocar HibmixHibmix com a com a sondasonda o.no.n. 70ºC . 70ºC –– todostodos osos Us Us têmtêm digoxigeninadigoxigenina (DIG)(DIG)

temperaturatemperatura dependedepende dasdas característicascaracterísticas dada sondasonda ((tamanhotamanho, , especificidadeespecificidade, , composiçãocomposição de de nucleótidosnucleótidos))

A HIS passo a passo…IIA HIS passo a passo…II

SÍNTESE DA SONDASÍNTESE DA SONDA••cDNAcDNA ((parteparte codificantecodificante do gene) é do gene) é inseridoinserido num vector num vector ••PodePode ficarficar inseridoinserido num num sentidosentido ouou noutronoutro

LinearizacãoLinearizacão do vectordo vector5’ 3’ 3’ 5’

SentidoSentido dada sintesesintese dada sondasonda RNARNA SentidoSentido dada sintesesintese dada sondasonda RNARNA

5’ 5’3’ 3’

= = PromotoresPromotores de de umauma RNA RNA polimerasepolimerase (dos (dos fagosfagos T7, T3, SP6)T7, T3, SP6)

SequênciaSequência do 5’3’ do 5’3’ cDNAcDNA = = sequênciasequência do 5’3’ mRNAdo 5’3’ mRNAA A nossanossa sondasonda é é complementarcomplementar ((antissenseantissense) ) aoao cDNAcDNA 5’3’ 5’3’ -- elaela é é automáticamenteautomáticamentecomplementarcomplementar aoao mRNAmRNA

6. 6. LavagemLavagem póspós--hibridaçãohibridaçãoRecuperarRecuperar HibmixHibmix com com sondasonda!!LavarLavar embriõesembriões com com Hibmix:MABTHibmix:MABT ((tampãotampão ondeonde se se vaivai fazerfazer a a reacçãoreacção imunoimuno--

histoquímicahistoquímica) ) LavarLavar emem MABTMABT

A HIS passo a passo…IIIA HIS passo a passo…III

Sonda hibridada incompletamentecom mRNAs não específicos

Sonda hibridada completamentecom mRNA específico

Sonda em excesso(que não hibridou com nada)

7. 7. PreparaçãoPreparação parapara a a detecçãodetecção porpor imunoimuno--histoquímicahistoquímicaIncubarIncubar emem MABT com MABT com soluçõessoluções de blocking de blocking –– minimizaminimiza ligaçõesligações inespecíficasinespecíficas

emem imunoimuno--histoquímicahistoquímica

8. 8. DetecçãoDetecção dada sondasonda porpor imunoimuno--histoquímicahistoquímicaAdicionarAdicionar anticorpoanticorpo antianti--DIG DIG conjugadoconjugado com com fosfatasefosfatase alcalinaalcalina, , o.no.n., 4ºC., 4ºCLavarLavar com MABTcom MABTLavarLavar com NTMT (com NTMT (tampãotampão alcalinoalcalino emem queque é é feitafeita a a revelaçãorevelação))

A HIS passo a passo…IVA HIS passo a passo…IV

mRNA

Sonda RNA

Anticorpo anti DIG

Molécula DIG

Anticorpo está acoplado a umaenzima Fosfatase alcalina

A HIS passo a passo…V A HIS passo a passo…V –– podem ter passado 3, 4 dias…podem ter passado 3, 4 dias…

9. 9. RevelaçãoRevelação (com um (com um substratosubstrato dada fosfatasefosfatase alcalinaalcalina))ColocarColocar emem BM Purple, BM Purple, incubarincubar àà tº tº ambienteambiente, , escuroescuro atéaté apareceraparecer claramenteclaramente

umauma coloraçãocoloração roxaroxa –– tempo tempo dependedepende dada sondasondaTirarTirar o BM Purple e o BM Purple e lavarlavar emem PBTPBTGuardarGuardar emem PBT com PBT com azidaazida ((evitaevita crescimentocrescimento de de bactériasbactérias))

((ouou póspós--fixarfixar maismais umauma vezvez osos embriõesembriões parapara guardarguardar a a longolongo prazoprazo))

ImportânciaImportância dos dos controloscontrolos

PositivosPositivos: : sondasonda queque sabemossabemos ser ser expressaexpressa nana amostraamostra

