Eksperimentalni pristupi

istraivanju membrana

Kako otopiti membranske proteine?

Periferne visoki pH i visoka konc. soli

Integralne detergentima

naruavaju hidrofobne veze i razaraju lipidni dvosloj

male amfipatske molekule u vodenoj sredini stvaraju micele

hidrofobni dio detergenta vee hidrofobnu regiju membranskog proteina kompleksi detergent-protein

Triton blagi ionski detergent

mogu se dobiti funkcionalno aktivni membranski sustavi

SDS jaki ionski detergent

moe otopiti i najhidrofobnije membranske proteine

2002 Bruce Alberts, et al.

Detergenti otapaju membrane

lipidni dvosloj + detergent = kompleks lipid-detergent

Figure 10-30 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

(- p o avan e)Primjena blagog detergenta (Triton)

- otapanje,

- proiavanje i

- rekonstrukcija

funkcionalnih sustava membranskih proteina

Na+-K+ pumpa

- izolacija iz lipidnog dvosloja r i j

- ugradnja u fosfolipidne vezikule

Figure 10-31 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Primjena jakog detergenta (SDS)

Elektroforeza u poliakrilamidnome gelu

SDS otapa, denaturira i disocira veinu proteina u pojedinane polipeptidne

Protein s dvije podjedinice, A i B, spojene disulfidnim mostom

Protein s jednom podjedinicom

lance

pojedinani polipeptidni lanci stvaraju kompleks s negativno nabijenim molekulama SDS-a

razdvajanje na osnovu molekulske mase proteina

proteini putuju prema anodi, a brzina pokretanja obrnuto je proporcionalna molekularnoj masi

Zagrijavanje uz SDS i merkaptoetanol

negativno nabijene SDS molekule

Poliakrilamid-gel elektroforeza

poliakrilamidni gel

2002 Bruce Alberts, et al.

Crvene krvne stanice (eritrociti)

model za prouavanja plazmatske membrane

dostupne u velikom broju (banke krvi)

nisu kontaminirane s drugim stanicama

nemaju jezgru

nemaju organele (nema kontaminacije s dr. membranama)

Figure 10-27. 2002 Bruce Alberts, et al.

Priprema crvenih krvnih stanica za analize

pucaju samo na jednom mjestu st. duhovi (ghosts) s jednom rupom

manje vezikule nastaju mehanikim oteenjem st. duhova

orijentacija moe biti s pravom stranom van ili obrnuta ovisi o ionskim uvjetima tijekom razaranja i ponovnog zatvaranja.

Figure 10-28. 2002 Bruce Alberts, et al.

Kemijski sastav i struktura membrane eritrocita

lipidni dvosloj - 40%

membranski proteini - 52%

eeri - 8%

vertikalna interakcija

stabiliziran lipidni dvosloj

horizontalna interakcija

podrka strukturnom integritetu

Cooper et al. 2000

Lipidi membrane eritrocita

distribucija u dvosloju

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Erythrocyte_Membrane_lipids.jpg

Proteini membrane eritrocita

Cooper et al. 2000

Glycophorin

http://www.acbd.monash.org/docs/red-cell- membrane.pdf

Band 3

- anionski transport

- strukturna uloga

Glycophorin

- visokoglikoziliran

- nosi epitope za krvne grupe

Aquaporin

- selektivna pora za transport vode

- omoguava eritrocitima da ostanu u osmotskoj ravnotei s izvanstaninom tekuinom

Aquaporin

http://en.wikipedia.org/wiki/File:AQP-channel.png

Tehnika smrzavanja i lomljenja (Freeze-fracture)

st. se smrznu u tekuem duiku

nastali blokovi se reu noem

ravnina rezanja ide kroz sredinu lipidnog dvosloja i razdvaja dva monomera

dvosloj lipida se rastavlja, a proteini ostaju uklopljeni u jednom od dva sloja

2002 Bruce Alberts, et al.

postupak

uzorak pripremiti pod kontroliranim uvjetima i na odgovarajuu veliinu (cca 1 mm3)

st. se smrznu u tekuem duiku

smrznuti uzorak se prebacuje u ureaj za freeze fracture (high vacuum freeze fracture device) i dri na temp. -100C do -150C

nastali blokovi se reu noem (microtome)

radi se replika povrine polaganjem sloja Pt/C (cca 2 nm) pod odreenim kutom

kombinirano sa slojem C (cca 30 nm) pod 90 na povrinu

http://www.mardre.com/homepage/mic/tem/freeze_fracture/freeze_fracture_scheme.html

