理學 碩 士學 位 請求 論 文

치환된 다이벤질아민의

생체모방 산화적 N - 벤질 제거 반응

Biomim et ic Oxidative N - Deben zy lat ion of

Sub st itut ed Diben zy lamines

200 1 年 2 月

仁荷大學校 大學院

化學科 (化學專攻 )

鄭 煥 圭

理學 碩 士學 位 請求 論 文

치환된 다이벤질아민의

생체모방 산화적 N - 벤질 제거 반응

Biomim et ic Oxidative N - Deben zy lat ion of

Sub st itut ed Diben zy lamines

200 1 年 2 月

指導敎授 金 性 洙

이 論文을 碩士學位 論文으로 提出함 .

仁荷大學校 大學院

化學科 (化學專攻 )

鄭 煥 圭

이 論文을 鄭煥 圭의 碩 士論文으로 認定함

200 1 年 2 月

主 審 印

副 審 印

委 員 印

요 약

치환된 다이벤질아민(YC 6H 4 CH 2NHCH 2 C 6H 5 ; Y: p - OCH 3 , p - CH3 , H,

p - Cl, m - Cl, p - CN, p - NO2 )을 합성하여 cy tochr ome P450(CYP450),

lead tetraacetate(LT A), FeⅢ T PPCl 그리고 hor seradish peroxidase(HRP)

와 반응을 시켜 일어나는 N - 벤질 제거 반응을 관찰하였다. 여기서 얻어

진 상대 속도 상수(k Y / k H )를 이용하여 H amm ett 관계식으로 치환기 효

과를 측정하였다. 치환기 상수는 σ+ 보다 σ에 더 좋은 상관관계를 보

였으며, 반응 상수 ρ는 음수값을 가졌다. 또한 치환된 다이벤질아민의

α위치 수소를 중수소로 치환하여 반응한 결과 동위원소 효과는 치환기

가 전자를 주는 경향에서 끌어 당기는 경향으로 갈수록 감소함을 관찰하

였다. 이 결과를 통해 생체모방 산화적 N - 벤질 제거 반응은 전자 전달

(ET )후 수소 원자 전달(HAT )이 일어나는 메카니즘으로 반응이 진행됨

을 알 수 있었다.

i

Ab str act

Substituted dibenzylamines (YC6H4 CH 2NHCH 2C6H 5 ; Y: p - OCH 3 ,

p - CH3 , H , p - Cl, m - Cl, p - CN , p - NO 2 ) hav e been pr epar ed.

Ox idat iv e N - deben zy lat ion s w er e ob serv ed when each subs tr at e

r eact ed with cy tochr om e P450(CYP450), lead t et r aacet at e (LT A ),

F eⅢ T PP Cl, an d hor ser adish per ox ida se (HRP ). Relat iv e r at es

(k Y / k H ) hav e been m easur ed. Hamm ett cor r elat ion s ar e bet t er

corr elat ed with σ r ather than σ+ . T he r eact ion con st an t (ρ) hav e

n eg at iv e v alues . Kin et ic isotope effect (KIE ) decr ea se fr om

sub st r at e w ith electr on - donat ing to sub str at e with electr on -

w ithdr aw in g sub st ituen t s . T hese r esult s hav e been in t erpr et ed to

in dicat e that the biomim etic ox idat iv e N - deben zy lat ion pr oceed

v ia electr on tr an sfer (ET ) follow ed by hy dr ogen atom tr an s fer

(HAT ).

ii

목 차

요 약 ⅰ

Ab str act ⅱ

Ⅰ. 서 론 1

Ⅱ. 이 론 4

Ⅲ. 결 과 및 고 찰 6

1. 상대 반응속도(k Y / k H ) 6

2. 동위원소 효과(k H / k D ) 8

3. Electr on tr an sfer/ Hydr ogen atom tr an sfer (ET / HAT )

메카니즘 10

Ⅳ. 결 론 16

Ⅴ. 실 험 17

1. Iodosoben zen e의 합성 17

2. Substituted dibenzylamine의 합성 18

3. α,α- Dideuterat ed substitut ed dibenzylamine의 합성 22

4. 상대 반응속도 및 동위원소 효과의 측정 26

1) Cytochrome P450(CYP450)/ NADPH 27

2) Lead tet r aacet at e (LT A ) 27

3) F eⅢ T PPCl/ PhIO 28

4) Hor ser adish per oxidase (HRP )/ H 2O2 28

5. 분석 기기 30

iii

Ⅵ. 참 고 문 헌 3 1

Ⅶ. 부 록 34

1. NMR spectr a

2. H ammet t corr elat ion s

iv

Ⅰ . 서 론

Cyt ochr ome P450 (CYP450)1은 학계에 보고된 이후 수 십 년간 활

발한 연구의 대상이 되었으며 현재까지 200여종이 발견되었다. CYP450

을 포함하여 hor seradish peroxidase (HRP ), chloroperoxidase,

lactoperoxidase등의 생체 효소들은 alky lamin e화합물과 작용하여

ox idat iv e dealkylat ion반응을 일으킨다. Amine의 산화반응은 세포내

물질의 신진대사 및 의약, 농약등의 유도체 합성에 매우 중요한 부분들

이다. 특히 CYP450에 의한 촉매작용의 반응 메카니즘은 파킨슨병이나

여러 종류의 x enobiot ics의 m etabolism 과정을 규명하는데 매우 중요

하다. CYP450의 act iv e s it e인 hem e은 Schem e 1에 나타나 있다.

S ch em e 1. Pr oposed React iv e Species of CYP450

1

＋

P er ox idase는 F e (Ⅲ) porphyr in을 가지는 단백질류 중에서 H 2 O2에

의해 기질을 산화시키는 촉매 역할을 하는 것들 중에 하나이다. HRP 2 ,3

는 이 부류들 중에 가장 많이 연구되어져 왔다. HRP는 그 구조가

CYP450과 매우 비슷하나, F e의 다섯 번째 lig an d가 cy st ein이 아닌

hist idin e의 im idazole이며, CYP는 대부분 tw o- electr on ox idan t인데

비하여 HRP는 on e - elect r on ox idan t이다.

