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B i o p h y s i c a lJ o u r n a lVo l u m e6 8 M a r c h1 9 9 5 1 1 9 1 - 1 1 9 5

A p p r o a c h e st o T e a c h i n gF l u o r e s c e n c eS p e c t r o s c o p y

C a t h e r i n eA . R o y e rU n i v e r s i t yo f W i s c o n s i n - M a d i s o nS c h o o l o f P h a r m a c y ,M a d i s o n ,W i s c o n s i n5 3 7 0 6 USA

INTRODUCTION

F l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yi so ne o ft h em o s tw i d e l yu sed s p e c -t r o s c o p i ct e c h n i q u e si nt h ef i e l d so fb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o p h y s i c st o d a y.A l t h o u g hf l u o r e s c e n c em e a s u r e m e n t sd o n o tp r o v i d ed e t a i l e ds t r u c t u r a li n f o r m a t i o n ,t h et e c h n i q u eh a sb e -c o m eq u i t ep o p u l a rb e c a u s eo fi t sa c u t es e n s i t i v i t yt oc h a n g e si nt h es t r u c t u r a la n d d y n a m i cp r o p e r t i e so fb i o m o l e c u l e sa n d b i -o m o l e c u l a rc o m p l e x e s .L i k e m o stb i o p h y s i c a lt e c h n i q u e s ,f l u o -r e s c e n c es p e c t r o s c o p i cs t u d i e sc a n b e c a r r i e do u ta tm a n yl e v e l sr a n g i n gf r o ms i m p l em e a s u r e m e n to fs t e a d y - s t a t ee m i s s i o ni n -t e n s i t yt o q u i t es o p h i s t i c a t e dt i m e - r e s o l v e ds t u d i e s .T h e i n f o r -

m a t i o nc o n t e n ti n c r e a s e sd r a m a t i c a l l ya s v a r i o u s f l u o r e s c e n c eo b s e r v a b l e sa r et i m er e s o l v e da n d c o m b i n e di ng l o b a la n a l y s e so f t h ep h e n o m e n ao f i n t e r e s t .N o n e t h e l e s s ,q u i t ea g o o dd e a lo fi n f o r m a t i o ni s a v a i l a b l ef r o m s t e a d y - s t a t em e a s u r e m e n t sf o rw h i c ht h er e q u i r e m e n t si n i n s t r u m e n t a t i o na r eq u i t em o d e s t .C o n s e q u e n t l y ,s t e a d y - s t a t ef l u o r o m e t e r sa r er o u t i n e l yu s e d t om e a s u r ec o m p l e x a t i o na n d c o n f o r m a t i o n a lp h e n o m e n ao fb i o -l o g i c a lm o l e c u l e s .

D e s p i t et h ew i d e s p r e a du s e o f f l u o r e s c e n c ei n r e s e a r c h ,c o u r s e s i nb i o p h y s i c a lc h e m i s t r yr a r e l yc o v e rf l u o r e s c e n c ei na n y d e t a i l ,i f a t a l l .O f t e ns t u d e n t sl e a r nf l u o r e s c e n c et e c h -n i q u e so n t h ef l y ,a n d a n u m b e ro f m i s t a k e sa n d o v e r s i g h t s

c a n r e s ul t i ns u b s e q u e n ti n v e s t i g a t i o n su s i n gt h et e c h n i q u e .T h e f o l l o w i n ga d d r e s s e sp r i m a r i l ya p p r o a c h e st o t e a c h i n gf l u o r e s c e n c ei n t h ec o n t e x t o f a n i n t r o d u c t o r yc o u r s e i nb i o -p h y s i c a lc h e m i s t r ya n d b i o p h y s i c a lt e c h n i q u e s .C l e a r l y ,w h e ne x p e r tf a c u l t ya r ea v a i l a b l ei t c a n e n r i c ha g r a d u a t ep r o g r a mi m m e n s e l yt o p r o v i d es t u d e n t sw i t h a c o m p r e h e n -s i v ec o u r s e i n f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y a n d i t s m o r es o p h i s t i c a t e da p p l i c a t i o n st ot h eu n d e r s t a n d i n go fb i o m o l e c u l e s .B e c a u s et h ef i e l dh a su n d e r g o n ea n u m b e ro f a d v a n c e si n i n -s t r u m e n t a t i o n ,a n a l y s i s ,a n d d a t ai n t e r p r e t a t i o ni n r e c e n ty e a r s ,a d i s c u s s i o ni s a l s op r e s e n t e do f s o m eo ft h ep o s s i b l es u b j e c t st h a tc o u l db e c o v e r e di n a n a d v a n c e dc o u r s e .

O n eo f t h ef i r s ti d e a st h a tm u s tb e b r o u g h th o m et os t u d e n t sw h e np r e s e n t i n ga ne w t e c h n i q u ei s i t s u s e f u l n e s s .T h e i re n t h u s i a s m f o r l e a r n i n gt h e t h e o r e t i c a lu n d e r p i n n i n g so ff l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yw i l lu l t i m a t e l yb e l i n k e dt o t h e i rp e r c e p t i o no f w h a ti t c a n t e l lt h e ma b o u t t h eb i o l o g i c a ls y s -

R e c e i v e d f o rp u b l i c a t i o n2 6 S e p t e m b e r1 9 9 4a n d i n f i n a l f o r r n2 1D e c e m b e r1 9 9 4 .A d d r e s sr e p r i n tr e q u e s t st oD r .C a t h e r i n eA . R o y e r ,U n i v e r s i t yo f W i s c o n s i nS c h o o lo fP h a r m a c y ,4 2 5 N . C h a r t e rS t r e e t ,M a d i s o n ,WI 5 3 7 0 6 .Te l . :6 0 8 -2 6 2 - 7 8 1 0 ;F a x : 6 0 8 - 2 6 2 - 3 3 9 7 ;E - m a i l :c a r @ p h a r m a c y . w i s c . e d u .X )1 9 9 5b y t h eB i o p h y s i c a lS o c i e t y

0 0 0 6 - 3 49 5 / 9 5 / 0 3 / 1 1 9 1 / 0 5 2 . 0 0

t e m si nw h i c ht h e ya r ei n t e r e s t e d .O n es h o u l dn o t r e l yo n a n yi n t r i n s i ci n t e r e s ti n p h o t o p h y s i c s ,h o w e v e rf a s c i n a t i n gt h es u b j e c tma y b e .F o r t h i sr e a s o n ,b e f o r e a n y d i s c u s s i o no ft h et h e o r yo f e m i s s i o n o f l i g h tb y m o l e c u l e si t i s a d v i s a b l et o b e g i n w i t h a b r i e f ,g e n e r a ld i s c u s s i o no f t h ek in ds o fi n -f o r m a t i o nt h a tf l u o r e s c e n c em e a s u r e m e n t sc a n p r o v i d e .

BASIC FLUORESCENCET H E O RY

T h e g o a l o f t e a c h i n gf l u o r e s c e n c et h e o r yi n a n i n t r o d u c t o rs u r v e yc o u r s ei nb i o p h y s i c a l t e c h n i q u e si st h a ts t u d e n t scomea w a yw i t ha b a s i cu n d e r s t a n d i n go f t h ep h e n o m e n o no f s p o n -t a n e o u se m i s s i o na n d t h em o l e c u l a ra n de n v i r o n m e n t a lp r o p -e r t i e st h a tg o v e r nt h ei n t en s i t y , c o l o r ,a n d p o l a r i z a t i o no f t h ee m i s s i o n .B e c a u s em a n yo f t h e s t u d e n t swho t a k et h e s ec o u r s e s a r en o t m a j o r si nb i o p h y s i c sb u ti nr e l a t e df i e l d ss u c ha s b i o c h e m i s t r yo r m o l e c u l a rb i o l o g y ,t h e i rb a c k g r o u n di np h y s i c a lc h e m i s t r yc a nb e s o m e w h a tl i m i t e d .O n eo f t h eg r e a td i f f i c u l t i e si n h e r e n ti no r g a n i z i n gs u c h a c o u r s e i s a d j u s t i n gt h el e v e lo f d e t a i lo f t h ed i s c u s s i o no f t h et h e o r yo f f l u o -r e s c e n c e t o t h es t u d e n t sb a c k g r o u n di n p a r t i c u l a rb e c a u s et h i sm a y v a r y w i d e l yw i t h i nt h es a m ec l a s s .B o t hi n t h ec o n -t e x to f a s u r v e yc o u r s ea sw e l l a si na m o r ed e t a i l e dt r e a t m e n to f f l u o r e s c e n c et e c h n i q u e st h ef o u r b a s i cr u l e so f f l u o r e s -c e n c e s h o u l d b e c o v e r e d .T h e s e a r ea s f o l l o w s :

1 . T h eF r a n c k - C o n d o np r in c ip l e : t h en u c l e ia r es t a t i o n a r yd u r i n ge l e c t r o n i ct r a n s i t i o n s ,a n d s o e x c i t a t i o no c c u r s t o v i -b r a t i o n a l l ye x c i t e dl e v e l so f t h ee x c i t e de l e c t r o n i cs t a t e .

