Bioquímica Para Agrónomos

8/18/2019 Bioquímica Para Agrónomos

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Universidad de ChileFacultad de Ciencias AgronómicasEscuela Ciclo BásicoLaboratorio de Bioquímica

Guía de Laboratorio

Profesor Coordinador !r" Ale#andro $iquelme E

Profesores colaboradores !r" %anuel Pinto C!rta" %arit&a Berti

'(('

PROGRAMA CURSO ELECTIVOTECNICAS BIOQUÍMICAS DE USO EN AGRONOMÍA


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2002

ANTECEDENTES GENERALES

Profesor Responsabe! Sr" Ae#an$ro R%&'e(e E"

Coabora$ores! Sr" Man'e P%n)o C"Sr)a" Mar%)*a Ber)% D"

Se(es)re! pr%(er se(es)reD'ra+%,n! - se(anasT%po $e as%.na)'ra! Ee+)%/aRe&'%s%)o! B%o&'(%+a GeneraN1 oras pr3+)%+as! 4 oras se(anaes

5a par)e )e,r%+a ser3 en)re.a$a en 'na .'a $e abora)or%o6N7(ero $e Un%$a$es Do+en)es! 89orar%o $e +ases! M%:r+oes $e ;< a ;=

Ob#e)%/o Genera $e C'rso! Mejorar la comprensión de las materias tratadas en elcurso teórico de Bioquímica General. Entregar conocimientos de técnicas bioquímicasen análisis modernos de uso común en agronomía.

Ob#e)%/os espe+f%+os! Lograr que los alumnos puedan:!onocer las principales técnicas analíticas usadas en los laboratorios de bioquímica "espectroscopia# potenciometría : p$ % conducti&idad# etc'. !omprender los conceptos de cinética en(imática . )prender a determinar los parámetros de *otosíntesis % respiración en &egetalessuperiores )islar el +,) de di*erentes *uentes &egetales % animales.

Un%$a$es $%$3+)%+as! 4 oras se(anaes $e )raba#o pr3+)%+o $'ran)e 4 se(anas 0>- se(anaes $e pr'eba $e abora)or%o

2 oras e?a(en

Pra+)%+o Uno " - oras'

/ntroducción "0ro*. )lejandro 1iquelme'

2


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- 1eglamentos % cuidados dentro del laboratorio. !onceptos de bioseguridad.- 1e&isión de los conceptos básicos de p$ % preparación de tampones.- /nstrucciones para el manejo de los espectro*otómetros % aplicación de la le% de

Beer.

- /ndicaciones para el uso apropiado de las centri*ugas analíticas.

) partir de la segunda semana# el curso se di&idirá en tres grupos que desarrollará en*orma paralela cada uno de los siguientes prácticos:

Pr3+)%+o Dos "- oras'En(imologia "0ro*. Marit(a Berti'

- E2tracción de αamilsas de semillas de cebada.

- !inética en(imática de las en(imas e2traídas- E*ecto de la temperatura % p$ en la acti&idad catalítica.

Pr3+)%+o Tres "- oras' Bioenergética "0ro*. Manuel 0into'

- Bioenergética de la germinación de semillas.- +eterminación de la respiración en semillas mediante técnicas polarimétricas de

detección de 34 - +eterminación de la tasa *otosintética en &egetales mediante técnicas de análisis

de intercambio de gases "análisis in*rarrojo de !34 '.- Balance energético a ni&el de oja % cloroplastos mediante el uso de técnicas dedetección de la *luorescencia emitida por la cloro*ila 5a6.

Pr3+)%+o C'a)ro "- oras' !Biología Molecular "0ro*. )lejandro 1iquelme'

- E2tracción de )+, desde tejidos &egetales % animales.- 7isuali(ación % cuanti*icación del )+, e2traído "electro*oresis'.

El material e2perimental que se usará será *undamentalmente semillas % plántulas de

trigo.

D%a.ra(a $e Pro.ra(a 2002

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8 de Mayo

Práctico 1Introducción

Determinación de pHEspectroscopia

Centrifugación

n so!o grupo de 1" a!umnos

1" de Mayo 22 de

Mayo

2# de

Mayo

Práctico 2

En$imo!og%a

Cin&tica en$imática de 'α-ami!asa desemi!!as de ce(ada)*

+rupo I +rupo II +rupo III

Práctico 3

,ioenerg&tica

Determinación de parámetros fotosint&ticos

y de respiración)

+rupo II +rupo III +rupo I

Práctico

,io!og%a Mo!ecu!ar

.is!amiento y /isua!i$ación de .D0

+rupo III +rupo I +rupo II

M:)o$o! Traba#o pr3+)%+o $e abora)or%o

E/a'a+%,n! Se )o(ar3n pr'ebas es+r%)as se(ana(en)e $e pr3+)%+opasa$o> +on 'n )o)a $e )res pr'ebas @ a f%na $e +'rso se rea%*ar3'n e?a(en es+r%)o &'e %n+'%r3 a )o$os os pr3+)%+os"


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Calendario de Pruebas ) E*amen

Prueba Fecha Ponderación

+, +- de %a)o .'-/0

', '' de %a)o .'-/01, '2 de %a)o .'-/0

E*amen Final (- de 3unio .'-/0

A!4!5E6C4A !E $E7U4E$E EL +(( / 8E A!4!5E6C4A

Bibliografía

$all +.3# 8curloc9 M3# Bolar ,orten9amp* $1# Leegood 1! and Long 80. ;


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Leer es)o an)es $e a+er +'a&'%er )raba#o en e abora)or%o"

Se.'r%$a$ Genera en e Labora)or%oEstar seguro de conocer las &ías dee&acuación % la ubicación de los e2tinguidores dentro del laboratorio. 8u &ida puededepender de eso.

G'an)esEn el caso de algunos de los e2perimentos será necesario que utilicenguantes para pre&enir alguna lesión a la piel por el contacto de alguna sustancia tó2ica.@anto en el manual como los asistentes le arán saber cuales de las sustanciasquímicas son tó2icas.Uso $e os Rea+)%/os8iempre leer cuidadosamente las etiquetas ante de usar algún reacti&o# % &eri*icar que le an dado el material correcto. 8i usted no leecuidadosamente la etiqueta# usted puede tener un reacti&o equi&ocado# % tal &e( debarepetir parte o todo el e2perimento. ,3 @3!)1 la punta de las pipetas dentro de losen&ases stoc9s. 8i usted desea usar algún reacti&o# colocar un poco en un &asoprecipitado o matra( limpio % entonces pipetear. Por fa/or +'%$ar $e no +on)a(%nar oens'+%ar os rea+)%/os" La (a@ora $e as bo)eas $e os rea+)%/os )en$r3n 'na

%n$%+a+%,n $e a +an)%$a$ a )o(ar"A.'a!uando un procedimiento e2perimental requiere de la adición de agua# quedapor entendido que se tata de agua destilada. El agua destilada será suministrada desdeun bidón debidamente marcado. !equear la limpie(a del material de &idrio que se leará entrega. En caso que sea necesario limpiar el material solo con agua destilada.C'a$erno $e Labora)or%o!ada persona debe tener su propio cuaderno delaboratorio aun cuando trabaje con un grupo. El propósito de un cuaderno de laboratorioes dar la e2periencia en el registro de datos e2perimentales en una *orma organi(ada.+e tal *orma que sea posible que alguien no *amiliari(ado con los e2perimentos puedaclaramente entender los procedimientos usados % los datos obtenidos. El cuaderno delaboratorio deberá traerlo a cada sesión % anotar los datos de cada e2periencia. En

algunos casos# algún compaAero de tu grupo podría anotar los datos en su cuadernoindicando claramente quien obtu&o los datos. 0or último el correcto uso del cuaderno delaboratorio será cequeado durante el semestre. !ada e2perimento en el cuaderno será anotado con lápi( a pasta "no a mina' comosigue:

;. e+a> T%)'o @ no(bre $e os %n)e.ran)es $e .r'po 5s% as +orrespon$e6"4. Pro+e$%(%en)o Usa$o % anotar las modi*icaciones ecas al procedimiento delmanual.=. Los $a)os ser3n colectados mientras se reali(a el e2perimento. Los datos que ansido anotados en papeles sueltos % pasados al cuaderno en *orma posterior es unapractica inaceptable.-. C'a&'%er (a)er%a +o(o fo)os> pa+as TLC> e)+" serán marcados con la *eca# sunombre# numero de e2pediente % pagina de su cuaderno. Entonces será pegado en sucuaderno.No)a! Den)ro $e abora)or%o no se per(%)e n% +o(er n% beber"


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In)ro$'++%,n

T:+n%+as $e Ana)%+as C'an)%)a)%/as

P%pe)as!

;. 0ipetas 0asteurLlenar asta los dos tercios del &olumen como má2imo1emo&er la ultima gota desde la punta

4. 0ipetas Graduadas!on graduación milimétrica sin marcación del *inal# llenar asta la marca masalta

1emo&er asta la ultima gota.!on graduación milimétrica con marcación del &olumen *inal# llenar asta lamarca mas alta.+etenerse en la marca in*erior. No remo&er el liquido asta ultima gota

=. 0ipetas 7olumétricas

Mejor precisión.0osee un solo &olumen# con solo dos marcas# superior e in*erior.,o remo&er la ultima gota# se debe llegar asta la marca in*erior.

-. 8istemas para pipetear E2isten un sistema de pera de goma que se coloca en la boca superior de lapipeta % permite succionar el liquido# también e2isten sistemas similares a las

jeringas que por medio de un &ástago se succiona el liquido % también a%sistemas eléctricos % automáticos de bombeo.

C. Micropipetas8on pipetas automáticas que sir&en para tomar &olúmenes mu% pequeAos"D#;;DDD L'Mediante un sistema de pistón se ace &acío para succionar la muestra.8e emplean puntas desecables para la toma de muestras

N'n+a p%pe)ear +on a bo+a


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Pro+e$%(%en)o Genera para p%pe)ear ,o tocar el *ondo del *rasco contenedor+renar la pipeta contra las paredes internas del contenedor

ras+os /o'(:)r%+os

Fsados para acer soluciones de &olumen conocidoLas ultimas gotas llenado deben ser dadas con la pi(etaMe(cle antes de tomar una alícuota

Transferen+%a C'an)%)a)%/a+isol&er el sólido en un pequeAo contenedor "*rasco' % &erter en un *rasco&olumétrico# sin botar.Enjuague el pequeAo contenedor % el liquido nue&amente &iértalo en el *rasco&olumétrico# repetir - a C &eces.+iluir asta la línea# use la pi(eta para las ultimas gotas.

