BIOQUÍMICA MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS · 2019. 3. 20. · Determinación de GrasasDeterminación de Grasas Métodos directos de extracción Los lípidos no pueden

BIOQUÍMICA

MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS DE ALIMENTOSALIMENTOS

Dra Roxana VerdiniDra. Roxana Verdini

[email protected]

2019

Esquema de Weendeq

Proteínas

Materia seca

Cenizas

Lípidos

Alimento

Materia secaMateria

Orgánica

Lípidos

FibraHumedad

Ext. no nitrogenados

Preparación de la muestrap

• MOLINILLO• MORTERO• TAMIZ• CUARTEO

ALIMENTOS SECOS• MUESTRA DE ENSAYO

• RALLAR• MUESTRA DE ENSAYO

ALIMENTOS DUROSMUESTRA DE ENSAYO

Ej.: Chocolate

PICADORA MECÁNICAALIMENTOS HÚMEDOS • PICADORA MECÁNICA

• MORTERO• RECIPIENTE CERRRADO• REFRIGERAR

HÚMEDOSEj.: carne, pescado,

t l • REFRIGERARvegetales

Preparación de la muestrap

• PROCESADO A ALTAALIMENTOS EMBEBIDOS EN

LÍQUIDOS • PROCESADO A ALTA VELOCIDAD

LÍQUIDOSEj: conserva de frutas y

hortalizas, salsas

• FILTRADO EN CALIENTEACEITES Y GRASAS FILTRADO EN CALIENTEACEITES Y GRASAS

• FUNDIR• FILTRAR EN CALIENTEACEITES Y GRASAS

TURBIOSTURBIOS

• CALENTAR A 35 ºC• HOMOGENEIZAR POR

EMULSIONES GRASASEj.: manteca, margarina

AGITACIÓNEj.: manteca, margarina

Determinación de humedad

Utilidad de la determinación:Permite conocer la composición del alimento ysu relación con el peso secosu relación con el peso seco.

Permite conocer las posibilidades de deteriorojunto con la aw.

Es útil en el caso de materiales que debenEs útil en el caso de materiales que debensometerse a molienda.

En algunos alimentos existe un límite legal.

Es un modo sencillo de controlar etapas deEs un modo sencillo de controlar etapas deelaboración.

Métodos para la determinación de phumedad

QUÍMICOS TITRIMÉTRICOSQUÍMICOS TITRIMÉTRICOS (KARL FISCHER)

INDIRECTOS CALOR SOLAMENTE

FÍSICOS - CALOR Y PFÍSICOS -DESECACIÓN

CALOR Y P REDUCIDA

DESECANTES Y P REDUCIDADIRECTOS

DESTILACIÓN (DEAN- STARK)( )


Método de Karl Fischer:El método Karl Fischer se utiliza como métodode referencia para numerosas sustanciasde referencia para numerosas sustancias.

A diferencia de otras técnicas, éste métodopuede detectar bajos niveles de agua libre,emulsionada y disuelta (mismos que no puedenser detectados por otros métodos, como el decrepitación).

Es capaz de medir niveles de agua tan bajoscomo 1 ppm o 0 0001 % en volumencomo 1 ppm o 0.0001 % en volumen.

Aconsejado para determinar cantidades deagua por debajo de 0.1% Ej.: grasas, productosdeshidratados.


Método de Karl Fischer:La determinación de agua por el método deKarl Fischer se basa en la reacción cuantitativaKarl Fischer se basa en la reacción cuantitativaentre el agua y un reactivo constituido pordióxido de azufre y iodo en presencia de metanoldióxido de azufre y iodo en presencia de metanoly una base orgánica como la piridina.

Actualmente los reactivos comerciales nocontienen piridina y la reemplazan por elimidazol.

La reacción no es estequiométrica por lo queLa reacción no es estequiométrica por lo quedebe valorarse frente a una cantidad conocida deagua.agua.


Método de Karl Fischer:El punto final se determina por la coloraciónpropia del exceso de yodo (o con la presencia depropia del exceso de yodo (o con la presencia dealmidón) o bien coulombimétricamente.

La principal diferencia entre ambos es que enel método volumétrico el reactivo titulador seagrega directamente a la muestra por medio deuna bureta.