2 . E m i s s i o no c c u r s f r o m t h el o w e s t v i b r a t i o n a ll e v e lo ft h el o w e s te x c i t e ds i n g l e ts t a t eb e c a u s er e l a x a t i o nf r o m t h ee x c i t e dv i b r a t i o n a ll e v e l si s m u c hf a s t e rt h a ne m i s s i o n .

3 . T h e S t o k e s s h i f t :e m i s s i o n i s a l w a y so f l ow ere n e r g yt h a n a b s o r p t i o nd u e t on u c l e a rr e l a x a t i o ni nt h ee x c i t e ds t a t e .

4 . T h em i r r o ri m a g er u l e :e m i s s i o ns p e c t r aa r em i r r o ri m -a g e s o f t h el o w e s te n e r g y a b s o r p t i o nb a n d

A r e a s o n a b l yt h o r o u g ha n d s t r a i g h t f o r w a r dt r e a t m e n to fb a s i cf l u o r e s c e n c et h e o r yc a n b e f o u n d i n a b o o ko n f l u o -r e s c e n c e s p e c t r o s c o p yb y L a k o w i c z( 1 9 8 3 ) .As a m e a n so fi l l u s t r a t i n gt h e s ep r i n c i p l e s ,t h eJ a b l o n s k id ia g r am a n dt h eL e n n a r d - J o n e sp o t e n t i a ld i a g r a mi n c h a p t e r1 o f L a k o w i c z( 1 9 8 3 )a r eq u i t eu s e f u l .I nt h eJ a b l o n s k id i a g r a m ,t h eg r o u n da n d t w o e x c i t e de l e c t r o n i cs t a t e so f a h y p o t h e t i c a lm o l e c u l ea r ed i a g r a m m e do n t h ee n e r g y a x i s .T h e a p p r o x i m a t et i m es c a l e sf o rt h ev a r i o u se v e n t s a r ea l s og i v e n i n t h i sd i a g r a mT h e i n t e r n a lc o n v e r s i o n o f e n e r g y r e s u l t i n gi n f a s t ,n o n r a d i a t i v et r a n s i t i o n sf r o m t h e s e c o n d ( S 2 )t o t h e f i r s t

e x c i t e ds i n g l e ts t a t e( S 1 )i s r e p r e s e n t e db y t h ed a s h e dl i n e s .

1 1 9 1

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Vo l u m e6 8 M a r c h1 9 9 5

T h e S t o k e s s h i f tc a n b e e x p l a i n e du s i n gt h eJ a b l o n s k id i a -g r a mb y p o i n t i n go u t t h el o n g e rl e n g t ho f t h ea r r o wf r o mt h ez e r o t hl e v e lo f t h eg r o u n ds t a t et ot h es e c o n dv i b r a t i o n a ll e v e lo f t h ee x c i t e ds t a t ea s c o m p a r e dw i t h t h ea r r o w l e n g t ho ft r a n s i t i o n sf r o mt h ez e r o t hl e v e lo f t h ef i r s te x c i t e ds t a t et ot h es e c o n dv i b r a t i o n a ll e v e lo f t h eg r o u n ds t a t e .

T h e L - J d i a g r a mh e l p st o b r i n gh o m et h ep o i n ta b o u t t h eS t o k e s s h i f tb y l i n k i n gt h el e n g t ho f t h ee m i s s i o n a r r o w t ot h ed eg re e o fn u c l e a rr e l a x a t i o nt h a to c c u r s i n t he e x c i t e ds t a t eb e f o r e e m i s s i o n .I f t h ei n t e r n u c l e a rc o o r d i n a t e so f t h ee x c i t e ds t a t ea r em u c hd i f f e r e n tf r o m t h o s eo f t h eg r o u n ds t a t e ,t h e nt h eS t o k e s s h i f ti s l a r g e .T h i s d i a g r a ma l s oh e l p si l l u s t r a t et h ec o n c e p t t h a tt h ep r o b a b i l i t yo f t h et r a n s i t i o nb e t w e e nt h ez e r o t hl e v e lo f e i t h e rt h eg r o u n do r e x c i t e ds t a t ea n d t h ev a r i o u sv i b r a t i o n a ll e v e l so f t h ee x c i t e do r g r o u n ds t a t e ,r e s p e c t i v e l y ,d e p e n d so n t h eo v e r l a po f t h es q u a r e o ft h ew a v e f u n c t i o n so f t h ee n e r g y l e v e l s .O n c et h ec o n c e p to f t h eo v e r l a po f w a v e f un c t io ns h a sb e e ni n t r o d u c e di t i s n o td i f f i c u l tt o e x p l a i nt h em i r r o ri m a g er u l e ,b e c a u s et h ef o r mo f t h ew a v e f u n c t i o ni n a n y v i b r a t i o n a ll e v e lo f t h ee x c i t e ds t a t ei s q u i t es i m i l a rt o i t sf o r mi n t h eg r o u n ds t a t e ,a n d t h u sp r o b a b i l i t i e sa r ec o m p a r a b l ei n e x c i t a t i o na n d e m i s s i o n .

FLUORESCENCEO B S E RVA B L E S

O n c et h e s eb a s i ct h e o r e t i c a lc o n c e p t s r e g a r d i n ge l e c t r o n i ct r a n s i t i o n sh a v e b e ena d d r e s s e d ,t h ev a r i o u sf l u o r e s c e n c eo b -s e r v a b l e sc a n b e c o v e r e d .T h e s ei n c l u d es t e a d y - s t a t ei n t e n -s i t ya n d t h es t e a d y - s t a t es p e c t r u m ,s t e a d y - s t a t ea n i s o t r o p y ,t i m e - r e s o l v e di n t e n s i t yd e c a ya n d d e c a y - a s s o c i a t e ds p e c t r a ,t i m e - r e s o l v e da n i s o t r o p yd e c a y ,a n d e x c i t e d - s t a t er e a c t i o n s .

I n a o n e t o t w o - l e c t u r es e s s i o na sp a r to f a n i n t r o d u c t o r yc o u r s e ,t h ed e t a i lw i t h w h i c ht h e s ep h e n o m e n ac a n b e c o v -e r e di s r e l a t i v e l yl i m i t e d ,w h e r e a si n a f i v et o e i g h t - l e c t u r es e c t i o no n e h ast h eo p p o r t u n i t yt oe x p a n dt h ed i s c u s s i o na n du s e n u m e r o u se x a m p l e s .W h e n i n t r o d u c i n gt h e s eo b s e r v -a b l e si t i s i m p o r t a n tt o c o v e r w h a t t h e ya r e ,w h a te n v i r o n -m e n t a lo rm o l e c u l a rf a c t o r sc o n t r i b u t et o t he i ru l t i m a t ev a l -u e s a n dp r o p e r t i e s ,a n dho w t h e ya r em e a s u r e d .T h i s l a s ta r e ar e q u i r e sp r e s e n t a t i o no f i n s t r u m e n t a t i o nd i a g r a m s .G o o de x -a m p l e so f s u c h c a n b e f o un di nt h eb o o kb y L a k o w i c z( 1 9 8 3 ) .T h i sb o o k a l s oc o v e r s t h e m e a s u r e m e n ta n d a n a l y s i so fa n i s o t r o p y ,s o l v e n tr e l a x a t i o n ,a n d t i m e - r e s o l v e df l u o r e s -c e n c e i n r e a s o n a b l ed e t a i l .F o r p r e s e n t a t i o no f e v e ng r e a t e rd e t a i l ,t h en e x t s e r i e so f b o o k se d i t e db y L a k o w i c z( 1 9 9 l a - c )i s v e r y c o m p l e t e .T h e r ea r et h r e ev o l u m e sc o v e r i n g ,r e s p e c -t i v e l y,t e c h n i q u e s ,p r i n c i p l e s ,a n d b i o c h e m i c a la p p l i c a t i o n s .I n t h ef i r s tv o l u m e ,c h a p t e r s1 a n d 5 , w h i c he x p l a i nt h et w om e t h o d s( t i m ea n d f r e q u e n c yd o m a i n )f o r t i m e - r e s o l v i n gf l u o r e s c e n c es i g n a l s ,a r ep a r t i c u l a r l ya p p l i c a b l et o a f i v et oe i g h t - l e c t u r es e r i e so n f l u o r e s c e n c e .A n o t h e ru s e f u lr e f e r -e n c e f o ra n i n - d e p t ht r e a t m e n to f f r e q u e n c yd o m a i nf l u o r o m -e t r yi s g i v e n b y J a m e s o ne t a l .( 1 9 8 4 ) .

