www.ainia.es 1#ainiainnovacion

Bioproducción de compuestos fertilizantes y fitosanitarios

innovadores

www.ainia.es 2#ainiainnovacion

Empleo de técnicas biotecnológicas como herramienta para obtener principios activos de aplicación agrícola 04

Nuevas tendencias y aplicaciones:

compuestos fertilizantes y fitosanitarios innovadores 09

Bioprodcción como herramienta

para la obtención de compuestos fertilizantes

Y fitosanitarios innovadores 15

RETOS A SOLVENTAR - Puntos clave a la hora de asegurar el éxito de un producto basado en microorganismos 21

www.ainia.es 3#ainiainnovacion

Empleo de técnicas biotecnológicas comoherramienta para obtener principios activos deaplicación agrícola

www.ainia.es 4#ainiainnovacion

Existe una demanda creciente por parte del consumidor de productos saludables y libres de químicos.

Los principios activos de base biológica con aplicaciones en agricultura

permiten sustituir a los actuales fitosanitarios químicos.

Son productos basados en microorganismos que se encuentran en el el propio ecosistema de la planta.

Este tipo de tratamiento no deja residuos en los cultivos. Este punto es de especial importancia en tratamientos post-cosecha.

>Introducción

www.ainia.es 5#ainiainnovacion

La biotecnología industrial o “White Biotechnology” integra unconjunto de técnicas que emplean enzimas y microorganismos paraobtener productos en los sectores químico, agrícola, alimentaciónhumana, alimentación animal y cosmética.

Desde el Departamento de Bioensayos de AINIA, la I+D+i que serealiza en el área de White Biotechnology se centra en el desarrolloy optimización de esos procesos, mediante el adecuado empleo demétodos fisiológicos y tecnológicos y siempre orientando losprocesos desde el inicio a buscar la mayor viabilidad industrial.

Bioproducción: Producción de Microorganismos con distintasfuncionalidades, starters industriales y probióticos.

Biosíntesis: Síntesis de compuestos de alto valor añadido apartir de microorganismos seleccionados.

Biocatálisis: Transformaciones biológicas de productosmediante el empleo Enzimas y de Microorganismosseleccionados.

> Biotecnología Industrial – White Biotechnology

www.ainia.es 6#ainiainnovacion

> Biotecnología Industrial – White Biotechnology

BIOPRODUCCIÓN BIOSINTESIS BIOCATÁLISIS

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

L01-1

L01-2

L01-3

L02-1

L02-2

L02-3

L04-1

L04-2

L04-3

L06-1

L06-2

L06-3

L08-2

L08-3

L10-1

L10-2

L10-3

starters

Microorg. bioestimulantes

Pigmentos Producción de enzimas

Hidrólisis enzimáticas

Bioplásticos

PUFAs

www.ainia.es 7#ainiainnovacion

>Principios activos para aplicación agrícola

Microorganismos antagonistas

Bionutrientes

Bioestimulantes

Inductores de Defensas

Bioinsecticidas

Bacteriófagos

www.ainia.es 8#ainiainnovacion

Microorganismos antagonistas

Bionutrientes

Bioestimulantes

Inductores de Defensas

Bioinsecticidas

Bacteriófagos

Bio

pro

du

cció

n

Bio

sín

tesis

Bio

catá

lisis

>Principios activos para aplicación agrícola obtenidos mediante Bioprocesos

www.ainia.es 9#ainiainnovacion

Nuevas tendencias y aplicaciones: compuestosfertilizantes y fitosanitarios innovadores

www.ainia.es 10#ainiainnovacion

>Situación actual

Actualmente existen en el mercado una gran variedad de productos que yacontienen entre sus ingredientes algún microorganismo o algún derivado.

Bacterias: Bacillus thuringiensis

Bacterias: Bacillus subtilis

Bacterias: Pseudomonas fluorescens

Hongos: Especies del género Trichoderma

Hongos: Especies del género Ampelomyces

Hongos: Beauveria bassiana

Microalgas: Spirulina platensis

Microalgas: Especies del género Chlorella

Macroalgas: Extractos de Algas

Metabolitos: Fitohormonas

Metabolitos: Aminoácidos libres

www.ainia.es 11#ainiainnovacion

>Técnicas preventivas: Inductores de defensas

Los inductores de defensas son sustancias que activan la sistemainmune de la planta. Estos compuestos, tambien llamados PAMP’s(Pathogen-Associated Molecular Patterns) y suelen ser compuestospresentes en las paredes celulares de los microorganismospatógenos, que, una vez son detectados por los receptores en laplanta inducen una amplia variedad de respuestas en los cultivos.

Estos compuestos son de aplicación precosecha en plantas y cultivocomo postcosecha en frutas y verduras.