Inversamente, con el otro método el reactivotitulador se genera electroquímicamente en latitulador se genera electroquímicamente en lacelda de titulación.

El método instrumental mide niveles de aguamucho más bajos que el método volumétrico.


Método de Karl Fischer:Existen aparatos comerciales basados en estemétodo donde se cuidan especialmente algunosmétodo donde se cuidan especialmente algunosdetalles operativos indispensables para lautilización del método especialmente referido autilización del método, especialmente referido ala humedad atmosférica y el secado de equipo.


Métodos indirectos - Desecación:La pérdida de peso observada representa lahumedad de la muestra y el peso obtenidohumedad de la muestra y el peso obtenidocorresponde a los sólidos totales.

con sustancia

inerteCalor solamente

inerte

sin sustanciasin sustancia inerte

Se utiliza en alimentos con alto contenidoacuoso y en aquellos que no se descomponen ay q q paltas temperaturas.


Métodos indirectos - Desecación:En alimentos líquidos es necesario evaporarpreviamente a Baño Maríapreviamente a Baño María.

Usualmente se calienta en estufa a 100-105ºCpor dos horas.

Se enfría y se pesaSe enfría y se pesa.

Se repite la operación hasta peso constantep p p


Métodos indirectos - Desecación:

Calor y presión reducidaSe utiliza en alimentos que contiene azúcaresespecialmente fructosa.p

Ej.: miel, mermeladas, jugos de fruta, frutast lsecas, vegetales.

El alimento se coloca en estufa parcialmenteEl alimento se coloca en estufa parcialmentedestapado alrededor de 5 hs a 70ºC y a unapresión de 25 a 100 mm de Hg, dependiendo dep g, pla naturaleza del material. Se repite la operacióna intervalos de 1 h hasta peso constante.p


Métodos indirectos - Desecación:

Desecantes y presión reducidaSe usa en alimentos que se descomponen ovolatilizan por calentamiento.p

Ej.: especias o productos que contienenit látilaceites volátiles

El método es similar al anterior pero se utilizaEl método es similar al anterior pero se utilizaH2SO4 como desecante y una P no mayor a 10mm de Hg.g


Expresión de resultados:Extracto seco: en materiales con altocontenido acuoso ( leche cremas cremascontenido acuoso ( leche, cremas, cremasheladas, bebidas alcohólicas y no alcohólicas,productos vegetales enlatados se determina porproductos vegetales enlatados, se determina porpesada los sólidos totales y se expresa enporcentaje.porcentaje.

Humedad: En productos sólidos o semisólidos, con menor contenido acuoso, seestablece que el contenido acuoso corresponde

l é did d d t l d ióa la pérdida de peso durante la desecación.

Debe indicarse la temperatura del ensayo.Debe indicarse la temperatura del ensayo.


Expresión de resultados:Causas de error

eliminación incompleta del agua

descomposición de azúcares por ladescomposición de azúcares por latemperatura inadecuada.

oxidación de aceites.

li i ió d t i i i látileliminación de otros principios volátiles.


Métodos directos – Dean Stark:Destilación azeotrópica: consiste en realizaruna destilación a reflujo con solventes nouna destilación a reflujo con solventes nomiscibles con el agua, de mayor punto deebullición y menor peso específico que ésta (Ej :ebullición y menor peso específico que ésta (Ej.:tolueno, heptano, xileno).

Normalmente se utiliza el tolueno que destilacomo un azeótropo con el agua, se condensanen el refrigerante y caen en la trampa de DeanStark donde se separan en dos capas por ladif i ddiferencia de peso.


Métodos directos – Dean Stark:


Métodos directos – Dean Stark:El agua se sitúa en la parte inferior del tubograduado que permite leer el contenido de aguagraduado que permite leer el contenido de aguaen forma directa, mientras el tolueno pasado ellímite de la trampa vuelve al balón de destilaciónlímite de la trampa vuelve al balón de destilación.


Métodos directos – Dean Stark:Alimentos en que se utiliza:

aquellos con gran contenido en fructosa,especias y productos que contienensustancias volátiles.

Causas de error:Causas de error:

Adherencia de agua a las paredes delg prefrigerante o tubo colector.

