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Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR * 2018 *

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Universidad Nacional del Nordeste

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura

BIOLOGIacuteA CELULAR Y

MOLECULAR

2018

Biologiacutea Celular y Molecular 2

A PRESENTACIOacuteN DE LA ASIGNATURA

I Introduccioacuten

El presente curso de Biologiacutea Celular y Molecular intenta proporcionar al estudiante

una visioacuten esencial de los patrones de estructura funcioacuten y organizacioacuten de las ceacutelulas

Se procuraraacute que el alumno conozca y aplique el meacutetodo cientiacutefico poniendo especial

eacutenfasis en el concepto de que el conocimiento cientiacutefico es provisorio y sometido a constante

revisioacuten

En el transcurso del cursado de la asignatura se presentaraacute al alumno una visioacuten de la

estructura y ultraestructura celular los distintos niveles de organizacioacuten y tipos de ceacutelulas la

relacioacuten entre forma y funcioacuten el metabolismo de las ceacutelulas y la reproduccioacuten celular

II Objetivos

Al finalizar el cursado de la asignatura se pretenden alcanzar los siguientes objetivos

que los docentes de la caacutetedra trataraacuten de promover activamente

Desarrollar destreza en el manejo de los instrumentos de laboratorio teacutecnicas

empiacutericas y microscopiacutea

Conocer los fundamentos resultados y limitaciones de los principales meacutetodos

empleados para el estudio de las ceacutelulas sus productos y sus interacciones

Reconocer las caracteriacutesticas fundamentales de las ceacutelulas patrones diversidad de

formas actividad metaboacutelica y regulacioacuten

Conocer las bases moleculares del funcionamiento celular

Establecer relaciones integradoras entre la estructura y la funcioacuten de las ceacutelulas

Examinar a la ceacutelula como un organismo autoacutenomo consolidando el concepto de

niveles de organizacioacuten subcelular

Instruirse en el empleo de la terminologiacutea baacutesica de las ciencias bioloacutegicas tanto en su

expresioacuten graacutefica como escrita y oral

Estimular el desarrollo del pensamiento reflexivo sobre la base del meacutetodo cientiacutefico

Desarrollar la capacidad de obtener seleccionar y registrar la informacioacuten bioloacutegica

pertinente

III Programa Analiacutetico

1 Introduccioacuten al estudio de la biologiacutea celular La biologiacutea celular dentro de las ciencias

bioloacutegicas Historia e importancia de su conocimiento Descubrimiento de la estructura

microscoacutepica Morfologiacutea al microscopio oacuteptico y electroacutenico El concepto de la relacioacuten

estructura-funcioacuten

2 Meacutetodos de estudio en biologiacutea celular Anaacutelisis de la estructura y ultraestructura celular

Fraccionamiento celular Electroforesis Cultivo de tejidos Ultracentrifugacioacuten

Histoquiacutemica Inmunohistoquiacutemica Inmunofluorescencia

3 Caracteriacutesticas generales de las ceacutelulas La ceacutelula como unidad funcional y estructural de

la vida Teoriacutea celular Niveles de organizacioacuten protoplaacutesmico celular tisular oacuterganos y

sistemas Envejecimiento degeneracioacuten y muerte de las ceacutelulas

Biologiacutea Celular y Molecular 3

4 Membrana Celular Composicioacuten molecular de las membranas bioloacutegicas Modelos de

membranas Propiedades de las membranas Diferenciaciones de la membrana

Interacciones de las ceacutelulas entre siacute y con las matrices extracelulares Cubiertas externas

5 Transporte a traveacutes de la membrana Permeabilidad de la membrana Transporte activo

y pasivo Difusioacuten simple y facilitada Osmosis Transporte de Iones y macromoleacuteculas

Bombas o ATPasas Proteiacutenas transportadoras

6 Citosol o Matriz citoplasmaacutetica Citoesqueleto caracteriacutesticas generales y organizacioacuten

Microtuacutebulos Organoides microtubulares Microfilamentos Filamentos intermedios

Movimiento de las ceacutelulas Cilios y flagelos

7 Organelos citoplasmaacuteticos Organelos membranosos y no membranosos Retiacuteculo

endoplasmaacutetico liso y rugoso Aparato de Golgi Ribosomas Vesiacuteculas con cubierta

Lisosomas Peroxisomas Descripcioacuten y funciones Endocitosis especiacutefica e inespeciacutefica

Fagocitosis

8 Mitocondrias Aspectos generales Membrana interna y externa Transporte Composicioacuten

y estructura molecular de las membranas Acople de la cadena respiratoria Fosforilacioacuten

oxidativa

9 La ceacutelula vegetal Morfologiacutea y fisiologiacutea Pared celular composicioacuten y estructura

Interaccioacuten y comunicacioacuten entre ceacutelulas vegetales Organizacioacuten interna Plaacutestidos

Vacuolas Cloroplastos modelos estructurales y metabolismo Fotosiacutentesis

10 Nuacutecleo interfaacutesico Descripcioacuten general Envoltura nuclear Las bases quiacutemicas de la

herencia Estructura del ADN Modelo de Watson y Crick Cromatina Nucleosomas

Empaquetamiento Proteiacutenas histoacutenicas y no histoacutenicas Replicacioacuten del ADN

Cromosomas morfologiacutea y estructura Eucromatina y heterocromatina

11 Mitosis Ciclo celular Descripcioacuten detallada de la mitosis Consecuencias geneacuteticas

Aspectos moleculares Aparato mitoacutetico en ceacutelulas vegetales y animales Cinetocoros

Citocinesis Control del ciclo celular Proteiacutenas reguladoras

12 Meiosis y Reproduccioacuten Sexual Descripcioacuten detallada de la meiosis Consecuencias

geneacuteticas Recombinacioacuten Metabolismo del ADN en la meiosis Recombinacioacuten a nivel

molecular Estructura de la cromatina en espermatozoides Dominio fiacutesico de los

pronuacutecleos masculino y femenino en las primeras ceacutelulas del embrioacuten

13 El material geneacutetico en accioacuten Funcioacuten del ADN Tipos de ARN estructura funcioacuten y

transcripcioacuten Siacutentesis regulacioacuten y maduracioacuten de los ARN Composicioacuten del nucleacuteolo

14 Coacutedigo geneacutetico Siacutentesis de proteiacutenas Traduccioacuten del ARN mensajero Ribosomas en

procariotas y eucariotas Ensamblaje de los ribosomas Estructura proteica Siacutentesis de

proteiacutenas citosoacutelicas y membranosas

IV Bibliografiacutea General

Alberts B A Johnson J Lewis M Raff K Roberts amp P Walter 2004 Biologiacutea Molecular

de la Ceacutelula 4ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona (2)

Alberts B D Bray K Hopkin A Johnson J Lewis M Raff K Roberts amp P Walter

2007 Introduccion a la Biologiacutea Molecular 2ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana

Buenos Aires (6)

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires (1)

Karp G 1998 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico (2)

Karp G 2005 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico (3)

Biologiacutea Celular y Molecular 4

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordm edicioacuten Ed Panamericana Buenos Aires (2)

Lodish H A Berk P Matsudaira C A Kaiser M Krieger M P Scott S Zipursky S

Lawrence amp J Darnell 2008 Biologiacutea Celular y Molecular 5ordm edicioacuten Ed

Panamericana Buenos Aires (7)

Purves W K D Sadava G H Orians amp H C Heller 2006 Vida la ciencia de la biologiacutea

6ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires (6)

V Bibliografiacutea Especiacutefica

Beadle G W 1961 Las bases fiacutesicas y quiacutemicas de la herencia Ed Eudeba Buenos Aires

Bianchi N O 1978 Duplicacioacuten cromosoacutemica y heterocromatina a nivel molecular

citoloacutegico OEA Serie de Biologiacutea Monografiacutea Nordm 19

Burns G W 1983 The science of genetics An introduction to heredity Ed Macmillan amp

Co New York

Gardner E J M J Simmons amp D P Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed

Limusa-Wiley Meacutexico

Griffiths A J F J H Miller D T Suzuki R C Lewontin amp W M Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena J R 1988 Geneacutetica Ed Agesa Madrid

Lacadena J R 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Sanchez-Monge E amp N Jouve 1989 Geneacutetica Ed Omega Barcelona

Sinnott E W Dunn L C amp T Dobzhansky 1961 Principios de Geneacutetica Ed Omega

Barcelona

Stern C 1963 Principios de geneacutetica humana Ed El Ateneo Buenos Aires

Strickberger M W 1978 Geneacutetica 2ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Thompson J S amp M W Thompson 1977 Geneacutetica humana Ed Salvat Buenos Aires

VI Programa de Examen

Bolilla Temas

1 1 11 14

2 2 12 13

3 3 12 14

4 4 11 13

5 5 7 10

6 2 6 9

7 5 7 8

8 1 6 8

9 2 4 9

10 1 2 10

Biologiacutea Celular y Molecular 5

B ORGANIZACIOacuteN DE LA ASIGNATURA

I Personal Docente

Profesor Titular

Dr Massimiliano Dematteis

Jefe de Trabajos Praacutecticos

Dra Mariacutea de las Mercedes Sosa

Dra Mariacutea Betiana Angulo

Auxiliar de Primera Adscripto

Dra Gabriela Elizabeth Farco

Dra Gisela Mariel Via do Pico

Auxiliares de Segunda

Carina Daniela Elena

Roxana Soledad Molina

II Caracteriacutesticas Generales

El curso comprende la realizacioacuten de clases teoacutericas y praacutecticas realizaacutendose 3

evaluaciones parciales con sus respectivos recuperatorios y un recuperatorio extraordinario

III Clases Teoacutericas

Las clases teoacutericas estaacuten destinadas al conjunto de los alumnos y constituyen una

actividad no obligatoria doacutende se desarrollan los aspectos fundamentales y la orientacioacuten

general de la materia Para facilitar la comprensioacuten de los contenidos desarrollados durante las

clases teoacutericas es importante la lectura o estudio previo de los temas dictados

IV Clases Praacutecticas

Las praacutecticas de laboratorio o trabajos praacutecticos son una actividad obligatoria para

todos los alumnos inscriptos y se desarrollan dos veces por semana guiados por uno o maacutes

auxiliares de docencia Las bases conceptuales de los temas de los trabajos praacutecticos son

desarrolladas previamente en las clases teoacutericas Para poder integrar los conocimientos

teoacutericos y praacutecticos que conduzcan a la comprensioacuten global de la materia es imprescindible

que los alumnos concurran a los trabajos praacutecticos habiendo estudiado o preparado

previamente el tema a desarrollar

Las clases tendraacuten una duracioacuten aproximada de 2 horas aunque ocasionalmente

algunos praacutecticos puedan demandar mayor o menor cantidad de tiempo Los temas a

desarrollar en los praacutecticos asiacute como los materiales necesarios y actividades se detallan en la

guiacutea de trabajos praacutecticos Al final de cada praacutectico en la guiacutea de actividades praacutecticas se

incluyen referencias bibliograacuteficas a las que el alumno podraacute recurrir para aclarar conceptos o

estudiar el tema Para cada clase praacutectica el alumno deberaacute concurrir conociendo la finalidad

del trabajo y trayendo la guiacutea de trabajos praacutecticos y los materiales necesarios mencionados

en la misma Se recomienda el uso de guardapolvo o chaquetilla durante los praacutecticos pero su

empleo no es obligatorio

La realizacioacuten de cada trabajo praacutectico implica la comprensioacuten de los principios

Biologiacutea Celular y Molecular 6

teoacutericos del fenoacutemeno en estudio el adiestramiento manual del alumno la praacutectica en el

manejo instrumental y entrenamiento en la presentacioacuten de datos e interpretacioacuten de

resultados Al finalizar cada trabajo praacutectico el alumno deberaacute entregar en forma individual

las actividades realizadas durante la clase para su evaluacioacuten (ilustraciones respuestas del

cuestionario problemas resueltos etc) Si dicho informe se presenta en estado deficiente o

incompleto se consideraraacute que no ha cumplido con la clase praacutectica Igualmente cuando el

alumno se encuentre ajeno al trabajo sea por ignorar los fundamentos teoacutericos o por

permanecer inactivo en la praacutectica se consideraraacute que no ha cumplido esa clase praacutectica

V Evaluaciones

Estaraacuten destinadas a determinar el grado de comprensioacuten de los diferentes temas por

parte de los alumnos y evaluar el grado en que los objetivos propuestos por la asignatura se

cumplen

a- Evaluaciones de las Actividades Praacutecticas tienen como objetivo determinar si el grado

de comprensioacuten de los fundamentos del tema es satisfactorio y verificar si el alumno es capaz

de aplicar dichos conocimientos en la resolucioacuten de problemas hipoteacutetico-deductivos La

evaluacioacuten de las mismas se realizaraacute a partir de los trabajos o problemas realizados por los

alumnos que seraacuten entregados al finalizar cada clase

b- Evaluaciones Parciales se realizaraacuten tres evaluaciones parciales que comprenderaacuten

temas estrechamente relacionados cuya comprensioacuten es fundamental para la correcta

asimilacioacuten de los temas posteriores Los parciales tendraacuten como objetivo fundamental

evaluar la capacidad de anaacutelisis y de las diferentes situaciones que pudieran plantearse Todos

los parciales se desarrollaraacuten por escrito Los mismos se consideraraacuten aprobados con una

calificacioacuten de 6 (seis) o superior Dentro de los 7 diacuteas posteriores a cada evaluacioacuten se

realizaraacute el recuperatorio correspondiente el cual tendraacute modalidad escrito y con preguntas a

desarrollar

VI Regularizacioacuten de la Asignatura

Seraacuten considerados alumnos regulares los que cumplieran con las siguientes

exigencias

a) Alcanzar el 75 de asistencia en las clases praacutecticas

b) Aprobar el 75 de las clases praacutecticas

c) Aprobar el 100 de las evaluaciones parciales con calificacioacuten 6 (seis) o superior

Los alumnos que no alcanzaran al 75 de aprobacioacuten de las clases praacutecticas o no

aprobaran los parciales con un miacutenimo de 6 (seis) seraacuten considerados alumnos libres

VII Horarios de Consultas

Las consultas que quieran realizar los alumnos tanto sobre temas teoacutericos como

praacutecticos las deberaacuten efectuar al Profesor responsable de la asignatura los diacuteas mieacutercoles y

viernes de 14 a 15 hs previos al inicio de las clases teoacutericas Cualquier duda que surgiera los

diacuteas restantes las consultas podraacuten ser realizadas en el Instituto de Botaacutenica del Nordeste

Sargento Cabral 2131 de 8 a 10 hs

Biologiacutea Celular y Molecular 7

VII Cronograma de Actividades

Clases teoacutericas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 09032018 Introduccioacuten al estudio de la biologiacutea celular La biologiacutea

celular dentro de las ciencias bioloacutegicas Historia e

importancia de su conocimiento

Dematteis Massimiliano

2 14032018 Meacutetodos de estudio en biologiacutea celular Anaacutelisis de la

estructura y ultraestructura celular Microscopiacutea oacuteptica y

electroacutenica

Dematteis Massimiliano

3 16032018 Fraccionamiento celular Cromatografiacutea Electroforesis

Cultivo de tejidos Ultracentrifugacioacuten Histoquiacutemica

Inmunohistoquiacutemica Autorradiografiacutea

Inmunofluorescencia

Dematteis Massimiliano

4 21032018 Teoriacutea celular Ceacutelulas procariotas y eucariotas

Caracteriacutesticas de las ceacutelulas vegetales y animales

Morfologiacutea y fisiologiacutea de las ceacutelulas Envejecimiento

degeneracioacuten y muerte de las ceacutelulas

Dematteis Massimiliano

5 23032018 Membrana Celular Composicioacuten molecular de las

membranas bioloacutegicas Modelos de membranas

Propiedades de las membranas

Dematteis Massimiliano

6 28032018 Diferenciaciones de la membrana Interacciones de las

ceacutelulas entre siacute y con las matrices extracelulares

Cubiertas externas

Dematteis Massimiliano

7 30032018 Viernes Santo Dematteis Massimiliano

8 04042018 Transporte a traveacutes de la membrana Permeabilidad de la

membrana Transporte activo y pasivo Bombas o

ATPasas Proteiacutenas transportadoras

Dematteis Massimiliano

10 06042018 Citosol o Matriz citoplasmaacutetica Citoesqueleto

caracteriacutesticas generales y organizacioacuten Microtuacutebulos

Organoides microtubulares Microfilamentos Filamentos

intermedios Movimiento de las ceacutelulas Cilios y flagelos

Dematteis Massimiliano

12 11042018 Organelos citoplasmaacuteticos Organelos membranosos y no

membranosos Retiacuteculo endoplasmaacutetico liso y rugoso

Aparato de Golgi

Dematteis Massimiliano

13 13042018 Primer parcial Dematteis Massimiliano

14 18042018 Ribosomas Vesiacuteculas con cubierta Lisosomas

Peroxisomas Descripcioacuten y funciones Endocitosis

especiacutefica e inespeciacutefica Fagocitosis

Dematteis Massimiliano

15 20042018 Mitocondrias Aspectos generales Membrana interna y

externa Transporte Composicioacuten y estructura molecular

de las membranas Acople de la cadena respiratoria

Fosforilacioacuten oxidativa

Dematteis Massimiliano

16 25042018 La ceacutelula vegetal Morfologiacutea y fisiologiacutea Pared celular

composicioacuten y estructura Organizacioacuten interna Plaacutestidos

Vacuolas Cloroplastos

Dematteis Massimiliano

17 27052018 Nuacutecleo interfaacutesico Descripcioacuten general Envoltura

nuclear Las bases quiacutemicas de la herencia Estructura

del ADN Modelo de Watson y Crick

Dematteis Massimiliano

18 02052018 Cromatina Nucleosomas Empaquetamiento Proteiacutenas

histoacutenicas y no histoacutenicas Replicacioacuten del ADN

Cromosomas Eucromatina y heterocromatina

Dematteis Massimiliano

19 04052018 Mitosis Ciclo celular Descripcioacuten detallada de la mitosis

Consecuencias geneacuteticas Aparato mitoacutetico en ceacutelulas

vegetales y animales Cinetocoros Citocinesis

Dematteis Massimiliano

20 09052018 Aspectos moleculares Control del ciclo celular

Proteiacutenas reguladoras

Dematteis Massimiliano

21 11052018 Segundo Parcial Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 8

22 16052018 Meiosis y Reproduccioacuten Sexual Descripcioacuten detallada de

la meiosis Consecuencias geneacuteticas Recombinacioacuten

Metabolismo del ADN en la meiosis

Dematteis Massimiliano

23 18052018 Recombinacioacuten a nivel molecular Estructura de la

cromatina en espermatozoides Dominio fiacutesico de los

pronuacutecleos masculino y femenino en las primeras ceacutelulas

del embrioacuten

Dematteis Massimiliano

24 23052018 El material geneacutetico en accioacuten Funcioacuten del ADN Tipos

de ARN estructura funcioacuten y transcripcioacuten Siacutentesis

regulacioacuten y maduracioacuten de los ARN Composicioacuten del

nucleacuteolo

Dematteis Massimiliano

25 25052018 Feriado Dematteis Massimiliano

26 30052018 Coacutedigo geneacutetico Siacutentesis de proteiacutenas Traduccioacuten del

ARN mensajero Ribosomas en procariotas y eucariotas

Ensamblaje de los ribosomas

Dematteis Massimiliano

27 01062018 Estructura proteica Siacutentesis de proteiacutenas citosoacutelicas y

membranosas

Dematteis Massimiliano

28 13062018 Tercer Parcial Dematteis Massimiliano

Clases Praacutecticas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 16032018 Praacutectico Nordm 1 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

2 21032018 Praacutectico Nordm 2 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

3 23032018 Praacutectico Nordm 3

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

4 28032018 Praacutectico Nordm 4 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

5 30032018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

6 04042018 Praacutectico Nordm 5 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

7 06042018 Praacutectico Nordm 6

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

8 11042018 Praacutectico Nordm 7

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

9 13042018 Primer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

10 18042018 Praacutectico Nordm 8 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

11 20042018 Recuperatorio Primer Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

12 25042018 Praacutectico Nordm 9 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

13 27042018 Praacutectico Nordm 10 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

14 02052018 Praacutectico Nordm 11 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

15 04052018 Praacutectico Nordm 12

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

16 09052018 Praacutectico Nordm 13 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

17 11052018 Segundo Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

18 16052018 Praacutectico Nordm 14 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

19 18052018 Recuperatorio Segundo Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Biologiacutea Celular y Molecular 9

Angulo Mariacutea Betiana

20 23052018 Praacutectico Nordm 15 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

21 25052018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

22 30052018 Praacutectico Nordm 16 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

23 01062018 Praacutectico Nordm 17 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

24 06062018 Praacutectico Ndeg 18 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

25 13062018 Tercer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

Parciales

Actividad Fecha Horario Docente responsable

1ordm Examen parcial 13042018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 1ordm examen parcial 20042018 17-19 Dematteis Massimiliano

2ordm Examen parcial 11052018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 2ordm examen parcial 18052018 17-19 Dematteis Massimiliano

3ordm Examen parcial 13062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 3ordm examen parcial 22062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio Extraordinario 29062018 15-17 Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 10

TRABAJOS PRAacuteCTICOS

Biologiacutea Celular y Molecular 11

Trabajo Praacutectico Nordm 1

MICROSCOPIacuteA OacutePTICA Y ELECTROacuteNICA

El microscopio oacuteptico o fotoacutenico de campo claro estaacute compuesto por una parte

mecaacutenica o estativo y por un sistema oacuteptico que incluye fuente de luz condensador

diafragma objetivos y oculares a traveacutes de los cuales se refractan los rayos luminosos

provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamantildeo

invertida y virtual Para ello el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente

contraste para poder discriminar sus componentes La transparencia se logra mediante la

realizacioacuten de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos

celulares El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o

por medio de sistemas oacutepticos particulares (por ejemplo microscopio de contraste de fases)

El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de ceacutelulas y tejidos

previamente fijados (muertos) y coloreados La coloracioacuten de las preparaciones cito-

histoloacutegicas tiene por finalidad provocar la absorcioacuten diferencial de luz con el propoacutesito de

visualizar las diversas estructuras en distintos colores Por el contrario para estudiar ceacutelulas u

organismos vivos que no se pueden colorear es necesario recurrir casi siempre a otros

sistemas oacutepticos especiales como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de

interferencia En estos dos casos se aprovecha una caracteriacutestica propia de los diferentes

componentes celulares que aunque son transparentes a la luz poseen densidades relativas

distintas

Existen baacutesicamente dos tipos de microscopio electroacutenico el microscopio electroacutenico

de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electroacutenico de transferencia (MET)

Estos microscopios a diferencia del microscopio oacuteptico forman imaacutegenes a partir de una

radiacioacuten de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes

que funcionan como lentes

Otra de las caracteriacutesticas es que proporcionan una resolucioacuten mayor que el

microscopio oacuteptico requieren de procedimientos maacutes elaborados para la preparacioacuten del

material y soacutelo se pueden examinar ceacutelulas deshidratadas y muertas El MET se utiliza

ampliamente para examinar la estructura interna de la ceacutelula mientras que el MEB examina

con detalle la superficie de las muestras las cuales se observan tridimensional mente debido a

la profundidad de foco que posee este uacuteltimo tipo de microscopio Tanto el MET como el

MEB son indispensables para el estudio de la biologiacutea celular y molecular

El microscopio electroacutenico de transmisioacuten es un microscopio que utiliza un haz de

electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio

oacuteptico estaacute limitada por la longitud de onda de la luz visible Debido a que los electrones

tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho

maacutes pequentildeas tiene un liacutemite de resolucioacuten de cerca de 2 nm Un MET mira ceacutelulas muertas

despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de metales pesados Las partes principales

de un microscopio electroacutenico son

Cantildeoacuten de electrones que emite los electrones que chocan contra el espeacutecimen

creando una imagen aumentada

Lentes magneacuteticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones ya

que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios oacutepticos no funcionan con

los electrones

Sistema de vaciacuteo es una parte muy importante del microscopio electroacutenico Debido a

que los electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire se debe hacer un

vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

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Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

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Biologiacutea Celular y Molecular 2

A PRESENTACIOacuteN DE LA ASIGNATURA

I Introduccioacuten

El presente curso de Biologiacutea Celular y Molecular intenta proporcionar al estudiante

una visioacuten esencial de los patrones de estructura funcioacuten y organizacioacuten de las ceacutelulas

Se procuraraacute que el alumno conozca y aplique el meacutetodo cientiacutefico poniendo especial

eacutenfasis en el concepto de que el conocimiento cientiacutefico es provisorio y sometido a constante

revisioacuten

En el transcurso del cursado de la asignatura se presentaraacute al alumno una visioacuten de la

estructura y ultraestructura celular los distintos niveles de organizacioacuten y tipos de ceacutelulas la

relacioacuten entre forma y funcioacuten el metabolismo de las ceacutelulas y la reproduccioacuten celular

II Objetivos

Al finalizar el cursado de la asignatura se pretenden alcanzar los siguientes objetivos

que los docentes de la caacutetedra trataraacuten de promover activamente

Desarrollar destreza en el manejo de los instrumentos de laboratorio teacutecnicas

empiacutericas y microscopiacutea

Conocer los fundamentos resultados y limitaciones de los principales meacutetodos

empleados para el estudio de las ceacutelulas sus productos y sus interacciones

Reconocer las caracteriacutesticas fundamentales de las ceacutelulas patrones diversidad de

formas actividad metaboacutelica y regulacioacuten

Conocer las bases moleculares del funcionamiento celular

Establecer relaciones integradoras entre la estructura y la funcioacuten de las ceacutelulas

Examinar a la ceacutelula como un organismo autoacutenomo consolidando el concepto de

niveles de organizacioacuten subcelular

Instruirse en el empleo de la terminologiacutea baacutesica de las ciencias bioloacutegicas tanto en su

expresioacuten graacutefica como escrita y oral

Estimular el desarrollo del pensamiento reflexivo sobre la base del meacutetodo cientiacutefico