C3+'os $e Con+en)ra+%,n

Molar moles H litro M "molaridad'mol numero de )&ogadro ?#D4= 2 ;D 4= átomos o moléculas

No(en+a)'ra

Pref%#o Abre/%a)'r

a

a+)or

(e.a M ;0 <

%o ;0 8

;0 0

(%% ( ;08

(%+ro ;0<

nano n ;0=

p%+o p ;0;2

; molar ;M ; mol Hlitro ; mmol H ml; micromolar ; M ; micromol H litro ; nmol H ml

O)ras Con+en)ra+%ones

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mg H ml# IH &H IH&

; : ;DD "porcentaje' ; g en ;DD ml o gramos totales

; : ;.DDD.DDD ppm ; g en ; 2 ;D

?

ml o gramos totalesó ; mg en ;DDD ml o g ó ; g en ; ml.

Probe(as!

;. +ado un compuesto J que posee la siguiente masa molecular ; mol =K g # asíque ; mmol =K mg % se reali(a una solución D#D4 mg H ml.

!ual es la molaridad

4. +ada una solución de concentración C mg H ml % se toma una alícuota de 4 ml % sedilu%e a ;D ml.

!ual es la molaridad

E?per%(en)o ;A"!alibración de Micropipetas

#


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Pr%n+%p%o $e a +a%bra+%,n $e as (%+rop%pe)as

El &olumen tomado por una micropipeta es determinado por el peso de la cantidadtomada di&idida por la densidad del agua a temperatura ambiente. Esto recibe el

nombre de calibración gra&imétrica.

Muco de los e2perimentos in&olucran el pipeteo de soluciones *rías# sin embargo laspuntas plásticas de las micropipetas *ueron ecas para ser usadas en soluciones mastemperadas "4D4C N!'. $a% problemas de contracción de las puntas plásticas ensoluciones *rías de este modo las micropipetas toman un &olumen menor al indicadopor la &isor digital. Esto se soluciona si las micropipetas están debidamente calibradas.

Pro+e$%(%en)o E?per%(en)a para e 'so @ +a%bra+%,n $e (%+rop%pe)as

Uso $e (%+rop%pe)as.

E2isten un set de tres micropipetas disponibles. En el costado esta indicado los rangosde &olúmenes sobre los cuales pueden ser usados: CCD# CD4DD % 4DD;DDD l.0ara la calibración a baja temperatura# se llenara un probeta con CDD ml de ielo.

Pro+e$%(%en)o

;. !olocar el &olumen deseado dentro del rango de la pipeta usada " ;DD l en lamicropipeta CD4DD' sosteniendo con una mano el cuerpo de la micropipeta %ajustar el &olumen de acuerdo al indicador análogo.

4. !oloque una nue&a punta plástica desecable a la micropipeta. 0resione*irmemente con un pequeAo giro para asegurar que este bien sujeta.=. 0resione el botón de la micropipeta con el pulgar asta sentir el primer tope %

mantenga estable la presión.-. Mantenga &erticalmente la micropipeta# sumerja la punta en la muestra liquida a

una pro*undidad de ;#C mm.C. Libere el botón lentamente permitiendo que la solución entre en la punta de

plástico.?. 0ara &erter la muestra# coloque el e2tremo de la punta contra las paredes

internas recipiente receptor % presione lentamente el botón asta el primer tope.Espere ; segundo para drenar la solución % presione mas *uerte asta llegar al

segundo tope# sacando todo el liquido residual desde la punta.K. !on la punta %a seca soltar el botón dejando que &uel&a a su posición original.

T:+n%+as para (e#orar a e?a+)%)'$ $e a (%+rop%pe)a

- )lgunas soluciones "tales como suero# soluciones conteniendo proteínas#

1>


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o sol&entes orgánicos' dejan una película en la punta de la micropipeta.Esto puede ser un problema en que algo de tu muestra queda en la punta.Esto se soluciona rellenando una segunda &e( la punta con la muestraantes de colocarlo en el recipiente receptor.

- Las soluciones o sustancias con densidades mu% di*erentes al agua no sepipetean bien porque ellas son conducidas o mu% lentas o mu% rápidas.La única *orma de compensar esto es calibrando la micropipeta# por ejemplo usando una solución mas densa que el agua

- 8oluciones *rías causan que las puntas plásticas se contraigan % tambiénusted necesita calibrar la micropipeta para este e*ecto. Esto es lo queusted ará en el laboratorio.

- 8i una burbuja de aire esta dentro de la punta durante la toma de lamuestra# de&uel&a la muestra al recipiente original# &eri*ique lapro*undidad de la inmersión de la punta % pipeteé mas lentamente. 8i&uel&e a aparecer la burbuja# descarte la punta % use una nue&a.

Ca%bra+%,n $e M%+rop%pe)as

El &olumen tomado por la micropipeta es determinado por el peso de la cantidadtomada % di&idida por la densidad del agua.

Coo+ar a (%+rop%pe)a en ;00 # llenar la punta de la micropipeta con agua a

temperatura ambiente % depositarlo en un pequeAo recipiente "puede ser un tubo5Eppendor*6'. !olocarlo en una balan(a analítica % anotar el peso. 1epetir esto ;D&eces.!alcular el &olumen tomado % tabular los resultados "Estar seguro de anotar latemperatura del agua'.

1epetir el procedimiento usando esta &e( agua con ielo "1ecuerde anotar la nue&atemperatura usando un termómetro'.

+etermine el &olumen promedio % calcule la des&iación estándar para ambassoluciones.

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Labora)or%o ;B"

An3%s%s Espe+)rofo)o(:)r%+o $e Corof%a

Infor(a+%,n Genera!La cloro*ila e2traída con acetona al ODP &H& de ojas &erdes son &erdes. El e2tracto decloro*ila puede &ariar en la pro*undidad o intensidad del &erde dependiendo del material&egetal desde el cual *ue e2traído. )nálisis cuidadoso basado en la inspección &isuales un mejor medida cualitati&a % permite reali(ar algunas mediciones cuantitati&as ocapacita para distinguir entre las &ariaciones de la molécula de cloro*ila.0ara entender mas acerca de la cloro*ila e2traída# un espectro*otómetro es necesariopara reali(ar análisis electrónico de los posibles e2tractos % darnos un ma%or in*ormación cuantitati&a basado en la lu( absorbida a longitudes de onda especi*icas.En )ngiospermas "la ma%oría de las plantas terrestres' a% típicamente dos tipos demoléculas de !loro*ila "!l'# llamadas# cloro*ila a "!l a' and cloro*ila b "!l b'. Estos

pigmentos absorben *otones de lu( en la región del espectro a(ul % rojo# pero laslongitudes de onda especi*icas que ellos absorben son di*erentes. 8erá determinada laabsorbancia de *otones a ??= nm % ?-C nm# especi*ico para !l a % !l b#respecti&amente. +ebido que el espectro de absorción "*igura que integra laslongitudes de onda de la lu( absorbida' de estas dos moléculas de !l se sobreponen#usted usará una ecuación simultanea para determinar la cantidad de ambos pigmentos.La ecuación para esto es conocida como ecuación de )rnon. La ecuación de )rnondará la in*ormación cuantitati&a acerca de la !l a % !l b.

Ma)er%aes!

Los materiales necesarios para este procedimiento inclu%e un mortero % &ástago# papel*iltro# embudo % un espectro*otómetro. $a% &arios modelos de espectro*otómetrosdisponibles. Las instrucciones sobre el correcto uso de ellos son dadas en el apéndicede este manual.

M:)o$o"

Los estudiantes trabajarán en pares % coordinaran su acti&idad con un segundo par deestudiantes. $abrá una &ariedad de plantas disponibles en el laboratorio. 0lanear sutrabajo para que usted % su compaAero estén trabajando con plantas di*erentes al otrogrupo. Fsted % su compaAero tomarán muestras de di*erentes plantas % determinar la

cantidad de !l en las ojas. !uando usted a%a terminado su trabajo compartirá suin*ormación con el otro par de estudiantes.En esta e2periencia de laboratorio usted usará cubetas para contener los e2tractosbasados en acetona durante la medición de absorción. La acetona daAa algunosmateriales plásticos. por eso el uso de cubetas de &idrio es recomendable. 7idrio 50ire26*unciona bien para las determinaciones con lu( de longitud de onda en el &isible.

)lgunas cubetas son ecas de cuar(o % son como el &idrio pero son muco mas caras% requieren gran cuidado.

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Fsted tomará una pequeAa cantidad de la ojaQ en la realidad usted necesita solamenteuna pequeAa cantidad de tejido así que la planta no es destruida. La muestra serápesada así que la cantidad de !l puede ser determinada en base del peso *resco dela oja. La muestra de oja será omogenei(ada en acetona al ODPQ este es unsol&ente que e2trae las moléculas idro*obicas de !l desde su medioambiente en la

membrana % la ace soluble. La muestra estará turbia debido a las proteínasdesnaturadas % las *ibras de paredes celulares# así que será *iltrada para producir unasolución limpia ópticamente.

Pro)o+oo!

;. @omar apro2imadamente CD a ;DD mg de tejido *oliar de una planta con unatijera. ,o use los tallos o &enas gruesas por que ellas son mu% duras para moler.+etermine el peso e2acto con una balan(a analítica. Los a%udantes delaboratorio demostrarán el uso correcto de las balan(as. @odos sus datosdeberán ser anotados en un cuaderno# R no con*íe en su memoriaS

4. !olocar el tejido en un mortero % agregar ;D ml de acetona al OD P

"acetona : agua OD:4D &H&'. Moler el tejido con un &ástago. Fsted debe moler completamente el tejido. Fn poco de arena de cuar(o puede a%udar a una buenamolienda de los tejidos.

=. !olocar un embudo en un tubo de ensa%o % colocar un papel *iltro en el cono.0asar el o(o.ena)o a tra&és del papel *iltro. Lo retenido es eliminado % el*iltrado es colectado en el tubo de ensa%o. El *iltrado puede ser llamado une?)ra+)o.

-. 8i usted necesita mas in*ormación sobre el uso de un espectro*otómetro enparticular# usted deberá consultar el apéndice del manual o preguntar al pro*esor o al a%udante.