Eliminación incompleta del agua del materialEliminación incompleta del agua del materialen estudio.

Cenizas – Contenido mineralEl método general para la determinación de

i t t l i l l id ió d t d lcenizas totales, involucra la oxidación de toda lamateria orgánica presente en una cantidad

t t d d l t i texactamente pesada de la muestra previamentehomogeneizada y la posterior pesada de lascenizas blancascenizas blancas.

Para la incineración se usan cápsulas depporcelana, platino o cuarzo que deben tararse.

S l tSe pesa la muestra.

Se coloca la cápsula en el mechero y seSe coloca la cápsula en el mechero y secalienta suavemente para después iraumentando la llama de modo de carbonizar lamuestra.

Cenizas – Contenido mineral Luego se pasa a la mufla cuya temperatura

l t d b d 500 550ºCnormalmente debe ser de 500 - 550ºC.

Aún a esa temperatura puede haber pérdidasAún a esa temperatura puede haber pérdidasde cloruros y a temperaturas más altas sepueden volatilizar algunos otros elementos comopueden volatilizar algunos otros elementos comoNa, K, S y P o bien producirse fusiones.

Cenizas – Contenido mineralErrores en la determinación

Oxidación incompleta de la materiaorgánica (agregado de agua).orgánica (agregado de agua).

Descomposición de sales con liberación deCO2, agua , HCl, etc..

Volatilización de ciertos elementosVolatilización de ciertos elementos.

Pérdidas mecánicas.

Determinación de blancos en caso de usarsustancias para favorecer la incineraciónsustancias para favorecer la incineración.

Determinación de Grasas La FAO y la OMS recomendaron que set i li l d t i d dtuviera amplio acceso a los datos apropiados decomposición de alimentos referidos a las grasas

l áli i b l t id dy que en los análisis sobre el contenido deácidos grasos de los alimentos y en laelaboración de bases de datos de nutrientes seelaboración de bases de datos de nutrientes seemplearan métodos normalizados y materialesde referenciade referencia.

En el sistema proximal de análisis, laspGRASAS se miden como la FRACCIÓN DELALIMENTO QUE ES SOLUBLE EN DISOLVENTESDE LÍPIDOS.

Determinación de Grasas El material extraído contiene una serie del dif t d t iclases diferentes de sustancias.

A efectos nutricionales, la medición de lasA efectos nutricionales, la medición de lasGRASAS TOTALES tiene un valor limitado.

No obstante, se sigue notificando confrecuencia y se mantiene en muchos requisitosd ti t d d l li t lde etiquetado de los alimentos y en lareglamentación sobre la composición de los

d t li ti iproductos alimenticios.

Determinación de Grasas

É Ó Los diversos MÉTODOS DE EXTRACCIÓNdisponibles permiten determinar como grasatodo el material soluble en el solvente que se usapara la extracción, además de la grasa

i t di h i l dpropiamente dicha, incluyendo: esteroles, ácidos grasos libres,, g ,pigmentos, carotenoides, clorofila, etc.

Por esta razón los resultados de éste análisisPor esta razón, los resultados de éste análisisse informan frecuentemente como GRASACRUDA o EXTRACTO ETÉREOCRUDA o EXTRACTO ETÉREO.

Determinación de Grasas

CONTINUO

DIRECTOSGRAVIMÉTRICO

VIA SECA

BUTT

VIA SECADISCONTINUO

SOXHLET

VOLUMÉTRICO HIDRÓLISIS ALCALINA (ROSE

CON ATAQUE PREVIO

DE GERBER ALCALINA (ROSE-GOTTLIEB)

HIDRÓLISISPREVIOGRAVIMÉTRICO

VIA HÚMEDA

HIDRÓLISIS ÁCIDA: (SCHMIDT-

SONDZYNSKI MODIFICADO)MODIFICADO).

HIDRÓLISIS COMBINADA:COMBINADA: ALCALINA Y

ÁCIDA.

Determinación de GrasasMétodos de extracción

É Ó Los diversos MÉTODOS DE EXTRACCIÓNdisponibles permiten determinar como grasatodo el material soluble en el solvente que se usapara la extracción, además de la grasa

i t di h i l dpropiamente dicha, incluyendo: esteroles, ácidos grasos libres,, g ,pigmentos, carotenoides, clorofila, etc.

