RCINBIOREAGR. ACTUAL ANALYSIS. ŁOT . £07700. te0 £L„,100 g 4U __ Cesium . C hioride. SgHR «* ** 0Mi>nUrtu?«!

POLSKIE ■ TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE

Advances in BiochemistryTOM 40, NR 3, 1994

Szlak sfingomielinowy ..................... 130Geny receptorów glutaminianu . . 135 Białka kodowane przez HBV . . . 143Apoptoza ................................................150Telomery a starzenie się komórek 161 Oddziaływanie asODN z mRNA . . 166A p i r a z y ................................................... 174Ekdysteroidy owadzie ..................... 181

http://rcin.org.pl

BIOREAGRACTUAL ANALYSIS. ŁOT £07700

t e * 0*£L„

,100 g 4U_ _ Cesium C h i o r i d eSgHR «* ****** 0****Mi>nUrtu?«!.<'« t'A fCij5H r r *''*

“■ 1

MOREAGENTy j ^K f^N A L Y SiS . LOT D30/I>-1

Biospecyficzne czyste i dokładnie oznaczone J T B a k e rULTRAPURE BIOREAGENTS

Wysoka i starannie oznaczona czystość, bez zanieczyszczeń aktywnych biologicznie - to szczególna cecha ULTRAPURE BIOREAGENTS. Stosując je w badaniach molekularno-biologicznych ogranicza się zakłócający wpływ zanieczyszczeń wprowadzanych z odczynnikami i w ten sposób unika się powtarzania oznaczeń. Równocześnie znacznie ułatwione jest wykrywanie możliwych błędów doświadczalnych, a wyniki pomiarów zyskują na precyzji.

ULTRAPURE BIOREAGENTS posiadają dokładnie oznaczone wszystkie cechy ich aktywności biologicznej. Jednoznacznym dowodem ich jakości jest świadectwo analizy widniejące na etykiecie każdego opakowania,

Program i bezpłatne broszury: S. W ITKO-EUROCOLOR, skr. poczt. 46, 90-980 Łód ź-7 , T e l./F a x (042) 84 46 09, 81 31 39, 81 31 40

v

K w arta !n ik , ,Postępy B ioch em ii" w ydaw any z pom ocą finansow ą K o m ite tu Badań Naukow ych.

J.T.BakerBAKERBOND ABxoczyszcza wszystkie przeciwciała z każdej matrycyOczyszczanie IgG i IgM z podwójnie produkującym hybrydoma

Warunki analizyKolumna:

Warunki analizy

Faza ruchoma:

Gradient: Przepływ łazy: Ciśnienie: Detekcja:Piki:

Próba:Czystość IgM:

BAKERBOND ABx 4,6 x 250 mm, 5 m A = 10 mM MES, pH 6,0 B = 250 mM KH2PO,, pH 6,8 0 % B 10 min.1 ml/min.68 barUV przy 280 nm; AUFS patrz +1. albuminy, transferyna2. IgG3. IgGPiyn z hodowli tkankowej 0,5 ml2. > 95%3. > 95%

Faza ruchoma:

Gradient: Przepływ fazy: Ciśnienie: Detekcja:Piki:

Próba:Czystość IgM:

BAKERBOND ABx4,6 + 250 mm, 5 /xm A = 10 mM KH,P04, pH 6,0 B = 500 mM KFUPO., pH 6,8 0% B do 50% B w 1 h 1 ml/min.68 barUV przy 280 nm; AUFS patrz+1. albuminy, transferyna2. białka słabo związane3. IgM - 4 . IgMPłyn wysiękowy myszy 0,5 ml3. > 95%4. > 95%

+ Pik 1 zawiera 90-95% niezatrzymywanych na kolumnie białek należących do klasy IgG. Czułość detektora dla wszystkich pozostałych pików została zwiększona 10 razy w celu uwidocznienia białek zatrzymywanych na kolumnie oraz przeciwciał monoklonalnych.

Faza BAKERBOND ABx zawiera mieszane jonowymienne grupy funkcyjne wbudowane do żelu krzemionkowego (5 /¿m, 15 ^m, 40 firn), dzięki czemu ma ona szczególną właściwość wiązania różnych klas, podklas, fragmentów i koniugatów wszystkich Ig zawartych w płynach biologicznych. Równocześnie transferyna, albuminy i inne białka nie są wiązane podobnie jak czerwień fenolowa. Odzyski określane wagowo oraz na podstawie aktywności biologicznej białek wynoszą powyżej 95%. ABx ma pojemność 150 mg/g. Trwałość kolumn przekracza 1000 godzin użytkowania.

Można otrzymać bezpłatną broszurę: EUROCOLOR Chemikalia Laboratoryjne skr. poczt. 46, 90-980 Łódź-7, tel. (042) 813140, 844614, fax (042) 844609http://rcin.org.pl

WYDAWCAE d ito rP O L S K IE T O W A R Z Y S T W O B IO C H E M IC Z N E P o lish B iochem ica l Society ul. P a s te u ra 302-093 W arsz aw a P o la n d(2) 658-20-99 fax: (22) 22-45-52

Drukarnia Naukowo-Techniczna Mińska 6503-828 Warszawa

REDAKCJAEditorial Board R E D A K TO R N A C ZELN Y E ditor in chief Z O FIA Z IE L IŃ SK A tel. 31-24-03 R ED A K TO R ZY EditorsG R A ŻY NA PA LA M A RC ZY K tel. 658-47-02A N D R ZEJ JE R Z M A N O W S K I tel. 659-70-72 w. 1217 A NNA SZA K IEL tel. 23-20-46JO LA N TA G RZY BO W SK A tel. 13-05-15

R E C EN Z E N C I ZESZY TU Referees of this issue JO LA N TA BARAŃSKA (W arszawa)BR O N ISŁA W C Y M B O R O W SK I(W arszawa)BARBARA C ZA RTO RY SK A (W arszawa)A N D R ZEJ JE R Z M A N O W S K I (W arszawa)JERZY K A W IAK (W arszawa)TERESA Ł O C H (W arszawa)KA TARZYNA N A ŁĘC Z (W arszawa)ADAM N O W O SŁA W SK I (W arszawa)G RAŻYNA PALA M A RC ZY K (W arszawa)EW A SIK O RA (W arszawa)TO M A SZ T W A R D O W SK I (Poznań)Z O FIA Z IE L IŃ SK A (W arszawa)

ADRES REDAKCJIA ddressR E D A K C JA K W A R T A L N IK A„ P O S T Ę P Y B IO C H E M II”IN S T Y T U T B IO L O G IID O Ś W IA D C Z A L N E Jim. M . N en ck ieg o P A Nul. P a s te u ra 302-093 W arsz aw atel (2) 659-85-71 w. 332fax: (22) 22-53-42telex: 81-48-92

s p i s t r e S ci CONTENTS

S fin g o rm e lin o w y szlak tra n s m is ji s y g n a łó wSphingom yelin pathway in signal transductionJA N IN A KW IATKOW SKA .................................................................... 130

G eny ko d u ją ce re c e p to ry jo n o tro p o w e g lu ta m in ia n uGlutamate receptor channe l-encoding genesDOROTA NO W ICKA ..............................................................................135

B ia łka p o w ie rz c h n io w e i rd z e n io w e H B V i ich ro la w ro z w o ju zapa len ia w ą tro b y ty p u BEnvelope and core proteins of HBV and their influence on the developm ent o f hepatitis BM AŁG O R ZATA SIDORKIEW ICZ, ANDRZEJ PŁUC IEN NIC ZAK 143

M e ch an izm y śm ie rc i p ro g ra m o w a n e j ko m ó re k (a p o p to zy )Mechanism s of the programmed cell death (apoptosis)EWA S IK O R A .............................................................................................. 150

T e lo m e ro w a h ip o te za s ta rze n ia się ko m ó re kThe telomere hypothesis of cell agingEWA JA R U G A ...........................................................................................161

M e c h a n iz m y d z ia ła n ia a n ty s e n s o w n y c h o lig o d e o k s y ry - b o n u k le o ty d ó wAntisense o ligodeoxyribonucleotides — mechanisms of action AR K A D IU S Z SZKLARCZYK .................................................................166

A p ira z y — enzym y k o n tro lu ją c e s tęże n ie w o ln y c h n u k le o - ty d ó w w k o m ó rka ch i tka n ka chApyrases — enzymes involved in the contro l o f nucleotide levels in cells and tissuesM IC H A Ł KOM OSZYŃSKI .................................................................... 174

E kd ys te ro id y o w a d z ie — b iosynteza, m e ta b o lizm i fu n k c jaEcdysteroids in insect: biosynthesis, metabolism and function KRYSTYNA GRZELAK .......................................................................... 181

http://rcin.org.pl

ARTYKUŁY

Sfingomielinowy szlak transmisji sygnałów

Sphingomyelin pathway in signal transduction

JANINA KWIATKOWSKA*

Spis treści:

I. Przemiana sfingomielinII. Ceramid jako przekaźnik wtórnyIII. Rola sfingozyny w regulacji procesów biologicznychIV. Pochodne sfingozyny a gospodarka wapniowa

Wykaz stosowanych skrótów: C aC M — kom pleksw apń/kalm odulina; D A G — diacyloglicerol; E G F — nabłonkow y czynnik wzrostu; ER — retikulum endoplaz- m atyczne; In sP 3 — inozytolotrisfosforan; M AP — białko aktywow ane przez mitogen (mitogen activated protein); M A PK — kinaza MAP; M AP-2 — białko związane z m ikro- tubulam i-2, (microtubules-associated protein-2), NFx/J— czynnik transkrypcyjny, aktywow any przez T N F a; Ix/?— inhibitor czynnika P K C — kinaza białkow a C; T N F— czynnik nekrozy now otw oru (tumor necrosis factor).

Fosfolipidy błon kom órkow ych są prekursoram i ważnych substancji regulatorowych. W generowaniu tych substancji biorą udział fosfolipazy, aktywow ane przez horm ony, neurotransm itery, cytokiny itp. Fos- folipaza A 2 uwalnia z fosfatydylocholin kwas arachi- donow y i inne prekursory prostaglandyn i leuko- trienów, a fosfatydylocholinowa fosfolipaza C-diacyloglicerol (DAG). DAG powstaje też z inozytolofos- fatydów pod wpływem fosfolipazy C. DAG aktywuje kinazę białkową C (PKC). Jednocześnie generowany jest też drugi przekaźnik wtórny, inozytolotrifosforan (InsP 3), który uczestniczy w mobilizacji w apnia i uwalnianiu go z retikulum endoplazm atycznego (ER).

O kazało się, że także sfingomieliny są prekursoram i przekaźników wtórnych: ceram idu, zasad sfingoinowych i ich pochodnych. Każdy z tych przekaźników m a wyodrębnione pole działania i swoiście reguluje określone procesy biologiczne. Przekaźniki te m odulują aktyw ność kinaz białkowych, różnicowanie i wzrost kom órek, agregację płytek krwi, funkcje obronne leukocytów, ekspresję genów, gospodarkę wapniową. W ykazano, że enzymy hydrolizujące sfingomieliny są

* Prof. d r hab., Zakład Biochemii Akadem ii Medycznej, ul. Chałubińskiego 10, 50-368 W rocław

Contents:

I. Sphingomyelin metabolismII. Ceramide as a second messengerIII. Role of sphingosine in regulation of biological processesIV. Sphingosine derivatives in calcium metabolism

pod kontro lą efektorów biologicznych, takich jak kalcytriol, interferon^, T N F, DAG.

W szystkie powyższe dane stały się podstaw ą do sform ułowania poglądu o funkcjonow aniu nieznanej do tąd drogi przekazu sygnałów w komórce, nazwanej szlakiem sfingomielinowym (sphingomyelin pathway)[1-4].

I. Przemiana sfingomielin w komórce

Sfingomieliny są zlokalizow ane głównie w zewnętrznej warstwie błon cytoplazmatycznych. W tej samej warstwie znajduje się też fosfodiesteraza sfingomielino- wa (EC 3.1.4.12), zwana sfingomielinidazą obojętną ze względu na optim um pH jej działania. P roduktam i hydrolizy sfingomielin są fosfocholina i ceram id (acylo- sfingozyna). Ceram id może być wykorzystany do re- syntezy sfingomielin. Reakcja przeniesienia reszty fos- focholiny z C D P-choliny na ceramid, katalizow ana przez cholinofosfotransferazę ceram idową (EC 2.7.8.3), jest głównym szlakiem syntezy sfingomielin w kom órkach. Ceram id może też ulegać deacylacji pod wpływem ceram idazy (deacylazy acylosfingozynowej, EC 3.5.1.23). Pow stają wtedy wolne kwasy tłuszczowe oraz zasady sfingoinowe. Zarów no ceramid, jak i wolne zasady sfingoinowe m ogą swobodnie wędrować przez błony i dalsza ich przem iana nie jest już ściśle zw iązana z w ew nątrzkom órkow ą, czy w ewnątrzbłono- wą lokalizacją odpowiednich enzymów. Acylotrans- feraza sfingozynowa (EC 2.3.1.24) może przekształcać sfingozynę i inne zasady w ceramid, kinaza — w fosfos- fingozynę, a fosfocholinotransferaza sfingozynowa (EC 2.7.8.10) — w sfingozylofosfocholinę. Schemat przem iany sfingomielin pokazano na rycinie 1.

Rozkład sfingomielin zachodzi nie tylko w błonach. W endosom ach i lizosomach znajduje się „kw aśna”

130 POSTĘPY BIOCHEMII 40 (3 ) , 1994http://rcin.org.pl

OH

Rye. 1. G łó w n y sz lak p rzem ian y sfingom ielin .

sfingomielinidaza, aktyw ow ana przez DAG. Wydaje się, że obydw a enzymy, hydrolizujące sfmgomieliny m ogą generować ceram id jako przekaźnik w tórny i że obydwa uczestniczą w szlaku transm isji sygnałów.

II. Ceramid jako przekaźnik wtórny

Początkow o wszystkie efekty biologiczne, tow arzyszące rozkładow i sfingomielin przypisywano sfingozy- nie, jej to bowiem używano w badaniach in vitro. Sfingozyna jest istotnie inhibitorem kinazy białkowej C i jest przekaźnikiem w procesach, regulowanych przez ten enzym. N atom iast w regulacji innych zjawisk bierze udział p roduk t acylacji sfingozyny, ceramid.

Badając m echanizm y różnicow ania kom órek pre- m ielocytarnych HL-60 stwierdzono, że sfingozyna w prow adzona do kom órek ham uje ich różnicowanie do m akrofagów , natom iast stymuluje przekształcanie do m onocytów . O ile pierwszy efekt jest związany z ham ow aniem kinazy C przez sfingozynę, o tyle różnicowanie m onocytarne przebiega drogą niezależną od PK C. Różnicowanie m onocytarne jest stym ulowane przez pochodne witam iny D, głównie kalcytriol, oraz przez interferony i T N F [3, 7, 8]. T N F a (kachety- na) i TNF^ (limfotoksyna) są cytokinam i o szerokim spektrum działania. M ogą grać rolę czynników wzrostu i różnicow ania, regulatorów aktywności leukocytów i limfocytów B, cytotoksyn itp. Obecnie uważa się, że w ich działaniu pośredniczy ceramid. T raktow anie kom órek prem ielocytarnych kalcyferolem prowadzi do aktywacji obojętnej sfingomielinidazy i generacji ceram idu. W tych doświadczeniach nie w ykazano

obecności wolnych zasad sfingoinowych. W odróżnieniu od ceram idu, wolna sfingozyna nie zwiększała efektywności subprogowych dawek calcytriolu [9]. Czas działania kalcyferoli jest długi. Przy dawce 100 nM kalcytriolu szczyt działania obserwuje się po dwu godzinach. Nie wyjaśniono, w jaki sposób przebiega sygnał między kalcytriolem a sfingomielinidazą. Nie jest wykluczone, że zachodzi indukcja syntezy enzymu, na co wskazywałby długi okres latencyjny. N atom iast interferon i T N F pobudzają wczesną, odw racalną hydrolizę sfingomielin [10]. Różnicowanie m onocytarne kom órek HL-60 zachodzi też po wprow adzeniu syntetycznego ceram idu w stężeniach 1-6 pM. S tosowano ceram idy o krótkich resztach acylowych, co umożliwia wnikanie do kom órek. O ptym alne stężenie ceram idu wynosi 20-1000 nM [9, 10].

N asuw ało się przypuszczenie, że ceramid działa podobnie jak inne przekaźniki wtórne, aktyw ując jakąś kinazę białkową. Istotnie, już pierwsze dośw iadczenia ze sfingozyną, w prow adzoną do kom órek raka nabłonka A431, wykazały związek między jej działaniem a fosforylacją receptora EGF. W iadom o, że reszta T hr 654 receptora ulega fosforylacji pod wpływem kinazy C. Zgodnie z oczekiwaniami, sfingozyna ham ow ała fosforylację tej reszty, ale jednocześnie stym ulow ała fosforylację innej reszty — T hr 669. Podobne zjawisko obserwow ano w hodowli fi- broblastów [11], Dalsze badania doprowadziły do wniosku, że fosforylacja T hr 669 jest pobudzana przez ceramid, a sfingozyna była substratem do jego syntezy. Syntetyczne ceramidy szybko i wydajnie stymulowały tę fosforylację, przy czym nie stw ierdzono ich rozpadu do wolnych zasad sfingoinowych. Przy w prow adzaniu sfingozyny działanie następow ało znacznie później niż po ceramidzie, przy czym tow arzyszył mu znaczny wzrost zawartości ceram idu [12]. Sprawę ostatecznie rozstrzygnęło wydzielenie z błon kinazy białkowej, aktywowanej przez ceramid i M g2 + . Katalizuje ona fosforylację receptora E G F na T hr 669, a także fosforylację syntetycznych peptydów, w których sekwencja wokół reszty treoniny była identyczna, jak w receptorze EGF. Aktywność tej kinazy w zrastała dw ukrotnie po potraktow aniu błon kom órek HL-60 przez T N F a. Towarzyszył temu spadek zawartości sfingomielin i dw ukrotny wzrost stężenia ceram idu w błonie. Nie obserwowano rozpadu innych lipidów.

Zarów no sfmgomieliny, jak i obojętna sfingomielinidaza i receptor E G F mieszczą się w zewnętrznych warstwach błony. Są też dane wskazujące, że kinaza aktyw ow ana przez ceramid jest integralnym białkiem błonowym. N astępujący przebieg szlaku sfingomielinowego jest więc topologicznie możliwy: T N F a -> receptor -> obojętna sfingomielinidaza -> ceramid -* kinaza białkowa -> fosforylacja substratów , m.in. receptora EG F. Rekonstrukcja tego szlaku w układzie bezkom órkowym potw ierdza wiarygodność schematu przedstawionego na rycinie 2.

POSTĘPY BIOCHEM II 40 (3 ) , 1994 131http://rcin.org.pl

INTERFE RONTNFDj EG F

KINAZA BIAŁKOWA • BI AŁ KA

Ryc. 2. S chem at sz laku sfingom ielinow ego . S M az a — o b o ję tn a sfingom ielin idaza; R — re c e p to r E G F .

A utorzy sądzą, że fosforylacja receptora E G F tą drogą jest stym ulow ana jedynie przez T N F a, a nie przez inne stym ulatory różnicow ania [2],

Inni autorzy sugerują, że istnieje też zależność między szlakiem sfmgomielinowym a aktywacją k inazy M AP, indukow aną przez TN F. Bakteryjna sfingom ielinidaza oraz syntetyczny ceramid, w prow adzone do kom órek, aktywowały kinazę M A P [M A P K ] w sposób porównyw alny z TN F. Nie wyjaśniono przebiegu tego szlaku, m ożna jednak sądzić, że kinazy aktyw ow ane przez ceram id znajdują się też w cytosolu. Ich substratem może być M A PK lub M AP [1].

W ydaje się, że funkcjonuje także inny mechanizm działania T N F przez szlak sfingomielinowy. T N F a stym uluje aktywację czynników transkrypcyjnych AP- 1 i N F x /f Przebieg aktywacji czynnika AP-1 jest znany. Po związaniu T N F a przez receptor TR 55 następuje aktywacja fosfolipazy C, swoistej wobec fosfatydylocholiny. Diacyloglicerol, uwolniony przez ten enzym, aktywuje kinazę C, k tóra stymuluje czynnik AP-1. PK C nie uczestniczy jednak w aktywacji czynnika NF>c/ł, aczkolwiek jest tu też potrzebna obecność DAG. Jak się okazało, DAG jest aktyw atorem we-

S M T N F « PC

©CER AMID

©DAG P K C

I©K IN A ZABIAŁKOWA

ii ?* '

K IN A Z A MAP

I®

1S M ►CERAMID

1©M A P

TRANSKRYPCJAGEN flW

INF*, II K/d

Ryc. 3. D rog i sz lak u sfingom ielinow ego , p o b u d z a n e przez T N F ,,. SM — sfingom ielina; P C — fosfa tydy loch ina; R — re c e p to r T N F.,; D A G — diacy log licero l; P K C — k in aza b ia łk o w a C; N F k/j — czynnik tran sk ry p cy jn y ; \ Kp — in h ib ito r czy n n ik a N F k/!; M A P — czynn ik ak ty w o w a n y przez m itogeny ; 1 — o b o ję tn a sfingom ielin idaza; 2 — fo sfa ty d y lo ch o lin o w a fosfo lipaza C; 3 — k w aśn a sf ingom ielin idaza (w /g 1, 2, 13).

w nątrzkom órkow ej, „kw aśnej” sfmgomielinidazy, zaś ceramid, przez nią uwalniany jest właściwym stym ulatorem czynnika N F xf3. Aktywacja polega na dysocjacji czynnika z połączenia z jego naturalnym inhibitorem , białkiem \-xf1 [13]. Sfingomielinidaza, aktyw ow ana przez DAG, jest glikoproteiną o masie 75 kD a i o p timum pH równym 4,5. Jest ona zlokalizow ana w endosom ach i lizosomach [14]. M ożna przypuszczać, że po związaniu T N F 2 z receptorem N F 55 zachodzi internalizacja receptora wraz z odcinkiem błony, zawierającym sfingomielinę i DAG — substrat i ak tyw ator kwaśnej sfmgomielinidazy. Wielu autorów uważa, że zaburzenia m etaboliczne, towarzyszące niedoborow i tej sfmgomielinidazy są, przynajm niej częściowo, następstwem niewydolności szlaku sfingomielinowego [4, 6].

Ceram id może więc pow stawać w kom órce dwiema drogami. W błonie cytoplazm atycznej generuje go obojętna, a wewnątrz kom órki — kw aśna sfingomielinidaza. Jak się wydaje, obydwie te drogi są pobudzane przez T N F a, co przedstaw iono na rycinie 3.

III. Rola sfingozyny w regulacji procesów biologicznych

Ceramidy, generowane ze sfingomielin, m ogą ulegać deacylacji z utworzeniem wolnych zasad sfingoinowych. Do naturalnie występujących zasad należą: sfinganina, 4-rrans-sfingenina, zw ana potocznie sfin- gozyną oraz 4-D -hydroksysfinganina (patrz Ryc. 4).

H 0 CHi ~ T — NH Sf ingozyna

Wszystkie te związki okazały się silnymi inh ib itorami kinazy białkowej C. H am ow anie PK C przez te zasady jest kom petycyjne względem naturalnych ak tyw atorów enzymu, DAG, C a2+ oraz estrów for- bolowych, nie jest zaś konkurencyjne względem substratu [4,15]. Sfingozyna ham uje też aktywację PK C przez lipidy [16]. Porów nując zasady o różnej dłlugo- ści łańcucha alkilowego stwierdzono, że najsilniej

Sfinganina

h 4-D-Hydroksysfinganina

Ryc. 4. N a tu ra ln ie w ystęp u jące zasad y sfingo inow e.

132 POSTĘPY BIOCHEM II 4 0 (3 ) , 1994http://rcin.org.pl

szymi inhibitoram i PKC są zasady o 18 atom ach C, a więc te występujące w sfmgomielinach [6], M echanizm inhibitacji nie jest dokładnie poznany. Sądzi się, że sfingozyna wiąże się z dom enam i regulatorowym i enzymu, a także ham uje jego translokację do błony.

Zasady sfingoinowe ham ują szereg funkcji fizjologicznych, których m ediatorem jest PKC, m.in. różnicowanie premielocytów do fenotypu makrofagowe- go [7], Sfingozyna ham uje sekrecję płytek krwi i drugą fazę ich agregacji, stym ulow aną przez kolagen, ADP, arachidonian, trom binę i czynnik aktywujący płytki. Nie wpływa przy tym na aktywność fosfolipazy C i generację DAG. H am uje fosforylację białka 40 kDA płytek, pobudzaną przez DAG i forbole [17]. W obecności zasad sfingoinowych w płytkach nie dochodzi do wzrostu pH, zw iązanego z fosforylacją nośnika N a +/ H + przez PK C [18]. Innym efektem działania sfingozyny jest ham ow anie wybuchu tlenowego leukocytów, wywołanego przez estry forbolowe i DAG. Zasady sfingoinowe ham ują w pełni sekrecję lakto- feryn z ziarnistości leukocytów obojętnochłonnych, lizozymu zaś — w 50%. Sfingozyna obniża cytotok- syczne właściwości limfocytów i ich zdolność niszczenia kom órek nowotworowych, zarów no konsty tutywną, jak i indukow aną przez interleukinę 2 [19],

H am ujące działanie sfingozyny na PK C oraz wszystkie związane z tym efekty biologiczne są uzależnione od obecności wolnej grupy N H 2. Jej acylacja znosi działanie, dlatego ceram idy nie m ają aktywności zasad sfingoinowych. Nie wszystkie jednak skutki działania sfingozyny są związane z ham owaniem PKC. Do takich zaliczyć należy wpływ na wiązanie tyreolibery- ny (TRH) z b łoną kom órek przysadki. Proces ten nie jest wrażliwy na estry forbolowe, ani na inhibitory PKC. Sfingozyna ham uje wiązanie 3[H]-m etylohis- tydynoTR H przez nienaruszone kom órki GH 3 oraz izolowane z nich błony. Sfingozyna w stężeniach 60-100 fiM wywołuje obniżenie powinowactwa recepto ra do TR H czemu towarzyszy wzrost K d z 1.1 do6.6 nM . Zachodzi także obniżenie sprawności wiązania (do 40% wartości kontrolnych), co wiąże się ze zmniejszeniem liczby receptorów na powierzchni błony. T akże to działanie zasad sfingoinowych wiąże się z obecnością wolnej grupy aminowej [20, 21]. Stwierdzono, że w obecności sfingozyny rośnie liczba receptorów E G F i zwiększa się powinowactwo do liganda w kom órkach ja jn ika chom ika chińskiego i ludzkich karcinom a A431 [22], Nie wyjaśniono, czy działanie to jest zw iązane z fosforylacją receptora, stym ulowaną przez ceramid.