Desarrollar la capacidad de obtener seleccionar y registrar la informacioacuten bioloacutegica

pertinente

III Programa Analiacutetico

1 Introduccioacuten al estudio de la biologiacutea celular La biologiacutea celular dentro de las ciencias

bioloacutegicas Historia e importancia de su conocimiento Descubrimiento de la estructura

microscoacutepica Morfologiacutea al microscopio oacuteptico y electroacutenico El concepto de la relacioacuten

estructura-funcioacuten

2 Meacutetodos de estudio en biologiacutea celular Anaacutelisis de la estructura y ultraestructura celular

Fraccionamiento celular Electroforesis Cultivo de tejidos Ultracentrifugacioacuten

Histoquiacutemica Inmunohistoquiacutemica Inmunofluorescencia

3 Caracteriacutesticas generales de las ceacutelulas La ceacutelula como unidad funcional y estructural de

la vida Teoriacutea celular Niveles de organizacioacuten protoplaacutesmico celular tisular oacuterganos y

sistemas Envejecimiento degeneracioacuten y muerte de las ceacutelulas

Biologiacutea Celular y Molecular 3

4 Membrana Celular Composicioacuten molecular de las membranas bioloacutegicas Modelos de

membranas Propiedades de las membranas Diferenciaciones de la membrana

Interacciones de las ceacutelulas entre siacute y con las matrices extracelulares Cubiertas externas

5 Transporte a traveacutes de la membrana Permeabilidad de la membrana Transporte activo

y pasivo Difusioacuten simple y facilitada Osmosis Transporte de Iones y macromoleacuteculas

Bombas o ATPasas Proteiacutenas transportadoras

6 Citosol o Matriz citoplasmaacutetica Citoesqueleto caracteriacutesticas generales y organizacioacuten

Microtuacutebulos Organoides microtubulares Microfilamentos Filamentos intermedios

Movimiento de las ceacutelulas Cilios y flagelos

7 Organelos citoplasmaacuteticos Organelos membranosos y no membranosos Retiacuteculo

endoplasmaacutetico liso y rugoso Aparato de Golgi Ribosomas Vesiacuteculas con cubierta

Lisosomas Peroxisomas Descripcioacuten y funciones Endocitosis especiacutefica e inespeciacutefica

Fagocitosis

8 Mitocondrias Aspectos generales Membrana interna y externa Transporte Composicioacuten

y estructura molecular de las membranas Acople de la cadena respiratoria Fosforilacioacuten

oxidativa

9 La ceacutelula vegetal Morfologiacutea y fisiologiacutea Pared celular composicioacuten y estructura

Interaccioacuten y comunicacioacuten entre ceacutelulas vegetales Organizacioacuten interna Plaacutestidos

Vacuolas Cloroplastos modelos estructurales y metabolismo Fotosiacutentesis

10 Nuacutecleo interfaacutesico Descripcioacuten general Envoltura nuclear Las bases quiacutemicas de la

herencia Estructura del ADN Modelo de Watson y Crick Cromatina Nucleosomas

Empaquetamiento Proteiacutenas histoacutenicas y no histoacutenicas Replicacioacuten del ADN

Cromosomas morfologiacutea y estructura Eucromatina y heterocromatina

11 Mitosis Ciclo celular Descripcioacuten detallada de la mitosis Consecuencias geneacuteticas

Aspectos moleculares Aparato mitoacutetico en ceacutelulas vegetales y animales Cinetocoros

Citocinesis Control del ciclo celular Proteiacutenas reguladoras

12 Meiosis y Reproduccioacuten Sexual Descripcioacuten detallada de la meiosis Consecuencias

geneacuteticas Recombinacioacuten Metabolismo del ADN en la meiosis Recombinacioacuten a nivel

molecular Estructura de la cromatina en espermatozoides Dominio fiacutesico de los

pronuacutecleos masculino y femenino en las primeras ceacutelulas del embrioacuten

13 El material geneacutetico en accioacuten Funcioacuten del ADN Tipos de ARN estructura funcioacuten y

transcripcioacuten Siacutentesis regulacioacuten y maduracioacuten de los ARN Composicioacuten del nucleacuteolo

14 Coacutedigo geneacutetico Siacutentesis de proteiacutenas Traduccioacuten del ARN mensajero Ribosomas en

procariotas y eucariotas Ensamblaje de los ribosomas Estructura proteica Siacutentesis de

proteiacutenas citosoacutelicas y membranosas

IV Bibliografiacutea General

Alberts B A Johnson J Lewis M Raff K Roberts amp P Walter 2004 Biologiacutea Molecular

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V Bibliografiacutea Especiacutefica

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Barcelona

Stern C 1963 Principios de geneacutetica humana Ed El Ateneo Buenos Aires

Strickberger M W 1978 Geneacutetica 2ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Thompson J S amp M W Thompson 1977 Geneacutetica humana Ed Salvat Buenos Aires

VI Programa de Examen

Bolilla Temas

1 1 11 14

2 2 12 13

3 3 12 14

4 4 11 13

5 5 7 10

6 2 6 9

7 5 7 8

8 1 6 8

9 2 4 9

10 1 2 10

Biologiacutea Celular y Molecular 5

B ORGANIZACIOacuteN DE LA ASIGNATURA

I Personal Docente

Profesor Titular

Dr Massimiliano Dematteis

Jefe de Trabajos Praacutecticos

Dra Mariacutea de las Mercedes Sosa

Dra Mariacutea Betiana Angulo

Auxiliar de Primera Adscripto

Dra Gabriela Elizabeth Farco

Dra Gisela Mariel Via do Pico

Auxiliares de Segunda

Carina Daniela Elena

Roxana Soledad Molina

II Caracteriacutesticas Generales

El curso comprende la realizacioacuten de clases teoacutericas y praacutecticas realizaacutendose 3

evaluaciones parciales con sus respectivos recuperatorios y un recuperatorio extraordinario

III Clases Teoacutericas

Las clases teoacutericas estaacuten destinadas al conjunto de los alumnos y constituyen una

actividad no obligatoria doacutende se desarrollan los aspectos fundamentales y la orientacioacuten

general de la materia Para facilitar la comprensioacuten de los contenidos desarrollados durante las

clases teoacutericas es importante la lectura o estudio previo de los temas dictados

IV Clases Praacutecticas

Las praacutecticas de laboratorio o trabajos praacutecticos son una actividad obligatoria para

todos los alumnos inscriptos y se desarrollan dos veces por semana guiados por uno o maacutes

auxiliares de docencia Las bases conceptuales de los temas de los trabajos praacutecticos son

desarrolladas previamente en las clases teoacutericas Para poder integrar los conocimientos

teoacutericos y praacutecticos que conduzcan a la comprensioacuten global de la materia es imprescindible

que los alumnos concurran a los trabajos praacutecticos habiendo estudiado o preparado

previamente el tema a desarrollar

Las clases tendraacuten una duracioacuten aproximada de 2 horas aunque ocasionalmente

algunos praacutecticos puedan demandar mayor o menor cantidad de tiempo Los temas a

desarrollar en los praacutecticos asiacute como los materiales necesarios y actividades se detallan en la

guiacutea de trabajos praacutecticos Al final de cada praacutectico en la guiacutea de actividades praacutecticas se

incluyen referencias bibliograacuteficas a las que el alumno podraacute recurrir para aclarar conceptos o

estudiar el tema Para cada clase praacutectica el alumno deberaacute concurrir conociendo la finalidad

del trabajo y trayendo la guiacutea de trabajos praacutecticos y los materiales necesarios mencionados

en la misma Se recomienda el uso de guardapolvo o chaquetilla durante los praacutecticos pero su

empleo no es obligatorio

La realizacioacuten de cada trabajo praacutectico implica la comprensioacuten de los principios

Biologiacutea Celular y Molecular 6

teoacutericos del fenoacutemeno en estudio el adiestramiento manual del alumno la praacutectica en el

manejo instrumental y entrenamiento en la presentacioacuten de datos e interpretacioacuten de

resultados Al finalizar cada trabajo praacutectico el alumno deberaacute entregar en forma individual

las actividades realizadas durante la clase para su evaluacioacuten (ilustraciones respuestas del

cuestionario problemas resueltos etc) Si dicho informe se presenta en estado deficiente o

incompleto se consideraraacute que no ha cumplido con la clase praacutectica Igualmente cuando el

alumno se encuentre ajeno al trabajo sea por ignorar los fundamentos teoacutericos o por

permanecer inactivo en la praacutectica se consideraraacute que no ha cumplido esa clase praacutectica

V Evaluaciones

Estaraacuten destinadas a determinar el grado de comprensioacuten de los diferentes temas por

parte de los alumnos y evaluar el grado en que los objetivos propuestos por la asignatura se

cumplen

a- Evaluaciones de las Actividades Praacutecticas tienen como objetivo determinar si el grado

de comprensioacuten de los fundamentos del tema es satisfactorio y verificar si el alumno es capaz

de aplicar dichos conocimientos en la resolucioacuten de problemas hipoteacutetico-deductivos La

evaluacioacuten de las mismas se realizaraacute a partir de los trabajos o problemas realizados por los

alumnos que seraacuten entregados al finalizar cada clase

b- Evaluaciones Parciales se realizaraacuten tres evaluaciones parciales que comprenderaacuten

temas estrechamente relacionados cuya comprensioacuten es fundamental para la correcta

asimilacioacuten de los temas posteriores Los parciales tendraacuten como objetivo fundamental

evaluar la capacidad de anaacutelisis y de las diferentes situaciones que pudieran plantearse Todos

los parciales se desarrollaraacuten por escrito Los mismos se consideraraacuten aprobados con una

calificacioacuten de 6 (seis) o superior Dentro de los 7 diacuteas posteriores a cada evaluacioacuten se

realizaraacute el recuperatorio correspondiente el cual tendraacute modalidad escrito y con preguntas a

desarrollar

VI Regularizacioacuten de la Asignatura

Seraacuten considerados alumnos regulares los que cumplieran con las siguientes

exigencias

a) Alcanzar el 75 de asistencia en las clases praacutecticas

b) Aprobar el 75 de las clases praacutecticas

c) Aprobar el 100 de las evaluaciones parciales con calificacioacuten 6 (seis) o superior

Los alumnos que no alcanzaran al 75 de aprobacioacuten de las clases praacutecticas o no

aprobaran los parciales con un miacutenimo de 6 (seis) seraacuten considerados alumnos libres

VII Horarios de Consultas

Las consultas que quieran realizar los alumnos tanto sobre temas teoacutericos como

praacutecticos las deberaacuten efectuar al Profesor responsable de la asignatura los diacuteas mieacutercoles y

viernes de 14 a 15 hs previos al inicio de las clases teoacutericas Cualquier duda que surgiera los

diacuteas restantes las consultas podraacuten ser realizadas en el Instituto de Botaacutenica del Nordeste

Sargento Cabral 2131 de 8 a 10 hs

Biologiacutea Celular y Molecular 7

VII Cronograma de Actividades

Clases teoacutericas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 09032018 Introduccioacuten al estudio de la biologiacutea celular La biologiacutea

celular dentro de las ciencias bioloacutegicas Historia e

importancia de su conocimiento

Dematteis Massimiliano

2 14032018 Meacutetodos de estudio en biologiacutea celular Anaacutelisis de la

estructura y ultraestructura celular Microscopiacutea oacuteptica y

electroacutenica

Dematteis Massimiliano

3 16032018 Fraccionamiento celular Cromatografiacutea Electroforesis

Cultivo de tejidos Ultracentrifugacioacuten Histoquiacutemica

Inmunohistoquiacutemica Autorradiografiacutea

Inmunofluorescencia

Dematteis Massimiliano

4 21032018 Teoriacutea celular Ceacutelulas procariotas y eucariotas

Caracteriacutesticas de las ceacutelulas vegetales y animales

Morfologiacutea y fisiologiacutea de las ceacutelulas Envejecimiento

degeneracioacuten y muerte de las ceacutelulas

Dematteis Massimiliano

5 23032018 Membrana Celular Composicioacuten molecular de las

membranas bioloacutegicas Modelos de membranas

Propiedades de las membranas

Dematteis Massimiliano

6 28032018 Diferenciaciones de la membrana Interacciones de las

ceacutelulas entre siacute y con las matrices extracelulares

Cubiertas externas

Dematteis Massimiliano

7 30032018 Viernes Santo Dematteis Massimiliano

8 04042018 Transporte a traveacutes de la membrana Permeabilidad de la

membrana Transporte activo y pasivo Bombas o

ATPasas Proteiacutenas transportadoras

Dematteis Massimiliano

10 06042018 Citosol o Matriz citoplasmaacutetica Citoesqueleto

caracteriacutesticas generales y organizacioacuten Microtuacutebulos

Organoides microtubulares Microfilamentos Filamentos

intermedios Movimiento de las ceacutelulas Cilios y flagelos

Dematteis Massimiliano

12 11042018 Organelos citoplasmaacuteticos Organelos membranosos y no

membranosos Retiacuteculo endoplasmaacutetico liso y rugoso

Aparato de Golgi

Dematteis Massimiliano

13 13042018 Primer parcial Dematteis Massimiliano

14 18042018 Ribosomas Vesiacuteculas con cubierta Lisosomas

Peroxisomas Descripcioacuten y funciones Endocitosis

especiacutefica e inespeciacutefica Fagocitosis

Dematteis Massimiliano

15 20042018 Mitocondrias Aspectos generales Membrana interna y

externa Transporte Composicioacuten y estructura molecular

de las membranas Acople de la cadena respiratoria

Fosforilacioacuten oxidativa

Dematteis Massimiliano

16 25042018 La ceacutelula vegetal Morfologiacutea y fisiologiacutea Pared celular

composicioacuten y estructura Organizacioacuten interna Plaacutestidos

Vacuolas Cloroplastos

Dematteis Massimiliano

17 27052018 Nuacutecleo interfaacutesico Descripcioacuten general Envoltura

nuclear Las bases quiacutemicas de la herencia Estructura

del ADN Modelo de Watson y Crick

Dematteis Massimiliano

18 02052018 Cromatina Nucleosomas Empaquetamiento Proteiacutenas

histoacutenicas y no histoacutenicas Replicacioacuten del ADN

Cromosomas Eucromatina y heterocromatina

Dematteis Massimiliano

19 04052018 Mitosis Ciclo celular Descripcioacuten detallada de la mitosis

Consecuencias geneacuteticas Aparato mitoacutetico en ceacutelulas

vegetales y animales Cinetocoros Citocinesis

Dematteis Massimiliano

20 09052018 Aspectos moleculares Control del ciclo celular

Proteiacutenas reguladoras

Dematteis Massimiliano

21 11052018 Segundo Parcial Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 8

22 16052018 Meiosis y Reproduccioacuten Sexual Descripcioacuten detallada de

la meiosis Consecuencias geneacuteticas Recombinacioacuten

Metabolismo del ADN en la meiosis

Dematteis Massimiliano

23 18052018 Recombinacioacuten a nivel molecular Estructura de la

cromatina en espermatozoides Dominio fiacutesico de los

pronuacutecleos masculino y femenino en las primeras ceacutelulas

del embrioacuten

Dematteis Massimiliano

24 23052018 El material geneacutetico en accioacuten Funcioacuten del ADN Tipos

de ARN estructura funcioacuten y transcripcioacuten Siacutentesis

regulacioacuten y maduracioacuten de los ARN Composicioacuten del

nucleacuteolo

Dematteis Massimiliano

25 25052018 Feriado Dematteis Massimiliano

26 30052018 Coacutedigo geneacutetico Siacutentesis de proteiacutenas Traduccioacuten del

ARN mensajero Ribosomas en procariotas y eucariotas

Ensamblaje de los ribosomas

Dematteis Massimiliano

27 01062018 Estructura proteica Siacutentesis de proteiacutenas citosoacutelicas y

membranosas

Dematteis Massimiliano

28 13062018 Tercer Parcial Dematteis Massimiliano

Clases Praacutecticas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 16032018 Praacutectico Nordm 1 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

2 21032018 Praacutectico Nordm 2 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

3 23032018 Praacutectico Nordm 3

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

4 28032018 Praacutectico Nordm 4 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

5 30032018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

6 04042018 Praacutectico Nordm 5 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

7 06042018 Praacutectico Nordm 6

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

8 11042018 Praacutectico Nordm 7

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

9 13042018 Primer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

10 18042018 Praacutectico Nordm 8 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

11 20042018 Recuperatorio Primer Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

12 25042018 Praacutectico Nordm 9 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

13 27042018 Praacutectico Nordm 10 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

14 02052018 Praacutectico Nordm 11 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

15 04052018 Praacutectico Nordm 12

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

16 09052018 Praacutectico Nordm 13 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

17 11052018 Segundo Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

18 16052018 Praacutectico Nordm 14 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

19 18052018 Recuperatorio Segundo Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Biologiacutea Celular y Molecular 9

Angulo Mariacutea Betiana

20 23052018 Praacutectico Nordm 15 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

21 25052018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

22 30052018 Praacutectico Nordm 16 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

23 01062018 Praacutectico Nordm 17 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

24 06062018 Praacutectico Ndeg 18 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

25 13062018 Tercer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

Parciales

Actividad Fecha Horario Docente responsable

1ordm Examen parcial 13042018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 1ordm examen parcial 20042018 17-19 Dematteis Massimiliano

2ordm Examen parcial 11052018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 2ordm examen parcial 18052018 17-19 Dematteis Massimiliano

3ordm Examen parcial 13062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 3ordm examen parcial 22062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio Extraordinario 29062018 15-17 Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 10

TRABAJOS PRAacuteCTICOS

Biologiacutea Celular y Molecular 11

Trabajo Praacutectico Nordm 1

MICROSCOPIacuteA OacutePTICA Y ELECTROacuteNICA

El microscopio oacuteptico o fotoacutenico de campo claro estaacute compuesto por una parte

mecaacutenica o estativo y por un sistema oacuteptico que incluye fuente de luz condensador

diafragma objetivos y oculares a traveacutes de los cuales se refractan los rayos luminosos

provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamantildeo

invertida y virtual Para ello el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente

contraste para poder discriminar sus componentes La transparencia se logra mediante la

realizacioacuten de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos

celulares El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o

por medio de sistemas oacutepticos particulares (por ejemplo microscopio de contraste de fases)

El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de ceacutelulas y tejidos

previamente fijados (muertos) y coloreados La coloracioacuten de las preparaciones cito-

histoloacutegicas tiene por finalidad provocar la absorcioacuten diferencial de luz con el propoacutesito de

visualizar las diversas estructuras en distintos colores Por el contrario para estudiar ceacutelulas u

organismos vivos que no se pueden colorear es necesario recurrir casi siempre a otros

sistemas oacutepticos especiales como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de

interferencia En estos dos casos se aprovecha una caracteriacutestica propia de los diferentes

componentes celulares que aunque son transparentes a la luz poseen densidades relativas

distintas

Existen baacutesicamente dos tipos de microscopio electroacutenico el microscopio electroacutenico

de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electroacutenico de transferencia (MET)

Estos microscopios a diferencia del microscopio oacuteptico forman imaacutegenes a partir de una

radiacioacuten de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes

que funcionan como lentes

Otra de las caracteriacutesticas es que proporcionan una resolucioacuten mayor que el

microscopio oacuteptico requieren de procedimientos maacutes elaborados para la preparacioacuten del

material y soacutelo se pueden examinar ceacutelulas deshidratadas y muertas El MET se utiliza

ampliamente para examinar la estructura interna de la ceacutelula mientras que el MEB examina

con detalle la superficie de las muestras las cuales se observan tridimensional mente debido a

la profundidad de foco que posee este uacuteltimo tipo de microscopio Tanto el MET como el

MEB son indispensables para el estudio de la biologiacutea celular y molecular

El microscopio electroacutenico de transmisioacuten es un microscopio que utiliza un haz de

electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio

oacuteptico estaacute limitada por la longitud de onda de la luz visible Debido a que los electrones

tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho

maacutes pequentildeas tiene un liacutemite de resolucioacuten de cerca de 2 nm Un MET mira ceacutelulas muertas

despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de metales pesados Las partes principales

de un microscopio electroacutenico son

Cantildeoacuten de electrones que emite los electrones que chocan contra el espeacutecimen

creando una imagen aumentada

Lentes magneacuteticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones ya

que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios oacutepticos no funcionan con

los electrones

Sistema de vaciacuteo es una parte muy importante del microscopio electroacutenico Debido a

que los electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire se debe hacer un

vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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179 436-441

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 3

4 Membrana Celular Composicioacuten molecular de las membranas bioloacutegicas Modelos de

membranas Propiedades de las membranas Diferenciaciones de la membrana

Interacciones de las ceacutelulas entre siacute y con las matrices extracelulares Cubiertas externas

5 Transporte a traveacutes de la membrana Permeabilidad de la membrana Transporte activo

y pasivo Difusioacuten simple y facilitada Osmosis Transporte de Iones y macromoleacuteculas

Bombas o ATPasas Proteiacutenas transportadoras

6 Citosol o Matriz citoplasmaacutetica Citoesqueleto caracteriacutesticas generales y organizacioacuten

Microtuacutebulos Organoides microtubulares Microfilamentos Filamentos intermedios

Movimiento de las ceacutelulas Cilios y flagelos

7 Organelos citoplasmaacuteticos Organelos membranosos y no membranosos Retiacuteculo

endoplasmaacutetico liso y rugoso Aparato de Golgi Ribosomas Vesiacuteculas con cubierta

Lisosomas Peroxisomas Descripcioacuten y funciones Endocitosis especiacutefica e inespeciacutefica

Fagocitosis

8 Mitocondrias Aspectos generales Membrana interna y externa Transporte Composicioacuten

y estructura molecular de las membranas Acople de la cadena respiratoria Fosforilacioacuten

oxidativa

9 La ceacutelula vegetal Morfologiacutea y fisiologiacutea Pared celular composicioacuten y estructura

Interaccioacuten y comunicacioacuten entre ceacutelulas vegetales Organizacioacuten interna Plaacutestidos

Vacuolas Cloroplastos modelos estructurales y metabolismo Fotosiacutentesis

10 Nuacutecleo interfaacutesico Descripcioacuten general Envoltura nuclear Las bases quiacutemicas de la

herencia Estructura del ADN Modelo de Watson y Crick Cromatina Nucleosomas

Empaquetamiento Proteiacutenas histoacutenicas y no histoacutenicas Replicacioacuten del ADN

Cromosomas morfologiacutea y estructura Eucromatina y heterocromatina

11 Mitosis Ciclo celular Descripcioacuten detallada de la mitosis Consecuencias geneacuteticas

Aspectos moleculares Aparato mitoacutetico en ceacutelulas vegetales y animales Cinetocoros

Citocinesis Control del ciclo celular Proteiacutenas reguladoras

12 Meiosis y Reproduccioacuten Sexual Descripcioacuten detallada de la meiosis Consecuencias

geneacuteticas Recombinacioacuten Metabolismo del ADN en la meiosis Recombinacioacuten a nivel

molecular Estructura de la cromatina en espermatozoides Dominio fiacutesico de los

pronuacutecleos masculino y femenino en las primeras ceacutelulas del embrioacuten

13 El material geneacutetico en accioacuten Funcioacuten del ADN Tipos de ARN estructura funcioacuten y

transcripcioacuten Siacutentesis regulacioacuten y maduracioacuten de los ARN Composicioacuten del nucleacuteolo

14 Coacutedigo geneacutetico Siacutentesis de proteiacutenas Traduccioacuten del ARN mensajero Ribosomas en

procariotas y eucariotas Ensamblaje de los ribosomas Estructura proteica Siacutentesis de

proteiacutenas citosoacutelicas y membranosas

IV Bibliografiacutea General

Alberts B A Johnson J Lewis M Raff K Roberts amp P Walter 2004 Biologiacutea Molecular

de la Ceacutelula 4ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona (2)

Alberts B D Bray K Hopkin A Johnson J Lewis M Raff K Roberts amp P Walter

2007 Introduccion a la Biologiacutea Molecular 2ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana

Buenos Aires (6)

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires (1)

Karp G 1998 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico (2)

Karp G 2005 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico (3)

Biologiacutea Celular y Molecular 4

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordm edicioacuten Ed Panamericana Buenos Aires (2)

Lodish H A Berk P Matsudaira C A Kaiser M Krieger M P Scott S Zipursky S

Lawrence amp J Darnell 2008 Biologiacutea Celular y Molecular 5ordm edicioacuten Ed

Panamericana Buenos Aires (7)

Purves W K D Sadava G H Orians amp H C Heller 2006 Vida la ciencia de la biologiacutea

6ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires (6)

V Bibliografiacutea Especiacutefica

Beadle G W 1961 Las bases fiacutesicas y quiacutemicas de la herencia Ed Eudeba Buenos Aires

Bianchi N O 1978 Duplicacioacuten cromosoacutemica y heterocromatina a nivel molecular

citoloacutegico OEA Serie de Biologiacutea Monografiacutea Nordm 19

Burns G W 1983 The science of genetics An introduction to heredity Ed Macmillan amp

Co New York

Gardner E J M J Simmons amp D P Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed

Limusa-Wiley Meacutexico

Griffiths A J F J H Miller D T Suzuki R C Lewontin amp W M Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena J R 1988 Geneacutetica Ed Agesa Madrid

Lacadena J R 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Sanchez-Monge E amp N Jouve 1989 Geneacutetica Ed Omega Barcelona

Sinnott E W Dunn L C amp T Dobzhansky 1961 Principios de Geneacutetica Ed Omega

Barcelona

Stern C 1963 Principios de geneacutetica humana Ed El Ateneo Buenos Aires

Strickberger M W 1978 Geneacutetica 2ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Thompson J S amp M W Thompson 1977 Geneacutetica humana Ed Salvat Buenos Aires

