SECUENCIACION

Paraclnicos Moleculares y de Gentica ForenseGISEL GORDILLO GONZLEZESP. GENTICA MDICAHIBRIDACIN

Unin complementaria de cidos nucleicosTcnicas: Detectar una molcula partiendo de una sonda complementaria a ella. PCR Arrays Hibridacin in situLa hibridacin es la unin complementaria de cidos nucleicos (ADN o ARN). Tcnicas de hibridacin se utilizan a menudo para detectar una molcula diana partiendo de una sonda complementaria a ella. Muchas tcnicas moleculares estn basadas en la hibridacin. Entre ellas estn tcnicas tan importantes como la PCR o las tecnologas de arrays de ADN. Tcnicas basadas en hibridacin se usan habitualmente en el diagnstico de enfermedades, la identificacin de microorganismos patgenos, el estudio de perfiles de expresin gnica, la localizacin de genes en cromosomas o de ARNm en tejidos (hibridacin in situ) o en la comparacin de especies hibridando su ADN. 2ELECTROFORESISSepara molculas en un campo elctrico segn tamao y carga elctrica.Siembra de la muestraGel porosoAplicar campo elctricoMigracinTincin (bromuro de etidio) para visualizacin

La electroforesis en gel es una tcnica sencilla empleada de forma rutinaria en laboratorio para separar molculas biolgicas especialmente ADN, ARN y protenas. Permite separar especies qumicas (cidos nucleicos o protenas) a lo largo de un campo elctrico en funcin de su tamao y de su carga elctrica. Los cidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extrado de una muestra biolgica sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo elctrico, se producir la migracin diferencial de los fragmentos a travs de los poros de la matriz. La tincin del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molcula de ADN, y la exposicin con luz ultravioleta, permite observar el resultado de sta migracin. El tamao de los fragmentos de ADN se puede estimar comparndolos con el patrn de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido3PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa)Tcnica de Biologa Molecular descrita por Kary Mullis en 1983, bioqumico.

Premio Nobel de Qumica, en 1993 junto con Michael Smith

4La PCR fue descrita en 1983 por Kary Mullis quien obtuvo un premio Nobel por ello.PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa)Objetivo:Amplificacin directa de un gen o fragmento de ADN, o indirecta de un RNA

RequisitoConocer la secuencia de una parte

5PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa)FUNDAMENTO:Propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, usando ciclos de alta y baja T para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

6T: temperaturaInicialmente la tcnica era bastante lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.

Aplicaciones de la PCRDiagnstico clnicoMonitoreo y evaluacin de terapiasDeteccin de cepas resistentes a antibiticosDeteccin de mutaciones puntualesPolimorfismos genticosMedicina forensePedigr animalControl de calidad

TermocicladorComponentes de la PCR

Muestra ADN

Primers (cebadores)

dNTPs8Muestra de ADNNo quelantes (EDTA) [Mg]

Terapia de Quelantes9EDTA: (cido etilen diamino tetractico)La muestra no debe llevar agentes quelantes (EDTA) que reducen la concentracin de iones de Mg en la disolucin. Tampoco debe haber determinados factores sanguneos, fenol, detergentes... que inhibiran la actividad de la polimerasa.

*Terapia de quelantes: es una terapia usada hoy en da en la que se administra EDTA que actua capturando los iones de metales para as, eliminar obstrucciones en las arterias, mejorando la circulacin sangunea.

Muestra de ADNADN no puede estar fragmentado en trozos ms pequeos de lo que queremos amplificar.

Cantidad de la muestra: mnimo 10-100 ng. y mximo 400-500 ng.

10La muestra se puede obtener de casi cualquier tejido, pero el ms fcil y preferible es la SANGRE PERIFRICA.Posteriormente se hace una extraccin del ADN de los leucocitos obtenindose ese filamento blanquecino que se observa en la imagen de la derecha.Primers (Cebadores)El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. Relacin mx purinas/pirimidinas = 60%/40%. Tamao: 18-30 pb. Tm= 4 (G+C) + 2(A+T)

11Los primers para realizar las PCR son diseados por medio de programas de computador. La clave reside en usar la formula de arriba, para as asegurarnos que la relacin entre purinas y pirimidinas no sobrepase 60%/40%La Tm (temperatura de melting de fusin) es la temperatura a la cual los primers se unen a su blanco en el ADN. Se calcula basado en la cantidad de nucleotidos de pirimidina y guanina en el primer.ADN PolimerasaTermolbiles TermoestablesActualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq polimerasa. Termus aquaticus