C. 3btenga una cubeta limpia % llene dos tercios con acetona ODP acetonaQ este es

llamado el ban+o. 0oner la cubeta en el espectro*otómetro % *ije la longitud deonda en ??= nm. El a( de lu( pasa a tra&és del compartimiento de la muestraen una dirección particular# de esta *orma los lados transparentes deben estar orientados de acuerdo a esto. Fsted limpiara con un papel sua&e "tisú' los ladostransparentes de la cubeta# para asegurarse que ellos estén secos antes deinsertarlos en compartimiento de la muestra. 0resione apropiadamente losbotones para que el espectro*otómetro se ajuste a D de absorbancia con lacubeta blanco colocada. 8acar la cubeta blanco % colocarla en un lugar seguropara ser usada mas tarde.

?. )gitar el *iltrado en el tubo de ensa%o % usarlo para llenar asta los dos tercios lasegunda cubeta % limpiar con el papel tisú# si es necesario. !olocar esta cubeta

muestra en el espectro*otómetro. La lectura será dada como )??=. Escribir estenúmero. 8acar la cubeta muestra % guardarla para los siguientes pasos.

K. !ambiar la longitud de onda a ?-C nm. 1einserte la cubeta blanco % coloquenue&amente el cero en el espectro*otómetro en la nue&a longitud de onda. 8acrala cubeta blanco e inserte la cubeta muestra. Lea la )?-C.

O. Enjuague las cubetas con agua destilada % séquelas colocándolas in&ertidassobre una toalla ,o&a % déjelas en un lugar seguro. R,o las deje en el borde delos mesonesS

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C3+'os!

La ecuación de )rnon es útil para con&ertir las mediciones de absorbancia a mg de!l H g de oja. "";4#K 2 )??=' "4#? 2 )?-C'' 2 mL de acetona!l a "mg H g de oja' mg de oja

""44#< 2 )?-C' -#?O 2 )??='' 2 mL de acetona!l b "mg H g de oja' mg de oja

@otal !l !l a T !l b

Estas ecuaciones *ueron publicadas por +./. )rnon ";


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APENDICE ;!A" G'a .enera para )o$os os espe+)rofo),(e)ros"

;. Fn adecuado tiempo de calentamiento aumentará el rendimiento delinstrumento. Espectro*otómetros mas &iejos pueden requerir seleccionar lalámpara % espejos apropiados para la longitud de onda usada. Losespectro*otómetros mas nue&os tienden a ser mas automáticos.

4. Los instrumentos de doble a( son usualmente menos susceptibles a trabajar sobre tiempo como los instrumentos de un solo a(. ,unca coloque una cubetaen el a( de re*erencia de un instrumento de doble a( a menos que lo a%asde*inido como necesario % entiendes los posibles arte*actos.

=. )umentando el anco de la ranura darás lecturas mas estables para muestrascon alta absorbancia. Fna anca ranura subestimará la absorbancia decompuestos con picos de absorción angostos. Los mas baratos

espectro*otómetros tienen un solo % *ijo anco de ranura.-. Estar seguro que tu estas usando cubetas de +'ar*o cuando estas trabajandocon longitudes de onda en el F7.

C. Los mas &iejos espectro*otómetros son ine2actos sobre ;.D de absorbancia# losmas nue&os espectro*otómetros son e2actos por lo menos para 4 unidades deabsorbancia.

?. Manteniendo la misma orientación de una cubeta usada para múltiples lecturasmejorará la precisión % e2actitud.

K. ,o tocar las super*icies ópticas de la cubeta. Guardar apropiadamente en sucaja.

O. Enjuagar las cubetas inmediatamente después de usar con agua destilada o

desioni(ada % secar con un papel sua&e.


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le&antando la puerta de entrada.C. !ierre el compartimiento % regule con la perilla /,!1E)8E asta llegar a cero en

la pantalla. Este es su blanco.?. 8iguiendo las instrucciones del manual obtenga las lecturas de los e2tractos

*oliares# colocando cada &e( las muestras en el soporte del equipo.

Un%+a( UV2"Fnicam F74 es un interesante ejemplo de un moderno espectro*otómetro. Estosinstrumentos cuestan apro2imadamente FY C#CDD % son su*icientemente so*isticadospara mucos tipos de análisis de rutina. Ellos emplean un monocromador que produceun anco de banda de 4 nm en el rango espectral. Estos instrumentos están equipadoscon lámparas de deuterio % son capaces de determinaciones en el rango del F7. Lama%oría de las *unciones son controladas por cla&es multi*uncionales# así que debenser mu% cuidadosos de cuales botones están presionando.

Ins)r'++%ones!

;. Encienda colocando en ON el interruptor. El interruptor esta en el costadoposterior i(quierdo. Espere que se complete el )F@3 @E8@.

4. !olocar el cursor en la palabra Z/). En la pantalla aparecerá una serie deparámetros que se pueden modi*icar. El M3+3 aparecerá como pre*ijado en

)B8 ")bsorbancia'. E2isten otras posibilidades como P@ "@ransmitancia' % !3,"multiplica por un *actor'.

=. Modi*icar la longitud de onda. !olocando el cursor en la palabra L3,G/@F+ +E3,+). 0resione el botón E+/@ % coloque el nue&o &alor para *inali(ar presioneE,@E1.

-. )mbas lámparas# "+euterio para lu( F7Q @ungsteno para lu( &isible'# estánaora encendidas. 8i usted esta usando una longitud de onda de =CD nm omenor# debe asegurarse que esta encendida la lámpara de +euterio. El paso deuna lámpara a otra se ace en *orma automática.

C. )brir la puerta del compartimientoQ insertar la cubeta con la solución blanco en elespectro*otómetro % cerrar la puerta.

?. 0resionar el botón de [E13HB)8EK. )brir el compartimiento % sacar el blancoO. /nsertar la muestra % cerrar la puerta del compartimiento.


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Espectro*otometría es de*inida como la medida de absorbancia o transmitancia de lu(

Espe+)ro Ee+)ro(a.n:)%+o

ra%os J F7 -DDnm ODDnm /1

7isible

λ cH& E & cHλ

Fna molécula o átomo absorbe lu( si la energía de la lu( es apro2imadamente igual a la

di*erencia de energía entre sus ni&eles e2ternos de electrones.

Pr%n+%p%os!

Le@ $e BeerLa(ber)

)nálisis cualitati&o# porque los compuestos absorben lu( en longitudes de ondacaracterísticas "nm# \ '

longitud de onda

)nálisis cuantitati&o# la concentración de los compuestos puede ser medidaespectro*ometricamente. El diagrama siguiente muestra lo que pasa cada &e( que la lu(incide sobre una solución.

.(sor(ancia

1


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8e establece que :

+onde :/o /ntensidad incidente /t /ntensidad transmitida

b longitud del paso de lu( c concentración del compuesto a absorti&idad característica del compuesto

0ara eliminar los números negati&os# la ecuación anterior puede ser trans*ormada como

o. I) Io H a b + o o. Io I) H a b +

8i ) log /t H /o# donde ) es llamada absorbancia# entonces:

Le@ $e BeerLa(ber)

Un%$a$es!) no debe tener unidadesb usualmente es ; cmc puede tener unidades de mgHml# gHl# molHl# etc.

a debe tener unidades reciprocas de b c

ejemplo: c tiene unidades de mgHml b ; cm a debe tener unidades de "mgHml' ; "cm' ;

a ] b ] c "mgHml' ; "cm' ; ] "mgHml' ] cm sin unidadesCoef%+%en)e Absor)%/%$a$

(

4t4(

!og ItI> - a ( c

. a F ( F c

18


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!omo encontrar el &alor de a 0or la medición de un estándar "concentración conocida del compuesto absorbedor'ejemplo ;.

c ; 2 ;D - mgHml "solución preparada'

b ; cm "cubeta normal' ) D#4 "absorbancia medida' a Fsando la ecuación ) a b c a ) "b c' ; a D#4 " ; cm ] ; 2 ;D - mgHml' ;

a 4 2 ;D = 4DDD ml " mg ] cm' ;

ejemplo 4. El mismo compuesto anterior pero aora con una concentracióndesconocida

b ; cm ) D#= "medido'c

c ) "a b' ;

c D#= " 4 2 ;D = ml " mg ] cm' ; " ; cm' ; ' c ;#C 2 ;D - mg Hml

C'r/a Es)3n$ar

Mucas &eces para determinar el coe*iciente 5a6 no basta con una sola mediciónsino que debe reali(arse una cur&a estándar.

8i usted &e la *ormula general de la ecuación de la recta:% m2 T b es posible obser&ar que la *ormula de BeerLambert encaja en este

tipo de ecuación: ) "a b' c T D+onde ) o absorbancia es gra*icada contra c o concentración# resultando

una línea recta

"c'oncentración

pendiente a (

'.*(sor(ancia

1#


20/59

Ban+os para os an3%s%s espe+)rofo)o(e)r%+os

El blanco per*ecto# se colocan todas los compuestos % sol&entes e2cepto el compuestoabsorbedor de lu( que nos interesa medir.

Des/%a+%ones a a Le@ $e Beer • Zuente de lu( no monocromática• Zuentes no omogéneas• )bsorción no lineal8oluciones mu% concentradas no obedecen la le% de Beer

Labora)or%o ;C"

An3%s%s $e T%)'a+%,n $e 'n a(%no3+%$o

2>


21/59

In)ro$'++%,n!

Los aminoácidos son ejemplos comunes de una biomolécula simple que tiene dos omas grupos titulables. )l igual que el bu**er $E0E8 tiene dos grupos titulables. Esto esimportante para comprender mucos procesos bioquímicos de moléculas ioni(ables. Laioni(ación de cada grupo sigue la ecuación de $enderson$asselbalc. 0or ejemplo#

glicina tiene dos grupos ioni(ables: un grupo carbo2ilo % un grupo amino# con &aloresde p^a de 4#- %


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Ma)er%aes!

En cualquier laboratorio o% en día# un p$metro es usado para determinar el p$ deuna solución. El pro*esor % los a%udantes demostrará el uso correcto de un p$metro.!ada grupo calibrará su p$metro de acuerdo a las instrucciones dadas por losa%udantes.

Par)e E?per%(en)aEste ejercicio los introducirá a las propiedades ácido H base de los aminoácidos. Elaminoácido usado aquí será la .%+%na.