VI Programa de Examen

Bolilla Temas

1 1 11 14

2 2 12 13

3 3 12 14

4 4 11 13

5 5 7 10

6 2 6 9

7 5 7 8

8 1 6 8

9 2 4 9

10 1 2 10

Biologiacutea Celular y Molecular 5

B ORGANIZACIOacuteN DE LA ASIGNATURA

I Personal Docente

Profesor Titular

Dr Massimiliano Dematteis

Jefe de Trabajos Praacutecticos

Dra Mariacutea de las Mercedes Sosa

Dra Mariacutea Betiana Angulo

Auxiliar de Primera Adscripto

Dra Gabriela Elizabeth Farco

Dra Gisela Mariel Via do Pico

Auxiliares de Segunda

Carina Daniela Elena

Roxana Soledad Molina

II Caracteriacutesticas Generales

El curso comprende la realizacioacuten de clases teoacutericas y praacutecticas realizaacutendose 3

evaluaciones parciales con sus respectivos recuperatorios y un recuperatorio extraordinario

III Clases Teoacutericas

Las clases teoacutericas estaacuten destinadas al conjunto de los alumnos y constituyen una

actividad no obligatoria doacutende se desarrollan los aspectos fundamentales y la orientacioacuten

general de la materia Para facilitar la comprensioacuten de los contenidos desarrollados durante las

clases teoacutericas es importante la lectura o estudio previo de los temas dictados

IV Clases Praacutecticas

Las praacutecticas de laboratorio o trabajos praacutecticos son una actividad obligatoria para

todos los alumnos inscriptos y se desarrollan dos veces por semana guiados por uno o maacutes

auxiliares de docencia Las bases conceptuales de los temas de los trabajos praacutecticos son

desarrolladas previamente en las clases teoacutericas Para poder integrar los conocimientos

teoacutericos y praacutecticos que conduzcan a la comprensioacuten global de la materia es imprescindible

que los alumnos concurran a los trabajos praacutecticos habiendo estudiado o preparado

previamente el tema a desarrollar

Las clases tendraacuten una duracioacuten aproximada de 2 horas aunque ocasionalmente

algunos praacutecticos puedan demandar mayor o menor cantidad de tiempo Los temas a

desarrollar en los praacutecticos asiacute como los materiales necesarios y actividades se detallan en la

guiacutea de trabajos praacutecticos Al final de cada praacutectico en la guiacutea de actividades praacutecticas se

incluyen referencias bibliograacuteficas a las que el alumno podraacute recurrir para aclarar conceptos o

estudiar el tema Para cada clase praacutectica el alumno deberaacute concurrir conociendo la finalidad

del trabajo y trayendo la guiacutea de trabajos praacutecticos y los materiales necesarios mencionados

en la misma Se recomienda el uso de guardapolvo o chaquetilla durante los praacutecticos pero su

empleo no es obligatorio

La realizacioacuten de cada trabajo praacutectico implica la comprensioacuten de los principios

Biologiacutea Celular y Molecular 6

teoacutericos del fenoacutemeno en estudio el adiestramiento manual del alumno la praacutectica en el

manejo instrumental y entrenamiento en la presentacioacuten de datos e interpretacioacuten de

resultados Al finalizar cada trabajo praacutectico el alumno deberaacute entregar en forma individual

las actividades realizadas durante la clase para su evaluacioacuten (ilustraciones respuestas del

cuestionario problemas resueltos etc) Si dicho informe se presenta en estado deficiente o

incompleto se consideraraacute que no ha cumplido con la clase praacutectica Igualmente cuando el

alumno se encuentre ajeno al trabajo sea por ignorar los fundamentos teoacutericos o por

permanecer inactivo en la praacutectica se consideraraacute que no ha cumplido esa clase praacutectica

V Evaluaciones

Estaraacuten destinadas a determinar el grado de comprensioacuten de los diferentes temas por

parte de los alumnos y evaluar el grado en que los objetivos propuestos por la asignatura se

cumplen

a- Evaluaciones de las Actividades Praacutecticas tienen como objetivo determinar si el grado

de comprensioacuten de los fundamentos del tema es satisfactorio y verificar si el alumno es capaz

de aplicar dichos conocimientos en la resolucioacuten de problemas hipoteacutetico-deductivos La

evaluacioacuten de las mismas se realizaraacute a partir de los trabajos o problemas realizados por los

alumnos que seraacuten entregados al finalizar cada clase

b- Evaluaciones Parciales se realizaraacuten tres evaluaciones parciales que comprenderaacuten

temas estrechamente relacionados cuya comprensioacuten es fundamental para la correcta

asimilacioacuten de los temas posteriores Los parciales tendraacuten como objetivo fundamental

evaluar la capacidad de anaacutelisis y de las diferentes situaciones que pudieran plantearse Todos

los parciales se desarrollaraacuten por escrito Los mismos se consideraraacuten aprobados con una

calificacioacuten de 6 (seis) o superior Dentro de los 7 diacuteas posteriores a cada evaluacioacuten se

realizaraacute el recuperatorio correspondiente el cual tendraacute modalidad escrito y con preguntas a

desarrollar

VI Regularizacioacuten de la Asignatura

Seraacuten considerados alumnos regulares los que cumplieran con las siguientes

exigencias

a) Alcanzar el 75 de asistencia en las clases praacutecticas

b) Aprobar el 75 de las clases praacutecticas

c) Aprobar el 100 de las evaluaciones parciales con calificacioacuten 6 (seis) o superior

Los alumnos que no alcanzaran al 75 de aprobacioacuten de las clases praacutecticas o no

aprobaran los parciales con un miacutenimo de 6 (seis) seraacuten considerados alumnos libres

VII Horarios de Consultas

Las consultas que quieran realizar los alumnos tanto sobre temas teoacutericos como

praacutecticos las deberaacuten efectuar al Profesor responsable de la asignatura los diacuteas mieacutercoles y

viernes de 14 a 15 hs previos al inicio de las clases teoacutericas Cualquier duda que surgiera los

diacuteas restantes las consultas podraacuten ser realizadas en el Instituto de Botaacutenica del Nordeste

Sargento Cabral 2131 de 8 a 10 hs

Biologiacutea Celular y Molecular 7

VII Cronograma de Actividades

Clases teoacutericas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 09032018 Introduccioacuten al estudio de la biologiacutea celular La biologiacutea

celular dentro de las ciencias bioloacutegicas Historia e

importancia de su conocimiento

Dematteis Massimiliano

2 14032018 Meacutetodos de estudio en biologiacutea celular Anaacutelisis de la

estructura y ultraestructura celular Microscopiacutea oacuteptica y

electroacutenica

Dematteis Massimiliano

3 16032018 Fraccionamiento celular Cromatografiacutea Electroforesis

Cultivo de tejidos Ultracentrifugacioacuten Histoquiacutemica

Inmunohistoquiacutemica Autorradiografiacutea

Inmunofluorescencia

Dematteis Massimiliano

4 21032018 Teoriacutea celular Ceacutelulas procariotas y eucariotas

Caracteriacutesticas de las ceacutelulas vegetales y animales

Morfologiacutea y fisiologiacutea de las ceacutelulas Envejecimiento

degeneracioacuten y muerte de las ceacutelulas

Dematteis Massimiliano

5 23032018 Membrana Celular Composicioacuten molecular de las

membranas bioloacutegicas Modelos de membranas

Propiedades de las membranas

Dematteis Massimiliano

6 28032018 Diferenciaciones de la membrana Interacciones de las

ceacutelulas entre siacute y con las matrices extracelulares

Cubiertas externas

Dematteis Massimiliano

7 30032018 Viernes Santo Dematteis Massimiliano

8 04042018 Transporte a traveacutes de la membrana Permeabilidad de la

membrana Transporte activo y pasivo Bombas o

ATPasas Proteiacutenas transportadoras

Dematteis Massimiliano

10 06042018 Citosol o Matriz citoplasmaacutetica Citoesqueleto

caracteriacutesticas generales y organizacioacuten Microtuacutebulos

Organoides microtubulares Microfilamentos Filamentos

intermedios Movimiento de las ceacutelulas Cilios y flagelos

Dematteis Massimiliano

12 11042018 Organelos citoplasmaacuteticos Organelos membranosos y no

membranosos Retiacuteculo endoplasmaacutetico liso y rugoso

Aparato de Golgi

Dematteis Massimiliano

13 13042018 Primer parcial Dematteis Massimiliano

14 18042018 Ribosomas Vesiacuteculas con cubierta Lisosomas

Peroxisomas Descripcioacuten y funciones Endocitosis

especiacutefica e inespeciacutefica Fagocitosis

Dematteis Massimiliano

15 20042018 Mitocondrias Aspectos generales Membrana interna y

externa Transporte Composicioacuten y estructura molecular

de las membranas Acople de la cadena respiratoria

Fosforilacioacuten oxidativa

Dematteis Massimiliano

16 25042018 La ceacutelula vegetal Morfologiacutea y fisiologiacutea Pared celular

composicioacuten y estructura Organizacioacuten interna Plaacutestidos

Vacuolas Cloroplastos

Dematteis Massimiliano

17 27052018 Nuacutecleo interfaacutesico Descripcioacuten general Envoltura

nuclear Las bases quiacutemicas de la herencia Estructura

del ADN Modelo de Watson y Crick

Dematteis Massimiliano

18 02052018 Cromatina Nucleosomas Empaquetamiento Proteiacutenas

histoacutenicas y no histoacutenicas Replicacioacuten del ADN

Cromosomas Eucromatina y heterocromatina

Dematteis Massimiliano

19 04052018 Mitosis Ciclo celular Descripcioacuten detallada de la mitosis

Consecuencias geneacuteticas Aparato mitoacutetico en ceacutelulas

vegetales y animales Cinetocoros Citocinesis

Dematteis Massimiliano

20 09052018 Aspectos moleculares Control del ciclo celular

Proteiacutenas reguladoras

Dematteis Massimiliano

21 11052018 Segundo Parcial Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 8

22 16052018 Meiosis y Reproduccioacuten Sexual Descripcioacuten detallada de

la meiosis Consecuencias geneacuteticas Recombinacioacuten

Metabolismo del ADN en la meiosis

Dematteis Massimiliano

23 18052018 Recombinacioacuten a nivel molecular Estructura de la

cromatina en espermatozoides Dominio fiacutesico de los

pronuacutecleos masculino y femenino en las primeras ceacutelulas

del embrioacuten

Dematteis Massimiliano

24 23052018 El material geneacutetico en accioacuten Funcioacuten del ADN Tipos

de ARN estructura funcioacuten y transcripcioacuten Siacutentesis

regulacioacuten y maduracioacuten de los ARN Composicioacuten del

nucleacuteolo

Dematteis Massimiliano

25 25052018 Feriado Dematteis Massimiliano

26 30052018 Coacutedigo geneacutetico Siacutentesis de proteiacutenas Traduccioacuten del

ARN mensajero Ribosomas en procariotas y eucariotas

Ensamblaje de los ribosomas

Dematteis Massimiliano

27 01062018 Estructura proteica Siacutentesis de proteiacutenas citosoacutelicas y

membranosas

Dematteis Massimiliano

28 13062018 Tercer Parcial Dematteis Massimiliano

Clases Praacutecticas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 16032018 Praacutectico Nordm 1 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

2 21032018 Praacutectico Nordm 2 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

3 23032018 Praacutectico Nordm 3

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

4 28032018 Praacutectico Nordm 4 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

5 30032018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

6 04042018 Praacutectico Nordm 5 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

7 06042018 Praacutectico Nordm 6

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

8 11042018 Praacutectico Nordm 7

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

9 13042018 Primer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

10 18042018 Praacutectico Nordm 8 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

11 20042018 Recuperatorio Primer Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

12 25042018 Praacutectico Nordm 9 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

13 27042018 Praacutectico Nordm 10 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

14 02052018 Praacutectico Nordm 11 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

15 04052018 Praacutectico Nordm 12

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

16 09052018 Praacutectico Nordm 13 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

17 11052018 Segundo Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

18 16052018 Praacutectico Nordm 14 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

19 18052018 Recuperatorio Segundo Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Biologiacutea Celular y Molecular 9

Angulo Mariacutea Betiana

20 23052018 Praacutectico Nordm 15 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

21 25052018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

22 30052018 Praacutectico Nordm 16 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

23 01062018 Praacutectico Nordm 17 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

24 06062018 Praacutectico Ndeg 18 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

25 13062018 Tercer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

Parciales

Actividad Fecha Horario Docente responsable

1ordm Examen parcial 13042018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 1ordm examen parcial 20042018 17-19 Dematteis Massimiliano

2ordm Examen parcial 11052018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 2ordm examen parcial 18052018 17-19 Dematteis Massimiliano

3ordm Examen parcial 13062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 3ordm examen parcial 22062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio Extraordinario 29062018 15-17 Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 10

TRABAJOS PRAacuteCTICOS

Biologiacutea Celular y Molecular 11

Trabajo Praacutectico Nordm 1

MICROSCOPIacuteA OacutePTICA Y ELECTROacuteNICA

El microscopio oacuteptico o fotoacutenico de campo claro estaacute compuesto por una parte

mecaacutenica o estativo y por un sistema oacuteptico que incluye fuente de luz condensador

diafragma objetivos y oculares a traveacutes de los cuales se refractan los rayos luminosos

provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamantildeo

invertida y virtual Para ello el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente

contraste para poder discriminar sus componentes La transparencia se logra mediante la

realizacioacuten de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos

celulares El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o

por medio de sistemas oacutepticos particulares (por ejemplo microscopio de contraste de fases)

El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de ceacutelulas y tejidos

previamente fijados (muertos) y coloreados La coloracioacuten de las preparaciones cito-

histoloacutegicas tiene por finalidad provocar la absorcioacuten diferencial de luz con el propoacutesito de

visualizar las diversas estructuras en distintos colores Por el contrario para estudiar ceacutelulas u

organismos vivos que no se pueden colorear es necesario recurrir casi siempre a otros

sistemas oacutepticos especiales como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de

interferencia En estos dos casos se aprovecha una caracteriacutestica propia de los diferentes

componentes celulares que aunque son transparentes a la luz poseen densidades relativas

distintas

Existen baacutesicamente dos tipos de microscopio electroacutenico el microscopio electroacutenico

de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electroacutenico de transferencia (MET)

Estos microscopios a diferencia del microscopio oacuteptico forman imaacutegenes a partir de una

radiacioacuten de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes

que funcionan como lentes

Otra de las caracteriacutesticas es que proporcionan una resolucioacuten mayor que el

microscopio oacuteptico requieren de procedimientos maacutes elaborados para la preparacioacuten del

material y soacutelo se pueden examinar ceacutelulas deshidratadas y muertas El MET se utiliza

ampliamente para examinar la estructura interna de la ceacutelula mientras que el MEB examina

con detalle la superficie de las muestras las cuales se observan tridimensional mente debido a

la profundidad de foco que posee este uacuteltimo tipo de microscopio Tanto el MET como el

MEB son indispensables para el estudio de la biologiacutea celular y molecular

El microscopio electroacutenico de transmisioacuten es un microscopio que utiliza un haz de

electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio

oacuteptico estaacute limitada por la longitud de onda de la luz visible Debido a que los electrones

tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho

maacutes pequentildeas tiene un liacutemite de resolucioacuten de cerca de 2 nm Un MET mira ceacutelulas muertas

despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de metales pesados Las partes principales

de un microscopio electroacutenico son

Cantildeoacuten de electrones que emite los electrones que chocan contra el espeacutecimen

creando una imagen aumentada

Lentes magneacuteticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones ya

que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios oacutepticos no funcionan con

los electrones

Sistema de vaciacuteo es una parte muy importante del microscopio electroacutenico Debido a

que los electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire se debe hacer un

vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Ed Omega

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 4

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordm edicioacuten Ed Panamericana Buenos Aires (2)

Lodish H A Berk P Matsudaira C A Kaiser M Krieger M P Scott S Zipursky S

Lawrence amp J Darnell 2008 Biologiacutea Celular y Molecular 5ordm edicioacuten Ed

Panamericana Buenos Aires (7)

Purves W K D Sadava G H Orians amp H C Heller 2006 Vida la ciencia de la biologiacutea

6ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires (6)

V Bibliografiacutea Especiacutefica

Beadle G W 1961 Las bases fiacutesicas y quiacutemicas de la herencia Ed Eudeba Buenos Aires

Bianchi N O 1978 Duplicacioacuten cromosoacutemica y heterocromatina a nivel molecular

citoloacutegico OEA Serie de Biologiacutea Monografiacutea Nordm 19

Burns G W 1983 The science of genetics An introduction to heredity Ed Macmillan amp

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Gardner E J M J Simmons amp D P Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed

Limusa-Wiley Meacutexico

Griffiths A J F J H Miller D T Suzuki R C Lewontin amp W M Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena J R 1988 Geneacutetica Ed Agesa Madrid

Lacadena J R 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Sanchez-Monge E amp N Jouve 1989 Geneacutetica Ed Omega Barcelona

Sinnott E W Dunn L C amp T Dobzhansky 1961 Principios de Geneacutetica Ed Omega

Barcelona

Stern C 1963 Principios de geneacutetica humana Ed El Ateneo Buenos Aires

Strickberger M W 1978 Geneacutetica 2ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Thompson J S amp M W Thompson 1977 Geneacutetica humana Ed Salvat Buenos Aires

VI Programa de Examen

Bolilla Temas

1 1 11 14

2 2 12 13

3 3 12 14

4 4 11 13

5 5 7 10

6 2 6 9

7 5 7 8

8 1 6 8

9 2 4 9

10 1 2 10

Biologiacutea Celular y Molecular 5

B ORGANIZACIOacuteN DE LA ASIGNATURA

I Personal Docente

Profesor Titular

Dr Massimiliano Dematteis

Jefe de Trabajos Praacutecticos

Dra Mariacutea de las Mercedes Sosa

Dra Mariacutea Betiana Angulo

Auxiliar de Primera Adscripto

Dra Gabriela Elizabeth Farco

Dra Gisela Mariel Via do Pico

Auxiliares de Segunda

Carina Daniela Elena

Roxana Soledad Molina

II Caracteriacutesticas Generales

El curso comprende la realizacioacuten de clases teoacutericas y praacutecticas realizaacutendose 3

evaluaciones parciales con sus respectivos recuperatorios y un recuperatorio extraordinario

III Clases Teoacutericas

Las clases teoacutericas estaacuten destinadas al conjunto de los alumnos y constituyen una

actividad no obligatoria doacutende se desarrollan los aspectos fundamentales y la orientacioacuten

general de la materia Para facilitar la comprensioacuten de los contenidos desarrollados durante las

clases teoacutericas es importante la lectura o estudio previo de los temas dictados

IV Clases Praacutecticas

Las praacutecticas de laboratorio o trabajos praacutecticos son una actividad obligatoria para

todos los alumnos inscriptos y se desarrollan dos veces por semana guiados por uno o maacutes

auxiliares de docencia Las bases conceptuales de los temas de los trabajos praacutecticos son

desarrolladas previamente en las clases teoacutericas Para poder integrar los conocimientos

teoacutericos y praacutecticos que conduzcan a la comprensioacuten global de la materia es imprescindible

que los alumnos concurran a los trabajos praacutecticos habiendo estudiado o preparado

previamente el tema a desarrollar

Las clases tendraacuten una duracioacuten aproximada de 2 horas aunque ocasionalmente

algunos praacutecticos puedan demandar mayor o menor cantidad de tiempo Los temas a

desarrollar en los praacutecticos asiacute como los materiales necesarios y actividades se detallan en la

guiacutea de trabajos praacutecticos Al final de cada praacutectico en la guiacutea de actividades praacutecticas se

incluyen referencias bibliograacuteficas a las que el alumno podraacute recurrir para aclarar conceptos o

estudiar el tema Para cada clase praacutectica el alumno deberaacute concurrir conociendo la finalidad

del trabajo y trayendo la guiacutea de trabajos praacutecticos y los materiales necesarios mencionados

en la misma Se recomienda el uso de guardapolvo o chaquetilla durante los praacutecticos pero su

empleo no es obligatorio

La realizacioacuten de cada trabajo praacutectico implica la comprensioacuten de los principios

Biologiacutea Celular y Molecular 6

teoacutericos del fenoacutemeno en estudio el adiestramiento manual del alumno la praacutectica en el

manejo instrumental y entrenamiento en la presentacioacuten de datos e interpretacioacuten de

resultados Al finalizar cada trabajo praacutectico el alumno deberaacute entregar en forma individual

las actividades realizadas durante la clase para su evaluacioacuten (ilustraciones respuestas del

cuestionario problemas resueltos etc) Si dicho informe se presenta en estado deficiente o

incompleto se consideraraacute que no ha cumplido con la clase praacutectica Igualmente cuando el

alumno se encuentre ajeno al trabajo sea por ignorar los fundamentos teoacutericos o por

permanecer inactivo en la praacutectica se consideraraacute que no ha cumplido esa clase praacutectica

V Evaluaciones

Estaraacuten destinadas a determinar el grado de comprensioacuten de los diferentes temas por

parte de los alumnos y evaluar el grado en que los objetivos propuestos por la asignatura se

cumplen

a- Evaluaciones de las Actividades Praacutecticas tienen como objetivo determinar si el grado

de comprensioacuten de los fundamentos del tema es satisfactorio y verificar si el alumno es capaz

de aplicar dichos conocimientos en la resolucioacuten de problemas hipoteacutetico-deductivos La

evaluacioacuten de las mismas se realizaraacute a partir de los trabajos o problemas realizados por los

alumnos que seraacuten entregados al finalizar cada clase

b- Evaluaciones Parciales se realizaraacuten tres evaluaciones parciales que comprenderaacuten

temas estrechamente relacionados cuya comprensioacuten es fundamental para la correcta

asimilacioacuten de los temas posteriores Los parciales tendraacuten como objetivo fundamental

evaluar la capacidad de anaacutelisis y de las diferentes situaciones que pudieran plantearse Todos

los parciales se desarrollaraacuten por escrito Los mismos se consideraraacuten aprobados con una

calificacioacuten de 6 (seis) o superior Dentro de los 7 diacuteas posteriores a cada evaluacioacuten se

realizaraacute el recuperatorio correspondiente el cual tendraacute modalidad escrito y con preguntas a

desarrollar

VI Regularizacioacuten de la Asignatura

Seraacuten considerados alumnos regulares los que cumplieran con las siguientes

exigencias

a) Alcanzar el 75 de asistencia en las clases praacutecticas

b) Aprobar el 75 de las clases praacutecticas

c) Aprobar el 100 de las evaluaciones parciales con calificacioacuten 6 (seis) o superior

Los alumnos que no alcanzaran al 75 de aprobacioacuten de las clases praacutecticas o no

aprobaran los parciales con un miacutenimo de 6 (seis) seraacuten considerados alumnos libres

VII Horarios de Consultas

Las consultas que quieran realizar los alumnos tanto sobre temas teoacutericos como

praacutecticos las deberaacuten efectuar al Profesor responsable de la asignatura los diacuteas mieacutercoles y

viernes de 14 a 15 hs previos al inicio de las clases teoacutericas Cualquier duda que surgiera los

diacuteas restantes las consultas podraacuten ser realizadas en el Instituto de Botaacutenica del Nordeste

Sargento Cabral 2131 de 8 a 10 hs

Biologiacutea Celular y Molecular 7

VII Cronograma de Actividades

Clases teoacutericas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 09032018 Introduccioacuten al estudio de la biologiacutea celular La biologiacutea

celular dentro de las ciencias bioloacutegicas Historia e

importancia de su conocimiento

Dematteis Massimiliano

2 14032018 Meacutetodos de estudio en biologiacutea celular Anaacutelisis de la

estructura y ultraestructura celular Microscopiacutea oacuteptica y

electroacutenica

Dematteis Massimiliano

3 16032018 Fraccionamiento celular Cromatografiacutea Electroforesis

Cultivo de tejidos Ultracentrifugacioacuten Histoquiacutemica

Inmunohistoquiacutemica Autorradiografiacutea

Inmunofluorescencia

Dematteis Massimiliano

4 21032018 Teoriacutea celular Ceacutelulas procariotas y eucariotas

Caracteriacutesticas de las ceacutelulas vegetales y animales

Morfologiacutea y fisiologiacutea de las ceacutelulas Envejecimiento

degeneracioacuten y muerte de las ceacutelulas

Dematteis Massimiliano

5 23032018 Membrana Celular Composicioacuten molecular de las

membranas bioloacutegicas Modelos de membranas

Propiedades de las membranas

Dematteis Massimiliano

6 28032018 Diferenciaciones de la membrana Interacciones de las

ceacutelulas entre siacute y con las matrices extracelulares

Cubiertas externas

Dematteis Massimiliano

7 30032018 Viernes Santo Dematteis Massimiliano

8 04042018 Transporte a traveacutes de la membrana Permeabilidad de la

membrana Transporte activo y pasivo Bombas o

ATPasas Proteiacutenas transportadoras

Dematteis Massimiliano

10 06042018 Citosol o Matriz citoplasmaacutetica Citoesqueleto

caracteriacutesticas generales y organizacioacuten Microtuacutebulos

Organoides microtubulares Microfilamentos Filamentos

intermedios Movimiento de las ceacutelulas Cilios y flagelos

Dematteis Massimiliano

12 11042018 Organelos citoplasmaacuteticos Organelos membranosos y no

membranosos Retiacuteculo endoplasmaacutetico liso y rugoso

Aparato de Golgi

Dematteis Massimiliano

13 13042018 Primer parcial Dematteis Massimiliano

14 18042018 Ribosomas Vesiacuteculas con cubierta Lisosomas

Peroxisomas Descripcioacuten y funciones Endocitosis

especiacutefica e inespeciacutefica Fagocitosis

Dematteis Massimiliano

15 20042018 Mitocondrias Aspectos generales Membrana interna y

externa Transporte Composicioacuten y estructura molecular

de las membranas Acople de la cadena respiratoria

Fosforilacioacuten oxidativa

Dematteis Massimiliano

16 25042018 La ceacutelula vegetal Morfologiacutea y fisiologiacutea Pared celular

composicioacuten y estructura Organizacioacuten interna Plaacutestidos

Vacuolas Cloroplastos

Dematteis Massimiliano

17 27052018 Nuacutecleo interfaacutesico Descripcioacuten general Envoltura

nuclear Las bases quiacutemicas de la herencia Estructura

del ADN Modelo de Watson y Crick

Dematteis Massimiliano

18 02052018 Cromatina Nucleosomas Empaquetamiento Proteiacutenas

histoacutenicas y no histoacutenicas Replicacioacuten del ADN

Cromosomas Eucromatina y heterocromatina

Dematteis Massimiliano

19 04052018 Mitosis Ciclo celular Descripcioacuten detallada de la mitosis

Consecuencias geneacuteticas Aparato mitoacutetico en ceacutelulas

vegetales y animales Cinetocoros Citocinesis

Dematteis Massimiliano

20 09052018 Aspectos moleculares Control del ciclo celular

Proteiacutenas reguladoras

Dematteis Massimiliano

21 11052018 Segundo Parcial Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 8