EXAMPLESO F FLUORESCENCEAPPLIED T OB I O P H Y S I C A LCHEMISTRY

A f t e ra g e n e r a li n t r o d u c t i o nt o t h eo b s e r v a b l e sl i s t e da b o v e ,e x p l a n a t i o no f t h e i ra n a l y s i si s p er h ap s m o s te a s i l ya c c o m -

p l i s h e dt h r o u g ht h ep r e s e n t a t i o no f s o m ee x a m p l e sf r o mt h el i t e r a t u r eo f t h eu s e o f f l u o r e s c e n c ei nb i o p h y s i c s .T h en u m -b e r o f e x a m p l e sc o v e r e d a n d t h ed e t a i li n w h i c ht h e ya r ep r e s e n t e dd e p e n d so n t h et i m e a v a i l a b l e .I n ao n e t o t w o -l e c t u r es e g m e n t ,p r e s e n t a t i o no f o n l y o n e e x a m p l ei s p r a c -t i c a l .I n a l o n g e rs e g m e n t ,t h r e e o rf o u re x a m p l e sc o u l d b ec o v e r e d a n d t h ed a t aa n a l y s i sc o u l d b e t r e a t e di n g r e a t e rd e t a i l .M a n yo t h e re x a m p l e si na d d i t i o nt ot h o s el i s t e dh e r ec a nb e f o u n dd i s c u s s e di n a v e r yc o m p l e t er e v i e wo n f l u o r e s c e nt e c h n i q u e sf o rs t u d y i n gp r o t e i ns t r u c t u r eb y E f t i n k( 1 9 9 0 ) ,a sw e l la s a n e a r l i e rr e v i e wb y B e e c h e ma nd B r an d( 1 9 8 5 )s p e -c i f i c a l l yt r e a t i n gt r y p t o p h a nf l u o r e s c e n c ei n p r ot e in s .L i k e w i s ei n Vo l s .2 a n d 3 o f t h eL a k o w i c zs e r i e s( 1 9 9 1 b ,c ) a r ef o u n dn u m e r o u se x a m p l e so f b i o p h y s i c a la p p l i c a t i o n s .

I n t r i n s i ct r y p t o p h a nf l u o r e s c e n c e i n p r o t e i n s

I f o n e h a s t h et i m e f o rp r e s e n t i n go n l y o n e e x a m p l eo f t h eu s e o f f l u o r e s c e n c ei n b i o p h y s i c sf r o m t h el i t e r a t u r e ,t h es t u d yo f t h ef l u o r e s c e n c ep r o p e r t i e so f t h es i n g l et r y p t o p h a nr e s i d u ei np h o s p h o f r u c t o k i n a s eb y K i m e ta l .( 1 9 9 3 )i sa g o o dc h o i c e .I td e a l sw i t h t h e o r i g i no f t h em u l t i - e x p o n e n t i a ld e c a yc h a r a c t e r i s t i c so f t r y p t o p h a ni n p r o t e i n s ,w h i c hh a s b e e n at o p i co f m u c h d e b a t e i n t h ef i e l do f f l u o r e s c e n c e .I t i s no ww i d e l y ,a l t h o u g hn o t u n i v e r s a l l y ,a c c e p t e dt h a tt h ec o m p l e x -i t y o f f l u o r e s c e n c ed e c a y o f s i n g l e - t r y p t o p h a np r o t e i n si si n d i c a t i v eo f m u l t i p l ec o n f o r m a t i o n a ls t a t e st h a ti n t e r c o n v eo n a t i m e s c a l et h a ti s s l o w c o m p a r e dw i t h e m i s s i o n .T h es t u d yo f K i m a n d c o - w o r k e r s( 1 9 9 3 )f r o m M a r yB a r k l e y sg r o u p p r o v i d e sa n e x t re me ly t h o r ou gha n d w e l l - p r e s e na r g u m e n tf o rt h ec o n f o r m a t i o n a lh e t e r o g e n e i t yh y p o t h e s iT h i s a r t i c l ei s w e l ls u i t e df o ru s e i n t e a c h i n gf l u o r e s c e nb e c a u s e t h ei n v e s t i g a t i o ni n c l u d e smany d i f f e r e n tf l u o r e s -c e n c ea p p r o a c h e s .T h u st h es t u d e n t sa r ee x p o s e dt oa l lo f t h ef l u o r e s c e n c eo b s e r v a b l e sl i s t e da b o v e i n t h ec o n t e x t o f a ni m p o r t a n tb i o p h y s i c a lp r o b l e m .T h e a u t h o r sf i r s tc h a r a c t e ri z e dt h ee m i s s i o n w a v e l e n g t hd e p e n d e n c eo f t h ef l u o r e s -c e n c ed e c a ya n d t h ec a l c u l a t i o no f d e c a y - a s s o c i a t e ds p e c t r a .T h e w o r ka l s oi n c l u d e se x a m i n a t i o no f t h et e m p e r a t u r ed e -p e n d e n c eo f t h ee m i s s i o na n d t h ec a l c u l a t i o no f t h ef r e q u e n c yf a c t o r sa n d t h ea c t i v a t i o ne n e r g y f o rt h eq u e n c h i n gp r o c e s su s i n gt w oa n a l y s i sa p p r o a c h e s( l i n e a ra n a l y s i so f t h es t e a d y -s t a t ed a t aa n dg l o b a la n a l y s i so ft h et i m e - r e s o l v e dd a t a ) .S o l -v e n t i s o t o p ee f f e c t sa n d q u e n c h i n gb y i o d i d ea n d a c r y l a m i d es o l u t e sw e r e p e r f o r m e d ,a n d t h ec o n c l u s i o no f a l lo f t h e s ee x p e r i m e n t si s t h a ts o l v e n tq u e n c h i n ga n d r e l a x a t i o nd o n o tc o n t r i b u t et o t h ed e c a y .I n t er e s t i ng l y , t h et w o l i f e t i m ec o m -p o n e n t se x h i b i td i f f e r e n tS t e r n - Vo l m e rq u e n c h i n gr a t e s .( S e eE f t i n k( 1 9 9 0 )f o r a n e x p l a n a t i o no f t h e S t e r n - Vo l m e rq u e n c h i n gc o n s t a n t s . )K i m e t a l . ( 1 9 9 3 )i n t e r p r e t t h et w oq u e n c h i n gr a t ec o n s t a n t sa ss t r o n ge v i d e n c ef o rt w oc o n f o r -m a t i o n a ls t a t e so f t h e p r o t e i n .I n a d d i t i o n ,t h e a u t h o r si n v e s t i g a t e dt h eq u a t e m a r ys t r u c t u r eb y a n i s o t r o p yd ec ay a ndl i g h ts c a t t e r i n ga n d d e m o n s t r a t et h a ti t i s h o m o g e n e o u s .T h e yc o n s i d e rt h ea l l o s t e r i ct r a n s i t i o na sw e l la n d c o n v i n c i n g l yd e m -o n s t r a t et h a tt h i sp h e n o m e n o nc a n n o tb e r e s p o n s i b l ef o r t h ec o i -

p l e xd e c a y .T h ed i s c u s s i o no f t h ec o n c l u s i o nt h a tc o n f o r m a t i oh e t e r o g e n e i t yi s t h e b a s i sf o r t h e d e c a y p r o p e r t i e si s w e l l

1 1 9 2 B i o p h y s i c a lJ o u r n a l

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Te a c h i n gF l u o r e s c e n c eS p e c t r o s c o p y

r e a s o n e da n dt h o r o u g h .M o r e o v e r ,m a n yo f t h ei m p o r t a n ts t u d i e so f t r y p t o p h a ne m i s s i o np r o p e r t i e st h a th a v e a p p e a r e do v e r t h ey e a r sa r ec i t e da n d d i s c u s s e d ,s o t h i sa r t i c l ep r o v i d e sa s o l i dr e s o u r c ef o re x p l a i n i n gf l u o r e s c e n c ed e c a yi n p r o t e i n s .