Por esta razón los resultados de éste análisisPor esta razón, los resultados de éste análisisse informan frecuentemente como GRASACRUDA o EXTRACTO ETÉREOCRUDA o EXTRACTO ETÉREO.

Determinación de GrasasDeterminación de GrasasMétodos directos de extracción

Los lípidos no pueden ser extraídos conefectividad de los alimentos húmedos ya que ely qsolvente no puede penetrar fácilmente a lostejidos húmedos del alimento.j

El éter es higroscópico, se satura con el agua yse vuelve ineficiente para la extracción de lasse vuelve ineficiente para la extracción de lasgrasas.

El material a analizar debe ser totalmentedesecado en estufa y el solvente a usar debe seryanhidro para impedir que la presencia de aguaposibilite la extracción de material hidrosolubleque sería determinado junto con la grasa.


PRESECADOFrecuentemente esta determinación se lleva aFrecuentemente esta determinación se lleva acabo a continuación de humedad, sobre la mismamuestra desecadamuestra desecada.No secar las muestras a altas temperaturas ya que

l lí id li t íalgunos lípidos se ligan a proteínas y acarbohidratos, por consiguiente no se puedenextraer fácilmente con solventes orgánicosextraer fácilmente con solventes orgánicos.El secado en estufa de vacío a baja temperatura ol li fili ió d bl tla liofilización son recomendables ya que aumentanla superficie de área de la muestra y proporciona unamejor extracción de lípidosmejor extracción de lípidos.El secado en estufa a 105°C también es adecuado.


PRESECADOEl d h l t á fá il dEl secado hace que la muestra sea más fácil demoler para una mejor extracción.Rompe las emulsiones aceite-agua para que lagrasa se disuelva fácilmente en el solvente

á iorgánico.Ayuda a que se libere la grasa de los tejidos delos alimentos.La eficiencia de la extracción de los lípidos deplos alimentos secos depende del tamaño de lapartícula: una molienda eficiente es importante.


EXTRACCIÓN CONTINUALa muestra se coloca en un dedal poroso deextracción hecho de cerámica.Se añade el solvente al frasco de ebullición.Se produce una extracción continua debido alSe produce una extracción continua debido algoteo del disolvente que se condensa sobre lamuestra contenida en el dedal alrededor del cualmuestra contenida en el dedal, alrededor del cualpasa el vapor caliente del disolvente.Proporcionan una extracción eficiente y rápida.Pueden ocasionar canalizaciones en la muestraPueden ocasionar canalizaciones en la muestray, por tanto una extracción incompleta.


EXTRACCIÓN CONTINUA – Equipo tipo BUTT


EXTRACCIÓN INTERMITENTE – SOXHLET

En el aparato de extracción intermitente el tubode extracción está equipado con un sifónde extracción está equipado con un sifón.

Cada 5 o 10 minutos el solvente más la grasaCada 5 o 10 minutos, el solvente más la grasaextraída es arrastrado y se vuelca en el balóninferior.inferior.

La muestra estará así en contacto con nuevoLa muestra estará así en contacto con nuevosolvente (sin grasa) cada pocos minutos.


SOXHLET

Determinación de GrasasMétodos directos de extracción

EXTRACCIÓN INTERMITENTE – SOXHLET Se pesa el balón presecado Se pesa el balón presecado. Se coloca el solvente en balón.

Se ensambla el balón con el dispositivo de Soxhlet y elcondensador.

Se extrae la grasa de la muestra a una velocidad decondensación de 5 ó 6 gotas por segundo calentando elsolvente en el balón durante el tiempo estipulado.

Se seca balón con la grasa extraída en un horno desecado por aire a 100ºc por 30 minutos.

Se enfría el balón en un desecador.

Se pesa el balón con el resto de la muestra.

Determinación de GrasasMétodos directos de extracción

SOXHLET

www.cenunez.com.ar

SOXHLETSOXHLET

http://www.biol.unlp.edu.ar/bromatologia/tp.htm


SOXHLET



Alimentos en que se emplea: cereales yproductos derivados carnes vegetales y nuecesproductos derivados, carnes, vegetales y nueces.