22 16052018 Meiosis y Reproduccioacuten Sexual Descripcioacuten detallada de

la meiosis Consecuencias geneacuteticas Recombinacioacuten

Metabolismo del ADN en la meiosis

Dematteis Massimiliano

23 18052018 Recombinacioacuten a nivel molecular Estructura de la

cromatina en espermatozoides Dominio fiacutesico de los

pronuacutecleos masculino y femenino en las primeras ceacutelulas

del embrioacuten

Dematteis Massimiliano

24 23052018 El material geneacutetico en accioacuten Funcioacuten del ADN Tipos

de ARN estructura funcioacuten y transcripcioacuten Siacutentesis

regulacioacuten y maduracioacuten de los ARN Composicioacuten del

nucleacuteolo

Dematteis Massimiliano

25 25052018 Feriado Dematteis Massimiliano

26 30052018 Coacutedigo geneacutetico Siacutentesis de proteiacutenas Traduccioacuten del

ARN mensajero Ribosomas en procariotas y eucariotas

Ensamblaje de los ribosomas

Dematteis Massimiliano

27 01062018 Estructura proteica Siacutentesis de proteiacutenas citosoacutelicas y

membranosas

Dematteis Massimiliano

28 13062018 Tercer Parcial Dematteis Massimiliano

Clases Praacutecticas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 16032018 Praacutectico Nordm 1 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

2 21032018 Praacutectico Nordm 2 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

3 23032018 Praacutectico Nordm 3

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

4 28032018 Praacutectico Nordm 4 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

5 30032018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

6 04042018 Praacutectico Nordm 5 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

7 06042018 Praacutectico Nordm 6

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

8 11042018 Praacutectico Nordm 7

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

9 13042018 Primer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

10 18042018 Praacutectico Nordm 8 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

11 20042018 Recuperatorio Primer Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

12 25042018 Praacutectico Nordm 9 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

13 27042018 Praacutectico Nordm 10 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

14 02052018 Praacutectico Nordm 11 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

15 04052018 Praacutectico Nordm 12

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

16 09052018 Praacutectico Nordm 13 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

17 11052018 Segundo Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

18 16052018 Praacutectico Nordm 14 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

19 18052018 Recuperatorio Segundo Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Biologiacutea Celular y Molecular 9

Angulo Mariacutea Betiana

20 23052018 Praacutectico Nordm 15 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

21 25052018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

22 30052018 Praacutectico Nordm 16 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

23 01062018 Praacutectico Nordm 17 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

24 06062018 Praacutectico Ndeg 18 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

25 13062018 Tercer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

Parciales

Actividad Fecha Horario Docente responsable

1ordm Examen parcial 13042018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 1ordm examen parcial 20042018 17-19 Dematteis Massimiliano

2ordm Examen parcial 11052018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 2ordm examen parcial 18052018 17-19 Dematteis Massimiliano

3ordm Examen parcial 13062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 3ordm examen parcial 22062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio Extraordinario 29062018 15-17 Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 10

TRABAJOS PRAacuteCTICOS

Biologiacutea Celular y Molecular 11

Trabajo Praacutectico Nordm 1

MICROSCOPIacuteA OacutePTICA Y ELECTROacuteNICA

El microscopio oacuteptico o fotoacutenico de campo claro estaacute compuesto por una parte

mecaacutenica o estativo y por un sistema oacuteptico que incluye fuente de luz condensador

diafragma objetivos y oculares a traveacutes de los cuales se refractan los rayos luminosos

provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamantildeo

invertida y virtual Para ello el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente

contraste para poder discriminar sus componentes La transparencia se logra mediante la

realizacioacuten de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos

celulares El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o

por medio de sistemas oacutepticos particulares (por ejemplo microscopio de contraste de fases)

El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de ceacutelulas y tejidos

previamente fijados (muertos) y coloreados La coloracioacuten de las preparaciones cito-

histoloacutegicas tiene por finalidad provocar la absorcioacuten diferencial de luz con el propoacutesito de

visualizar las diversas estructuras en distintos colores Por el contrario para estudiar ceacutelulas u

organismos vivos que no se pueden colorear es necesario recurrir casi siempre a otros

sistemas oacutepticos especiales como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de

interferencia En estos dos casos se aprovecha una caracteriacutestica propia de los diferentes

componentes celulares que aunque son transparentes a la luz poseen densidades relativas

distintas

Existen baacutesicamente dos tipos de microscopio electroacutenico el microscopio electroacutenico

de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electroacutenico de transferencia (MET)

Estos microscopios a diferencia del microscopio oacuteptico forman imaacutegenes a partir de una

radiacioacuten de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes

que funcionan como lentes

Otra de las caracteriacutesticas es que proporcionan una resolucioacuten mayor que el

microscopio oacuteptico requieren de procedimientos maacutes elaborados para la preparacioacuten del

material y soacutelo se pueden examinar ceacutelulas deshidratadas y muertas El MET se utiliza

ampliamente para examinar la estructura interna de la ceacutelula mientras que el MEB examina

con detalle la superficie de las muestras las cuales se observan tridimensional mente debido a

la profundidad de foco que posee este uacuteltimo tipo de microscopio Tanto el MET como el

MEB son indispensables para el estudio de la biologiacutea celular y molecular

El microscopio electroacutenico de transmisioacuten es un microscopio que utiliza un haz de

electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio

oacuteptico estaacute limitada por la longitud de onda de la luz visible Debido a que los electrones

tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho

maacutes pequentildeas tiene un liacutemite de resolucioacuten de cerca de 2 nm Un MET mira ceacutelulas muertas

despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de metales pesados Las partes principales

de un microscopio electroacutenico son

Cantildeoacuten de electrones que emite los electrones que chocan contra el espeacutecimen

creando una imagen aumentada

Lentes magneacuteticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones ya

que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios oacutepticos no funcionan con

los electrones

Sistema de vaciacuteo es una parte muy importante del microscopio electroacutenico Debido a

que los electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire se debe hacer un

vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

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Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 5

B ORGANIZACIOacuteN DE LA ASIGNATURA

I Personal Docente

Profesor Titular

Dr Massimiliano Dematteis

Jefe de Trabajos Praacutecticos

Dra Mariacutea de las Mercedes Sosa

Dra Mariacutea Betiana Angulo

Auxiliar de Primera Adscripto

Dra Gabriela Elizabeth Farco

Dra Gisela Mariel Via do Pico

Auxiliares de Segunda

Carina Daniela Elena

Roxana Soledad Molina

II Caracteriacutesticas Generales

El curso comprende la realizacioacuten de clases teoacutericas y praacutecticas realizaacutendose 3

evaluaciones parciales con sus respectivos recuperatorios y un recuperatorio extraordinario

III Clases Teoacutericas

Las clases teoacutericas estaacuten destinadas al conjunto de los alumnos y constituyen una

actividad no obligatoria doacutende se desarrollan los aspectos fundamentales y la orientacioacuten

general de la materia Para facilitar la comprensioacuten de los contenidos desarrollados durante las

clases teoacutericas es importante la lectura o estudio previo de los temas dictados

IV Clases Praacutecticas

Las praacutecticas de laboratorio o trabajos praacutecticos son una actividad obligatoria para

todos los alumnos inscriptos y se desarrollan dos veces por semana guiados por uno o maacutes

auxiliares de docencia Las bases conceptuales de los temas de los trabajos praacutecticos son

desarrolladas previamente en las clases teoacutericas Para poder integrar los conocimientos

teoacutericos y praacutecticos que conduzcan a la comprensioacuten global de la materia es imprescindible

que los alumnos concurran a los trabajos praacutecticos habiendo estudiado o preparado

previamente el tema a desarrollar

Las clases tendraacuten una duracioacuten aproximada de 2 horas aunque ocasionalmente

algunos praacutecticos puedan demandar mayor o menor cantidad de tiempo Los temas a

desarrollar en los praacutecticos asiacute como los materiales necesarios y actividades se detallan en la

guiacutea de trabajos praacutecticos Al final de cada praacutectico en la guiacutea de actividades praacutecticas se

incluyen referencias bibliograacuteficas a las que el alumno podraacute recurrir para aclarar conceptos o

estudiar el tema Para cada clase praacutectica el alumno deberaacute concurrir conociendo la finalidad

del trabajo y trayendo la guiacutea de trabajos praacutecticos y los materiales necesarios mencionados

en la misma Se recomienda el uso de guardapolvo o chaquetilla durante los praacutecticos pero su

empleo no es obligatorio

La realizacioacuten de cada trabajo praacutectico implica la comprensioacuten de los principios

Biologiacutea Celular y Molecular 6

teoacutericos del fenoacutemeno en estudio el adiestramiento manual del alumno la praacutectica en el

manejo instrumental y entrenamiento en la presentacioacuten de datos e interpretacioacuten de

resultados Al finalizar cada trabajo praacutectico el alumno deberaacute entregar en forma individual

las actividades realizadas durante la clase para su evaluacioacuten (ilustraciones respuestas del

cuestionario problemas resueltos etc) Si dicho informe se presenta en estado deficiente o

incompleto se consideraraacute que no ha cumplido con la clase praacutectica Igualmente cuando el

alumno se encuentre ajeno al trabajo sea por ignorar los fundamentos teoacutericos o por

permanecer inactivo en la praacutectica se consideraraacute que no ha cumplido esa clase praacutectica

V Evaluaciones

Estaraacuten destinadas a determinar el grado de comprensioacuten de los diferentes temas por

parte de los alumnos y evaluar el grado en que los objetivos propuestos por la asignatura se

cumplen

a- Evaluaciones de las Actividades Praacutecticas tienen como objetivo determinar si el grado

de comprensioacuten de los fundamentos del tema es satisfactorio y verificar si el alumno es capaz

de aplicar dichos conocimientos en la resolucioacuten de problemas hipoteacutetico-deductivos La

evaluacioacuten de las mismas se realizaraacute a partir de los trabajos o problemas realizados por los

alumnos que seraacuten entregados al finalizar cada clase

b- Evaluaciones Parciales se realizaraacuten tres evaluaciones parciales que comprenderaacuten

temas estrechamente relacionados cuya comprensioacuten es fundamental para la correcta

asimilacioacuten de los temas posteriores Los parciales tendraacuten como objetivo fundamental

evaluar la capacidad de anaacutelisis y de las diferentes situaciones que pudieran plantearse Todos

los parciales se desarrollaraacuten por escrito Los mismos se consideraraacuten aprobados con una

calificacioacuten de 6 (seis) o superior Dentro de los 7 diacuteas posteriores a cada evaluacioacuten se

realizaraacute el recuperatorio correspondiente el cual tendraacute modalidad escrito y con preguntas a

desarrollar

VI Regularizacioacuten de la Asignatura

Seraacuten considerados alumnos regulares los que cumplieran con las siguientes

exigencias

a) Alcanzar el 75 de asistencia en las clases praacutecticas

b) Aprobar el 75 de las clases praacutecticas

c) Aprobar el 100 de las evaluaciones parciales con calificacioacuten 6 (seis) o superior

Los alumnos que no alcanzaran al 75 de aprobacioacuten de las clases praacutecticas o no

aprobaran los parciales con un miacutenimo de 6 (seis) seraacuten considerados alumnos libres

VII Horarios de Consultas

Las consultas que quieran realizar los alumnos tanto sobre temas teoacutericos como

praacutecticos las deberaacuten efectuar al Profesor responsable de la asignatura los diacuteas mieacutercoles y

viernes de 14 a 15 hs previos al inicio de las clases teoacutericas Cualquier duda que surgiera los

diacuteas restantes las consultas podraacuten ser realizadas en el Instituto de Botaacutenica del Nordeste

Sargento Cabral 2131 de 8 a 10 hs

Biologiacutea Celular y Molecular 7

VII Cronograma de Actividades

Clases teoacutericas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 09032018 Introduccioacuten al estudio de la biologiacutea celular La biologiacutea

celular dentro de las ciencias bioloacutegicas Historia e

importancia de su conocimiento

Dematteis Massimiliano

2 14032018 Meacutetodos de estudio en biologiacutea celular Anaacutelisis de la

estructura y ultraestructura celular Microscopiacutea oacuteptica y

electroacutenica

Dematteis Massimiliano

3 16032018 Fraccionamiento celular Cromatografiacutea Electroforesis

Cultivo de tejidos Ultracentrifugacioacuten Histoquiacutemica

Inmunohistoquiacutemica Autorradiografiacutea

Inmunofluorescencia

Dematteis Massimiliano

4 21032018 Teoriacutea celular Ceacutelulas procariotas y eucariotas

Caracteriacutesticas de las ceacutelulas vegetales y animales

Morfologiacutea y fisiologiacutea de las ceacutelulas Envejecimiento

degeneracioacuten y muerte de las ceacutelulas

Dematteis Massimiliano

5 23032018 Membrana Celular Composicioacuten molecular de las

membranas bioloacutegicas Modelos de membranas

Propiedades de las membranas

Dematteis Massimiliano

6 28032018 Diferenciaciones de la membrana Interacciones de las

ceacutelulas entre siacute y con las matrices extracelulares

Cubiertas externas

Dematteis Massimiliano

7 30032018 Viernes Santo Dematteis Massimiliano

8 04042018 Transporte a traveacutes de la membrana Permeabilidad de la

membrana Transporte activo y pasivo Bombas o

ATPasas Proteiacutenas transportadoras

Dematteis Massimiliano

10 06042018 Citosol o Matriz citoplasmaacutetica Citoesqueleto

caracteriacutesticas generales y organizacioacuten Microtuacutebulos

Organoides microtubulares Microfilamentos Filamentos

intermedios Movimiento de las ceacutelulas Cilios y flagelos

Dematteis Massimiliano

12 11042018 Organelos citoplasmaacuteticos Organelos membranosos y no

membranosos Retiacuteculo endoplasmaacutetico liso y rugoso

Aparato de Golgi

Dematteis Massimiliano

13 13042018 Primer parcial Dematteis Massimiliano

14 18042018 Ribosomas Vesiacuteculas con cubierta Lisosomas

Peroxisomas Descripcioacuten y funciones Endocitosis

especiacutefica e inespeciacutefica Fagocitosis

Dematteis Massimiliano

15 20042018 Mitocondrias Aspectos generales Membrana interna y

externa Transporte Composicioacuten y estructura molecular

de las membranas Acople de la cadena respiratoria

Fosforilacioacuten oxidativa

Dematteis Massimiliano

16 25042018 La ceacutelula vegetal Morfologiacutea y fisiologiacutea Pared celular

composicioacuten y estructura Organizacioacuten interna Plaacutestidos

Vacuolas Cloroplastos

Dematteis Massimiliano

17 27052018 Nuacutecleo interfaacutesico Descripcioacuten general Envoltura

nuclear Las bases quiacutemicas de la herencia Estructura

del ADN Modelo de Watson y Crick

Dematteis Massimiliano

18 02052018 Cromatina Nucleosomas Empaquetamiento Proteiacutenas

histoacutenicas y no histoacutenicas Replicacioacuten del ADN

Cromosomas Eucromatina y heterocromatina

Dematteis Massimiliano

19 04052018 Mitosis Ciclo celular Descripcioacuten detallada de la mitosis

Consecuencias geneacuteticas Aparato mitoacutetico en ceacutelulas

vegetales y animales Cinetocoros Citocinesis

Dematteis Massimiliano

20 09052018 Aspectos moleculares Control del ciclo celular

Proteiacutenas reguladoras

Dematteis Massimiliano

21 11052018 Segundo Parcial Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 8

22 16052018 Meiosis y Reproduccioacuten Sexual Descripcioacuten detallada de

la meiosis Consecuencias geneacuteticas Recombinacioacuten

Metabolismo del ADN en la meiosis

Dematteis Massimiliano

23 18052018 Recombinacioacuten a nivel molecular Estructura de la

cromatina en espermatozoides Dominio fiacutesico de los

pronuacutecleos masculino y femenino en las primeras ceacutelulas

del embrioacuten

Dematteis Massimiliano

24 23052018 El material geneacutetico en accioacuten Funcioacuten del ADN Tipos

de ARN estructura funcioacuten y transcripcioacuten Siacutentesis

regulacioacuten y maduracioacuten de los ARN Composicioacuten del

nucleacuteolo

Dematteis Massimiliano

25 25052018 Feriado Dematteis Massimiliano

26 30052018 Coacutedigo geneacutetico Siacutentesis de proteiacutenas Traduccioacuten del

ARN mensajero Ribosomas en procariotas y eucariotas

Ensamblaje de los ribosomas

Dematteis Massimiliano

27 01062018 Estructura proteica Siacutentesis de proteiacutenas citosoacutelicas y

membranosas

Dematteis Massimiliano

28 13062018 Tercer Parcial Dematteis Massimiliano

Clases Praacutecticas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 16032018 Praacutectico Nordm 1 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

2 21032018 Praacutectico Nordm 2 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

3 23032018 Praacutectico Nordm 3

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

4 28032018 Praacutectico Nordm 4 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

5 30032018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

6 04042018 Praacutectico Nordm 5 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

7 06042018 Praacutectico Nordm 6

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

8 11042018 Praacutectico Nordm 7

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

9 13042018 Primer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

10 18042018 Praacutectico Nordm 8 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

11 20042018 Recuperatorio Primer Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

12 25042018 Praacutectico Nordm 9 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

13 27042018 Praacutectico Nordm 10 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

14 02052018 Praacutectico Nordm 11 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

15 04052018 Praacutectico Nordm 12

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

16 09052018 Praacutectico Nordm 13 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

17 11052018 Segundo Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

18 16052018 Praacutectico Nordm 14 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

19 18052018 Recuperatorio Segundo Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Biologiacutea Celular y Molecular 9

Angulo Mariacutea Betiana

20 23052018 Praacutectico Nordm 15 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

21 25052018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

22 30052018 Praacutectico Nordm 16 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

23 01062018 Praacutectico Nordm 17 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

24 06062018 Praacutectico Ndeg 18 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

25 13062018 Tercer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

Parciales

Actividad Fecha Horario Docente responsable

1ordm Examen parcial 13042018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 1ordm examen parcial 20042018 17-19 Dematteis Massimiliano

2ordm Examen parcial 11052018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 2ordm examen parcial 18052018 17-19 Dematteis Massimiliano

3ordm Examen parcial 13062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 3ordm examen parcial 22062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio Extraordinario 29062018 15-17 Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 10

TRABAJOS PRAacuteCTICOS

Biologiacutea Celular y Molecular 11

Trabajo Praacutectico Nordm 1

MICROSCOPIacuteA OacutePTICA Y ELECTROacuteNICA

El microscopio oacuteptico o fotoacutenico de campo claro estaacute compuesto por una parte

mecaacutenica o estativo y por un sistema oacuteptico que incluye fuente de luz condensador

diafragma objetivos y oculares a traveacutes de los cuales se refractan los rayos luminosos

provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamantildeo

invertida y virtual Para ello el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente

contraste para poder discriminar sus componentes La transparencia se logra mediante la

realizacioacuten de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos

celulares El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o

por medio de sistemas oacutepticos particulares (por ejemplo microscopio de contraste de fases)

El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de ceacutelulas y tejidos

previamente fijados (muertos) y coloreados La coloracioacuten de las preparaciones cito-

histoloacutegicas tiene por finalidad provocar la absorcioacuten diferencial de luz con el propoacutesito de

visualizar las diversas estructuras en distintos colores Por el contrario para estudiar ceacutelulas u

organismos vivos que no se pueden colorear es necesario recurrir casi siempre a otros

sistemas oacutepticos especiales como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de

interferencia En estos dos casos se aprovecha una caracteriacutestica propia de los diferentes

componentes celulares que aunque son transparentes a la luz poseen densidades relativas

distintas

Existen baacutesicamente dos tipos de microscopio electroacutenico el microscopio electroacutenico

de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electroacutenico de transferencia (MET)

Estos microscopios a diferencia del microscopio oacuteptico forman imaacutegenes a partir de una

radiacioacuten de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes

que funcionan como lentes

Otra de las caracteriacutesticas es que proporcionan una resolucioacuten mayor que el

microscopio oacuteptico requieren de procedimientos maacutes elaborados para la preparacioacuten del

material y soacutelo se pueden examinar ceacutelulas deshidratadas y muertas El MET se utiliza

ampliamente para examinar la estructura interna de la ceacutelula mientras que el MEB examina

con detalle la superficie de las muestras las cuales se observan tridimensional mente debido a

la profundidad de foco que posee este uacuteltimo tipo de microscopio Tanto el MET como el

MEB son indispensables para el estudio de la biologiacutea celular y molecular

El microscopio electroacutenico de transmisioacuten es un microscopio que utiliza un haz de

electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio

oacuteptico estaacute limitada por la longitud de onda de la luz visible Debido a que los electrones

tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho

maacutes pequentildeas tiene un liacutemite de resolucioacuten de cerca de 2 nm Un MET mira ceacutelulas muertas

despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de metales pesados Las partes principales

de un microscopio electroacutenico son

Cantildeoacuten de electrones que emite los electrones que chocan contra el espeacutecimen

creando una imagen aumentada

Lentes magneacuteticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones ya

que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios oacutepticos no funcionan con

los electrones

Sistema de vaciacuteo es una parte muy importante del microscopio electroacutenico Debido a

que los electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire se debe hacer un

vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

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Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Biologiacutea Celular y Molecular 52

Buenos Aires

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 6

teoacutericos del fenoacutemeno en estudio el adiestramiento manual del alumno la praacutectica en el

manejo instrumental y entrenamiento en la presentacioacuten de datos e interpretacioacuten de

resultados Al finalizar cada trabajo praacutectico el alumno deberaacute entregar en forma individual

las actividades realizadas durante la clase para su evaluacioacuten (ilustraciones respuestas del

cuestionario problemas resueltos etc) Si dicho informe se presenta en estado deficiente o

incompleto se consideraraacute que no ha cumplido con la clase praacutectica Igualmente cuando el

alumno se encuentre ajeno al trabajo sea por ignorar los fundamentos teoacutericos o por

permanecer inactivo en la praacutectica se consideraraacute que no ha cumplido esa clase praacutectica

V Evaluaciones

Estaraacuten destinadas a determinar el grado de comprensioacuten de los diferentes temas por

parte de los alumnos y evaluar el grado en que los objetivos propuestos por la asignatura se

cumplen

a- Evaluaciones de las Actividades Praacutecticas tienen como objetivo determinar si el grado

de comprensioacuten de los fundamentos del tema es satisfactorio y verificar si el alumno es capaz

de aplicar dichos conocimientos en la resolucioacuten de problemas hipoteacutetico-deductivos La

evaluacioacuten de las mismas se realizaraacute a partir de los trabajos o problemas realizados por los

alumnos que seraacuten entregados al finalizar cada clase

b- Evaluaciones Parciales se realizaraacuten tres evaluaciones parciales que comprenderaacuten

temas estrechamente relacionados cuya comprensioacuten es fundamental para la correcta

asimilacioacuten de los temas posteriores Los parciales tendraacuten como objetivo fundamental

evaluar la capacidad de anaacutelisis y de las diferentes situaciones que pudieran plantearse Todos

los parciales se desarrollaraacuten por escrito Los mismos se consideraraacuten aprobados con una

calificacioacuten de 6 (seis) o superior Dentro de los 7 diacuteas posteriores a cada evaluacioacuten se

realizaraacute el recuperatorio correspondiente el cual tendraacute modalidad escrito y con preguntas a

desarrollar

VI Regularizacioacuten de la Asignatura

Seraacuten considerados alumnos regulares los que cumplieran con las siguientes

exigencias

a) Alcanzar el 75 de asistencia en las clases praacutecticas

b) Aprobar el 75 de las clases praacutecticas

c) Aprobar el 100 de las evaluaciones parciales con calificacioacuten 6 (seis) o superior

Los alumnos que no alcanzaran al 75 de aprobacioacuten de las clases praacutecticas o no

aprobaran los parciales con un miacutenimo de 6 (seis) seraacuten considerados alumnos libres

VII Horarios de Consultas

Las consultas que quieran realizar los alumnos tanto sobre temas teoacutericos como

praacutecticos las deberaacuten efectuar al Profesor responsable de la asignatura los diacuteas mieacutercoles y

viernes de 14 a 15 hs previos al inicio de las clases teoacutericas Cualquier duda que surgiera los

diacuteas restantes las consultas podraacuten ser realizadas en el Instituto de Botaacutenica del Nordeste