NegativosNegativos: : sondasonda queque sabemossabemos nãonão ser ser expressaexpressa nana amostraamostrasondasonda sense sense

Resultados, finalmente…Resultados, finalmente…

Material e fotos: Fernanda Material e fotos: Fernanda BajancaBajanca

In In totototo

Em cortesEm cortes

paraxisparaxis

Foto: Pedro Foto: Pedro CampinhoCampinhoSosicSosic et al. 1997et al. 1997

Comparação BM Comparação BM PurplePurple / / FishFish

Tratamento de imagem: reconstrução 3D, cortes ópticosTratamento de imagem: reconstrução 3D, cortes ópticos

Material: Pedro Material: Pedro CampinhoCampinho; Imagem: Gabriel Martins; Imagem: Gabriel Martins

FISH FISH –– fluorescentfluorescentinin situsitu hybridisationhybridisation

Embriões deEmbriões degalinhagalinhaDenkersDenkers 20042004

••Sequência embriões de ratinho E7.5Sequência embriões de ratinho E7.5--E11.5:E11.5:

Pax3 Caixa1Pax3 Caixa1

E9.5E9.0

E8.0E7.5

Observação de embriões Observação de embriões marcados por HIS (parte prática)marcados por HIS (parte prática)

Tipo de marcadores a ver:Tipo de marcadores a ver:Musculares: myf5Musculares: myf5

MLC (cadeia leve MLC (cadeia leve miosinamiosina))Cardíacos: Cardíacos: αα--actinaactina cardcardííacaaca

MLCMLCSomitogéneseSomitogénese e relógio molecular:e relógio molecular:

pax3pax3paraxisparaxisdeltadeltalunaticlunatic fringefringe

MicroarraysMicroarrays de DNAde DNA

RNA de RNA de célulascélulas tipotipo 11

RNA de RNA de célulascélulas tipotipo 22

RT

RT

cDNAcDNA de de célulascélulas tipotipo 11

cDNAcDNA de de célulascélulas tipotipo 22

MisturarMisturar osos doisdois

PodePode ser ser amplificadoamplificado porpor PCRPCR

AdicionarAdicionar

Princípio da técnicaPrincípio da técnica““MicroarraysMicroarrays””

PlacasPlacas de de microarraymicroarray com com sondassondascomplementarescomplementares aoao cDNAcDNA de de célulascélulas de um de um dos dos tipostipos..

1. O que são os arrays de DNA?1. O que são os 1. O que são os arraysarrays de DNA?de DNA?

DNA DNA arrayarray é um conjunto de moléculas de DNA é um conjunto de moléculas de DNA impressas de uma forma sistemática num substrato impressas de uma forma sistemática num substrato sólido sólido Dependendo do tamanho das manchas de DNA: Dependendo do tamanho das manchas de DNA: MicroarraysMicroarrays (Ø <250 (Ø <250 µµm) ou m) ou MacroarraysMacroarrays (Ø > 300 (Ø > 300 µµm)m)Quando o suporte sólido usado é pequeno, chamamQuando o suporte sólido usado é pequeno, chamam--seseDNA DNA chipschips..

Affymetrix™Affymetrix™ Gene Gene ChipChip

Tipos de Tipos de microarraysmicroarrays

OligoOligo chipschips((GeneChipGeneChip®®, , AffymetrixAffymetrix))

20 nts or 100 ntsSequenciaçãoSequenciação e expressãoe expressão

cDNAcDNA chipschips((StanfordStanford))

500-5,000 nts

ExpressãoExpressão

GenomicGenomic chipschips

> 50,000 ntsAnálise Análise genómicagenómica

Fabrico dos Fabrico dos microarraysmicroarrays

Máquinas de imprimir Máquinas de imprimir microarraysmicroarrays

ImpressãoImpressãoImpressão

http://http://cmgm.stanford.edu/pbrown/arrayer.htmlcmgm.stanford.edu/pbrown/arrayer.html

Cabeça de impressão com 48 Cabeça de impressão com 48 pinspins

Cabeça do Cabeça do pinpin

Sistema de impressão robotizadoSistemaSistema de de impressãoimpressão robotizadorobotizado

http://http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/arrays/arrayer.htmlwww.bio.davidson.edu/courses/genomics/arrays/arrayer.html