12Las ADN polimerasas son una familia de enzimas normales en la naturaleza. En principio se usaba un tipo que era termolbil, es decir, que cada vez que se elevaba la temperatura la enzima se degradaba y haba que agregar nueva enzima en cada ciclo.Hoy en da se utilizan las termoestables, que pueden soportar grandes temperaturas. La ms usada es la Tag Polimerasa, extrada de la bacteria Termus Aquaticus (de ah su nombre) que vive en los termales, por lo que sobrevive y trabaja con temperaturas de hasta 200C.

Otros reactivosUtilizamos dNTPs (Deoxinucletidos trifosfato)dATP, dGTP, dCTP y dTTPConcentraciones iguales.

[dNTPs] = [Mg++]13Los dNTPs deben agregarse a la reaccin en partes iguales, porque si hay menos cantidad de uno que de los otros, la cadena de ADN puede quedar incompleta.Los dNTPs pueden captar Magnesio por lo que las concentraciones de ambos componentes deben guardar siempre la misma relacin.

Principios (pasos) de la PCRDenaturalizacin reversible del ADN, por calentamientoAnillamiento del primerSntesis de la cadena de ADN por una ADN polimerasa en sentido 5 3

14

http://www.fitolab.com.mx/fitolabSiteRecs/esquemaPCR.jpg

Aunque la imagen dice desnaturalizar no es as; es denaturar.Alineacin del cebador, es lo mismo que hibridacin o anillamiento del primer.

15La deteccin del producto de la PCR, se hace por electroforesis

ProductoAmplificado (AMPLICON)16Todos el proceso de los ciclos ocurre en la cmara del termociclador, donde realmente no sabemos si el proceso esta siendo llevado a cabo de manera correcta. Por ello, luego de terminar, se debe hacer una comprobacin, y revisar si en verdad obtuvimos Amplicones (productos amplificados en una PCR)Para eso se realiza una electroforesis, generalmente en gel de poliacridamida o agarosa. Si la PCR fue adecuada, se observaran las bandas del producto, sino, no se ver nada.PCR en Tiempo RealPermite cuantificar adems de detectar y amplificar secuencias de ADNDiferencias:Uso de Reporteros fluorescentes (Beacons)

http://www.docstoc.com/docs/108459246/PCR-en-Tiempo-Real

La PCR en tiempo real o PCR cuantitativa permite cuantificar adems de detectar y amplificar secuencias de ADN.En la PCR en tiempo real se emplean sondas marcadas con fluorocromos. Uno de los fluorocromos acta como donador de fluorescencia en el extremo 5 y el otro como aceptor de esta fluorescencia en el extremo 3, estos son los Beacons.El fluoroforo emite la seal (fluorescente) cuando el agente bloqueador (quencher) se encuentra alejado por efecto de la hibridacin a la secuencia blanco.17PCR en Tiempo Real

http://www.udg.edu/serveis/STRUBM/Tecniques/PCRquantitativa/tabid/13251/language/es-ES/Default.aspx

La ADN polimerasa se desplaza sobre la cadena de ADN sintetizando la cadena complementaria a partir de un fragmento de ADN que sirve de molde (cebador). Al llegar al punto en el que la sonda se ha hibridado, la hidroliza. El fluorocromo del extremo 5 de la sonda (el donador) es liberado. El fluorocromo aceptor no puede entonces absorber la fluorescencia del donador por estar alejado de l espacialmente. Un detector realiza la medida de esta emisin de fluorescencia, que es proporcional a la cantidad de ADN presente, y la representa grficamente. 18PCR en Tiempo RealVentajasAplicacionesAnlisis de la cintica de la reaccinDeteccin del producto en cada cicloMayor sensibilidad (menos falsos negativos)Ms rpidaMenos contaminacin (menos falsos positivos)

Cuantificacin expresin de genesControl eficacia frmacosDeteccin agentes infecciososDx. TumoresDeteccin polimorfismos

Adems de proporcionar informacin cuantitativa, la PCR en tiempo real presenta otra serie de ventajas frente a la PCR tradicional. La fundamental es su mayor sensibilidad lo que disminuye el riesgo de falsos negativos. Tambin es ms rpida y tiene menos probabilidad de contaminacin con lo que disminuyen los falsos positivos. Son muchas las aplicaciones de esta tcnica en el campo de la medicina. Cabe destacar la cuantificacin viral, la cuantificacin de la expresin de genes, el control de la eficacia de frmacos, la deteccin de agentes infecciosos, el diagnstico de tumores y la deteccin de polimorfismos.