F l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ga n d p r o t e i ns t r u c t u r ea n d d y n a m i c s

T h e d y n a m i cq u e n c h i n go f f l u o r e s c e n c ee m i s s i o n o f t r y p -t o p h a ni np r o t e i n sa r i s e sf r o me x c i t e d - s t a t ee n c o u n t e r so f t h et r y p t o p h a nw i t h t h ef u n c t i o n a lg r o u p s o f t h ea m i n oa c i d si nt h es u r r o u n d i n gp r o t e i nm a t r i xo r f r o me n c o u n t e r sw i t h t h es o l v e n t .An a r t i c l eb y H a r r i sa n d H u d s o n( 1 9 9 0 )p r o v i d e sag o o d d i s c u s s i o no f t h eq u e n c h i n gp r o p e r t i e so f p a r t i c u l a ra m i n oa c i d s .T h i s e x c i t e d - s t a t ee n c o u n t e ri m p l i e st h a tt h et r y p t o p h a na n d / o ri t ss u r r o u n d i n g sm o v e d u r i n gt h el i f e t i m eo ft h ee x c i t e ds t a t ea n d t h u si np r i n c i p l e ,t r y p t o p h a nl i f e t i m ed a t ac a r r yi n f o r m a t i o na b o u t t h ed y n a m i cp r o p e r t i e so ft h ep r o t e i n .L a k o w i c za n d W e b e r( 1 9 7 3 )p u b l i s h e do n e o f t h ee a r l yd e m on s t r a t io n s o fp r o t e i nm o t i o n so n t h en a n o s e c o n dt i m e s c a l eb y o x y g e nq u e n c h i n go f i n t r i n s i ct r y p t o p h a nr e s i -d u e s i n a n u m b e ro fp r o t e i n s .R o s s e t a l .( 1 9 8 1 )u s e d s o l u t eq u e n c h i n gt o d e m o n s t r a t et h ea c c e s s i b i l i t yo f t h et w o t r y p -t o p h a nr e s i d u e si n l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ,a n d t h u sp r o v i d es o m es t r u c t u r a li n f o r m a t i o na b o u tt h ep r o t e i n .

I n t r i n s i ct r y p t o p h a ne m i s s i o n a n d p r o t e i n f o l d i n gT h e l i t e r a t u r ea b o u n d sw i t h f l u o r e s c e n c es t u d i e so f p r o t e i nd e n a t u r a t i o na n d r e n a t u r a t i o nb o t h k i n e t i ca n d e q u i l i b r i u m .I n a d d i t i o n ,t w o r ev ie w so f t h es u b j e c th a v e r e c e n t l ya p -p e a r e d( E f t i n k ,1 9 9 4 ;R o y e r, 1 9 9 4 ) .T h ef l u o r e s c e n c ep r o p -e r t i e so f i n t r i n s i ct r y p t o p h a nr e s i d u e si n p r o t e i n si n v a r i a b l yc h a n g e so n d e n a t u r a t i o no f t h ep r o t e i n .T h i s s a i d ,i t i s n o tu s u a l l y p o s s i b l et op r e d i c th o w t h ei n t e n s i t yo f f l u o r e s c e n c ew i l lc h a n g e .S o m ep r o t e i n se x h i b i tl a r g ei n c r e a s e si n t h e i ri n t e n s i t i e sa n d l i f e t i m e sa n d o t h e r s ,d e c r e a s e s ,o n u n f o l d i n go f t h ec h a i n .P r o t e i n sw i t h h e m ep r o s t h e t i cg r o u p s t y p i c a l l ye x h i b i ta n i n c r e a s ei n i n t e n s i t yo n u n f o l d i n gd u e t o l o s so ft h eh e m eg r o u p , w h i c hq u e n c h e st h et r y p t o p h a ne m i s s i o ni nt h en a t i v es t a t eb y F o r s t e re n e r g y t r a n s f e r .C o m p a r i s o n so fq u a n t u my i e l d sf o ra n u m b e ro f p r o t e i n si n t h e i rn a t i v ea n dd e n a t u r e ds t a t e s( K r o n m a na n d H o l m e s ,1 9 7 1 ;G r i n v a l da n dS t e i n b e r g ,1 9 7 6 )r e v e a l st h a tt h e s ev a r yw i d e l y .T h ea v e r a g e

e n e r g y o f t h ee m i s s i o no f t h et r y p t o p h a nr e s i d u e su s u a l l ys h i f t st o t h er e do n u n f o l d i n gb e c a u s et h es o l v e n te x p o s u r ea n d t h u ss o l v e n tr e l a x a t i o ni s a u g m e n t e di n t h eu n f o l d e ds t a t e .T h e m a g n i t u d eo f t h es h i f ti n e n e r g y d e p e n d so n t h ee x t e n t t ow h i c ht h ep r o t e i ni sb u r i e di nt h en a t i v es t a t e .I nt h eu n f o l d e d s t a t em o s t t r y p t o p h a nr e s i d u e si n p r o t e i n sh a v es p e c t r as i m i l a rt o t h a to f N - a c e t y lt r y p t o p h a n a m i d ei nw a t e r ,w i t h a m a x i m u m o f - 3 5 5 n m . B e c a u s et h em o t i o n so f t h et r y p t o p h a nr e s i d u e sa r es i g n i f i c a n t l yl e s sc o n s t r a i n e di n t h ed e n a t u r e ds t a t e so f p r o t e i n s ,o n e a l s oo b s e r v e sa l a r g ed e -c r e a s e i n t h ea n i s o t r o p yo f t h ef l u o r e s c e n c ee mi ss io n o nd e -n a t u r a t i o n .T h ee x t e n tt ow h i c ho ne c a ni n t e r p r e tt h ec h a n g e so b s e r v e di n t h e f l u o r e s c e n c ep a r a m e t e r so f a p a r t i c u l a rp r o -t e i no n u n f o l d i n gd e p e n d s o n t h eu n d e r s t a n d i n go n e h a s

a b o u tt h es t ru c tu r a l f a c t o r st h a tc o n t r i b u t et ot h ef l u o r e s c e nc h a r a c t e r i s t i c si n t h e n a t i v es t a t e .I n a d d i t i o n ,i t u s u a l l yp r o v e sd i f f i c u l tt od r a wd e t a i l e ds t r u c t u r a lc o n c l u s i o n sf r o mf l u o r e s c e n c eu n f o l d i n ge x pe r i me nt s o fp r o t e i n sc o n t a i n i nm u l t i p l et r y p t o p h a nr e s i d u e s .

A n i s o t r o p yo fe x t r i n s i cp r o b e s a n d

b i o m o l e c u l a rc o m p l e x a t i o nF l u o r e s c e n c ea n i s o t r o p yi s a n o t h e rf l u o r e s c e n c eo b s e r v a b l et h a tc a n b e v e r y u s e f u li nm o l e c u l a rb i o p h y s i c s .T h e a n i s o t -r o p y i s d e f i n e da s t h er a t i oo f t h e d i f f e r e n c eb e t w e e nt h ee m i s s i o n i n t e n s i t yp a r a l l e lt o t h ep o l a r i z a t i o no f t h ee l e c t r i cv e c t o r o f t h ee x c i t i n gl i g h t I Ia n d t h a tp e r p e n d i c u l a rt o t h a tv e c t o r ( I L )d i v i d e db y t h et o t a li n t e n s i t y I T .