Ensaio DNA MicroarrayEnsaio DNA Ensaio DNA MicroarrayMicroarray

““SpottingSpotting” do DNA num substrato ” do DNA num substrato

(vidro, plástico, metal, …)(vidro, plástico, metal, …)

Isolamento e marcação da amostraIsolamento e marcação da amostra

HibridaçãoHibridação Sonda/Amostra Sonda/Amostra

Detecção e análise dos resultados de Detecção e análise dos resultados de hibridaçãohibridação

EnsaioEnsaioEnsaio

A A sondasonda éé o o áácidocido nucleiconucleico com com sequênciasequência conhecidaconhecidaimobilizadoimobilizado..

A A amostraamostra--alvoalvo éé o o áácidocido nucleiconucleico livrelivre cujacujapresenpresençça/abundânciaa/abundância estestáá a ser a ser detectadadetectada..

Amostra-Alvo*

AmostraAmostra--AlvoAlvo*

SondaSondaSondaHibridaçãoHibridaçãoHibridação

SinalSinalSinal

MicroarraysMicroarraysExperiênciasExperiências ComparativasComparativas

Obtenção e tratamento dos resultadosObtenção e tratamento dos resultadosObtenção e tratamento dos resultados

ImagemImagem

Programa de análise de imagemPrograma de análise de imagem

NormalizaçãoNormalização

Complexidade da ligação Complexidade da ligação sondasonda--alvoalvo

BackgroungBackgroung e e autoauto--fluorescênciafluorescência do do chipchip

Eficiência da Eficiência da hibridaçãohibridação

Tecnologia da detecção (sinal, eficiência, “ruído de fundo”)Tecnologia da detecção (sinal, eficiência, “ruído de fundo”)

Numero e Nome do gene Imagem

1

Imagem

2

Etc.

Ficheiro com todos os dadosFicheiro com todos os dados

Grupo de genes com padrão de

expressão semelhante

Número de genes

Padrão de expressão

Genes“down-regulated”

Genes“up-regulated”

Resultado obtido com Resultado obtido com SOMTreeSOMTree

Resultados obtidos com Resultados obtidos com FatiGOFatiGO

Vantagens dos Vantagens dos microarraysmicroarrays

Detecção de expressão Detecção de expressão génicagénica simultaneamentesimultaneamentepara um enorme conjunto de genes!para um enorme conjunto de genes!

RapidezRapidezAutomaçãoAutomação

Mas…Mas…

Preço muito elevado para um grande Preço muito elevado para um grande nºnº amostrasamostras

Aplicações dos Aplicações dos microarraysmicroarrays

Estudos sobre níveis de expressão Estudos sobre níveis de expressão génicagénica

Identificação de sequências Identificação de sequências génicasgénicas (ou mutações)(ou mutações)

Investigação básicaInvestigação básicaDoenças genéticas (cancro, genética préDoenças genéticas (cancro, genética pré--natal)natal)Efeitos de drogasEfeitos de drogas

Mas também agricultura, ambiente, …Mas também agricultura, ambiente, …

ManipulaçãoManipulação dada expressãoexpressão génicagénica

ManipulaçãoManipulação dada expressãoexpressão génicagénica

DesregulaçãoDesregulação do do processoprocesso biológicobiológico??

InterferirInterferir com a com a expressãoexpressão normal do genenormal do geneEstratégiasEstratégias parapara estudarestudar a a funçãofunção dos genesdos genes

AumentarAumentar a a quantidadequantidade de de proteínaproteína funcionalfuncionalformadaformada

AbolirAbolir a a formaçãoformaçãode de proteínaproteína normalnormal

FavorecerFavorecer a a formaçãoformação de de umauma proteínaproteína nãonão

funcionalfuncional ouou alteradaalterada

AbolirAbolir a a formaçãoformação de de proteínaproteína normalnormal

RatinhosRatinhos knockknock--out out definitivosdefinitivos ouou condicionaiscondicionais((tambémtambém knockknock--ins)ins)

MorpholinosMorpholinos ((oligosoligos antisenseantisense))

InterferênciaInterferência de RNA (RNA de de RNA (RNA de cadeiacadeia dupladupla))