19BLOTSWestern Blot InmunoblotNos permite visualizar anticuerpos (Acs) directos contra protenasPrueba confirmatoria para un ELISA de HIV positivo

http://www.pathology.ucla.edu/cirl/pages/publicview/images/autoblot.jpg21En Western Blot, tambin llamado inmunoblot es un estudio que nos permite identificar protenas, gracias a antcuerpos directos contra estas. Esta prueba se usa cotidianamente como prueba confirmatoria del VIH.Recordemos que este virus en su capside, tiene una gran cantidad de protenas como son gp 160, gp120, p65, p55..entre otras (ver la imagen arriba)Pasos del Western BlotProtenas se separan por gel de electroforesis, usualmente pgina de SDS (sodium dodecyl sulfate)Las protenas se transfieren a una hoja de papel de nitrocelulosa.La mancha se incuba con una protena (protenas de la leche)Se adiciona un anticuerpo a la solucin que se une especficamente a la protena.22En el paso uno se hace una electroforesis normal (separacin por cargas elctricas segn peso molecular) usando un gel especial de SDS (sodioduodecil sulfato)Luego que se termina la electroforesis, el gel se coloca encima de una hoja de nitrocelulosa con un peso encima; por accin de la gravedad y con ayuda del peso que se coloco encima, los componentes ya separados de las protenas se pasan al papel en exactamente el mismo sitio.Este papel luego es introducido un tiempo en una cubeta con leche. Porque se hace esto? El papel de nitrocelulosa es un papel lleno de poros, algunos de los cuales, estan ocupados por las protenas que pasaron del gel, pero los otros estn vacios. Si se dejan as, podran caer otra protena y contaminar el proceso, as que las protenas de la leche, lo que hacen es llenar los poros vacios.El ultimo paso es adicionar el anticuerpo especfico contra el antgeno conocido, el cual luego ser detectado si la reaccin es positiva.

http://www.virology.ws/wp-content/uploads/2010/07/western_blot.jpgEn esta imagen los pasos ya mencionados.Un punto importante es que generalmente el Ac esta marcado (labeled antibody), lo cual permitir que sea detectado. Puede marcarse con fluorescencia, o en algunos casos bioqumicamente lo que reaccionar posteriormente con alguna enzima que producir un color.Despus de la reaccin lo ultimo que queda es el revelado (que depender del marcaje del Ac)23Pasos del Western Blot4) El anticuerpo se localiza por tincin de este que lo hace visible

24En este caso un WB de pacientes sospechosos con VIH.En el primer carril, estn los controles, indicando a que niveles se deben encontrar las protenas de la capside. Los carriles 2 y A estn en blanco es decir, que si son pacientes, entonces no tienen VIH, al contrario de los otros donde se ven bandas identificando las protenasSouthern Blott Northern BlotMtodo para localizar secuencias de ADNMtodo para localizar secuencias de ARN

Ejemplo de Southern. http://es.wikipedia.org/wiki/Southern_blot25Southern y Northern Blot son tcnicas con el mismo procedimiento, solo que reconocen diferentes molculas; el SB reconoce ADN y el NB, ARN.SECUENCIACINSecuenciacinMtodos y tcnicas bioq. para determinar el orden de los nucletidos de un fragmento de ADN.

La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden de los nucletidos adenina, guanina, citosina y timina (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN.27Utilidad de la SecuenciacinPROYECTO GENOMA HUMANO.Investigaciones biolgicas.Investigaciones forenses.

La secuencia de ADN constituye la informacin gentica heredable del ncleo celular, los plsmidos, la mitocondria y cloroplastos (en plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. As pues, determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los procesos biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como la investigacin forense.

28Desarrollo de la Secuenciacin.30 mtodo de terminacin de cadena: Sanger.70 mtodo de punto corrido: Gilbert y Maxam.Secuenciacin de ARN.Secuenciacin de ADN.Secuenciacin automtica.MTODO SANGER(terminacin de la cadena dexosi)COMPONENTES:Hebra de ADN.Cebador primer (marcado)ADN polimerasaADN Pol I bacteriofago T4Nucletidos trifosfato.Nucletidos dideoxi

30Proceso: Mtodo SangerNucletidos modificados (didesoxi): ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP.