Sargento Cabral 2131 de 8 a 10 hs

Biologiacutea Celular y Molecular 7

VII Cronograma de Actividades

Clases teoacutericas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 09032018 Introduccioacuten al estudio de la biologiacutea celular La biologiacutea

celular dentro de las ciencias bioloacutegicas Historia e

importancia de su conocimiento

Dematteis Massimiliano

2 14032018 Meacutetodos de estudio en biologiacutea celular Anaacutelisis de la

estructura y ultraestructura celular Microscopiacutea oacuteptica y

electroacutenica

Dematteis Massimiliano

3 16032018 Fraccionamiento celular Cromatografiacutea Electroforesis

Cultivo de tejidos Ultracentrifugacioacuten Histoquiacutemica

Inmunohistoquiacutemica Autorradiografiacutea

Inmunofluorescencia

Dematteis Massimiliano

4 21032018 Teoriacutea celular Ceacutelulas procariotas y eucariotas

Caracteriacutesticas de las ceacutelulas vegetales y animales

Morfologiacutea y fisiologiacutea de las ceacutelulas Envejecimiento

degeneracioacuten y muerte de las ceacutelulas

Dematteis Massimiliano

5 23032018 Membrana Celular Composicioacuten molecular de las

membranas bioloacutegicas Modelos de membranas

Propiedades de las membranas

Dematteis Massimiliano

6 28032018 Diferenciaciones de la membrana Interacciones de las

ceacutelulas entre siacute y con las matrices extracelulares

Cubiertas externas

Dematteis Massimiliano

7 30032018 Viernes Santo Dematteis Massimiliano

8 04042018 Transporte a traveacutes de la membrana Permeabilidad de la

membrana Transporte activo y pasivo Bombas o

ATPasas Proteiacutenas transportadoras

Dematteis Massimiliano

10 06042018 Citosol o Matriz citoplasmaacutetica Citoesqueleto

caracteriacutesticas generales y organizacioacuten Microtuacutebulos

Organoides microtubulares Microfilamentos Filamentos

intermedios Movimiento de las ceacutelulas Cilios y flagelos

Dematteis Massimiliano

12 11042018 Organelos citoplasmaacuteticos Organelos membranosos y no

membranosos Retiacuteculo endoplasmaacutetico liso y rugoso

Aparato de Golgi

Dematteis Massimiliano

13 13042018 Primer parcial Dematteis Massimiliano

14 18042018 Ribosomas Vesiacuteculas con cubierta Lisosomas

Peroxisomas Descripcioacuten y funciones Endocitosis

especiacutefica e inespeciacutefica Fagocitosis

Dematteis Massimiliano

15 20042018 Mitocondrias Aspectos generales Membrana interna y

externa Transporte Composicioacuten y estructura molecular

de las membranas Acople de la cadena respiratoria

Fosforilacioacuten oxidativa

Dematteis Massimiliano

16 25042018 La ceacutelula vegetal Morfologiacutea y fisiologiacutea Pared celular

composicioacuten y estructura Organizacioacuten interna Plaacutestidos

Vacuolas Cloroplastos

Dematteis Massimiliano

17 27052018 Nuacutecleo interfaacutesico Descripcioacuten general Envoltura

nuclear Las bases quiacutemicas de la herencia Estructura

del ADN Modelo de Watson y Crick

Dematteis Massimiliano

18 02052018 Cromatina Nucleosomas Empaquetamiento Proteiacutenas

histoacutenicas y no histoacutenicas Replicacioacuten del ADN

Cromosomas Eucromatina y heterocromatina

Dematteis Massimiliano

19 04052018 Mitosis Ciclo celular Descripcioacuten detallada de la mitosis

Consecuencias geneacuteticas Aparato mitoacutetico en ceacutelulas

vegetales y animales Cinetocoros Citocinesis

Dematteis Massimiliano

20 09052018 Aspectos moleculares Control del ciclo celular

Proteiacutenas reguladoras

Dematteis Massimiliano

21 11052018 Segundo Parcial Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 8

22 16052018 Meiosis y Reproduccioacuten Sexual Descripcioacuten detallada de

la meiosis Consecuencias geneacuteticas Recombinacioacuten

Metabolismo del ADN en la meiosis

Dematteis Massimiliano

23 18052018 Recombinacioacuten a nivel molecular Estructura de la

cromatina en espermatozoides Dominio fiacutesico de los

pronuacutecleos masculino y femenino en las primeras ceacutelulas

del embrioacuten

Dematteis Massimiliano

24 23052018 El material geneacutetico en accioacuten Funcioacuten del ADN Tipos

de ARN estructura funcioacuten y transcripcioacuten Siacutentesis

regulacioacuten y maduracioacuten de los ARN Composicioacuten del

nucleacuteolo

Dematteis Massimiliano

25 25052018 Feriado Dematteis Massimiliano

26 30052018 Coacutedigo geneacutetico Siacutentesis de proteiacutenas Traduccioacuten del

ARN mensajero Ribosomas en procariotas y eucariotas

Ensamblaje de los ribosomas

Dematteis Massimiliano

27 01062018 Estructura proteica Siacutentesis de proteiacutenas citosoacutelicas y

membranosas

Dematteis Massimiliano

28 13062018 Tercer Parcial Dematteis Massimiliano

Clases Praacutecticas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 16032018 Praacutectico Nordm 1 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

2 21032018 Praacutectico Nordm 2 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

3 23032018 Praacutectico Nordm 3

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

4 28032018 Praacutectico Nordm 4 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

5 30032018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

6 04042018 Praacutectico Nordm 5 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

7 06042018 Praacutectico Nordm 6

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

8 11042018 Praacutectico Nordm 7

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

9 13042018 Primer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

10 18042018 Praacutectico Nordm 8 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

11 20042018 Recuperatorio Primer Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

12 25042018 Praacutectico Nordm 9 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

13 27042018 Praacutectico Nordm 10 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

14 02052018 Praacutectico Nordm 11 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

15 04052018 Praacutectico Nordm 12

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

16 09052018 Praacutectico Nordm 13 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

17 11052018 Segundo Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

18 16052018 Praacutectico Nordm 14 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

19 18052018 Recuperatorio Segundo Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Biologiacutea Celular y Molecular 9

Angulo Mariacutea Betiana

20 23052018 Praacutectico Nordm 15 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

21 25052018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

22 30052018 Praacutectico Nordm 16 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

23 01062018 Praacutectico Nordm 17 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

24 06062018 Praacutectico Ndeg 18 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

25 13062018 Tercer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

Parciales

Actividad Fecha Horario Docente responsable

1ordm Examen parcial 13042018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 1ordm examen parcial 20042018 17-19 Dematteis Massimiliano

2ordm Examen parcial 11052018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 2ordm examen parcial 18052018 17-19 Dematteis Massimiliano

3ordm Examen parcial 13062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 3ordm examen parcial 22062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio Extraordinario 29062018 15-17 Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 10

TRABAJOS PRAacuteCTICOS

Biologiacutea Celular y Molecular 11

Trabajo Praacutectico Nordm 1

MICROSCOPIacuteA OacutePTICA Y ELECTROacuteNICA

El microscopio oacuteptico o fotoacutenico de campo claro estaacute compuesto por una parte

mecaacutenica o estativo y por un sistema oacuteptico que incluye fuente de luz condensador

diafragma objetivos y oculares a traveacutes de los cuales se refractan los rayos luminosos

provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamantildeo

invertida y virtual Para ello el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente

contraste para poder discriminar sus componentes La transparencia se logra mediante la

realizacioacuten de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos

celulares El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o

por medio de sistemas oacutepticos particulares (por ejemplo microscopio de contraste de fases)

El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de ceacutelulas y tejidos

previamente fijados (muertos) y coloreados La coloracioacuten de las preparaciones cito-

histoloacutegicas tiene por finalidad provocar la absorcioacuten diferencial de luz con el propoacutesito de

visualizar las diversas estructuras en distintos colores Por el contrario para estudiar ceacutelulas u

organismos vivos que no se pueden colorear es necesario recurrir casi siempre a otros

sistemas oacutepticos especiales como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de

interferencia En estos dos casos se aprovecha una caracteriacutestica propia de los diferentes

componentes celulares que aunque son transparentes a la luz poseen densidades relativas

distintas

Existen baacutesicamente dos tipos de microscopio electroacutenico el microscopio electroacutenico

de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electroacutenico de transferencia (MET)

Estos microscopios a diferencia del microscopio oacuteptico forman imaacutegenes a partir de una

radiacioacuten de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes

que funcionan como lentes

Otra de las caracteriacutesticas es que proporcionan una resolucioacuten mayor que el

microscopio oacuteptico requieren de procedimientos maacutes elaborados para la preparacioacuten del

material y soacutelo se pueden examinar ceacutelulas deshidratadas y muertas El MET se utiliza

ampliamente para examinar la estructura interna de la ceacutelula mientras que el MEB examina

con detalle la superficie de las muestras las cuales se observan tridimensional mente debido a

la profundidad de foco que posee este uacuteltimo tipo de microscopio Tanto el MET como el

MEB son indispensables para el estudio de la biologiacutea celular y molecular

El microscopio electroacutenico de transmisioacuten es un microscopio que utiliza un haz de

electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio

oacuteptico estaacute limitada por la longitud de onda de la luz visible Debido a que los electrones

tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho

maacutes pequentildeas tiene un liacutemite de resolucioacuten de cerca de 2 nm Un MET mira ceacutelulas muertas

despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de metales pesados Las partes principales

de un microscopio electroacutenico son

Cantildeoacuten de electrones que emite los electrones que chocan contra el espeacutecimen

creando una imagen aumentada

Lentes magneacuteticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones ya

que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios oacutepticos no funcionan con

los electrones

Sistema de vaciacuteo es una parte muy importante del microscopio electroacutenico Debido a

que los electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire se debe hacer un

vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 7

VII Cronograma de Actividades

Clases teoacutericas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 09032018 Introduccioacuten al estudio de la biologiacutea celular La biologiacutea

celular dentro de las ciencias bioloacutegicas Historia e

importancia de su conocimiento

Dematteis Massimiliano

2 14032018 Meacutetodos de estudio en biologiacutea celular Anaacutelisis de la

estructura y ultraestructura celular Microscopiacutea oacuteptica y

electroacutenica

Dematteis Massimiliano

3 16032018 Fraccionamiento celular Cromatografiacutea Electroforesis

Cultivo de tejidos Ultracentrifugacioacuten Histoquiacutemica

Inmunohistoquiacutemica Autorradiografiacutea

Inmunofluorescencia

Dematteis Massimiliano

4 21032018 Teoriacutea celular Ceacutelulas procariotas y eucariotas

Caracteriacutesticas de las ceacutelulas vegetales y animales

Morfologiacutea y fisiologiacutea de las ceacutelulas Envejecimiento

degeneracioacuten y muerte de las ceacutelulas

Dematteis Massimiliano

5 23032018 Membrana Celular Composicioacuten molecular de las

membranas bioloacutegicas Modelos de membranas

Propiedades de las membranas

Dematteis Massimiliano

6 28032018 Diferenciaciones de la membrana Interacciones de las

ceacutelulas entre siacute y con las matrices extracelulares

Cubiertas externas

Dematteis Massimiliano

7 30032018 Viernes Santo Dematteis Massimiliano

8 04042018 Transporte a traveacutes de la membrana Permeabilidad de la

membrana Transporte activo y pasivo Bombas o

ATPasas Proteiacutenas transportadoras

Dematteis Massimiliano

10 06042018 Citosol o Matriz citoplasmaacutetica Citoesqueleto

caracteriacutesticas generales y organizacioacuten Microtuacutebulos

Organoides microtubulares Microfilamentos Filamentos

intermedios Movimiento de las ceacutelulas Cilios y flagelos

Dematteis Massimiliano

12 11042018 Organelos citoplasmaacuteticos Organelos membranosos y no

membranosos Retiacuteculo endoplasmaacutetico liso y rugoso

Aparato de Golgi

Dematteis Massimiliano

13 13042018 Primer parcial Dematteis Massimiliano

14 18042018 Ribosomas Vesiacuteculas con cubierta Lisosomas

Peroxisomas Descripcioacuten y funciones Endocitosis

especiacutefica e inespeciacutefica Fagocitosis

Dematteis Massimiliano

15 20042018 Mitocondrias Aspectos generales Membrana interna y

externa Transporte Composicioacuten y estructura molecular

de las membranas Acople de la cadena respiratoria

Fosforilacioacuten oxidativa

Dematteis Massimiliano

16 25042018 La ceacutelula vegetal Morfologiacutea y fisiologiacutea Pared celular

composicioacuten y estructura Organizacioacuten interna Plaacutestidos

Vacuolas Cloroplastos

Dematteis Massimiliano

17 27052018 Nuacutecleo interfaacutesico Descripcioacuten general Envoltura

nuclear Las bases quiacutemicas de la herencia Estructura

del ADN Modelo de Watson y Crick

Dematteis Massimiliano

18 02052018 Cromatina Nucleosomas Empaquetamiento Proteiacutenas

histoacutenicas y no histoacutenicas Replicacioacuten del ADN

Cromosomas Eucromatina y heterocromatina

Dematteis Massimiliano

19 04052018 Mitosis Ciclo celular Descripcioacuten detallada de la mitosis

Consecuencias geneacuteticas Aparato mitoacutetico en ceacutelulas

vegetales y animales Cinetocoros Citocinesis

Dematteis Massimiliano

20 09052018 Aspectos moleculares Control del ciclo celular

Proteiacutenas reguladoras

Dematteis Massimiliano

21 11052018 Segundo Parcial Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 8

22 16052018 Meiosis y Reproduccioacuten Sexual Descripcioacuten detallada de

la meiosis Consecuencias geneacuteticas Recombinacioacuten

Metabolismo del ADN en la meiosis

Dematteis Massimiliano

23 18052018 Recombinacioacuten a nivel molecular Estructura de la

cromatina en espermatozoides Dominio fiacutesico de los

pronuacutecleos masculino y femenino en las primeras ceacutelulas

del embrioacuten

Dematteis Massimiliano

24 23052018 El material geneacutetico en accioacuten Funcioacuten del ADN Tipos

de ARN estructura funcioacuten y transcripcioacuten Siacutentesis

regulacioacuten y maduracioacuten de los ARN Composicioacuten del

nucleacuteolo

Dematteis Massimiliano

25 25052018 Feriado Dematteis Massimiliano

26 30052018 Coacutedigo geneacutetico Siacutentesis de proteiacutenas Traduccioacuten del

ARN mensajero Ribosomas en procariotas y eucariotas

Ensamblaje de los ribosomas

Dematteis Massimiliano

27 01062018 Estructura proteica Siacutentesis de proteiacutenas citosoacutelicas y

membranosas

Dematteis Massimiliano

28 13062018 Tercer Parcial Dematteis Massimiliano

Clases Praacutecticas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 16032018 Praacutectico Nordm 1 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

2 21032018 Praacutectico Nordm 2 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

3 23032018 Praacutectico Nordm 3

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

4 28032018 Praacutectico Nordm 4 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

5 30032018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

6 04042018 Praacutectico Nordm 5 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

7 06042018 Praacutectico Nordm 6

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

8 11042018 Praacutectico Nordm 7

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

9 13042018 Primer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

10 18042018 Praacutectico Nordm 8 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

11 20042018 Recuperatorio Primer Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

12 25042018 Praacutectico Nordm 9 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

13 27042018 Praacutectico Nordm 10 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

14 02052018 Praacutectico Nordm 11 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

15 04052018 Praacutectico Nordm 12

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

16 09052018 Praacutectico Nordm 13 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

17 11052018 Segundo Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

18 16052018 Praacutectico Nordm 14 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

19 18052018 Recuperatorio Segundo Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Biologiacutea Celular y Molecular 9

Angulo Mariacutea Betiana

20 23052018 Praacutectico Nordm 15 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

21 25052018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

22 30052018 Praacutectico Nordm 16 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

23 01062018 Praacutectico Nordm 17 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

24 06062018 Praacutectico Ndeg 18 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

25 13062018 Tercer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

Parciales

Actividad Fecha Horario Docente responsable

1ordm Examen parcial 13042018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 1ordm examen parcial 20042018 17-19 Dematteis Massimiliano

2ordm Examen parcial 11052018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 2ordm examen parcial 18052018 17-19 Dematteis Massimiliano

3ordm Examen parcial 13062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 3ordm examen parcial 22062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio Extraordinario 29062018 15-17 Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 10

TRABAJOS PRAacuteCTICOS

Biologiacutea Celular y Molecular 11

Trabajo Praacutectico Nordm 1

MICROSCOPIacuteA OacutePTICA Y ELECTROacuteNICA

El microscopio oacuteptico o fotoacutenico de campo claro estaacute compuesto por una parte

mecaacutenica o estativo y por un sistema oacuteptico que incluye fuente de luz condensador

diafragma objetivos y oculares a traveacutes de los cuales se refractan los rayos luminosos

provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamantildeo

invertida y virtual Para ello el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente

contraste para poder discriminar sus componentes La transparencia se logra mediante la

realizacioacuten de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos

celulares El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o

por medio de sistemas oacutepticos particulares (por ejemplo microscopio de contraste de fases)

El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de ceacutelulas y tejidos

previamente fijados (muertos) y coloreados La coloracioacuten de las preparaciones cito-

histoloacutegicas tiene por finalidad provocar la absorcioacuten diferencial de luz con el propoacutesito de

visualizar las diversas estructuras en distintos colores Por el contrario para estudiar ceacutelulas u

organismos vivos que no se pueden colorear es necesario recurrir casi siempre a otros

sistemas oacutepticos especiales como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de

interferencia En estos dos casos se aprovecha una caracteriacutestica propia de los diferentes

componentes celulares que aunque son transparentes a la luz poseen densidades relativas

distintas

Existen baacutesicamente dos tipos de microscopio electroacutenico el microscopio electroacutenico

de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electroacutenico de transferencia (MET)

Estos microscopios a diferencia del microscopio oacuteptico forman imaacutegenes a partir de una

radiacioacuten de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes

que funcionan como lentes

Otra de las caracteriacutesticas es que proporcionan una resolucioacuten mayor que el

microscopio oacuteptico requieren de procedimientos maacutes elaborados para la preparacioacuten del

material y soacutelo se pueden examinar ceacutelulas deshidratadas y muertas El MET se utiliza

ampliamente para examinar la estructura interna de la ceacutelula mientras que el MEB examina

con detalle la superficie de las muestras las cuales se observan tridimensional mente debido a

la profundidad de foco que posee este uacuteltimo tipo de microscopio Tanto el MET como el

MEB son indispensables para el estudio de la biologiacutea celular y molecular

El microscopio electroacutenico de transmisioacuten es un microscopio que utiliza un haz de

electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio

oacuteptico estaacute limitada por la longitud de onda de la luz visible Debido a que los electrones

tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho

maacutes pequentildeas tiene un liacutemite de resolucioacuten de cerca de 2 nm Un MET mira ceacutelulas muertas

despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de metales pesados Las partes principales

de un microscopio electroacutenico son

Cantildeoacuten de electrones que emite los electrones que chocan contra el espeacutecimen

creando una imagen aumentada

Lentes magneacuteticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones ya

que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios oacutepticos no funcionan con

los electrones

Sistema de vaciacuteo es una parte muy importante del microscopio electroacutenico Debido a

que los electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire se debe hacer un

vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 8

22 16052018 Meiosis y Reproduccioacuten Sexual Descripcioacuten detallada de

la meiosis Consecuencias geneacuteticas Recombinacioacuten

Metabolismo del ADN en la meiosis

Dematteis Massimiliano

23 18052018 Recombinacioacuten a nivel molecular Estructura de la

cromatina en espermatozoides Dominio fiacutesico de los

pronuacutecleos masculino y femenino en las primeras ceacutelulas

del embrioacuten

Dematteis Massimiliano

24 23052018 El material geneacutetico en accioacuten Funcioacuten del ADN Tipos

de ARN estructura funcioacuten y transcripcioacuten Siacutentesis

regulacioacuten y maduracioacuten de los ARN Composicioacuten del

nucleacuteolo

Dematteis Massimiliano

25 25052018 Feriado Dematteis Massimiliano

26 30052018 Coacutedigo geneacutetico Siacutentesis de proteiacutenas Traduccioacuten del

ARN mensajero Ribosomas en procariotas y eucariotas

Ensamblaje de los ribosomas

Dematteis Massimiliano

27 01062018 Estructura proteica Siacutentesis de proteiacutenas citosoacutelicas y

membranosas

Dematteis Massimiliano

28 13062018 Tercer Parcial Dematteis Massimiliano

Clases Praacutecticas

Clase Fecha MoacuteduloTema Docentes

1 16032018 Praacutectico Nordm 1 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

2 21032018 Praacutectico Nordm 2 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

3 23032018 Praacutectico Nordm 3

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

4 28032018 Praacutectico Nordm 4 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

5 30032018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

6 04042018 Praacutectico Nordm 5 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

7 06042018 Praacutectico Nordm 6

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

8 11042018 Praacutectico Nordm 7

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

9 13042018 Primer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

10 18042018 Praacutectico Nordm 8 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

11 20042018 Recuperatorio Primer Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

12 25042018 Praacutectico Nordm 9 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

13 27042018 Praacutectico Nordm 10 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

14 02052018 Praacutectico Nordm 11 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

15 04052018 Praacutectico Nordm 12

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

16 09052018 Praacutectico Nordm 13 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

17 11052018 Segundo Parcial

Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

18 16052018 Praacutectico Nordm 14 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

19 18052018 Recuperatorio Segundo Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Biologiacutea Celular y Molecular 9

Angulo Mariacutea Betiana

20 23052018 Praacutectico Nordm 15 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

21 25052018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

22 30052018 Praacutectico Nordm 16 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

23 01062018 Praacutectico Nordm 17 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

24 06062018 Praacutectico Ndeg 18 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

25 13062018 Tercer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

Parciales

Actividad Fecha Horario Docente responsable

1ordm Examen parcial 13042018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 1ordm examen parcial 20042018 17-19 Dematteis Massimiliano

2ordm Examen parcial 11052018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 2ordm examen parcial 18052018 17-19 Dematteis Massimiliano

3ordm Examen parcial 13062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 3ordm examen parcial 22062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio Extraordinario 29062018 15-17 Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 10

TRABAJOS PRAacuteCTICOS

Biologiacutea Celular y Molecular 11

Trabajo Praacutectico Nordm 1

MICROSCOPIacuteA OacutePTICA Y ELECTROacuteNICA

El microscopio oacuteptico o fotoacutenico de campo claro estaacute compuesto por una parte

mecaacutenica o estativo y por un sistema oacuteptico que incluye fuente de luz condensador

diafragma objetivos y oculares a traveacutes de los cuales se refractan los rayos luminosos

provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamantildeo

invertida y virtual Para ello el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente

contraste para poder discriminar sus componentes La transparencia se logra mediante la

realizacioacuten de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos

celulares El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o

por medio de sistemas oacutepticos particulares (por ejemplo microscopio de contraste de fases)

El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de ceacutelulas y tejidos

previamente fijados (muertos) y coloreados La coloracioacuten de las preparaciones cito-

histoloacutegicas tiene por finalidad provocar la absorcioacuten diferencial de luz con el propoacutesito de

visualizar las diversas estructuras en distintos colores Por el contrario para estudiar ceacutelulas u

organismos vivos que no se pueden colorear es necesario recurrir casi siempre a otros

sistemas oacutepticos especiales como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de

interferencia En estos dos casos se aprovecha una caracteriacutestica propia de los diferentes

componentes celulares que aunque son transparentes a la luz poseen densidades relativas

distintas

Existen baacutesicamente dos tipos de microscopio electroacutenico el microscopio electroacutenico

de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electroacutenico de transferencia (MET)

Estos microscopios a diferencia del microscopio oacuteptico forman imaacutegenes a partir de una

radiacioacuten de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes

que funcionan como lentes

Otra de las caracteriacutesticas es que proporcionan una resolucioacuten mayor que el

microscopio oacuteptico requieren de procedimientos maacutes elaborados para la preparacioacuten del

material y soacutelo se pueden examinar ceacutelulas deshidratadas y muertas El MET se utiliza

ampliamente para examinar la estructura interna de la ceacutelula mientras que el MEB examina

con detalle la superficie de las muestras las cuales se observan tridimensional mente debido a

la profundidad de foco que posee este uacuteltimo tipo de microscopio Tanto el MET como el

MEB son indispensables para el estudio de la biologiacutea celular y molecular

El microscopio electroacutenico de transmisioacuten es un microscopio que utiliza un haz de

electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio

oacuteptico estaacute limitada por la longitud de onda de la luz visible Debido a que los electrones

tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho

maacutes pequentildeas tiene un liacutemite de resolucioacuten de cerca de 2 nm Un MET mira ceacutelulas muertas

despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de metales pesados Las partes principales

de un microscopio electroacutenico son

Cantildeoacuten de electrones que emite los electrones que chocan contra el espeacutecimen

creando una imagen aumentada

Lentes magneacuteticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones ya

que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios oacutepticos no funcionan con

los electrones

Sistema de vaciacuteo es una parte muy importante del microscopio electroacutenico Debido a

que los electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire se debe hacer un

vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

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6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 9

Angulo Mariacutea Betiana

20 23052018 Praacutectico Nordm 15 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

21 25052018 Feriado Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

22 30052018 Praacutectico Nordm 16 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

23 01062018 Praacutectico Nordm 17 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

24 06062018 Praacutectico Ndeg 18 Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

25 13062018 Tercer Parcial Sosa Mariacutea de las Mercedes

Angulo Mariacutea Betiana

Parciales

Actividad Fecha Horario Docente responsable

1ordm Examen parcial 13042018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 1ordm examen parcial 20042018 17-19 Dematteis Massimiliano

2ordm Examen parcial 11052018 15-17 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 2ordm examen parcial 18052018 17-19 Dematteis Massimiliano

3ordm Examen parcial 13062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio 3ordm examen parcial 22062018 1517 Dematteis Massimiliano