시험관내에서는 CYP450을 모방한 효율적인 모델 시스템을 개발하기

위한 연구가 적어도 20년 이상 진행되어왔다. H em e 구조와 유사한 구

조를 가지고 있는 m etalloporphyr in s 4의 다양한 구조적 변화를 통한 산

화반응 촉매 시스템이 그것인데, 중심 m etal로는 F e와 Mn이 주로 사용

되며, 적당한 m on oox y gen don or로는 iodosoben zen e5 , sodium

hypochlor it e 6 , hy dr oper ox ides 3 c ,7 , hy dr ogen per ox ide 8 , per oxy acids 9 ,

amin e N - ox ide 1 0 등이 사용되었다. 몇 가지 m etallopor phyr in s의 종류

를 Scheme 2에 나타내었다.

S ch e m e 2 . Metallophophyr in s

2

이처럼 산화효소 및 metalloporphyr in s을 이용한 유기 화합물의 산

화반응에 대한 연구는 잘 알려져 있지만, 그 반응 메카니즘은 정확하게

알려진 것이 없다. 이에 본 연구에서는 amine의 N - dealky lat ion 반응

이 일어날 수 있는 자리가 2개인 diben zy lamin e을 선택, 합성하여 각

반응에 대한 상대 반응속도와 동위원소 효과를 측정하여 그 경향성을 분

석, 설명함으로써 반응의 구체적인 메카니즘을 규명하고자 하였다.

3

Ⅱ . 이 론

수 십 년간의 노력에도 불구하고 반응에 대한 메카니즘은 아직 논제

의 대상이 되고 있다. Amin e에 대한 ox idat iv e N - dealky lat ion의 주된

메카니즘은 세 가지 주장이 유력한데, (1) electr on/ pr oton tr an s fer

(ET / PT ; path A, C)2 , 1 1∼ 14와 (2) hydrogen atom tran sfer (HAT ; path

B )15 , 그리고 (3) electr on/ hydrogen atom tran sfer (ET / HAT ; path A,

D )1 6이다. 이것은 Schem e 3에 함께 비교하여 도식하였다.

S c h e m e 3 . P os sible Mechanism s of Oxidat iv e N - Dealky lat ion

of Amin e

ET / PT 메카니즘은 path A를 통해서 n it r og en으로부터 전자 한 개

가 떨어져 나온 후, α- car bon으로부터 pr oton이 떨어져 나가는 path

B 를 거쳐 진행된다는 주장이다. 이 메카니즘에 따르면 path A를 통해

r adical cat ion이 생성이 되는데, Or t iz de Montellan o 1 7는 이를 실험적

4

으로 증명하기도 했다. HRP 18에의한 여러 가지 화합물에 대한 산화 반

응에서는 EPR에 의해서 amin ium r adical cat ion이 검출되었다. 이것은

HRP에 대한 산화 반응이 ET 를 통해서 일어나고 있다는 것을 말한다.

Inhibitor를 사용한 실험결과 또한 이를 뒷받침하고 있다1 9 . T . Shon o2 0

와 Larr y R . Hall2 0 c은 전기화학을 이용한 산화반응을 통한 동위원소 효과

를 측정하여 그 결과의 유사성으로 이 주장을 뒷받침하는 근거를 발표하였

다. α- Carbon의 수소를 중수소로 치환하여 그 동위원소 효과를 측정하

는 것은 amine의 산화반응 메카니즘 연구에 상당히 일반화 되어있다.

대부분의 이러한 연구들은 1983년에 Miw a 2 1가 제안했던 방법에 근거하

고 있는 것이 사실이다. 그는 N,N - dimethylaniline으로부터의 demethylation

반응을 연구하여 그 intramolecular isotope effect가 작음(k H / k D = 1.6∼

1.7)을 보이고 이를 근거로 하여 ET / PT 메카니즘을 설명하였다.

HAT 메카니즘은 path B를 통해서 α- Car bon의 수소가 직접 떨어

져 나가게 된다. 따라서 이 메카니즘에서는 r adical cat ion을 형성하지

않는다. 결과적으로는 ET / PT 와 같은 결과를 가지므로 그 구분이 매우

어렵다. Dinn ocenzo 15는 N ,N - dimethylan ilin e의 par a 위치에 치환기를

도입한 기질을 준비하여 치환기에 따른 동위원소 효과를 측정하였다. 또

한 동일한 기질을 사용하여 hydr og en atom t r an sfer 반응을 시켜 동위

원소 효과를 측정하였다. 이렇게 얻어진 두 결과의 경향성이 서로 같음

을 실험적으로 보이면서 CYP450에 의한 N - dealky lat ion은 HAT 메카

니즘을 따른다고 설명하고 있다.

1984년에 B urka 1 6는 CYP450을 사용한 실험에서 amin e의

ox idat ion에 대한 치환기 효과를 H ammet t corr elat ion한 결과, 반응 상

수(ρ)가 음수값을 가지는 것으로 ET / HAT 를 설명하고 있다.

5

Ⅲ. 결 과 및 고 찰

1. 상대 반응속도(k Y / k H )

현재까지의 연구에서는 C 6H 5 N (CH 3 )2와 YC6H 4 N (CH 3 )2를 혼합하여

경쟁반응을 시켜 상대 속도상수를 연구하였다. 그러나 본 연구에서는

YC 6H 4 CH 2NHCH 2 C 6H 5를 기질로 사용함으로써 경쟁반응이 같은 분자내

에서 일어나도록 고안하였다. Substituted dibenzylamine의 N - debenzylation

은 Schem e 4에서 보는 바와 같이 두 곳에서 가능하다. 즉 이와 같은

in t r amolecular 경쟁반응을 통해서 C6H 5 CH O와 YC 6H 4 CHO이 생성되

고, 그 생성물의 비가 곧 상대 속도상수의 값이 되게 하였다.