IV. Pochodne sfingozyny a gospodarka wapniowa

Pod wpływem lipazy C powstaje DAG oraz In sP 3. Ten ostatn i stym uluje pośrednio (dzięki mobilizacji jonów wapnia) kinazy zależne od C a2+ i kalm oduliny (Ca/CM ). O dkrycie ham ującego działania sfingozyny

na PK C skłoniło badaczy do sprawdzenia, czy zasady sfingoinowe wpływają też na drogę stym ulow aną przez In sP 3. O kazało się, że ham ują one enzymy aktyw ow ane przez C a/C M . W obecności sfingozyny obserwowano znam ienne obniżenie aktywności kinazy lekkiego łańcucha miozyny mięśni gładkich, w ielofunkcyjnej kinazy białkowej oraz fosfodiesterazy, zależnych od kom pleksu C a/C M . Ham ow anie to jest konkurencyjne względem kalm oduliny. Podobnie jak w przypadku PKC, zachodzi kom petycja między sfingozyną a aktyw atorem enzymów. Sfingozyna działa na oczyszczone preparaty badanych enzymów, a także w nienaruszonych kom órkach. W kom órkach GH3 sfingozyna ham uje fosforylację białka M AP2, katalizow aną przez wielofunkcyjną kinazę C a/C M oraz fosforylację czynnika elongacji EF-2, zachodzącą pod wpływem kinazy III zależnej od C a/C M [23].

Bezpośredni wpływ sfingozyny na enzymy regulowane przez jony wapnia nie wyczerpuje jednak m ożliwości działania na gospodarkę wapniową. Zasady sfingoinowe m ają zdolność uw alniania jonów C a2 + z w ewnątrzkom órkowych magazynów. D odanie 30 fiM sfingozyny do hodowli kom órek mięśni gładkich powoduje wzrost stężenia C a2+ w cytoplazmie. Działanie to jest uw arunkow ane obecnością wolnej grupy aminowej. Działanie sfingozyny jest zauważalne już w stężeniu 0,5 fiM, 50% efekt uzyskuje się przy1,6 fiM, a pełny — przy 30 fiM. Doświadczenia przeprow adzane na izolowanych błonach retikulum endoplazm atycznego wskazują na to, że sfingozyna działa na te same kanały wapniowe, które są wrażliwe na In sP 3. Czy jednak w tym działaniu sfingozyna jest właściwym efektorem? Długi okres latencyjny jej działania, wyraźny dodatni wpływ A TP oraz brak działania w niskich tem peraturach, utrudniających procesy enzymatyczne, nasunęły przypuszczenie, że działa ra czej pochodna sfingozyny. Autorzy sugerują, że może nią być fosfosfingozyna [24],

Podobne wyniki otrzym ano badając wpływ sfingozyny na mobilizację wapnia w kom órkach trzustki i ślinianek. Sfingozyna w prow adzona do tych kom órek w dozach 10-100 ¿¿moli indukuje 10-krotny wzrost stężenia C a2+ w cytosolu. Efekt następuje po kilku m inutach w 37°. Mobilizacji wapnia nie ham owały inhibitory fosfolipazy C, generującej In sP 3, ani heparyna, k tóra selektywnie blokuje receptory InsP 3 w ER. Ponieważ po długotrwałym działaniu m aksymalnych ilości In sP 3 sfingozyna nie stym ulowała mobilizacji wapnia, przypuszcza się, że i w tych kom órkach oba efektory działają na te sam kanały w ER. Badając działanie różnych pochodnych sfingozyny stw ierdzono, że sfingozylofosfocholina działa natychm iastow o, niezależnie od tem peratury. Fosfosfingozyna, wbrew wcześniejszym przypuszczeniom, nie jest zapewne właściwym efektorem i działa podobnie jak sfingozyna [25].

Z aproponow ano następujący schemat działania szlaku sfingomielinowego w gospodarce wapniowej: ceramid, uwalniany pod wpływem sfingomielinidazy

POSTĘPY B IO C H EM II 40 (3 ) , 1994 133http://rcin.org.pl

ulega deacylacji. Sfmgozyna wędruje do błon ER i tu przechodzi dalszą przemianę. N ierozpuszczalny p ro dukt, przypuszczalnie sfingozylocholina, jest wychwytywany przez błonę ER i działa na kanały wapniowe [24, 25],

B adania nad szlakiem sfingomielinowym trwają. Już teraz m ożna stwierdzić, że pow stają w nim różnorodne przekaźniki w tórne o swoistych m echanizm ach działania. Przekaźniki te biorą udział w regulacji aktywności kinaz białkowych, mobilizacji wapnia i regulacji ekspresji genów.

Artykuł otrzymano 5 maja 1994 r.Zaakceptowano do druku 26 maja 1994 r.

Piśmiennictwo

1. R a i n e s M A , K o l e s n i c k R N , G o l d e s D W (1933) J B iol Chem 268: 14572-14575

2. D r e s s i e r K A, M a t h i e s S, K o l e s n i c k R N (1992) Science 255: 1715-1718

3. Z h a n g H, B u c k l e y N E , G i b s o n K, S p i e g e l S (1990) J B iol Chem 265: 76-81

4. H a n n u m Y, B e l l R M (1987) Science 235: 670-6745. M e r i l l A H J r , S e r e n i A M , S t e v e n s V L , H a n n u m

Y A, B e l l R M , K i n k a d e J M J r (1986) J B iol C hem 261: 12610-12615

6. M e r i l l A H J r , S t e v e n s V L (1989) Biochim B iophys A cta 1010: 131-139

7. K o l e s n i c k R N (1989) J B io l C hem 264: 7617-7623

8. O k a z a k i T, B e l l R, H a n n u m Y (1989) J B iol C hem 264: 19076-19080

9. O k a z a k i T, B i e l a w s k a A, B e l l R M , H a n n u m Y A (1990) J B iol Chem 265: 15823-15831

10. K i m M Y , L i n a r d i e C, O b e i d L, H a n n u m Y (1991) J B iol C hem 266: 484-489

11. F a u c h e r M, G i r o n e s N, H a n n u m Y A, B e l l R M, D a v i s R J (1988) J B iol C hem 263: 5319-5327

12. G o l d k o r n T, D r e s s i e r K A , M u i n d i J, R a d i n N S , M e d e l s o h n J, M e n d a l i n o D, L i o t t a D, K o l e s n i c k R N (1991) J Biol C hem 266: 16092-16097

13. S c h u t z e S, P o t t h o f K , M a c h l e i d t T, B e r k o v i c D, W i e g m a n n K, K r o n k e M (1992) Cell 71: 756-776

14. K o l e s n i c k R N (1987) J B io l Chem 262: 16759-1676215. W i l s o n E, O l c o t t M C, B e 11 R M , M e r i l l A H J r,

L a m b e t h J D (1986) J B iol Chem 2 61 :12616-1262316. O i s h i K, R a y n o r R L , C h a r p P A , K u o J F (1988) J Biol

Chem 263: 6865-687117. H a n n u m Y A, G r e e n b e r g C S , B e l l R M (1987 ) J Biol

Chem 262: 13620-1362618. S a n c h e z A, A l o n s o M T , C o l l a z o s J M (1988) Biochim

B iophys A c ta 938: 497-50019. W i l s o n E, R i c e W G , K i n k a d e R M J r , M e r i l l A H

J r , A r n o l d R P , L a m b e t h J D (1987) Arch B iochem Biophys 259: 204-214

20. W i n i c o w I, G e r s h e n g o r n M C (1988) J B iol C hem 263: 12179-12182

21. W i n i c o w I, C o r y R N , G e r s h e n g o r n M C (1990) E n d o cryno loyy 126: 1688-1672

22. D a v i s RJ , G i r o n e s N, F a u c h e r M (1988 ) J B io l Chem 263: 5373-5379

23. J e f f e r s o n A B , S c h u l m a n H (1988) J B io l C hem 263: 15241-15244

24. G h o s h T K , B i a n J, G i 11 D L (1990) Science 248: 1653- 1656

25. Y u l e D I , W u D, E s s i n g t o n T E , S h a y m a n J A , W i l l i a m s J A (1993) J B iol Chem 268 :12353-12358

Komunikaty Zarządu Głównego

W roku 1995 kolejny, XXXI, Zjazd Polskiego Towarzystwa B iochem icznego odbędzie się w W arszawie w dniach 6 -8 września. Pierwsze zaw iadom ienie C złonkow ie otrzymają w lis topadzie.

Z przyjemnością inform ujem y, że — wzorem lat ubiegłych — b iochem icy polskiego pochodzenia i Polacy pracujący w krajach byłego Zw iązku Radzieckiego mogą ubiegać się o pokrycie kosztów uczestnictwa w Zjeździe i pobytu w Warszawie. Serdecznie zapraszamy i prosim y o pow iadom ienie o tej m ożliw ości zainteresowanych ko legów . Zgłoszenia przyjm uje Pełnom ocnik Zarządu do kon taktów z kolegam i w krajach byłego ZSRR — profesor dr med. Marek Gniazdowski z Zakładu Chemii Ogólnej, Akadem ii Medycznej (ul. Lindleya 6, 90-131 Łódź, tel. 784 277) oraz Zarząd G łów ny P.T.Bioch. (ul. Pasteura 3, 0 2 -0 9 3 W arszawa).

134 POSTĘPY BIOCHEMII 4 0 (3 ), 1994http://rcin.org.pl

Geny kodujące receptory jonotropowe glutaminianu

Glutamate receptor channel-encoding genes

DOROTA NOWICKA*

Spis treści:

I. WstępII. Technika klonowania genów kodujących receptory jo

notropoweIII. Receptor AM PAIV. Receptor kainianowyV. Receptor N M D AVI. Receptory jonotropowe glutaminianu w chorobach neu-

rodegeneracyjnychVII. Uwagi końcowe

Contents:

I. IntroductionII. Glutamate receptor gene cloningIII. AM PA receptorIV. Kainate receptorV. N M D A receptorVI. Glutamate receptor channels in neurodegenerative dise

asesVII. Final remarks

Wykaz stosowanych skrótów: EAA — excitatory aminoacids, am inokw asy pobudzające; LTP — long term potentiation, długotrw ałe wzmocnienie synaptyczne; LTD — long term depression, d ługotrw ałe osłabienie synaptyczne; G luR — glutamate receptor, receptor glutam inianu; N M D A — N- metyl-D-aspartate, kwas N -m etylo-D -asparaginow y; AM PA— alfa-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid, kwas alfa-am ino-3-hydroksy-5-m etylo-4-izoksazolopropio- nowy; cA M P — adenosine-3',5'-cyclophosphate, cykliczny adenozynom onofosforan; L-AP-4 — L-2-amino-4-phospho- nobutanoic acid, kwas 2-amino-4-fosfonomasłowy; nAChR— nicotinic acetylcholine receptor, receptor nikotynow y dla acetylocholiny; G A BA a R — gamma-aminobutyric acid receptor, receptor kw asu gam m a-am inom asłow ego; PCR — polymerase chain reaction, reakcja łańcuchowa polimerazy; KA— kainic acid, kwas kainowy, KYN — kynurenic acid, kwas kynureninow y; 7-C1-KYN — 7-Cl-kynurenic acid, kwas 7-chloro-kynureninow y; C P P — 3-(( + )-2-carboxypipera- zin-4-yl)-propyl-l-phosphonate, kwas 3-(2-karboksypipera- zyno-4-ilo)-propylo-l-fosfonow y; APV — D-( — )-2-amino- 5-phosphonovalerate, kwas 2-amino-5-fosfonowalerianowy; M K-801 — dizocilpine, D-5-methyl-10,11 ,dihydro-5H- -dibenzo[a,d]cyclohepten-5-10-imine maleate, m aleinian 5- -m etylo-10,11 -dihydro-5H-dibenzocyklohepteno-5,10-iminy.

I. Wstęp

W połowie lat 50-tych opublikow ano prace w ykazujące, że glutam inian i asparaginian, am inokwasy powszechnie występujące w białkach, podane obw odow o wywołują drgaw ki u zwierząt laboratoryjnych [1]. W krótce potem ukazało się wiele doniesień wykazujących działanie glutam inianu i asparaginianu w ośrodkowym układzie nerwowym [2], jednak dopiero

* M gr, P racow nia H odow li K om órek i Tkanek, Insty tu t Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, 02-093 W arszawa, ul. P asteu ra 3

w ostatnich latach uznano je powszechnie za neuro- przekaźniki [3-5] i określa się jako tzw. am inokwasy pobudzające (EAA — excitatory aminoacids). Obecnie uważa się nawet, że wszystkie neurony — a także i niektóre kom órki glejowe — są wrażliwe na działanie am inokwasów pobudzających, co świadczyć może0 szczególnie istotnej roli tego systemu neuroprzekaź- nikowego.

Zm iany przekaźnictwa glutam inianowego leżą p ra w dopodobnie u podstaw plastyczności synaptycznej1 neurotoksyczności. Przykładam i procesów uznaw anych za przejawy plastyczności układu nerwowego są: długotrw ałe wzmocnienie synaptyczne (LTP — long term potentiation) w hipokam pie i długotrw ałe osłabienie synaptyczne (LTD — long term depression) w m óżdżku, polegające odpow iednio na wzroście lub spadku efektywności synaps pod wpływem specyficznego d ra żnienia neuronu prądem o określonej częstotliwości [6-8]. Ponieważ uważa się, że uczenie i zapam iętyw anie polega na trwałych zm ianach w wydajności synaps, wspom niane powyżej zjawiska m ogą naśladow ać zachodzący w mózgu proces grom adzenia i przechowywania informacji. D latego badanie mechanizmów LTP i LTD oraz udziału w nich receptorów EAA może dostarczyć informacji o roli tych ostatnich w funkcjonow aniu układu nerwowego. Z drugiej strony, zaburzenia wydzielania glutam inianu podczas niedotlenienia mózgu, silne pobudzenie kom órek nerwowych przez występujący w dużym nadm iarze neuroprzekaź- nik pow oduje zakłócenie pracy synaps i w efekcie prowadzi do śmierci neuronu. Również w powolnych procesach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera czy choroba H untingtona, wśród licznych i nie do końca poznanych m echanizmów występują również nieprawidłowości w przekaźnictwie glutam i- nianowym [9].

POSTĘPY BIO C H EM II 40 (3 ) , 1994 135http://rcin.org.pl

Aminokwasy pobudzające, podobnie jak inne neu- roprzekaźniki, nie działają na kom órki nerwowe bezpośrednio ale przez receptory znajdujące się na powierzchni błony kom órkowej. W ieloletnie badania p ro wadzące do udoskonalenia „narzędzi farm akologicznych”, jakim i są agoniści i antagoniści EAA, pozwoliły wyróżnić 5 zasadniczych podtypów receptorów , k tó rych nazwy pochodzą od ich selektywnych agonistów:

1. Receptor N M D A (ang. N-methyl-D-aspartate, kwas N-m etylo-D -asparaginowy), jonotropow y (tzn. taki, k tóry w obrębie kom pleksu receptorow ego zawiera kanał jonowy), o wysokiej przepuszczalności dla jonów wapnia, sodu i p o ta su. Pod wieloma względami jest to najlepiej scharakteryzow any receptor, przede wszystkim dlatego, że znanych jest wiele substancji ak tywujących i blokujących go w sposób selektywny.

2. Receptor AM PA (ang. alfa-amino-3-hydroxy-5- -methyl-4-isoxazolepropionic acid, kwas alfa- -am ino-3-hydroxy-5-m etylo-4-izoksazolopropio- nowy), jonotropow y, przepuszczalny dla k a tio nów, jak się wydawało, wyłącznie jednow artoś- ciowych. Badania m olekularne wykazały, że m ogą istnieć subpopulacje receptorów AM PA przepuszczalnych dla jonów wapnia.

3. Receptor kainianowy — o wysokim pow inow actwie do kwasu kainowego — słabo poznany: do niedaw na jego istnienie jako odrębnego recepto ra poddaw ano w wątpliwość. Znów dzięki badaniom m olekularnym jego istnienie zostało potwierdzone. Zawiera w obrębie kom pleksu receptorowego kanał jonow y przepuszczalny dla N a + , K + i C a2 + .

P onad to wyróżnia się jeszcze:4. Receptor m etabotropow y — w odróżnieniu od

poprzednich ten receptor swój wpływ wywiera poprzez białko G oddziałujące na specyficzną cyklazę adenylanow ą (szlak cAM P) lub na fos- folipazę C (szlak fosfoinozytolowy).

5. Receptor L-AP-4 (ang. L-2-amino-4-phosphono- butanoic acid, kwas 2-amino-4-fosfonomasłowy), o niedokładnie poznanej charakterystyce farm akologicznej i funkcjonalnej. Znajduje się praw dopodobnie na błonie presynaptycznej i być może reguluje wydzielanie glutam inianu do szczeliny synaptycznej.

II. Technika klonowania genów kodujących receptory EAA

D o końca lat 80-tych w badaniach nad receptoram i am inokwasów pobudzających wykorzystywano głównie m etody elektrofizjologiczne, połączone ze stosow aniem rozmaitych substancji farmakologicznych. P ro wadziło to do stosunkow o dobrego scharakteryzow ania pod względem funkcjonalnym tylko tych receptorów , w przypadku których odkryto substancje o d działujące na nie w sposób specyficzny. Pełniejszej

wiedzy na tem at struktury, właściwości i ekspresji receptorów EAA dostarczają badania z zastosow aniem technik biologii m olekularnej.

Konwencjonalne podejście do klonow ania genów kodujących określone białka, także receptorowe, wym agało uzyskania czystego białka, zsekwencjonowa- nia, określenia praw dopodobnej sekwencji nukleotydowej i w yprodukow ania kom plem entarnej sondy do przeszukiwania biblioteki genowej lub cDNA. Dzięki pomysłowemu połączeniu techniki elektrofizjologicznej z m olekularną skom plikow ana procedura została znacznie uproszczona [10]. W eksperym entach w ykorzystano znaną od daw na zdolność oocytów Xenopus laevis do produkcji białek lub m atrycy sztucznie wprow adzonego do nich mRNA. W przypadku białek receptorow ych ich obecność w oocycie jest łatwo wykrywalna poprzez pom iar aktywności elektrofizjologicznej oocytu po pobudzeniu przez selektywnego agonistę. Technika klonow ania wygląda następująco:

z mRNA wyizolowanego z mózgu konstruuje się bibliotekę cDNA w wektorze um ożliwiającym później syntezę RNA in vitro. Bibliotekę dzieli się na porcje i każdą z nich bada oddzielnie. W yprodukowane in vitro m RNA wstrzykuje się do oocytów.

B ib lio te ka cDNA

w w ekto rze ekspre sy jnym

synteza mRNA in v it ro

T T T T T T T T T

) A A A A A AA A A

in iekc ja mRNA do o o c y tu Xenopus

E le k tro fiz jo lo g ic z n y pom ia r e k sp re s ji

re ce p to ra w o o cyc ie Xenopus

Ryc. 1. S chem at p ro ced u ry k lo n o w a n ia cD N A d la recep to ra p o przez k o m b in ac ję ekspresji b ia łk a recep to ro w eg o w oocycie X enopus, i p o m ia ru e lek tro fiz jo log icznego .

136 POSTĘPY BIO C H EM II 4 0 (3 ), 1994http://rcin.org.pl

O obecności w danej puli poszukiwanego mRNA kodującego białko receptorowe wnioskuje się na podstawie aktywacji błony oocytu pod wpływem podanego liganda. D o dalszej obróbki wybiera się te części biblioteki, które praw dopodobnie zawierają klony niosące geny receptorowe. Procedura jest pow tarzana, aż do m om entu otrzym ania pojedynczego, pozytywnego klonu (Rye. 1). Tą m etodą wykryto wiele podjednostek receptorów am inokw asów pobudzających.

III. Receptor AM PA

Wszystkie lub prawie wszystkie poznane do tej pory podjednostki receptorów jonotropow ych, w tym rów nież receptorów AM PA zbudow ane są według p odobnego schematu. Cząsteczka białka o zmiennej długości zawiera w części C-końcowej cztery konserwatywne dom eny TM I — TM IV, zakotwiczające podjednostkę w błonie kom órkow ej. Natyw ny receptor składa się praw dopodobnie z pięciu podjednostek ułożonych w ten sposób, że ich dom eny TM II tworzą kanał jonowy, a wolne końce wystają do przestrzeni ze- w nątrzkom órkow ej (Ryc. 2a, b) [11].

Znane są cztery geny kodujące podjednostki receptora AM PA. Podjednostki te, odkryte niezależnie przez dwa zespoły badawcze, noszą nazwy GluR1-4 lub odpow iednio GluR A-D [12-14], Ich wielkość waha się od 862 reszt aminokwasowych w przypadku G luR B do 889 w przypadku GluR A. Duże podobieństwo, sięgające 70% na poziomie RNA oraz całkowity brak hom ologii z innymi poznanymi genami kodującym i podjednostki receptorów jonotropow ych, np. nAChR, (ang. nicotinic acetylcholine receptor, receptor nikotynow y acetylocholiny) lub GABAa R (igamma-aminohutyric acid receptor, receptor GABAa ) wskazuje, że receptory jonotropow e glutam inianu stanowią ewolucyjnie odrębną rodzinę białek receptorowych.

N a podstaw ie sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów określono praw dopodobną strukturę i właściwości białek. W szystkie podjednostki GluR zawierają w części C-końcowej cztery hydrofobowe dom eny w ewnątrzbłonowe, oraz długą (ponad 400 reszt am inokwasowych), zew nątrzkom órkow ą dom enę N -końcow ą o stosunkow o największej zmienności [12]. Fragm enty cząsteczki tworzące zewnętrzny i wewnętrzny o tw ór kanału m ają netto ładunek ujemny. W szczególności ujemnie naładow ana jest pętla cytoplazm atyczna pom iędzy dom enam i TM I i TM II. D odatkow o, po obu stronach dom eny TM II (która bierze bezpośredni udział w tworzeniu kanału) znajdują się ujemne aminokwasy, determ inujące przepuszczalność receptora dla kationów [13].

Do niedaw na sądzono, że kanał jonow y położony w obrębie receptora A M PA przepuszcza wyłącznie kationy jednow artościow e. Eksperym enty in vitro z heterom erycznym i receptoram i wykazały, że czynnikiem

A

Na+

B K*

Na*

Ryc. 2. U p ro szcz o n y m odel re cep to ra jo n o tro p o w e g o . A: p rzek ró j p rzez recep to r; d o m en y śró d b ło n o w e o zn acz o n o cyfram i rzym sk im i I, II, III, IV. D o m en a T M II tw orzy k a n a ł jo n o w y , w olne koń ce C i N w ysta ją d o p rzestrzen i zew n ą trz - k o m ó rk o w e j. B: p ra w d o p o d o b n a p en tam ery czn a s tru k tu ra k o m p le k su recep to row ego .

blokującym przepływ wapnia przez kanał jest obecność w kompleksie receptorow ym podjednostki GluR B [15]. Ponieważ akurat ta podjednostka ulega ekspresji w większości obszarów mózgu, wydaje się, że występuje powszechnie w receptorach, determ inując tym samym ich nieprzepuszczalność dla C a2 + . W ykryto jednak w mózgu kom órki, w których podjednostka G luR B nie ulega ekspresji. Zidentyfikowano je jako kom órki glejowe Bergmanna. Kom órki te, hodowane in vitro wykazują w badaniach elektrofizjologicz- nych obecność na swej powierzchni receptorów AM PA przepuszczalnych dla jonów wapnia, zbudowanych najpraw dopodobniej z podjednostek GluR A i D [16, 17].

Zasadnicza różnica właściwości podjednostek A, C, D i podjednostki B, na poziomie m olekularnym sprowadza się do obecności w tzw. miejscu Q /R położonym w dom enie TM II podjednostki GluR B am inokw asu argininy (R) zam iast glutam iny (Q) znajdującej się w tym samym miejscu w pozostałych podjednostkach (Ryc. 3). Stwierdzono, że kodon CAG kodujący glu taminę obecny jest we wszystkich czterech genach,

POSTĘPY B IO C H EM II 4 0 (3 ) , 1994 137http://rcin.org.pl

COOH

Y /Cl /V

Ryc. 3. O d c in ek łań cu ch a p o d je d n o s tk i G lu R o b e jm u jący śró d - b ło n o w e d o m en y T M I-T M IV. W n iek tó ry ch p o d jed n o s t- kach (G luR B, G lu r 5 i 6) o k reś lo n e pozycje w o b szarze T M II m o g ą być za ję te p rzez ró żn e a m in o k w asy dzięki zach o d z ącem u w tych m iejscach p rocesow i red ag o w an ia m R N A (Q /R — g lu ta m in a /a rg in in a , I/V — izoleucy- n a /w a lin a , Y /C — ty ro zy n a /cy ste in a).

a zm iana na kodon CCG argininy odbywa się na drodze redagowania RNA (ang. R N A editing) GluR B [18].

K ażda podjednostka może istnieć w dwóch wersjach, różniących się jedynie fragm entem 38 am inokwasów, położonym pom iędzy dom enam i TM III i TM IV, a więc w obszarze pętli cytoplazmatycznej (Ryc. 4). Te dwie formy pow stają w wyniku wybiórczego włączania do m RNA jednego z dwóch istniejących w pre-m RN A segmentów o długości 115 nukleotydów (ang. alternative splicing) [19]. Segmenty te, nazwane odpowiednio flip i flop, m imo niewielkich różnic w sekwencji (7-11 na 38 kodow anych am inokwasów) wpływają wyraźnie na kinetykę i am plitudę odpowiedzi wywoływanych przez agonistów.

cDNA IV

Ryc. 4. O b sz a r genu d la p o d jed n o s tk i G lu R B (d o ln a rycina) k o d u jący ekso n y f l ip i f lo p po d leg a jące w yb ió rczem u w łączan iu d o m R N A (g ó rn a rycina).

Podjednostki G luR A, B, C ulegają ekspresji w wielu obszarach mózgu, np. w korze, hipokam pie, m óżdżku, struk turach podkorow ych, podczas gdy GluR D znajdow ana jest prawie wyłącznie w m óżdżku [13, 14]. Istotne różnice obserwuje się dla form flip i flop', formy flip w korze tworzą wyraźne warstwy, podczas gdy formy flop rozłożone są równomiernie. Szczególnie wyraźny jest ich układ w hipokam pie — strukturze ważnej dla prawidłowego przebiegu procesu uczenia się: formy te występują tutaj kom plem entarnie — warianty flip w polu CA3, flop — w polu CA1 oraz w zakresie zębatym (Ryc. 5) [19].