UsarUsar inibidoresinibidores dada proteínaproteína

UsarUsar anticorposanticorpos contra a contra a proteínaproteína

Produção de quimerasProdução de quimeras2 métodos2 métodos

RatinhosRatinhos KnockKnock--outout

Hz

KO

KnockKnock--outout de myf5de myf5

AumentarAumentar a a quantidadequantidade de de proteínaproteína normalnormalElectroporaçãoElectroporaçãoInfecçãoInfecção com com vírusvírusTransplantesTransplantes usandousando a a zonazona queque fabricafabrica a a proteínaproteínaImplantaçãoImplantação de de esferasesferas (“beads”) (“beads”) impregnadosimpregnados com a com a proteínaproteínaAumentarAumentar a a quantidadequantidade de de proteínaproteína nãonão funcionalfuncional normalnormalInserçãoInserção de de cDNAcDNA ““alteradoalterado””

Inserir uma proteína novaInserir uma proteína novaTransgénicosTransgénicos

Produção de Produção de transgénicostransgénicos::AdiçãoAdição de um gene ao de um gene ao genomagenoma normal do embrião:normal do embrião:1. Injecção do 1. Injecção do blastocistoblastocisto

Promotor constante Promotor constante -- promotor específico de um tecido promotor específico de um tecido -- promotor promotor controlável...controlável...

Produção de Produção de transgénicostransgénicos::AdiçãoAdição de um gene ao de um gene ao genomagenomanormal do embrião:normal do embrião:2. Produção de quimeras2. Produção de quimeras

Expression of human AAT is restricted to mammary tissue and is secreted into milk

ProduçãoProdução de de ovelhasovelhas transgénicastransgénicas

Clonagem terapêutica:Clonagem terapêutica: clonagemclonagemcélulas células estaminaisestaminaiscélulas células transgénicastransgénicas

Principal bibliografia usada nesta aula (HIS):Principal bibliografia usada nesta aula (HIS):

Colaboração parte prática Colaboração parte prática –– Fernanda Fernanda BajancaBajanca

Gilbert SF (2006) Gilbert SF (2006) -- Developmental Biology (8º ed), Developmental Biology (8º ed), SinauerSinauer AssociatesAssociates

Junqueira LC & Carneiro J (2004) Junqueira LC & Carneiro J (2004) –– Histologia Básica: Texto & Atlas (10º ed.), Histologia Básica: Texto & Atlas (10º ed.), Guanabara Guanabara KooganKoogan

Principal bibliografia usada nesta aula (Principal bibliografia usada nesta aula (microarraysmicroarrays, , RNAiRNAi):):

CaustonCauston HC et al. (2003) HC et al. (2003) –– MicroarrayMicroarray -- Gene Gene expressionexpression Data Data AnalysisAnalysis, , A A Beginner´sBeginner´s GuideGuide. . BlackwellBlackwell PublishingPublishing

GeleyGeley S & MS & Müllerüller C (2004) C (2004) –– RNAiRNAi: ancient mechanism with a promising: ancient mechanism with a promisingFuture. Future. Experimental GerontologyExperimental Gerontology, 39 (7): 985, 39 (7): 985--9898

StekelStekel D (2003) D (2003) –– MicroarrayMicroarray Bioinformatics. Cambridge UniversityBioinformatics. Cambridge UniversityPressPress

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/arrays/arrayer.htmlhttp://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/arrays/arrayer.htmlhttp://cmgm.stanford.edu/pbrown/explore/index.htmlhttp://cmgm.stanford.edu/pbrown/explore/index.html

http://gepas.bioinfo.cnio.es/data/index.htmlhttp://gepas.bioinfo.cnio.es/data/index.html

http://www.ncbi.nlm.nih.govhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov//

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http://www.affymetrix.com/products/arrays/index.affxhttp://www.affymetrix.com/products/arrays/index.affx

http://www.chem.agilent.com/Scripts/PDS.asp?lPage=2433http://www.chem.agilent.com/Scripts/PDS.asp?lPage=2433

Filme geral Filme geral microarraysmicroarrays: : http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chipQ.htmlhttp://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chipQ.html

WebsitesWebsites

RNAi:

http://www.hhmi.org/biointeractive/rna/rnai/index.html

Filme RNAi:

WebsitesWebsites ((contcont.) e filmes .) e filmes

rnai_revised_500x280.mov