Stanice uzgajane na zlatnoj foliji se smrznu

Stave se u ureaj za freeze-fracture

Podizanjem zlatne folije st. membrana okrenuta prema zlatnoj foliji se razdvaja na dva dijela:

- protoplazmatski (P) P-strana (lice)

- egzoplazmatski (E) E-strana (lice)

Fosfolipidi ostaju u odgovarajuem sloju

Transmembranski proteini se razdvajaju u jedan ili drugi sloj ovisno o mol. svojstvima

Quantitative electron microscopy for the nanoscale analysis of membrane lipid distribution

Akikazu Fujita, Jinglei Cheng & Toyoshi Fujimoto

Nature Protocols 5, 661 - 669 (2010) Published online: 18 March 2010

Protein ostaje u lipidnom monomeru koji sadri vei dio proteina

2002 Bruce Alberts, et al.

Transport molekula kroz

membranu

Propusnost membrane

zbog hidrofobne unutranjosti lipidni dvosloj visoko nepropusna barijera za veinu polarnih molekula

posebni mehanizmi za prijenos u vodi topivih molekula

to je mol. manja i bolje topiva u ulju bra difuzija kroz lipidni dvosloj

lipidni dvosloj nepropustan za nabijene

molekule (ioni) bez obzira na veliinu

Figures 11-1; 11-2 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Tri naina za prolaz molekula kroz bioloku membranu

Pasivna difuzija

Olakana difuzija

Aktivni transport

Pasivni transport

http://science.nayland.school.nz/graemeb/yr12%20biology/Cells/Cells.html

Pasivna difuzija

najjednostavniji mehanizam

- molekula se otopi u u lipidnom dvosloju

- difundira

- zatim se otopi u vodenom mediju na dr. strani

tijek molekula uvijek niz konc. gradijent

neselektivan proces

prolaze samo male, relativno hidrofobne molekule

(O2, CO2, benzen, H2O, CH3CH2OH)

Olakana difuzija

- membranski transportni proteini

2 skupine:

Proteini nosai veu specifinu mol. koju treba prenijeti kroz membranu i pri

tome prolaze kroz konformacijske promjene (npr. transport glukoze)

Kanalni proteini stvaraju pore koje se proteu kroz lipidni dvosloj kroz koje prolaze molekule (ionski kanali, akvaporini)

tijek molekula u smjeru koji je odreen:

koncentracijskim gradijentom

elektrokemijskim gradijentom

Figure 11-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Olakana difuzija pomou proteinskog nosaa

niz koncentracijski gradijent!

Animacija

http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072495855/student_view0/chapter2/animation

how_facilitated_diffusion_works.html

primjer olakane difuzije prijenos glukoze

Slika 12-17. 2004. Cooper i Hausman

Razlika izmeu difuzije i olakane difuzije

(putem prenositelja pasivan prijenos)

brzina obine difuzije proporcionalna koncentraciji molekule

brzina olakane difuzije dostie max. kada je proteinski nosa zasien s molekulama koje vee

Figure 11-6 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Prolaz tvari kroz membranu

Pasivni transport provode ga svi kanalni proteini i mnogi proteinski nosai

Aktivni transport uvijek posredovan proteinskim nosaima i treba energiju

tjeran hidrolizom ATP-a primarni aktivni transport

tjeran elektrokem. gradijentom sekundarni aktivni transport

Figure 11-4a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Tri naina za dobivanje energije za aktivni transport