Jak dotąd nie wyjaśniono fizjologicznego znaczenia różnorodności białek receptorowych. Wszystkie podjednostki m ogą in vitro tworzyć funkcjonalne hom o- bądź heterom eryczne kanały jonow e o zróżnicow anych właściwościach. W neuronach najpraw dopodob-

Ryc, 5. R ozm ieszczenie m R N A p o d jed n o s tk i G lu R A w h ip o k a m pie.O b sz a ro m o najw iększym nasycen iu barw y białej o d p o w ia d a najw iększe stężenie m R N A . A: fo rm a A fl ip w ystępu je w po lu CA 3, B: fo rm a f lo p — w po lu CA1 o raz w zak ręcie zęb a ty m D G (b a d a n ia w łasne).

niej jednak mamy do czynienia z m ieszaniną podjednostek połączonych w stałych proporcjach. Dzięki badaniom wykonanym m etodą PCR (ang. polymerase chain reaction, reakcja łańcuchow a polimerazy) w iadomo, że kom órki różnią się między sobą składem kom pleksu receptorowego. Np. w kom órkach Purkinjego m óżdżku ekspresji ulegają podjednostki GluR A i B w obu formach oraz GluR C flip, podczas gdy w kom órkach ziarnistych m óżdżku wykryto podjednostki GluR B flip i GluR D flop, a we wspomnianych kom órkach Bergmanna GluR B w ogóle nie występuje [20].

Nie ma, jak dotąd, danych jednoznacznie w skazujących, czy zmiany ekspresji genów kodujących podjednostki receptorowe m ogą leżeć u podstaw plastyczności synaptycznej. Pewne zmiany obserwuje się podczas rozwoju osobniczego [21]. W fazie em brionalnej w mózgu szczura wykrywane są jedynie formy flip podjednostek: poziom ich ekspresji stopniow o rośnie i osiąga stały poziom około czwartego tygodnia po urodzeniu. Form y flop natom iast pojawiają się dopiero w drugim tygodniu w różnym czasie, zależnie od rodzaju kom órek.

W raz z pojawieniem się form flop w kom órkach, zmieniają się właściwości receptorów. Z badań in vitro

138 POSTĘPY BIOCHEMII 4 0 (3 ) , 1994http://rcin.org.pl

wynika, że receptory zawierające formę flip podjednostki są bardziej przepuszczalne dla jonów. Pojawienie się we właściwym momencie receptorów z formą flop, może w konsekwencji pow odow ać zmniejszenie ak tywności synaps, a więc zm ianę plastyczną [19, 21].

N ajpraw dopodobniej jednak oprócz zm ian rozw ojowych związanych z dojrzewaniem neuronów, poziom mRNA GluR jest stały. Nie wyklucza to innych mechanizmów regulacji receptorów lub ich udziału w procesach związanych z plastycznością. Szczegółowa analiza sekwencji am inokwasowej wykazała obecność w cząsteczce receptora miejsc rozpoznawanych przez kinazę C i kinazę II zależną od kalm oduliny [13]. D ostępne dane sugerują, że fosforylacja receptorów jonotropow ych jest jednym z głównych sposobów regulowania wydajności synaptycznej w L TP i LTD [22]. Wielka różnorodność podjednostek receptorowych i rozm aitość kinaz białkowych występujących w kom órce stw arza szerokie możliwości zarówno krótko- jak i długotrw ałych zm ian przekaźnictwa glutam inianowego, być może również w naturalnych procesach plastycznych.

IV. Receptor o wysokim powinowactwie do kwasu kainowego

Kwas kainowy (KA) jest silną neurotoksyną, w d u żych stężeniach działającą w sposób nieselektywny na różne receptory. W śród nich receptory wyróżniające się szczególnie wysokim powinowactwem do KA wyróżniono jako osobną klasę receptorów. Receptor kainianowy występuje głównie w polu CA3 hipokam - pa, w zakręcie zębatym oraz w głębokich warstwach kory. W innych struk turach jego stężenie jest znacznie niższe.

Dotychczas sklonow ano 7 podjednostek tw orzących dwie podrodziny: G luR 5 [24], 6 [25, 26] i 7 [27] oraz KA-1 [28] i KA-2 [29]. Dwie pozostałe podjednostki delta-1 i delta-2 [30, 31], k tóre na podstawie podobieństw a sekwencji zaklasyfikowano do receptorów kainianowych, nie tworzą in vitro funkcjonalnyh kanałów jonowych i jak do tąd nie są znane ich właściwości ani funkcja. D odatkow e urozmaicenie wprow adzają potranskrypcyjne modyfikacje podjednostek GluR 5 i 6, polegające na delecji 15 am ino- kwasowego odcinka w obrębie N-końcowej domeny cytoplazmatycznej (podjednostka G luR 5-2) [24, 32] oraz insercjach w części C końcowej [25].

Podjednostki receptora kainianow ego są niew ątpliwie spokrewnione z opisanym i poprzednio receptoram i AM PA. Są zbliżone wielkością (ok. 900 am inokwasów) i mają podobną sekwencję (40% homologii na poziomie mRNA). Znacznie mniej natom iast wiadom o na temat składu i właściwości kom pleksów jakie tworzą.

S truktura receptora kainianowego nie została jak d o tąd szczegółowo opisana. Podjednostki G luR 5 i 6, w przeciwieństwie do G luR 7 m ogą in vitro tworzyć

funkcjonalne kanały jonowe, o charakterystyce farmakologicznej i elektrofizjologicznej bardzo podobnej do receptorów położonych na neuronach rogu tylnego rdzenia kręgowego [25,27, 33, 34], co sugeruje, że przynajmniej niektóre podjednostki mogą tworzyć w mózgu naturalne hom om eryczne kompleksy receptorowe. KA-1 i KA-2 nie tworzą hom om erycznych kanałów jonow ych, jednak w połączeniu z G luR 5 i 6 m ogą funkcjonować jako receptory o zróżnicowanych w zależności od składu kom pleksu właściwościach [29, 35]. Podobnie jak w przypadku GluR B, m RNA kodujące podjednostki G luR 5 i 6 podlegają redagow aniu w miejscu Q /R, jednak gdy G luR B istnieje wyłącznie w formie R (tzn. z argininą), G luR 5 i 6 występują w obu formach różniących się przepuszczalnością dla jonów wapnia [36, 37]. Co więcej, w obrębie dom eny TM I podjednostki GluR 6 odkryto dodatkow e dwie pozycje podlegające redagowaniu i mające wpływ na właściwości kanału (Ryc. 3) [38]. Redagowanie RNA jest praw dopodobnie sposobem regulowania i różnicowania napływu wapnia do ko mórki, niezależnym od zm ian w ekspresji samego genu. W izolowanym z mózgu RNA, całkowicie zredagow ana forma podjednostki G luR 6 stanowi 65% RNA kodującego tę podjednostkę [38]. Zm iana proporcji form zredagowanych, częściowo zredagowanych i nie- redagowanych, podlegająca ścisłej kontroli kom órkowej, może mieć znaczenie w regulacji napływu wapnia do wnętrza kom órki wywoływanego przez neuroprzekaźnik.

Dzisiejszy stan wiedzy o receptorach kainianowych jest z pewnością niewystarczający, by określić ich rolę w układzie nerwowym. Wydaje się, że jedynie badania pojedynczych neuronów, opisujące skład kom pleksu receptorowego w poszczególnych rodzajach kom órek mogą dostarczyć nowych, wartościowych informacji.

V. Receptor NM DA

Spośród wszystkich receptorów glutam inianu recep tor N M D A jest najlepiej poznany i scharakteryzow any pod względem farm akologicznym i funkcjonalnym, a to dzięki istnieniu wielu selektywnych agonistów i antagonistów . W badaniach z użyciem tych substancji rozpoznano i opisano kilka unikatowych dom en położonych w obrębie kom pleksu receptor-kanał N M D A (Ryc. 6).

W parze ze znajom ością właściwości i funkcji recepto ra N M D A przez długi czas nie szła znajom ość budowy m olekularnej kompleksu. Dopiero lata dziewięćdziesiąte przyniosły odkrycia kolejnych podjednostek. Sklonow ano jak dotąd 5 genów, kodujących 5 białek, które zaklasyfikować m ożna do dwóch grup: N M DA R1 (NR1) [39, 40] i N M D A R2A -D(NR2A-2D) [41-45]. Podjednostką najliczniej reprezentow aną w mózgu jest NR1. W ystępuje w dużej ilości w korze mózgowej w której tworzy warstwy, w hipokam pie we wszystkich jego obszarach, w móż-

POSTĘPY BIO CHEM II 40 (3 ), 1994 139http://rcin.org.pl

7-C I-KynKyn

NMDA APV Asp CPP Glu poliaminy

Ryc. 6. M odel re cep to ra N M D A . H m iejsca p o b u d z e n ia recep to ra , m iejsca h am u jące lub b lo k u jące recep to r. Asp(ang. asparta te, a sp a ra g in ian ), A P V (ang. D -( — )-2- -am ino-5-phosphonovalerate, kw as 2 -am ino-5 -fosfonow ale- rianow y), C P P (ang. 3 - ( ( + )-2 -ca rh o x yp ip era zin -4 -y l)- -propyl- 1-phosphonate, kw as 3 -(2 -k arb o k sy p ip erazy n o -4 - -ilo )-p ro p y lo -l-fo sfo n o w y , G lu (ang. glutam ate, g lu ta m inian), G ly (ang. glycine, glicyna), K yn , 7 -C l-K yn — kynurenic acid, 7-C l-kynuren ic acid, kw as k y n u ren in o w y , kw as 7 -ch lo ro k y n u ren in o w y M K -801 (ang. dizocilpine, m ale in ian 5 -m e ty lo -1 0 ,l l - d ih y d ro -5 H -d ib e n z o c y k lo h e p te n o -5 ,1 0 - -im iny), N M D A (N -m ety l-D -a sp a rta te , kw as N -m e ty lo -D - -asparag in o w y ), P C P (ang. phencyclidine, fencyklidyna).

dżku oraz w mniejszych ilościach w struk turach pod- korowych [39]. Z grupy białek NR2 jedynie NR2A występuje dość powszechnie, bo w korze, hipokam pie i m óżdżku, jednak zaw artość jego jest mniejsza niż zaw artość NR1. W ystępowanie pozostałych ograniczone jest do pewnych obszarów: NR2B ulega ekspresji głównie w korze i hipokam pie, NR2C — prawie wyłącznie w m óżdżku i wzgórzu, N R 2D — również w m óżdżku i w strukturach podkorow ych [41].

Ekspresja podjednostek receptora N M D A zmienia się wyraźnie podczas rozwoju osobniczego szczura. Zm iany polegają przede wszystkim na wzroście ilości m RNA aż do osiągnięcia stałego poziom u ok. trzeciego tygodnia życia po urodzeniu (np. NR1 i NR2A) [46], jednak np. podjednostka N R 2D obecna już w mózgu em brionalnym zanika ok. drugiego tygodnia [46], a N R2C w drugim tygodniu ulega krótkotrw ałej, przejściowej ekspresji z hipokam pie [47],

Zm iany ekspresji pięciu podjednostek receptora N M D A podczas rozwoju sugerują, że zmienia się również skład kom pleksu receptorowego. W bad aniach in vitro stwierdzono, że aby receptor działał prawidłowo, w jego skład musi wchodzić podjednostka NR1 oraz co najmniej jedna z podjednostek NR2 [41], Hom om eryczny kom pleks NR 1 wykazuje in vitro właściwości receptora N M D A , jednak jego aktywność m ierzona m etodam i elektrofizjologicznymi jest kilkakrotnie niższa niż receptorów heterom erycznych jak również i natywnych. Kom pleks złożony z samych tylko podjednostek NR2 jest nieaktywny. M ogą one być jednak uważane za swego rodzaju m odulatory, gdyż receptory o różnym składzie podjednostkow ym wykazują istotne różnice w kinetyce odpowiedzi na obecność w środowisku agonisty, jak również we wrażliwości na glicynę czy magnez [41].

W przeciwieństwie do wcześniej opisanych, geny

kodujące podjednostki NR1 i NR2 nie są blisko spokrewnione. H om ologia między nimi sięga zaledwie 18%. Podjednostki NR2 przejawiają ponadto pewną interesującą cechę, odróżniającą je od innych, a m ianowicie długi, bo złożony z ok. 550 am inokwasów konie C. Tym samym jest on dłuższy niż koniec N, tradycyjnie umieszczany po stronie cytoplazmatycznej, i który we wszystkich poznanych podjednostkach ma długość ok. 500 am inokwasów [41]. Pom im o zasadniczych różnic w sekwencji aminokwasowej wszystkie podjednostki N M D A zawierają tę samą funkcjonalną determ inantę w obrębie dom eny TM II. Jest nią asparagina (N), znajdująca się w punkcie odpow iadającym miejscu Q/R receptorów nie-N M DA, k tó ra w podjednostkach NR1 i NR2 jest odpowiedzialna za przepuszczalność kanału dla jonów C a2 + oraz za zależny od napięcia blok kanału przez jony M g2 + . Zastąpienie asparaginy w podjednostce NR1 glutam iną powoduje znaczny spadek przepuszczalności kanału dla wapnia, lecz nie ma wpływu na blok magnezowy. T aka sam a operacja dokonana na podjednostce NR2 nie zmienia przepuszczalności dla wapnia, znosi natom iast częściowo blokujące działanie magnezu. Stąd wniosek, że asparagina w miejscu Q /R w podjednostce NR1 i N R2 ma niejednakowy wkład w determ inow anie właściwości kom pleksu receptorow ego [48],

Podobnie jak w przypadku opisanych wcześniej receptorów nie-N M D A, pre-m RNA podjednostki NR1 ulega potranskrypcyjnym modyfikacjom: wykryto 7 izoform, będących kom binacjam i jednej inser- cji i dwóch delecji w pobliżu N i C końców, różniących się wrażliwością na poszczególne ligandy (Ryc. 7) [49].

R1A

R1B

R1C

R1D

R1E

R1F

R1G

Ryc. 7. L in iow y sc h em at siedm iu izoform re cep to ra N M D A . In s i — inserc ja w części N -końcow ej, I i II — delecje p o ło żo n e w części C -końcow ej. Z a k re sk o w a n e p ro s to k ą ty — d o m en y śró d b ło n o w e.

P onad to pojawiły się doniesienia o odkryciu miejsc fosforylacji przez kinazę C, położonych w obrębie delecji w części C-końcowej, co podaje w wątpliwość słuszność zastosow ania modelu struktury receptora nikotynowego do receptorów N M D A [50]. Aby roz

140 POSTĘPY BIOCHEM II 40 (3 ) , 1994http://rcin.org.pl

wiązać tę sprzeczność proponuje się inne modele budowy przestrzennej (Ryc. 8a, b). Jeden z nich zakłada istnienie piątej dom eny śródbłonowej w obszarze pomiędzy TM IV a końcem C, k tóra m ogłaby w prowadzać koniec C O O H do wnętrza kom órki. Jest to jednak m ało praw dopodobne gdyż w tym regionie nie m a wyraźnych stref hydrofobowych. W drugim p roponowanym modelu dom ena TM IV nie przechodzi przez błonę kom órkow ą, pozostaw iając koniec C O O H po stronie cytoplazmatycznej.

A

B

Ryc. 8. A, B: P ro p o n o w a n e a lte rn a ty w n e m odele b u d o w y re cep to ra N M D A .

VI. Receptory glutaminianu w procesych neurodegeneracyjnych

Wiele doniesień sugeruje, że m echanizmy kom órkowe, które służą przekazywaniu informacji, zm ienione w procesach chorobowych, m ogą pow odow ać śmierć kom órek. W pewnych stanach patologicznych obserwuje się zaburzenia w przekaźnictwie glutam inia- nowym, prowadzące do degeneracji określonych grup

kom órek nerwowych. Praw dopodobnie jednak w większości przypadków zm ianom neurotransm isji nie towarzyszy zm iana ekspresji genów kodujących podjednostki receptorowe. Jak dotąd, jedynym opisanym przypadkiem takiej zmiany jest globalna ischemia (niedokrwienie) mózgu [51], Po upływie 24 godzin od wywołania eksperym entalnej ischemii u szczura obserwuje się znaczny spadek ekspresji podjednostki GluR B, zarów no formy flip jak i flop, w polu CA1 hipokam - pa. Brak podjednostki G luR B najpraw dopodobniej prowadzi do pow staw ania kom pleksów receptorowych AM PA przepuszczalnych dla wapnia. N adm iar jonów wapniowych napływających do kom órki przyczynia się do rozlegulowania procesów m etabolicznych i w rezultacie do śmierci neuronu.

VII. Uwagi końcowe

Badania z zastosowaniem technik biologii m olekularnej ujawniły istnienie wielu rozmaitych receptorów glutam inianu w ośrodkowycm układzie nerwowym. Sklonow anie poszczególnych podjednostek i badanie heterom erycznych receptorów , rekom binow anych w oocytach Xenopus pozwoliło na szczegółową analizę funkcjonalną czystych populacji kanałów receptorowych. Tego typu analiza nie jest możliwa w preparatach natywnych błon neuronalnych, a tym bardziej w neuronach, ponieważ zwykle w błonach tych kom órek znajdują się rozm aite receptory, należące do różnych klas, przemieszane ze sobą w różnych p roporcjach. W dodatku nawet z użyciem wyjątkowo selektywnych agonistów czy antagonistów różnice w składzie kom pleksów receptorów różnych klas, położonych na różnych kom órkach są prawie niemożliwe do zarejestrow ania dostępnym i m etodam i elektrofizjologicznymi.

Badanie genów kodujących podjednostki G luR ujawniły funkcjonowanie genetycznych mechanizmów, takich jak redagowanie RNA czy alternative splicing, regulujących obecność funkcjonalnych dom en w podjednostkach receptora. Dzięki nim wykryto szereg nowych właściwości receptorów , takich jak np. przepuszczalność określonych receptorów AM PA dla w apnia czy regzulacja właściwości kanału przez pojedyncze am inokwasy w łańcuchu białkowym.

Dalsze badania będą praw dopodobnie miały na celu określenie szczegółowej (pre- czy postsynaptycznej) lokalizacji poszczególnych podtypów receptorów m etodą hybrydyzacji in situ i immunocytochemii. Równie istotne dla pełnego zrozum ienia sposobu funkcjonowania receptorów będzie zbadanie kom órkowych m echanizm ów modyfikacji białek receptorowych (np. oddziaływania allosteryczne rozmaitych m odulatorów, fosforylacja, redagowanie na etapie RNA itp.). W yjaśnienia wym agają również zjawiska neu ro tok syczności oraz przyczyn chorób neurodegeneracyjnych. W tym kontekście konieczny jest dalszy rozwój farm akologii receptorów i testowanie nowych specyfi


cznych, lecz niezbyt silnych antagonistów , selektywnych dla wybranych receptorów, które nie wywołując efektów ubocznych znoszą szkodliwe efekty nadm iernego pobudzenia.

Badania m olekularne nad receptoram i am inokw asów pobudzających są ciągle jeszcze w fazie początkowej. W ykryto cały szereg genów kodujących wiele podjednostek, występujących w wielu izoformach, określono ich sekwencję nukleotydow ą i białkową, zbadano właściwości farm akologiczne i elektrofizjologiczne. Wiele problem ów pozostaje jednak jak dotąd niewyjaśnionych. Dalsze badania będą niewątpliwie interesujące i ważne dla zrozum ienia integracyjnej funkcji transm isji glutam inianowej w ośrodkow ym układzie nerwowym.

Artykuł otrzymano 11 stycznia 1994 r.Zaakceptowano do druku 20 maja 1994 r.

Piśmiennictwo

1. H a y a s h i T (1954) K eio J M ed 3: 183-1922. C u r t i s D R , P h i l l i s J W, W a t k i n s J C (1959) N a tu re

183: 611-6123. W a t k i n s J C , E v a n s R H (1981) A nnu R ev Pharm acol

Toxicol 21: 165-2044. M o n o g h a n D T , B r i d g e s R J, C o t m a n C W (1989)

A nnu R ev P harm acol Toxicol 29: 365-4025. C o l l i n g r i d g e G L , L e s t e r R A J (1989) P harm acol Rev

41: 143-2106. E r r i n g t o n M L , L y n c h M A, B l i s s T V P (1987) N eu ro

science 20: 279-2847. M a d i s o n D V , M a l e ń k a R C , N i e o l l R A (1991) A nnu

R ev N eurosc i 14 (379)8. I t o M (1989) A nnu R ev N eurosci 12: 85-1029. M e l d r u m B, G a r z w a i t e J (1990) Trends P harm acol Sei

11: 379-38710. M a s u Y, N a k a y a m a Y, T a m a k i H, H a r a d a Y,

K u n o M, N a k a n i s h i S (1987) N a tu re 329: 836-83811. U n w i n N (1989) N euron 3: 665-67612. H o l l m a n n M, O ’ S h e a - G r e e n f i e l d A, R o g e r s

S W , H e i n e m a n n S (19N a tu re 342: 643-64813. K e i n a n e n K, W i s d e n W, S o m m e r B, W e r n e r P,

H e r b A, V e r d o o r n T A , S a k m a n n B, S e e b u r g P H(1990) N a tu re 342: 556-560

14. B o u l t e r J, H o l m a n n M, O ’ S h e a - G r e e n f i e l d A, H a r t l e y M, D e n e r i s E, M a r o n C, H e i n e m a n n S(1990) Science 249: 1033-1037

15. H o l l m a n n M, H a r t l e y M, H e i n e m a n n S (1991)252: 851-853

16. B u r n a s h e v N, K h o d o r o v a A, J o n a s P, H e l m P J , W i s d e n W, M o n y e r H, S e e b u r g P H , S a k m a n n B (1992) Science 256: 1566-1569

17. M u l l e r T, M o l i e r T, B e r g e r T, S c h n i t z e r J, K e t t e n m a n n H (1992) Science 256: 1563-1566

18. B u r n a s h e v N, M o n y e r H, S e e b u r g P H , S a k m a n n B (1992) N euron 8: 189-198

19. S o m m e r B, K e i n a n e n K, V e r d o o r n T A , W i s d e n W, B u r n a s h e v N, H e r b A, K o h l e r M, T a k a g i T, S a k m a n n B, S e e b u r g P H (1990) Science 249: 1580-1585

20. L a m b o l e z B, A u d i n a t E, B o c h e t P, C r e p e l F, R o s s i e r J (1992) N euron 9 :2 4 7 -2 5 8

21. M o n y e r H , S e e b u r g P H , W i s d e n W (1991) N euron 6: 799-810

22. C o l l i n g r i d g e G L , S i n g e r W (1990) Trends P harm acol Sei 11: 290-296

23. G r e e n a m y r e J T , O l s o n J M M , P e n n e y J B . Y o u n g A B (1985) J Pharm ac E x p Ther 233: 254-263

24. B e t t l e r B, B o u l t e r J, H e r m a n s - B o r g m e y e r 1, O ’ S h e a - G r e e n f i e l d A, D e n e r i s E S , M o l l C, B o r - g m e y e r U, H o l l m a n n M, H e i n e m a n n S (1990) N e u ron 5: 583-595

25. S o m m e r B, B u r n a s h e v N, V e r d o o r n T A, K e i n a n e n K, S a k m a n n B, S e e b u r g P H (1992) The E M BO J 11: 1651-1656

26. E g e b j e r g J, B e t t l e r B, H e r m a n s - B o r g m e y e r I, H e i n e m a n n S (1991) N a tu re 351: 745-748

27. L o m e l i H, W i s d e n W, K o h l e r M, K e i n a n e n K, S o m m e r B, S e e b u r g P H (1992) F E B S L e tt 307: 139-143

28. W e r n e r P, V o i g t M, K e i n a n e n K, W i s d e n W, S e e b u r g P H (1991) N a tu re 351: 742-744

29. H e r b A, B u r n a s h e v N, W e r n e r P, S a k m a n n B, W i s d e n W, S e e b u r g P H (1992) N euron 8: 775-785

30. Y a m a z a k i M, A r a k i K, S h i b a t a A, M i s h i n a M (1992) Bichem B iophys Res C om m un 183: 886-892

31. L o m e l i H, S p r e n g e l R, L a u r i e D J , K o h r G, H e r b A, S e e b u r g P H , W i s d e n W (1993) F E B S L e tt 315: 318-322

32. G r e g o r P, O ’ H a r a B F , Y a n g X, U h l G R (1993) N euro R eport 4: 1343-1346

33. B e t t l e r B, E g e b j e r g J, S h a r m a G, P e c h t G, H e r m a n s - B o r g m e y e r I, M o l l C, S t e v e n s C F, H e i n e - m a n n S (1992) N euron 8: 257-265

34. H u e 11 n e r J E (1990) N euron 5: 255-26635. S a k i m u r a K, M o r i t a T, K u s h i y a E, M i s h i n a M

(1992) N euron 8: 267-27436. S o m m e r B, S e e b u r g P H (1992) Trends Pharm acol Sei 13:

291-29637. S o m m e r B, K o h l e r M, S p r e n g e l R, S e e b u r g P H

(1991) C ell 67: 11-1938. K o h l e r M, B u r n a s h e v N, S a k m a n n B, S e e b u r g

P H (1993) N euron 10: 491-50039. M o r y i o s h i K, M a s u M, I s h i i T, S h i g e m o t o R,

M i z u n o N, N a k a n i s h i N (1991) N a tu re 354: 31-3740. Y a m a z a k i M, M o r i H, A r a k i K, M o r i K, M i s

h i n a M (1992) F E B S L e tt 300: 39-4541. M o n y e r H, B u r n a s h e v N, S a k m a n n B, S e e b u r g

P H (1992) Science 256: 1217-122142. M e g u r o H, M o r i H, A r a k i K, K u s h i y a E, K u t -

s u w a d a T, Y a m a z a k i M, K u m a n i s h i T, A r a k a - w a M, S a k i m u r a K, M i s h i n a M (1992) N a tu re 357: 70-74

43. K u t s u w a d a T, K a s h i w a b u c h i N. M o r i H, S a k i m u r a K, K u s h i y a E, A r a k i K, M e g u r o H, M a s a - k i H, K u m a n i s h i T, A r a k a w a M (1992) N a tu re 358: 36-41

44. I k e d a K, N a g a s a w a H, M o r i H, A r a k i K, S a k i m u r a K, W a t a n a b e M, I n o u e Y, M i s h i n a M (1992) F E B S L e tt 313: 34-38

45. I s h i i T, M o r i y o s h i K, S u g i h a r a H, S a k u r a d a K, K a d o t a n i H, Y o k o i M, A k a z a w a C, S h i g e m o t o R, M i z u n o N, M a s u M (1993) J B iol Chem 268: 2836-2843

46. W a t a n a b e M, I n o u e Y, S a k i m u r a K, M i s h i n a M(1992) N eu ro R ep o rt 3: 1138-1140

47. P o l l a r d H, K r e s t c h a t i s k y M, M o r e a u J, B e n A r i Y (1993) N e u ro R ep o rt 4: 411-414

48. B u r n a s h e v N, S c h o e p f e r R, M o n y e r H, R u p p e r s - b e r g J P , G u n t h e r W, S e e b u r g P H , S a k m a n n B (1992) Science 257: 1415-1419

49. S u g i h a r a H, M o r i y o s h i K, I s h i i T, M a s u M, N a k a n i s h i N (1992) Biochem B iophys Res Com m un 185: 826-832

50. T i n g l e y W G , R o c h e K W , T h o m p s o n A K, H u g a - n i r R L (1993) N a tu re 364: 70-73

51. P e l l e g r i n i - G i a m p i e t r o D E . Z u k i n RS , B e n n e t t M V L , C h o S, P u l s i n e l l i W A (1992) P roc N a t I A ca d Sei 89: 10499-10503


Białka powierzchniowe i rdzeniowe HBV i ich rola w rozwoju zapalenia wątroby typu B

Envelope and core proteins of HBV and their influence on the development of hepatitis B

MAŁGORZATA SIDORKIEWICZ1, ANDRZEJ PŁUCIENNICZAK2

Spis treści:

I. WstępII. Białka powierzchniowe HBV

II-l. Białko SII-2. Białko M11-3. Białko LII-4. Rola białek powierzchniowych w odpowiedzi im

munologicznejIII. Produkty ekspresji ORF preC/C

III-I. Białko c III-2. Białko eIII-3. Rola białek rdzeniowych w rozwoju zapalenia

wątroby typu BIV. Uwagi końcowe

Wykaz stosowanych skrótów: HBV — wirus zapalenia w ątroby typu B, HBs — białko S HBV, HBc — białko rdzeniowe HBV, O R F — o tw arta ram ka odczytu, preS/S — rejon genom u HBV kodujący białka powierzchniowe, PreC /C— rejon genom u HBV kodujący białka rdzeniowe, Ag— antygen, Ab — przeciwciało, P — proteina, G P — gliko- proteina, aa — am inokw as, kz — tysiąc par zasad, wzw B — wirusowe zapalenie w ątroby typu B.