A = 4 I- I 4 + 2 I k )B e c a u s et h ea n i s o t r o p yo fe m i s s i o n( A )i s r e l a t e dt o t h ec o r r e -l a t i o nt i m eo f t h ef l u o r o p h o r e( x ct h r o u g ht h eP e r r i ne q u a t i o

A O / A 1 = T / Tcw h e r eA Oi s t h el i m i t i n ga n i s o t r o p yo f t h ep r o b e ,w h i c hd e p e n do n t h ea n g l eb e t w e e nt h ea b s o r p t i o na n d e m i s s i o nt r a n s i t i o nd i -p o l e s ,a n dT i st h ef l u o r e s c e n c el i f e t i m e ,t h e s em e a s u r e m e n t sc a nb e u s e dt o o b t a i nh y d r o d y n a m i ci n f o r m a t i o nc o n c e r n i n gm a c -r o m o l e c u l e sa n d m a c r o m o l e c u l a rc o m p l e x e s .B e c a u s et h et r y p -t o p h a nr e s i d u e si n t r i n s i ct op r o t e i n sa n dc o v a l e n t l ya t t a c h e dd y em o l e c u l e sn e a r l ya l w a y se x h i b i tl o ca l r o t a t i o na lm o t i o ni n a d -d i t i o nt od e p o l a r i z a t i o nt h r o u g hg l o b a lB r o w n i a nt u m b l i n go ft h em a c r o m o l e c u l e ,i t i sw i s et o m e a s u r et h et i m e - r e s o l v e da n i s o t -r o p y a sw e l la st h a to b s e r v e di nt h es t e a d y - s t a t em o d e .M o t i o n so fp r o b e so n m a c r o m o l e c u l e sa r eq u i t ec o m p l e xa n dh a v eb e e nt h e s u b j e c to f n u m e r o u sr e p o r t s .T h e r e a d e ri s r e f e r r e dt oL a k o w i c z( 1 9 8 5 ,1 9 9 3 a - c )f o ra m o r ec o m p l e t ed i s c u s s i o no ff l u o r o p h o r em o t i o na n d t h ea n a l y s i sa n d i n t e r p r e t a t i o no f f l u o -r e s c e n c ed e p o l a r i z a t i o ni nm a c r o m o l e c u l e s .

D e s p i t et h ep o t e n t i a lc o m p l i c a t i n gf a c t o r s ,i t i s n e a r l ya l -w a y so b s e r v e dt h a tc o m p l e x a t i o nb e t w e e nt w o m a c r o m o l -e c u l e so r b e t w e e na s m a l lf l u o r e s c e n tl i g a n da n d a m a c r o -m o l e c u l el e a d st oa n i n c r e a s ei nt h es t e a d y - s t a t ef l u o r e s c e na n i s o t r o p y .I f n o c h a n g e si n q u a n t u my i e l do c c u r o n c o m -p l e x a t i o no n e c a n d i r e c t l yf i tt h ea n i s o t r o p yd a t ai n t e r m s o ft h ee q u i l i b r i u mc o n s t a n t f o rt h ei n t e r a c t i o n .T h e l a b o r a t o ro f G r e g o r i oW e b e rh a sl o n ge m p l o y e ds t e a d y - s t a t ef l u o r e s -c e n c ea n i s o t r o p yt os t u d yt h ed i s s o c i a t i o no fp r o t e i ns u b u n i tb y d i l u t i o no r b y t h ea p p l i c a t i o no f h i g hh y d r o s t a t i cp r e s s u r eT h eb u l ko f t h i sw o r ki sr e f e r e n c e di n ar e c e n tr e v i e wb y S i l v aa n dW e b e r( 1 9 9 3 ) ,a s a r emany p a p e r s b y o t h e ri n v e s t i g a t owh o h a v eu s e d t h et e c h n i q u e .I nc a s e s w h e r et h ef l u o r o p h ol i f e t i m ec h a n g e s ,t h e n t h es t e a d y - s t a t ea n i s o t r o p ya n d t h ef r a c t i o n a li n t e n s i t yw e i g h t e da v e r a g el i f e t i m e sc a n b e u s e di n t h eP e n r i ne q u a t i o nt o c a l c u l a t et h ea v e r a g ec o r r e l a t i ot im e o ft h ef l u o r o p h o r e .D e s p i t et h ef a c t t h a tt h i sv a l u e r e p -r e s e n t sa n a v e ra ge o ft h ed e p o l a r i z a t i o nd u e t o l o c a la n dg l o b a lm o t i o n s ,i t i s n o n e t h e l e s su s e f u lf o rm o n i t o r i n gc o m -p l e x a t i o ne v e n t s ,i fn o t f o rc a l c u l a t i n gt h em o l e c u l a rw e i g h t so f t h e

s p e c i e si n v o l v e d .F o r

t h i sl a t t e r ,o n e m u s t

c a r r yo u tt i m e - r e s o l v e da n i s o t r o p ym e a s u r e m e n t s .A g o o de x a m p l eo f

R o y e r 1 1 9 3

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Vo l u m e6 8 M a r c h1 9 9 5

t h i st y p e o f e x p e r i m e n ti n t h et i m e - r e s o l v e dm o d ei s t h a to fN e y r o ze t a l .( 1 9 8 7 ) .T h e s ea u t h o r ss t u d i e dt h et e m p e r a t u r ed e p e n d e n c eo f t h em o n o m e r - d i m e re q u i l i b r i u mo f e n z y m eIo f t h es u g a r t r a n s p o r ts y s t e m a n d d e m o n s t r a t e dt h eg e n e r a lr u l et h a tc o r r e l a t i o nt i m e s t h a ta r e> 1 0 - f o l dt h ef l u o r o p h o r el i f e t i m ec a n n o tb e r e c o v e r e df r o ma n i s o t r o p yd a t aw i t h a n yr e a s o n a b l ea c c u r a c y .O t h e r c o m p l i c a t i n gf a c t o r si n c l u d ec o n s i d e r a t i o n so f t h ei r r e g u l a rs h a p eo f m a c r o m o l e c u l e sa n dm a c r o m o l e c u l a rc o m p l e x e s ,a l t h o u g hr e a s o n a b l yg o o d a p -p r o x i m a t i o n sc a n u s u a l l yb e m ad e .H e y d u ka n d L e e ( 1 9 9 0 )f i r s tu s e d f l u o r e s c e n t l yl a b e l e dDNA f o rp r o t e i nb i n d i n gt i -t r a t i o n so b s e r v i n gt h ei n c r e a s ei n a n i s o t r o p yo f t h ef l u o r o -p h o r e a s t h ep r o t e i nb i n d st o DNA. T h e s e n s i t i v i t yo f t h i sa p p r o a c hh a s r e c e n t l yb e e ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e ds u c h t h a ti t i s n o w q u i t ea p p l i c a b l et o t h es t u d yo f v e r y h i g h - a f f i n i t yp r o t e i n - n u c l e i ca c i di n t e r a c t i o n s( L e T i l l ya n d R o y e r , 1 9 9 3 ) .

F l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r a n dp r o t e i n u n f o l d i n go r c o m p l e x a t i o n

R e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e ri s a v e r y p o w e r f u lm e t h o df o ro b t a i n i n gb o t h s t r u c t u r a la n d d y n a m i ci n f o r m a t i o na b o u tm a c r o m o l e c u l e sa n d m a c r o m o l e c u l a rc o m p l e x e s .I t i sb a s e do n t h et h r o u g h - s p a c ed i p o l a rt r a n s f e ro f e x c i t e d - s t a t ee n e r g yt o a c c e p t o rm o l e c u l e su p t o 7 5 A r e m o v e df r o mt h ed o n o rf l u o r o p h o r e .T h e e f f i c i e n c yo f t r a n s f e ri s r e l a t e dt o t h ei n -v e r s e o f t h es i x t hp o w e ro f t h ed i s t a n c eb e t w e e nt h ed o n o ra n d a c c e p t o rm o l e c u l e s .O t h e rf a c t o r ss u c h a st h eo v e r l a po ft h ee m i s s i o no f t h ed o n o rw i t h t h ea b s o r p t i o no f t h ea c c e p t o ra n d t h er e l a t i v eo r i e n t a t i o n so f t h et w o c h r o m o p h o r e sa l s oa f f e c tt h ee n e r g y t r a n s f e r .T h u sd i s t a nc e s , d i s t a n c ed i s t r i b u -t i o n s ,a n d e v e n d y n a m i cd i s t a n c ed i s t r i b u t i o n sc a n b e o b -t a i n e du s i n gt h i s a p p r o a c h .L a k o w i c z( 1 9 8 3 )a n d E f t i n k( 1 9 9 0 )p r o v i d eg o o d i n t r o d u c t i o n st o t h ep h e n o m e n o no fe n e r g y t r a n s f e r .A m o r ed e t a i l e dt r e a t m e n tc a n b e f o u n d i nt h ec h a p t e rb y C h e u n gi n Vo l .2 o f t h eL a k o w i c zs e r i e s( C h e u n g ,1 9 9 1 ) .O n e c a n f i n di n t h el i t e r a t u r emany e x -a m p l e so f t h eu s e o f e n e r g yt r a n s f e ri nb i o p h y s i c s .I m p o r t a n ts t r u c t u r a li n f o r m a t i o no n t h eh a m m e r h e a dr y b o z y m ew a sr e c e n t l yp r e s e n t e di n a n e n e r g y t r a n s f e rs t u d yb y T u s c ha n dc o - w o r k e r s( 1 9 9 4 ) .T h e w o r ki n t h el a b o r a t o r i e so f A m i ra n d H a a s ( 1 9 8 8 )a n d B r a n da n d c o - w o r k e r s( J a m e se t a l . ,1 9 9 2 )p r o v i d ee x c e l l e n te x a m p l e so f t h ee l e g a n tu s e o f f l u o -r e s c e n c ee n e r g yt r a n s f e rt os t u d yp r o t e i nf o l d i n gp h e n o m e n a .