Recuperatorio Extraordinario 29062018 15-17 Dematteis Massimiliano

Biologiacutea Celular y Molecular 10

TRABAJOS PRAacuteCTICOS

Biologiacutea Celular y Molecular 11

Trabajo Praacutectico Nordm 1

MICROSCOPIacuteA OacutePTICA Y ELECTROacuteNICA

El microscopio oacuteptico o fotoacutenico de campo claro estaacute compuesto por una parte

mecaacutenica o estativo y por un sistema oacuteptico que incluye fuente de luz condensador

diafragma objetivos y oculares a traveacutes de los cuales se refractan los rayos luminosos

provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamantildeo

invertida y virtual Para ello el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente

contraste para poder discriminar sus componentes La transparencia se logra mediante la

realizacioacuten de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos

celulares El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o

por medio de sistemas oacutepticos particulares (por ejemplo microscopio de contraste de fases)

El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de ceacutelulas y tejidos

previamente fijados (muertos) y coloreados La coloracioacuten de las preparaciones cito-

histoloacutegicas tiene por finalidad provocar la absorcioacuten diferencial de luz con el propoacutesito de

visualizar las diversas estructuras en distintos colores Por el contrario para estudiar ceacutelulas u

organismos vivos que no se pueden colorear es necesario recurrir casi siempre a otros

sistemas oacutepticos especiales como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de

interferencia En estos dos casos se aprovecha una caracteriacutestica propia de los diferentes

componentes celulares que aunque son transparentes a la luz poseen densidades relativas

distintas

Existen baacutesicamente dos tipos de microscopio electroacutenico el microscopio electroacutenico

de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electroacutenico de transferencia (MET)

Estos microscopios a diferencia del microscopio oacuteptico forman imaacutegenes a partir de una

radiacioacuten de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes

que funcionan como lentes

Otra de las caracteriacutesticas es que proporcionan una resolucioacuten mayor que el

microscopio oacuteptico requieren de procedimientos maacutes elaborados para la preparacioacuten del

material y soacutelo se pueden examinar ceacutelulas deshidratadas y muertas El MET se utiliza

ampliamente para examinar la estructura interna de la ceacutelula mientras que el MEB examina

con detalle la superficie de las muestras las cuales se observan tridimensional mente debido a

la profundidad de foco que posee este uacuteltimo tipo de microscopio Tanto el MET como el

MEB son indispensables para el estudio de la biologiacutea celular y molecular

El microscopio electroacutenico de transmisioacuten es un microscopio que utiliza un haz de

electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio

oacuteptico estaacute limitada por la longitud de onda de la luz visible Debido a que los electrones

tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho

maacutes pequentildeas tiene un liacutemite de resolucioacuten de cerca de 2 nm Un MET mira ceacutelulas muertas

despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de metales pesados Las partes principales

de un microscopio electroacutenico son

Cantildeoacuten de electrones que emite los electrones que chocan contra el espeacutecimen

creando una imagen aumentada

Lentes magneacuteticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones ya

que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios oacutepticos no funcionan con

los electrones

Sistema de vaciacuteo es una parte muy importante del microscopio electroacutenico Debido a

que los electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire se debe hacer un

vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

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Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 10

TRABAJOS PRAacuteCTICOS

Biologiacutea Celular y Molecular 11

Trabajo Praacutectico Nordm 1

MICROSCOPIacuteA OacutePTICA Y ELECTROacuteNICA

El microscopio oacuteptico o fotoacutenico de campo claro estaacute compuesto por una parte

mecaacutenica o estativo y por un sistema oacuteptico que incluye fuente de luz condensador

diafragma objetivos y oculares a traveacutes de los cuales se refractan los rayos luminosos

provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamantildeo

invertida y virtual Para ello el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente

contraste para poder discriminar sus componentes La transparencia se logra mediante la

realizacioacuten de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos

celulares El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o

por medio de sistemas oacutepticos particulares (por ejemplo microscopio de contraste de fases)

El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de ceacutelulas y tejidos

previamente fijados (muertos) y coloreados La coloracioacuten de las preparaciones cito-

histoloacutegicas tiene por finalidad provocar la absorcioacuten diferencial de luz con el propoacutesito de

visualizar las diversas estructuras en distintos colores Por el contrario para estudiar ceacutelulas u

organismos vivos que no se pueden colorear es necesario recurrir casi siempre a otros

sistemas oacutepticos especiales como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de

interferencia En estos dos casos se aprovecha una caracteriacutestica propia de los diferentes

componentes celulares que aunque son transparentes a la luz poseen densidades relativas

distintas

Existen baacutesicamente dos tipos de microscopio electroacutenico el microscopio electroacutenico

de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electroacutenico de transferencia (MET)

Estos microscopios a diferencia del microscopio oacuteptico forman imaacutegenes a partir de una

radiacioacuten de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes

que funcionan como lentes

Otra de las caracteriacutesticas es que proporcionan una resolucioacuten mayor que el

microscopio oacuteptico requieren de procedimientos maacutes elaborados para la preparacioacuten del

material y soacutelo se pueden examinar ceacutelulas deshidratadas y muertas El MET se utiliza

ampliamente para examinar la estructura interna de la ceacutelula mientras que el MEB examina

con detalle la superficie de las muestras las cuales se observan tridimensional mente debido a

la profundidad de foco que posee este uacuteltimo tipo de microscopio Tanto el MET como el

MEB son indispensables para el estudio de la biologiacutea celular y molecular

El microscopio electroacutenico de transmisioacuten es un microscopio que utiliza un haz de

electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio

oacuteptico estaacute limitada por la longitud de onda de la luz visible Debido a que los electrones

tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho

maacutes pequentildeas tiene un liacutemite de resolucioacuten de cerca de 2 nm Un MET mira ceacutelulas muertas

despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de metales pesados Las partes principales

de un microscopio electroacutenico son

Cantildeoacuten de electrones que emite los electrones que chocan contra el espeacutecimen

creando una imagen aumentada

Lentes magneacuteticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones ya

que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios oacutepticos no funcionan con

los electrones

Sistema de vaciacuteo es una parte muy importante del microscopio electroacutenico Debido a

que los electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire se debe hacer un

vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 11

Trabajo Praacutectico Nordm 1

MICROSCOPIacuteA OacutePTICA Y ELECTROacuteNICA

El microscopio oacuteptico o fotoacutenico de campo claro estaacute compuesto por una parte

mecaacutenica o estativo y por un sistema oacuteptico que incluye fuente de luz condensador

diafragma objetivos y oculares a traveacutes de los cuales se refractan los rayos luminosos

provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamantildeo

invertida y virtual Para ello el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente

contraste para poder discriminar sus componentes La transparencia se logra mediante la

realizacioacuten de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos

celulares El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o

por medio de sistemas oacutepticos particulares (por ejemplo microscopio de contraste de fases)

El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de ceacutelulas y tejidos

previamente fijados (muertos) y coloreados La coloracioacuten de las preparaciones cito-

histoloacutegicas tiene por finalidad provocar la absorcioacuten diferencial de luz con el propoacutesito de

visualizar las diversas estructuras en distintos colores Por el contrario para estudiar ceacutelulas u

organismos vivos que no se pueden colorear es necesario recurrir casi siempre a otros

sistemas oacutepticos especiales como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de

interferencia En estos dos casos se aprovecha una caracteriacutestica propia de los diferentes

componentes celulares que aunque son transparentes a la luz poseen densidades relativas

distintas

Existen baacutesicamente dos tipos de microscopio electroacutenico el microscopio electroacutenico

de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electroacutenico de transferencia (MET)

Estos microscopios a diferencia del microscopio oacuteptico forman imaacutegenes a partir de una

radiacioacuten de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes

que funcionan como lentes

Otra de las caracteriacutesticas es que proporcionan una resolucioacuten mayor que el

microscopio oacuteptico requieren de procedimientos maacutes elaborados para la preparacioacuten del

material y soacutelo se pueden examinar ceacutelulas deshidratadas y muertas El MET se utiliza

ampliamente para examinar la estructura interna de la ceacutelula mientras que el MEB examina

con detalle la superficie de las muestras las cuales se observan tridimensional mente debido a

la profundidad de foco que posee este uacuteltimo tipo de microscopio Tanto el MET como el

MEB son indispensables para el estudio de la biologiacutea celular y molecular

El microscopio electroacutenico de transmisioacuten es un microscopio que utiliza un haz de

electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio

oacuteptico estaacute limitada por la longitud de onda de la luz visible Debido a que los electrones

tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho

maacutes pequentildeas tiene un liacutemite de resolucioacuten de cerca de 2 nm Un MET mira ceacutelulas muertas

despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de metales pesados Las partes principales

de un microscopio electroacutenico son

Cantildeoacuten de electrones que emite los electrones que chocan contra el espeacutecimen

creando una imagen aumentada

Lentes magneacuteticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones ya

que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios oacutepticos no funcionan con

los electrones

Sistema de vaciacuteo es una parte muy importante del microscopio electroacutenico Debido a

que los electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire se debe hacer un

vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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179 436-441

Strasburger E 1986 Tratado de Botaacutenica8va ed Ed Omega S A

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 12

Placa fotograacutefica o pantalla fluorescente que se coloca detraacutes del objeto a visualizar

para registrar la imagen aumentada

Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones que suele ser

una computadora

El microscopio electroacutenico de barrido (MEB) tambieacuten tiene un liacutemite de 2 nm El

MEB permite mirar a ceacutelulas muertas despueacutes de haber sido fijadas y tentildeidas con iones de

metales pesados Con esta teacutecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del

espeacutecimen

El presente Trabajo Praacutectico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

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Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 13

funcionamiento del microscopio oacuteptico y un microscopio electroacutenico que son los maacutes

utilizados en el aacuterea de las ciencias bioloacutegicas

Objetivos

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio

Analizar las caracteriacutesticas del instrumental oacuteptico

Adquirir destreza en el uso del microscopio oacuteptico

Aprender las normas baacutesicas para su cuidado y manejo

Conocer las caracteriacutesticas del microscopio electroacutenico

Entender las aplicaciones de la microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten y barrido

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Papel tissue

Puerro

Agujas

Pinzas

Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades

1 Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y

colocar sobre un portaobjetos Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos Observar

el preparado a traveacutes del microscopio oacuteptico empezando por el menor aumento

Estos preparados les permitiraacuten instruirse en la utilizacioacuten del microscopio oacuteptico hasta

adquirir relativa destreza

2 Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a

continuacioacuten hasta que el enfoque de una preparacioacuten sea una maniobra automaacutetica y

sencilla

Encender la luz del microscopio colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en

el eje oacuteptico subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el

diafragma

Colocar la preparacioacuten sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material

en el orificio de la platina

Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macromeacutetrico

mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5

mm del preparado

Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparacioacuten

Completar el enfoque mediante el control micromeacutetrico

Regular la iluminacioacuten ajustando la altura del condensador y la apertura del

diafragma

Para pasar a objetivos de mayor aumento bajar un poco la platina Si se trata de un

objetivo de inmersioacuten colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el

costado acercando el objetivo con el tornillo macromeacutetrico hasta hacer contacto con

la gota de aceite Se debe actuar con precaucioacuten para evitar la rotura del portaobjetos

del preparado o de la lente frontal del objetivo

Mirar por el ocular y maniobrar con el control micromeacutetrico hasta visualizar la

preparacioacuten y enfocar correctamente

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Esau K 1976 Anatomiacutea Vegetal 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Raven P H Evert R F amp Einchhorn S E 1992 Biologiacutea de las Plantas Ed Reverteacute

SA Barcelona

Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

Ed Omega

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Biologiacutea Celular y Molecular 52

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 14

Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio separar el

objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento Si se utilizoacute aceite de

inmersioacuten se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para

lentes)

Una vez terminado esto se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y

cubrir el microscopio con la funda o estuche

Para el adecuado uso de un microscopio oacuteptico tambieacuten pueden ser importantes

algunas de las recomendaciones que se detallan a continuacioacuten

Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema

oacuteptico a sus ojos

Si utiliza anteojos correctores de miopiacutea no necesita usarlos para mirar al

microscopio En cambio si emplea anteojos para astigmatismo si es necesario

utilizarlos

Los microscopios utilizados para las clases praacutecticas variacutean en cuanto a la forma y

posicioacuten de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio Solicite

ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso

Recuerde siempre que cuanto mayor es el aumento utilizado menor es el campo

microscoacutepico observado En todos los casos se debe empezar a observar una

preparacioacuten con el objetivo de menor aumento

3 Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X)

4 Examinar las fotografiacuteas que se hallan a continuacioacuten e indique en cada caso que tipo de

microscopio fue utilizado

5 Explicar queacute tipo de informacioacuten brinda la utilizacioacuten de cada uno de estos microscopios

Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

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Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

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Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

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VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

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Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 15

Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Dhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Ehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

6 Completar el siguiente esquema indicando sus partes oacutepticas y mecaacutenicas

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

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Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

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Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 16

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Ed Omega

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 17

Trabajo Praacutectico Nordm 2

TEacuteCNICAS CITOQUIacuteMICAS

El propoacutesito inmediato de la citoquiacutemica consiste en la identificacioacuten y localizacioacuten de

los diferentes compuestos quiacutemicos dentro de la ceacutelula La histoquiacutemica hace lo propio a nivel

tisular Este propoacutesito es tanto cualitativo como cuantitativo Puede realizarse con fines

diagnoacutesticos y en tal sentido debemos sentildealar que los procedimientos cito-histoquiacutemicos (en

especial los referidos a la inmunohistoquiacutemica) se convirtieron en un instrumento invalorable

en el diagnoacutestico o pronoacutestico de innumerables alteraciones histopatoloacutegicas

Las teacutecnicas cito-histoquiacutemicas como instrumento de investigacioacuten involucran el

estudio de los cambios dinaacutemicos en la organizacioacuten citoquiacutemica durante los distintos estadios

funcionales En tal sentido es posible establecer el papel que desempentildean los diferentes

componentes celulares en los procesos metaboacutelicos de la ceacutelula

El meacutetodo citohistoquiacutemico en sentido estricto es microscoacutepico porque comprende

una serie de procedimientos quiacutemicos y fiacutesicos que se emplean para individualizar con el

microscopio diferentes componentes quiacutemicos en el interior de las ceacutelulas o en las matrices

extracelulares

Objetivos

Identificar compuestos quiacutemicos mediante teacutecnicas citoquiacutemicas dentro de la ceacutelula

Conocer la base quiacutemica de las diferentes reacciones

Deteccioacuten de almidoacuten

Los azuacutecares gluacutecidos o hidratos de carbono son compuestos formados por aacutetomos de

carbono hidroacutegeno y oxiacutegeno Representan la principal fuente de energiacutea de los organismos y

ademaacutes son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de

las sustancias intercelulares De acuerdo al nuacutemero de moleacuteculas que la componen se

clasifican en monosacaacuteridos disacaacuteridos trisacaacuteridos oligosacaacuteridos (de cuatro a diez)

polisacaacuteridos (maacutes de diez) Estos junto con las proteiacutenas y los aacutecidos nucleicos forman las

macromoleacuteculas Entre estos compuestos se encuentran la glucosa fructosa sacarosa

almidoacuten glucoacutegeno celulosa quitina etc

Materiales

Almidoacuten de origen vegetal suspendido en agua al 10

Reactivo de Lugol (Iodo en solucioacuten de Ioduro de potasio)

Tres tubos de ensayo

Papa arroz trigo etc

Agua destilada

Procedimiento

1 Rotular con nuacutemeros los tres tubos de ensayo

2 Agregar al Tubo 1 4 ml de agua destilada + tres gotas de solucioacuten de Lugol

3 Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensioacuten de almidoacuten al 10 + tres gotas de Lugol

4 En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz trigo o raspado

de papa + tres gotas de Lugol

5 Agitar los tres tubos durante unos segundos

6 Observar dibujar e interpretar los resultados

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

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Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 18

Las moleacuteculas de yodo se intercalan en los bucles de la heacutelice de amilosa formando un

complejo de color azul-violaacuteceo

Deteccioacuten de ADN

Los aacutecidos nucleicos son macromoleacuteculas de gran importancia bioloacutegica debido a que

contienen la informacioacuten para codificar la siacutentesis de proteiacutenas Todos los organismos vivos

contienen aacutecidos nucleicos en forma de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) y aacutecido

ribonucleico (ARN) algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN

Los aacutecidos nucleicos resultan de la polimerizacioacuten de nucleoacutetidos Los nucleoacutetidos son

las unidades estructurales de los aacutecidos nucleicos y estaacuten formado por tres subunidades una

base nitrogenada ligada a un azuacutecar (pentosa) que se combina a su vez con una moleacutecula de

aacutecido fosfoacuterico Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN

Las bases nitrogenadas son moleacuteculas ciacuteclicas y estaacuten formadas por carbono oxiacutegeno

hidroacutegeno y nitroacutegeno Existen dos tipos de bases nitrogenadas las pirimiacutedicas que se llaman

citosina timina y uracilo y las puacutericas que son la adenina y la guanina Las bases pirimiacutedicas

estaacuten formadas por una sola moleacutecula ciacuteclica mientras que las puacutericas tienen dos anillos

fusionados en su moleacutecula Las bases puacutericas se encuentran en todos los aacutecidos nucleicos en

cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN salvo contadas

excepciones

Los nucleoacutetidos se unen entre siacute formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa

del siguiente formando largos poliacutemeros que estaacuten integrados solo por ribonucleicos en el

ARN o desoxirribonucleicos en el ADN Las funciones de ambos tipos de aacutecidos nucleicos

estaacuten vinculadas a la codificacioacuten de la informacioacuten geneacutetica y la siacutentesis de proteiacutenas

Materiales

Portaobjetos y cubreobjetos

2 Pinzas de diseccioacuten

Papel secante

1 Aguja histoloacutegica

Elementos de dibujo

Procedimiento

1 Colocar las raiacuteces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con aacutecido

clorhiacutedrico 1N

2 Incubar en bantildeo mariacutea a 60degC durante 8 minutos

3 Pasar las raiacuteces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff

4 Inmediatamente despueacutes colocar el tubo en caacutemara oscura durante unos 20 o 30 minutos

Luego de transcurrido ese lapso controlar las raiacuteces y verificar si han tomado color

5 Una vez realizada la teacutecnica de Feulgen se podraacute observar coloreada en color violeta la

zona de activo crecimiento de la raiacutez

6 Colocar las raiacuteces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado

7 Bajo la lupa en primer lugar se deberaacute retirar la cofia de la raiacutez (que cubre la regioacuten

meristemaacutetica)

8 Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al aacutepice

de la raiacutez (unos 2 o 3 mm)

9 Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico

10 Macerar suavemente la regioacuten meristemaacutetica utilizando una varilla de vidrio o la parte

posterior de una aguja histoloacutegica

11 Por uacuteltimo colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Esau K1982 Anatomiacutea de las plantas con semillas Ed Hemisferio Sur S A

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 19

12 Observar en el microscopio el aspecto de las ceacutelulas y esquematizar una que se encuentre

en divisioacuten

Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de

elemento por ello se debe utilizar una pinza especiacutefica para cada caso

La hidroacutelisis aacutecida extrae las purinas a nivel de la unioacuten desoxirribosa purina del ADN

y de esa manera libera los grupos aldehiacutedos de la desoxirribosa Los grupos aldehiacutedos libres

reaccionan con el reactivo de Schiff Cuando se aplica a la ceacutelula la reaccioacuten es positiva en el

nuacutecleo y negativa en el citoplasma El nucleolo es Feulgen negativo

Con los resultados observados elabore un informe sinteacutetico detallando las sustancias

detectadas los reactivos utilizados y las caracteriacutesticas de la reaccioacuten

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1987 Invitacioacuten a la Biologiacutea Ed Meacutedica Panamericana Meacutexico

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 20

Trabajo Praacutectico Ndeg 3

USOS Y MANIPULACIOacuteN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE

BIOLOGIacuteA MOLECULAR

La seguridad en el Laboratorio de Biologiacutea Molecular es tan importante como conocer los

usos de cada uno de los equipos que posee Los laboratorios en los que se desarrollan las

praacutecticas son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos

quiacutemicos seres vivos y numerosas teacutecnicas instrumentales lo que implica que existan

siempre riesgos en ellos Los riesgos que se presentan maacutes frecuentemente implican

exposicioacuten a agentes quiacutemicos agentes bioloacutegicos y agentes fiacutesicos ademaacutes del consabido

riesgo de explosioacuten e incendio

Por otra parte la biologiacutea molecular estudia la composicioacuten estructura y funcioacuten de las

moleacuteculas bioloacutegicamente importantes asiacute como los procesos en los que esteacuten implicadas

Engloba principalmente a proteiacutenas y aacutecidos nucleicos Esta praacutectica introduce a las teacutecnicas

de pipeteo y pipeteo en esterilidad teacutecnicas usadas a traveacutes del curso Dominar estas teacutecnicas

es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las praacutecticas La

mayoriacutea de los laboratorios usan voluacutemenes muy pequentildeos de ADN y reactivos Esto requiere

el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir voluacutemenes tan pequentildeos como 1

microlitro Por lo tanto es importante mantener las condiciones de esterilidad minimizar la

oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foraacuteneos Se debe usar

material esteacuteril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano medio nutritivo

soluciones pipetas puntas asas de inoculacioacuten y esparcidores frascos tubos y placas de

cultivo

Pipetas de precisioacuten de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento

permite el pipeteo de pequentildeos voluacutemenes de liacutequidos con precisioacuten y reproducibilidad Es un

instrumento de precisioacuten que como tal es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo

Las mismas son autoclavables y utilizan un cono punta o tip descartable con el que se toman

las muestras Requerimos leer atentamente este apeacutendice para evitar una mala manipulacioacuten

de las mismas

A Tapa para control del volumen

B Visor donde se observa el volumen a

calibrar

C Botoacuten para eyectar los tips

D Rango de volumen que permite la

pipeta

E Eyector de tips

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

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Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Biologiacutea Celular y Molecular 52

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Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 21

Descripcioacuten general de una micropipeta tipo

Precauciones al momento de usar una micropipeta

Nunca rotar el ajustador de volumen maacutes allaacute del rango inferior o superior de la pipeta

Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar esto puede arruinar el pistoacuten

Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno el liacutequido podriacutea entrar dentro

del pistoacuten

Nunca liberar violentamente el eacutembolo despueacutes de vaciar el liacutequido esto podriacutea dantildear el

pistoacuten

Nunca meter el cono de la pipeta en liacutequido

Nunca flamear la punta de la micropipeta

Objetivos

Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biologiacutea molecular y sobre la importancia

de la esterilidad

Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes

usos y riesgos de seguridad y contaminacioacuten

Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equiposinstrumentales

Adquirir destreza en el uso y manipulacioacuten de micropipetas

Materiales

Guiacutea de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)

Micropipetas y tips

Tubos Eppendof

Vaso de precipitados

Agua con colorante

Actividades

1-Responder

a- Nombrar los elementos de proteccioacuten que se requieren para entrar a un laboratorio

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 22

b- Si debo preparar una solucioacuten que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante iquestBajo

queacute condiciones debo preparar la solucioacuten

c-iquestQueacute debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos

2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las

actividadesusos que se realizan con este con sus posibles riesgos de contaminacioacuten yo

riesgo de seguridad

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ___________________________

Usos ______________________________

___________________________________

___________________________________

Riesgos____________________________

___________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre _________________________________

Usos

_________________________________________

_________________________________________

_________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 23

3- Seguir los pasos para la utilizacioacuten de micropipetas realizando el pipeteo con agua

coloreada

Procedimiento para la utilizacioacuten de micropipetas

Observar que el botoacuten de eyeccioacuten tiene tres posiciones T0 (B y E) T1 primer tope (AC)

T2 segundo tope (D)

Para la carga

1 Calibracioacuten del volumen tener mucho cuidado en no sobrepasar los liacutemites operativos de

cada pipeta Colocar el tip

2 Llevar el eacutembolo a la posicioacuten de carga T1 (ver A)

3 Dentro del liacutequido a pipetear liberar el eacutembolo lentamente hasta la posicioacuten T0 (ver B)

4 Para la descarga

5 Bajar el eacutembolo suavemente este debe pasar por primer tope (ver C) y para la descarga

total llegar hasta el final posicioacuten T2 (ver D)

6 Finalmente fuera del liacutequido dispensado liberar el eacutembolo hasta T0 (ver E)

7 Descartar el tip

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Nombre ________________________________

Usos ___________________________________

________________________________________

________________________________________

Riesgos_________________________________

_________________________________________

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

Oregon

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

Barcelona

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

Ateneo Buenos Aires

LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

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Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 24

Conversiones meacutetricas

Es muy importante familiarizarse con las unidades meacutetricas de medida y sus conversiones

Vamos a ejemplificar con las medidas de liacutequidos basadas en el litro pero los mismos pre-

fijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos Las dos medidas que maacutes se

usaraacuten en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (microl)

1 microl = 1 000 ml = 0000001 litro 1 000 000 microl = 1 litro

1 ml = 0001 microl = 0001 litro 1 000 ml = 1 litro

4- Responder la siguiente situacioacuten

-Tengo que hacer una solucioacuten de 25microL para realizar la digestioacuten del ADN de una muestra

(Tabla 1) iquestQueacute tipos de micropipetas debo usar y cuaacuteles son sus liacutemites operativos iquestCuaacutentos

tips diferentes tengo debo usar

Tabla 1 Componentes de mezcla de digestioacuten EcoRI-MseI

Componentes Concentracioacuten

inicial

Concentracioacuten

final

Volumen para 1

muestra (25 μL)

Buffer OPA 5X 1X 5 μL

DTT 250 mM 5 mM 05 μL

BSA 10000 ngμL 50 ngμL 0125 μL

EcoRI 12 U 5 unidades 04 μL

MseI 10 U 5 unidades 05 μL

ADN 300 ngμL 1 μg 34 μL

Agua UP 15075 μL

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

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Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Biologiacutea Celular y Molecular 52

Buenos Aires

Gardner E 1971 Principios de Geneacutetica Ed Limusa-Wiley Meacutexico

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 25

ANEXO

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Normas para el trabajo en el laboratorio