El plan general es subir el p$ de una solución de glicina "D#- M' a apro2imadamente ;#Cpor la adición de ;#D M de $!l# % entonces agregar alícuotas de 4#D ml de ;#D M de^3$ a la solución de glicina para proceder a la cur&a de titulación.

Pro)o+oo"

;. !omen(ar el e2perimento con la adición del $!l ;.D M a -DmL de solución deGlicina agitando constantemente asta obtener un p$ de apro2imadamente ;#C.8i el equipamiento del laboratorio lo permite# colocar una barra magnética dentro del&aso que contiene la muestra % colocarlo en una agitador magnético.

4. !olocar en una tabla de datos en tu cuaderno de laboratorio con el siguienteencabe(ado.

mL de ^3$ p$ de la solución deGlicina

D `; `

4 `etc. `

Fsando una pipeta o micropipeta# agregar alicuotas de ; o 4 ml de ^3$ a lamuestra# agitando constantemente la solución# medir % anotar el p$. La solucióntitulante es ;.D M ^3$ "que es pre*erible a ,a3$ debido que el ion sodiointer*iere con algunos electrodos a p$ altos'. 1epetir este procedimiento detitulación asta que el p$ sea superior a ;4. Limpiar bien el electrodo despuésde este e2perimento % comen(ar a preparar la siguiente titulación de ^3$ con

el &aso que contiene -D ml de agua destilada.

=. )gregar los -D ml de agua % colocarlo en las mismas condiciones anteriores./gual que en caso anterior# con el objeto de acidi*icar la muestra# agregamos $!l;#D M asta llegar a p$ cercano a ;#C. 7ol&er a acer una tabla similar a lausada anteriormente.

ml de ̂ 3$ p$ del agua

22


23/59

D `; `4 `

etc. `

Fsando una pipeta# agregar alicuotas de ; 4 mL de ^3$ a la muestra# agitandola solución# medir % anotar el p$ obtenido. !ontinuar agregando las alicuotas de^3$ asta llegar a p$ ma%ores de ;4.Limpiar el área de trabajo.

An3%s%s!

!oloque los datos en una tabla ampliada. Encabe(ada de la siguiente manera:

ml ̂ 3$ p$ Gl% p$ $43 mmol ̂ 3$ ∆ p$ / ∆ mmol Gl% ∆ p$ / ∆ mmol $43

+eterminar los milimoles "mmoles' multiplicando el &olumen de ^3$ en ml por ; de lamolaridad de la solución de ^3$.1eali(ar los grá*icos de p$ &ersus ml de ^3$ para cada solución. 1eali(ar los grá*icosde ∆ p$ / ∆ mmol &ersus p$ para las dos soluciones.

0reguntas:;' !uál es el rango de p$ en el cual cada solución es amortiguado4' +iga las di*erencias signi*icati&as entre las dos cur&as de &aloración=' +ibujar las - posibles *ormas iónicas de glicina-' /denti*icar cuales de estas *ormas son predominantes a p$ ;# p$ ?# % p$ ;;# % que

no e2isten en el agua.C' /denti*icar los dos p^as de la glicina.?' Escriba las ecuaciones mostrando como la glicina puede tamponar las soluciones en

su p^a por consumo de pequeAas cantidades agregadas de iones idrogeno oidró2ido.

Ap:n$%+e 2" I" Cons%$era+%ones )e,r%+asEn este e2perimento se desarrollará bajo el *enómeno de disociación ácido base. Lade*inición general de un ácido es una molécula que puede disociarse % liberar ionesidrogeno. +e la misma *orma # una base es una molécula que puede aceptar ionesidrogeno. La siguiente ecuación muestra la disociación del ácido débil# ácido acético:

23


24/59

!$=!33$ ↔ !$=!33 T $T

La disociación de un ácido débil tal como el ácido acético obedece la le% de acción demasas que es descrita por la ecuación:

[!$=!33] [$T]^ [ !$=!33$]

donde ^ es la constante de disociación % los términos entre paréntesis cuadradorepresentan la concentración de las moléculas indicadas en moles por litro. La cantidadde iones idrogeno que son liberados cuando un ácido o base débil es disuelto en unasolución puede ser descrito por la siguiente ecuación:

V$TW √ ^!

donde ! es la concentración del ácido débil en sus *ormas protonada % desprotonada.Uue es#

! V!$=!33W T V!$=!33$W

A" Der%/a+%,n $e a e+'a+%,n 9en$erson9asseba+"La ecuación de $enderson$asselbalc es usada para describir la acción de unbu**er cuando un ácido o una base *uerte es adicionada a un ácido o base débil.1earreglando la ecuación de acción de masas dada anteriormente:

; ; [ !$=!33]

[$T] ^ [ !$=!33$ ]

0orque p$ log "; H [$T] ' log V$TW % p^ log ";H^' log ^# podemos deri&ar lasiguiente ecuación:

p$ pâ T log [ !$=!33] [!$=!33$]

8i generali(amos la ecuación de la disociación de todos los ácidos "$) ↔ $T T )'#obtenemos la ecuación de $enderson$asselbalc :

p$ pâ T log [ )]

[ $)]

B" A.en)es A(or)%.'a$ores o )a(ponan)es 5)a(b%:n a(a$os b'ffers6"Los agentes amortiguadores son moléculas que impiden que un sistema cambie mucosu p$. Las moléculas que puede aceptar o liberar un ion idrogeno es un bu**erQ enotras palabras# los ácidos o base débiles pueden ser&ir como un bu**er. Los agentesamortiguadores mas comunes usados en in&estigaciones bioquímicas son $E0E8 "pâ K#CC a 4DN!' % @ris "pâ O#=D a 4DN!'. Los bu**ers tienen su mas alta capacidadamortiguadora cerca de su pâ .

2


25/59

Fn e2amen de la ecuación de $enderson$asselbalc permite entender el termino p^ a.!uando la V)W V$)W# el termino log V)W H V$)W llega a ser igual a log ; que es cero.Bajo estas condiciones el p$ pâ. )demás# podemos de*inir pâ como el p$ en elcual las concentraciones de las *ormas protonadas % desprotonadas son iguales. El

pâ también es igual al p$ en el cual el grupo ioni(able esta en su mejor capacidadamortiguadoraQ que es# cuando el cambio de p$ cambia le&emente con los cambios enV)W o V$)W.

,ota: Todos los valores de pKa son derivados con una unidad de concentración (aprox.1.0 molar). Los valores de pKa de muchos iones importantes en sistemas biouímicoscambian con la temperatura! "uer#a iónica $ cuando se dilu$en a concentraciones mu$ ba%as. &l símbolo pK a' desina los valores de pKa en sistemas de iones diluidos.

A(or)%.'a$ores Peso or('a pa a 20 1C pa 1C A2-0 of 0";M

0/0E8# sal sódica ==C.= ?.O; ± D.;C D.DD< D.DC/mida(ol$!l ;D-.C K.D- ± D.;C D.D;K D.DDC

M308 4D


26/59

usado *recuentemente como bu**er pero interactúa con mucos metales#precipita en la presencia de !a4T % no es tan útil bu**er como los listadosanteriormente.

?. El bu**er no absorberá la lu( F7# %a que mucos ensa%os bioquímicos utili(anesa longitud de onda . 8erá mejor si la molécula no absorbe sobre los 4-D nm

pero todos ellos lo acen.

II" p9Me)ro;. El p$ Metro# posee la precisión de un mili &oltímetro# mide potenciales deelectrodo % los trans*orma a unidades de p$ % corresponde a la siguienteequi&alencia:

C


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INTRODUCCIN"

'n+%,n @ +as%f%+a+%,n $e as en*%(as

Las en(imas son proteínas que tienen la *unción de catali(ar todas las

reacciones químicas que ocurren dentro de los organismos &i&os. Estas se designan %se clasi*ican de acuerdo con el tipo de reacción que catali(an. Los seis gruposprincipales son: @rans*erasas# $idrolasas# Liasas# /somerasas# % Ligasas "8intetasas'.

!ada en(ima se designa con un nombre sistemático % por un número que laidenti*ica de acuerdo a los grupos % subgrupos. @ambién tienen un nombre mas comúnque mucas &eces resulta más práctico % más con&eniente de usar que el nombresistemático.

Me$%+%,n $e a a+)%/%$a$ en*%(3)%+a

+ebido a las bajas concentraciones de en(ima que se requieren para catali(ar una reacción dada# normalmente la presencia de una en(ima se detecta siguiendo ladesaparición del sustrato o la aparición de un producto que pueda ser identi*icado por alguna técnica analítica. 8i se con*ecciona una cur&a de progreso de la cantidad desustancia trans*ormada en *unción del tiempo "*igura 4'# se puede obser&ar que alcomien(o la reacción es lineal# pero pronto comien(a a disminuir debido# por una partea la disminución del sustrato % por otra parte a la presencia del producto lo que aceque la reacción in&ersa ocupe un papel cada &e( más importante asta llegar a unequilibrio. Zinalmente la reacción puede ser inibida por los productos *ormados opuede inacti&arse bajo las condiciones e2perimentales. @odos estos e*ectos juntos

acen que sea casi imposible deri&ar una ecuación estandar que se ajuste a la cur&a deprogreso. 0or lo tanto la acti&idad en(imática se determina considerando la &elocidadinicial de la reacción "& aHb' %a que en tales condiciones los e*ectos discutidos sonmás pequeAos.

La acti&idad en(imática se e2presa *recuentemente en término de unidades "F'.Fna unidad es la cantidad de en(ima que catali(a la con&ersión de un micromol desustrato "o producto' por minuto bajo condiciones de*inidas. 3tra manera de e2presar la acti&idad en(imática es mediante la unidad 8/ que es la 9atals "9at' % representa latrans*ormación de ; mol de sustrato por segundo. !omo esta unidad es grande lo máscomún es usar la unidad nano9atals "n9at'.

8ustancia trans*ormada# s

2


28/59

b

a

@iempo# t

%.'ra 2! C'r/a )p%+a $e pro.reso

; F ; mol min;

; 9atal ; mol s;

; F 9atH?D ;?#?K n9at.