S ch em e 4 . Oxidat iv e N - Deben zylat ion s

6

이와 같은 방법에 의해서 측정된 상대 속도상수(k Y / k H )와 이것으로부터

유도 계산된 Hammett ρ 및 ρ+ 값들이 T able 1에 나와있다. Hammett

correlations은 σ+보다는 σ와 보다 나은 상관관계를 갖고 있음을 correlation

coefficient값들로부터 확실히 알 수 있다.

T able 1. Oxidative N - Debenzylation s of Substituted Dibenzylamines

by CYP450, LT A , F eⅢ T PP Cl, an d HRP

a ) s olv en t/ T ℃: H 2 O/ 37℃, 본 연구실에서 먼저 수행된 결과를 인용

b ) solvent/ T ℃: CH 2Cl2/ 25℃ c ) solvent/ T ℃: CH 2Cl2/ 25℃ d ) solvent/ T ℃: H 2O/ 37℃

k Y / k H

ρ(r ) ρ+ (r )p - OCH 3 p - CH 3 H p - Cl m - C l p - CN p - N O 2

CYP 4 501.69

±0.0 2- 1

0.4 6±0.0 1

0.38±0.0 1

0.225±0 .0 2

0. 145±0 .0 1

- 0 .952(0 .993 )

- 0 .709(0 .94 5 )

LT A3.55

±0.041.6 2

±0 .0 21

0 .463±0.0 1

0.325±0.0 1

0.062±0.003

0.056±0.005

- 1.65(0 .996 )

- 1.23(0 .965 )

F e T P P Cl1. 11

±0.0 11.08

±0 .031 -

0 .925±0.0 1

0.823±0 .0 1

0.802±0 .0 2

- 0 . 13(0 .996 )

- 0 . 10(0 .968 )

H RP1.64

±0.081.30

±0 .091

0 .609±0.03

0.49 1±0.09

0.3 10±0 .04

-- 0 .76

(0 .997 )- 0 .5 1

(0 .965 )

7

a

Ⅲ

b

c

d

2. 동위원소 효과(k H / k D )

산화반응에서의 k H / k D 값을 Scheme 5와 같은 방법으로 측정을 하였으

며, 치환기 H에 대해서는 GC에서 C6H 5 CHO와 C6H 5 CDO의 peak의 구분

이 불가능하므로, Scheme 6과 같은 간접적인 방법을 이용해서 측정하였다.

그 값이 T able 2에 나와있다.

S ch em e 5 .

8

S ch em e 6 .

T able 2 . Kinet ic Is otope E ffect s

a ) s olv en t/ T ℃: H 2 O/ 37℃, b ) s olv en t/ T ℃: CH 2 Cl2/ 25℃

c ) solv en t/ T ℃: CH 2 Cl2/ 25℃ d ) s olv en t/ T ℃: H 2 O/ 37℃

k H / k D

p - OCH 3 H m - Cl

CYP450 4.56±0.2 1.9 1±0.03 1.6 1±0.03

LT A 5.15±0.3 2.25±0.02 1.66±0.02

F e T PP Cl 3.90±0.2 1.65±0.05 1.40±0.0 1

HRP 3.43±0.3 1.34±0.06 1.17±0.02

9

a

Ⅲ

b

c

d

3. Electr on tr an sfer/ Hydr ogen atom tr an sfer (ET / HAT ) 메카니즘

CYP와 유사CYP에 의한 N ,N - dimethylanilines의 N - demethylation반

응은 hydr ogen atom tr an sfer (HAT )보다는 elect r on tr an sfer (ET )을

시작으로 해서, 결국에는 N - methylaniline과 formaldehyde를 생성한다.

그런데 이 반응에서 치환기 변화에 따른 KIE (k H / k D )의 변화는 N ,N -

dimethylanilines과 t - butoxy r adical(t - BuO ) 사이의 HAT 에서의 변화

와 비슷한 추세를 보이는 결과를 발표한 것이 있다(HAT 에 대한 실험적 증

거)15 b , 15 d . 그러나 t - butoxy radical과 CYP반응에서의 active oxidant인

iron - oxo radical cation ( )이 반드시 비슷한 반응성을 보여야

한다는 이유는 없다.

본 연구결과를 포함해서 여러 개의 alkylamin es의 dealky lat ion 반

응에서 H ammett ρ< 0 인 것은 반응 중간체가 posit iv e char g e를 갖고

있는 것을 의미하며, alky lamin es의 ox idat ion poten t ial (E O )이 감소함

에 따라서 N - demethylat ion 반응속도가 증가하는 것 역시 ET 의 개입

을 암시하고 있다. LT A 4 2는 ET 반응을 통해서 N ,N - dim ethy lan ilin es을

oxidative demethylat ion시키며, 치환기 효과에 의한 Hammett correlation

은 ρ= - 2.4인 것이 관찰되었다. 이 값은 본 연구에서 subs t itut ed

diben zy lamin es과 LT A사이의 산화반응에서 측정된 ρ= - 1.65와 매우

좋은 상관관계를 보여주고 있다. 만약 CYP450과 F eⅢ T PPCl의 산화반

응에서 E T 대신 HAT 가 일어난다면 ben zy lic hydr ogen at om tr an sfer

(B HAT )가 일어나는 것이 될 것이다. 본 연구실에서 지난 20여 년 간의

연구에 의하면2 3 t - butox y r adical과 같은 electr ophilic r adical에 의한

B HAT 반응에서 치환기 효과는 σ보다는 σ+와 보다 더 좋은 상관관계

를 이루고 있다. 그러나 T able 1에서는 H amm ett corr elat ion이 σ와

보다 나은 관계식을 유지하고 있다(HAT 반응의 부정적 증거).