I d e a l l y ,t h ei n s t r u c t o rc a n t a i l o rt h eb i o p h y s i c a le x a m p l e st o f i t i n w i t h p a r t i c u l a ra r e a so f c o n c e n t r a t i o no f t h eb i o -p h y s i c sp r o g r a mi n h i so r h e ri n s t i t u t i o no rd e p a r t m e n t .F o re x a m p l e , n o n e o f t h es t u d i e sd i s c u s s e da b o v ed e a l sw i t hm e m b r a n e s ,m e m b r a n ep r o t e i n s ,o r r e c e p t o r - l i g a n di n t e r a c -t i o n s .T h en u m b e ro f e x a m p l e si s s o l a r g et h e r ei sn o a t t e m p th e r et o g i v ea c o m p l e t eo v e r v i e w .T h e g e n e r a lr e v i e w sa n db o o k sl i s t e di n t h er e f e r e n c es e c t i o ns h o u l d g i v et h er e a d e ra m u c hb r o a d e rr a n g e f r o mw h i c ht o c h o o s e .

L AB O R ATORYEXPERIMENTSAN D I N - C L A S SDEMONSTRATIONS

O n e p a r t i c u l a r l ya d v a n t a g e o u sp r o p e r t yo f f l u o r e s c e n c ei st h a t ,b e c a u s e i t i n v o l v e st h ee m i s s i o n o f p h o t o n s ,o n e c a n

a c t u a l l ys e e i t .T h i s m a y a p p e a rt ob e s t a t i n gt h eo b v i o u s ,b u tf r o ma p e d a g o g i c a lp o i n to f v i e w ,v i s u a l i z a t i o no f a p h y s i c a lp h e n o m e n o nc a n b e r e a s s u r i n gt o s t u d e n t s .I t i s n o t d i f f i c u l tt o d e v i s el a b o r a t o r ye x p e r i m e n t sf o rs u c h a n i n t r o d u c t oc l a s s ,a n d s t e a d y - s t a t ef l u o r o m e t e r sa r en o t i n c r e d i b l ye x -p e n s i v e .H o w e v e r ,j u s t i f i c a t i o no f s p e n d i n g 3 0 , 0 0 0 o nt e a c h i n ge q u i p m e n tu s u a l l yd e p e n d so n t h en u m b e ro f s t u -d e n t st a k i n gt h ec o u r s e .W h e r e v e rp o s s i b l e ,i n c l u s i o no fl a b o r a t o r ys e c t i o n si n a d d i t i o nt o i n c l a s sd e m o n s t r a t i o n si sh i g h l ya d v i s a b l e .Some e x a m p l e so f e x p e r i m e n t si n c l u d et h eu n f o l d i n go f a p r o t e i nw i t hG u H C lm o n i t o r i n gt h et r y p t o p h ae m i s s i o n s p e c t r u m ,w h i c hc h a n g e si n i n t e n s i t ya n d a v e r a g ee m i s s i o n e n e r g y a s t h e t r y p t o p h a nr e s i d u e ( s )b e c o m ee x -p o s e d t o s o l v e n t ;t i t r a t i o no f b o v i n es e r u ma l b u m i nw i t h t h eh y d r o p h o b i cp r o b e ,a n i l i n o - n a p h t h a l e n es u l f o n a t e( A N S ) ,i n c r e a s i n gt h eq u a n t u my i e l do f AN S e n o r m o u s l yo n b i n d -i n g ;a n d t i t r a t i o no f a f l u o r e s c e n t l yl a b e l e dDNA d o u b l es t r a n dw i t h a p r o t e i nt h a tr e c o g n i z e sa s p e c i f i cs e q u e n c eo nt h a tDNA c a u s i n g t h ea n i s o t r o p yo f f l u o r e s c e n c eo f t h el a b e lo n t h eDNA t o i n c r e a s ea s t h ep r o t e i n b i n d s .

I f l a b o r a t o r ys e s s i o n sa r en o t p r a c t i c a l , i n -c l a s sd e m o n -s t r a t i o n sc a n b e q u i t eu s e f u la n d e v e n i n s p i r i n gt o t h es t u -d e n t s .S o l v e n t r e l a x a t i o np h e n o m e n aa n d t h e i r e f f e c to n t h ee n e r g y( c o l o r )o f t h ee m i s s i o ns p e c t r u mp ro v id e a ne x c e l l e n te x a m p l e f o r i n - c l a s sd e m o n s t r a t i o n s .6 - P r o p i o n y l - 2 -m e t h y l a m i n o ) n a p h t h a l e n e PRODAN e x h i b i t sa v e r y l a r g ee x c i t e d - s t a t ed i p o l et h a tr e n d e r st h ee m i s s i o ns p e c t r u mq u i t es e n s i t i v et o t h er e l a x a t i o no f t h es o l v e n t( W e b e ra n d F a r r i s ,1 9 7 9 ) .A l t h o u g ht h em a x i m u m i n c y c l o h e x a n ei s -400 n mi t s h i f t s t o-540 n m i nw a t e r .T h ep r o b ec a n b e d i s s o l v e di nt h e s es o l v e n t si n g l a s st e s tt u b e s .T h e n a s m a l lu l t r a v i o l e th a n d l a m p c a n b e u s e d f o r e x ci t a t i o n .O n e o b s e r v e s t h e

p u r p l ef l u o r e s c e n c ef r o m t h er e de d g e o f t h es p e c t r u mi nc y c l o h e x a n e .As o n e m o v e st od i m e t h y l f o r m a m i d e ,g l y c e r o l ,e t h a n o l ,a n d t h e nw a t e r , t hec o l o ro f t h ee m i s s i o n c h a n g e sf r o mp u r p l et oy e l l o wb e c a u s eo ft h eg r e a t e re f f e c to f r e l a x a t i o nf o rs o l v e n t so f h i g hp o l a r i t y.T o b r i n gh o m et h ep o i n tt h a tt h e s es h i f t sa r ed u e t om o l e c u l a rm o t i o n ,i . e . ,r e o r i e n t a t i o no f t h es o l -v e n tm o l e c u l e sa r o u n dt h ee x c i t e d - s t a t ed i p o l e ,a t u b ec o n t a i n i nP R O D A Nd i s s o l v e di ng l y c e r o l ,w h i c hf l u o r e s c e sg r e e na tr o o mt e m p e r a t u r e ,i s p l u n g e di n t oa b a t ho fd r yi c e / e t h a n o lt o r e d u c et h et e m p e r a t u r et o n e a r- 6 0 C .A f t e ra t i m e ,t h ee m i s s i o nh a ss h i f t e df r o mg r e e nt op u r p l eb e c a u s eo f t h es l o w e rr e o r i e n t a t i oo ft h es o l v e n td i p o l e sa ts u c hh i g hv i s c o s i t y.On h e a t i n gt h et u b eb y h o l d i n gi t i no n e s

h a n d ,t h e

e m i s s i o ne v e n t u a l l ys h i f t sb a c kt og r e e na n dt h et e m p e r a t u r eg r a d i e n ti nt h et u b ec a nb e o b s e r v e da t i n t e r m e d i a t et i m e s .