1 Se implementaraacute el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas

Es recomendable no usar faldas shorts o zapatos abiertos Las personas de cabello largo

deberaacuten sujetarlos mientras esteacuten en el laboratorio

2 No fumar comer o beber (incluye mate yo terereacute) en el laboratorio Lavar bien las manos

al salir del lugar

3 Es importante conocer la localizacioacuten de los accesorios de seguridad

-Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego

pueden apagar

-Localizar las salidas de emergencia

-Localizar la llave general de electricidad del laboratorio

-Localizar la manta anti-llama

-Localizar el lava-ojos y ducha maacutes cercanos

4 Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse

5 No devolver los reactivos a los frascos originales aunque no hayan sido usados

6 No usar ninguacuten instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar

7 Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo Cuando los instrumentos

no esteacuten siendo usados deben permanecer desenchufados

8 Nunca pipetear liacutequidos con la boca En este caso usar peras de plaacutestico o pipetas especiales

para tal fin

9 Se deberaacuten utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quiacutemica o

material bioloacutegico Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberaacute tocar

objetos ni superficies tales como teleacutefono lapiceras manijas de cajones o puertas

cuadernos

10 Es imprescindible mantener el orden y la limpieza Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes

11 Las praacutecticas que produzcan gases vapores humos o partiacuteculas aquellas que pueden ser

riesgosas por inhalacioacuten deben llevarse a cabo bajo campana

12 Estaacute prohibido descartar liacutequidos inflamables o toacutexicos o corrosivos o material bioloacutegico

por los desaguumles de las piletas sanitarios o recientes comunes para residuos En cada caso se

deberaacuten seguir los procedimientos establecidos para la gestioacuten de residuos

Material de Vidrio

1 Al usar material de vidrio verificar su condicioacuten Cualquier material de vidrio que esteacute

astillado debe ser rechazado

2 Los vidrios rotos asiacute como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente

apropiado

Residuos

Consultar siempre la viacutea de descarte de cada uno de los reactivos utilizados

Al retirarse verificar que el instrumental utilizado esteacute apagado y en su lugar La mesada de

trabajo debe quedar libre y limpia

Cualquier desperfecto rotura o accidente deberaacute ser informado a los docentes

Biologiacutea Celular y Molecular 26

Bibliografiacutea

Suaacuterez-Baron H amp G Gallego 2014 Guiacutea de Laboratorio de Biologiacutea Molecular Baacutesica

Publicacioacuten CIAT Ndeg 397 httpswwwresearchgatenetpublication275639881

Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Acquaah G 1992 Practical protein electrophoresis for genetic research Dioscorides Press

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Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lehningher A DL Nelson amp M Cox 1995 Principios de Bioquiacutemica 2ordf ed Ed Omega

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

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Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

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LODISH H A BERK S L ZIPURSKY D BALTIMORE amp J DARNELL 2002 Biologiacutea Celular y

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VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Selosse M A amp S Loiseaux-de Goeumlr 1997 La saga de la endosimbiosis Mundo Cientiacutefico

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Strasburger E 1986 Tratado de Botaacutenica8va ed Ed Omega S A

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

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VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Strasburger E 1986 Tratado de Botaacutenica8va ed Ed Omega S A

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

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Biologiacutea Celular y Molecular 27

Trabajo Praacutectico Nordm 4

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una teacutecnica de separacioacuten o resolucioacuten de moleacuteculas de una mezcla

por aplicacioacuten de un campo eleacutectrico Constituye uno de los meacutetodos maacutes aplicados en

Biologiacutea Celular cuando se necesita separar aislar yo identificar componentes subcelulares o

macromoleacuteculas En la electroforesis la separacioacuten aprovecha una caracteriacutestica de la mayoriacutea

de los compuestos bioloacutegicos la de poseer carga eleacutectrica Por lo tanto colocados bajo la

influencia de un campo eleacutectrico de corriente continua esos compuestos son capaces de

desplazarse en forma caracteriacutestica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas Las

moleacuteculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relacioacuten entre

sus cargas Por ejemplo si dos moleacuteculas tienen masa y formas iguales la de mayor carga

neta se desplazaraacute con mayor velocidad hacia un electrodo

La separacioacuten de moleacuteculas pequentildeas como los aminoaacutecidos y los nucleoacutetidos es una

de las muchas aplicaciones de la electroforesis En este caso se deposita una pequentildea gota de

muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa que luego es embebida en

una solucioacuten conductora Cuando se aplica un campo eleacutectrico sobre los extremos de la tira

las moleacuteculas pequentildeas disueltas en la solucioacuten conductora se desplazan a lo largo de la tira

en correspondencia con la magnitud de su carga Asiacute las moleacuteculas bioloacutegicas pueden ser

separadas y caracterizadas seguacuten la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser

utilizada para aislar aacutecidos nucleicos alcaloides proteiacutenas etc de una mezcla compleja

determinar el PM identificar moleacuteculas similares con diferente carga neta determinar la

pureza de una fraccioacuten molecular aislar diferentes compuestos etc

Existen varios sistemas electroforeacuteticos aunque el maacutes usado es la llamada

electroforesis zonal En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisoacutelido (papel)

o gelatinoso (almidoacuten agar poliacrilamida) que al someterse a un campo eleacutectrico permite

que las moleacuteculas migren a traveacutes de ellos

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

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Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

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VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Strasburger E 1986 Tratado de Botaacutenica8va ed Ed Omega S A

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Ed Omega

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Lacadena J R 1988 Geneacutetica Ed Agesa Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Biologiacutea Celular y Molecular 52

Buenos Aires

Gardner E 1971 Principios de Geneacutetica Ed Limusa-Wiley Meacutexico

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 28

Objetivo

Comprender los fundamentos de las teacutecnicas electroforeacuteticas

Actividades

1 Observar la fotografiacutea de la corrida electroforeacutetica y determinar las bandas proteicas en la

muestra

2 Medir las distancias relativas de migracioacuten (Rf) de cada una de las muestras y del

marcador de peso molecular

3 A partir de los datos obtenidos calcular el peso molecular de la muestra

Rf (muestra) yo Rf a - yo Rf PM

4 Contestar las siguientes preguntas

a- iquestCuaacuteles son las aplicaciones de la cromatografiacutea y la electroforesis

b- iquestCuaacutel es el fundamento de la electroforesis zonal

Biologiacutea Celular y Molecular 29

Bibliografiacutea

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Puertas M J 1992 Geneacutetica fundamentos y perspectivas 1ordm edicioacuten Ed McGraw - Hill

Interamericana Madrid

Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 30

Trabajo Praacutectico Nordm 5

CEacuteLULA

La teoriacutea celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentacioacuten de

la teoriacutea de la evolucioacuten de Darwin pero estas dos grandes teoriacuteas estaacuten estrechamente

vinculadas Las similitudes entre las ceacutelulas nos permiten hacer una raacutepida mirada a la historia

evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras ceacutelulas que se originaron

hace 3500 ma

La teoriacutea celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o

modificado algunos puntos La teoriacutea actual considera que

la ceacutelula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos

las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus ceacutelulas

las ceacutelulas se originan uacutenicamente a partir de otras ceacutelulas preexistentes por medio de

divisioacuten celular

la unidad maacutes pequentildea de vida es la ceacutelula

La teoriacutea celular es de una importancia enorme para la biologiacutea porque hace eacutenfasis en

la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad

de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes

Objetivos

Asimilar el concepto de ceacutelula como unidad estructural y funcional de los seres vivos

Reconocer las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

Distinguir las caracteriacutesticas especiales de las ceacutelulas

Relacionar las estructuras observadas con la funcioacuten que cumplen

Materiales

Portaobjetos y Cubreobjetos

Pinzas y Agujas

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

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DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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179 436-441

Strasburger E 1986 Tratado de Botaacutenica8va ed Ed Omega S A

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Raven P H Evert R F amp Einchhorn S E 1992 Biologiacutea de las Plantas Ed Reverteacute

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Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

Ed Omega

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

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Biologiacutea Celular y Molecular 31

Observaciones

Para la observacioacuten de ceacutelulas procariotas se analizaraacuten las bacterias presentes en el

yogur para ello se deberaacute colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocaraacute una gota

de agua Luego de ello se observaraacute a distintos aumentos

El reconocimiento de ceacutelulas eucariotas se realizaraacute a partir de preparaciones provistas

por la caacutetedra y otras realizadas por los alumnos Para la realizacioacuten de preparados se

requeriraacute de cebolla (bulbo) hojas de Elodea sp o Vallisneria sp Para la observacioacuten se

deberaacute desprender una porcioacuten del material y colocar con una gota de agua sobre el

portaobjetos luego se coloca el cubreobjetos Una vez realizada la muestra se lleva al

microscopio y observa en distintos aumentos En ambos casos se deberaacute esquematizar las

ceacutelulas y tejidos

Actividades

1 Esquematizar los diferentes tipos de ceacutelulas observadas durante el trabajo praacutectico e

indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse

2 Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre ceacutelulas procariotas y eucariotas

3 Resumir los postulados de la teoriacutea celular indicando los autores de la misma

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

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VILLEE C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 32

Trabajo Praacutectico Nordm 6

MEMBRANA PLASMAacuteTICA

Las ceacutelulas tienen una composicioacuten quiacutemica diferente al medio que la rodea y dicha

diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmaacutetica o celular que es la

encargada de regular el intercambio de iones y moleacuteculas entre la ceacutelula y el medio

extracelular Debido a ello la comprensioacuten de la estructura y funcionamiento de la membrana

plasmaacutetica resultan fundamentales para la comprensioacuten de la mayoriacutea de las actividades

celulares

Objetivos

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmaacutetica

Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido

Actividades

1 Completar con referencias el esquema de la membrana plasmaacutetica de acuerdo al modelo

actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar

2 La unidad estructural de las membranas bioloacutegicas son los liacutepidos de los cuales los maacutes

abundantes son los fosfoliacutepidos Hacer un esquema representando la estructura de un

fosfoliacutepido tiacutepico indicando sus componentes mediante flechas

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

Ed Omega

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 33

3 Seguacuten el modelo del ldquomosaico fluidordquo los liacutepidos constituyen la unidad estructural de la

membrana pero la unidad funcional son las proteiacutenas Describir las propiedades de los

tres tipos diferentes de proteiacutenas de membrana indicando las diferencias y similitudes de

unas con otras

Bibliografiacutea

ALBERTS B D BRAY J LEWIS M RAFF K ROBERTS amp J D WATSON 1989 Molecular

biology of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

DE ROBERTIS EMF J HIB amp R PONZIO 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

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Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

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Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Biologiacutea Celular y Molecular 52

Buenos Aires

Gardner E 1971 Principios de Geneacutetica Ed Limusa-Wiley Meacutexico

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

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Biologiacutea Celular y Molecular 34

Trabajo Praacutectico Nordm 7

TRANSPORTE DE MEMBRANA

Como resultado de las diferencias en la concentracioacuten de solutos a ambos lados de la

membrana plasmaacutetica el agua tiende a entrar o a salir de la ceacutelula por oacutesmosis Si el medio

extracelular tiene una concentracioacuten maacutes alta de sales o sea es hiperosmoacutetico o hipertoacutenico el

agua tiende a salir de la ceacutelula y por lo tanto el volumen celular disminuye

Por el contrario si el medio extracelular tiene una concentracioacuten menor de sales es

hiposmoacutetico o hipotoacutenico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la ceacutelula

Cuando el medio extracelular posee la misma concentracioacuten de sales que el citoplasma los

compartimentos son isosmoacuteticos o isotoacutenicos y no se modifica el volumen de la ceacutelula

Objetivos

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la membrana plasmaacutetica

Comprender la naturaleza dinaacutemica de la membrana

Observaciones

Con ayuda de un bisturiacute cortar un fragmento pequentildeo de hoja de la planta acuaacutetica

Vallisneria sp (Hydrocharitaceae)

Colocar en el portaobjetos agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos

Observar en el microscopio e ilustrar las ceacutelulas poniendo especial atencioacuten al volumen

celular

Por otro lado sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp en una solucioacuten salina

Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente

Actividades

Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes conteste las siguientes

preguntas

1 iquestQueacute sustancias han atravesado la membrana plasmaacutetica

2 iquestCoacutemo es el medio extracelular en ambos casos iquestes hipertoacutenico hipotoacutenico o isotoacutenico

con respecto al citoplasma

3 iquestLas sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de

concentracioacuten

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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179 436-441

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 35

4 Analizar las caracteriacutesticas de los distintos mecanismos de transporte a traveacutes de la

membrana plasmaacutetica (difusioacuten simple difusioacuten facilitada oacutesmosis transporte activo) y

realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a

consumo de energiacutea gradiente de concentracioacuten y las moleacuteculas involucradas en el

transporte

5 Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa sentildealando su estructura

sustancia que transportan y localizacioacuten maacutes frecuente

6 Una solucioacuten es hipertoacutenica respecto a otra cuando posee

a) Menor concentracioacuten de soluto

b) Mayor concentracioacuten de soluto

c) Igual concentracioacuten de soluto

d) Mayor demanda de soluto

7 Una ceacutelula vegetal colocada en un medio cuya concentracioacuten de solutos es menor que la

de la ceacutelula

a) Se plasmoliza

b) Aumenta su presioacuten de turgencia

c) Pierde sus solutos por difusioacuten

d) Activa su sistema de vacuolas contraacutectiles

e) No experimenta ninguacuten cambio

8 Indique que ocurriraacute respecto al movimiento de solutos y agua si

a) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipertoacutenica

b) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten isotoacutenica

c) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten hipotoacutenica

d) Se somete a un gloacutebulo rojo a una solucioacuten muy hipotoacutenica

e) Se coloca a un alga marina en agua destilada

f) Se sumerge una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten salina hipertoacutenica

g) Se coloca una planta de Vallisneria sp en una solucioacuten hipotoacutenica

9 Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos

compartimentos A y B En A se coloca una solucioacuten de glucosa 3 M y se le agrega

almidoacuten que conforma una suspensioacuten En B se coloca agua destilada Indique queacute

cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente y los cambios

esperables en la variacioacuten de voluacutemenes de solvente en ambos compartimentos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

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Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

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Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Ed Omega

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 36

Trabajo Praacutectico Nordm 8

CITOESQUELETO

El citoesqueleto es un sistema citoplasmaacutetico de fibras esencial para la movilidad y

estructura celular Estaacute constituido por tres tipos de fibras citosoacutelicas microfilamentos

(filamentos de actina) filamentos intermedios y microtuacutebulos Estas fibras citoesqueleacuteticas

estaacuten compuestas por poliacutemeros bien ordenados construidos a partir de pequentildeas subunidades

proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes

El citoesqueleto no es una estructura estaacutetica sino que estaacute sometido a

reordenamientos constantes capaces de producir movimientos Desempentildea un papel

estructural importante al sostener la membrana plasmaacutetica y formar carriles a lo largo de los

cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol Asiacute el citoesqueleto

interviene en el mantenimiento de la forma celular la movilidad celular y los cambios

coloidales que experimenta el citoplasma

Objetivos

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto

Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular

Reconocer los mecanismos baacutesicos de movimiento de las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microscopio oacuteptico

Actividades

Para el presente praacutectico se observaraacuten preparados permanentes y realizaraacuten

preparaciones para microscopio oacuteptico a los efectos de observar diferentes elementos del

citoesqueleto Los materiales a observar en cada caso se detallan a continuacioacuten

1 Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos

Observar detenidamente el preparado hasta hallar alguacuten organismo ciliado o flagelado

Esquematizar y colocar las referencias pertinentes

2 Observar los preparados de espermatozoides de Mamiacuteferos provistos por la caacutetedra

Analizar la preparacioacuten y esquematizar detalladamente los flagelos

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

Ed Omega

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 37

3 Observar preparados permanentes de corte transversal de traacutequea Esquematizar las ceacutelulas

ciliadas

4 Observar ceacutelulas en divisioacuten mitoacutetica de Allium cepa con y sin pretratamiento Analizar y

esquematizar las ceacutelulas

Observacioacuten de elementos del citoesqueleto en microfotografiacuteas electroacutenicas

Actividades

En la presente clase se observaraacuten microfotografiacuteas electroacutenicas de distintos organelos

y de componentes del citoesqueleto En las mismas se deberaacute identificar el componente del

citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen

5 Microfotografiacutea electroacutenica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide

humano

6 Centriacuteolos

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Avers C J 1991 Biologiacutea Celular Ed Iberoameacuterica Meacutexico

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

El Ateneo Buenos Aires

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Esau K1982 Anatomiacutea de las plantas con semillas Ed Hemisferio Sur S A

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Selosse M A amp S Loiseaux-de Goeumlr 1997 La saga de la endosimbiosis Mundo Cientiacutefico

179 436-441

Strasburger E 1986 Tratado de Botaacutenica8va ed Ed Omega S A

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

Ed Omega

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 38

7 Microfotografiacutea electroacutenica de cilios en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo

basal

Contestar el siguiente cuestionario

1 iquestEn queacute fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada

2 iquestEn queacute etapa de la divisioacuten de una ceacutelula animal y de queacute manera se organiza el huso

mitoacutetico Compare con lo que ocurre en ceacutelulas vegetales

3 iquestQueacute funcioacuten de la actividad celular se veriacutea alterada por la accioacuten de la colchicina

4 Sentildeale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a traveacutes del siguiente cuadro

Cilios

Flagelos

Cantidad

Longitud

Diaacutemetro

Forma de movimiento

Ejemplos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

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Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 39

Trabajo Praacutectico Nordm 9

ORGANELOS CITOPLASMAacuteTICOS

La mayor parte de las ceacutelulas eucariotas contienen abundantes membranas internas

que cierran compartimentos especiacuteficos las organelas y los separa del resto del citoplasma la

regioacuten de la ceacutelula que estaacute por fuera del nuacutecleo Casi todas las organelas estaacuten rodeadas por

una uacutenica membrana fosfolipiacutedica pero varias de ellas entre ellas el nuacutecleo estaacuten encerradas

por dos membranas

Cada tipo de organela desempentildea una funcioacuten singular en el crecimiento y

metabolismo de la ceacutelula y cada una contiene un conjunto de enzimas especiacuteficas que

catalizan las reacciones quiacutemicas requeridas Las membranas que definen estos

compartimentos subcelulares controlan su composicioacuten ioacutenica interna de manera que estas

suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas

Objetivos

Conocer la morfologiacutea de los organelos membranosos presentes en eucariotas

Relacionar la morfologiacutea con la fisiologiacutea de dichos organelos

Reconocer el tipo de ceacutelula en que se encuentran presentes los organelos

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Pinzas de diseccioacuten

Portaobjetos y cubreobjetos

Gotero

Hoja de afeitar o bisturiacute

Actividades

Durante la clase praacutectica se efectuaraacute la observacioacuten de diferentes tipos de organelos

citoplasmaacuteticos Pare ello se realizaraacuten preparaciones para microscopio oacuteptico que seraacuten

examinadas detenidamente En todos los casos se deberaacuten esquematizar las ceacutelulas con cada

organelo observado indicando sus respectivas referencias Una vez finalizado el trabajo

praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos realizados

1 Cloroplastos

La observacioacuten de cloroplastos se efectuaraacute en hojas de Vallisneria para lo cual se

deberaacute seguir procedimiento que se detalla a continuacioacuten

1 Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturiacute

2 Colocar el fragmento sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos

4 Observar en el microscopio primero con el menor aumento y luego pasar a 40x

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

En las ceacutelulas se podraacute observar la pared celular los cloroplastos que rodea la zona de las

vacuolas El nuacutecleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de

cloroplastos que lo enmascaran

2 Nuacutecleo y nucleolo

Para la visualizacioacuten de nuacutecleos y nucleolos se emplearaacuten ceacutelulas de la epidermis

Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1994 Biologiacutea molecular

de la ceacutelula 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona Espantildea

Cooper G M 2002 La Ceacutelula 2deg Edicioacuten Ed Marbaacuten Espantildea

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Lodish H A Berk SL Zipursky P Matsudaira D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea

Celular y Molecular 4ordf ed Ed Panamericana Espantildea

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Selosse M A amp S Loiseaux-de Goeumlr 1997 La saga de la endosimbiosis Mundo Cientiacutefico

179 436-441

Strasburger E 1986 Tratado de Botaacutenica8va ed Ed Omega S A

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Esau K 1976 Anatomiacutea Vegetal 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

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Ed Omega

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Biologiacutea Celular y Molecular 52

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

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De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 40

interna de la tuacutenica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla El procedimiento a

realizar es el siguiente

1 Tomar un trozo de tuacutenica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara

coacutencava una parte de la epidermis

2 Colocar la epidermis sobre un portaobjetos

3 Agregar una gota de safranina

4 Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio

5 Examinar detenidamente esquematizar las ceacutelulas con cada organelo e indicar las

respectivas referencias

Con menor aumento podraacute observar la forma de las ceacutelulas con mayor aumento podraacute

ver el nuacutecleo coloreado de rojo y uno o maacutes nucleolos En el citoplasma podraacute observar

inclusiones lipiacutedicas que se presentan como graacutenulos refringentes

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 41

Trabajo Praacutectico Nordm 10

ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS

La ceacutelula eucarioacutetica tiene un alto grado de organizacioacuten estructural Una vasta red

membranosa de tuacutebulos vesiacuteculas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos

compartimentos fundamentales uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado

por fuera de ellas (matriz citoplasmaacutetica o citosol)

Las membranas internas proporcionan a las ceacutelulas un soporte para la localizacioacuten

ordenada de muacuteltiples sistemas enzimaacuteticos diferentes y de subcompartimientos funcionales

cerrados (organelas) cada uno de ellos con estructura dotacioacuten enzimaacutetica y propiedades

funcionales que lo caracterizan tales como a) separacioacuten y asociacioacuten de sistemas

enzimaacuteticos b) digestioacuten intracelular de sustancias c) distribucioacuten de las diferentes proteiacutenas

hacia sus destinos finales d) regulacioacuten de potenciales de membrana de gradientes ioacutenicos y

de diferentes valores de pH intracelular etc

Objetivos

Entender las funciones de los organelos citoplasmaacuteticos membranosos y no membranosos

Conocer la estructura de los diferentes organelos

Relacionar la morfologiacutea y fisiologiacutea de dichos organelos con el tipo de ceacutelula en que se

encuentran presentes

Actividades

1 Se deberaacuten observar detenidamente las ilustraciones y fotografiacuteas que se encuentran a

continuacioacuten

2 En cada caso se deberaacute indicar el organelo citoplasmaacutetico de que se trata

3 Posteriormente se colocaraacuten las respectivas referencias

4 Describir la funcioacuten de cada uno de los organelos dentro de la ceacutelula

a-

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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179 436-441

Strasburger E 1986 Tratado de Botaacutenica8va ed Ed Omega S A

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

Ed Omega

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 42

Cuestionario

1 iquestCuaacuteles son los organelos membranosos que puede tener una ceacutelula eucariota

2 iquestQueacute organelos no forman parte del sistema de endomembranas iquestQueacute actividades

desempentildean dichos organelos

3 Las mitocondrias cloroplastos y peroxisomas estaacuten rodeados por membrana iquestPor queacute no

se los considera parte del sistema de endomembranas

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Selosse M A amp S Loiseaux-de Goeumlr 1997 La saga de la endosimbiosis Mundo Cientiacutefico

179 436-441

Strasburger E 1986 Tratado de Botaacutenica8va ed Ed Omega S A

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Esau K 1976 Anatomiacutea Vegetal 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Raven P H Evert R F amp Einchhorn S E 1992 Biologiacutea de las Plantas Ed Reverteacute

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Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 43

Trabajo Praacutectico Nordm 11

CEacuteLULA VEGETAL

Las ceacutelulas vegetales poseen tiacutepicamente una pare celular semi-riacutegida y el

protoplasto El protoplasto incluye el citoplasma y el nuacutecleo La matriz citoplasmaacutetica estaacute

frecuentemente en movimiento fenoacutemeno que se denomina flujo citoplasmaacutetico o ciclosis

Una de las caracteriacutesticas mas sobresalientes de las ceacutelulas vegetales es la presencia de una

pared celular la cual tiene diversas funciones La pared celular protege los contenidos de la

ceacutelula da rigidez a la estructura celular provee un medio poroso para la circulacioacuten y

distribucioacuten de agua minerales y otras pequentildeas moleacuteculas nutrientes ademaacutes de contener

moleacuteculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las

enfermedades De afuera hacia dentro de la ceacutelula presenta varias capas que se desarrollan con

la maduracioacuten celular la laminilla media la pared primaria y la pared secundaria En la pared

primaria es dominante la matriz amorfa formada por hemicelulosas y polisacaacuteridos no

celuloacutesicos En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa 60) y la matriz amorfa

estaacute formada por hemicelulosas y lignina (30) Las comunicaciones intercelulares como los

plasmodesmos puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las ceacutelulas

vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armoacutenica

Las ceacutelulas vegetales tambieacuten se caracterizan por la presencia de vacuolas en el

citoplasma las que tiene el importante papel de la rigidez tisular la degradacioacuten de

macromoleacuteculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la ceacutelula En una ceacutelula adulta las

vacuolas ocupan casi todo el interior de la ceacutelula limitando el protoplasma a una delgada capa

parietal La membrana que limita la vacuola el tonoplasto es selectivamente permeable e

interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento El

contenido de la vacuola es el jugo celular y estaacute constituido por agua y una variedad de

compuestos orgaacutenicos e inorgaacutenicos Las vacuolas actuacutean tambieacuten como lisosomas orgaacutenulos

digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgaacutenulos innecesarios Las

sustancias ergaacutesticas son productos del metabolismo celular de reserva o de desecho que se

acumulan en la pared celular en las vacuolas o en plaacutestidos como hidratos de carbono o

cristales

Los plastos (cloroplastos cromoplastos y leucoplastos) estaacuten rodeados por una

envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican seguacuten los tipos de pigmentos

que contiene

Objetivos

Reconocer la ceacutelula como unidad estructural de los tejidos vegetales

Identificar las partes constitutivas y los orgaacutenulos que componen la ceacutelula vegetal

Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergaacutesticas en la ceacutelula

vegetal

Actividades

1- Observar analizar y dibujar

a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus

sp)

b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de pareacutenquima de fruto de pera (Pyrus

communis)

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

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Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de peciacuteolo de sandalia

de pescador (Philodendron sp)

d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero

(Ficus elastica)

e) Cromoplastos en ceacutelulas de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento)

Las ceacutelulas que observaraacute son polieacutedricas con paredes celulares delgadas En el citoplasma

podraacute observar cromoplastos ahusados o esfeacutericos de color rojo vivo o amarillo

f) Leucoplastos en tubeacuterculos de Solanum tuberosum (papa)

2- Responder el siguiente cuestionario

a) iquestCuaacuteles son las principales diferencias entre las ceacutelulas animales y las vegetales

b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas

c) iquestQueacute caracteriacutesticas de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la

fotosiacutentesis

3- Colocar las referencias

a)- Porcioacuten de pared entre dos ceacutelulas

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biologiacutea Celular y Molecular 45

d) Perforaciones

Bibliografiacutea

De Robertis M F J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular 12ordm edicioacuten Ed

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Esau K 1976 Anatomiacutea Vegetal 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Karp G 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Raven P H Evert R F amp Einchhorn S E 1992 Biologiacutea de las Plantas Ed Reverteacute

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Strasburger E Noll F Schench H amp Schimper A F W 1994 Tratado de Botaacutenica 2ordm ed

Ed Omega

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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d) Perforaciones

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Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

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Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

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Biologiacutea Celular y Molecular 52

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 46

Trabajo Praacutectico Nordm 12

ESTRUCTURA Y FUNCIOacuteN DE LOS CROMOSOMAS

El teacutermino cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para

referirse a los filamentos del nuacutecleo que se tintildeen con colorantes baacutesicos y que son los

portadores de los genes Actualmente se lo define como una moleacutecula de ADN asociado a

proteiacutenas que porta informacioacuten geneacutetica dispuesta en secuencia lineal En el caso de los

procariotas solamente hay un cromosoma circular mientras que en los eucariotas hay varios

cromosomas lineales cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN

Antes de la divisioacuten celular cada cromosoma eucarioacutetico se encuentra formado por dos

cromaacutetidas hermanas geneacuteticamente ideacutenticas ya que una es la copa exacta de la otra Cada

cromaacutetida se encuentra formada por una uacutenica hebra de ADN que se extiende desde un

extremo a otro del cromosoma Cada uno de estos extremos se denomina teloacutemero El punto

en que se encuentran unidas las dos cromaacutetidas hermanas es la constriccioacuten primaria o

centroacutemero

El centroacutemero contiene una regioacuten especial llamada cinetocoro que es la que se une a

las fibras del huso acromaacutetico durante la divisioacuten celular Algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria tambieacuten llamada regioacuten organizadora de nucleolos

(NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr

La posicioacuten de la constriccioacuten secundaria determina la existencia de un sateacutelite que es

la parte distal del brazo que lleva la constriccioacuten secundaria El centroacutemero divide al

cromosoma en dos brazos cromosoacutemicos y determina la forma del cromosoma

Objetivos

Comprender la estructura de los cromosomas

Conocer las diferentes formas de cromosomas

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitoacuteticos de

diferentes organismos A partir de los mismos deberaacuten realizar las siguientes actividades

Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

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Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Lacadena J R 1988 Geneacutetica Ed Agesa Madrid

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Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Biologiacutea Celular y Molecular 52

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

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Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

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Biologiacutea Celular y Molecular 47

1 Determinar el nuacutemero de cromosomas caracteriacutestico de la especie analizada

2 Esquematizar una metafase mitoacutetica de cada preparado observado

3 Seguacuten la morfologiacutea de los cromosomas determinar los distintos tipos que presenta cada

especie

Bibliografiacutea

Gardner EJ MJ Simmons amp DP Snustad 1998 Principios de Geneacutetica 4ordf ed Ed

Limusa Wiley Meacutexico

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Biologiacutea Celular y Molecular 52

Buenos Aires

Gardner E 1971 Principios de Geneacutetica Ed Limusa-Wiley Meacutexico

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 48

Trabajo Praacutectico Nordm 13

CARIOTIPO

La representacioacuten graacutefica o fotograacutefica de los cromosomas somaacuteticos caracteriacutesticos de

una especie determinada se conoce como cariotipo A traveacutes de este se puede establecer el

nuacutemero tamantildeo y forma de los cromosomas e identificar los miembros de cada par de

cromosomas homoacutelogos Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su

morfologiacutea por lo que se utilizan teacutecnicas de bandeo cromosoacutemico para posibilitar la

distincioacuten de los cromosomas del mismo tamantildeo e identificar los homoacutelogos

El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que estaacuten en metafase mitoacutetica

cada uno de los cuales estaacute formado por dos cromaacutetidas hermanas unidas a la altura de sus

centroacutemeros El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la deteccioacuten de ciertas

enfermedades geneacuteticas que son causadas por anormalidades en el nuacutemero o en la estructura

de los cromosomas

Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafaacutesica

Cariotipo

Idiograma

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

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Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Biologiacutea Celular y Molecular 52

Buenos Aires

Gardner E 1971 Principios de Geneacutetica Ed Limusa-Wiley Meacutexico

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 49

Objetivos

Comprender la importancia del cariotipo

Conocer los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

Materiales

Laacutepiz negro y goma

Hojas blancas lisas

Regla milimetrada

Tijera

Goma de pegar

Actividades

Se proveeraacute a los alumnos de fotografiacuteas de ceacutelulas vegetales en metafase mitoacutetica a

partir de las cuales se confeccionaraacute el cariotipo El primer lugar se les deberaacute asignar un

nuacutemero arbitrario a cada cromosoma y se mediraacute el brazo corto y el largo total de cada uno

calculando el correspondiente iacutendice centromeacuterico (brazo corto x 100 largo total del

cromosoma) Luego se formaraacuten los pares de cromosomas de acuerdo a los paraacutemetros

obtenidos anteriormente se recortaraacute cada cromosoma y de construiraacute el cariotipo Para ello

se colocaraacuten en primer teacutermino los cromosomas m luego los sm los st los ac y por uacuteltimo los

t Dentro de cada grupo seraacuten ordenados de acuerdo a su tamantildeo en forma decreciente (de

mayor a menor)

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacute entregar los cariogramas realizados

incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las

preguntas que se detallan a continuacioacuten

1 iquestQueacute se representa a traveacutes del cariotipo

2 Indique los pasos para la realizacioacuten de un cariotipo

3 iquestEn que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y

como se los observa

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Curtis H amp N S Barnes 1993 Biologiacutea 5ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos

Aires

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Lacadena J R 1988 Geneacutetica Ed Agesa Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

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Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Biologiacutea Celular y Molecular 52

Buenos Aires

Gardner E 1971 Principios de Geneacutetica Ed Limusa-Wiley Meacutexico

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

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Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

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Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 50

Trabajo Praacutectico Nordm 14

ETAPAS DEL CICLO CELULAR

El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las ceacutelulas durante su

proceso vital es decir proliferacioacuten (eventualmente reposo proliferativo) diferenciacioacuten

envejecimiento y muerte celular Todas estas etapas estaacuten finamente reguladas Durante el

ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinoacutenimo de ciclo celular) la ceacutelula replica su

DNA y se divide con lapsos de tiempo entre estas dos etapas de tal manera que este proceso

se puede dividir en 4 fases Fase S (siacutentesis de DNA) G1 (lapso entre la divisioacuten celular y la

fase S) G2 (lapso entre la fase S y la divisioacuten siguiente) y M (mitosis y citocinesis)

En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno una ceacutelula

puede salir del ciclo proliferativo sin necesariamente seguir el camino de la diferenciacioacuten

Este periacuteodo de tiempo se denomina G0 y se dice que la ceacutelula estaacute en reposo proliferativo La

salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1 En el control del ciclo

proliferativo participan un conjunto de proteiacutenas kinasas que son reguladas a su vez por otras

proteiacutenas denominadas ciclinas Luego que el DNA se replica se activan mecanismos de

revisioacuten del material geneacutetico que detectan y reparan posibles fallas en el DNA para proceder

a la divisioacuten celular Otros puntos de control importantes (check points) estaacuten en G1 y la

mitosis La entrada en mitosis estaacute finamente controlada por un complejo proteico

denominado MPF (factor promotor de la mitosis) Este complejo consiste en una proteiacutena

denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y estaacute regulado por

fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se

inactiva (por degradacioacuten de la ciclina) al teacutermino de eacutesta Un complejo similar regula la

entrada en fase S y el proceso en su conjunto estaacute controlado por sentildeales extracelulares

denominadas en general factores de crecimiento

Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares

sucesivas a partir de una sola ceacutelula original el cigoto el cual porta dos dotaciones

cromosoacutemicas una derivada del padre y otra de la madre El fenoacutemeno de la divisioacuten celular

es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes aunque

los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua Las etapas se denominan

profase metafase anafase y telofase

Durante la mitosis ocurren una serie de cambios caracteriacutesticos dentro de la ceacutelula y

especialmente en los cromosomas Estos comienzan a contraerse por condensacioacuten de la

cromatina hasta llegar a individualizarse (profase a metafase) luego se ordenan en la placa

ecuatorial (metafase) separan sus cromaacutetidas y migran a polos opuestos (anafase) por uacuteltimo

se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase) La ceacutelula finalmente se

divide por invaginacioacuten de la membrana citoplasmaacutetica en el caso de los animales o por

formacioacuten de un tabique en las ceacutelulas vegetales

Objetivos

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones

Distinguir las distintas fases de la mitosis

Interpretar el mecanismo de distribucioacuten de los cromosomas durante la divisioacuten mitoacutetica

Observar el efecto de las sustancias quiacutemicas sobre la proliferacioacuten celular

Establecer la duracioacuten comparativa de las diferentes etapas de la mitosis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Calculadora

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Biologiacutea Celular y Molecular 52

Buenos Aires

Gardner E 1971 Principios de Geneacutetica Ed Limusa-Wiley Meacutexico

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

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Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

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Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

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Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 51

Observaciones

Se deberaacuten observar los preparados de mitosis provistos por la caacutetedra y diferenciar los

distintos estadios de la mitosis Se deberaacute poner especial eacutenfasis en los fenoacutemenos que

ocurren en cada fase de la divisioacuten mitoacutetica Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten

entregar los dibujos realizados junto con las respuestas que se detallan a continuacioacuten

Actividades

1 Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis

observado en el microscopio oacuteptico

2 Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado

3 iquestEn queacute fase resulta maacutes faacutecil el recuento de los cromosomas

4 iquestCuaacuteles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento

5 Determinar la proporcioacuten de ceacutelulas en interfase y en divisioacuten celular y la proporcioacuten de

ceacutelulas en cada fase de la mitosis Para ello elegir al azar varios campos de la preparacioacuten

y contar entre 200 ceacutelulas la cantidad de eacutestas que se encuentran en interfase profase

metafase anafase y telofase Con los datos obtenidos se deberaacute calcular el Indice

Mitoacutetico (IM) que es la razoacuten entre el nuacutemero de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten y

el nuacutemero total de ceacutelulas observadas multiplicado por 100

IM = Nordm ceacutel en divisioacuten x 100 =

Nordm de ceacutel observadas

6 Tambieacuten se deberaacute calcular el Indice de Fases (IF) que es la razoacuten entre la cantidad de

ceacutelulas en cada fase y el nuacutemero total de ceacutelulas en divisioacuten multiplicado por 100

IF = Nordm ceacutel en una fase x 100 =

Nordm de ceacutel en divisioacuten

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deben entregar todos los datos obtenidos y las

respuestas que se detallan a continuacioacuten

7 iquestCuaacutel es el porcentaje de ceacutelulas que se encuentran en divisioacuten en cada caso

8 iquestCuaacutel es la fase maacutes frecuente

9 iquestQueacute proporcioacuten de ceacutelulas se observan en cada fase de la mitosis

10 Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas

Bibliografiacutea

Alberts B Johnson A Lewis J Raff M Keiths R y Walter P 4ta Edicioacuten 2002

Molecular Biology of the Cell Garland Science Taylor and Francis Group New York USA

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Biologiacutea Celular y Molecular 52

Buenos Aires

Gardner E 1971 Principios de Geneacutetica Ed Limusa-Wiley Meacutexico

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

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Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

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Buenos Aires

Gardner E 1971 Principios de Geneacutetica Ed Limusa-Wiley Meacutexico

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Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Strickberger M W 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Villee C A 1996 Biologiacutea 8ordm Edicioacuten Ed McGraw-Hill Interamericana Meacutexico

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 53

Trabajo Praacutectico Nordm 15

MEIOSIS

La meiosis es un tipo especial de divisioacuten celular que ocurre en los organismos

superiores durante la formacioacuten de las gametas La palabra ldquomeiosisrdquo significa reduccioacuten o

disminucioacuten debido a que su funcioacuten es la reduccioacuten del nuacutemero de cromosomas a la mitad

En la meiosis ocurren una serie de fenoacutemenos caracteriacutesticos y particulares la

disminucioacuten del nuacutemero cromosoacutemico a la mitad el apareamiento y recombinacioacuten entre

cromosomas homoacutelogos y la distribucioacuten al azar de los cromosomas a las ceacutelulas hijas

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la divisioacuten meioacutetica

Observar el apareamiento de los cromosomas homoacutelogos

Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meioacuteticos

Esquematizar todas las etapas de la divisioacuten meioacutetica

Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Agujas

Mechero

Botones florales

Tubos de ensayo

Portaobjetos y cubreobjetos

Alcohol

Aacutecido aceacutetico

Orceiacutena aceacutetica

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

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COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

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EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 54

Actividades

1 Se eligen botones florales todaviacutea en un estado de desarrollo incipiente antes de que se

llegue a abrir la flor

2 Para interrumpir la meiosis se deben fijar las ceacutelulas para ello se sumergen en tubos de

ensayo con una mezclas de seis partes de etanol tres partes de aacutecido aceacutetico y una parte de

cloroformo (fijador Carnoy) es este estado se puede conservar el material de estudio

durante meses e incluso antildeos (Es preferible mantenerlo en friacuteo) La otra mezcla que se

puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etiacutelico absoluto y 1 de aacutecido aceacutetico)

3 Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botoacuten para extraer las anteras

4 Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a tentildeir con

orceiacutena aceacutetica o aacutecido aceacutetico Presionar las anteras con aguja histoloacutegica para la salida

de las ceacutelulas madres de los granos de polen Esparcir las ceacutelulas y desechar el resto de la

antera Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos Con la punta de un laacutepiz

con goma presionar suavemente para aplastar las ceacutelulas Flamear el preparado 2 o 3 veces

evitando la ebullicioacuten del liacutequido Con un papel de filtro retirar el excedente y luego

realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar

5 Observar al microscopio para ver con nitidez en queacute fase de la divisioacuten celular se

encuentra seraacute necesario utilizar el objetivo de inmersioacuten

6 Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada

2 Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material

estudiado

3 Calcular cuantas ceacutelulas y con cuantos cromosomas se obtendraacuten al final de la meiosis del

material estudiado

Una vez finalizado el trabajo praacutectico se deberaacuten entregar los dibujos de meiosis

realizados

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lacadena JR 1988 Geneacutetica 4ordm edicioacuten Ed Agesa Madrid

Lacadena JR 1996 Citogeneacutetica 1ordm edicioacuten Ed Complutense Madrid

Strickberger MW 1988 Geneacutetica 3ordm edicioacuten Ed Omega Barcelona

Zarlavski G E 2014 Histologiacutea Vegetal teacutecnicas simples y complejas 1ordm edicioacuten Ed

Sociedad Argentina de Botaacutenica SAB Buenos Aires Argentina

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 55

Trabajo Praacutectico Nordm 16

GAMETOGEacuteNESIS

En los animales la reproduccioacuten ocurre mediante la formacioacuten de gametos haploides que

se unen en el proceso de fecundacioacuten formando un cigoto diploide El proceso de fecundacioacuten

puede ser externo o interno En la fecundacioacuten externa como ocurre en los anfibios y peces

los gametos son liberados al exterior y alliacute se ponen en contacto En la fecundacioacuten interna se

produce la unioacuten de los gametos dentro del tracto genital femenino La fecundacioacuten interna

constituye una adaptacioacuten a la vida terrestre presente en muchos animales principalmente los

vertebrados superiores

Tanto en la fecundacioacuten externa como la interna se distinguen dos tipos de gametos el

gameto masculino o espermatozoide que es moacutevil y de tamantildeo pequentildeo y el gameto

femenino llamado oacutevulo que tiene mayor tamantildeo y es inmoacutevil

La gametogeacutenesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y

femeninos La gametogeacutenesis incluye a la meiosis y la diferenciacioacuten de las ceacutelulas

resultantes en oacutevulos y espermatozoides Los oacutevulos animales se caracterizan por acumular

nutrientes para el posterior desarrollo del embrioacuten mientras que los espermatozoides

generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al oacutevulo

Objetivos

Reconocer las distintas fases de la gametogeacutenesis

Visualizar diferentes estadios de la espermiogeacutenesis

Esquematizar todas las etapas de la espermatogeacutenesis

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepiz negro goma etc)

Actividades

1 Se realizaraacute la observacioacuten de preparados meioacuteticos provistos por la caacutetedra y dibujaraacuten los

estadios de la espermatogeacutenesis

2 Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogeacutenesis y

espermatogeacutenesis

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 56

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 57

Trabajo Praacutectico Nordm 17

ACCIOacuteN GEacuteNICA SIacuteNTESIS DE ARNr

Ademaacutes de la constriccioacuten primaria o centroacutemero algunos cromosomas suelen

presentar una constriccioacuten secundaria conocida como ldquoRegioacuten Organizadora Nucleolarrdquo

(NOR) Mediante las teacutecnicas citoloacutegicas convencionales esta regioacuten aparece como una zona

heteropicnoacutetica negativa (sin tentildeir) ubicada generalmente en posicioacuten subterminal en el brazo

del cromosoma denominaacutendose sateacutelite a la parte distal del brazo Por la presencia de dicho

sateacutelite a los cromosomas que llevan la regioacuten NOR se los denomina tambieacuten cromosomas

SAT o satelitados

En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosoacutemico

(ARNr) el cual formaraacute parte de los ribosomas Estos genes ribosoacutemicos se hallan reunidos

en ldquoclustersrdquo o grupos que contienen numerosas copias y forman la regioacuten NOR La cantidad

de copias de los genes ribosoacutemicos presentes en el genoma variacutea entre diferentes organismos

Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias en la mosca de la fruta

Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de

400 o 500 copias por genoma haploide

Las regiones organizadoras de nucleacuteolo que portan los genes ribosoacutemicos pueden

detectarse mediante la tincioacuten con nitrato de plata (NO3Ag) Una particularidad importante de

la tincioacuten con plata o tincioacuten argeacutentica es que solamente se tintildeen los NORs que estuvieron

activos durante la interfase anterior Ello significa que la tincioacuten argeacutentica puede ser usada

para analizar la actividad geacutenica en las regiones organizadoras de nucleacuteolo

Objetivos

Comprender las caracteriacutesticas y fundamentos de la tincioacuten argeacutentica

Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tincioacuten argeacutentica

Observar la estructura de los nucleolos

Materiales

Elementos para dibujar (hojas blancas laacutepices etc)

Actividades

En el desarrollo del trabajo praacutectico se observaraacuten preparaciones de cromosomas en

mitosis tentildeidas mediante la teacutecnica de impregnacioacuten con nitrato de plata o tincioacuten argeacutentica

Se deberaacuten esquematizar ceacutelulas en interfase con ellos nucleolos y ademaacutes metafases en

doacutende se observen los cromosomas portadores de los genes ribosoacutemicos o regiones NOR

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

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De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

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Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

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Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 58

Trabajo Praacutectico Nordm 18

COacuteDIGO GENEacuteTICO

Las reacciones que ocurren en los organismos vivos estaacuten siempre mediadas por

enzimas las cuales son proteiacutenas Una proteiacutena es un poliacutemero de subunidades menores

(monoacutemeros) llamados aminoaacutecidos Cada enzima consiste de un determinado nuacutemero de

aminoaacutecidos unidos en una secuencia especiacutefica En las proteiacutenas naturales se observan un

total de 20 aminoaacutecidos que de acuerdo a como se ordenen formaraacuten los diferentes tipos de

proteiacutenas

El molde para formar las proteiacutenas esta codificado en la cadena de ADN Cada

aminoaacutecido es codificado por 3 nucleoacutetidos los cuales constituyen un codoacuten Debido a que

existen cuatro bases diferentes (A T C G) el nuacutemero posible de combinaciones y por ende

de aminoaacutecidos seriacutea 43=64 Como los aminoaacutecidos son solamente 20 se deduce que existe

maacutes de un codoacuten para la mayoriacutea de los aminoaacutecidos

La informacioacuten del ADN es transcripta primeramente a ARNm utilizando al primero

como molde El mensajero pasa del nuacutecleo al citoplasma donde ocurriraacute la siacutentesis proteica

La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN llamado ARN de transferencia

(ARNt) que posee una secuencia complementaria a cada codoacuten llamada anticodoacuten Debido a

que cada codoacuten posee una secuencia especiacutefica existen tantos ARNt como aminoaacutecidos

Objetivos

Asimilar los conceptos de transcripcioacuten y traduccioacuten

Comprender la naturaleza y caracteriacutesticas del coacutedigo geneacutetico

Entender el mecanismo por el cual se transmite la informacioacuten del ADN hasta las

proteiacutenas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

Fibras de diferentes colores

Un libro de texto de Geneacutetica general

Actividades

A partir de la secuencia hipoteacutetica de ADN entregada por la Caacutetedra los alumnos

deberaacuten transcribir el ARN mensajero correspondiente Suponiendo que este no posee

intrones se deberaacute formar un polipeacuteptido valieacutendose de una tabla con los codones que

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 59

codifican cada tipo aminoaacutecido Se deberaacute tener en cuenta que la lectura se realiza en

direccioacuten 5rsquo-3rsquo y que el codoacuten de inicio es siempre AUG

Resultados

Se deberaacute detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante Tambieacuten se

deberaacute especificar e ilustrar a que aminoaacutecidos corresponden los codones utilizando un color

diferente para cada uno de ellos Por uacuteltimo mediante un esquema se detallaraacute la cadena

polipeptiacutedica resultante

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

De Robertis EMF J Hib amp R Ponzio 1996 Biologiacutea Celular y Molecular Ed El Ateneo

Buenos Aires

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Lodish H A Berk S L Zipursky D Baltimore amp J Darnell 2002 Biologiacutea Celular y

Molecular 4ordm edicioacuten Ed Meacutedica Panamericana Buenos Aires

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Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 60

Trabajo Praacutectico Nordm 19

EXTRACCIOacuteN DE ADN VEGETAL

En la literatura se han descripto varios procedimientos de extraccioacuten de ADN de tejidos

vegetales los cuales variacutean dependiendo de la clase del material que se quiere analizar

(especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco liofilizado etc) Sin embargo los

protocolos utilizados son baacutesicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente

catioacutenico (CTAB cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS sodium dodecyl

sulfate) en el buffer de extraccioacuten Cuando se trabaja con un gran nuacutemero de plantas como es

el caso de los bancos de germoplasma se requiere un meacutetodo raacutepido y eficiente de extraccioacuten

que permita obtener ADN de alta calidad La metodologiacutea de extraccioacuten de ADN es raacutepida

sencilla y permite la obtencioacuten de ADN genoacutemico de buena calidad libre de compuestos

secundarios proteiacutenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN los cuales inhiben la

reaccioacuten de amplificacioacuten de ADN Estos protocolos involucran varias etapas baacutesicas que se

describen a continuacioacuten

Objetivos

Conocer los fundamentos de la extraccioacuten y purificacioacuten de ADN

Reconocer los pasos indispensables para la extraccioacuten de ADN en un protocolo

Comprender y analizar cada una de las etapas

Materiales

Elementos de dibujo (hojas blancas laacutepices etc)

PROTOCOLO

a) Material Fresco

1) Pulverizar con nitroacutegeno liacutequido tejido foliar joven recieacuten cortado

2) Agregar 15 ml de buffer de extraccioacuten

El buffer de extraccioacuten consiste en 1ml de CTAB II 400 ul de Cloroformo ndash alcohol

isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol

3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 15 o 2 ml e incubar por 10 minutos

a 55ordmC agitando cada 3 minutos (Mucho cuidado en esta operacioacuten ya que el cloroformo a

esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos)

4) Centrifugar por 10 minutos a maacutexima revolucioacuten

5) Recuperar el sobrenadante con mucho cuidado de no tocar el pellet

6) Agregar 12 voluacutemenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar

7) Descartar el sobrenadante con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin

de no re-suspender el pellet y perderlo

8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante y dejar secar

9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 microl de RNasa

b) Material en Siacutelica - Gel

En general es lo mismo que en material fresco con la excepcioacuten de que no es necesario el

nitroacutegeno liacutequido para pulverizar el tejido foliar

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York

Biologiacutea Celular y Molecular 61

Responder

1- iquestCuaacutel es la diferencia entre ADN genoacutemico y ADN cromosoacutemico

2- iquestQueacute son las nucleasas

3- Describa cuaacutel es el objetivo de cada una de las siguientes etapas

a- Extraccioacuten de aacutecidos nucleicos

b- Purificacioacuten de los aacutecidos nucleicos

Bibliografiacutea

Alberts B D Bray J Lewis M Raff K Roberts amp J D Watson 1989 Molecular biology

of the Cell 2ordm edicioacuten Ed Garland Publ Inc New York

Ferreira M E amp D Grattapaglia 1998 Introduccioacuten al Uso de Marcadores Moleculares en

el Anaacutelisis Geneacutetico 1 ed Brasiacutelia EMBRAPA-CENARGE Pp 220

Griffiths AJF JH Miller DT Suzuki RC Lewontin amp WM Gerbart 1996 An

Introduction to Genetic Analysis 6ordm edicioacuten Ed Freeman amp Co New York