10

Scheme 7에는 E T 를 시작으로 하는 메카니즘에 대해 가능한 메카니

즘(ET / PT 또는 ET / HAT )을 나타내었다.

S ch em e 7 . P os sible Mechan ism s of Ox idat iv e N - deben zy lat ion of

Sub st itut ed Diben zy lamin e

전체 반응 메카니즘이 ET / PT 메카니즘을 따른다면, YC 6H 4 CHO가

생성되는 반응의 전체 반응 속도상수 k E T / P T 는 정상상태 근사법을 적용

11

하여 다음과 같이 쓸 수 있다.

k E T / P T = (1)

같은 방법으로, C 6H 5 CHO가 생성되는 반응의 전체 반응 속도상수

k 'E T / P T 는 다음과 같이 쓸 수 있다.

k 'E T / P T = (2)

전체 반응이 ET / HAT 메카니즘을 따르는 경우에 대해서도 k E T / H A T

와 k 'E T / H A T 는 다음과 같이 쓸 수 있다.

k E T / H A T = (3)

k 'E T / H A T = (4)

ET / PT 메카니즘에서의 상대 반응속도는 식 (1)과 (2)로부터

k Y / k H = = (5)

이며, E T / HAT 메카니즘에서 상대 반응속도는 식 (3 )과 (4 )로부터

k Y / k H = = (6)

이다. 식 (5)와 (6 )에서 보듯이 어떤 메카니즘을 가지느냐에 상관없이

12

k E T k P T (Y )

k - E T + k P T (Y ) + k P T (H )

k E T k P T (H )

k - E T + k P T (Y ) + k P T (H )

k E T k H A T (Y )

k - E T + k H A T (Y ) + k H A T (H )

k E T k H A T (H )

k - E T + k H A T (Y ) + k H A T (H )

k E T / P T

k 'E T / P T

k P T (Y )

k P T (H )

k E T / P T

k 'E T / P T

k P T (Y )

k P T (H )

N - deben zy lat ion 후에 생성되는 두 aldehy des의 양은 첫 번째의 ET 단

계는 영향이 없고, 두 번째 PT 또는 HAT 단계에서만 영향을 받는다는

것을 알 수 있다.

ET / PT 의 메카니즘의 경우를 생각해 보면, PT 후에는 r adical이 형

성된다. 즉, posit iv e char g e가 감소하는 방향으로 방향이 진행된다. 때

문에 치환기가 EW G인 경우에는 pr oton tr an sfer 속도가 증가하고, 치

환기가 EDG인 경우에는 pr oton t r an sfer 속도가 감소한다. 결과적으로

반응상수 ρ는 양의 값을 가진다.

ET / HAT 의 메카니즘의 경우는 E T 후에 HAT 가 일어나므로,

pos it iv e char g e가 증가하는 방향으로 반응이 진행되어 cat ion이 형성된

다. 이 때는 치환기가 EW G인 경우에는 hy dr ogen atom tr an sfer 속도

가 감소하고, 치환기가 E DG인 경우에는 hydr ogen atom tr an s fer 속도

가 증가한다. 따라서 얻어지는 반응 상수 ρ는 음수이다. T able 1에서

보듯이 네 개의 ρ값은 모두 음수이다(ET / HAT 메카니즘의 증거).

F igur e 1과 F igur e 2는 치환기 3개(p - OCH 3 , H , m - Cl)에 대해 최

초 electr on t r an sfer가 일어난 후 pr oton tr an s fer가 일어날 때의

potent ial en er gy 변화곡선을 en dothermic 상황과 ex othermic 상황으

로 나누고, 이와 관계한 동위원소 효과를 연관지어 나타낸 것이다.

F igur e 1에 의하면, pr oton tr an sfer의 속도는 p - OCH 3가 가장 느리고,

m - Cl에서 가장 빠르게 나타난다. 동위원소 효과는 m - Cl에서 가장 크

고, p - OCH 3에서 가장 작다. F igur e 2에서는 반응속도는 p - OCH 3에서

m - Cl로 갈수록 빨라지고, 동위원소 효과는 m - Cl에서 p - OCH 3로 갈수

록 커진다.

F igur e 3과 F igur e 4는 최초 elect r on tr an sfer로 반응이 시작되고,

그 다음에 hy dr ogen atom tr an s fer가 일어날 때의 변화를 나타낸 것이

다. F igur e 3에서는 m - Cl에서 p - OCH 3로 갈수록 t r an sfer의 속도는

13

증가하고, 동위원소의 효과는 감소한다. 이는 본 연구에서 나타난 결과

와 일치한다. F igur e 4에서는 p - OCH 3에서 m - Cl로 갈수록 t r an sfer의

속도는 감소하고, 동위원소 효과는 증가한다.

F ig ure 1. Proton T r ansfer/ F ig ure 2. Proton T r ansfer/

Endothermic Exothermic

14

p - OCH 3

r .c .

K IE

P .E .

r .c .

H

m - Cl

K IE

P .E .

r .c .

r .c .

p - OCH3

Hm - Cl

Figure 3. Hydrogen Atom Transfer/ Figure 4. Hydrogen Atom Transfer/

Endothermic Exothermic

15

K IE

P .E .

r .c .

r .c .p - OCH3

Hm - Cl

K IE

P .E .

r .c .

p - OCH3

H

m - Cl

r .c .

Ⅳ . 결 론

1. 반응에서 얻어진 상대 속도상수(k Y/ k H )는 Hammett corr elation한 결과,

elect r on tr an s fer r eag en t로 알려진 lead t et r aacet at e (LT A )와 같은

경향성을 가지면서 σ+보다 σ에 더 좋은 상관 관계를 보였다.