I. Wstęp

Zapalenie w ątroby typu B (wzw B), wywołane przez wirusa zapalenia w ątroby (HBV), jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych na świecie chorób zakaźnych i stanowi po m alarii największe źródło śm iertelności (ponad milion przypadków na rok). O koło 10% osób, u których rozwinęło się wzw B, nie eliminuje w irusa i staje się jego nosicielami [1]. Zakażenie HBV nie wywiera na kom órki w ątrobow e pierw otnego efektu cytopatycznego. Przebieg kliniczny choroby zależy przede wszystkim od odpowiedzi im m unologicznej zakażonego organizm u, nie zaś samej obecności czynnika etiologicznego w hepatocytach [2]. W zależności od interakcji pomiędzy antygenam i HBV a mechanizm am i obronnym i gospodarza wyróżniam y kil-

1 D r, I Zakład Biochemii Akadem ii Medycznej w Łodzi, 90-131 Łódź, ul. Lindleya 6 .2 Prof., C entrum M ikrobiologiii W irusologii PA N , Łódź, ul. D ąbrow skiego 251.

Contents:

I. IntroductionII. Surface proteins of HBV

II-1. S proteinII-2. M proteinII-3. L proteinII-4. Role of envelope proteins in the immunological

responseIII. Expression products of the ORF preC/C

III-l. c protein 1II-2. e proteinIII-3. Role of core proteins in the development of

hepatitis BIV. Concluding remarks

ka postaci klinicznych choroby; postać ostra kończy się eliminacją wirusa, regeneracją tkanki wątrobowej i trwałą odpornością; zapalenie typu nadostrego (hepatitis fulminans) prowadzi do zniszczenia tkanki w ątrobowej i charakteryzuje się 85% odsetkiem śm iertelności; zapalenie przewlekłe, wielokrotnie zwiększa ryzyko rozwoju marskości w ątroby i raka wątroby [3].

M echanizm obronny gospodarza skierowany jest przeciw białkom wirusowym zlokalizowanym bezpośrednio na cząstce wirusa oraz wewnętrznym kom ponentom wirusa, które są eksponow ane na pow ierzchni zakażonych hepatocytów. Dzięki częściowo n ak ładającym się i przesuniętym w fazie otw artym ram kom odczytu, niewielki genom HBV (3200 kz) koduje aż 7 białek (organizacji genetycznej HBV poświęcono pracę przeglądową w 2 numerze P o s t ę p ó w B i o c h e m i i z 1993 roku). Odpowiedź im m unologiczna typu hum oralnego indukow ana jest w różnym stopniu przez wszystkie białka HBV. Największe znaczenie m ają tutaj białka powierzchniowe indukujące pow stanie, neutralizujących wirusa, przeciwciał skierowanych przeciw dom enom : preS l, preS2 i S [4]. Powstanie tych przeciwciał możliwe jest dzięki współdziałaniu kom órek prezentujących antygen, w restrykcji głównego układu zgodności tkankowej klasy II (HLA II), z limfocytami pomocniczymi T i limfocytami B. G łów nym celem odpowiedzi typu kom órkow ego są białka rdzeniowe prezentow ane wraz z białkam i głównego układu zgodności tkankowej klasy I (HLA I) na

POSTĘPY BIOCHEM II 4 0 (3 ) , 1994 143http://rcin.org.pl

powierzchni błony kom órkowej hepatocytów [5]. Do skutecznej eliminacji zakażenia konieczne jest skoordynow ane działanie cytotoksycznych kom órek T, lizu- jących zakażone hepatocyty, oraz przeciwciał neutralizujących bezpośrednio cząstki wirusowe, poprzez tworzenie kom pleksów immunologicznych.

II. Białka powierzchniowe

O toczka białkowa występująca na powierzchni wirusa HBV oraz cząstki subwiralne składają się z trzech rodzajów białek: małego (S), średniego (M) i dużego (L), posiadających własności antygenow e [6]. Białka te kodow ane są przez O R F preS/S, k tó ra zawiera trzy, znajdujące się w fazie kodony startu translacji. W efekcie każde z białek powierzchniowych posiada taki sam odcinek C-końcowy (białko S), różni się natom iast rejonem N -końcowym (Ryc. 1). Białka powierzchniowe, ze względu na swą lokalizację, pełnią wiele istotnych funkcji w cyklu życiowym wirusa. Biorą udział w wiązaniu cząstki wirusowej z powierzchnią atakow anej kom órki i jej penetracją w pierwszym etapie infekcji, są nieodzowne w procesie dojrzewania wirusa i jego transporcie do przestrzeni zewnątrz- kom órkow ej [7],

W I PRE SI ^ | PRE S2 I s 1ATG T ATG ATG TAA

& s— V / ~ ' V2.1 kz m - RNA 3’

T

)\ .5

. )

<

)

226 aa J S P24/G P27

, T T| 55 aa 226 aa 1 U GP33/GP36

\ /2,4 kz m-RNA 3’

1 106/119 aa | 55 aa | 226 aa | L P38/GP42

1 389/400

Ryc. 1. S ch em at O R F p reS /S k o d u jące j b ia łk a pow ierzchn iow e H B V . Z a z n a c z o n o m iejsca p ro m o to ro w e d la genu p reS l (zak resk o w an e ko ło) i genu S (ko ło w k ra tk ę ) i p ro d u k ty tra n sk ry p c ji tych genów : 2,1 kz, 2,4 kz R N A . P ro d u k ty tran s lac ji 2,1 kz R N A to b ia łk o S (m ałe) i M (średnie). P ro d u k te m tran slac ji 2,4 kz R N A je s t b ia łk o L (duże), zaw iera jące d o m en y p re S l, p reS2 i S. Z a z n a c z o n o w ielkość b ia łek (liczba aa) o ra z m iejsca, w k tó ry c h u legają one g likozylacji.

II-l. Białko S

M ałe białko powierzchniowe S, często określane jako HBsAg, jest głównym składnikiem otoczki w irusowej oraz cząstek subwiralnych i stanowi 90% białek otoczki HBV obecnych w surowicy [8]. Białko S składa się z 226 am inokwasów kodow anych przez rejon S genom u HBV. W ystępuje w dwóch formach: glikozy- lowanej G P27 i niegłikozylowanej P24. G likan przyłączany jest do A sn146. Pierwszorzędow a struk tu ra tego białka wykazuje obecność sekwencji hydrofobowych

pomiędzy 7-23, 80-98, 169-226 aa [9], Dwa pierwsze rejony odpowiedzialne są za transport przez błonę lipidową. Rejon pomiędzy 122-155 am inokwasem w białku S, występujący w obrębie drugiego rejonu hydrofilowego, jest w yeksponowany na powierzchni cząstki. Przy użyciu przeciwciał m onoklonalnych wykazano w tym rejonie obecność determ inant grupowych i podtypowych. Reakcje serologiczne, w których używane były przeciwciała przeciw HBsAg ujawniły istnienie 4 głównych podtypów serologicznych HBV: adw, adr, ayw, ayr [10], Litera a oznacza wspólną dla wszystkich podtypów HBV specyficzność antygenow ą, k tóra jest związana z obecnością więcej niż jednego epitopu. Litery d/y i w/r oznaczają odpow iednio pary wzajemnie wykluczających się podtypów antygenowych. W ykazano jednak możliwość wspólnego występow ania obu allelicznych determ inant (d i y lub w i r) na tej samej cząstce HBsAg [11]. R óżnorodność podtypów wynika z różnic antygenow ych pomiędzy białkam i S i zależy bezpośrednio od wymiany pojedynczych am inokwasów. Podstaw ow a różnica w pod- typach d i y zależy od substytucji Arg przez Lys w pozycji 122, różnica zaś między w i r odpow iada zamianie Arg w Lys w pozycji 160 [12].

Czternaście cystein występujących w białku S bierze udział w tworzeniu m ostków S-S. Dwa do czterech wiązań S-S, w pozycjach 121,124,221, i p raw dopodobnie 48, ma charak ter międzycząsteczkowy. Dziesięć pozostałych miejsc występowania cysteiny tworzy wiązania wewnątrzcząsteczkowe [13]. Białko S jest początkow o syntetyzowane jako integralne białko m em branowe. Ta transm em branow a forma jest stopniow o przekształcana w lipoproteinow ą cząstkę złożoną z około 100 kopii białka S. N a tę przem ianę m ają wpływ silnie hydrofobowe sekwencje topogeniczne (7-22, 84-130aa). Wszystkie informacje potrzebne do prawidłowego utworzenia cząstki i jej sekrecji zawarte są w białku S. W skazuje na to form ow anie takich cząstek w hodowlach kom órkow ych (HepG2, CoS-7), do których w prow adzono w ektor kodujący tylko białko S [14]. W ytwarzanie znaczynch ilości HBsAg jest unikalną cechą zakażenia HBV. U trzym yw anie się wysokiego stężenia białka powierzchniowego we krwi może wywoływać stan tolerancji immunologicznej i prowadzić do rozwoju zakażenia przewlekłego [15],

II-2. Białko M

Białko M o długości 281 aa kodow ane jest przez rejon S i preS2 genom u HBV i zawiera w stosunku do białka S dodatkow e 55aa od N -końca [9]. Białko to występuje w postaci glikoproteiny z jedną (GP33) lub dwiema cząsteczkami cukru (GP36) [16], Zaobserwowano, że w białku M sekwencja preS2 zawsze ulega glikozylacji, natom iast nigdy nie ulega ona glikozylacji w białku L [13].

Hydrofilow a dom ena preS2 zawiewra swoisty gatunkow o receptor dla spolimeryzowanej album iny

144 POSTĘPY BIO CHEM II 4 0 (3 ) , 1994http://rcin.org.pl

surowicy [17]. Sekwencja biorąca udział w wiązaniu preS2 z album iną występuje w tej sekwencji pomiędzy 15 i 30aa [18]. Łączenie z rejonem preS2 jest specyficzne głównie dla polim erów album iny tworzonych in vitro w reakcjach z glutaraldehydem [19]. Reakcja wiązania jest silnie ham ow ana przez m onoklonalne przeciwciała anty-preS2 [20]. N ie obserwuje się trw ałego łączenia rejonu preS2 z m onom eryczną album iną, k tóra stanow i podstaw ow ą formę w krwioobiegu. Ta forma album iny łączy się jedynie z powierzchniowym białkiem S [21], p raw dopodobnie poprzez tworzenie nieodw racalnych wiązań z cysteiną.

II-3. Białko L

Białko L, największe z białek powierzchniowych, składa się z białka M oraz dodatkow ego N -term inal- nego fragm entu, o długości 108-119 aa, kodowanego przez rejon preSl [9]. Białko L występuje w formie glikoproteiny G P42 lub jako nie glikozylowane białko P39. C harakteryzuje się ono (za wyjątkiem hydrofobowego fragm entu 55-85aa w rejonie preSl) wysoką hydrorofilnością i wysoką zaw artością obdarzonych ładunkiem am inokw asów [22]. Samo białko L nie tworzy form sekrecyjnych, praw dopodobnie w związku z przyłączeniem do N -końca, kwasu mirystylowe- go. Białko L ulega mirystylacji na pierwszej glicynie w sekwencji p reS l [23]. Rejony preSl wszystkich przedstawicieli rodziny Hepadna zawierają N -końco- wą sekwencję m etionina-glicyna niezbędną do procesu mirystylacji. Białko L wywiera istotny wpływ na formowanie i sekrecję cząstki wirusa. Jednak porów nanie proliferacji kom órek produkujących białko L, w postaci mirystylowanej lub nie (delecja kodonu glicyny), wykazało, że sam a mirystylacja nie jest odpowiedzialna za zm iany morfologiczne w błonie RE, związane z zaham ow aniem wydzielania cząstek w irusowych [24].

N adprodukcja polipeptydu L w stosunku do innych białek powierzchniowych ham uje wydzielanie praw idłowych cząstek wirusowych i subwiralnych [25] i indukuje tworzenie cząstek białka L o długości ponad 1000 nm. Są one grom adzone w retikulum endoplaz- matycznym, co prow adzi do zw yrodnienia kom órek hepatocytarnych transgenicznych myszy [26]. Przypom ina to zw yrodnienie typu „m atowego szkła”, obserwowane w hepatocytach pacjentów z zakażeniem przewlekłym [27]. Cytolityczny wpływ nadekspresji białka L na hepatocyty stanowi jedyny przykład cytopatyczności HBV. Inne badania wykazują, że nadprodukcją białka L u transgenicznych myszy p ro wadząca do długotrw ałego uszkodzenia kom órek, indukuje także proliferację neoplastyczną [28],

D om ena preS l jest najbardziej wyeksponow ana na powierzchni otoczki wirusowej. W obrębie sekwencji p reS l, pom iędzy 21 i 47 am inokwasem , zidentyfikowano miejsce rozpoznające receptor na powierzchni kom órek ludzkiej hepatom y H epG 2 [29, 30]. Kolejne

badania wykazały obecność receptorów rozpoznających sekwencję p reS l(21-47) również na powierzchni błony plazmatycznej ludzkich hepatocytów [31].

Ze względu na stwierdzoną pozaw ątrobow ą replika- cję HBV, badano także obecność receptorów rozpoznających' sekwencję preSl na powierzchni innych kom órek. Receptor dla HBV został zidentyfikowany na powierzchni: limfocytów B, kom órek nerw iaka niedojrzałego, owodni i innych linii kom órkow ych o pochodzeniu pozaw ątrobow ym [32].

Najnowsze badania wykazały, że rejon p reS l(21-47) ma zdolność silnego wiązania się z interleukiną 6. Fizjologiczny receptor dla tej cytokiny jest p raw dopodobnie także receptorem umożliwiającym HBV wnikanie do kom órek docelowych [33].

II-4. Rola białek powierzchniowych w odpowiedzi immunologicznej

W szystkie białka powierzchniowe HBV m ają własności antygenowe i pow odują powstanie przeciwciał. W sekwencji białka S główne epitopy B-kom órkowe zidentyfikowano pomiędzy 120-157aa [34]. Antygen HBs ma charak ter konformacyjny. Redukcja i alkila- cja m ostków dwusiarczkowych znacząco redukuje im m unogenność HBsAg [13]. Stwierdzono również istotny wpływ oddziaływań lipidowo-białkowych na utrzym anie właściwej struktury antygenu [35]. Antygen HBs wykrywany jest w surowicy po 3-6 tygodniach od zakażenia i w przypadkach kończących się wyleczeniem, utrzym uje się w surowicy do 6 tygodni. U większości chorych przeciwciała przeciw białku S pojawiają się po zniknięciu w surowicy HBsAg i utrzym ują się w niskich stężeniach niekiedy do końca życia [6]. Przeciwciała anty-H Bs m ają charakter ochronny; jest to praw dopodobnie związane z aglutynacją natywnej cząstki HBV przez te przeciwciała, co w konsekwencji prowadzi do m askow ania rejonu preSl odpowiedzialnego za rozpoznawanie receptorów na hepatocytach [29].

Dom eny preSl i preS2 są najbardziej wyeksponow ane na powierzchni cząstki wirusowej i mimo braku epitopów o charakterze konformacyjnym odgrywają isto tną rolę w odpowiedzi immunologicznej.

Przeciwciała przeciw preSl i preS2, mające zdolność neutralizacji wirusa, wytwarzane są we wczesnej fazie infekcji, przed pojawieniem się przeciwciał anty-HBs [36]. Przeciwciała przeciw preS, obecne w surowicach chorych zakażonych HBV, reagują preferencyjnie z syntetycznymi peptydam i o sekwencjach: preS 1(12-32), preS 1(12-47), preS2(120-145), preS2(120--153) [34]. Szczególne znaczenie w neutralizacji HBV m ają przeciwciała przeciw sekwencji p reS l(21-47), ze względu na możliwość blokow ania na cząstce wirusa miejsca wiążącego się z receptorem na powierzchni hepatocytu [37].

Przeciwciała przeciw preS pojawiają się w przebiegu ostrej infekcji HBV dwufazowo [38]. Wczesne prze

POSTĘPY BIOC H EM II 4 0 (3 ) , 1994 145http://rcin.org.pl

ciwciała wykrywane są w obecności HBsAg i często HBeAg. Ponow nie pojaw iają się jako późne przeciwciała w fazie zdrowienia, po rozwinięciu HBeAb, a przed pojawieniem się HBsAb. Obecność w surowicy przeciwciał przeciw preS uw ażana jest za sym ptom zdrowienia [8 ,39]. W ykrywane są one u osób z ostrym, sam ogojącym przebiegiem wzw B oraz u osób nabyw ających odporność na HBV. Bardzo rzadko przeciwciała takie pojaw iają się w wzw B ewolucującym ku postaci przewlekłej [8].

W przypadku nadostrego wzw B (hepatitis fulminas), występuje nadm iernie wysoka, wczesna odpowiedź hum oralna na produkty ekspresji rejonów preSl i preS2 genom u HBV. M a ona wpływ na wczesny i szybki zanik HBsAg (mimo braku przeciwciał przeciw HBs) oraz pow oduje silne uszkodzenie w ątroby charakterystyczne dla tego typu przebiegu wzw B [40]. Obecność dom eny preSl i preS2 m a istotny wpływ na im m unogenność białka S. Zaobserw ow ano, że śladowe ilości białka M i L zaw arte w szczepionkach pochodzących z plazmy nosicieli (np. Hevac B) wywoływały u biorców znacznie lepszą odpowiedź anty-H Bs niż szczepionki typu rekom binacyjnego, zawierające tylko oczyszczone białko S [37]. W ykazano, że obecność determ inanty preSl w m ateriale stosowanym do immunizacji myszy spowodowała zniesienie braku o d powiedzi na domenę preS2 i S, w wyniku współdziałania preSl-swoistych, pomocniczych kom órek T w wytwarzaniu przeciwciał anty-preS2 i anty-HBs [41].

„Porozum iew anie się” kom petentnych kom órek prow adzące do pow stania przeciwciał przeciw białkom powierzchniowym , odbywa się przy udziale an ty genów zgodności tkankowej klasy II. W ykryto, że prezentacja białek powierzchniowych przez limfocyty

Ryc. 2. S ch em at O R F p re C /C kodującej: g łów ne b ia łk o rdzen iow e P21 (gdy p ro ces tran s lac ji ro z p o czy n a się o d w ew nętrznego A U G ) o ra z p re k u rso ro w e b ia łk o P25 (gdy syn teza b ia łk a ro z p o c z y n a się o d p ierw szego A U G ). P21 i P25 m a ją ta k i sam b o g a ty w a rg in in ę 35 am in o k w aso w y odcin ek na C -k o ń c u cząsteczk i (o b sza r zak ro p k o w a n y ) P o h y dro liz ie N -k o ń co w ej sekw encji sygnałow ej (o b sz a r zak resk o w an y ) p o w s ta je in te rm e d ia t P22. W czasie sekrecji hyd ro liz ie u lega C -k o ń c o w a część in te rm e d ia tu , co p ro w ad z i d o p o w s ta n ia b ia łk a e -P 17 (jest to najczęściej h e te ro g e n n a p o p u la c ja b ia łek o m asach o d 15 d o 22 kd).

B może w pewnych przypadkach wywoływać bezpośredni atak cytotoksycznych kom órek T na limfocyty B. Ham uje to odpowiedź hum oralną skierow aną przeciw białkom powierzchniowym, a tym samym eliminację wirusa i może przyczyniać się do rozwoju stanu nosicielstwa [42].

III. Produkty ekspresji ORF preC/C

O tw arta ram ka odczytu genu rdzeniowego zawiera dwa, będące w fazie kodony startu translacji i dzieli ten gen na rejon preC i C (Ryc. 2). Inicjacja translacji od wewnętrznego kodonu A U G prowadzi do powstania głównego białka rdzeniowego P21 [43], stanowiącego antygen HBcAg, lokalizowany w jądrach zakażonych hepatocytów.

Synteza drugiego produk tu białkowego O R F preC/C inicjowana jest od pierwszego kodonu AUG i daje w fazie początkowej prekursorow e białko P25. Potranslacyjne zmiany prow adzą w efekcie do powstania, wydzielanego do krwioobiegu HBeAg.

III-l. Białko c

Wykrycie białka rdzeniowego poprzedzone było znalezieniem w surowicy nosicieli HBsAg przeciwciał precypitujących z cząstkam i powstającymi po usunięciu z powierzchni wirusa płaszcza białkowego [44]. Gen kodujący białko P21 zidentyfikowany został przez ekspresję odpowiedniej O R F w bakteriach E. coli[45]. Cząsteczki białka P21 asocjują w cząstkę rdzeniową, w której połączone są z pregenom owym wirusowym RNA, a następnie (po działaniu odwrotnej transkryptazy) z DNA [46]. W skład cząstki rdzeniowej wchodzi 180 m onom erów P21.

Za wiązanie białka rdzeniowego z kwasami nukleinowymi odpowiedzialny jest jego C-końcowy fragm ent o dl. 35aa, zawierający dom enę bogatą w a rgininę. Fragm ent ten, przypom inający swą budową protam iny, zawiera ośm iopeptydowy tandem Ser- Pro-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Glu [9]. Przypuszcza się, że dom ena bogata w Arg jest również odpow iedzialna za transport cząstek rdzeniowych do jąd ra kom órkow ego, gdzie są one akum ulow ane [47].

Cząstki rdzeniowe pochodzące z zainfekowanych hepatocytów jak i poddanych działaniu detergentu cząstek D ane’a, wykazują aktywność kinazow ą [48]. Inkubacja rdzenia wirusowego z y32ATP, prowadzi do fosforylacji cząstki rdzeniowej w licznych miejscach, w których występują seryna i teonina. Aktywność kinazow ą wykazują również cząstki rdzeniowe, będące produktam i rekom binacji [49].

III-2. Białko e

W surowicy nosicieli HBsAg odkryta została, rów nież rozpuszczalna, sekrecyjna forma białka rdzeniowego HBeAg [50]. Prace mające na celu ekspresję całej


rdzeniowej O R F, wykazały pojawianie się w hepatocytach pierw otnego produktu translacji, w postaci białka P25, prekursora cząstek HBeAg [51]. W ykazano więc, że HBcAg i HBeAg pochodzą z dwóch różnych produktów translacji: P21 dla HBcAg i P25 dla HBeAg.

Sekwencja kodow ana przez rejon preC stanowi sekwencję sygnałową. Zawiera dodatn io naładow ane am inokw asy na N -końcu, a za nimi grupę 10 am inokwasów hydrofobowych, przy czym znamienny jest konserwatyzm ewolucyjny 29aa tego rejonu u wszystkich wirusów Hepadna. P ierw otny p roduk t translacji rejonu preC /C , białko P25 ulega, dzięki sekwencji sygnałowej, translokacji do błon retikulum endoplaz- m atycznego [43]. Po proteolitycznym usunięciu 19aa z sekwencji sygnałowej, obserwuje się pojawianie transm em branow ego białka P22 [51]. Dalsze proteolityczne traw ienie bogatej w argininę dom eny C-koń- cowej prow adzi do pow staw ania cząstek o masach od 15kd do 22kd (przeważająca część o masie 17 kd), które są wydzielane do krwioobiegu. Białko P25 nie bierze udziału w tworzeniu HBcAg, może natom iast przejść serię proteolitycznych degradacji i powrócić z RE do cytoplazmy, a naw et do jąd ra [46].

U w aża się, że proces dojrzew ania cząstek HBeAg, może być związany z działaniem proteinazy aspar- tylowej. Zwraca uwagę podobieństw o białka rdzeniowego do centrum katalitycznego proteinazy aspar- tylowej [52]. Stw ierdzono wpływ inhibitora tego enzymu, na zaham ow anie wydzielania cząstek HBeAg w hodowli kom órkowej przy jednoczesnym grom adzeniu wewnątrzkomórkowych intermediatów HBeAg [53].

