Upload
medikcz
View
2.043
Download
2
Embed Size (px)
Citation preview
Mikroskopická technika
Úkol 1:
Pojmenujte
jednotlivé
části
mikroskopu
1
2
4
5
6
7
3
okulár
objektiv
stolek
kondenzor
stativ
šroub hrubého zaostření
šroub jemného zaostření
Měření velikosti mikroskopických objektů v optickém mikroskopu
okulárové měřítko (okulárový mikrometr)
Kalibrace okulárového měřítka
Měření velikosti mikroskopických objektů
Barvení chromozomů pro účely světelné mikroskopie
• Giemsa-Romanowski
• Hematoxylin
• Acetokarmín
• Acetoorcein
• Fuchsin – Feulgenova reakce
Barvení Giemsou
leukocyty chromozomy
Úkol 2: Pozorování chromozomů
• Preparáty byly získány z dělících se lymfocytů lidské periferní krve.
• Krev jsme po odběru kultivovali v médiu, kde byly buňky přinuceny k mitotickému dělení.
• Vzniklou suspenzi jsme fixovali, nakapali na skla a po zaschnutí obarvili roztokem Giemsa-Romanowski
Úkol 2: Prohlídka skel pod mikroskopem
• Sklo položíme (buňkami nahoru!) na stolek mikroskopu a prohlížíme objektivem 6x nebo 10x.
• Po zaostření na plochu obsahující větší počet buněk (výrazně modrofialově zbarvená jádra nebo skupinky chromozomů) použijeme objektiv s vyšším zvětšením (nejlépe 45x). Při zaostřování s vyšším zvětšením pozor na nebezpečí poškození preparátu a znehodnocení objektivu!
• Vyhledáme chromozomy a zkusíme je spočítat. Obraz v mikroskopu srovnáme s přiloženou fotografií.
Stereomikroskop
Fluorescenční mikroskop
Princip fluorescence:
Schéma fluorescenčního mikroskopu
Fluorescenční barviva v genetice
• DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)
• PI (propidium iodide)
• Chinakrin
• Ethidium bromid
Nejnovější trend – spojení mikroskopu a počítače
Kultivace buněk in vitro
Kultury
• Orgánové
• Tkáňové
• Buněčné
– Buňky opouštějí původní tkáň a v médiu se
samostatně dělí – tak vzniká buněčná
kultura .
Oba termíny se často zaměňují.
Alexis Carrel (1873 – 1944)
Složení média• základní anorganické živiny• stopové prvky
• stabilizátory pH (CO32-/HCO3
-, HPO42-/H2PO4
-)– pH = 7,2 – 7,4
• glukóza• aminokyseliny• vitaminy a jiné složky různých enzymů• mastné kyseliny a lipidy• specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení • sérum (zpravidla fetální bovinní sérum)• antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi)
Kultivační podmínky
• Používáme skleněné nebo umělohmotné nádobky, které plníme médiem s rozptýlenými buňkami.
• Přechováváme v termostatu při 37 ºC. Buňky brzy ulpí na stěnách nádobky a začnou se dělit.
• V některých případech přidáváme do kultivační atmosféry oxid uhličitý.
Práce ve sterilním boxu
Pasážování buněk
• Po určité době se živiny z média vyčerpají a početnost buněk stoupne na neúnosnou míru.
• Proto je nutné část buněk odebrat, smísit s novým médiem a tuto suspenzi přenést do další kultivační nádobky
Buněčné kultury
• živočišných buněk
– savčích buněk (včetně
lidských)
• rostlinných buněk
– explantátové kultury
– význam ve šlechtitelství a
genetickém inženýrství –
produkce transgenních
plodin
kultura makrofágů
explantátová kultura – tzv. kalus
Podle typu a morfologie buněk rozlišujeme:
• kultury epiteliálních buněk
• k. fibroblastoidních buněk
• k. lymfoblastoidních buněk
• k. neuroblastoidních buněk
Z hlediska životnosti dělíme buněčné kultury do 3 skupin:
• Primokultury (též primární kultury)– obsahují buňky čerstvě izolované z organismu– Po převedení do kultivačního média přežívají pouze ty buňky, které jsou lépe
přizpůsobeny daným podmínkám. – existují zpravidla jen několik dní, pak je nutné buňky, které se rozmnožily,
převést do nového média.