2. 각 반응에서 얻어진 반응상수 ρ(LT A:ρ=- 1.65 ; FeⅢ T PPCl:ρ=- 0.13 ;

HRP :ρ=- 0.76)는 음수 값을 가졌다. 따라서 이 반응은 electr on

tr an s fer 후 pr oton tr an s fer로 진행되는 것이 아니라, 최초 electr on

tr an s fer로 반응이 개시되어 이후에는 반응중심에 pos it iv e char g e가

증가하는 hydr ogen atom tr an sfer로 진행됨을 알 수 있다.

3. 상대 반응속도와 동위원소 효과(k H / k D )는 치환기가 electr on - donating

gr oup에서 electr on - withdr awin g gr oup으로 갈수록 감소하였다. 이

사실로 electron transfer 후에 일어나는 반응은 endothermic hydrogen

atom tr an s fer 반응임을 알 수 있다.

4 . 이상의 결과를 통하여 생체 모방 산화적 N - 벤질 제거 반응은 전자

전달/ 수소 원자 전달(ET / HAT ) 메카니즘으로 반응이 진행됨을 알았

다.

16

Ⅴ . 실 험

1. Iodosoben zen e의 합성

Iodosoben zene은 iodosy lben zen e이라고도 하며 엷은 상아색의 고체

로 그 합성법은 이미 잘 알려져 있다2 4 .

S ch e m e 8 . Syn thes is of Iodosoben zene

Iodoben zen e diacet at e 3.22g (0.0 1m ole )을 250mL 플라스크에 넣

고, 여기에 3N NaOH 15mL를 5분에 걸쳐 천천히 dr opping하면서 교

반시킨다. 1시간 후 10mL의 H 2 O를 첨가하고, 10분 후 걸러내어 연한

상아색 고체를 얻었다. 이를 다시 한 번 물로 씻어내고 상온에서 감압하

여 건조시킨다. 이 과정을 3회 반복 후 고체를 비이커에 옮기고 여기에

클로로포름을 채우고 고체를 약수저를 이용해서 작은 크기로 잘게 부수

어 씻는다. 이것을 걸러내고 공기 중에서 완전히 건조하여 1.86g (수득률

85%)의 순수한 iodosobenzen e을 얻었다. 합성 후 매 사용 시마다 질소

가스를 충진하여 파라핀 필름으로 밀봉하여 0∼5℃에서 냉장 보관하였다.

m .p . 208∼209℃ (lit . 210℃)2 5

iodoben zen e diacet at e: Aldr ich 제품 사용 (순도 98%)

NaOH : 동양화학 제품 사용 (순도 96%이상)

CCl4 : Aldr ich 제품 사용 (순도 99.9% )

17

2. Sub st itut ed diben zy lamin e의 합성

합성 후 high v acuum dist illat ion으로 pur ificat ion한 후에 각 반응

의 sub str at e로 사용하였다. 매 사용 시마다 질소 가스를 충진 한 후 파

라핀 필름으로 밀봉하여 데시케이터에 보관하였다.

S ch em e 9 . Syn thesis of Sub st itut ed Dibenzy lamin e

1) N - B en zy l- 4 - m ethox yben zylamin e의 합성

p - An isaldehy de 2.72g (0.02mole )을 ben zen e 15mL와 함께 100mL

플라스크에 넣고, 여기에 ben zy lamin e 2. 14g (0.02mole )을 benzen e에

묽힌 것을 10분에 걸쳐 천천히 dr oppin g하면서 교반시킨다. 이때 H 2 O

가 생성되면서 점차 뿌옇게 흐려지는 것을 볼 수 있다. 3시간 후 교반을

중지하고 무수 황산나트륨을 넣어 발생한 H 2 O를 제거하였다. 1시간 방

치 후 걸러 맑은 용액을 얻었다. Ev apor ator를 사용하여 ben zen e을 제

거한 후 NMR을 사용하여 im in e의 생성을 확인하였다.

합성된 imine을 ice bath에서 methanol에 녹인 후 1.5당량의 NaBH4를

여러 번에 걸쳐 나누어 넣었다. 기체가 더 이상 발생하지 않을 때 ice bath

18

를 제거하고 1시간 더 반응을 유지하였다. Methanol을 제거하고 여기에

methylene chloride와 물을 사용하여 유기층을 추출하였다. 무수 황산나트

륨을 사용하여 건조 후, evapor ator를 사용하여 methylene chloride를 제거

하여 4.34g (수득률 95%)의 순수한amine을 얻었다.

NMR (CDCl3 ) δ: 3.8 (d , 7H , CH 3 O, 2CH 2 ), 6.9 (d , 2H , C 6H 4 ),

7.2∼7.3 (m , 7H , C 6H 5 , C 6H 4 )

p - an is aldehy de: Aldr ich 제품 사용 (순도 98% )

ben zylamin e: J un s ei Chemical 제품 사용 (순도 99.0%)

ben zen e: HPLC gr ade , Aldr ich 제품 사용 (순도 99.9% )

m ethanol: HPLC gr ade , Aldr ich 제품 사용 (순도 99.93% )

무수 황산나트륨: 동양화학 제품 사용 (순도 99%)

NaB H 4 : Aldr ich 제품 사용 (순도 99%)

m ethy len e chlor ide: 동양화학 제품을 P 2 O5와 함께 증류하여 사용

(순도 99.5%)

2) N - B en zy l- 4 - m ethy lben zylamin e의 합성

N - Benzyl- 4- methoxybenzylamine과 동일한 방법으로 p - tolualdehyde

2.40g (0.02m ole )과 ben zy lamine 2. 14g (0.02mole )을 사용하여 im in e을

만들고, 이를 r educt ion하여 amin e 4.05g (수득률 96% )을 얻었다.