III-3. Rola białek rdzeniowych w rozwoju wirusowego zapalenia wątroby typu B

Białka rdzeniowe HBcAg i HBeAg są głównym celem dla cytoksycznych kom órek T. K om órki te rozpoznają szereg różnych epitopów występujących pom iędzy 1 i 140 am inokwasem w sekwencji białka C [54]. Podobieństw o strukturalne HBcAg i HBeAg powoduje, że wykazują one krzyżową reaktywność na poziom ie kom órek T. Limfocyty T swoiste dla HBcAg rozpoznają liczne miejsca w obrębie sekwencji HBcAg oraz HBeAg [54]. O prócz białek rdzeniowych odpowiedź ze strony cytotoksycznych kom órek T wywołują także białka powierzchniowe i białko X. Jak w wielu innych infekcjach wywoływanych przez wirusy (grypa, odra, m ononukleoza itp.) antygeny wirusowe rozpoznaw ane są na powierzchni zakażonych kom órek tylko w połączeniu z antygenam i zgodności tk an kowej klasy I [55]. Praw idłow a odpowiedź immunogi- czna w rozwoju wzw B obejmuje cytolityczne działanie limfocytów T prow adzące do eliminacji zakażonych hepatocytów eksponujących na swej powierzchni obce antygeny. Zaburzenie takiej odpowiedzi prowadzi do przetrw ania wirusa i rozwoju zakażenia przewlekłego. Przyczyn nieprawidłowej odpowiedzi zakażonego o r

ganizm u może być kilka. N adm iar krążących przeciwciał anty-H Bc i ich wiązanie się z pow ierzchnią hepato cytów, może m askować wyeksponow ane tam an ty geny rdzeniowe przed działaniem cytotoksycznych kom órek T i przedłużać obecność HBV [56]. Brak ekspresji antygenów HLA I na powierzchni hepatocytów może uniemożliwiać prezentację antygenów w irusowych. W typowym o ostrym przebiegu zapalenia w ątroby typu B gęstość HLA I we wczesnym etapie infekcji wzrasta pod wpływem podwyższonej p rodukcji a-interferonu [57] oraz transaktyw ującego działania HBxAg na geny HLA I [58]. W zakażeniu o charakterze przewlekłym często obserwuje się zaham owanie produkcji interferonu [59, 60].

M imo, że HBcAg jest wewnętrzną kom ponentą wirusa, przeciwciała przeciw HBc produkow ane są w wysokich stężeniach przez większość chorych [61]. Badania mające na celu lokalizację epitopów B-komó- rkowych wykazały obecność na powierzchni HBcAg pojedyńczej, konformacyjnej determ inanty pomiędzy 78-85aa (nakłada się na nią liniowa determ inanta HBeAg). D odatkow y B-kom órkowy epitop wykryto w obrębie bogatej w Arg C-końcowej części białka [62].

Cząstka rdzeniowa, w której 180 identycznych podjednostek białka p21 otacza pregenom ow e RNA lub DNA, jest niezwykle efektywnym im m unogenem , nie wymagającym współdziałania pom ocniczych kom órek T [63]. W łasności te, będące praw dopodobnie wynikiem regularnego rozmieszczenia w określonych odległościach identycznych epitopów, wykorzystywane są do efektywnej prezentacji im munologicznej o b cych epitopów. U tw orzone przy użyciu technik rekom - binacyjnych białka fuzyjne złożone z heterogennego epitopu i białka rdzeniowego zachow ują zdolność do form ow ania cząstek o regularnej budowie, o ile zachow ane zostaną w tej „konstrukcji” 144 N-końcowe am inokw asy białka p21. U zyskano w ten sposób podobne do rdzeniowych cząstki eksponujące na całej powierzchni epitopy: transm em branow ego białka gp41 wirusa HIV-1 [64], białka otoczki w irusa FM D V [65], białka p24 wirusa HIV-1 [66] oraz wielu innych ważnych z klinicznego punktu widzenia białek.

Nie zaobserw ow ano bezpośredniego wpływu cząstek HBeAg na replikację czy dojrzewanie wirusa, nie mniej ich obecność we krwi jest ściśle skorelow ana z aktyw ną replikacją HBV. W praktyce diagnostycznej dłuższa niż 10-tygodniowa obecność HBeAg w surow icy jest sym ptom em rozwoju zakażenia przewlekłego. N atom iast serokonwersja w układzie HBe występująca w norm alnym , ostrym, przebiegu wzw B jest skorelow ana z eliminacją krążących cząstek HBV [67].

U dzieci, k tórych m atki są nosicielami HBV, wczesny kon tak t z HBeAg może być (obok niedojrzałości limfocytów cytotoksycznych, obecności w surowicach czynników im m unosupresyjnych oraz m atczynych IgG anty-HBc) przyczyną rozwoju zakażenia o charakterze przewlekłym. Przenikający przez łożysko 12 am inokwasow y fragm ent antygenu HBe wywołuje


stan tolerancji T-kom órkow ej u dziecka i umożliwia dalszą obecność wirusa [68].

Isto tną rolę w patogenezie zakażenia HBV m ają także zm utowane szczepy wirusa zapalenia w ątroby typu B. Najczęściej opisywane są przypadki zakażenia szczepem „e-minus” [69, 70], który ma defektywny fragm ent w rejonie genu preC i nie syntetyzuje HBeAg. W 90% przypadków m utacja ta (substytucja G -> A) zw iązana jest z powstaniem kodonu stop (TAG) w dys- talnej części rejonu preC. M utanty związane z defek- tywnym rejonem genu preC są ściśle skorelowane z rozwojem nadostrego zapalenia w ątroby hepatitis fu lm inans [71]. W norm alnym przebiegu wzw B rozpuszczalny antygen HBeAg wydzielany jest do krw ioobiegu gospodarza i działa jak m odulator im m unologiczny łagodzący atak cytotoksycznych kom órek T na zakażone hepatocyty [58]. W przypadku współzaka- żenia szczepem „dzikim” i szczepem zm utowanym , gdy m utan t „e-minus” zaczyna dom inow ać w rozwoju zakażenia, poziom HBeAg zmniejsza się, zanika efekt im m unom odulacji i dochodzi do gwałtownego, p o stępującego uszkodzenia wątroby. U pacjentów z hepatitis fu lm inans wykrywa się także m utację w obrębie genu C. Polega ona w 50% przypadków na zamianie C-końcowej seryny na prolinę [72], a w konsekwencji do zaham ow ania fosforylacji białka rdzeniowego i do jrzewania cząstek wirusa [73]. Pozostający w kom órce nadm iar HBeAg, eksponow any jest na powierzchni hepatocytów i powoduje gwałtowną odpowiedź ze strony cytolitycznych kom órek T.

Również w zakażeniach o charakterze przewlekłym wykrywa się szczepy zmutowane w rejonie preC/C [74, 75], Pojedyncza substytucja am inokw asu zmienia determ inantę antygenow ą i powoduje, że wirus staje się „niewidoczny” dla systemu odpornościow ego gospodarza. W czasie rozwoju zapalenia przewlekłego zwiększa się heterogenność populacji wirusowej, dochodzi przy tym do akum ulacji m utantów produkujących antygeny rdzeniowe ze zmienionymi epitopam i T-ko- m órkow ym i. M utacje te są następstwem presji im m unologicznej wywieranej na szczep „dziki” i „strategii” HBV uciekającego przed mechanizm am i obronnymi gospodarza.

IV. Uwagi końcowe

Poznanie budowy m olekularnej oraz własności im m unologicznych białek HBV pozwoliło częściowo wyjaśnić rolę, jak ą odgryw ają one w rozwoju zapalenia w ątroby typu B.

B adania kliniczne potw ierdzają, że sam czynnik etiologiczny, jego replikacja i poziom ekspresji genów nie wywołują pierw otnego efektu cytopatycznego. S topień uszkodzenia w ątroby i przebieg kliniczny choroby zależą od nasilenia odpowiedzi immunologicznej zakażonego organizm u. Skuteczna odpowiedź organizm u uw arunkow ana jest przez:

1) osobniczą heterogenność białek HLA,

2) zwiększenie ekspresji HLA we wczesnej fazie zakażenia HBV,

3) odpowiedni poziom cytokin (INT, 11-2, TNF).Różne czynniki takie jak: maskujące działanie prze

ciwciał anty-HBc, stan im munosupresji, współzakaże- nia wirusem atakującym bezpośrednio im munocyty (odra, różyczka, cytomegalowirus, HIV), zakażenie zm utowanym szczepem HBV i wiele innych mają istotny wpływ na rozwój nieadekwatnej odpowiedzi immunologicznej uniemożliwiającej eliminację HBV.

Szereg zagadnień związanych z mechanizmem p a to genezy wzw B pozostaje niewyjaśnionych. Z pewnością lepsze poznanie oddziaływań pom iędz HBV i zakażonym organizm em pozwoli zrozumieć ten skom plikowany proces i umożliwi rozwój efektywnych m etod leczenia i profilaktyki wzw B.

A rty k u ł o trzym ano 16 marca 1994 r.Zaakceptow ano do druku 26 maja 1994 r.

Piśmiennictwo

1. S h a p i r o C N, M a r g o l i s H S (1990) Epidem iologi R eview s 12: 221-227

2. G e r b e r M A , T h u n g S N (1985) Lab Invest 52: 572-5903. T h o m a s H (1990) Springer Sem in Im m unopath 12: 1-34. A l b e r t i A, G e r l i c h W H , H e e r m a n n K - H, P o n t i s -

s o (1990) Springer Sem in Im m unopath 12: 5-235. S y l v a n S P E ' (1991) Liver 11: 1-236. H e e r m a n K M , K r u s e F, S e i f e r M, G e r l i c h W H

(1987) In terviro logy 28: 14-257. G e r l i c h W H, H e e r m a n n K - H , X u a n y o n g L (1992)

Arch Virol S4: 129-1328. H e e r m a n K H , G e r l i c h W H (1989) R heum atol In tern 9.

167-1739. T i o 11 a i s P, P o u r c e l C h , D e j e a n A (1985) N a tu re 317:

489-49510. B a n c r o f t W H , M u n d o n F K, R u s s e l l P K (1972)

J Im m unology 109: 842-84811. N o r d e n f e i t E, L e B o u v i e r G (1974) In terv iro logy 2:

65-7412. O k a m o t o H, I m a i M, M i y a k a w a Y, M a y u m i

M (1987) Bioch and B ioph R es C om m un (1987) 148: 500-50413. N e u r a t h A R , T h a n a v a l a Y (1990) red M H V V an

R e g e n m o r t e 1, A R N e u r a t h , E lsevier Science Publishers B V 403-458

14. M a n g o l d C M T , S t r e e c k R F (1993) J Virol 67 :4558-459715. P e t e r s M, V i e r l i n g J, G e r s h w i n M E , M i l i c h D,

C h i s a r i F V , H o o f n a g l e J H (1991) H epa to logy 13: 977-994

16. S t i b b e W, G e r l i c h W H (1983) J Virol 46: 626-62817. N e u r a t h A R , K e n t S B H, S t r i c k N, P a r k e r K (1988)

A nn In st P asteur Vir 139: 13-3818. T h e i l m a n n L, G o e s e r T (1991) H epato -G astroen tero logy

38: 10-1319. M a c h i d a A, K i s h i m o t o S, O h n u m a N, B a b a K,

I t o h Y, M i y a m o t o H, F u n a t s u G (1984) G astroentero logy 86: 910-918

20. P o n t i s s o P , R u v o l e t t o M G , G e r l i c h W H, H e e r m a n n K H , B a r d i n i R, A l b e r t i A (1989) Virology 173: 522-530

21. K r o n e B, L e n z A, H e e r m a n n K H , S e i f e r M, X u a n - g y o n g L, G e r l i c h W H (1990) H epa to logy 6: 1050-1056

22. H e e r m a n n K H , G o l d m a n n U, S c h w a r t z W, S e y f - f a r t h T, B a u m g a r t e n M, G e r l i c h W H (1984) J Virol 52: 396-402

23. P e r s i n g D H , V a r m u s H E , G a n e m D ( 1 987) J Virol 61 : 1672-1677

148 POSTĘPY BIOCHEMII 40 (3 ), 1994http://rcin.org.pl

24. B i e m a n s R, T h i n e s D, R u n g e r s T, D e W i l d e M, C a b e n z o n T (1991) D N A and C ell B io logy 3: 191-200

25. P e r s i n g D H , V a r m u s H E , G a n e m D (1986) Science 234: 1388-1395

26. C h i s a r i F V , F i l i p p i P, B u r a s J, M c L a c h l a n A, P o p e r H, P i n k e r t C A , P a l m i t e r R D , B r i n s t e r R L (1987) Proc N a tl A cad Sei 84: 6909-6913

27. S t e i n O, F a i n a r u M, S t e i n Y (1972) Lab Invest 26: 262-269

28. C h i s a r i F V , K l o p c h i n K, M o r i y a m a T, P a s q u i - n e l l i C, D u n s f o r d H A , S e l l S, P i n k e r t C A , B r i n s t e r R L. P a l m i t e r R D (1987) C ell 59: 1145-1156

29. N e u r a t h A R , K e n t S B H, S t r i c k N (1986) C ell 46: 429-436

30. P e t i t M A , D u b a n c h e t S, C a m p e i F, V o e t P, D a n g e n e t C h , H a n s e n P (1991) Virology 180: 483-491

31. P o n t i s s o P, R u v o l e t t o M G , G e r l i c h W H , H e e r m a n n K H , B a r d i n i R, A l b e r t i A (1989) Virology 173: 522-530

32. N e u r a t h A R, S t r i c k N, S p r o u l P, R a l p h H E , V a 1 i n s k y J (1990) Virology 176: 448-457

33. N e u r a t h A R , S t r i c k N, S p r o u l P h (1992) J E x p M ed 175: 461-469

34. N e u r a t h A R , S t r i c k N, K e n t S B H (1986) Vaccines 4: 371-375

35. G a v i l a n e s F, G o m e s - G u t t e r i e s J, A r a c i l M, G o n z a l e s - R o s s J M , F e r r a g u t J A , G u e r r o E, P e t e r s o n D R (1990) Biochem J 265: 857-864

36. G e r l i c h W H , D e e p e h R, H e e r m a n K H , K r o n e B, L u X - Y , S e i f e r M , T h o m s s e n R (1990) Vaccines 8: 63-68

37. N e u r a t h A R , S r i c k N, K e n t S B H , P a r k e r K, S e t o B, G i v a r d M (1988) Vaccines 6: 229-234

38. B u d k o w s k a A , D u b r e u i l P, M a i l l a r d P, P o y n a r d T , P i 11 o t J (1990) H epa to logy 6: 1271-1277

39. I b a r r a M Z , M a r a I, B a r t o l o m e J, P o r r e s J G , C a r r e n o V (1989) L iver 9: 153-158

40. S i n c l a i r S, W a k e f i e l d A, L e y G (1990) Springer Sem in Im m u n o p a th 12: 33-45

41. M i l i c h D R , M c L a c h l a n A, T h o r t o n G B (1987) Vaccines 5: 50-55

42. B a r n a b a V, F r a n c o A, A l b e r t i A, B e n v e n u t o R, B a l s a n o F (1990) N a tu re 345: 258-260

43. O u J, L a u b O, R u t t e r W J (1986) Proc N a tl A cad Sei 83: 1578-1582

44. A l m e i d a J D , R u b e n s t e i n D, S t o t t E J (1971) Lancet 2: 1225-1227

45. P a s e k M, G o t o T, G i l b e r t W, Z i n k B, S c h a l 1 e r H, M c K a y P, L e a d b e t t e r G, M u r r a y K (1979) N a tu re 282: 575-579

46. G a r c i a P D , O u J H, R u t t e r W J , W a l t e r P (1988) J C ell B io l 106: 1093-1104

47. Y e h C h T , L i a w Y F , O u J H (1990) J Virol 64: 6141-614748. G e r l i c h W H , G o l d m a n U, M u l l e r R, S t i b b e W,

W o l f f W (1982) J Virol 42: 761-76649. L a n f o r d R E , N o t b v a i l L (1990) Virology 176: 222-233

50. M a g n i u s L O , E s p m a r k J A (1972) J Im m unol 109: 1017-1021

51. B r u s s V, G e r l i c h W H (1988) Virology 163: 268-275

52. M i l l e r R H (1987) Science 236: 722-72553. J e a n - J e a n O, L e r r e r o M, W i l l M, P e r r i c a n d e t M,

R e s s i g n o l J M (1989) Virology 170: 99-10654. M i l i c h D R , M c L a c h l a n A, M o r i a r t y A, T h o r n

t o n G B (1987) J Im m unology 139: 1223-123155. B e r t o l e t t i A, F e r r a r i C, F i a c c a d o r i F, P e n n a A,

M a r g o l s k e e R, S c h l i c h t H J, F l o w e r P, G u i l h o t S, C h i s a r i F V (1991) Proc N a tl A cad Sei U SA 88: 10445-10449

56. O l d s t o n e M B A , L a m p e r t P W (1979) Springer Sem in Im m unopatho l 2: 261-264

57. P i g n a t e l l i M, W a t e r s J, B r o w n J, L e v e r A, I w a r - s o n S, S c h l a f f Z, G e r e t y R (1986) H epato logy 6: 349-353

58. Z h o u D - X , T a r a b o u l o s A, O u J - H , Y e n B (1990) J Virol 64: 4025-4028

59. T w u J S, L e e C H , L i n P M , S c h l o e m e r R H (1988) Proc N a tl A ca d Sei U S A 85: 252-256

60. O n j i M , L e v e r A M L , T h o m a s H C (1989) H epa to lo g y 9: 92-96

61. M i l i c h D R (1987) Im m unological R eview s 99: 71-103

62. M a c h i d a A, O h n u m a H, T a k a i E, T s u d a F, T a n a k a T, N a i t o M, M u n e k a t a E, M i y a k a w a Y, M a y u - m i M (1989) M o l Im m unol 26: 413-421

63. M i l i c h D R , M c L a c h l a n A (1986) Science 234: 1398-1401

64. B o r i s o w a G P, B e r z i n s I, P u s h k o P M , P u m p e n P, G r e n E J , T s i b i n o g i n V V , L o s e v a V, O s e V, U r l i c h R, S i a k k o n H, R o s e n t h a H A (1989) F E B S L e tt 259: 121-124

65. B e e s l e y K M , F r a n c i s M J, C l a r k e BE , B e e s l e y J E , D o p p i n g - H e p e n s t a l P J C , C l a r e J J , B r o w n F, R o m a n o s M A (1990) B io technology 8: 644-649

66. U l r i c h R, B o r i s o w a G P, G r e e n E, B e r z i n I, P u m p e n P, E c k e r t R, O s e V, S i a k k o u H, G r e n E J , v o n B a e h r R, K r u g e r D H (1992) A rch Virol 126: 321-328

67. C a s t i l l o J, B a r t o l o m e J, Q u i r o g a J A , P o r v e s J C , R a v v e n o V (1990) Liver 10: 79-84

68. M i l i c h D R , J o n e s J E , H u g h e s J L, P r i c e J, R a n e y A K, M c L a c h l a n A (1990) Proc N a tl A cad Sei U SA 87: 6599-6603

69. U l r i c h P P , B h a t R A, K e l l y I, B r u n e t t o M R , B o - n i n o F, V y a s G N (1990) J M ed Virol 32: 109-118

70. T o n g P - S , L i J - S , V i t v i s k i L, T r e p o C (1992) Virology 191: 237-245

71. C a r m a n n W F, F a g a n E A , H a d z i y a n n i s S, K a r a - y o a n n i s P, T a s s o p o u l o s N C , W i l i a m s R, T h o m a s H C (1991) H epa to logy 14: 219-222

72. U c h i d a T (1993) M icrobia l Im m unol 37: 425-439

73. R o s s i n c k M J , S i d d i g u i A (1987) J Virol 61: 955-96174. K a n e k o S, M i l l e r R H (1989) J In fect Dis 160: 903-90475. W a k i t a T, K a k u m u S, S h i b a t a M, Y o s h i o k a K,

I t o Y, S h i n a g a w a T, T a k a y a n a g i M, M o r s h i m a T (1991) J Clin Invest 88: 1793-1801

Do członków Polskiego Towarzystwa Biochemicznego

Zarząd P.T.Bioch. uprzejmie prosi wszystkich cz łonków o w pła tę zaległych i bieżących składek członkow skich .Jednocześnie inform ujem y, że w dniu 14 września 1993 roku, na zebraniu Zarządu G łów nego Polskiego Tow arzystw a B iochem icznego ustalono podwyższenie od roku 1994 rocznej opłaty składek członkow skich do sumy 100 000 zł. Natom iast koledzy będący członkam i PTBioch status studenta w in n i w nosić roczną opłatę w w ysokości 50 000 zł.Zachęcamy także do zaprenum erowania „P ostępów B iochem ii” .


Mechanizmy śmierci programowanej komórek (apoptozy)

Mechanisms of the programmed cell death (apoptosis)

EWA SIKORA*

Spis treści:

I. WstępII. Znaczniki apoptozy

II-1. Morfologia komórki apoptotycznejII-2. Synteza białka i mRNAII-3. Endonukleazy i fragmentacja D N AII-4. Inne enzymy

III. Przekazywanie sygnału do apoptozyIII-l. Aktywacja receptora TCRIII-2. Rola receptorów glukokortykoidowychIII-3. cAM P i indukcja apoptozyIII-4. Czynnik nekrozy nowotworu (TNF)III-5. Wolne rodniki tlenoweIII-6. Niedobór czynników wzrostowychIII-7. Udział wapnia w przekazywaniu sygnału do

apoptozyIV. Geny indukowane w komórkach stymulowanych do

apoptozyV. Udział protoonkogenów i onkogenów w apoptozieVI. Rola p53 w apoptozieVII. Hamowanie apoptozyVIII. Uwagi końcowe

Contents:

I. IntroductionII. Markers of apoptosis

II-l. Morphology of apoptotic cell II-2. mRNA and protein synthesis II-3. Endonucleases and D N A fragmentationII-4. Other enzymes

III. Cellular signaling in apoptosisIII-l. T cell receptor (TCR) activationIII-2. Role of glucocorticoid receptorsIII-3. cAM P and induction of apoptosisIII-4. Tumor necrosis factor (TNF)I1I-5. Free oxygen radicalsIII-6. Growth factors deprivationIII-7. Calcium and cellular transduction to apoptosis

IV. Genes induced in cells stimulated to undergo apoptosisV. Role of protooncogenes and oncogenes in apoptosisVI. Role of p53 in apoptosisVII. Inhibition of apoptosisVIII. Concluding remarks

Wykaz stosowanych skrótów: T N F — czynnik nekrozy now otw oru; TCR — receptor kom órek T; ConA — kon- kanaw alina A; PH A — fitohem aglutynina; G R — receptor glukokortykoidow y; G R E — sekwencja D N A wiążąca receptory glukokortykoidow e; PK A — kinaza białkow a zależna od cA M P; P K C — kinaza białkow a C.

I. Wstęp

Śmierć kom órek zw ana nekrozą (martwicą) znana jest od bardzo dawna. Zachodzi ona pod wpływem bardzo różnorodnych czynników mechanicznych, fizycznych, chemicznych i biologicznych, które prow adzą do natychm iastow ego (w ciągu kilku m inut) uszkodzenia błony kom órkowej i organelli, w tym również s truk tu r jądrow ych. Cały proces nekrozy może trwać zaledwie kilkanaście minut. Zaw artość kom órki nekrotycznej wydostaje się na zewnątrz pow odując reakcję obronną organizm u w postaci stanu zapalnego. Rzadko kiedy nekroza ogranicza się do pojedynczych kom órek; na ogół proces ten dotyczy dużej części tkanki [1, 2].

Śmierć kom órek może jednak być, podobnie jak ich podziały, procesem aktywnym , charakteryzującym się indukcją genów i sekwencją pewnych zdarzeń bio-

* D r, Z akład Biochemii K om órki, Insty tu t Biologii D o świadczalnej im. M. Nenckiego, PAN, P asteura 3, 02-093 W arszawa

chemicznych. N azyw ana jest wtedy śmiercią fizjologiczną, program ow aną, sam obójczą lub najczęściej apoptozą (z greckiego opadanie płatków) [1, 3]. T erminów tych naogół używa się zamiennie, aczkolwiek coraz częściej term in apoptoza rezerwuje się wyłącznie do opisu charakterystycznych zdarzeń, jakie m ają miejsce podczas wielu, choć nie wszystkich przypadków naturalnej, nieprzypadkowej, śmierci kom órki. Ponieważ artykuł niniejszy stanowi próbę opisu m echanizm ów aktywnej śmierci, au to rka świadom ie rezygnuje z dociekań terminologicznych używając wszystkich przedstawionych wyżej term inów jak o synonimów naturalnej śmierci kom órki.

Śmierć program ow ana zachodzi w procesie embriogenezy, morfogenezy, podczas wymiany kom órek w tkankach proliferujących, takich jak np. skóra, czy nabłonki [1]. Ponad 90% kom órek um iera podczas dojrzewania tym ocytów w grasicy i kom órek krw iotwórczych w szpiku kostnym [4], Śmierć kom órek jest niezbędna do utrzym ania prawidłowej hom eostazy organizm u. Również kom órki now otw orow e um ierają śmiercią sam obójczą spontanicznie, a także pod wpływem prom ieniow ania jonizującego i cytostatyków [5, 6]. Z apoptozą kom órek nerwowych m am y praw dopodobnie do czynienia w procesach patologicznych takich jak choroba Alzheimera [7, 8]. Także limfocyty C D 4 + u ludzi chorych na AIDS um ierają poprzez apoptozę [9, 10].


A poptoza bardzo często dotyczy pojedynczych komórek i w odróżnieniu od nekrozy nie wywołuje stanu zapalnego, gdyż kom órka rozpada się na tzw. ciałka apoptotyczne, k tóre są natychm iast traw ione przez makrofagi lub sąsiadujące kom órki (Ryc. 1). Apoptoza może trw ać od kilku godzin do kilku dni [11].

M echanizm om śmierci kom órek do niedaw na poświęcano znacznie mniej uwagi niż regulacji podziałów kom órkow ych, choć wydaje się, że obydwa procesy są równie złożone. Niemniej jednak w ciągu ostatnich kilku lat obserwujem y praw dziwą eksplozję badań dotyczących śmierci kom órek. Świadczy o tym chociażby ilość prac przeglądowych jakie nieustannie się pojaw iają [np. 2, 12-18].

II. Znaczniki apoptozy

K om órki apoptotyczne poza specyficzną m orfologią, charakteryzują się pewną sekwencją genetycznych i biochemicznych zdarzeń w nich zachodzących (Ryc. 1). C oraz więcej jednak badań wskazuje na różnorodność m orfologicznego i biochemicznego oraz genetycznego obrazu śmierci kom órki. D latego m ówiąc o znacznikach apoptozy powinniśm y pam iętać, że nie zawsze w um ierającej kom órce występują one wszystkie naraz.