Expresión de resultados: se puede expresar enExpresión de resultados: se puede expresar enbase seca o en base húmeda:

para expresarlo en base húmeda (muestraoriginal) se debe tener en cuenta el contenidooriginal) se debe tener en cuenta el contenidode humedad determinado previamente.



Errores de la determinación:

extracción de materiales no lipídicos pordisolución de estos en el agua proveniente delalimento no deshidratado o del solvente noanhidro.

extracción incompleta: uso de solventes,aparatos o tiempos no adecuadosaparatos o tiempos no adecuados.

descomposición u oxidación (por calor yaire) del material en extracción.


EQUIPOS SEMIAUTOMÁTICOS

La extracción viene realizada de acuerdo almétodo de Soxhlet mejorado según Randall.j g

Operan en dos fases mas una de recuperacióndel solvente destilado y permiten:del solvente destilado y permiten:

reducir los tiempos de extracción (solventep (caliente),

salvaguardar la contaminación atmosférica salvaguardar la contaminación atmosférica,

reducir el costo de los análisis.


EQUIPOS SEMIAUTOMÁTICOS

Determinación de GrasasDeterminación de GrasasMétodos con ataque previo

¿Cuándo se usan?

Se usan cuando los métodos gravimétricos porextracción seca no son aconsejablesextracción seca no son aconsejables.

Esto puede deberse a la presencia de proteínasEsto puede deberse a la presencia de proteínasy elevadas cantidades de glúcidos puede impedirla extracción total de la grasa presente en algunosla extracción total de la grasa presente en algunosalimentos, especialmente productos lácteos.

En alimentos con elevado contenido acuoso.


FUNDAMENTO

Los sólidos que rodean a los glóbulos degrasa de algunos alimentos son destruidos congrasa de algunos alimentos, son destruidos conagentes ácidos o alcalinos para permitir lacoalescencia y posteriorcoalescencia y posterior

medida volumétrica de la grasa (métodosmedida volumétrica de la grasa (métodosbutirométricos),

la extracción por solventes mediantetécnicas gravimétricas.g


Métodos gravimétricos por extracciónhúmeda:húmeda:

Método por hidrólisis alcalina (Rose-Gottlieb, método de referencia)

Método por hidrólisis ácida: (Schmidt-Sondzynski modificado)Sondzynski modificado).

Método por hidrólisis combinada: alcalinapy ácida.


MÉTODO DE ROSE-GOTTLIEB

En este método, una cantidad exactamentemedida o pesada de la muestra se trata conpalcohol etílico e hidróxido de amonio y se extraeposteriormente la grasa por agitación con éteretílico y éter de petróleo, en tubo de Rörig ofrasco de Mojonnier.



Los volúmenes etéreos conteniendo la grasadisuelta se vuelcan o sifonan a un balónpreviamente tarado.

Se hacen cuatro o cinco extracciones y luegoSe hacen cuatro o cinco extracciones y luegose evaporan los solventes y se determina lagrasa extraída por pesadagrasa extraída por pesada.

El alcohol etílico, soluble en agua y éter,, g y ,permite que este último entre en contacto másíntimo con la grasa.



En los productos lácteos permite además laprecipitación de la caseína en forma muyp p yfinamente dividida y por consiguiente la rápidadisolución de ésta en el hidróxido de amonio.

El éter de petróleo reduce la solubilidad del aguaen el éter etílico y previene la extracción por el éteren el éter etílico y previene la extracción por el éterde materiales hidrosolubles.

Alimentos en que se emplea: leche, lechecondensada, leche en polvo, helados, dulce deleche, crema.


MÉTODO DE HIDRÓLISIS ÁCIDA

Este método se diferencia fundamentalmentedel anterior en que el ataque previo se realiza conq q pácido clorhídrico, también en medio alcohólico.

Se calienta la mezcla y la proteína se disuelve Se calienta la mezcla y la proteína se disuelveen el medio ácido y la porción lipídica se separaen la parte superioren la parte superior.

Se prosigue la determinación del mismo modop gque en el método por hidrólisis alcalina.