THOUGHTSO N C O N T E N TFO R AN A D VA N C E DGRADUATECOURSEO N FLUORESCENCE

O f c o u r s e ,i f o n e h a s t h el u x u r yo f d e v o t i n ga n e n t i r es e -m e s t e r ( 2 0 t o 3 0 l e c t u r e s )t o f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ya n di t s b i o p h y s i c a la p p l i c a t i o n s ,t h e n e a c h o f t h et o p i c sm e n -t i o n e da b o v ec a n b e e x p l o r e di n m u c h g r e a t e rd e p t h .Onem a y w a n t t o b e g i n w i t h l e c t u r e so n t h ep h y s i c a lc h a r a c t e r -

i s t i c so f l i g h t .T h i s c a n b e f o l l o w e db y i n - d e p t hd i s c u s s i o no f e l e c t r o n i ca b s o r p t i o nt r a n s i t i o n si n c o n j u g a t e da n d

1 1 9 4 B i o p h y s i c a lJ o u r n a l

8/13/2019 biophysj00064-0469

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R o y e r T e a c h i n gF l u o r e s c e n c eS p e c t r o s c o p y 1 1 9 5

a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ,t h ee f f e c t so f s u b s t i t u e n t sa n d s o l -v e n t s ,a n d t h ep o l a r i z a t i o no f t h et r a n s i t i o n s .T h e s ea r ew e l le x p l a i n e di n t h ew o r k so f P l a t t( 1 9 4 9 ) ,B a y l i s s( 1 9 5 2 ) ,a n dS u z u k i( 1 9 6 7 ) ,i nw h i c ht h ea u t h o r sd e s c r i b et h ef r e ee l e c t r o na p p r o x i m a t i o nf o rb e n z e n e , n a p h t h a l e n e ,a n d a n t h r a c e n e ,a n d t h ea s s i g n m e n t sa n d p o l a r i z a t i o n so f t h e e l e c t r o n i ct r a n -s i t i o n s .T h e c o n t e n to f t h e c o u r s e d e a l i n gw i t h e m i s s i o nw a v e l e n g t hp r o p e r t i e sc o u l d i n c l u d em u c hg r e a t e rd e t a i lt h a np r e s e n t e dh e r e ,s u c h a s t h e L i p p e r t e q u a t i o n sa n d t i m e -r e s o l v e ds p e c t r af o rs o l v e n tr e l a x a t i o np h e n o m e n a( We b e ra n d F a r r i s ,1 9 7 9 ;B i s m u t oe t a l . ,1 9 8 7 ) ,d e r i v a t i o no f t h ee x p r e s s i o n sf o ra n i s o t ro p y d e c a y ,a n d e x c i t e d - s t a t er e a c t i o n sf r o mt h ed i f f e r e n t i a le q u a t i o n so f t h ec h a n g ei nt h ep o l a r i z e di n t e n s i t yc o m p o n e n t sw i t ht i m e ( s e et h ec h a p t e rb y R . S t e i n e ri n Vo l .2 o f t h eL a k o w i c zs e r i e s( S t e i n e r ,1 9 9 1 ) .O n ec a nc o v e r t h eu s e o f r o t a t i o nm a t r i c e sa n d t h eL e g e n d r ep o l y -n o m i a l st o d e r i v et h ee x p r e s s i o nf o ra n i s o t r o p ya n d a n i s o t -r o p y d e c a y .A g o o dd i s c u s s i o no f t h i st o p i cc a n b e f o u ndi na p p l i c a t i o nn o t e s 5 a n d 1 6 o f Z a r e ( 1 9 8 8 ) .O n e c a n a l s oi n c l u d et h ed e r i v a t i o no f t h er e l a t i o n s h i p so f f r e q u e n c yd o -m a i na n d t i m e- d o ma i nf l u o r o m e t r y ,a n d a d i s c u s s i o no f t h ei n f o r m a t i o nc o n t e n ti n f l u o r e s c e n c ed e c a y ( s e eL a k o w i c z ,1 9 9 1 a ) .A n a l y s i sa p p r o a c h e st oh e t e r o g e n e o u sd e c a y ,a n i s o -t r o p i cr o t a t i o n s ,t i m e - r e s o l v e ds o l v e n tr e l a x a t i o np h e n o m -e n a ,a n d e x c i t e d - s t a t er e a c t i o n sc a n a l s ob e d i s c u s s e d .T h ec o m p a r t m e n t a la n a l y s i sa p p r o a c hf o r c o m p l e xs y s t e m su s i n g a n u m e r i c a le i g e n v e c t o r - e i g e n v a l u es o l v e ri s p r e -s e n t e d b y B e e c h e ma n d c o - w o r k e r si n t h es e c o n dv o l u m eo f t h eL a k o w i c zs e r i e s( B e e c h e me t a l . ,1 9 9 1 ) .A l s o o f u s et o t h es t u d e n t si s a p r e s e n t a t i o no f l a s e r sa n d s y n c h r o t r o nr a d i a t i o na s e x c i t a t i o ns o u r c e s ,a n d u l t r a f a s ta n d p a r a l l e ld e t e c t o r s .T h e s e a r ed i s c u s s e d i n c h a p t e r s 1 a n d 2 o f t h e

f i r s tv o l u m eo f t h es e r i e s( L a k o w i c z ,1 9 9 1 a ) .F i n a l l y ,i ns u c h a c l a s s ,m a n y l e c t u r e so r s t u d e n tp r e s e n t a t i o n sc o u l db e d e v o t e dt ou s e s o f f l u o r e s c e n c ei n t h er e c e n t o r c u r r e n tl i t e r a t u r e .

G E N E R A LR E F E R E N C E SB e e c h e m ,J . M . , a n d L . B r a n d . 1 9 8 5 .Ti m e - r e s o l v e df l u o r e s c e n c eo fp r o -

t e i n s .A n n u .R e v. B i o c h e m .5 4 : 4 3 - 7 1 .E f t i n k ,M . 1 9 9 0 .F l u o r e s c e n c eTe c h n i q u e sf o rS t u d y i n gP r o t e i nS t r u c t u r e .

I n P r o t e i nS t r u c t u r eD e t e r m i n a t i o n :M e t h o d so f B i oc h em i ca lA n a l y s i s ,Vo l .3 5 .C la r en ce H .S u e l t e r ,e d i t o r .J o h n W i l e ya n d S o n s I n c . ,N e wYo r k .

L a k o w i c z ,J . R . 1 9 8 3 . P r i n c i p l e so f F l u o r e s c e n c eS p e c t r o s c o p y ,P l e n u mP r e s s ,N e w Yo r k .

T h e f o l l o w i n ga r ec i t e di n t h et e x ta s L a k o w i c z1 9 9 1 a - c ) :To p i c s i n F l u o r e s c e n c eS p e c t r o s c o p yV o l 1 . Te c h n i q u e s ,J . R . L a k o w i c z ,

e d . ,P l e n u mP r e s s ,N e w Yo r k .To p i c s i nF l u o r e s c e n c eS p e c t r o s c o p yV o l2 .P r i n c i p l e s ,J . R .L a k o w i c z ,e d . ,

P l e n u mP r e s s ,N e w Yo r k .To p i c s i n F l u o r e s c e n c eS p e c t r o s c o p yV o l 3 . A p p l i c a t i o n s ,J . R .L a k o w i c z ,

e d . ,P l e n u mP r e s s ,N e w Yo r k .

S P E C I F I CR E F E R E N C E S

A m i r , D . a n d E . H a a s . 1 9 8 8 .R e d u c e db o v i n ep a n c r e a t i ct r y p s i ni n h i b i t o rh a s a c o m p a c ts t r u c t u r e ,B i o c h e m i s t r y .2 7 : 8 8 8 9 - 8 8 9 3 .

B a y l i s s ,N . S . 1 9 5 2 .T h e f r e e - e l e c t r o na p p r o x i m a t i o nf o rc o n j u g a t e dc o m -p o u n d s . Q .R e v .6 : 3 1 9 - 3 3 9 .

B e e c h e m ,J . M . , E . G r a t t a n ,M . A m e l o o t ,J . R . K n u t s e n ,a n d L . B r a n d .1 9 9 1 . T h e g l o b a la n a l y s i so f f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t ya n d a n i s o t r o p yd e c a y d a t a :s e c o n d - g e n e r a t i o nt h e o r ya n d p r o g r a m s . In To p i c s i nF l u o r e sc e n c e S p e c t r o sc o p y,Vo l . 2 . P r i n c i p l e s .J . R . L a k o w i c z ,e d . ,P l e n u mP r e s s ,N e w Yo r k .