II-l. Morfologia komórki

M orfologia kom órki umierającej różni się w zależności od tego, czy mamy do czynienia ze śmiercią nekrotyczną, czy też sam obójstwem kom órki. K om órki nekrotyczne w początkowej fazie procesu są napę- czniałe, a ich chrom atyna tworzy agregaty. W kolejnej fazie następuje rozerwanie błony i całkow ita dezintegracja struk tu r kom órkowych. N atom iast kom órki apoptotyczne są obkurczone, a chrom atyna skondensowana w obrębie błony jądrow ej. Z czasem błona kom órkow a i błona jądrow a tw orzą uwypuklenia odrywające się od kom órki w postaci wyżej wspom nianych ciałek apoptotycznych, w których uwięzione są morfologicznie niezmienione organella kom órkow e i chromatyna. Kom órka wygląda jakby pączkowała [1],

II-2. Synteza białka i mRNA

Śmierć program ow ana kom órki jest procesem ak tywnym. W skazuje na to jej ham owanie przez inhibitory m RN A i białka. I tak, zarów no u owadów jak i płazów w czasie morfogenezy [19, 20] spontaniczną apoptozę ham ow ała aktynom ycyna D (inhibitor syntezy mRNA), jak też cykloheksoim id (inhibitor syntezy białka). Opóźnienie lub zaham ow anie apoptozy przez

Nekroza

kom órkanapęczniałaorganellauszkodzonechrom atynauszkodzona

Apoptoza

kom órkaobkurczonaorganellanieuszkodzonem arginalizacjachrom atyny

• liza kom órki• destrukcja

organelli• destrukcja

chrom atyny

Fagocytoza Stan zapalny

Ryc. I. S ch em at m orfo lo g iczn y ch zm ian k o m ó rk i n ek ro ty czn e j i ap o p to ty czn e j.

• tw orzenie się ciałekapoptotycznych

• organella n ienaruszone

• chrom atyna pofragm entow ana

Fagocytoza

POSTĘPY B IO C H EM II 4 0 (3 ) , 1994 151http://rcin.org.pl

inhibitory syntezy m akrocząsteczek obserwowano także w wielu kom órkach stym ulowanych do apoptozy. Były to m.in. tymocyty traktow ane deksam etazonem (syntetyczny glukokortykoid) [21], limfocyty naprom ieniow ane prom ieniam i gam m a oraz kom órki limfoidalne i białaczkowe stym ulowane do apoptozy poprzez aktywację receptora kom órkow ego T (TCR) [22-25]. Podobnie, zaham ow anie syntezy mRNA i białka chroniło przed śmiercią kom órki nerwowe hodowane in vitro bez czynników wzrostowych [26]. Jednakże opisywano również kom órki stym ulow ane do apoptozy, w których inhibitory syntezy m RNA i białka nie ham ow ały ich śmierci [27], jak również takie, w których inhibitory syntezy m akrocząsteczek wręcz indukow ały apoptozę [28]. Świadczy to o wielkiej różnorodności m echanizmów prowadzących do nieprzypadkowej śmierci kom órki.

II-3. Endonukleazy i fragmentacja DNA

D o jednej z bardziej charakterystycznych cech kom órek apoptotycznych należy obecność w nich DNA pofragm entow anego na odcinki stanowiące w ielokrotność nukleosom ów (180-200 par zasad) [1, 29]. F ragm entacja DN A stanowi praw dopodobnie pierwszy nieodw racalny etap apoptozy, choć obserwow any nie we wszystkich kom órkach wykazujących m orfologiczne cechy tego procesu [30, 31]. Za fragm entację DNA odpow iedzialna jest aktywacja endonukleaz, katalizujących rozerwanie wiązań internukleosom alnych [32,33]. Jak dotychczas nie zidentyfikow ano specyficznej nukleazy odpowiedzialnej za fragm entację DNA w kom órkach ulegających apoptozie, choć bierze się pod uwagę trzy enzymy: NUC-18, DNAzę I, DNAzę II [34]. Aktyw atoram i dwóch pierwszych enzymów są jony w apnia i magnezu, a inhibitoram i są jony cynku. W przypadku DNAzy II nie wykazano wpływu tych jonów na jej aktywność [34, 35].

O becność pofragm entowanego D N A stanowi podstawę większości m etod stosowanych do identyfikacji kom órek um ierających poprzez apoptozę. Jedną z najprostszych i najczęściej stosowanych jest elektroforeza D N A w żelu agarozowym [29], F ragm enty o wielokrotności nukleosom ów dają w żelu obraz charak terystycznej „drabinki”. C oraz częściej do badania kom órek apoptotycznych wykorzystuje się szereg metod z zastosow aniem cytofluorym etrii przepływowej. W iększość nich opiera się na wykryw aniu kom órek ze zdegradow anym DNA. K om órki apoptotyczne charakteryzują się zmniejszoną barwliwością DNA, co widać jak o dodatkow ą populację kom órek o mniejszej zaw artości DNA niż kom órki w fazie spoczynkowej [29, 36].

II-4. Inne enzymy

Dotychczas poza endonukleazam i zidentyfikow ano kilkanaście enzymów, których aktyw ność wzrasta

w kom órkach apoptotycznych.Bardzo ważną rolę w apoptozie przypisuje się trans-

glutam inazom tkankow ym , których aktyw ność przyczynia się do pow stania usieciowań ciałek apopto tycznych poprzez tworzenie krzyżowych wiązań pomiędzy białkam i z udziałem e(y-glutamylo)lizyny [37, 38],

Ponadto w różnych kom órkach obserw ow ano wzrost aktywności między innymi takich enzymów jak gam m a-glutam ylo transpeptydazy, rybonukleazy, aktyw atora plazm inogenu [15].

III. Przekazywanie sygnału do apoptozy

Apoptozę może wywołać bardzo wiele różnorodnych czynników, zarów no (i) fizycznych takich jak różnego rodzaju prom ieniowanie, szok zimny i cieplny, (ii) chemicznych jak różne cytostatyki, wolne rodniki tlenowe, oraz (iii) biologicznych jak glukokortykoidy, czynnik martwicy now otw oru (TNF), przeciwciała anty Fas/A PO -1, czy niedobór czynników w zrostowych. W yczerpujący zestaw czynników wywołujących śmierć program ow aną znajdzie czytelnik w pracy przeglądowej S e n ’a [15]. Często te same czynniki wywołują również nekrozę. O tym czy kom órka ulegnie przypadkowej śmierci, czy uruchom i program apoptozy decyduje (i) rodzaj czynnika indukującego śmierć (np. T N F wywołuje zarów no apoptozę jak i nekrozę) (ii) długość ekspozycji kom órek i daw ka czynnika stymulującego śmierć, jak to ma miejsce w przypadku różnych cytostatyków , lub w końcu (iii) typ kom órek stymulow anych do śmierci [39, 40],

Niestety, ciągle niewiele jeszcze w iadom o na tem at dróg przekazywania sygnałów kom órkow ych prow adzących do uruchom ienia program u apoptozy. Z pewnością są one bardzo różnorodne tak jak czynniki wywołujące śmierć kom órki. Stosunkow o najwięcej w iadom o na tem at przekazywania sygnału do ap o p tozy w kom órkach limfoidalnych. Są to kom órki, które m ożna doświadczalnie zastym ulować do śmierci poprzez aktywację receptorów błonowych takich jak TCR, czy Fas/A PO -1, receptorów cytosolowych ta kich jak glukokortykoidow e, jak również poprzez uszkodzenia DNA czy jonofory wapniowe. N iektóre z dróg aktywacji tym ocytów do apoptozy pokazano na rycinie 2.

III-l. Aktywacja receptora TCR

TCR (Tceli receptor) jest receptorem tyrozynow ym składającym się z kilku łańcuchów białkowych w tym łańcucha CD3. Dojrzałe limfocyty T rozpoznają obce antygeny poprzez specyficzne receptory TCR. S tym ulacja tych receptorów, podobnie jak działanie plejot- ropowych czynników m itogennych, takich jak kon- kanaw alina A (ConA) i fitohem aglutynina (PHA), prowadzi do wzrostu stężenia wapnia cytosolowego, syntezy interleukiny-2 i proliferacji kom órek [4, 40a]. Paradoksalnie z pozoru, pobudzenie receptora TCR

152 POSTĘPY BIO CHEM II 40 (3 ) , 1994http://rcin.org.pl

TCR

T P A PG E2Adenozyna

Prom ieniowaniejonizująceWolnerodnikidenowe

Ryc. 2. S ch em at d ró g p rzek azy w an ia sygna łu d o a p o p to z y stym ulow anej w ty m o cy tach przez różn e czynnik i. D ex d ek sam e tazo n ; G R — re c e p to r g lu k o k o rty k o id o w y ; T C R — re c e p to r k o m ó re k T; T P A — estry forboli; P G E 2 — p ro sta g la n d y n a ; P K C — k in aza b ia łk o w a C; P K A — k in a z a b ia łk o w a A.

np. przez przeciwciało anty CD3, jak również stym ulacja tymi samymi czynnikami m itogennymi takim i jak Con A czy PHA, ale niedojrzałych limfocytów (tymo- cytów), a także kom órek mieszańcowych wywołuje śmierć poprzez apoptozę [23,41,42], Tak więc ten sam początkow y sygnał może prowadzić, w zależności od stopnia zróżnicow ania kom órki na k tó rą działa, do tak skrajnie różnych efektów jakie stanow ią śmierć i podziały kom órkow e.

III-2. Rola receptorów glukokortykoidowych

G lukokortykoidy są horm onam i sterydowymi p ro dukow anym i w korze nadnerczy. Ich im m unosupre- syjne i przeciwnowotworowe działanie jest znane i wykorzystyw ane od daw na [43-45]. N iedojrzałe limfocyty T indukow ane są do apoptozy poprzez glukokortykoidy już w fizjologicznych stężeniach [49]. T raktow anie glukokortykoidam i zarów no ludzkich[46] jak i mysich [47, 48] kom órek now otw orow ych pochodzących od limfocytów T prowadzi do ich śmierci, nieraz w ciągu zaledwie kilku godzin od dodania do pożywki horm onu [50], O bw odow e limfocyty T są całkowicie oporne na działanie glukokor- tykoidów [51].

G lukokortykoidy pełnią swoją biologiczną funkcję poprzez reakcję ze specyficznym w ew nątrzkom órkowym receptorem zwanym w skrócie GR [52]. Sygnał do apoptozy jest ściśle związany z funkcją tych receptorów, gdyż kom órki linii opornych na działanie glukokortykoidów m ają zm ienioną ilość, bądź funkcję receptorów glukokortykoidow ych [47, 53], Receptory horm onów sterydowych należą do dużej rodziny, w skład której wchodzą także receptory horm onów tyroidowych, kwasu retinoidowego i pochodnych witam iny D [54], W ykazano, że aktywna, zw iązana z ligandem forma receptora glukokortykoidow ego, wiąże się do odcinka DNA o specyficznej sekwencji zwanej G RE (glucocorticoid responsive elements) w miejscu prom otorow ym genu docelowego [55, 56]. Jak wiele innych regulatorów transkrypcji, receptory glukokortykoidow e m ogą stymulować ekspresję jednych genów, a ham ować innych [54]. W bardzo wielu doświadczeniach polegających na transfekcji do kom órek genów kodujących białko receptorowe, a także genów kodujących białka wchodzące w skład czynnika transkrypcyjny AP-1 (Fos, Jun) wykazano, że występuje wzajemne ham ujące działanie tych dwóch czynników transkrypcyjnych. M oże ono występować na poziomie reakcji białek lub w innych przypadkach

POSTĘPY BIO CHEM II 40 (3 ) , 1994 153http://rcin.org.pl

na poziom ie wiązania z DN A (praca przeglądowa, [57]). Jak do tej pory brak jest danych doświadczalnych na tem at oddziaływań tych dwóch czynników w kom órkach stym ulow anych do apoptozy. Nasze wstępne dane ( S i k o r a , dane niepublikowane) wskazują na silne powinowactwo czynnika transkrypcyjnego AP-1 wyizolowanego z tym ocytów stym ulow anych do apoptozy deksam etazonem do sekwencji specyficznej dla receptorów glukokortykoidow ych (GRE).

III-3. cAM P i indukcja apoptozy

Inny mechanizm indukcji apoptozy występuje w kom órkach stym ulowanych do śmierci przez podwyższanie poziom u cA M P w komórce. Zależy on od obecności w kom órce funkcjonalnej kinazy A, k tóra jest aktyw ow ana przez cA M P (PKA) [58], W ykazano, że większość m utantów nie odpow iadających na podwyższenie stężenia cA M P apoptozą ma zm ienioną ekspresję lub funkcję PK A [59]. P onad to trudności w uzyskaniu m utantów , opornych jednocześnie na glukokortykoidy i cA M P, m ogą świadczyć o niezależności tych dwóch m echanizm ów [60]. O statnio jednakże udało się wyselekcjonować m utan ta mysich kom órek limfoidalnych, który pom im o obecności zarówno funkcjonalnych receptorów GR, jak i funkcjonalnej PK A jest oporny na działanie zarów no gluko- kortykoidów jak i cA M P [61]. P raw dopodobnie więc te dwie drogi przekazywania sygnału kom órkow ego są niezależne tylko do pewnego m om entu. Sądzi się, że cA M P bierze być może, udział w fosforylacji receptora glukokortykoidow ego, gdyż antagonista tego receptora całkowicie znosił indukcję apoptozy w tymocy- tach wywoływaną analogiem adenozyny zwiększającym stężenie cA M P [62]. Niewykluczone, że in terakcja tych dwóch dróg przekazywania sygnału występuje na poziom ie regulacji transkrypcji [61]. Spostrzeżenie to wym aga jednakże doświadczalnego potwierdzenia.

III-4. Czynnik nekrozy nowotworu (TNF)

Czynnik nekrozy now otw oru T N F -a produkow any przez m akrofagi oraz limfotoksynę (TNF-/?) p rodukowaną przez limfocyty identyfikowano pierwotnie jako czynniki antynow otw orow e. Później wykazano, że m ają one badzo szerokie spektrum działania jako czynniki antywirusowe, im m unoreglatorowe, a nawet stym ulujące podziały kom órkow e [64], T N F -a w niektórych kom órkach wywołuje zarów no nekrozę jak i apoptozę [40]. W kom órkach wielu typów takich jak np. ludzkie kom órki białaczkowe HL-60, czy też U937, a także mysie L929 wykazano tylko apoptotyczne działanie T N F -a [63]. Działanie T N F -a jest plejot- ropowe. Generuje on wolne rodniki tlenowe w tym podtlenek azotu i indukuje hydrolizę sfingolipidów do ceram idu [65]. Uważa się, że ceram id może być wewnątrzkom órkow ym pośrednikiem w przekazywa

niu sygnału do apoptozy wywołanej T N F -a [66], Sam ceramid podobnie jak T N F -a wywoływał apoptozę w wielu mysich i ludzkich kom órkach now otw orowych [63, 66]. Receptory T N F (typ I i II) należą do rodziny receptorów, w skład której wchodzą poza nimi receptor czynnika wzrostu nerwów [67], antygen CD40 limfocytów B [68], a także antygen Fas/Apo-1 [69]. Fas jest antygenem występującym w błonach mysich kom órek, natom iast Apo-1 stanowi ludzki odpowiednik tego antygenu. Pobudzenie tego receptora przeciwciałem anty Fas prowadziło do apoptozy mysich kom órek białaczkowych i fibroblastów, do których w prow adzono gen kodujący polipeptyd Fas [69]. N atom iast myszy, których tymocyty nie mają aktywnego Fas cierpią na chorobę autoim m unoreak- tywną z powodu zaburzeń w apoptozie tych kom órek skierowanych przeciwko własnym antygenom [70]. N iedaw no udało się zidentyfikować w limfocytach ligand tego receptora. Jest to białko transm em branowe o dużej homologii z T N F -a i TNF-/?. Jednakże sklonowany szczurzy ligand receptora Fas/Apo-1 nie aktywował receptorów T N F z ludzkich kom órek [71]. Rola tego liganda i jego receptora wciąż pozostaje bardzo zagadkowa.

III-5. Wolne rodniki tlenowe

Wiele fizyczynch i chemicznych czynników indukujących apoptozę wywołuje stres oksydacyjny pow odujący generację wolnych rodników tlenowych [72]. N a przykład, zarówno prom ieniowanie ultrafioletowe jak i gam m a wywołują apoptozę, jak też generują powstawanie takich aktywnych form tlenu jak H 20 2 i O H ' [72], O statn io zauważono, że podtlenek azotu, który jest wolnym rodnikiem tlenowym indukuje apoptozę w m akrofagach i m onocytach [73]. O b niżenie poziom u wewnątrzkom órkowych zm iataczy wolnych rodników tlenowych często czyni kom órkę bardziej wrażliwą na apoptozę indukow aną egzogennie podanym i wolnymi rodnikam i. O dw rotnie, ap o p tozę wywołaną T N F m ożna zaham ow ać podając tioredoksynę, k tó ra jest zmiataczem wolnych ro d ników tlenowych [75]. Jaki może być udział wolnych rodników w indukcji apoptozy? W iadom o, że wolne rodniki tlenowe prow adzą do uszkodzeń DNA, które z kolei aktywują poli(ADP-rybozo) polimerazę (praca przeglądowa [76]). Poli AD P-rybozylacja prowadzi do obniżenia wewnątrzkomórkowej puli N A D /N A D H i spadku stężenia ATP. Pozbawienie kom órki energii może stanowić bezpośrednią przyczynę jej śmierci. Ponadto wolne rodniki tlenowe prow adzą do perok- sydacji lipidów błon kom órkowych. W m itochond- riach pod wpływem wolnych rodników tlenowych następuje wypływ wapnia [77]. W olne rodniki tlenowe aktywują niektóre geny. Niewykluczone, że są to geny aktywne w procesie apoptozy. T N F na przykład indukuje aktywność czynnika transkrypcyjnego N Fxb [78]. Również całkiem niedawno wykazano, indukcję tego


czynnika transkrypcyjnego podtlenkiem w odoru [79],

I I I-6 . Niedobór czynników wzrostowych

Bardzo wiele już wiemy na tem at regulacji cyklu kom órkow ego i stymulacji kom órek do podziału czynnikami wzrostu. D odanie czynników wzrostowych do pożywki pow oduje aktywację genów cyklu kom órkowego i kaskadę wielu zdarzeń biochemicznych, w tym procesów fosforylacji [80, 81]. Niestety sytuacja odw rotna tzn. pozbawienie kom órek czynników wzrostowych nie jest tak jasna. W wielu przypadkach prowadzi do zaham ow ania podziałów i apoptozy aczkolwiek trudno jest mówić o jednakow ym m echanizmie regulującym ten proces we wszystkich przypadkach. Usunięcie epiderm alnego czynnika wzrostu powoduje śmierć mysich kom órek em brionalnych [82], natom iast niedobór czynnika wzrostu nerwu pow oduje apoptozę szczurzych kom órek PC 12 i kom órek neuronalnych [83]. Podobnie usunięcie z pożywki płytkowego czynnika wzrostu pow oduje śmierć kom órek glejowych [84]. A poptozę spow odow aną usunięciem specyficznych czynników wzrostowych wielokrotnie obserwowano w przypadku progenitorow ych kom órek hem atopoetycznych i kom órek limfoidalnych [17]. N iedobór czynników wzrostowych z jednej strony może prowadzić do spadku ekspresji genów niezbędnych do przeżycia (np. bcl-2) lub aktywacji genów zaangażowanych w regulację apoptozy (c-myc, p53). Niewykluczone, że spadek pobudzenia receptorów czynników wzrostowych prowadzi do ekspresji nowych genów [17].

I I I-7 . Udział wapnia w przekazywaniu sygnału do apoptozy

Podobnie jak w wielu innych procesach kom órkowych, w tym proliferacji, jony wapniowe wydają się odgrywać ważną rolę także w przekazywaniu sygnału do apoptozy [85], Chociaż znane są przykłady ham owania apoptozy spow odow ane wzrostem w ew nątrzkom órkow ego stężenia jonów wapnia [86], to jednak w większości znanych przypadków wzrost stężenia cytozolowego wapnia towarzyszy indukcji apoptozy. I tak wzrost stężenia wapnia obserw ow ano w limfocytach stymulowanych do śmierci poprzez aktyw ację receptora TCR, a także przez glukokortykoidy i jonofory wapniowe [21, 87]. Różnica pomiędzy stym ulacją kom órki do apoptozy i do podziałów na tym etapie przekazywania sygnału dotyczy praw dopodobnie aktywności kinazy C. Stym ulacja kom órek do proliferacji związana jest ze wzrostem aktywności tego enzymu, podczas gdy aktyw atory kinazy C, estry forbolu, często ham owały apoptozę [21, 88-91]. I odwrotnie, obserwowano indukcję apoptozy w kom órkach traktow anych inhibitoram i kinazy C. I tak na przykład, polimyksyna B indukow ała apoptozę ludzkich limfocytów T [92], a staurosporyna kom órek

wielu linii nowotworow ych [93]. Jon w apnia jest aktyw atorem zarów no endonukleaz (DNAzy I, N U C - 18), jak również transglutam inaz tkankow ych ulegających aktywacji w procesie apoptozy. W zrost wewnątrzkom órkow ego stężenia wapnia jest również niezbędny do zmian jaki zachodzą w cytoszkielecie podczas tworzenia ciałek apoptotycznych [94].

W ludzkich kom órkach białaczkowych obserw ow ano indukcję genu kalm oduliny pod wpływem deksam etazonu [95], K alm odulina należy do białek w iążących wapń i bierze udział w regulacji aktywności bardzo wielu enzymów. Indukcja tego genu występowała tylko w kom órkach z funkcjonalnym i receptoram i glukokortykoidowym i. K om órki zm utowane, nie mające receptorów glukokortykoidow ych nie wykazywały wzrostu ekspresji kalm oduliny [95].

IV. Aktywacja genów związana z indukcją apoptozy

Program ow ana śmierć kom órki, podobnie jak p ro liferacja, jako proces aktywny wymaga praw dopodobnie ekspresji wielu genów. D o dzisiaj zidentyfikowano kilkanaście genów, których wzrost ekspresji obserwuje się po zadziałaniu czynnika stym ulującego apoptozę. Przy czym część z nich, tak jak np. ced-3 i ced-4, ma związek tylko ze śmiercią program ow aną, n a to miast inne, tak jak np. protoonkogeny, biorą udział również w regulacji innych procesów.

Jednym z genów, którego ekspresja ulega indukcji w kom órkach stym ulowanych do apoptozy jest TR PM -2 (testosterone repressed prostatic message-2). W zrost syntezy mRNA tego genu obserwow ano m.in. w czasie regresji horm ono-zależnego mysiego now otw oru Shionogi [96], w ludzkich kom órkach now otworu prostaty po działaniu chem ioterapeutyków [97], po indukcji apoptozy w mysich kom órkach nowotworow ych L929 traktow anych T N F czy inhibitoram i topoizom erazy II [98], oraz w um ierających kom órkach ludzkiego now otw oru sutka [99], W ykazano wysoką hom ologię pomiędzy TR PM -2, a genem SGP-2 (sulphated glykoprotein-2), którego mRNA oraz białkowy produkt występuje w wielu tkankach (jądrach, prostacie, wątrobie, pęcherzu m oczowym i innych) [100]. W kom órkach apopto tycznych obserwuje się w ielokrotny wzrost ilości m RNA tego genu, podobniejak TR PM -2 [101]. O bydw a geny należą do tej samej rodziny co gen kodujący klastrynę związaną z procesem różnicowania kom órek [102]. T rudno jest powiedzieć jak ą rolę w kom órkach ulegających apoptozie mogą odgrywać białka kodow ane przez te geny. W yizolowano również dwa klony mRNA tzw. RP-2 i RP-8 specyficzne dla tym ocytów stym ulowanych do apoptozy. Przypuszcza się, że funkcja tych mRNA pow inna być ściśle związana z procesem program ow anej śmierci [103].

U nicienia Caenorhabditis elegans zidentyfikow ano geny ulegające ekspresji w kom órkach umierających

POSTĘPY BIOCHEMII 4 0 (3 ), 1994 155http://rcin.org.pl

śmiercią naturalną w procesie morfogenezy. Są to tzw. geny ced-3, ced-4. Gen ced-4 koduje białko, które nie wykazuje żadnego podobieństw a do dotychczas znanych białek [104], N atom iast gen ced-3 koduje białko hom ologiczne z białkiem ICE (interleukin-fl-convertig enzyme), występującym w tkankach ssaków. ICE jest proteazą, aktyw ującą 1-/? interleukinę, pośredniczącą w reakcjach związanych ze stanem zapalnym [105]. Transfekcja genu IC E do szczurzych fibroblastów pow odow ała ich śmierć, aczkolwiek trudno jest cokolwiek powiedzieć o mechanizmie tego procesu [106].

V. Udział protoonkogenów i onkogenów w apoptozie

Indukcję protoonkogenów c-fos, c-jun i c-m yc obserwowano w wielu różnych kom órkach stym ulowanych do apoptozy (Tabela 1). Należą one do genów tzw. wczesnej odpowiedzi kom órkowej i są również indukow ane w kom órkach stymulowynch m.in. do proliferacji [107, 113]. Protoonkogeny te grają rolę czynników transkrypcyjnych. Białka Fos i Jun tworzą dimery o nazwie czynnika transkrypcyjnego AP-1. W tym ocytach szczurzych stym ulowanych do apoptozy dekasm etazonem wykazano wzrost w iązania białka AP-1 ze specyficzną sekwencją DNA [114,, 115]. Rolę protoonkogenów , a także czynników transkrypcyjnych w śmierci kom órki om ówiono szerzej w a rtykułach przeglądowych S i k o r y [116, 117]. Uważa się, że w pewnych przypadkach protoonkogeny, a w innych onkogeny m ogą „uwrażliwiać” kom órkę na apo- ptozę. D obry przykład stanowić może tu mechanizm transform acji nowotworowej wywoływanej przez on-

kogennego adenovirusa zawierającego DNA. Do pełnej transform acji nowotworowej kom órek niezbędna jest w spółpraca dwóch onkogenów tego wirusa, E l A i E l B. Przy czym, jak wykazano, sam onkogen E l A wywoływał apoptozę w kom órkach nerki szczura podczas gdy jedno z dwóch białek onkogenu E1B (19-kDa) ham owało śmierć tych kom órek, podobnie jak ludzki protoonkogen bcl-2 [118, 119]. Tak więc wydaje się, że „nieśm iertelność” w postaci nieograniczonych podziałów nie może ujawnić się bez ekspresji genu indukującego śmierć. O statn io jednak wykazano, że wręcz przeciwnie produkt białkowy genu E l A 12S, ham ował apoptozę szczurzych kom órek pow odując jednocześnie ich immortalizację. Udział E1B n ato miast sprow adzałby się zatem do transform acji now otworowej zim m ortalizowanych kom órek [120].