MÉTODO DE HIDRÓLISIS ÁCIDA

La hidrólisis ácida es menos aconsejable queel método de Rose-Gottlieb si el materialcontiene una proporción elevada de azúcar.

Alimentos en que se emplea: pan pastasAlimentos en que se emplea: pan, pastas,productos de panificación, productos de lapesca huevos etcpesca, huevos, etc.


MÉTODO DE HIDRÓLISIS COMBINADA

Se realiza la digestión en primer lugar conhidróxido de amonio y después de neutralizar,y p ,con ácido clorhídrico.

El resto del procedimiento es igual al yaEl resto del procedimiento es igual al yamencionado y la determinación de la grasa estambién gravimétricatambién gravimétrica.

Determinación de GrasasMétodos con ataque previo

UNIDADES DE HIDRÓLISIS



La unidad de hidrólisis permite hidrolizarvarias muestras simultáneamente.

La hidrólisis se puede realizar en ambienteácido o en ambiente básico a temperaturaácido o en ambiente básico a temperaturacontrolada.

La muestra hidrolizada se filtra y se lava conagua desionizada para eliminar cualquier rastrog p qde ácido o de álcali; se somete después a laextracción por solvente.



Ver video en http://www.youtube.com/watch?v=jkxD5Tvt9Is


MÉTODO DE GERBER - VOLUMÉTRICO

Consiste en disolver la fracción proteica pormedio de un ácido para dejar la materia grasa enmedio de un ácido para dejar la materia grasa enlibertad y poder reunirla por centrifugación.

Se utiliza H2SO4 de densidad 1,82 que rompe elglóbulo graso disolviendo la caseína y alcoholglóbulo graso disolviendo la caseína y alcoholamílico que es ayuda a romper la emulsión,antiespumígeno y previene la carbonización de laantiespumígeno y previene la carbonización de lamateria orgánica


MÉTODO DE GERBER


Tubo que comunica por unextremo con un vástagoaplanado graduado queaplanado, graduado quetermina en una pequeñacámara.

Un extremo con una boca quese cierra mediante un tapón dese cierra mediante un tapón degoma que puede enroscarsemás o menos profundamente.

Cada graduación gruesacorresponde a 1 % de grasa.p g


MÉTODO DE GERBER

Alimentos en que se emplean: leche, lechedescremada cremas etcdescremada, cremas, etc.

El empleo de estos métodos para el análisis El empleo de estos métodos para el análisisde cremas requiere del uso de butirómetrosespecialmente calibrados al efecto.especialmente calibrados al efecto.

Determinación de ProteínasDeterminación de Proteínas La determinación de la CANTIDAD DEPROTEÍNA d li t ill l lPROTEÍNA de un alimento no es sencilla y el valorobtenido en cada caso depende del MÉTODOutilizadoutilizado.Muchos ensayos dependen de la PRESENCIA DEUNA DETERMINADA CADENA LATERALUNA DETERMINADA CADENA LATERALAMINOACÍDICA (Lowry, Biuret).

los resultados analíticos se veráncondicionados por la proporción delaminoácido en cuestión en las proteínassometidas al ensayo y necesitarán ser

f id l t í tá dreferidos a alguna proteína estándar.Otros métodos se basan en la determinación delcontenido de NITRÓGENO TOTAL (Kjeldahl).

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasExisten numerosas fuentes de NITRÓGENONO PROTEICO que pueden interferir en algunosmétodos de análisis:

aminoácidos libres, péptidos pequeños,ácidos nucleicos fosfolípidosácidos nucleicos, fosfolípidos,aminoazúcares, porfirina, algunasvitaminas, alcaloides, ácido úrico, urea,vitaminas, alcaloides, ácido úrico, urea,iones amonio, etc.

Otras fuentes de interferencia pueden ser losotros macronutrientes presentes en losli t hid t d b lí idalimentos como hidratos de carbono y lípidos.

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasEs un método oficial descrito en múltiplesnormativas: AOAC, ISO, Farmacopeas y distintasDirectivas Comunitarias.