La pure(a de la en(ima se e2presa en términos de acti&idad especí*ica que sede*ine como el número de unidades en(imáticas por milígramo de proteína. La acti&idadespecí*ica en unidades 8/ se e2presa como 9atals por 9ilogramo de proteína

E+'a+%,n $e M%+ae%s Men)en

La cur&a presentada en la *igura = corresponde a una cinética en(imática típicaque *ue deri&ada por primera &e( por Micaelis Menten obteniéndose la siguienteecuación:

& 7 s 7 7elocidad má2ima s T ̂ m ^m !oncentración de sustrato correspondiente a la

mitad de la &elocidad má2ima

)cti&idad en(imática# v

7ma2 7ma2

28


29/59

^m !oncentración de sustrato# s

%.'ra 8! C'r/a $e M%+ae%sMen)en

De)er(%na+%,n $e as +ons)an)es $e ( @ V(a?

Las constantes ^m % 7ma2 pueden determinarse más con&enientemente

utili(ando una trans*ormación lineal de la ecuación de Micaelis que se obtienetomando los recíprocos

; ; T ^m 2 ;& 7 7 s

% gra*icando ;H& &ersus ;Hs siendo la pendiente ^m H 7. 8in embargo la pendiente deesta cur&a depende muco de las &elocidades medidas a bajas concentraciones desustrato que son las menos e2actas# por tal ra(ón se pre*iere utili(ar una *orma alternaque consiste en multiplicar la ecuación de los recíprocos por s "*igura -'.

s s T ^m & 7 7

!uando s D# s ^m % cuando s D# s ^m& 7 &

s, v

^m 7 0endiente ;

7

2#


30/59

^m D s

%.'ra 4! Re+)a +orrespon$%en)e a os re+pro+os $e a e+'a+%,n $e M%+ae%sMen)en (')%p%+a$os por s> para a $e)er(%na+%,n $e as +ons)an)es ( @ V("

Efe+)o $e a )e(pera)'ra @ e p9 sobre a a+)%/%$a$ en*%(3)%+a

Las en(imas son bastante sensibles a las condiciones e2perimentales detemperatura % p$. La &elocidad de una reacción catali(ada por una en(ima# al igual quela ma%oría de las reacciones químicas# aumenta con la temperatura. Esto se debe

principalmente al e*ecto sobre las constantes de &elocidad de las di&ersas reaccionesparciales que componen la reacción total % a la a*inidad de la en(ima por losco*actores# acti&adores etc. ) ele&adas temperaturas# la proteína de la en(ima sedesnaturali(a dando como resultado una pérdida de acti&idad. La temperatura a la cualuna en(ima alcan(a su má2ima acti&idad se denomina 5@emperatura óptima6. !adaen(ima di*iere en cuanto a la temperatura óptima que necesita para actuar % esta sepuede determinar lle&ando a cabo la acti&idad en(imática a di*erentes temperaturas %luego reali(ando una cur&a de acti&idad &ersus temperatura# obteniéndosenormalmente una cur&a como la mostrada en la *igura C. En la práctica la ma%oría delas en(imas son completamente inacti&adas por encima de los KDN!.

!on respecto al p$ las en(imas son acti&as en un rango limitado de p$ % un

grá*ico de la acti&idad en *unción del p$# da una cur&a en *orma de campana parecida ala que se muestra en la *igura C. El p$ al cual se obtiene la acti&idad má2ima se conocecomo el p$ óptimo % es característico de la en(ima# siempre % cuando esta sea estableen las condiciones e2perimentales usadas.

8ustrato trans*ormado en el tiempo

3>


31/59

T

@emperatura

%.'ra -! Te(pera)'ra ,p)%(a 5T6 $e 'na en*%(a

Los cambios de acti&idad con el p$ se deben a cambios en el estado deioni(ación de la proteína en(imática % de los otros componentes de la me(cla dereacción. Micaelis % +a&idson sugirieron en ;


32/59

el sobrenadante a un nue&o tubo % calentar a ?DN! por C min. !entri*ugar a ;C.DDDrpm por C min. % tras&asijar nue&amente a otro tubo % dejar el tubo en ielo.

Me$%+%,n $e a a+)%/%$a$ en*%(3)%+a

!olocar en un tubo de C mL C


33/59

arginina# % esta reacción se detecta a C


34/59

In)ro$'++%,n

El crecimiento en los &egetales es el producto de la síntesis % acumulación de nue&asbiomoléculas que se producen por la trans*ormación# al interior de la célula# de dos

tipos de sustratos: uno orgánico % otro mineral. El sustrato orgánico es el másabundante % proporciona tanto las estructuras carbonadas que ser&irán de base para lanue&a síntesis como la energía necesaria para e*ectuarla. Este sustrato correspondepor lo general a idratos de carbonos dentro de los cuales la glucosa es el másimportante. 0or su parte el sustrato mineral# menos abundante pero igualmenteimportante# corresponde a los elementos minerales absorbidos por las raíces quedurante la síntesis se unen a las moléculas orgánicas para permitirles cumplir di&ersas*unciones# Zigura ?.

$es:iración

Figura


35/59

Or%.en $e a G'+osa en os Ve.e)aes

En los &egetales superiores# la glucosa destinada a constituir el sustrato orgánico#pro&iene en su totalidad de la asimilación de !34 en el proceso de la *otosíntesis. 8in

embargo# a inicio del crecimiento de órganos pre&iamente en latencia# como en elcaso de las %emas o durante la germinación de semillas# la glucosa pro&iene deldesdoblamiento de las reser&as.

La o)osn)es%s! pro+eso en+ar.a$o $e %n+orporar a ener.a @ e+arbono para e +re+%(%en)o $e os /e.e)aes

La *otosíntesis es el proceso mediante el cual los &egetales pueden trans*ormar laenergía de los *otones luminosos en energía de enlaces químicos. Esta trans*ormaciónse e*ectúa en los cloroplastos mediante la inter&ención de dos procesos bien di*erentes:el primero# conocido como *ase clara# en el que la energía luminosa queda almacenada

como )@0 % ,)+0$4 # Zigura K % el segundo en que la energía del )@0 % el ,)+0$4es usada para la

9 fotones 9 fotones ; fotones .Eq0

Figura ?"- Es4uema de !a fase c!ara de !a fotos%ntesis

!L

P! 4P!44

9e

'@' ' 9 e

9@

' 6A8 9e

9@

' 6A8P@'

1A5P1A8P Pi

3"


36/59

*ormación de compuestos más estables a partir del !34 atmos*érico el cual esabsorbido a tra&és de los estomas % reducido a e2osa "glucosa' de acuerdo con lasecuaciones siguientes:

A6 en as pan)as +on (e)abo%s(o C8 >< CO2 ;2 NADP9 ; ATP C


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el !iclo de los )cidos @ricarbo2ílicos "o ciclo de ^rebs' % la Zos*orilación 32idati&a.

Mediante la acción combinada de estos tres procesos# durante la germinación# laplántula puede disponer de estructuras carbonadas que ser&irán de base para las

nue&as biomoléculas % de energía utili(able bajo *orma de )@0 % ,)+$4 .

%.'ra " Esquema del proceso de la 1espiración

La G%+,%s%s

La glicólisis es el punto de partida de la o2idación de la glucosa que en el caso de lassemillas de cereales pro&iene de la idrólisis del almidón de reser&a.

otos%ntesiseser/as

DLUC!A

9 6A8@'' A5P

< 6A8@'' FA8@'' A5P

Dlicólisis

C'

Ciclo de=rebs

'

osfor%a+%,n O?%$a)%/a+6A8@' ; 1 A5P +FA8@' ; ' A5P

+ Dlucosa ; 1 A5P

Amilasas

3


38/59

Almidón @' . Dlucosas 0 n

Esta glucosa " !?$;43?' se o2ida a tra&és de unas ;D reacciones intermediasproduciendo 4 ácidos pirú&icos# dando como balance una ganancia neta en energía de- )@0 T - ,)+$4 .

C%+o $e os A+%$os Tr%+arbo?%+os

Los ácidos pirú&icos se descarbo2ilan % acti&an a la &e( trans*ormándose en4 )cetil !o )# liberando 4 !34 % produciendo - ,)+$4 adicionales.

Los 4 )cetil !o ) acti&ados entran al !iclo de los )cidos @ricarbo2ílicos o !iclo de^rebs en donde se o2idan % descarbo2ilan totalmente liberando - !3 4 % produciendo 4

)@0 T ? ,)+$4 T 4 Z)+$4

En total la o2idación de un mol de glucosa en la Glicólisis % el !iclo de ^rebs produce:

;0 NAD92 2 AD92 4 ATP

)demás el ciclo de ^rebs posee la particularidad que a lo largo de sus numerosasreacciones# produce compuestos intermediarios que sir&en de estructura base para lasíntesis de otras biomoléculas como proteínas# lípidos# ácidos orgánicos# aminoácidosetc.

osfor%a+%,n o?%$a)%/a

La *os*orilación o2idati&a es el proceso que ocurre en las mitocondrias mediante el cuallos compuestos reducidos# producidos en la Glicólisis % en le ciclo de ^rebs ",)+$ 4 %Z)+$4' se o2idan por acción del 34 liberando energía que es *inalmente utili(ada parala síntesis de )@0 . 0or cada ,)+$4 % Z)+$4 o2idados se producen = )@0 % 4 )@0respecti&amente.

La producción energética *inal de la o2idación de un mol de Glucosa en la respiraciónes por lo tanto# de =O moles de )@0 produciéndose al mismo tiempo la liberación de ?moles de !34 % consumiéndose ? moles de 34.

Este balance ilustra bien la importancia del o2ígeno durante la germinación de la semilla%a que sin el suministro adecuado de este elemento el metabolismo energético de lasemilla se &erá a*ectado % por lo tanto# no abrá su*iciente )@0 ni estructuras

C


39/59

carbonadas para sustentar el crecimiento.

Resp%ra+%,n D'ran)e a Ger(%na+%,n $e Se(%as

ases ener.:)%+as $e a .er(%na+%,n $e as se(%as

+esde el punto de &ista energético# a partir del inicio de la germinación# la primera partedel desarrollo de un &egetal se puede di&idir en tres *ases# Zigura < :

la primera o *ase eterótro*a# en que el crecimiento es totalmente dependiente delsustrato orgánico originado del metabolismo de las reser&as contenidas en lasemilla. En esta *ase el sustrato mineral también &iene en gran medida de lasreser&as de la semilla pero es ín*imo en comparación con el orgánico.

la segunda o *ase intermedia# en que el crecimiento es sustentado tanto por eldesdoblamiento de las reser&as como por la *otosíntesis de las primeras ojas en

desarrollo %

la tercera o *ase autótro*a# en que abiéndose agotado las reser&as es el proceso*otosintético quién proporciona todo el sustrato orgánico para el crecimiento de laplanta.