Los nucletidos didesoxi son nucletidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posicin 3' de la desoxirribosa. Estos nucletidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningn otro nucletido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucletido didesoxi se termina la sntesis de la cadena de ADN.31Proceso: Mtodo Sanger4 tubos:dNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddATPdNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddGTPdNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddCTPdNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddTTP

dNTPVSddNTPEn primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reaccin. Cada mezcla de reaccin contiene los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), la polimerasa, un cebador marcado radioactivamente (en el mtodo sanger) y un nucletido didesoxi diferente en cada tubo (ddATP en un tubo, ddGTP en otro y as sucesivamente) a una concentracin baja. El nucletido didesoxi utilizado (supongamos que el ddATP) competir con su homlogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se est sintetizando, produciendo la terminacin de la sntesis en el momento y lugar donde se incorpora.32Proceso: Mtodo Sanger

Por este sistema, en cada mezcla de reaccin se producen una serie de molculas de ADN de nueva sntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucletido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 3' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

33Proceso: Mtodo Sanger

50 cm-Los fragmentos de ADN de nueva sntesis obtenidos en cada mezcla de reaccin se separan por tamaos mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucletido. Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reaccin se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel.-Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una pelcula fotogrfica de autorradiografa. La aparicin de una banda en una posicin concreta de la autorradiografa en uno de los cuatro carriles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva sntesis (complementario al ADN molde) est la base correspondiente al nucletido didesoxi utilizado en la mezcla de reaccin correspondiente.Teniendo en cuenta que el ADN de nueva sntesis crece en la direccin 5' 3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamao (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamao de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva sntesis en la direccin 5' 3'.

34Secuenciacin AutomticaEl mtodo automtico en lugar de radioactividad utiliza fluorescenciaCada dNTP con un fluorocromo distintoPermite leer al mismo tiempo los ADNs de nueva sntesis producto de las cuatro mezclas de reaccin.

-La principal diferencia entre mtodo enzimtico de Sanger y el mtodo Automtico radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el mtodo automtico en vez de radioactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reaccin, cada una con nucletido trifosfato (dNTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva sntesis producto de las cuatro mezclas de reaccin.35

36GENTICA FORENSEGentica ForensePruebas biolgicas de paternidadCriminalstica biolgicaIdentificacin humanaInvestigacin

38Gentica ForensePolimorfismos genticos Marcadores genticos:Se transmiten mendelianamenteDiversidad gnica en individuos de la misma especieDatos poblacionales de frecuencias allicasLas pruebas forenses se basan en los Polimorfismos genticos Marcadores genticos. Se utilizan por sus caractersticas, como son:-Al momento de transmitirse siguen las leyes de mendel-Varan entre los individuos de una misma especie dependiendo de su origen; no son iguales los polimorfismos colombianos que los chinos (por ejemplo)-Existen artculos que describen sus frecuencias allicas en las poblaciones (Frecuencia allica: frecuencia con la que cada polimorfismo se presenta en una poblacin39Gentica ForenseTasa de mutacin bajaAnalizable con mtodo rpidoAntgenos eritrocitarios y leucocitariosProtenas sricasEnzimasRegiones hipervariablesSeguimos con las caractersticas por las que utilizan los polimorfismos:-Tienen una tasa de mutacin baja-Se estudian rpidamenteAlgunos ejemplos son los Ag eritrocitarios y leucocitarios, las protenas sricas, enzimas.Pero los ms utilizados son las regiones hipervariables.40Regiones HipervariablesADN codificante (30%) protenaNo codificante (70%) altamente polimrficoADN Microsatlite: tienen un tamao muy pequeo de hasta 400 pb, por lo que son idneos para la prueba de PCR usada en forense. Tambin se conocen como Short Term Tandem Repeat (STR), ya que la repeticin oscila entre 4 a 7 pb. Se encuentran en todo el genoma.Ejemplo: CCTTACTCCTTACTCCTTACTCCTTACTCCTTACTSabemos que la mayora del ADN es no codificante. Dentro de este ADN existen un tipo llamado los Microsatelites STRs (shrt term tandem repeat repeticiones cortas en tandem)Son secuencias cortas repetitivas localizados a lo largo del genoma.41