B i s m u t o ,E . ,D . M . J a m e s o n ,a n d E . G r a t t o n .1 9 8 7 .D i p o l a rr e l a x a t i o ni ng l y c e r o l :a d y n a m i cf l u o r e s c e n c es t u d yo f 4 - 2 - ( d i m e t h y l a m i nn a p h t h o y l c y l c o h e x a n e c a r b o x y l i ca c i d( D A N C A ) .J .A m .C h e m .S o c .1 0 9 :2 3 5 4 - 2 3 5 7 .

C h e u n g ,H . C .1 9 9 1R e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r .I nTo p i c si n F l u o r e s c e n c eS p e c t r o s c o p y , Vo l .2 . P r i n c i p l e s .J . R . L a k o w i c z ,e d .P l e n u mP r e s s ,Ne wYo r k .

E f t i n k ,M. 1 9 9 4 .T h e u s e o f f l u o r e s c e n c em e t h o d st o m o n i t o ru n f o l d i n gt r a n s i t i o n si n p r o t e i n s .B i o p h y s .J . 6 6 : 4 8 2 - 5 0 1 .

G r i n v a l d ,A . a ndI .Z .S t e i n b e r g .1 9 7 6 .T h ef l u o r e s c e n c ed e c a yo f t r y p t o p h ar e s i d u e si n n a t i v ea n d d e n a t u r e dp r o t e i n s .B i o c h i m .B i o p h y s .A c t a .4 2 7 :6 6 3 - 6 7 8 .

H a r r i s ,D . L . ,a n d B .S .H u d s o n .1 9 9 0 .Tr y p t o p h a np h o t o p h y s i c si nT4 p h a g el y s o z y m e .B i o c h e m i s t r y .2 9 : 5 2 7 6 - 5 2 8 5 .

H e y d u k ,T . ,a n dJ .C .L e e .1 9 9 0 .A p p l i c a t i o no f f l u o r e s c e n c ee n e r g yt r a n s f e ra n d p o l a r i z a t i o nt o m o n i t o rE s c h e r i c h i ac o l ic A M P r e c e p t o rp r o t e i nl a cp r o m o t e ri n t e r a c t i o n .P r o c .N a t l .A c a d . S c i .U S A .8 7 : 1 7 4 4 - 1 7 4 8 .

J a m e s ,E . ,P .W u ,a n d L .B r a n d .1 9 9 2 .C o m p a c td e n a t u r e ds t a t eo f a s t a p h y -l o c o c ca l n u c l e a s em u t a n t b y g u a n i d i n i u ma s d e t e r m i n e db y r e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r .B i o c h e m i s t r y .3 1 : 1 0 2 1 7 - 1 0 2 2 5 .

J a m e s o n ,D . M . , E . G r a t t o n ,a n d R . D . H a l l .1 9 8 4 .T h e m e a s u r e m e n ta n da n a l y s i so f h e t e r o g e n e o u se m i s s i o n sb y m u l t i f r e q u e n c yp h a s ea n d m o d u -l a t i o nf l u o r o m e t r y .A p p l .S p e c t r o s c .R e v .2 0 : 5 5 - 1 0 6 .

K i m ,S . - J . ,F . N . C h o w d u r y ,W. S t r y j e w s k i ,E .S .Yo u n a t h a n ,P . S .R u s s o ,a n d M . D . B a r k l e y .1 9 9 3 .Ti m e - r e s o l v e df l u o r e s c e n c e o ft h es i n g l et r y p -t o p h a nr e s i d u eo f B a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s p h o s p h o f r u c tB i o -p h y s .J . 6 5 : 2 1 5 - 2 2 6 .

K r o n m a n ,M . J . , a n d L . G . H o l m e s . 1 9 7 1 . T h e f l u o r e s c e n c eo f n a t i v e ,d e n a t u r e d a n d r e d u c e d - d e n a t u r e dp r o t e i n s .P h o t o c h e m .P h o t o b i o l .1 4 : 1 1 3 - 1 3 4 .

L a k o w i c z ,J . R . ,a n dG . We b e r .1 9 7 3 .Q u e n c h i n go ff l u o r e s c e n c eb y o x y g e n .A p r o b ef o rs t r u c t u r a lf l u c t u a t i o n si nm a c r o m o l e c u l e s .B i o c h e m i s t r y1 2 :4 1 7 1 - 4 1 7 9 .

L e T i l l y ,V . ,a n d C .A . R o y e r . 1 9 9 3 .F l u o r e s c e n c eA n i s o t r o p yA s s a y s I m -p l i c at e P r o t e in - P r o t e i n I n t er a c t i o n si n R e g u l a t i n gt r p R e p r e s s o r DNAB i n d i n g ,B i o c h e m i s t r y3 2 : 7 7 5 3 - 7 7 5 8 .

N e y r o z ,P ,L .B r a n d ,a n d S .R o s e m a n .1 9 8 7 .S u g a rt r a n s p o r tb y t h eb a c t e r i a lp h o s p h o t r a n s f e r a s es y s t e m : t h e i n t ri n s icf l u o r e s c e n c eo f e n z y m eI .J . B i o l .C h e m .2 6 2 :1 5 9 0 0 - 1 5 9 0 7 .

P l a t t ,J . R . 1 9 4 9 .T h e C l a s s i f i c a t i o no f c a t a - c o n d e n s e dh y d r o c a r b o nJ . C h e m .P h y s .1 7 : 4 8 4 - 4 9 5 .

R o s s ,J . B . A . ,S c h m i d t ,C .J . a n d B r a n d ,L . 1 9 8 1 .Ti m e - r e s o l v e dF l u o r e s -c e n c e o f t h eT w o T r y p t o p h a n si n H o r s eL i v e rA l c o h o lD e h y d r o g e n a s e ,B i o c h e m i s t r y2 0 : 4 3 6 9 - 4 3 7 7 .

R o y e r ,C .A . 1 9 9 5 .F l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y .I nP r o t e i nF o l d i n ga n d S t a -b i l i t y :M e t h o d si nM o l e c u l a rB i o l o g y .B . S h i r l e y ,e d i t o r .Humana P r e s s ,To t o w a ,N e w J e r s e y .I n p r e s s .

S i l v a ,J . L . ,a n d G . W e b e r .1 9 9 3 .P r e s s u r es t a b i l i t yo f p r o t e i n s .A n n u .R e v.

P h y s .C h e m .4 4 : 8 9 - 1 1 3 .S t e i n e r ,R .F . 1 9 9 1 .F l u o r e s c e n c ea n i s o t r o py : t h e o rya n d a p p l i c a t i o n s .I n

T o p i c si nF l u o r e s c e n c eS p e c t r o s c o p y .Vo l .2 . P r i n c i p l e s .J . R .L a k o w i c z ,e d .P l e n u mP r e s s ,N e w Yo r k .

S u z u k i ,H . 1 9 6 7 . E l e c t r o n i cA b s o r p t i o n S p e c t r a a n d G e o m e t r yo fO r g a n i cM o l e c u l e s : An A p p l i c a t o n o f M o l e c u l a rO r b i t a lT h e o r y,A c a d e m i cP r e s s ,N e w Yo r k .

Tu s c h , T . ,C .G o h l k e ,T . M . J o v i n ,E . W es th of , a n dF . E c k s t e i n .1 9 9 4 .At h r e e - d i m e n s i o n a lm o d e lf o rt h eh a m m e r h e a dr y b o z y m eb a s e d o n f l u o -r e s c e n c e m e a s u r e m e n t s .S c i e n c e 2 6 6 :7 8 5 - 7 8 9 .

We b e r ,G . ,a n d F . F a r r i s .1 9 7 9 .S y n t h e s i sa n d f l u o r es c e n t p r o pe r t i e so f ah y d r o p h o b i cf l u o r e s c e n tp r o b e :6 - p r o p i o n y l - ( d i m e t h y l a m i nl e n e .B i o c h e m i s t r y .1 8 : 3 0 7 5 - 3 0 7 8 .

Z a r e ,R .N . 1 9 8 8 .I nA n g u l a rM o m e n t u m .J o h nW i l e ya n d S o n s ,N e w Yo r k .