Se basa en los siguientes supuestos:

la proporción de nitrógeno no proteínico enun producto alimenticio es demasiado

ñ i ifi tipequeña para ser significativa,

una determinación del contenido denitrógeno total (refleja con suficiente precisiónel contenido de proteína del alimento,

la proporción que representa el nitrógenoen la mayor parte de las proteínas alimenticiasen la mayor parte de las proteínas alimenticiases de 16%.

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasFUNDAMENTO

Involucra la conversión del nitrógeno presentea sulfato de amonio por DIGESTIÓNa sulfato de amonio por DIGESTIÓN,DESTRUCCIÓN OXIDATIVA O MINERALIZACIÓNcon ácido sulfúricocon ácido sulfúrico.

Posteriormente el sulfato de amonio seÓdescompone por ALCALINIZACIÓN con

hidróxido de sodio y DESTILACIÓN del amoníacoliberado captándolo en una solución ácida.

Finalmente se realiza una VALORACIÓN delFinalmente se realiza una VALORACIÓN delamoníaco.

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasEl ácido sulfúrico OXIDA LA MATERIAORGÁNICA bi l iORGÁNICA y se combina con el amonioformado. Los elementos carbono e hidrógeno seconvierten en dióxido de carbono y agua.Durante la digestión se libera el nitrógenoproteico para formar iones de amonio.proteico para formar iones de amonio.Esta determinación incluye todo el nitrógenoreducido presente ( NH2 y =NH) de modo quereducido presente (-NH2 y =NH), de modo quelos compuestos amoniacales, urea yaminoácidos libres son también valoradosaminoácidos libres son también valorados. El uso de perlas de vidrio sirve de núcleo parala formación de burbujas.

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasECUACIONES

Digestión: n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores CO2 + (NH4)2SO4 + SO2 Neutralización y destilación (NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O NH3 + H3BO3 NH4+ + H2 BO3- Titulación H BO - + H+ H BOH2BO3 + H+ H3BO3

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasUN POCO DE HISTORIA

En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahldesarrolló el proceso básico del conocidodesarrolló el proceso básico del conocidométodo actual de análisis de proteínas por elmétodo Kjeldahl más propiamente para analizarmétodo Kjeldahl, más propiamente, para analizarnitrógeno orgánico.

El método original fue sufriendo luego algunasmodificaciones.

Wilforth (1885)

Gunning (1889)

Arnold Arnold

Winkler

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasUN POCO DE HISTORIA

En el método original la digestión se efectuabacon una mezcla de ácido sulfúrico y anhídridocon una mezcla de ácido sulfúrico y anhídridofosfórico y la oxidación se completaba mediantela adición de permanganato de potasiola adición de permanganato de potasio.

Las modificaciones del método que hanresultado más útiles emplean:

óxido de mercurio como catalizador de óxido de mercurio como catalizador deoxidación (Wilfoth). K SO para aumentar el punto de K2SO4 para aumentar el punto deebullición del ácido sulfúrico (Gunning). CuSO4 también como catalizador deoxidación (Arnold).

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasUN POCO DE HISTORIA Los catalizadores permiten acortar el tiempo dedigestión y actúan como transportadores de O2.g y p 2Cuando se usa Hg como catalizador, éste debeser precipitado mediante el agregado de tiosulfatoser precipitado mediante el agregado de tiosulfatode sodio para liberar el NH3. Ot difi ió li t t d l Otra modificación ampliamente aceptada es laintroducida en la etapa de destilación propuestapor Winkler:por Winkler:

originalmente se utilizaba ácido sulfúricol d t l ívalorado para captar el amoníaco, titulando posteriormente su exceso conpNaOH valorado.

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasUN POCO DE HISTORIA La modificación consiste en:

recibir el NH sobre una solución de ácidorecibir el NH3 sobre una solución de ácidobórico,valorarlo directamente con soluciónvalorada de H2SO4 (Winkler) o HCl.

Ventajas:la solución de ácido bórico no necesitala solución de ácido bórico no necesitaser exactamente medida, eliminando loserrores en la medición del ácido valorado enerrores en la medición del ácido valorado enel colector y por otra parte sólo se requiereuna solución valorada H2SO4 o HCl.una solución valorada H2SO4 o HCl.