Aktivno transportirana molekula

Izvor energije

A - zdrueni transporteri elektrokem. gradijent

B - pumpa energija ATP-a

C - pumpa energija svjetlosti

Figure 11-7 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Proteinski nosai

specifino mjesto vezanja molekule

sudjeluju i u pasivnom i u aktivnom transportu

Pasivni transport niz konc. gradijent

Figure 11-5 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Proteinski nosai

prenose mol. s jedne strane na drugu uniport

zdrueni transporteri prijenos jednog tipa mol. ovisi o prijenosu dr. tipa mol.

u istom smjeru simport (glukoza uz Na+)

u suprotnom smjeru antiport (Na+/K+ pumpa)

Animation Molecular Biology of the Cell 11.2. carrier proteins

Figure 11-8 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Aktivni transport glukoze primjer simporta

primjer sekundarnog aktivnog transporta

2004. Cooper i Hausman

nosa je transmembranski protein koji ima mjesto za dva iona Na+

vezanjem Na+ nastaju konformacijske promjene vezanje Glu i istovremeni prijenos

simport

tjeran elektrokem. gradijentom sekundarni aktivni transport

Animation Molecular Biology of the Cell 11.3. glucose uptake

Na+/K+ pumpa primjer antiporta

primjer primarnog aktivnog transporta

aktivno pumpa Na+ izvan, a K- u stanicu protiv njihovog elektrokemijskog gradijenta antiport

za svaki hidroliziranu mol. ATP-a, 3 Na+ se pumpaju van, a 2 K+ unutar stanice

primarni aktivni transport tjeran hidrolizom ATP-a

Video Molecular Biology of the Cell 11.1. Na-K pump

Animacija

http://www.goldiesroom.org/Multimedia/Flash/014--Active%20Transport.swf

2002 Bruce Alberts, et al.

Model djelovanja Na+/K+ pumpe (animalne stanice)

Animacija

Slika 12-29. 2004. Cooper i Hausman

http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072495855/student_view0/chapter2/animation

how_the_sodium_potassium_pump_works.html

http://highered.mheducation.com/sites/9834092339/student_view0/chapter38/sodium-potassium_exchange_pump.html

Na+/K+ pumpa potrebna za

odranje osmotske ravnotee

Slika 12-30. 2004. Cooper i Hausman

stabilizaciju st. volumena

odgovor eritrocita na promjene u osmolarnosti

Figure 11-6. 2008 Bruce Alberts, et al.

izbacivanje Ca2+ i H+ iz stanice

primjer antiporta

primjer sekundarnog aktivnog transporta

Ca2+ i H+ izbacuju se iz stanice uz istovremeni ulaz Na+ antiport

njihovo izbacivanje vezuje se s energijski povoljnim unosom Na+

sekundarni aktivni transport tjeran elektrokem. gradijentom

Slika 12-34. 2004. Cooper i Hausman

Kanalni proteini

stvaraju pore ispunjene vodom kroz membranu

vanjske membrane bakterija, mitohondrija i kloroplasta imaju velike, neselektivne pore

plazmatske membrane biljnih i animalnih st. imaju male, visokoselektivne pore ionski kanali

provode pasivni transport (difuzija Na+ K+ Ca2+ Cl- niz elektrokemijski gradijent)

specifini za odreene ione

vrata koja se na kratko otvore

Animacija http://www.youtube.com/watch?v=s0p1ztrbXPY&feature=related

2002 Bruce Alberts, et al.

Slika 12-24. Ionska selektivnost Na+ kanala

uska pora omoguuje prolaz iona Na+ vezanog za jednu mol. H2O

ali ometa prolaz K+ ili veih iona

2004. Cooper i Hausman

Otvaranje ionskih kanala

A - Kanali nadzirani naponom promjene el. potencijala kroz st. membranu

B - Kanali nadzirani lizvanst. ligandom vezanje signalne molekule C - Kanali nadzirani unutarst. ligandom vezanje signalne molekule D - Mehaniko otvaranje

Animacija - Ligand gated ion channels structure and function

http://www.youtube.com/watch?v=Du-BwT0Ul2M

Figure 11-21 Molecular Biology of the Cell (2008)

