Biopsia Líquida mediante NGS de cfDNA en pacientes con cáncer colorrectal Laboratorio de Nuevas Terapias (IIS-FJD)

¿Podemos identificar a los pacientes que sufrirán metástasis en el Cáncer Colorrectal?

Secuenciación de alta capacidad de exomas del ADN libre en el plasma de pacientes con cáncer colorrectal ("biopsia

líquida") y su relación con el proceso metastásico PI13/01924 (2014-2016)

4

Dr. Damián García-Olmo Dra. Dolores García-Olmo

Criterios de selección de los pacientes

5

Non-metastatic cohort

(N=10)

Metastatic cohort

(M=10)

Unclassifiable cohort

(U=10)

Inclusion criteria

- Age: 18 - 80 years

- Candidates to elective surgery

- Agreement with the informed consent

- Histological diagnosis: colon adenocarcinoma of enteroid pattern

- Tumor stages:

pT1-pT3

pN0

M0 (established by PET-CT)

R0

M1: liver metastasis with

an enteroid

adenocarcinoma pattern,

histologically

established.

- Tumor stages:

pT4 and/or pN1-pN2

M0 (established by PET-CT)

Exclusion criteria - Previous cancers in other locations

- Lynch syndrome or other hereditary intestinal cancers

PET-CT: Positron Emission Tomography - Computed Tomography

Proyecto biopsia líquida ESTUDIO CLÍNICO

Pacientes CON Metas Hepáticas

n= 10

Pacientes SIN Metas Hepáticas

n= 10

Pacientes Inclasificicables

N=10

DISEÑO

Suecuenciación de exomas

Plasm

a P

MN

Definición de un panel genético

de posible valor pronóstico

NGS en Biopsia Líquida para Cáncer Colorrectal

7

Kim ST et al. Oncotarget. 2015;6(37):40360-9. Zhou J, et al. PLoS One. 2016;11(7).

Paneles génicos

Perfiles mutacionales Dianas terapéuticas

Detección temprana de recidivas Fluctuaciones

ctDNA

Biopsia Líquida mediante NGS en pacientes con CCR

8

[cfDNA] M > [cfDNA] N

U comparte características con M y N

9 Mouliere et al (2012). Expert Opin Biol Ther. 12 Suppl 1:S209-15.

Biopsia Líquida: Patrón de fragmentación

Necrosis Fagocitosis

>1000 pb (>10000 pb)

Apoptosis 180-200 pb

Biopsia Líquida mediante NGS en pacientes con CCR

10

Patrón de fragmentación nucleosomal

Análisis de la secuenciación

Secuenciación

•De señales de secuenciación a nucleótidos

•FASTQ, Cutadapt y Prinseq

Alineamiento

•Alineamiento a genoma de referencia

•BWA sobre Grch37

Calling de variantes

•Diferencias entre la muestra y la referencia

•VarScan, Samtools y VEP

Filtrado y anotación

•Seleccionar las variantes con potencial interés biológico

•GPRO

64%

Biopsia Líquida mediante NGS en pacientes con CCR

12

GRUPO M=10 GRUPO N=10 GRUPO U=10

Alineamiento

Calidad

Bowtie (3 mismatches) Genoma de referencia hg38 % Alineamiento: 64-77 % Sin filtrados adicionales

FastQC Calidad de base>28 (puntualmente<22) Errores en las 10-11 primeras bases

Número de lecturas por paciente entre 45 y 87 millones (76 pb 50X)

Biopsia Líquida en Cáncer Colorrectal

13

↑ cfDNA

KRAS NRAS BRAF EGFR …

Predicción y pronóstico Vigilancia y seguimiento

Detección temprana de progresión

- Bettegowda et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci Transl Med. 2014;6(224):224ra24. - Misale S. Resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer: from heterogeneity to convergent evolution. Cancer Discov. 2014;4(11):1269-80. - Spindler KL. Circulating free DNA as biomarker and source for mutation detection in metastatic colorectal cancer. PLoS One. 2015;10(4):e0108247. - Siravegna G et al. Clonal evolution and resistance to EGFR blockade in the blood of colorectal cancer patients. Nat Med. 2015;21(7):827. - Misale S et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature. 2012;486(7404):532-6. - Reinert Tet al. Analysis of circulating tumour DNA to monitor disease burden following colorectal cancer surgery. Gut. 2016;65(4):625-34.