• Buněčné kmeny– vycházejí z primárních kultur– kultury normálních diploidních buněk, které byly již alespoň jednou pasážovány – vznikají z buněk, které se v podmínkách in vitro začaly rozmnožovat– zhruba po 40-50 děleních zanikají.
• Buněčné linie (též permanentní buněčné linie)– mají charakter nádorových buněk– jsou plně adaptovány na podmínky in vitro– neomezeně se dělí a lze je přechovávat libovolně dlouho– vznikají transformací buněčných kmenů anebo jde o buňky původně izolované z
nádorů
Růstová křivka buněčné kultury• vyjadřuje změny početnosti buněk v závislosti na čase• Růst buněčné kultury prochází několika fázemi:
– Lag-fáze – počáteční fáze, počet buněk nejprve mírně klesne a pak poměrně rychle vzrůstá. Buňky se adaptují na kultivační prostředí a připravují se k buněčnému dělení.
– Log-fáze (též logaritmická nebo exponenciální fáze) – počet buněk exponenciálně roste. V této fázi zachytíme nejvíce buněk v mitóze, což lze využít pro chromozomové vyšetření.
– Stacionární fáze – rychlost růstu buněčné populace postupně klesá, projevují se inhibiční mechanismy (např. kontaktní inhibice, produkce růstových inhibitorů) a postupné vyčerpávání živin z média.
– Fáze úbytku buněk – dochází k postupnému odumírání buněk způsobenému nedostatkem živin, snížením pH (následkem zvýšení koncentrace CO2 a dalších kyselinotvorných látek v médiu) a hromaděním toxických produktů buněčného metabolismu.
log N
čas
lag
log
stacionární fáze
úbytek
Růstová křivka buněčné kultury
Praktické úkoly
viz návody na stolech
Úkol 3: Pozorování buněčné kultury inverzním mikroskopem
• Seznamte se s použitím inverzního mikroskopu.
• Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kultivační nádobku s buněčnou kulturou.
• Povšimněte si tvarů buněk a posuďte jejich denzitu.
Práce s inverzním mikroskopem
Úkol 4: Pozorování buněk HeLa
• Epiteliální buňky HeLa jsou
stabilizovanou buněčnou linií.
• Primární kultura byla získána z buněk
karcinomu děložního krčku pacientky
Henrietty Lacksové v počátku 50.let
20.století.
• Dosud se v laboratořích používají jako
typický model zachovávající všechny
vlastnosti nádorových buněk.
Henrietta
Lacks
Úkol 4: Pozorování buněk HeLa
• Buňky v předložených Petriho miskách byly po krátkodobé kultivaci fixovány methanolem a obarveny trypanovou modří. V některých miskách lze již vizuálně pozorovat jejich kolonie.
• Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kolonie buněk HeLa. K vyhledání a pozorování využijte objektivů 10x-20x.
• Povšimněte si utváření jednotlivých buněk a kolonií. Vysvětlete, proč mají některé buňky kulovitý tvar.
Úkol 5: Počítání buněk v suspenzi
• Bürkerovu počítací komůrku přikryjte krycím sklíčkem, jehož okraje musí pevně přilnout k podkladu (provede vedoucí praktika). Pipetou odeberte cca 10 – 20 mikrolitrů vzorku (suspenze buněk) a kápněte ji ke hranám krycího sklíčka po obou stranách (tedy 2 x 10 µl).
• Vzorek nejprve prohlédněte pod malým zvětšením (objektiv 6x nebo 10x), s nímž vyhledejte mřížku s buňkami. Pak spočtěte buňky pod 20x, popř. 45x zvětšujícím objektivem.
• Ze zjištěného údaje vypočtěte buněčnou denzitu. Její hodnotu (d) v počtu buněk na mililitr suspenze udává vzorec:
d = p . 104 / n• kde p - celkový počet vyhodnocených buněk a n - počet
malých čtverečků mřížky, na nichž byly buňky počítány.
Úkol 5: Počítání buněk v suspenzi
Úkol 6: Chromozomy v buňkách stabilizované linie CHO
• Na fotografiích jsou zobrazeny chromozomy stabilizované buněčné linie CHO.