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasESQUEMÁTICAMENTE

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasEQUIPO DE KJELDAHL

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasUNIDADES DE DIGESTIÓN Y DESTILACIÓN

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasALGUNOS EQUIPOS Los equipos mas modernos vienen con unsistema de EXTRACCIÓN Y NEUTRALIZACIÓN DEGASES:

una unidad “Scrubber” que bloquea el una unidad Scrubber que bloquea elpaso y neutraliza las condensacionesácidas,ácidas, una bomba de recirculación de agua queproporciona un gran caudal de vacío para laproporciona un gran caudal de vacío para laaspiración de los gases.

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasUNIDADES DE DIGESTIÓN, SCRUBBER YBOMBA

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasDESTILADORES

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasDESTILADORES Y TITULADORES

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasVENTAJAS DEL MÉTODO Apropiado para varios tipos de productos.Alta confiabilidadAlta confiabilidad.Usado como método de referencia.

DESVENTAJAS DEL MÉTODODESVENTAJAS DEL MÉTODOInterfieren compuestos nitrogenados noproteicos.Uso de catalizadores tóxicos o caros.Elección del factor de conversión.

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasFACTOR DE CONVERSÓN El contenido porcentual promedio de N en lasproteínas de diversos alimentos es de 16%.pEl factor para convertir N en proteínas seríaentonces 100/16 = 6 25entonces 100/16 = 6,25.Este factor general de conversión no es sin

b t l t í d iembargo exacto, ya que las proteínas de origenanimal contienen generalmente menos nitrógeno ylas de origen vegetal máslas de origen vegetal más.Así, el factor de conversión para la proteína delt i 5 7 l d d t lá t 6 38trigo es 5,7 y para la de productos lácteos es 6,38.

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasFACTOR DE CONVERSÓN Actualmente se conoce el contenido de N, y porlo tanto el factor apropiado, de una gran cantidadp p , gde productos agrícolas.Debido a la confusión que podría derivarse delDebido a la confusión que podría derivarse delhecho de utilizar el factor general de conversión6,25 o el específico para la proteína en estudio6,25 o el específico para la proteína en estudio

Es necesario aclarar siempre en losinformes el factor de conversión utilizadoinformes el factor de conversión utilizadopara el cálculo de proteínas.

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasFACTOR DE CONVERSÓN

Determinación de ProteínasDeterminación de ProteínasCÁLCULOS

%N = V x N x 14 x 100%N V x N x 14 x 1001000 p

%N = V x N x 0,014 x 100pp

V: mL de ácido N: normalidad del ácidoP: gramos de muestraP: gramos de muestra0,014: equivalente volumétrico del N

Determinación de FibraDeterminación de FibraTécnica para determinar Fibra Dietaria Total -Método enzimático gravimétrico (AOAC 985.29)

Las muestras por duplicado previamenteLas muestras, por duplicado, previamentedesecadas deben desgrasarse si el contenido delípidos es igual o mayor a 10%.p g y

Se gelatinizan con Termamyl (alfa amilasat t bl ) l di i i ti ttermoestable) y luego se digieren enzimaticamentecon proteasa y amiloglucosidasa para eliminarproteínas y almidónproteínas y almidón.

Cuatro volúmenes de etanol se adicionan paraprecipitar la fibra dietaria soluble.

El residuo total se filtra se lava con etanol 78%El residuo total se filtra, se lava con etanol 78%,etanol 95% y acetona.

Determinación de FibraDeterminación de FibraDespués de secado se pesa el residuo.

Un duplicado se emplea para determinar deproteínas y otro se incinera a 525º C y se empleaproteínas y otro se incinera a 525 C y se empleapara cuantificar cenizas.

Fibra dietaria total = peso del residuo – peso(proteína + cenizas)

Determinación de Hidratos deDeterminación de Hidratos de carbono

En general se determinan por diferenciaconociendo los otros componentes.p

H de C=humedad-proteínas-grasas-cenizas-fibra

Determinación de Hidratos deDeterminación de Hidratos de carbono

En general se determinan por diferenciaconociendo los otros componentes.p

Se pueden determinar por Métodos FísicosIndirectos:Indirectos:

RefractometríaPolarimetríaAerometrías

Se pueden determinar por Métodos FísicosIndirectos:Indirectos:

VolumetríaGravimetríaGravimetría

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