NGS

• Mapeo

Variantes

Variantes filtradas: significado

72%

21%

6%

1% 0,2%

Variante sin

sentido

Variante

sinónima

NGS en Biopsia Líquida para Cáncer Colorrectal

16

Genetic alteration Sequencing methodology Reference

Copy number changes Rearrangements

Whole-Genome Sequencing Leary 2012

Copy number changes Whole-Genome Amplification Heitzer 2013

Copy number changes Whole-Genome Sequencing

(Plasma-Seq) Mohan 2014

Somatic mutations KRAS, NRAS, BRAF

NGS (Deep Sequencing) Sakai 2015

Somatic mutations 54-gene panel

Next-Generation Digital Sequencing Technology (DST)*

Kim 2015

Somatic mutations 15-gene panel

Massively Parallel Sequencing (Safe-Seq)

Tie 2015

MET amplification Whole-Genome Sequencing Ragvah 2016

Somatic mutations SNVs, Indels

Targeted Capture Sequencing Zhou 2016

* Guardant360 Panel

Cobertura media por región

Ch

r1

Ch

r2

Ch

r3

Ch

r4

Ch

r5

Ch

r6

Ch

r7

Ch

r8

Ch

r9

Ch

r10

C

hr1

1

Ch

r12

Ch

r13

C

hr1

4

Ch

r15

Ch

r16

C

hr1

7

Ch

r18

Ch

r19

Ch

r20

C

hr2

1

Ch

r22

Ch

rX

Ch

rY

PROYECTO PI13/01924

18

Enfoque alternativo

Secuenciación de exoma a menor profundidad

Perspectiva global del cfDNA

Perfiles o rasgos diferenciales (aparte de SNPs): presencia diferencial de exones (DPE) Metastásicos vs no metastásicos Características tumorales y no tumorales

Flujo de trabajo experimental

19

Presencia Diferencial de Exones (DPE)

20

“Presencia Diferencial de Exones”

pv≤0.005

EdgeR

QLF LRT Unique

DPE 366 297 379

QLF ∩

LRT

Unique = Num QLF + Num LRT – Num (QLF ∩ LRT)

QLF LRT

Análisis de Componentes Principales

21

Clusterización

22

Método de Ward

Pacientes M y N separados en 2 grupos

Pacientes U entre los límites de ambos

Pacientes libres de recaída agrupados

Presencia Diferencial de Exones (DPE)

Desarrollo de un algoritmo predictivo de metástasis

23

1. Los pacientes metastásicos (M) y no metastásicos (N) tienen distintos niveles de ciertos exones en plasma:

2. Estos perfiles de DPE permiten agrupar y clasificar a los pacientes.

3. A partir de los perfiles de DPE se ha desarrollado un algoritmo que puede tener potencial predictivo de metástasis en pacientes de CCR.

Olmedillas-López et al. Cancer Medicine 2018 (in press)

Olmedillas-López et al. Cancer Medicine 2018 (in press)

Clasificación de Random Forest

24

Metastásico No metastásico

M1 0.68 0.32

M2 0.67 0.33

N1 0.36 0.64

N2 0.35 0.65

pv≤0.005

Test de comprobación

Clasificación de Random Forest ̶ capacidad predictiva del algoritmo

Clasificación de Random Forest

25

Paciente Metastásico No metastásico

p04 0.60 0.40

p08 0.53 0.47

p12 0.48 0.52

p15 0.55 0.45

p23 0.56 0.44

p28 0.55 0.45

p57 0.49 0.51

p58 0.51 0.49

p63 0.60 0.40

p66 0.51 0.49

pv=0.005

Probabilidades obtenidas para el grupo U

Clasificación de Random Forest ̶ capacidad predictiva del algoritmo

M

M

HIPEC

HIPEC

EXITUS

N

N

N

N

N

DPE vs paneles de mutaciones

26

Estrategia fácil, rápida, no invasiva y económica Identificación de pacientes con alto riesgo de desarrollar metástasis Perspectiva más amplia vs paneles de mutaciones como biomarcadores clínicos

Concentración de DNA en el plasma Ruido de fondo Abundancia relativa de DNA tumoral Eficiencia de captura

Validez clínica limitada

PANELES

“Presencia Diferencial de exones” Transferencia horizontal − Genometástasis M y N agrupados y separados correctamente Algoritmo Identificación de M y HIPEC en grupo U

Valor predictivo

DPE

Publicación y patente

27

Secuenciación de alta capacidad de exomas del ADN libre en el plasma de pacientes con cáncer colorrectal ("biopsia

líquida") y su relación con el proceso metastásico PI13/01924 (2014-2016)

28

Estudio de validación de un modelo predictivo de desarrollo de metástasis en pacientes con cáncer colorrectal mediante secuenciación de exomas en ADN libre

en plasma ("biopsia líquida") PI17/01233 (2018-2021)

Un nuevo concepto: Presencia Diferencial de Exones (DPE)

29

Olmedillas-López et al. Cancer Medicine 2018

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN

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Laboratorio de Nuevas Terapias (FIIS-FJD)

Agradecimientos: S. Genómica y S. Masiva CBMSO

Begoña Aguado Ramón Peiró Fernando Carrasco

Genómica Parque Científico

Ricardo Ramos Servicio Genética FJD

Ana Bustamante Servicio de Cirugía FJD