Algunos marcadores utilizadosD8S1179D7S820THO1D13S317VWATPOXD18S51FGAAmelogenina

Cada uno de los marcadores, tiene una posicin ya identificada en el cromosoma (locus) y por estudios de estadstica poblacional, se sabe cual es su frecuencia en la poblacin. Estos son los ms utilizados puesto que son los ms frecuentes en la poblacin.Nomenclatura:La D: ADNEl nmero: cromosoma donde esta localizadoEl resto: el nombre que le colocan luegoAlgunos tienen nombres especficos porque son de protenas importantes como el VWA: factor de VonWillebrand43MtodoToma de sangre (semen, frotis de vagina, saliva, pelos, orina)Extraccin ADNSecuenciacinElectroferograma Genotipificacin

El proceso es el mismo que hemos visto hasta el momento; lo que varia es lo que estamos buscando, los STRs.Electroferograma: imagen computarizada que obtenemos luego de una secuenciacinGenotipificacin: descripcin de las secuencias especficas de un individuo (en este caso, descripcin de sus STRs)44

ElectroferogramaComo se lee un electroferograma?Centrmonos en el marcador D8S1179 (circulo rojo): tiene dos picos que dicen 13 y 14. Si hay dos picos significa que ese marcador es heterocigoto en este individuo, es decir, heredo uno de su padre u otro diferente la madre, y cada nmero indica el nmero de repeticiones que tiene. En un alelo hay 13 repeticiones en la secuencia y en el otro alelo hay 14 repeticiones.Los que solo tienen un pico (circulo verde) son homocigotos para ese nmero de repeticiones, es decir que ambos padres tenan el mismo nmero de repeticiones. Cuando hay ms de tres picos (circulo morado) eso indica contaminacin. Debe repetirse ese marcador.45

D8S1179D16S539D19S433D18S51D8S1179D16S539D19S433D18S51D8S1179D16S539D19S433D18S5113 1411 1214 1413 141312141213181811181171414111421Ncleo FamiliarLas pruebas de forense se utilizan entre otras cosas para la paternidad.En este caso tenemos un rbol genealgico sencillo de dos generaciones. Queremos saber si el individuo II3 es hijo de la pareja.Si comparamos los marcadores:D8S1179 tiene 13 y 14; el 13 puede ser del padre y el 14 de la madreD16S529: el 11 del padre y el 12 de la madreD19S433: es homocigoto para el 14, y cada padre pudo transmitirle el suyoEl ultimo, D18S51: el 14 de las madre y el 13?46Mutacin de STRsStepping-stone

STR = 11STR = 12STR = 10Aunque los STRs se usan entre otras cosas por su baja tasa de mutaciones, ellos tambin pueden mutar.Las mutaciones que sufren se conocen como mutacin de Stepping-Stone (saltando piedras). Los STRs pueden mutar ganando repeticiones perdindolas, es decir, si tengo un STR de 11 repeticiones, sus mutaciones probables son hacia 10 (perdi una repeticin) hacia 12 (gano una repeticin).47Resultado Prueba ForenseMINIMO 13 marcadores estudiados confiabilidad del 99,999%Menos de 13 marcadores no se da un dictamen debe repetirse el estudio.Paternidad/Identidad (con mnimo 13 marcadores): existe un 0,001% de probabilidad que el seor X no sea el padre de el individuo Y

Como se dan los resultados de las pruebas forenses?Para dar un dictamen tengo que tener mnimo 13 marcadores estudiados, lo que me provee una confiabilidad del 99,999%.Si el electroferograma me da menos de 13 marcadores, me da 13 pero uno no es analizable, entonces no se puede dar un dictamen, debe repetirse el estudio.El resultado siempre se da en un lenguaje negativo, nunca en positivo, as:Si es una prueba de paternidad entonces se dice que hay un 0,001% de probabilidad que el seor X NO SEA el padre del individuoSi es de identificacin, igual.Los porcentajes no varan segn la cantidad de marcadores. Siempre ser 0,001% 99,999%48EJEMPLO CASO FORENSEINSTRUCCIONESEl objetivo del ejercicio es responder las preguntas que van apareciendo; detenerse y pensar antes de seguir.Pasar cada diapositiva lentamente para no perder el objetivo del ejercicio.50

Escena del crimen En el bao de un Centro Comercial

51Se descubre el cuerpo de una joven asitica, con signos de violencia..