Endocitoza

Proteinski nosai i kanalni proteini prenose male

molekule kroz membranu

Makromolekule i estice iz okoline stanice uzimaju

endocitozom

Materijal koji se unosi u st. zaokrui se odsjekom

membrane koji zatim pupa i oblikuje vezikule

Fagocitoza (st. hranjenje)

Pinocitoza (st. napajanje)

Egzocitoza

izbacivanje materijala iz stanice putem sekretornih vezikula

Fagocitoza

st. prodiru bakterije ili dr. stanice

fagosom stapanje s lizosomom

fagolizosom razlaganje (kisele hidrolaze)

Amebe hranjenje

Viestanini organizmi

mehanizam obrane protiv mikrorg.

uklanjanje oteenih i ostarjelih st.

Sisavci bijele krvne st.

makrofagi i neutrofili tjelesni obrambeni sustav

bakterija

fuzija membrana

lizosom

fagolizosom

pseudopodiji

fagosom

Animacija http://www.youtube.com/watch?v=4gLtk8Yc1Zc&feature=related

2002 Cooper i Hausman

A B

A ameba koja guta drugog protista

B makrofagi prodiru crvene krvne stanice

Animacija - Amoeba eats two paramecia (Amoeba's lunch)

http://www.youtube.com/watch?v=pvOz4V699gk

2002 Cooper i Hausman

Pinocitoza

Endocitoza posredovana receptorom

Mehanizam za selektivno uzimanje spec. makromolekula

makromol se veu na spec. receptor

(klatrinom obloene jaice)

jaice pupaju klatrinom obloene vezikule

vezikule se stapaju s endosomom

sortiranje sadraja

spajanje s lizosomom

receptor

2002 Cooper i Hausman

EM-snimka etiri stadija u oblikovanju klatrinskih vezikula

Faza 1 Faza 2

Faza 3 Faza 4

2002 Cooper i Hausman

Uzimanje kolesterola endocitozom

LDL- low density lipoprotein

kiseli pH!

Slika 12-42. 2004 Cooper i Hausman

Animacija

13.3. receptor_endocytosis

Mutacije u LDL-receptorima

Slika 12-39. 2004. LDL-receptor Cooper i Hausman

obiteljska hiperkolesterolemija

nema vezanja LDL na LDL receptore

nasljedne mutacije LDL-receptora (npr. Tyr Cys)

6. Stanina stijenka

Stanina stijenka bakterijskih stanica

- sustav dvostruke membrane

- tanka st. stijenka

- E. coli

- jedna membrana

- debela st. stijenka

- S.aureus

2004 Cooper i Hausman

peptidoglikan

NAG

N-acetilglukozamin

NAM

N-acetilmuraminska kiselina

(1-4) glikozidna veza

ak sastav razliit kod razliith sojeva bakterija

2004 Cooper i Hausman

Stanine stijenke biljnih stanica

Glavni sastojci polisaharidi

Osnovni strukturni polisahardi:

gljive - hitin (polimeri GlcNAC)

- vanjski skelet artropoda

alge i vie biljke celuloza (linearni polimer Glu)

= najzastupljeniji polimer na zemlji

Lanci celuloze celulozni mikrofibrili

2004 Cooper i Hausman

Celulozni mikrofibrili uronjeni u matriks :

proteini

dva tipa polisaharida:

hemiceluloza

pektin

2004 Cooper i Hausman

http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/library/webb/BOT311/PlantCellWalls00/PCW00-18.htm

Primarne i sekundarne biljne st. stijenke

Rastue st. primarna st. stijenka

tanke i fleksibilne

podjednaki udjeli celuloze, hemiceluloze i

pektina

celulozna vlakna nasumino rasporeena

Formirane st. sekundarne st. stijenke

deblje i tvre

nemaju pektin; 50 80% celuloze

lignin (fenolni polimer)

celulozna vlakna paljivo ureena

2004 Cooper i Hausman

Teme za seminare

slinosti i razlike membrane prokariotskih i eukariotskih stanica

eritrociti kao modeli za istraivanje biolokih membrana

primarni i sekundarni aktivni transport u biljnim stanicama

cistina fibroza defekt transporta iona Cl