NMR (CDCl3 ) δ: 2.4 (s , 3H , CH 3 ), 3.8 (d , 4H , 2CH 2 ),

7.2∼7.4 (m , 9H , C 6H 5 , C 6H 4 )

p - t olualdehy de: Aldr ich 제품 사용 (순도 97% )

19

3) N - B en zy l- 4 - chlor obenzy lamin e의 합성

N - Benzyl-4- methoxybenzylamine과 동일한 방법으로 4- chlorobenzaldehyde

2.8 1g (0.02m ole )과 ben zy lamine 2. 14g (0.02mole )을 사용하여 im in e을

만들고, 이를 r educt ion하여 amin e 4.32g (수득률 93% )을 얻었다.

NMR (CDCl3 ) δ: 3.8(d, 4H, 2CH2 ), 7.2∼7.4(m, 9H, C6H5 , C6H4 )

4 - chlor obenzaldehy de: Aldr ich 제품 사용 (순도 97%)

4) N - B en zy l- 3 - chlor obenzy lamin e의 합성

N - Benzyl-4- methoxybenzylamine과 동일한 방법으로 3- chlorobenzaldehyde

2.8 1g (0.02m ole )과 ben zy lamine 2. 14g (0.02mole )을 사용하여 im in e을

만들고, 이를 r educt ion하여 amin e 4.46g (수득률 96% )을 얻었다.

NMR (CDCl3 ) δ: 3.8(d, 4H, 2CH2 ), 7.2∼7.4(m, 9H, C6H5 , C6H4 )

3 - chlor obenzaldehy de: Aldr ich 제품 사용 (순도 97%)

5) N - B en zy l- 4 - cy an oben zy lamin e의 합성

N - Benzyl-4- methoxybenzylamine과 동일한 방법으로 4- cyanobenzaldehyde

2.62g (0.02m ole )과 ben zy lamine 2. 14g (0.02mole )을 사용하여 im in e을

만들고, 이를 r educt ion하여 amin e 4.22g (수득률 95% )을 얻었다.

20

NMR (CDCl3 ) δ: 3.8(d, 4H, 2CH2 ), 7.2∼7.6(m, 9H, C6H5 , C6H4 )

4 - cy an oben zaldehy de: Aldr ich 제품 사용 (순도 95%)

6) N - B en zy l- 4 - n it r oben zylamin e의 합성

N - Benzyl- 4- methoxybenzylamine과 동일한 방법으로 4- nitrobenzaldehyde

3.02g (0.02m ole )과 ben zy lamine 2. 14g (0.02mole )을 사용하여 im in e을

만들고, 이를 r educt ion하여 amin e 4.5 1g (수득률 93% )을 얻었다.

NMR (CDCl3 ) δ: 3.8 (d , 4H , 2CH 2 ), 7.2∼7.4 (m , 5H , C6H 5 ),

7.5 (d , 2H , C6H 4 ), 8.2(d , 2H , C 6H 4 )

4 - n it r oben zaldehy de: Aldr ich 제품 사용 (순도 98% )

2 1

3. α,α- Dideuter at ed sub st itut ed diben zy lamin e의 합성

두 가지 방법으로 합성을 시도하였다.

첫 번째는, 치환된 ben zoylchlor ide와 ben zy lamin e을 이용한 합성이

다. benzoy lchlor ide와 ben zy lamin e으로 amide를 먼저 만들고, 이것을

다시 LiAlD 4로 r educt ion시키면 중수소로 치환된 diben zy lamin e이 만

들어진다.

두 번째는, benzon it r ile로부터 중수소로 치환된 ben zy lamine을 만

들고, 이를 ben zaldehyde와 반응시켜 im in e을 만든다. 그 후에 NaB H 4

로 r educt ion시키면 중수소로 치환된 dibenzy lamin e이 만들어진다.

이 실험에서는 상대적으로 수득률이 높고, pur ificat ion과정이 쉬운

두 번째 방법을 사용하였으며, 합성 후에는 high v acuum dist illat ion으

로 pur ificat ion하였다.

22

S c h e m e 10 .

S c h e m e 1 1.

23

1) α,α- Dideuter io- N - ben zy l- 4 - methox yben zy lamine의 합성

Ice bath를 설치한 상태에서 20mL T HF에 LiAlD 4 1.5당량을 넣는

다. 4 - Methox yben zonit r ile 3.99g (0.03mole )을 20mL T HF에 녹이고,

이것을 4시간에 걸쳐 천천히 dr oppin g한다. Ice bath를 제거하고, 실온

에서 질소 가스를 계속 흘려주면서 24시간 반응을 유지한다.

Ice bath를 다시 설치하고, 5% H Cl을 용액이 산성이 될 때까지 천

천히 첨가하여 생성된 amin e과 salt를 형성하게 한다. B en zen e 50mL

를 넣고 물층을 분리해 낸다. 물층에 3N NaOH를 용액이 염기성이 될

때까지 첨가하여 HCl을 amin e으로부터 떼어낸다. B en zen e을 사용하여

유기층을 분리해낸 후, ev apor ator를 사용하여 benzen e을 제거하여

3.25g 의 α,α- dideuter io - 4 - m ethoxyben zy lamin e을 얻었다. 이것은

NMR로 확인하였다.

α,α- Dideuterio- 4 - methoxybenzylamine 3.25g (0.023mole)과 2.44g

(0.023mole)의 benzaldehyde를 반응시켜 N - benzylidene- α,α- dideuterio

- 4 - methoxybenzylamine을 먼저 만들고 이를 NaBH4로 환원시켜 4.98g

(수득률 72%)의 amin e을 얻었다.