Fase 4 Fase 44 Fase 444

40

20

- ;0 ;- 20 80

Crecimiento :or reservas

fotosíntesis

Crecimiento:or reservas

% a t e r i a ! e c a G P l a n t a

g 0

Consumode reservas

3#


40/59

Das $esp':s $e s%e(bra

%.'ra =" E&olución del peso seco de las distintas partes de la plántula detrigo durante las tres *ases energéticas de sus primeros estadosde desarrollo

En !a primera fase= 9asta !os 1" d%as despu&s de siem(ra= todas !as estructuras car(onadas y !a

energ%a necesaria para e! crecimiento pro/ienen de! desdo(!amiento de !as reser/as semina!es 4uedan origen a! denominado sustrato orgánico tota! '5@* ) Este sustrato= por !o tanto= se puede

di/idir= en a4ue! destinado a proporcionar estructuras '5t* y a4ue! destinado a proporcionar

nicamente energ%a '5e*) Por !o tanto?

La ef%+%en+%a $e +re+%(%en)o $'ran)e a .er(%na+%,n

+urante la *ase eterótro*a se produce# en consecuencia# el consumo de las reser&asde las que solo 8t &a a quedar incorporado como ganancia neta en las estructuras dela parte aérea "tallos % ojas' % de la raí(# % 8e &a a ser totalmente o2idado en larespiración para producir la energía para la trans*ormación de 8t. )sí la e*iciencia "Ec'

a la cual se produce este consumo de reser&as se puede calcular a partir de:

Esta e*iciencia se conoce como E*iciencia de !recimiento e indica la proporción de

reser&as que se trans*ormó en estructuras &egetales en relación al consumo desustrato total. )sí por ejemplo# si durante la *ase eterótro*a del trigo "Zigura


41/59

este &alor re&ela que el trigo# durante la *ase eterótro*a# es bastante e*iciente entrans*ormar sus reser&as en estructuras radiculares % de la parte aérea. Esto esconsecuencia de que las moléculas constitu%entes de la plántula son probablementede estructura mu% similar a la del almidón de reser&a# por lo que las trans*ormaciones

de este son menores % por lo tanto# no requieren de un gran consumo energético. En elcaso del *rejol en cambio esta e*iciencia es cercana a D#?D indicando que el consumo

energético es ma%or# cercano al -D P de las reser&as. Esto es probablemente debido alalto contenido proteico de sus estructuras lo cual requiere una ma%or in&ersión

energética para la trans*ormación del sustrato. En el caso de oleaginosas como lamara&illa# por el eco de tener reser&as más bien lipídicas# con ma%or contenido

energético que los idratos de carbono % las proteínas# el consumo de reser&as con*ines energéticos es considerablemente menor lo que ace que en estas semillas Ec

sea superior a D#OC. Es decir en este caso menos de un ;CP de las reser&as sondestinadas a la producción energética % por lo tanto# la ma%or parte de ellas se usan

para *ormar estructuras.

El metabolismo encargado de sustentar todas las trans*ormaciones descritas es larespiración % por lo tanto# es importante anali(ar en *orma general algunas de susreacciones.

1


42/59

PRCTICO DE BIOENERGJTICA VEGETALA6 De)er(%na+%,n $e a E?%.en+%a C'3n)%+a 5E&6 (e$%an)e a e/o'+%,n$e O2

Fna de las *ormas para medir la acti&idad *otosintética# en particular a ni&el de lacadena transportadora de electrones en la *ase clara# es a tra&és de la determinaciónde la tasa de desprendimiento de 34. Esta determinación se e*ectúa mediante el uso deun electrodo de !lar9 # dotado de un ánodo de )g % un cátodo de 0t sobre el cual &auna membrana semipermeable a tra&és de la cual puede di*undir el 3 4# Zigura ;D.

' Pt Mem(rana

.g Pt

%.'ra ;0" Electrodo de !lar9

La reacción que se produce luego que el 3 4 alcan(a el 0t es la siguiente:

Ptred G 2 G H PtoJ G HH G 2 e-

Los electrones desprendidos generan una corriente eléctrica proporcional a la cantidadde 34 di*undido a tra&és de la membrana.

2


43/59

El electrodo se sitúa en la base "a' de una cámara ermética# compuesta de tres partes% bajo la parte "b' donde se sitúa el tejido *oliar al que se le &a a medir la tasa dee&olución de 34 # Zigura ;;.

'c*

'(*

'd*

'a*

%.'ra ;;" Esquema del sistema de medición de 34

Esta cámara# al momento de la medición# está saturada con !34 para que la*otosíntesis pueda *uncionar. En su parte superior a% una *uente de lu( "c' la cual sepuede programar a distintas intensidades. El electrodo se encuentra conectado a uncomputador el cual# mediante un programa especial permite la calibración del sistema %la medición del 34 desprendido del tejido *oliar en *unción de di*erentes intensidadesluminosas.

En la Zigura ;4# se presenta un cur&a característica de la e&olución de 3 4 de una oja")'# "moles de 34 m4 s;' en *unción de distintas intensidades luminosas. En ella sedistinguen cuatro parámetros característicos :

o# que corresponde al 34 consumido por la respiración mitocondrial o respiraciónoscura#-L! que corresponde al punto de compensación luminoso en donde el 34consumido se iguala al desprendido desde la *otólisis del agua quedando la*otosíntesis ")' neta igual a cero#

max! que corresponde a la tasa de desprendimiento de 3 4 má2ima %# que corresponde al rendimiento cuántico má2imo el cual a su &e( correspondea la pendiente de la cur&a en su origen "moles de 34Hmoles de *otones'La e2igencia cuántica mínima "Eq' corresponde al &alor in&erso de "moles de*otones necesarios para desprender un mol de 3 4'

uente de !u$

Cámara de medición

Cámara de! e!ectrodoComputador

3


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2>

.maJ

ϕ >

Ro ">> 1>>> 1">> 2>>>

PCL Intensidad Auminosa ' Kmo! fotones m-2 s-1*

%.'ra ;2" !ur&a característica de la e&olución de la *otosíntesis neta ")# mol 34 m4 s;' en *unción de la intensidad luminosa

Ob#e)%/o! el objeti&o de este trabajo de laboratorio será anali(ar los *undamentos delmétodo usado para cuanti*icar el 34 desprendido por un disco de oja de ;D cm4 en*unción de la intensidad de radiación incidente con el *in de determinar los parámetrosdescritos en la Zigura K.

Ma)er%aes @ E&'%pos!

32ígra*o "$ansatec# F^'!omputador dotado de so*Iare Lea*+isc "$ansatec# F^'Manual de calibración del 32ígra*o8istema de control de temperatura por circulación de agua8olución de ^3$ saturada!ilindro de !34 ;D.DDD ppmeringas de ; % ;D mL8acabocados de ;D cm4

0lantas de poroto con ojas desarrolladas

Pro+e$%(%en)o

Luego de calibrar el o2ígra*o según lo seAalado en el manual del equipo procédase dela siguiente manera:a' corte un disco de oja de ;D cm4 con el sacabocadosb' abra la cámara del o2ígra*o % deposite el disco de oja en el comportamiento

especial sobre la gradillac' cierre erméticamente la cámarad' abra las &ál&ulas laterales e in%ecte ;D mL de !34 ";D.DDD ppm' e2traídos con una

. = K m o ! I 2 m - 2 s

- 1


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jeringa desde el cilindro correspondiente.e' cierre las &ál&ulas % proceda a recalibrar el equipo aora con la muestra de oja en

su interior *' lograda la calibración# elija un programa de intensidades de radiación# desde D a

4DDD mol *otones m4 s;

g' aga correr el programa % para la medición proceda según indique el programacomputacional' una &e( terminada la medición obtenga los parámetros de la cur&ai' repita la medición con ojas de di*erente condición % edad % discuta sus resultados

B6 De)er(%na+%,n $e a resp%ra+%,n en se(%as (e$%an)e an3%s%s $eCO2 $espren$%$o

La respiración es el metabolismo mediante el cual los organismos e2traen energía desus reser&as para e*ectuar trabajo biológico "síntesis de biomoléculas# transporte de

metabolitos# mo&imiento etc.'. En el caso de las semillas# durante el período de latencia#los ni&eles de respiración son mu% bajos debido a que prácticamente no e2iste trabajobiológico. +urante este período a% una mu% baja acti&idad metabólica# producto de la*alta de crecimiento# % por lo tanto# el consumo de reser&as con *ines energéticos estambién mínima. Bajo condiciones *a&orables para la germinación# luego que esta seinicia# el principal trabajo biológico a reali(ar por la semilla es la síntesis % el transportede las nue&as biomoléculas que constituirán las nue&as estructuras de los órganos encrecimiento# es decir# de la raí( % del tallo % las ojas. Este trabajo lo deberá e*ectuar#en una primera *ase# totalmente a e2pensas de las reser&as que contenga de dondedeberá e2traer:

a) cadenas carbonadas para *ormar la estructuras de los nue&os constitu%entes de losnue&os órganos %b) energía bajo *orma de )@0 para e*ectuar dica síntesis

)mbos componentes son proporcionados por el metabolismo respiratorio# que en elcaso de las semillas con reser&as idrocarbonadas# como el trigo % el maí(# usa comosustrato al almidón. Este es desdoblado a glucosa# que es el compuesto que *inalmentees o2idado para la obtención de )@0. 0ara que la o2idación de la glucosa sea completase necesita su*iciente disponibilidad de 34 en la atmós*era circundante de la semilla# delo contrario el consumo de las reser&as no se e*ectuará e*icientemente % por lo tanto# elcrecimiento de la plántula se &erá a*ectado. 0roducto de la o2idación de la glucosa se

producirá !34 el cual es liberado a la atmós*era.

AL%48H6 @' .DLUC!A0n

C


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@anto el consumo de 34 como la liberación de !34 se pueden medir % por lo tanto#ambas mediciones sir&en de método para cuanti*icar el comportamiento de larespiración de una semilla en determinadas condiciones.

Ob#e)%/o! el objeti&o de este trabajo de laboratorio será anali(ar los *undamentos de

los métodos usados para cuanti*icar el !34 en la atmós*era % determinar el e*ecto de latemperatura en la ta(a de eliminación de !34. respirado por semillas de trigo engerminación.