Algunos ejemplos de principios activos con aplicaciones enagricultura:

Metabolitos: Elicitores Bacterianos (Polisacáridos, Polipéptidos, flagelina)

Metabolitos: Elicitroes Fungicos (Quitina, Quitosano, Polioligoglucanos.

www.ainia.es 12#ainiainnovacion

> Nuevos Retos: Enfermedades sin control químico efectivo

Huanglongbing - Greening de los cítricos

Candidatus Liberibacter spp

Marchitez bacteriana en tomate

Ralstonia solanacearum

Síndrome del decaimiento rápido en Olivo

Xylella fastidiosa

Fuego bacteriano en frutales

Erwinia amylovora

Fuente: EPPO Fuente: Junta de Andalucía

Fuente: EPPO Fuente: Junta de Andalucía

www.ainia.es 13#ainiainnovacion

Los Bacteriófagos son virus capaces de infectar de forma específica adeterminadas bacterias y causar su inactivación.

Se encuentran naturalmente en el medio ambiente, coexistiendo junto conlos microorganismos a los que fagocitan, por lo que esta estrategia seconsidera natural y presenta numerosas ventajas, al afectar únicamente alos microorganismos diana y no provocar resistencias como en el caso de losantibióticos. El uso de bacteriófagos es totalmente inocuo y ya goza conclasificación GRASS para usos alimentarios.

Otros microorganismos patógenos: Pseudomonas syringae en kiwi

Xanthomonas fuscan en cítricos

>Uso de Bacteriófagos para control de enfermedades bacterianas sin tratamiento químico efectivo

www.ainia.es 14#ainiainnovacion

Sea cual sea el sector de aplicación final, cuando se plantea emplearbacteriofagos como control bacteriano, siempre se buscará seleccionar unbacteriófago con capacidad lítica, es decir aquellos que, por su naturalezamás virulenta, provocan la lisis de la bacteria huésped en su proceso demultiplicación.

>Uso de Bacteriófagos para control de enfermedades bacterianas sin tratamiento químico efectivo

Fuente: Nature Reviews

www.ainia.es 15#ainiainnovacion

Bioprodcción como herramienta para la obtenciónde compuestos fertilizantes y fitosanitariosinnovadores

www.ainia.es 16#ainiainnovacion

>Esquema general

ESTABILIZACIÓN DEL PRINCIPIO ACTIVO

ADECUACIÓN DE MATERIAS PRIMAS, SELECCIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO DE BAJO COSTE

FORMULACIÓN DEL PRODUCTO Y ENSAYOS DE VALIDACIÓN DEL PRODUCTO

ENSAYOS DE APTITUD DE INÓCULO A ESCALA DE LABORATORIO: SELECCIÓN VARIABLES INTENSIVAS

ADECUACIÓN DE PARÁMETROS AL PROCESO:

MODELIZACIÓN, ESCALADO Y VALIDACIÓN DE MODELOS

VIA

BILID

AD

TÉC

NIC

O-E

CO

NÓ

MIC

AAISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS, CARACTERIZACIÓN Y

ESTUDIOS DE APTITUD

www.ainia.es 17#ainiainnovacion

> FASE 1 (LABORATORIO): Aislamiento, caracterización y mantenimiento de microorganismos de aplicación en agricultura

Actividades:

•Crioconservación

•Mantenimiento cepario

•Viabilidad

• Pureza

Conservación de microorganismos

Fuentes de microorganismos:

•Matrices alimentarias

•Aguas residuales

•Co-productos

•Colecciones de referencia

Aislamiento y obtención de microorganismos

Caracterización genética y molecular

Técnicas:

•PCR en tiempo real

•REP-PCR

•DGGE

•Campo pulsado

•Expresión génica

•MALDI TOF

www.ainia.es 18#ainiainnovacion

>FASE 1 (LABORATORIO): Determinación de las variables intensivas y evaluación de la aptitud del microorganismo a escala in-vitro

Citometría de flujoEspectro-fluorimetríaAnálisis molecular Cultivo celular

Sistemas miniaturizados

0

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5

7

90

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

rate

(lo

g (

cfu

/g)/

days

Aditive (ppm)

temperature

Response Surface for Listeria monocytogenes at different levels of

preservative and temperatures

Listeria monocytogenes in sliced mortadella

at 5ºC

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 5 10 15 20 25 30

time(days)

Log(u

fc/g

) data

fit

Métodos tradicionales

0

200

400

600

800

1000

1 2 3 4 5 6

Tipo de muestra

Cantidad normalizada expresada del gen iNOS/B-

actina respecto a las células sin tratar

Microscopia

www.ainia.es 19#ainiainnovacion

> FASE 2 (PILOTO): Escalado de Bioprocesos: Determinación de variables extensivas y viabilidad del proceso productivo

Objetivo: Selección de las condiciones de diseño que aseguren que elefecto de las distintas variables sobre un proceso es el mismo enunidades de distinto tamaño, consiguiendo de ese modo rendimientos ycalidades similares.