• Jde o fibroblasty izolované z ovarií čínského křečka (Chinese Hamster Ovary Cells).
Chromozomy byly izolovány z dělících se buněk, fixovány směsí methanol-kyselina octová a po zaschnutí suspenze na podložním skle obarveny roztokem Giemsa-Romanowski.
Úkol 6: zadání• Spočtěte jednotlivé chromozomy a
povšimněte si jejich utváření.
• Zkuste vysvětlit své výsledky.
karyotyp
Úkol 7: Využití buněčných kultur při mapování genomu• Při mapování genomu byly využity hybridní
buněčné linie vzniklé fúzí normálních lidských buněk s nádorovými buňkami myši. Vznikla tak stabilní linie, jejíž další proliferací došlo ke vzniku několika klonů o různé chromozomové konstituci.
• Při vývoji těchto klonů buňky ztrácejí některé lidské chromozomy, zatímco počet myších chromozomů se příliš nemění.
• V extrémním případě může v buňkách zůstat pouze jediný lidský chromozom, zatímco zbytek karyotypu tvoří myší chromozomy.
• Jednotlivé klony lze poměrně snadno izolovat do samostatných buněčných kultur a pak přímo v buňkách nebo v jejich médiu zjistit přítomnost konkrétních lidských proteinů.
• Pokud se sledované proteiny v buňkách vytvářejí, lze srovnáním těchto výsledků s karyotypem buněk zjistit, na kterém chromozomu se gen pro příslušný protein nachází.
fúze buněk
Úkol 7: Využití buněčných kultur při mapování genomu
• V laboratoři byla připravena série hybridních klonů normálních lidských a myších nádorových buněk. Analýzou chromozomů se zjistilo, že uvedené klony obsahují následující lidské chromozomy:– Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X– Klon II: 1, 3, 7, 21, X– Klon III: 9, 13, 19, 21, X– Klon IV: 1, 4, 10, 19, X– Klon V: 2, 3, 13, 20, X.
• Ve všech klonech byla biochemickou analýzou stanovována přítomnost 4 různých lidských enzymů. Přitom bylo zjištěno, že:– a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí.– b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech.– c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV.– d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů.
• Lze pomocí uvedených dat upřesnit chromozomovou lokalizaci genů pro příslušné enzymy? Pokud ano, zjistěte na kterých chromozomech se tyto geny nachází.
Řešení úkolů
Úkol 4: Pozorování buněk HeLa
Kulovitý tvar mají buňky v mitóze.
Úkol 6
21 chromozomů
7
6
4
4
5
6
3
7
Aneuploidní počet chromozomů je výsledkem transformace buněk dlouhodobě přechovávaných v kultuře.
Karyotyp buněk CHO
21 chromozomů
Buňky CHO mají charakter nádorových buněk.
Karyotyp normální a nádorové buňky
normální buňka muže
nádorová buňka
Při vývoji nádoru dochází rychlou a nekontrolovanou proliferací ke změnám počtu a struktury chromozomů.
Úkol 7: Využití buněčných kultur při mapování genomu
• Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X• Klon II: 1, 3, 7, 21, X• Klon III: 9, 13, 19, 21, X• Klon IV: 1, 4, 10, 19, X• Klon V: 2, 3, 13, 20, X.
– a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí.– b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech.– c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV.– d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů.
Gen pro enzym A leží na chromozomu 2.
Gen pro enzym B leží na chromozomu X.
Gen pro enzym C leží na chromozomu 19.
Gen pro enzym D neleží ani na jednom z uvedených
chromozomů.
Význam buněčných kultur• studium regulace buněčného cyklu a diferenciace buněk• studium procesů vedoucích ke vzniku a progresi
nádorových chorob. • produkce monoklonálních protilátek, které jsou nezbytné
při diagnostice mnoha onemocnění. • testování účinků léčiv a jiných chemických látek, které by
mohly ohrozit zdraví člověka, stanovení genotoxicity – nahrazení pokusů s laboratorními zvířaty?
• klinická genetika– prenatální vyšetření (amniocyty z plodové vody, buňky choriových
klků)– postnatální vyšetření (kultury lymfocytů periferní krve) – chromozomové vyšetření nádorových buněk
• mapování lidského genomu• klonování savců• virologie – kultivace a izolace virů
Na shledanou!