Observe la escena detalladamente.Que le llama la atencin?La victima no tiene ropaManchas de sangre en el sueloHematomas en cuello52Como genetista experto en el rea forense, su primera deduccin es:1. La joven se suicid2. Tuvo un Infarto y falleci sbitamente3. Fue violada y asesinada por desconocido/s 4. Resbal en el bao y cayRECUERDE LA AUSENCIA DE ROPA, LOS HEMATOMAS EN CUELLO Y LAS MANCHAS DE SANGRE EN LA ESCENA.53Cerca de la victima se encontr una gorra de bisbol abandonada.Piense un poco

Mx. de la sangre encontrada en la escenaMx. Victima:Sangre Fondo de saco de vaginaMx Gorra

Con los datos anteriores, qu muestras debe tomar de la escena del crimen?54Que otras muestras, adems de las anteriores (obvias) podran recogerse de la escena?

- Del lecho ungueal de la victima. Recordemos que fue un acto violento; pudo haberse defendido.55Con ayuda de la polica, se descubre que la victima fue trada de Japn por una banda de trata de personas.

Se logra encontrar en Japn, un to quien acepta donar una Mx de sangre para comprobar la identidad de la victima.

56Investigaciones arrojan datos sobre 2 sospechosos quienes fueron vistos con la victima poco antes de su muerte:

En que orden de importancia solicitara estas muestras?- Sangre- Semen- Cabellos- SalivaPrimero sangre, luego saliva, seguido de cabello y por ultimo semen. 57Finalmente obtenemos la Genotipificacin para 16 marcadores de:- Sangre de la victima- Fondo de saco de vagina- Posible to de la victima- Sospechoso No 1- Sospechoso No 2- Sangre del piso- Gorra de bisbol58El laboratorio de gentica forense realiz la genotipificacin de todas las muestras, incluyendo una separacin diferencial (fraccin masculina y femenina) de la muestra de fondo de saco vaginal, la cual se observa en el siguiente cuadro:Nota: la fraccin masculina no especfica cuantos individuos aportaron a la muestra. Por eso encontraran 3 STRs en algunos marcadores.59MarcadorSangre VictimaFraccin masculina FSVFraccin femenina FSVMx Posible ToSospechoso No 1Sospechoso No 2Sangre en el pisoGorra bisbolD8S11798 , 910, 13, 148 , 98 , 910 ,138, 1213, 14NAD7S82011 , 1211, 13, 1411 ,1212 ,1413 ,1416 ,1711, 1111THO19.3 , 107 , 89.3 , 106 , 66, 76 , 67, 86,7,8D13S31714 , 1511 ,1514 ,1512 ,1415, 1512 ,1311, 12NAVWA19 , 2019 ,1919 , 2019 ,2019, 207 , 818, 1918,19TPOX7 , 99 , 97 , 97 ,88, 911 ,169, 99,11,16D18S5121 , 2210,12,1421 , 2221 ,2010, 123 , 512, 1412,14FGA14 , 16NA14 ,1624 ,2818, 18.223 , 2323, 24NAD21S1129 , 30NA29 ,3028 ,3036 , 3730 ,3223, 2434, 35CSF1PO10 , 117, 8, 910 ,1111 ,118, 96, 734, 356,7D3S135815 , 1715 ,1515 ,1716 ,1615, 1512,127, 712, 14,15D16S53912 , 138 , 1012 ,1311 ,125, 82, 314, 153D2S133811 , 125 , 611 ,128 , 95, 613, 149, 10NAD19S43319 , 2021 , 2219 , 2018 , 1921, 2219, 2013, 145, 7, 20D5S81814 , 1611 , 1214 , 1614 , 167, 115, 611, 1211, 12AmelogeninaXXXYXXXYXYXYXYXYNA= No amplifica FSV= Fondo de Saco de vaginaA partir de los datos, responda:1. Cuantos marcadores comparten la victima y el posible to?Cual es la probabilidad que el seor sea el to de la victima.

2. Cuantos individuos, aportaron a la fraccin masculina de la muestra de FSV?SE RESPONDERAN EN CLASE61A partir de los datos, responda:3. Cuantos individuos aportaron a la muestra de la gorra de beisbol?

4. Cuantos sospechosos cree usted, estuvieron involucrados en el crimen?

5. A quien corresponde la muestra de sangre en el suelo (victima-sospechosos-otro) y porqu?

SE RESPONDERAN EN CLASE

62GRACIAS