Ma)er%aes @ E&'%pos!

Estos materiales son para un grupo de seis alumnos en que tres alumnos trabajaránmidiendo la respiración en semillas germinando a ;CN! % los otros tres en semillasgerminando a =Df!.

!ámara de culti&o con control de temperatura

Equipo de circulación de agua con control de temperatura )nali(ador /n*rarrojo de !341egistrador o !omputador con so*tIare apropiado;4 placas 0etri4 pin(as=D semillas de trigo pregerminadas;4 discos de papel *iltro estéril de diámetro similar a la placa 0etri= picetas con agua destilada estéril; rollo de *ilm plástico "euro*ilm';4 jeringas plásticas de ; mL? marcadores de tinta

; rollo de cinta de papel engomado

Pro+e$%(%en)o

a' 0regerminar semillas de trigo en papel úmedo por -O oras a temperaturaambiente.

b' !ada alumno dispondrá de dos placas 0etri que deberá identi*icar con las letras ) %B más el subíndice ;CN o =DN ! según la temperatura que le toque anali(ar.

c' !olocar dos discos de papel por placa 0etri % luego umedecerlas con aguadestilada estéril. !olocar sobre el papel las semillas pregerminadas "4 ó =' % dejar equilibrar a la temperatura correspondiente por espacio de ;C minutos.

d' !ubrir la placa con *ilm plástico de manera que queden erméticamente cerradas.

e' 1egistrar el tiempo % e2traer una muestra de aire "D#C mL' desde cada placa conuna jeringa de ; mL per*orando el *ilm plástico con la aguja % marcar la jeringa con elpapel engomado con la marca @o "tiempo cero'# Zigura ;=.

*' Guardar la jeringa insertada en una goma# a temperatura ambiente# asta elmomento del análisis % tapar la per*oración con otro peda(o de *ilm plástico.


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eringa de muestreo

5emi!!as en germinación

i!m transparente para mantener

disco 9erm&ticamente cerrado

%.'ra ;8" E2tracción de muestra de gas desde placa 0etri con semillas

g' !olocar las placas con las semillas en la cámara de culti&o regulando pre&iamente latemperatura al ni&el deseado.

' Muestrear tres &eces cada ;C minutosi' /n%ectar las muestras de gas al sistema de medición /1G)# según Zigura ;-.

j' +eterminar la altura de la seAal % luego calcular la concentración de !34 en *unciónde una cur&a de calibración pre&iamente establecida usando muestras conconcentraciones conocidas de !34# Zigura ;C

9' !alcular la cantidad de !34 respirado por semilla en cada tratamiento detemperatura

$egistrador4$DA

$eferencia %uestra

6'

1( ::m

Figura +9" 5istema de medición deC2 en muestras de gas

8


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+>-

+>(

(>-

1((


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LABORATORIO N14

ETRACCIN ANLISIS DEL DNAr. le%andro iuelme

INTRODUCCIN

En este laboratorio ustedes podrán e2traer el +,) de una &ariedad de células % &er lasmoléculas que resultan con sus propios ojos. 0ara apro&ecar mejor la práctica usteddeberá entender la teoría celular debido que es esencial para adquirir los conceptosde bioquímica % genética que se desarrollarán en el laboratorio. Esta acti&idad será una

manera e*ica( de re*or(ar lo que ustedes %a saben sobre las células % podrán &er susposibles aplicaciones al campo de la agronomía.

OBETIVO DE LA PRACTICA : )islar el +,) de las células.

METODOLOGÍA!

Las células serán tratadas químicamente para romper la célula % las membranasnucleares. La porción de la me(cla que contienen el +,) "la porción acuosa' será separada de

la porción que contiene las membranas % las proteínas asociadas "la porciónlipídica' .

8erán anali(adas las proteínas que protegen el +,) % que la mantienen *irmementeen un estado enrollado.

La solución que contiene el +,) disuelto será alterada de modo que el +,)precipite.

El resultado será asombroso. El +,) sale de la solución "Este proceso se llamaprecipitación'. El +,) precipitado será obser&able a simple o#o. 8erá *ácil aislar %puede ser utili(ado para otras in&estigaciones.

">


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PURIICACIN DE DNA GENMICO CON LA SOLUCIN DE C9OMCKNSI

DESCRIPCIN DEL REACTIVORea+)%/o $e Co(+*@ns% es un reacti&o completo % listo para el aislamiento del+,) genómico de muestras sólidas % líquidas de origen animal % &egetal. El

procedimiento de Co(+*@ns% se basa en el uso de una solución de lisis deguanidina % detergente que idroli(a el 1,) % permite la precipitación selecti&a del +,)desde una célula lisada. +esarrollado por 0. !omc(%ns9i ";'# es un método a&an(adode aislamiento del +,). El protocolo de !omc(%ns9i es rápido % permite elaislamiento de la +,) genómico de una gran cantidad de muestras % de &olúmenespequeAos o grandes "C'.+urante el aislamiento# una muestra biológica es lisada "o omogenei(ada' en elreacti&o de !omc(%ns9i % el +,) genómico es precipitado desde el lisado con etanol.8eguido de un la&ado con etanol# el +,) se solubili(a en agua ó O mM ,a3$. Elprocedimiento lle&a ;D a =D minutos con una recuperación del +,) genómico de KD;DDP. El +,) aislado se puede utili(ar# sin una puri*icación adicional# para análisis58outern6# análisis por ibridación "dot blot'# clonamiento molecular# reacción encadena de la polimerasa "0!1' % otras aplicaciones moleculares en biología %biotecnología.

ESTABILIDAD! El reacti&o de !omc(%ns9i es estable en la temperatura ambiente porlo menos dos aAos después de la *eca de la compra.

PRECAUCIONES DE MANIPULACIN! El reacti&o de !omc(%ns9i contieneirritantes. Manipule con cuidado# e&ite el contacto con la piel# utilice protección para losojos "blindaje# anteojos de seguridad'.

EN CASO DE CONTACTO! La&e la piel con una cantidad copiosa de agua % busque laatención médica.

PROTOCOLO GENERAL

;" LISIS W 9OMOGENEIKACIN! ; ml reacti&o de !omc(%ns9i T 4C CD mg decélulas del tejido ó D#; ml de muestra líquida.

2" Cen)r%f'.a+%,n 5Op+%ona6! ;D.DDD g 2 ;D minutos.8" PRECIPITACIN DEL DNA! lisado T D#C ml de etanol al ;DDP.4" LAVADO DEL DNA! ; ml de etanol de KCP "42'.-" SOLUBILIKACIN DEL DNA! O mM ,a3$ o agua. &l procedimiento se reali#a a la temperatura ambiente! a menos ue est3 indicado deotra manera. eactivo reueridos4 etanol $ 5 m* 6a78.

"1


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;. LISIS 9OMOGENIKACIN

En Genera"$omogenice los tejidos en un omogenei(ador manual de &idrio@e*lón. Ftilice unomogeni(ador con una tolerancia ma%or de D#;D#;C mm. $omogenice el tejido "4CCD

mg' en ; ml de reacti&o de !omc(%ns9i aplicando la menor cantidad de mo&imientosposibles. @ípicamente# C;D mo&imientos se requieren para la omogenei(acióncompleta. Las cantidades pequeAas "C;D mg' de tejidos sua&es# tales como ba(o ocerebro se pueden dispersar % lisar por repetiti&os pipeteos con una micropipeta.Guardar el omogenato por C;D minutos a temperatura ambiente.

a' @ejidos: $omogenice las muestras de tejido con ; ml de la 8olución de!omc(%ns9i por CD;DD mg de tejido# usando un omogeni(ador de &idrio conte*lón "uno en el que el émbolo encaje con soltura' % omogenicecompletamente con el mínimo de golpes "normalmente se necesitan de C;Dgolpes'. 8i se trata de pequeAas de un tejido sua&e "como el ba(o % elcerebro'# se puede *ragmentar % lisar por pipeteo repetido con una micropipeta.los tejidos de plantas deben ser pul&eri(ados antes me(clarlos con la soluciónde !omc(%ns9i# lo que se puede acer e*icientemente si primero se congelanen nitrógeno líquido o ielo seco con etanol.

b' !élulas crecidas como monocapa: Lise las células directamente en la placa deculti&o# aAadiendo D.KC;.D. ml de 8olución de !omc(%ns9i por cada ;D cm 4

del área de la placa de culti&o "; ml en una placa de =.C cm de diámetro'#agitando la placa % pasando sua&emente con una pipeta el lisado celular a untubo nue&o.

c' !élular crecidas en suspensión: )Aada ; ml de 8olución de !omc(%ns9i por cada ;= 2 ;DK células# sedimentadas o en suspensión# cu%o &olumen noe2ceda o.; ml# % lise las células por pipeteo sua&e % repetido.

d' ,úcleos de células: )Aada ;ml de 8olución de !omc(%ns9i por cada ;= 2 ;DK

núcleos de células# sedimentados o en suspensión# cu%o &olumen no e2cedaD#; ml# % lise los núcleos por in&ersión del tubo o pipeteo sua&e % repetido

e' 8angre: !on muestras de asta ;DDµl de sangre# aAada ; ml de 8olución de!omc(%ns9i % lise las células por pipeteo sua&e % repetido. 8i el &olumen dela muestra es ma%or de ;DDµl# entonces me(cle la sangre# en proporción ;.C#con un bu**er de lisis "8acarosa D.=4 M# tris ;D mM p$ K.C# Mg!l 4 C mM %@ritón J;DD ;P'# % agite sua&emente asta lograr la lisis celular. !entri*ugue a-DDD rpm ";DDD2g' por ;D min a 4ON! % desece el sobrenadante "puedeusar una pipeta 0asteur'. )Aada ;ml de 8olución de !omc(%ns9i % lise elprecipitado o sedimento de núcleos por pipeteo sua&e % repetido.

4. Cen)r%f'.a+%,n "3pcional'

8edimente el omogenato por centri*ugación a ;D.DDD g por ;D minutos a -4C !.Luego# trans*iera el sobrenadante &iscoso que resulta a un tubo limpio.&ste paso uita los "ramentos insolubles del te%ido! el 6 parcialmente hidroli#ados

$ el exceso de los polisac9ridos del lisado/homoenato. e reuiere solamente para el

"2


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aislamiento del :6 de te%idos tales como híado! m;sculos $ la ma$oría de te%idos de

planta ue contienen una cantidad rande de material celular $/o extracelular $ tambi3n

se recomienda para el aislamiento de 6 libre de :6.