W yniki innych doświadczeń zdają się jednak potwierdzać tezę o bardzo ścisłym związku pomiędzy progresją cyklu kom órkowego indukow aną onkoge- nami a śmiercią kom órki. M ianowicie wykazano, że gen chimeryczny pełniący funkcję czynnika transk rypcyjnego, tzw. E 2 A -P B X 1 powstały na skutek translokacji chrom osom u 1 i 19 limfocytów B ch arak teryzującej niektóre typy białaczek wieku dziecięcego, powodował w myszach transgenicznych transform ację now otw orow ą kom órek limfoidalnych. Transform acja ta jednakże poprzedzona była masowym wymieraniem kom órek progenitorow ych zarówno B jak i T [121],

VI. Udział p53 w apoptozie

Białko p53 jest produktem genu supresoru now otworu i w formie niezmutowanej bierze udział w regulacji cyklu kom órkow ego*1. Podwyższony poziom p53 prowadzi do zatrzym ania podziałów kom órkowych [122]. W ykazano, że podwyższona ekspresja genu p53 wywołuje apoptozę w wielu kom órkach [123, 124], Jednakże myszy pozbawione tego genu (tzw. knock ou t) rozwijały się bez żadnych zaburzeń m ogących świadczyć o zachwianiu równowagi pomiędzy proliferacją i śmiercią kom órek [125]. W innych doświadczeniach wykazano, że gen p53 jest niezbędny do indukcji apoptozy w tym ocytach, ale tylko wywoływanej przez czynniki uszkadzające DNA. M ianowicie tymocyty myszy pozbawionych p53 um ierały pod wpływem glukokortykoidów , natom iast wykazywały całkow itą oporność (zarówno in vivo jak i in vitro) na śmierć indukow aną prom ieniowaniem jonizującym [126, 127]. Doświadczenia te wykazują, że istnieją przynajmniej dwie drogi indukcji apoptozy, przy czym tylko jedna z nich zależałaby od p53. Rola p53 w indukcji apoptozy jest niezbyt jasna. Być może wzrost ekspresji p53 wpływa specyficznie na aktywację genów indukow anych w czasie apoptozy [128], N iewykluczone, że udział p53 w apoptozie związany jest

’* W łasności genu p53 om ów iono dokładniej w artykule H enryka B e r b e c i a Post. Biochem. (1994) 40: 6-10

T abela 1.In d u k c ja p ro to o n k o g e n ó w w k o m ó rk a c h sty m u lo w an y c h do ap o p to zy .

k o m ó rk iczynnik

in d u k u jącya p o p to z ę

p ro to o n k o g e n źró d ło

szczurzefib ro b la s ty

n ie d o b ó rczynn ików

w zrostow ychc-m yc [107]

szczu rza p ro s ta ta k a s tra c ja c-fos, c -m yc [108]

m ysi n o w o tw ó r S hiongi

k as tra c ja c-fos, c -m yc [96]

szczurze tym o cy ty d e k sam etazo n c-fos, c-jun c-m yc

[109]

m ysie lim focyty in te rle u k in o z a leżn e

n ie d o b ó rin te rleu k in y

c-fos, c-jun [110]

k o m ó rk i nerw ow e k w as k ainow y c-fos [111]

lu d zk ie k o m ó rk i H U V E

T N F c-jun [112]

ludzk ie k o m ó rk i M C F -7

n ie d o b ó res tro g en u

c-fos [99]


z rolą tego genu supresoru now otw oru w mechanizmie reperacyjnym kom órki. Jeśli uszkodzenia nie są zbyt rozległe, to po dokonaniu napraw kom órka podejmuje norm alną proliferację. Jeśli jednak przekraczają one możliwości naprawcze kom órki to „popełnia ona sam obójstw o” w „ucieczce” przed transform acją nowotworową, do której prowadziłyby powstałe m u tacje. Rola p53 w apoptozie wydaje się jednak jeszcze bardziej skom plikow ana jeżeli weźmiemy pod uwagę fakt, że w leukemicznych kom órkach interleukinoza- leżnych zaham ow anie ekspresji p53 powodowało wzrost ich przeżywalności. Z drugiej strony nadekspresja p53 przyspieszała ich śmierć, ale tylko w nieobecności interleukiny 3. D odanie do pożywki tej cytokiny całkowicie równoważyło „śm iercionośny” efekt p53. Wynik tych doświadczeń sugeruje, że p53 bierze udział w regulacji apoptozy indukowanej nie tylko uszkodzeniami DNA. M ożna sądzić, że przynajmniej w niektórych kom órkach p53 ma swój udział w przekazywaniu sygnału poprzez czynniki wzrostowe [129].

VII. Hamowanie apoptozy

Śmierć kom órek jest niezbędna w utrzym aniu p rawidłowej ich liczby w organizmie. Stanowi także jeden z m echanizm ów obronnych przyczyniając się do usuwania kom órek uszkodzonych i zm utowanych. Potencjalnie każda kom órka organizm u jest zdolna do uruchom ienia program u śmierci. O tym, czy to nastąpi czy nie, decyduje bardzo wiele czynników zarówno wewnętrznych jak i zewnętrznych (Ryc. 3). O wewnętrznych możliwościach kom órki do popełnienia sam obójstwa stanowi praw dopodobnie wzajemne oddziaływanie genów indukujących apoptozę z jednej strony i ham ujących ten proces, z drugiej. Do dzisiaj udało się badaczom poznać kilka takich antagonistycznie działających „układów genów”. Są to geny ced-3, ced-4 i gen ced-9 , geny bcl-2 i bax, geny bcl-x oraz IC E i crmA.

O b e c n o ść lub b ra k sygnału k o m ó rk o w eg o

o b e c n o ś ć lu b b ra ksu b s ta n c jiodży w czy ch

k o m ó rk o w eg o s tan

; m etabo liczny sto p ień

uszkodzeń

m ito z a

stan spoczynkowy

r ó ż n ic o w a n ie

a p o p to z a

Ryc. 3. Z ew n ętrzn e i w ew nętrzne czynn ik i w p ływ ające n a stan k o m ó rk i.

U obleńca C. elegans w procesie morfogenezy um iera 131 komóek. W kom órkach tych są aktywne tzw. geny „śmierci” ced-3 i ced-4. N atom iast w pozostałych kom órkach, które przeżywają okres morfogenezy jest aktywny gen ced-9 , k tóry jak w ykazano ham uje ap o p tozę [130].

W kom órkach ssaków występuje gen bcl-2, który wykazuje 22% strukturalnej homologii z genem ced-9 i hom ologię funkcjonalną w ham ow aniu apoptozy [131, 132]. Po raz pierwszy gen bcl-2 zidentyfikowano w kom órkach ziarnicy złośliwej, now otw oru limfocytów B, w miejscu translokacji chrom osom u 14 i 18. W wyniku tej translokacji następuje wzmożona synteza m RNA bcl-2, gdyż gen ten dostał się pod kontrolę sekwencji regulatorowej ciężkiego łańcucha im munog- lobuliny [133, 134]. Później niejednokrotnie wykazywano, że rola bcl-2 wiąże się raczej z przeżywalnością kom órek niż stym ulowaniem ich do proliferacji. Pro- toonkogen ten np. ham ow ał śmierć wyselekcjonowanych kom órek hem atopoetycznych, które pozbaw iono limfokin [135,136]. Limfocyty T, zarów no wyizolowane z grasicy jak też obwodowe otrzym ywane z myszy transgenicznych, w których dokonano transfekcji genu bcl-2 przeżywały pom imo traktow ania ich w sposób, k tóry norm alnie powoduje śmierć kom órek (pozbawienie czynników wzrostowych, ekspozycja na p ro m ieniowanie jonizujące, glukokortykoidy, estry forbolu, jonom ycynę, azydek sodu) [137]. W innych doświadczeniach wykazano ham owanie pod wpływem bcl-2 delecji klonalnej tymocytów, k tóra zachodzi poprzez apoptozę [138], W ykazano również, że b łonowe białko 1 wirusa Epstein-Barr rozregulowuje ekspresję bcl-2 i blokuje apoptozę w kom órkach zainfekowanych tym wirusem [139]. K om órki nerwowe szczura, w których dokonano transfekcji ludzkiego genu bcl-2, wykazywały w hodowli znacznie wydłużoną przeżywa- lność (do kilku tygodni), nawet gdy pozbawiono je czynnika wzrostu nerwu [140].

Gen bcl-2 ham uje również apoptozę wywołaną protoonkogenem c-myc. K om órki chomicze, które wykazywały zarówno ekspresję jednego jak i drugiego genu charakteryzow ały się znacznie większą przeżywalnością niż kom órki, w których indukow ano tylko c-m yc [141]. Podobnie indukcja c-myc w szczurzych fibroblastach pow odow ała śmierć morfologicznie scharakteryzow aną jako apoptozę. Jeśli w kom órkach dokonano transfekcji genu bcl-2 wtedy nie tylko przeżywały, ale również zaczynały się dzielić [142]. Szczegółowe badania rozmieszczenia białka Bcl-2 w różnych tkankach wykazały obecność jego w miejscach, w których zachodzą procesy różnicowania kom órek i ich selekcji przez apoptozę. Bcl-2 zdaje się występować w kom órkach, które są już zróżnicowane i nie podatne na apoptozę [143]. O statnio wykazano, że białko Bcl-2 współdziała w regulacji apoptozy z tzw. białkiem Bax. O bydw a białka wykazują duże p o d o bieństwo w sekwencji am inokwasów i tworzą ze sobą kompleksy. Jeżeli w kom órce jest nadm iar Bcl-2 to


wtedy związuje ono całą pulę białka Bax. Pozostałe białko Bcl-2 natom iast tworzy hom odimery. Taka sytuacja pozwala kom órce na przeżycie. O dwrotnie, jeśli w kom órce występuje nadm iar Bax, to ilościowo dom inujące hom odim ery tego białka przechylają szalę w stronę śmierci kom órki [144]. Interesujące jest jaką funkcję pełnią te białka. Jeśli o funkcji białka Bax nic jeszcze nie możemy powiedzieć, to na tem at biochemicznej roli Bcl-2 pojawiły się już pierwsze doniesienia. Białko Bcl-2 zlokalizowane jest w zewnętrznej błonie m itochondrialnej, błonie jądrow ej i częściowo w siateczce śródplazmatycznej [131,145], Nie w ykazano jednakże żadnego związku pomiędzy Bcl-2, a oksydacyjną fosforylacją. Postuluje się natom iast, że Bcl-2 może brać udział w „zm iataniu” wolnych rod ników tlenowych, bądź też w przeciwdziałaniu efektów przez nie wywoływanych w indukcji apoptozy. W mysich limfocytach gen bcl-2 całkowicie zapobiegał apoptozie indukowanej nadtlenkiem w odoru, jak również nadekspresja tego genu znosiła całkowicie peroksyda- cję lipidów pow odow aną zwykle przez wolne rodniki tlenowe [146]. Postuluje się też udział Bcl-2 w przekazywaniu sygnałów kom órkow ych poprzez związek z białkiem R-ras [147]. M echanizm ochrony kom órki przed śmiercią z udziałem bcl-2 i bax nie jest jedyny, w ykazano bowiem, że w myszach pozbawionych bcl-2 genu kom órki układu nerwowego rozwijały się praw idłowo [148],

Innym kandydatem do ochrony kom órki przed śmiercią może być niedawno wyizolowane, białko zwane Bcl-x, które występuje w formie długiej i k ró tkiej. Przy czym dłuższa z nich podobnie jak Bcl-2 m iałaby chronić kom órki przed śmiercią, a krótsza, podobnie jak Bax, stym ulować je do apoptozy [149].

Inną parę genów działających antagonistycznie z punk tu widzenia „życia i śmierci” kom órek stanowić m ogą geny IC E i crmA. W ykazano, że nadekspresja IC E pow odow ała śmierć szczurzych fibroblastów. Z aham ow anie apoptozy w tych kom órkach uzyskano poprzez m ikroiniekcję bcl-2 lub genu wirusa ospy bydlęcej crmA, którego białkowy produk t jest inhibitorem proteazy IC E [108]. M ikroiniekcja genu crmA ham ow ała także śmierć kom órek nerwowych kurczęcia wywoływaną niedoborem czynnika wzrostu nerwu [150]. W ykazano także, że śmierć tych kom órek może być indukow ana nadekspresją ICE. Brakuje jednakże doświadczeń, w których bezpośrednio by wykazano, że crmA ham uje śmierć kom órek nerw owych indukow aną genem IC E lub jego produktem białkowym.

W ydaje się, że lista genów zdolnych do zaham ow ania apoptozy jest otw arta. Szczególnie dobrym źródłem do ich poszukiwania powinny być kom órki zróżnicowane, mniej podatne na spontaniczną apoptozę od kom órek proliferujących. I tak np. z kom órek leukemicznych stym ulowanych do różnicowania estrami forbolu wyizolowano gen M C L l o sekwencji podobnej do sekwencji genu bcl-2 [151].

VIII. Uwagi końcowe

Drogi aktywacji kom órki do apoptozy m ogą być bardzo różnorodne. Nie jesteśmy w stanie dzisiaj odpowiedzieć na pytanie, w którym momencie występuje połączenie tych dróg i indukcja procesów, które są jednakow e niezależnie od bodźca wywołującego śmierć i typu kom órki, w której ona następuje. W ydaje się jednak wielce praw dopodobne, że drogi te krzyżują się na etapie aktywacji i interakcji czynników transkrypcyjnych. Funkcje czynników transkrypcyjnych pełnią produkty genów c-fos i c-jun tworząc dimery o nazwie AP-1. Również białko Myc, p53, a także receptory glukokortykoidow e pełnią funkcję czynników transkrypcyjnych. Niestety, nie w iadom o jeszcze jakie geny m ogą podlegać regulacji przez te czynniki transkrypcyjne w procesie apoptozy.

PodziękowanieA utorka pragnie serdecznie podziękować P ani Prof.

B. G r z e l a k o w s k i e j - S z t a b e r t za dyskusję i cenne wskazówki pom ocne w przygotow aniu niniejszej pracy.

Artykuł otrzymano 16 maja 1994 r.Zaakceptowano do druku 3 czerwca 1994 r.

Piśmiennictwo

1. W y l l i e A H , K e r r J F R, C u r i e A R (1980) In t R ev C yt 68: 251-306

2. C o h e n J J (1993) Im m unol Today 14: 126-1303. K e r r J F R . W y l l i e A H, C u r r i e A R (1972) Br J C ancer

26: 239-2574. A b b a s A K , L i c h t m a n A H, P o b e r J S (1991) W:

C e llu la r an d M o le cu la r Im m u n o lo g y , S o u n d ers C o m p a n y5. S m e t s L A (1994) A n ti-C ancer D rugs 5: 3-96. W y l l i e A H (1992) C ancer M eta st R ev 11: 95-1037. F o r l o n i G (1993) F u n d N euro l 8: 211-2258. L o o D T , C o p a n i A, P i k e C J , W h i t t e m o r e E R ,

W a l e n c e w i c z E J , C o t m a n C W (1993) Proc A cad Sei U SA 90: 7952-7955

9. M e y a a r d L, O t t o S A, J o n k e r R R , M i j n s t e r MJ , K e e t R P M , M i e d e m a F (1992) Science 257: 217-218

10. A m e i s e n J C (1992) Im m unol Today 13: 388-39111. W i l l i a m s G T , S m i t h C A, M c C a r t h y N J, G r i m e s

E A (1992) Trends C ell B iol 2: 263-26712. W i l l i a m s G T , S m i t h C A (1993) Cell 74: 777-77913. F e s u s L (1993) F E B S L e tt 328: 1-514. M a r t i n S J, G r e e n D R , C o t t e r T G (1994) Trends B iol

Sei 19: 26-3015. S e n S (1992) Biol R ev 67: 287-31916. E v a n s V G (1993) Cell B iol In terna l 17: 461-47617. C o l l i n s M C L, R i v a s A L (1993) Trends B iochem Sei 18:

307-30918. B u r s h W, O b e r h a m m e r F, S c h u l t e - H e r m a n

R (1992) Trends P harm ac Sei 131: 245-25119. W e b e r R (1969) W: L ysosom es in B iology an d P a th o lo g y

t 2 D ingle JT , Fell H B (red) N o r th H o lla n d P u b lish in g C o m p an y , A m ste rd am s tr 437-461

20. L o c k s h i n R A, W o n g T R (1981) J Cell B iol 91: 21 l a21. M c C o n k e y D J , N i c o t e r a P, H a r t z e l l P, B e l -

l o m o G, W y l l i e A H , O r r e n i u s S (1989) Arch B iochem B iophys 269: 365-370

22. Y a m a d a T, O h y a m a H (1988) In t J R ad ia t B iol 53: 65-7523. U c k e r D S , A s h w e l l J D , N i c k a s G (1989) J Im m unol

143: 3461-3469


24. S h i Y , S a h a i B M , G r e e n D R (1989) N a tu re 3 3 9 :625-62625. L a n o t t e M. R i v i e r e J B , H e r m o u e t S, H o u g e G,

V i n t e r m y r O K , G j e r s t e n B T , D o e s k c l a n d S O(1991) J Cell P hysio l 146: 73-80

26. M a r t i n D P , S c h m i d t E S , D i S t e f a n o P S , L o w r y O H , C a r t e r J G , J o h n s o n E M (Jr.) (1988) J C ell Biol 106: 829-844

27. K r u m a n I I , G u k o v s k a y a AS , P e t r u n k a y a VV, B e l e t s k y I P , T r e p a k o w a E S (1992) J C ell P hysio l 153: 112-117

28. M a r t i n S J, L e n o n S V, B o n h a m A M , T G C o t t e r T G (1990) J Im m unol 145: 1859-1867

29. C o m p t o n M M (1992) C ancer M e t has R evs 11: 105-11930. O r m e r o d M G , O ’ N e i l l C F , R o b e r t s o n D, H a r -

r a p K R (1994) E x p C ell R es 211: 231-23731. C o h e n G M , S u n X - M , S n o w d e n R T , D i n s d a l e D,

S k i l i e t e r D N (1992) Biochem J 286: 331-33432. A r e n d s M J, M o r r i s R G , W y l l i e A H (1990) Am

J P a tho l 136: 593-60833. C o h e n J J, D u k e R C (1984) J Im m unol 132: 38-4234. P e i t s c h M C , M a n n h e r z H G , T s c h o p p J (1994)

Trends C ell B iol 4: 37-4135. G a i d o M L , C i d l o w s k i J A (1991) J B iol C hem 266:

18580-1858536. D a r z y n k i e w i c z Z, B r u n o S, D e l B i n o G , G o r

c z y c a W, H o t z M A , L a s s o t a P, T r a g a n o s F (1992) C y to m e try 13: 795-808

37. F e s u s L, T h o m a z y V, F a l u s A (1987) F E E B S L e tt 284: 104-108

38. F e s u s L, D a v i e s P J , P i a c e n t i n i M (1991 ) Eur J Cell B iol 56: 170-177

39. L e n n o n S V, M a r t i n S J , C o t t e r T G (1991) C ell Profil 24: 203-214

40. L a s t e r S M , W o o d J G , G o o d i n g L R (1988)7 Im m unol 141: 2629-2634

40a. J a k ó b i s i a k M (1992) W: K a w ia k J , M ire c k a J ,O lsz e w sk a M , W arch o ł J (red) P o d sta w y C ytofizjo log ii. W y d aw n ic tw o N au k o w e P W N , W arszaw a, s tr 516-547

41. M c C o n k e y D J , H a r t z e l l P, A m a d o r p e z J F, O r - r e n i u s S, J o n d a l M (1989) J Im m unol 143: 1801-1806

42. O d a k a C h , K i z a k i H, T a d a k u n a T (1990) J Im m unol 144: 2096-2101

43. D o u g h e r t y T F (1952) P hysio l R ev 32: 379-40144. C 1 a m a n H N (1972) N Engl J M ed 287: 388-39745. B a n s a l N, H o u l e A G , M e l n i k o v i c h G (1990 ) J Celi

P hysio l 143: 105-10946. N o r m a n N N , T h o m p s o n E B (1977) C ancer R es 37:

3785-379147. H a r r i s A W (1970) E xp C ell R es 60: 341-34848. H o r i b a t a K, H a r r i s A W (1970) E xp C ell R es 60: 61-7749. I w a t a M , H a n a o k a S, S a t o K (1991) Eur J Im m unol 21:

643-64850. B o u r g e o i s S, N e w b y R F (1977) C ell 11: 425-43051. N i e t o M A , G o n z a l e s A, G a m b o n F, D i a z - E s

p a d a F, L o p e z - R i v a s A (1992) Clin E xp Im m unol 88: 341-344

52. M i e s f e l d R L (1989) Crit R ev B iochem M o l B iol 24: 101-11753. D i e k e n E S , M i e s f e l d R L (1992) M o l C ell B iol 12:

589-59754. E v a n s R M (1988) Science 240: 889-89455. S c h e i d e r e i t C, B e a t o M (1984) Proc N a tl A cad Sei U SA

81: 3029-303356. P a y v a r F P , F r a n c o D, F i r e s t o n e G L , E d g a r B,

W r a n g e O, O k e r t S, G u s t a f s s o n J - A , Y a m a m o t o K R (1983) C ell 35: 381-392

57. P o n t a H, C a t o A C B, H e r r l i c h P (1992) Biochim Biophys A c ta 1129: 255-261

58. I n s e l P A , B o u r n e H R , C o f f i n o P, T o m k i n s G M (1975) Science 190: 896-898

59. F r e d r i c h U, C o f f i n o P (1977) Proc N a tl A cad Sei U SA 74: 679-683

60. G e r h i n g U, C o f f i n o P (1977) N a tu re 268: 167-16961. D o w d D R , M i e s f e l d R L (1992) M o l C ell B iol 12:

3600-360862. M c C o n k e y D, O r r e n i u s S, O k e r t S, J o n d a l M

(1993) F A S E B J 7: 580-58563. J a r v i s W D , K o l e s n i c k R , F o r n a r i F A , T r a y l o r

RS , G e w i r t z D, G r a n t S (1994) Proc N a tl A cad Sei U SA 91: 73-77

64. B e u t l e r B, C e r a m i A (1989) A nnu R ev Im m unol 7: 625-655

65. K i m M - Y , L i n a r d i c C , O b e i d L , H a n n u n Y (1991) J B iol Chem 266: 484-489

66. O b e i d L M , L i n a r d i c C M , K a r o l a k L A , H a n n u n Y A (1993) Science 259: 1769-1771

67. J o h n s o n D, L a n a h a n A, B u c k C R , S e g h a l A, M o r g a n C, M e r c e r E, B o t h w e l l M , C h a o M (1986) C ell 47: 545-554

68. S t a m e n k o v i c 1, C l a r k E A, S e e d B (1989) E M BO J 8: 1403-1410

69. I t o h N, Y o n e h a r a S, I s h i i A . Y o n e h a r a M, M i z u - s h i m a S, S a m e s h i m a M , H a s e A, S e t o Y, N a g a - t a S (1991) Cell 66: 233-243

70. C o h e n P L , E i s e n b e r g R A (1991) A R ev Im m un 9: 243-269

F 7 1 . S u d a T , T a k a h a s h i T, G o l s t e i n T, N a g a t a S (1993) Cell 75: 1169-1178

72. B u t t k e T M , S a n d s t r o m P A (1994) Im m unol Today 15: 7-10

73. H a l l i w e l l B, G u t t e r i d g e J M C (1990) M eth o d s En- zym ol 186: 1-85

74. A l b i n a J E , C u i S , M a t e o R B , R e i c h e r J S (1993) J Im m unol 150: 5080-5085

75. M a t s u d a M , M a s u t a n i H, N a k a m u r a H, M i y a j i - m a S, Y a m a u c h i A, Y o n e h a r a S (1991) J Im m unol 147: 3837-3841

76. S i k o r a E (1989) P ost B iochem 35: 563-57477. G u n t e r T E , P f e i f f e r D R (1990) A m J P hysio l 258:

C 755-C 78678. S c h u t z e S, P o t t h o f f K, M a c h l e i d t T, B e r k o v i c

D, W i e g m a n n K, K r o n k e M (1992) Cell 71: 765-77679. M e y e r M, S c h r e c k R, B a e u e r l e P A (1993) E M BO

J 12: 2005-201580. G r z e l a k o w s k a - S z t a b e r t B (1992) Post B iochem 38:

98-10781. K a w i a k J (1990) Post B iol K om 17: 325-33382. R a w s o n C L , L o o D T , D u i m s t r a J R , H e d s t r o m

O R , S c h m i d t E E , B a r n e s D W (1 9 9 1 )7 Cell B iol 113: 671-680

83. B a t i s t a t o u A, G r e e n e L A (1991) J C ell B iol 115: 461-471

84. B a r r e s BA, H a r t I K , C o l e s S R , B u r n e J F, V o y - v o d i c J T , R i c h a r d s o n W D , R a f f M C (1992) Cell 70: 31-46

85. N i c o t e r a P , B e l l o m o G , O r r e n i u s S (1992) A nnu Rev Pharm acol Toxicol 32: 449-470

86. R o d r i g u e z - T a r d u c h y R, C o l l i n s M, L o p e z - R i - v a s R (1990) E M BO J 9: 2997-3002

87. I s e k i R, M u k a i M, I w a t a M (1991) J Im m unol 147: 4286-4292

88. M c C o n k e y D J , H a r t z e l P, J o n d a l M, O r r e n i u s S (1989) J B iol C hem 264: 13399-14002

89. R o d r i g u e z - T a r d u c h y G, L o p e z - R i v a s R (1989) Biochem B iophys R es Com m un 164: 1069-1075

90. T o m e i L D , K a n t e r P, W e n n e r C E (1981) Biochem B iophys R es Com m un 115: 324-331

91. F o r b e s I J, Z a l e w s k i P D , G i a n n a k i s C, C o w l e d P A (1992) E x p C ell R es 198: 367-372

92. L u c a s M , S o 1 a n o F, S a n z F (1991) F E B S L e tt 2 7 9 :19-2093. B e r t r a n d R, S o l a r y E, O ’ C o n n o r P, K o h n K W ,

P o m m i e r Y (1994) E x p C ell R es 211: 314-32194. F o w l k e s BJ , P a r d o l l D M (1989) A dv Im m unol 44:

207-26495. D o w d D R , M a c D o n a l d P N , K o m m BS , H a u s

s i e r M R , M i e s f e l d R (1991) J B iol Chem 266: 18423- 18426

96. R e n n i e P S , B r u c o v s k y N, B u t t y a n R, B e n s o M, C h e n g H (1988) Cancer R es 48: 6309-6312

97. K y p r i a n o u N, I s a a c s J T (1989) Biochem B iophys R es C om m un 165: 73-81

98. K y p r i a n o u N, A l e x a n d e r RB , I s a a c s J T (1991) J N a tl C ancer In st 83: 346-350

99. K y p r i a n o u N, E n g l i s h H F , D a v i d s o n N E , I s a a c s J T (1991) C ancer R es 51: 162-166


100. S l a w i n K, S a w c z u k I S, O l e s s o n C A , B u t t y a n R (1990) Biochem B iophys R es C om m un 172: 160-164