El proceso de escalado está basado en la experimentación y en lademostración a una menor escala.

Productividad vs. Costes Productivos vs. Eco-eficiencia

www.ainia.es 20#ainiainnovacion

>Optimización del proceso de fermentación

Influencia en la calidad de los cultivos

El número de generaciones que se requieren para llegar a unaconcentración celular final a partir de un determinado nivel deinóculo.

Esterilización

Los fermentadores de mayor volumen requieren distintos sistemasde esterilización.

Agitación y Aeración: Variables Extensivas

La forma y el tamaño del recipiente, así como el sistema de agitacióninfluyen sobre la transferencia de oxígeno

Intercambio de calor

El calor generado por el proceso es proporcional al volumen,mientras que el intercambio de calor es proporcional a la superficie.

)XlnXlnV(ln44,1Ng 0

www.ainia.es 21#ainiainnovacion

RETOS A SOLVENTAR - Puntos clave a la hora deasegurar el éxito de un producto basado enmicroorganismos

www.ainia.es 22#ainiainnovacion

>Coste vs fitosanitarios químicos

15000 Litros1%

76%

4%

15%

4%

COMPARATIVA POR VOLUMENES

1%

76%

4%

15%

4%

Consumos Eléctricos

Medio de Cultivo

Amortización de Equipos

RRHH

Limpieza

200 Litros

21%

13%

20%

29%

17%

5000 Litros

2%

51%

6%

33%

8%

20.000 Litros5.000 Litros200 Litros

%

El coste de las materias primas el parámetro que más influye en el costefinal de un producto obtenido por bioproducción.

Los consumos energéticos tienen una incidencia mayor en el caso desistemas agitados o en el caso de microorganismos dependientes de laluz (fototróficos).

Es importante dimensionar la escala final del producto para que loscostes de amortización sean asumibles por el producto.

01. Evolución de los distintos elementos que influyen en el coste de un producto con la escala.

www.ainia.es 23#ainiainnovacion

> Viabilidad industrial de los procesos bioproductivos

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000

Volumen de Trabajo (L)

%

Consumos Eléctricos

Medio de Cultivo

Amortización de Equipos

RRHH

Limpieza

02. Evolución de los distintos elementos que influyen en el coste de un producto con la escala.

www.ainia.es 24#ainiainnovacion

Una de las etapas finales en un proceso de bioproducción, es la etapade estabilización final del producto, que facilite su almacenamiento ysu dosificación.

La eficacia del producto final depende directamente de ladegradación que haya podido sufrir durante el proceso, por lo tanto,dar con un proceso de estabilización, con unas variables adecuadas,puede incrementar de manera relevante su eficacia, permitiendotambién reducir los costes asociados.

>Estabilidad y compatibilización con otras matrices

Estabilización de formulaciones líquidas mediante conservantesquímicos

Liofilización y secado por Spray Drying

Encapsulación de compuestos y/o microorganismos

www.ainia.es 25#ainiainnovacion

La protección de las innovaciones relacionadas con un bioproductopasan por la patentabilidad del uso de cepas de microorganismos

En el desarrollo de un bioproceso es imprescindible emplearmicroorganismos aislados para diferenciarse de la competencia,evitar acuerdos de transferencia y/o el pago de licencias a terceros

>Protección y diferenciación de bioproductos

Los microorganismos aislados permiten la diferenciación entreproductos similares.

Permite proteger el producto mediante patente (patente asociadaal uso de una cepa concreta)

www.ainia.es 26#ainiainnovacion

Biotecnología: Mediante la bioproducción de microorganismos, biosíntesisde metabolitos y la biocatalisis de materias organicas es posible obtener una gran variedad de productos con aplicaciones en agricultura:

Bionutrientes y Bioestimulantes

Inductores de Defensas

Biocontrol (microgranismos y bacteriofágos)

Optimización de procesos y viabilidad económica : Durante el proceso de escalado se seleccionan las condiciones óptimas y que aporten mayor viabilidad al proceso. Para asegurar la viabilidad económica de este tipo de productos hay que trabajar en la reducción de costes durante el proceso de producción empleando medios de cultivo de bajo costes y/o subproductos de industrias agroalimentarias.

Importancia de aislar microorganismo como punto de partida para el desarrollo de un bioprodceso: El empleo de microorganismos aislados permite diferenciar los nuevos productos de los ya existentes en el mercado.

La estabilización de los productos obtenidos: Este aspecto es clave para determinar la vida útil de un producto y su compatibilidad con otras matrices para su formulación

>Conclusiones

www.ainia.es 27#ainiainnovacion

Muchas gracias por su atención

Ana Torrejón 961 366 690