NMR (CDCl3 ) δ: 3.8 (s , 5H , CH 3 O, CH 2 ), 6.9 (d , 2H , C 6H 4 ),

7.2∼7.4 (m , 7H , C 6H 5 , C 6H 4 )

T HF : 동양화학 제품을 sodium과 함께 증류하여 사용

4 - m ethox yben zonit r ile: Aldr ich 제품을 사용 (순도 99%)

benzaldehyde: r edistilled, Aldrich 제품을 사용 (순도 99.5%이상)

24

2) α,α- dideut er io - N - ben zyl - 3 - chlor oben zy lamin e의 합성

α,α- Dideuter io - N - benzy l- 4 - m ethox yben zylamin e과 동일한 방

법으로 3- chlor obenzonitrile 2.75g (0.02mole)을 사용하여 2.07g의 α,α

- dideuterio- 3- chlorobenzylamine을 얻었다. 이것과 1.53g의 benzaldehyde

를 반응시켜 3. 11g (수득률 67% )의 amin e을 얻었다.

NMR (CDCl3 ) δ: 3.8 (s , 2H , CH 2 ), 7.2∼7.4 (m , 9H , C6H 5 , C 6H 4 )

3 - chlor obenzon it r ile: Aldr ich 제품을 사용 (순도 99%)

3) α,α- dideut er io - N - (3 - chlor oben zy l)- ben zy lamine의 합성

α,α- Dideuter io - N - benzy l- 4 - m ethox yben zylamin e과 동일한 방

법으로 benzonitrile 2.06g (0.02mole)을 사용하여 1.66g의 α,α- dideuterio

- benzylamine을 얻었다. 이것과 2.14g의 3- chlor obenzaldehyde를 반응시

켜 3.38g (수득률 72% )의 amin e을 얻었다.

NMR (CDCl3 ) δ: 3.8 (s , 2H , CH 2 ), 7.2∼7.4 (m , 9H , C6H 5 , C 6H 4 )

ben zon it r ile : Aldr ich 제품을 사용 (순도 99% )

25

4. 상대 반응속도 및 동위원소 효과의 측정

Dibenzy lamin e이 N - debenzy lat ion이 일어나면 Scheme 4에서 보

듯이amin e과 aldehyde가 생성이 되는데, 이 두 물질은 유기층 내에서

서로 cr os s coupling이 일어나서 im in e이 생성이 된다. 상대 반응속도

는 aldehyde와 치환된 aldehyde의 생성비로 측정이 되는데, couplin g이

생기면 정확한 측정이 불가능하므로, GLC로 분석 전에 이 couplin g으

로 생긴 im in e을 다시 aldehy de와 amin e으로 분리를 해야하는 작업이

필요하다.

이 문제는 반응 종결 시 5%의 HCl을 충분히 넣어 줌으로써 해결이

가능하다. 대조 실험으로 확인한 결과 im in e이 100% aldehy de와

amin e으로 분해가 된 것을 확인하여 타당함을 입증하였다.

또한, 반응 환경 내에서는 생성된 aldehyde는 더 이상 산화되지 않

는 것도 대조 실험으로 확인하였다.

상대 반응속도의 측정은 LT A , F eⅢ T PP Cl, HRP에 대해서 측정을

하였다. 각 치환기에 대하여 최소 4회 이상의 실험으로 얻어진 값을 산

술 평균하여 사용하였으며, CYP450에 대한 상대 반응속도는 본 연구실

에서 선행되어진 결과를 인용하였다.

동위원소 효과는 CYP450 , LT A , F eⅢ T PP Cl, HRP에 대해서 상대

반응속도와 동일한 실험방법으로 측정하였다. Scheme 5와 Scheme 6에

서 보듯이 치환기가 p - OCH 3 , H , m - Cl 인 기질에 대하여 측정을 하였

으며, 각 치환기에 대하여 최소 3회 이상의 실험으로 얻어진 값을 산술

평균하여 사용하였다. H에 대해서는 생성물이 C6H 5 CH O와 C 6H 5 CDO이

다. 하지만 이 두 물질은 GC 상에서 peak의 구분이 불가능하므로 다른

한 쪽의 ben zen e에 치환기를 붙여서 구분을 할 수 있게 하였다.

26

1) Cy tochr om e P450(CYP450)/ NADPH

3차 증류수 650μL에 200μL의 potassium phosphate buffer (pH=7.4),

40μL (2.5nmole)의 microsomal CYP450, 10μL (2.5mmole in methanol)

의 기질, 그리고 100μL (25mM )의 NADPH를 순서대로 혼합하였다. 각

단계마다 충분히 v or t ex in g하였으며, ice bath상태에서 혼합하였다. 이

혼합물을 37.0±0.1℃ 항온수조에서 60회/ min의 속도로 흔들어 주면서

30분간 in cubat ion하였다.

Ice bath에 넣고 1mL의 5% H Cl을 가하여 반응을 종결시키고

amin e을 salt로 만들었다. In t er n al s t an dar d로 1,4 - dibr om oben zen e

10μL (0.02mm ole)를 가하였다. 3mL의 methylen e chlor ide를 가하여

흔들어 준 후, 원심 분리하여 유기층을 분리해 냈다. 이 과정을 2회 더

반복하여 모아진 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. Sample은

20μL까지 농축하여 GLC를 사용하여 분석하였다.

2) Lead tet r aacet at e (LT A )

각각의 subs tr at e (0.2mm ole )를 2mL의 m ethy len e chlor ide에 녹이

고 여기에 LT A (0.02mm ole)를 첨가시키면서 반응을 개시하였다. 질소

가스를 계속 흘려주면서, 순환식 항온 수조를 이용해서 25.0±0. 1℃에서

30분간 반응하였다.

반응 후 5% HCl 2mL를 넣고 ice bath로 옮겨 반응을 종결시키고,

in ternal standard로 1,4 - dibr omobenzene (0.02mmole) 10μL를 첨가했

다. 증류수를 넣고 원심 분리하여 유기층을 분리해냈다. 이 과정을 2회 더 반

복하여 모아진 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후 GLC로 분석하였다.