=. PRECIPITACIN DEL DNA i. 0recipite el +,) del lisadoHomogenato por la adición de D#C ml de etanol al

;DDP por cada ml de reacti&o de !omc(%ns9i usado para la e2tracción.ii. Me(cle las muestras in&irtiendo los tubos CO &eces % manténgalas a la

temperatura ambiente por ;= minutos. !erciórese de que el reacti&o de!omc(%ns9i % el etanol se me(clen bien para *ormar una solución omogénea.El +,) debe llegar a ser rápidamente &isible como precipitado blancu(co.

iii. 8i el precipitado de +,) es su*icientemente grande# se puede pescar con unapunta de pipeta o una bagueta# enrollarlo sobre ésta# % mo&erlo acia la boca deltubo# dejándolo en la pared del tubo cerca de la boca "otra alternatí&a estrans*erirlo a un tubo nue&o'. +esece el sobrenadante con muco cuidado#coloque el tubo &erticalmente por ; min % elimine por aspiración el resto delsobrenadante que quede en el *ondo del tubo.

i&. 8i se pipeteó muco para lograr la lisis % omogeni(ación# % por esa causa el+,) se *ragmentó o si a% poco +,) en la muestra ()# el +,) no *ormaráel precipitado nebuloso &isible. En estos casos se debe centrí*ugar a -DDD C.DDD 2 g por ;C min a temperatura ambiente o a -N! para precipitar el +,).

4" LAVADO DEL DNALa&e el precipitado de la +,) dos &eces con D#O ;#D ml de etanol KCP. En cadala&ado# resuspenda el +,) en etanol in&irtiendo los tubos = ? &eces. !oloque lostubos &erticalmente por D#C ; minuto para permitir que el +,) sedimente en el *ondode los tubos % quite el etanol con una micropipeta.&n caso de necesidad! sedimente la pella de :6 a 1.000 por 1 ? @ minutos aA ? @= B. -ara uitar me%or los contaminantes al aislar la :6 de los te%idos! la primeralavada de etanol se puede sustituir por lavado en una solución ue contiene C0D dereacti&o de !omc(%ns9i $ E0D de etanol-" SOLUBILIKACIN DEL DNA8eque el precipitado al aire % a temperatura ambiente por C;Cmin# remo&iendo elalcool desde el *ondo del tubo usando una micropipeta.+espués# disuel&a el +,) en O mM ,a3$# pasando lentamente la pella a tra&és de lapipeta. )lternati&amente# disuel&a el +,) en agua. 8in embargo# la solubili(ación del+,) ocurre más rápidamente en medio alcalino % asegura la completa solubili(ación del+,) precipitado. )gregue una cantidad adecuada de O mM ,a3$ o agua para alcan(ar

una concentración del +,) de 4DD =DD ngHl. @ípicamente# agregar 4DD =DD l de OmM ,a3$ o agua al +,) aislado de ;D4D mg de tejido animal.Las preparaciones del :6 aisladas de te%idos tales como híado! m;sculos $ plantascontienen un poco de material insoluble (sobre todo polisac9ridos). uite el material insoluble por centri"uación a [email protected] por 10 minutos. Las soluciones alcalinasd3biles son neutrali#adas por el 7@ del aire. Fna ve# al mes! preparar 5 m* 6a78 dela solución stoc de @ ? A * 6a78 ue no debe tener mas de H meses de antiIedad.

"3


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CUANTIICACIN DEL DNA RESULTADOSMe(cle una parte alícuota del +,) solubili(ado con ; ml de O mM ,a3$# o ;= mM

,a4$03-# o agua % mida )4?D % )4OD de la solución que resulta. !alcule el +,)contenido asumiendo que una unidad de ) 4?D es igual a CD g de +,) doble ebraH ml. La ra(ón de )4?D H ) 4OD del +,) aislado estará dentro del rango ;#? ;#< % conun peso molecular que se e2tiende de 4D a ;DD ^b. El peso molecular del +,) aisladodepende de las *uer(as mecánicas aplicadas durante la lisis H omogeni(ación odurante la solubili(ación del precipitado del +,).0ara el cálculo del número de células en las muestras anali(adas o un rendimientoesperado de +,)# se asume que la cantidad de +,) por ;D ? de células diploides deorigen umano# de rata % de ratón es igual K#;# ?#C % C#O g respecti&amente "4'.El rendimiento típico para los tejidos de animales "g +,) H mg de tejido': ígado# riAóno pulmones# = CgQ músculo esquelético# cora(ón o cerebro# ; =gQ tejido de planta#D#= D#O g. El +,) aislado contiene el 1,) parcialmente degradado. 8i una reduccióndel contenido del 1,) a menos que =P es necesaria# realice la centri*ugación "paso 4'según el protocolo descrito. En análisis 8outern# el 1,) puede ser digeridoagregando a la me(cla 1,ase "; gHml'.

NOTAS COMENTARIOS; 0ara el aislamiento de los núcleos de células recomendamos un método simple

% e*iciente del citrato basado en la omogenei(ación de tejidos en la solución de;P @ritón J;DD en -D mM citrato de sodio.

4 El procedimiento del aislamiento puede ser interrumpido % las muestras puedenser guardadas como sigue: El lisado H omogenato se puede guardar por ; mesa la temperatura ambiente o por ;D meses a - ó 4D !. +urante el la&ado# el+,) se puede guardar en etanol


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mM ,aE+@) "p$ K#C O'# ;P laurilsarcosina de sodio % D#; mgHml de proteinasa^. +igiera ;D;CD mg de tejido en D#C ml de bu**er a C? N! durante la noce. Enel término de la digestión# licue el tejido completamente por pipeteos &igorosos %me(clan totalmente D#; ml del e2tracto con ; ml de reacti&o de !omc(%ns9i "-'.+espués de terminada la digestión# proceda según protocolo.

REERENCIAS

;. !omc(%ns9i 0.# Mac9e% ^.# +reIs 1. and Xil*inger X. ;


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tamaAo de los *ragmentos. +os marcadores de tamaAo molecular se utili(an# el p9i-L1


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a9dale el +romuro de &tidio a ambos o a ninuno.

=. +esmonte cuidadosamente la placa % el peine del gel % coloque el gel en unaparato ori(ontal de electro*oresis. )gregue el bu**er de electro*oresis de ;J

@)E a los depósitos asta que el bu**er apenas cubra el gel de agarosa.) )gregue por lo menos un décimo del &olumen de la solución de carga con

colorante ?J a cada muestra de +,)# me(cle# % cargue en los bolsillos.Electro*oresis el gel a ;CD4DD m) asta la separación requerida se a%aalcan(ado# generalmente D#C; oras ";DD;4D m) para la agarosa de bajatemperatura de geli*icación'# % en*riar el gel durante la electro*oresis con un&entilador. 7isualice los *ragmentos de la +,) en una caja de la lu( F7 de laonda larga % *otogra*ié con una cámara *otográ*ica polaroid )

Si no se añadio el Bromuro de Etidio en el paso 2, teñir el gel en una solución de buffer TAE !con Bromuro de Etidio "#$ %g&ml durante '"()$ minutos a temperatura ambiente# La detección

de cantidades mu* pe+ueñas de -A ./" ng0 se facilita si se logra un me1or contraste,

eliminando el fondo de Bromuro de Etidio no unido a -A, lo +ue se puede lograr mediante lainmersión del gel en agua o Sulfato de agnesio m, durante 2" minutos a temperatura

ambiente#

E's%,n $e os fra.(en)os $e DNA $es$e a a.arosaLos *ragmentos de +,) son eluidos desde los geles de agarosa de baja temperaturade geli*icación usando un procedimiento inédito primero desarrollado por el +r. 1oe.

)quí# la banda de interés es cortada con una oja de a*eitar estéril o bisturí #colocándolo en un tubo de microcentri*uga# congelar a KD !# % después se derrite.Entonces# el *enol saturado con @E se agrega al tro(o del gel derretido# % la me(cla es

otra &e( congelada % después descongelada. +espués de este segundodescongelamiento# se centri*uga el tubo % la capa acuosa se quita a un tubo nue&o. El*enol residual se quita con dos e2tracciones de éter# % el +,) es concentrada por precipitación con etanol.

Pro)o+oo;. 0onga el tro(o del gel de agarosa que contiene el +,) en un tubo

del microcentri*uga de ;#C ml % congele a hKD ! por lo menos ;Cminutos# o asta el congelamiento. Es posible detenersebre&emente en esta etapa en el procedimiento de elusión % dejar eltro(o de gel congelado a hKD !.

4. +errita el tro(o incubando el tubo a ?C !.=. )gregue un &olumen de *enol de @Esaturado# agite por =Dsegundos# % congele la muestra a hKD ! por ;C minutos.

-. +esiele la muestra# % centri*úguela en una microcentri*uga a;4.DDD rpm por C minutos a la temperatura ambiente para separar las *ases. La *ase acuosa entonces se quita a un tubo limpio#e2traído dos &eces con igual &olumen de éter# precipite con etanol#% la pella de +,) es la&ada % secada.

"


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APENDICE 8"/. 0ara determinar la concentración deseada de )garosa. 0uede guiarse por lasiguiente tabla:

P de )garosa recomendado 1esolución óptima del +,) lineal"@amaAo de los *ragmentos en pb'

0"8 ->000 0000"< ;>000 20>0000" 00 ;0>000;"0 -00 X>000;"2 400 000

;"- 200 8>0002"0 ;00 2>0008"0 Y ;00

II" Mar+a$or $e DNA 5Es+aa $e DNA6Los marcadores de tamaAo molecular de +,) contiene ;< *ragmentos en el rango de;DD pb a ;D 9b de +,)# donde los *ragmentos de D.C 9b# ; 9b# ;.C 9b % =.D 9b tienenuna ma%or intensidad para ser&ir como banda de re*erencia.

Zragmento @amaAo "9b'

; ;D.D4 O.D= ?.D- C.DC -.D? 8"0K 4.DO ;"-< ;.4;D ;"0;; D.<;4 D.O;= D.K;- D.?;C 0"-;? D.-;K D.=;O D.4

"8


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;< D.;

8e recomienda cargar =C l "D.?;.D g' de los marcadores de +,)# diluida en bu**er de carga ;2 para electro*oresis de +,).

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