27

3) F eⅢ T PPCl/ PhIO

각각의 subs tr at e (0.5mm ole )를 5mL의 m ethy len e chlor ide에 녹이

고 여기에 순차적으로 FeⅢ T PPCl(tetraphenylporphyr in iron (Ⅲ) chloride,

5μm ole), PhIO (0.05mm ole)을 재빨리 넣고 반응을 개시하였다. 질소

가스를 계속 흘려주면서, 순환식 항온 수조를 이용해서 25.0±0. 1℃에서

2시간 동안 반응하였다.

반응 후 5% H Cl 5mL를 넣고 ice bath로 옮겨 반응을 종결시키고,

in t ern al st an dar d로 1,4 - dibr om obenzen e 10μL (0.02mm ole)를 첨가

했다. 증류수를 넣고 원심 분리하여 유기층을 분리해냈다. 이 과정을 2

회 더 반복하여 모아진 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후 GLC로

분석하였다.

4 ) Hor s er adish per ox idas e (HRP )/ H 2 O2

증류수 650μL와 sodium phosphate buffer (pH =7.4 ) 200μL를 섞

고 여기에 순차적으로 0.0625mM HRP 40μL (최종 2.5nm ole ), 0.25 M

substrate 10μL (최종 2.5μmole), 0.25M H 2O2 100μL (최종 25μmole)

를 재빨리 넣고 반응을 개시하였다. 순환식 항온수조를 이용해서 37.0±0.1℃

에서 30분간 반응하였다.

반응 후 5% HCl 2mL를 넣고 ice bath로 옮겨 반응을 종결시키고,

in t ern al st an dar d로 1,4 - dibr om obenzen e 10μL (0.02mm ole)를 첨가

했다. 증류수를 넣고 원심 분리하여 유기층을 분리해냈다. 이 과정을 2

회 더 반복하여 모아진 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후 20μL까

지 농축하여 GLC로 분석하였다.

28

HRP : type Ⅵ, Sigm a 제품 사용

s odium phosphat e buffer (pH =7.4 )의 제조

A : m onobas ic s odium phosphat e 0.2M 용액

(NaH 2P O4·H 2 O 27.8g in 1000mL )

B : dibasic sodium phosphate 0.2M 용액

(Na 2HP O4·7H 2 O 7 1.7g in 1000mL )

: A 19mL와 B 8 1mL를 혼합하고 이것을 최종 부피가 200mL가

되게 묽혀서 pH 7.4 (pH m eter로 확인)의 sodium phosphate

buffer 용액을 만들었다.

29

5. 분석 기기

기질은 각 합성 단계마다 물질의 생성을 NMR을 사용하여 확인을 하

였다. NMR은 Varian Gemin i 2000 NMR (200㎒)을 사용하였다.

반응 후 생성된 aldehydes의 상대적 생성량은 GLC를 사용하여 측

정하였다. 기기 장치로는 Var ian 3300 모델의 GC를 사용하였고, 운반

기체로는 고순도 N 2 가스 (30mL/ min )를 사용하였다. column은 J &W사의

DB - 1 (길이: 30m 내경: 0.25㎜ 필름두께: 1㎛) nonpolar column을

사용하였다. 검출기로는 F ID (O 2 : 300mL/ min H 2 : 30mL/ min )를 사용

하였다. GC 프로그램은 다음과 같다.

Inj . t emp . : 250℃

Det . t emp . : 300℃

30

50℃ (3m in )

170℃ (1m in )

300℃ (7 .5min )

10℃/ m in

20℃/ m in

Ⅵ. 참 고 문 헌

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33

Ⅶ . 부 록

1. NMR spectr a

2. H ammet t corr elat ion s

34

1. NMR spectr a

2. Hamm ett cor r elat ion s

1) CYP450

2) LT A

3) F eⅢ T PPCl

4) HRP

감사의 글

지금의 제가 있기까지 많은 관심과 학문의 길을 열어주시고, 학문적 지식뿐

만이 아닌 살아가는 지혜를 깨닫게 해 주신 은사 김 성수 교수님께 진심으로

깊은 감사를 드립니다.

바쁘신 중에도 본 논문을 심사해 주시고 깊은 조언을 해 주신 이 해황 교수

님, 조 형진 교수님께 감사 드리며, 그 동안 저에게 많은 가르침을 주신 인하대

학교 화학과 모든 교수님 한 분 한 분께 감사 드립니다.

대학원 생활동안 저의 힘들고 어려웠던 일들을 함께 해 주시며 제게 큰 도움

을 주신 김 천수 박사님께 특별한 감사를 드립니다.

또한 학문과 실험에 있어서 많은 도움을 주신 Dr . Lin , Dr . B oy ar sky , Dr .

T rou shk ov와 연구실에서 동고동락하며 많은 도움을 주시고 지금은 졸업을 하

신 지원형, 상학형에게 큰 감사를 드립니다. 같이 졸업을 하는 경문형, 민수,

이제 남아서 연구실을 끌어 갈 지영이와 은정이, 종혁이, 막내 상수에게도 고마

움을 전합니다. 옆에서 항상 지켜봐 주시고 조언을 아끼지 않으신 박 찬일 박

사님과 후배 흥진, 진영, 현철, 동원, 대일, 대호, 지희와 그 외에도 일일이 열

거하지 못한 사랑하는 동기들과 많은 선·후배님들께도 고마움을 전합니다.

특히 학교 밖에서 항상 격려와 도움을 준 승복이와 석범이, 동훈, 태균, 영

민, 지홍이에게도 감사 드립니다.

끝으로 자식을 위해 늘 걱정하시며 고생하신 사랑하는 어머니와 항상 저를

믿어 주시고 묵묵히 지켜봐 주신 존경하는 아버지께 머리 숙여 큰 감사를 드립

니다.

저를 바라보며 오랜 기간 곁에서 저의 모든 것을 함께 한 사랑하는 인성이와

함께 이 기쁨을 나누고 싶습니다.

2000년의 끝자락에서

정 환 규