101. B e t t u z z i S, T r o i a n o L, D a v a l l i P, T r o p e a F, I n g l e t t i M C , G r a s s i l l i E, M o n t i D, C o r t i A (1991) Biochem B iophys R es Com m un 175: 810-815

102. F r e n c h L E , C h o n n J J , D u c r e s t D, B a u m a n n B, B e l i n D, W o h l e v e n d A, K i s s J Z , S a p p i n o A P , T s c h o p p J, S c h i f f e r l i J A (1993) J "Cell B iol 122: 1119-1130

103. O w e n s G P , C o h e n J J (1992) C ancer M e ta st R ev 11: 149-156

104. Y u a n J, H o r v i t z H R (1992) D evelopm ent 116: 309-320105. Y u a n J, S h a h a m S, L e d o u x S, E l l i s H M , H o r v i t z

H R (1993) Cell 75: 641-653106. M i u r a M, Z h u H, R o t e l l o R, H a r t w e i g E, Y u a n

J (1993) Cell 75: 653-660107. E v a n G I , W y l l i e A H , G i l b e r t C S , L i t t l e w o o d

T D , L a n d H, B r o o k s M, W a t e r s C M , P e n n L Z , H a n c o c k D C (1992) C ell 69: 119-128

108. B u t t y a n R, Z a k e r i Z, L o c k s h i n R, W o l g e m u t h D (1988) M o l E ndocrinol 2: 650-657

109. G r a s s i l i E, C a r c e r e r i d e P r a t i A, M o n t i D, T r o i a n o L, M e n e g a z z i M, B a r b i e r i D, F r a n c e s - c h i C, S u z u k i H (1992) B iochem B iophys R es C om m un 188: 1261-1266

110. C o l o t t a F, P o l e n t a r u t t i N, S i r o n i M, M a n t o - v a n i A (1992) J B iol C hem 267: 18278-18283

111. S m e y n e R J , V e n d r e l l M , H a y w a r d M, B a k e r SJ , M i a o G G , S c h i l l i n g K, R o b e r t s o n L M , C u r r a n T, M o r g a n J I (1993) N a tu re 363: 166-169

112. D i x i t V M, M a r k s R M , S a r n i a V, P r o c h o w n i k E V (1989) J B iol C hem 264: 16905-16909

113. A n g e l P, K a r i n M (1991) Biochim B iophys A c ta 1072: 129-157

114. S i k o r a E, G r a s s i l l i E, B e l l e s i a E, T o r i n o L, F r a n c e s c h i C (1993) Biochem B iophys R es C om m un 192: 386-391

115. S i k o r a E, G r a s s i l l i E, R a d z i s z e w s k a E, B e l l e s i a E, B a r b i e r i D, F r a n c e s c h i C (1993) B iochem B iophys R es Com m un 197: 709-715

116. S i k o r a E (1993) A cta B iochim Polon 40: 389-394117. S i k o r a E (1993) P ost B iochem 39: 212-220118. W h i t e E, S a b b a t i n i P, D e b b a s M, W o l d W S M ,

K u s h e r D I , G o o d i n g L (1992) M o l C ell B iol 12: 2570-2580

119. R a o L, D e b b a s M, S a b b a t i n i P, H o c k e n b e r y D, K o r s m e y e r S, W h i t e E (1992) Proc N a tl A cad Sci U SA 89: 7742-7746

120. Q u i n l a n M P (1993) O ncogene 8: 3289-3296121. D e d e r a D A , W a l t e r E K , L e B r u n D P , S e n - M a j u -

m d a r A, S t e v e n s M E , B a r s h G S , C l e a r y M L (1993) C ell 74: 833-843

122. M i c h a l o v i t z D, H a r v e y O, O re n M (1990) C ell 62: 671-680

123. Y o n i s h - R o u a c h E, R e s n i t z k y D, L o t e m J, S a c h s L , K i m c h i A, O r e n M (1991) N a tu re 353: 345-347

124. S h a w P, B o v e y R, T a r d y S, S a h l i R, S o r d a t B, C o s t a J (1992) Proc A cad Sci U SA 89: 4495-4499

125. D o n e h o w e r L A , H a r v e y L A , S l a g l e B L , M c A r t

h u r M J , M o n t g o m e r y C A J r . B u t e l J S , B r a d l e y A (1992) N a tu re 356: 215-221

126. L o w e S, S c h m i t t E M , S m i t h S W , O s b o r n e BA, J a c k s T (1993) N a tu re 362: 847-849

127. C l a r k e A R , P u r d i e C A , H a r r i s o n D J , M o r r i s R G , B i r d C C , H o o p e r M L , W y l l i e A H (1993) N ature 362: 849-852

128. K a s t a n M B , Z h a n Q, e l D e i r y W S , C a r r i e r F, J a c k s o n T, W a l s h W V (1992) C ell 71: 587-597

129. G o t t l i e b E, H a f f n e r R, v o n R ü d e n T, W a g n e r E F , O r e n M (1994) E M B O J 13: 1368-1374

130. H e n g a r t n e r M O , E l l i s R E , H o r v i t z R (1992) N a tu re 356: 494-499

131. R e e d J C (1994) J C ell B io l 124: 1-6132. H e n g a r t n e r M O , H o r v i t z H R (1990) C ell 76: 665-668133. T s u j i m o t o J, F i n g e r LS , T u n i s J, N o w e l l P C ,

C r o c e C M (1984) Science 226: 1097-1099134. B a k h s h i A, J e n s e n J P , G o l d m a n P, W r i g h t J J ,

M c B r i d e O W , E p s t e i n A L, K o r s m e y e r S J (1985) C ell 41: 899-906

135. V a u x D L , C o r y S, A d a m s J M (1988) N a tu re 335: 440-442

136. N u n e z G, L o n d o n L, H o c k e n b e r y D, A l e x a n d e r M, M c K e a r n J P , K o r s m e y e r S J (1990) J Im m unol 144: 3602-3610

137. S t r a s s e r A , H a r r i s A W , C o r y S (1991) C ell 67: 889-899138. S i e g e l R M , K a t s u m a t a M, M i y a s h i t a T , L o u i n e

D C , G r e e n e M I , R e e d J C (1992) Proc N a tl A cad Sci U SA 89: 7003-7007

139. H e n d e r s o n S, R o w e M, G r e g o r y C, C r o o m - C a r t e r D, W a n g F, L o n g n e c k e r R, K i e f f E, R i c k n s o n A (1991) Cell 65: 1107

140. G a r c i a I, M a r t i n o u Y, T s u j i m o t o Y, M a r t i n o u J - C (1992) Science 258: 302-304

141. B i s s o n n e t t e R P , E c h e v e r r i A, M a h b o u b i A, G r e e n D R (1992) N a tu re 359: 552-556

142. F a n i d i A, H a r r i n g t o n E A, E v a n G I (1992) N ature 359: 554-556

143. H o c k e n b e r y D, Z u t t e r M, H i c k e y W, N a h m M, K o r s m e y e r S J (1991) Proc N a tl A ca d Sci U S A 88: 6961-6965

144. O l v a i Z N , M i l l i m a n K, K o r s m a y e r S J (1993) Cell 74: 609-619

145. H o c k e n b e r y D, N u n e z G, M i l l i m a n C, S c h r e i b e r R D , K o r s m e y e r S J (1990) N a iu rc 348: 334-336

146. H o c k e n b e r y D M , O l t v a i Z N , Y i n X - M, M i l - l i m a n C L , K o r s m e y e r S J (1993) C ell 75: 241-251

147. F e r n a n d e z - S a r a b i a M R . B i s c h o f f J R (1993) N a ture 366: 274-275

148. V e i s D J , S o r e n s o n C M , S h u t t e r J R (1993) C ell 75: 229-240

149. B o i s e L H , G o n z a l e z - G a r c i a M, P o s t e m a C h E , D i n g E, L i n d s t e n T, T u r k a L A, M a o X, N u n e z G, T h o m p s o n C B (1993) C ell 74: 597-608

150. G a g l i a r d i n i V, F e r n a n d e z P - A , L e e R K K , D r e - x l e r H C A , R o t e l l o RJ , F i s h m a n M C , Y u a n J (1994) Science 263: 826-828

151. K o z o p a s K M , H e a t h e r T Y , B u c h a n L, Z h o u P, C r a i g R W (1993) Proc N a tl A cad Sci U S A 90: 3516-3520

Wydawca prosi o kontakt tych, którzy chcieliby wykorzystać łamy „Postępów Biochemii” do reklamowania swych produktów i usług związanych z biochemią, biologią molekularną i biologią komórki.

Please contact the Editors if you wish to advertise in „Postępy Biochemii" the products and services related to biochemistry, molecular biology and cell biology.

160 POSTĘPY BIOCHEM II 40 (3 ), 1994http://rcin.org.pl

Telomerowa hipoteza starzenia się komórek

The telomere hypothesis of cell aging

EWA JARUGA*

Spis treści:

I. WprowadzenieII. Telomery — struktura i znaczenieIII. TelomerazaIV. Telomery a starzenie się komórek in vitro i in vivoV. Telomerowa hipoteza starzenia się komórek

Contents:

I. IntroductionII. Telomeres — structure and functionIII. TelomeraseIV. Telomeres and cell aging in vitro and in vivoV. The telomere hypothesis of cell aging

I. Wprowadzenie

Starzenie się i śmierć kom órek przez nieuchronność i powszechność tych procesów budzą zainteresowanie wielu badaczy, o czym świadczyć może m nogość teorii dotyczących tej dziedziny [1-11].

O statn io ukazał się w Postępach Biochemii artykuł* o roli protoonkogenów , okogenów i antyonkogenów w starzeniu się i unieśm iertelnianiu kom órek. W spom niano w nim o telomerowej hipotezie starzenia się, jako próbie wyjaśnienia zjawiska ograniczonej zdolności do podziałów prawidłowych kom órek o niezmienionym kariotypie. H ipoteza ta była i jest przedm iotem intensywnych badań w celu jej weryfikacji. Przez szeroki zakres stosowalności hipotezy obejm ujący tak rozległe dziedziny jak gerontologia czy onkologia z pewnością zasługuje na bliższe z nią zapoznanie.

Proces starzenia się kom órek w hodowlach tk an kowych zaczęto badać, gdy H a y f l i c k i M o o r h e a d obalili mit o nieśmiertelności kom órek hodowli prawidłowych stworzony przez C a r r e l a i E b e - l i n g a w latach 1912-1946 [12]. N ow atorskim było nie tyle stwierdzenie, że hodow ane przez nich ludzkie fibroblasty m ają ograniczoną zdolność do podziałów (limit Hayflicka), ile wykazanie, że kom órki te są norm alne, nie stransform ow ane now otworow o. Z asugerowali oni, że zanik zdolności replikacyjnych nie wynika z błędów m etodycznych popełnionych w czasie hodowli, lecz jest związany ze starzeniem się na poziom ie kom órkow ym [13-15]. Obserwacje te zostały potw ierdzone w wielu doświadczeniach również w odniesieniu do innych kom órek [16-22].

D ługość życia in vitro norm alnych kom órek som atycznych wydaje się zależeć od ilości podziałów, nie zaś

* S tudentka piątego roku biologii m olekularnej, U niw ersytet Łódzki, K atedra Biofizyki M olekularnej, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź

od bezwzględnego upływu czasu. K om órki takie żyją dowolnie długo w w arunkach niesprzyjających podziałom np. w niskiej tem peraturze czy przy niedostatecznym stężeniu czynników wzrostowych w środowisku. W w arunkach optym alnych kom órki dzielą się do uzyskania limitu podziałów, jakby „odliczając” podziały wcześniejsze np. przed zamrożeniem [21,23-25]. Inaczej zachow ują się kom órki rozrodcze, now otw orow e i unieśmiertelnione. Te dzielą się nie- ograniczenie [26].

Co stanowi „licznik podziałów ” w norm alnych kom órkach somatycznych oraz dlaczego nie działa on w kom órkach nowotworowych, unieśmiertelnionych czy rozrodczych?

W 1973 r. 0 1 o v n i k o v zwrócił uwagę na fakt, że chrom osom y liniowe z każdą rundą replikacyjną tracą fragm ent DNA na swych końcach (telomerach), co wynika z właściwości polimerazy DNA syntetyzującej tylko w kierunku 5'-3' i wymagającej wolnej grupy 3 '-OH DNA lub startera RNA. Jest to zjawisko niepełnej replikacji (the endreplication problem , Ryc. 1), k tó ra prowadząc do utraty genów może powodow ać śmierć kom órki [27],

Poniższy artykuł przedstawia propozycję wyjaśnienia m echanizm u ograniczania liczby podziałów kom órkowych poprzez niepełną replikację liniowych chrom osom ów norm alnych kom órek somatycznych, czego odzwierciedleniem jest ciągłe skracanie telomerów.

II. Telomery — struktura i znaczenie

Telom ery stanow ią heterochrom atynow y obszar na końcach ram ion chrom osom ów eukariotycznych zawierający odcinki DN A skom pleksowane z białkam i specyficznie wiążącymi telomery. Telomerowy DNA

* Ewa S i k o r a , „Nieśmiertelność, starzenie i śmierć kom órek. Rola protoonkogenów , onkogenów i antyonkogenów ”, Post Biochem (1993) tom 39, str. 212-220.


a)3 ’ 5 ’

5 ’ C Z U f

3 ’

5 ’

b)3 ’

3 ’

5 ’

3 ’

5 ’

3 ’

5 ’

3 ’

3 ’

Ryc. 1. Z ja w isk o niepełnej rep likacji lin iow ych ch ro m o so m ó w .a) S yn teza p o to m n e g o D N A (szero k a linia) przez poli- m erazę D N A o d b y w a się n a o b u n ic iach m acierzystych (w ąska linia) rów nocześn ie . P o lim e ra z a D N A w ym aga o becn o śc i s ta r te ra R N A (pusty p ro s to k ą t) sy n te ty zo w an eg o p rzez p rym azę. N a m a try cy zo rien to w an e j w k ie ru n k u 3 '-5 ' (czyli zgo d n ie z ru ch em w idełek rep likacy jnych ) syn teza zach o d z i w sp o só b ciągły (d ługa strza łka), zaś n a m atrycy sk ie row ane j p rzeciw nie — w sp o só b n ieciągły , czyli d ro g ą frag m en tó w O k a z a k i (k ró tk ie strzałk i).b) S ta rte ro w e o d c in k i R N A są w ycinane, a fragm en ty p o to m n e g o D N A (szero k a linia) łączone w całość dzięki p o lim eraz ie D N A . Z a p e łn io n e m o g ą być ty lk o luki w ew nętrzne. Z ew n ętrzn e z o s taw ia ją w iszące koń ce m acierzystego D N A , k tó re nie z o s ta ło zrep likow ane.

Telomery wpływają na stabilność chrom osom ów. Złam ane chrom osom y, pozbawione naturalnych zakończeń, ulegają fuzji tworząc m.in. dwucentryczne chrom osom y [40]. Obecność tej i innych aberracji chrom osom owych, w tym strukturalnych i liczbowych, wykazano w hodowli starych fibroblastów ludzkich [13, 18, 20]. Nie stw ierdzono fuzji naturalnych chromosomów, czy nawet chrom osom ów z delecjami w telomerowej sekwencji [41, 42]. Telom ery stanow ią obronę przed degradacją końców chrom osom ów . Białka specyficznie wiążące telomery chronią in vitro telom erowy DNA przed m etylacją i działaniem eg- zonukleaz pełniąc być może podobną funkcję in vivo [43, 44].

Telomery także, oprócz centrom erów, biorą udział w kształtow aniu architektury jąd ra interfazowego przez oddziaływania typu: chrom osom -chrom osom , chrom osom -błona jądrow a [45], Praw dopodobnie w czasie podziału kom órkow ego umożliwiają rozdzielenie acentrycznych chrom osom ów dzięki połączeniu z białkam i cytoszkieletu, a dokładniej filamentami pośrednimi: lam inam i jądrow ym i i w im entyną[46 ,47].

Telomery pozw alają na pełną replikację chrom osomów liniowych. Po degradacji s tartera RNA (Ryc. 2)

a)3 ’

5 ’

5 ’

3 ’

charakteryzuje się tandem ow o powtarzającym i się, prostym i sekwencjami nukleotydów o dużej zaw artości guaniny w nici biegnącej w kierunku t.zw. 5'-3' końca cząsteczki DN A (Tab. 1) [28-36]. Nie wykryto krótkich, tandem ow o pow tarzających się sekwencji DNA w telom erach staw onogów, mięczaków i szkar- łupni [37]. DNA telom erów jest konserwatywny ewolucyjnie, na co wskazywać może niezmienność sekwencji (TTA G G G ) u kręgowców, oraz telom erow a lokalizacja tej sekwencji bez względu na liczbę czy długość chrom osom ów [31, 38]. Telom erowy DN A liczy od kilkuset par zasad u drożdży czy orzęsków do kilku tysięcy par zasad u kręgowców [39].

Tabela 1.P rz y k ła d y p o w ta rza jący ch się sekw encji n u k leo ty d ó w w te lo m erach różn y ch o rg an izm ó w .

E le m e n t p o w ta rz a ją c y się

O rg an izm P rzyp isy

G j - 3 T Saccharom ycescerevisiae

[31 ]

A G G G T T H om o sapiens [32 ]

G G G G T T Tetrachym enatherm ophila

[33 ]

G G G G T T T T E uplo tes crassus [34 ]

5 ’ ----------------------------- 1 ~1 3 ’

c)3 ’ 5 ’ 3 ! 5 '

5 ’ ----------------------------- 1 ~ l 3 ’

d )

5 ’ ----------------------------- 1' 1 ~ l 3 ’

Ryc. 2. R ola te lom erazy w pełnej rep likacji c h ro m o so m ó w lin io wych.a) W w yn iku n iepełnej rep likacji p o z o s ta je w iszący k on iec 3' m acierzystej nici D N A (w ąska lin ia) ta k zw an a nić G.b) T e lo m e raza d o sy n te ty z o w u je d o nici G sekw encję telo- m erow ą (zapełn iony p ro sto k ą t).c) P rz e d łu ż o n a m ac ie rzy sta nić D N A sta je się m a try cą d la p rym azy , k tó ra p ro w ad z i syn tezę s ta r te ro w e g o R N A (pusty p ro s to k ą t) . D zięk i jeg o obecności p o lim era za D N A m oże ro zp o cząć n ieciąg łą syntezę nici (lin ia ła m a n a ) zapełn ia jącej lukę.d) P ierw szy s ta r te r R N A u lega d eg rad ac ji tw o rząc w iszący k on iec 3' nici m acierzystej.

162 POSTĘPY BIOCHEM II 4 0 (3 ), 1994http://rcin.org.pl

pozostaje luka przy końcu 5' potom nej nici długości kilkudziesięciu do kilkuset par zasad (rozmiary startera lub fragm entu Okazaki). Do wiszącego końca 3' macierzystej nici D N A zostaje dosyntetyzow ana sekwencja telom erow a w kierunku 5'-3' dzięki telomerazie (patrz niżej) [48, 49] lub na drodze rekom binacji [50] telom erów [51]. T a wydłużona nić staje się celem ataku prym azy, syntetyzującej starter RNA, dając możliwość polimerazie DNA przeprow adzenia nieciągłej syntezy potom nej nici, k tóra zapełni lukę. Oczywiście ów pierwszy starter RNA ulega degradacji i znów powstaje przerwa na końcu 5' potom nej nici, jednak tym razem dotyczy to sekwencji telomerowej, nie zaś kodującej informację.

W interpretacji wyników badań nad zależnością liczby podziałów kom órkow ych in vitro od długości telom erów pom oże znajom ość mechanizm u ich replikacji.

III. Telomeraza

Za syntezę telom erów odpow iada enzym telom eraza. Jest to polim eraza DN A zależna od RNA (odw rotna transkryptaza), dość nietypowa, gdyż m atryca RNA stanowi integralną część enzymu. Potw ierdzeniem jest kom plem entarność sekwencji RNA telom erazy np. 5' CAACCCCAA 3' z Tetrahymena thermophila [48] czy 5' CAAAACCCCAAAA 3' z Euplotes crassus [49] wobec pow tarzających się ich sekwencji telom ero- wych, odpowiednio: T T G G G G i T T T T G G G G . Zm iany w sekwencji RNA telom erazy np. 5' CGACCCCAA 3' m ają odzwierciedlenie w kolejności zasad telom eru 5' G G G G T C 3' [47],

Enzym rozpoznaje telomerowy koniec 3' macierzystej nici DNA bardziej dzięki nietypowej strukturze drugorzędowej zdeterm inowanej obecnością reszt gu- ainowych, niż dzięki sekwencji nukleotydów [52]. Telom eraza nie rozpocznie syntezy, jeśli koniec 3' chrom osom u zawiera odcinki bogate w reszty A + T, C, czy o dowolnej kolejności nukleotydów [48, 52]. Ich sekwencja wydaje się jednak isto tna ze względu na regulację długości telomerów. Doświadczenia na orzęs- kach z gatunku Tetrahymena thermophila pokazały, że m utacje telom erazowego RNA m ogą pow odow ać zarów no skracanie, jak i wydłużanie sekwencji telom ero- wych. W obu jednak przypadkach ujawnia się ten sam fenotyp: zaburzenia podziałów' kom órkow ych, osłabienie organizm u, starzenie się i śmierć. M ożna założyć, że w kom órkach tych występuje białko regulatorowe specyficznie wiążące nić G, konkurencyjne względem telomerazy. W tedy zm iana sekwencji telomerowej obniża powinow actwo regulatora do niej faworyzując telom erazę, a tym samym powoduje wydłużanie telom eru [47]. Jeśli więc po każdej rundzie replikacyjnej chrom osom y tracą końcowe fragmenty, to znaczy, że nie działa telom eraza, a kom órka z każdym podziałem zmniejsza swe szanse na przeżycie pozbywając się kolejnych partii genów.

IV. Telomery a starzenie się komórek in vitro i in vivo

Rolę telom erów w pełnej replikacji chrom osom ów potw ierdzają liczne badania. Delecje w telomerowej sekwencji chrom osom ów muszki owocowej Drosophila zakłócają prawidłowy przebieg replikacji [41]. K ażda runda replikacyjna wiąże się ze stratą około 2 par zasad, co powoduje ubytek 36-96 par zasad w czasie przypadającym na podwojenie populacji kom órek [42].

U drożdży Saccharomyces cerevisieae stw ierdzono pojawianie się w późnej fazie S cyklu kom órkowego odcinków T G j _ 3 [53], Ich synteza, jak się przypuszcza, przebiega głównie na drodze rekombinacji telom erów [51], choć nie wyklucza się innych sposobów [54]. Nie bez znaczenia jest tu gen estl kodujący praw dopodobnie białko wchodzące w skład drożdżowej telom erazy [55, 56], choć nie udało się jak dotąd wykazać aktywności telomerazowej u drożdży in vivo. M utacja estl ~ prowadzi do powolnej lecz postępującej utraty term inalnych sekwencji (0 ^ 3^ (ever shorter telomeres), przy czym większość kom órek słabiej dzieli się i um iera [55].

W hodow anych in vitro ludzkich, norm alnych fibroblastach pobranych od dawców w okresie płodowym, po urodzeniu i aż do ich późnej starości, stw ierdzono, że w czasie przypadającym na podwojenie populacji kom órek następuje skracanie telomerów o około 2 tysiące par zasad DNA. Przy tym kom órki wykonują o 10 podziałów mniej na każdy tysiąc traconych zasad DNA. Jednocześnie całkow ita ilość DNA również zmniejsza się, co odsuwa podejrzenie transpozycji [57].

Fibroblasty pacjentów z zespołem H utchinsona- Gilforda (fenotyp przyśpieszonego starzenia się) charakteryzują się mniejszą liczbą podziałów in vitro niż kontrolne fibroblasty zdrowych dawców w tym samym wieku. W ykazano, że telomery kom órek pacjentów są krótsze w porów naniu z kom órkam i zdrowych osób [58].

Niewielki, lecz znaczący spadek długości telomerów DNA fibroblastów ludzkich zaobserw ow ano w czasie starzenia się in vivo. U dawców w wieku od 0 do 93 lat stw ierdzono spadek 15 + 6 par zasad na rok (r = -0.43), co daje około 1500 par zasad w ciągu całego życia, czyli prawie 30% telom erowego DNA [58].

Telomery leukocytów krwi obwodowej płodu są średnio o 12 tysięcy par zasad krótsze niż telomery plemników. Analogicznie w przypadku nabłonka błony śluzowej okrężnicy różnica ta wynosi 14 tysięcy par zasad [59],

M ożna zauważyć zbieżność między długością sekwencji telomerowej a liczbą podziałów kom órkowych in vitro, jak również zależność: wiek dawcy — długość telomeru.

W odróżnieniu od wyżej przedstawionych danych dotyczących chrom osom ów kom órek somatycznych, długość telomerów plem ników nie ulega zmniejszeniu,


lecz nawet w niewielkim stopniu zwiększa się wraz z wiekiem dawcy. W kom órkach linii rozwojowej plem ników również nie stw ierdzono skracania telome- rów [58, 55, 35]. Niezmienność długości sekwencji telomerowej dotyczy również nowotworow ych kom órek HeLa, w których w ykazano obecność telomerazy [60]. M ożna się zastanawiać, przez analogię, czy w kom órkach linii rozwojowej plem ników działa podobny mechanizm rekom pensujący straty wywołane niepełną replikacją chrom osom ów liniowych. Niestety z pow odu niedostatecznej czułości m etody oznaczania telomerazy, jak również ze względu na trudności w przygotow aniu ekstraktów ze świeżych tkanek nie udało się wykazać aktywności telomerazowej dla kom órek rozrodczych [61].

V. Telomerowa hipoteza starzenia się komórek

W yniki przedstaw ionych wyżej badań posłużyły do sform ułowania telomerowej hipotezy starzenia się [58, 61, 62]. Z akłada się, że kom órki rozrodcze zawierają telom erazę przeciwdziałającą skracaniu telomerów, co gw arantuje przekazywanie z pokolenia na pokolenie chrom osom ów o tej samej długości. W norm alnych kom órkach som atycznych telom eraza podlega represji, gdyż nie stwierdza się jej aktywności, a telomery ulegają skróceniu z każdym podziałem kom órek in vitro i in vivo. Gdy ubytek chrom osom u jest odpow iednio duży, mówimy wówczas, że osiągnięty zostaje punkt kontrolny podziałów (checkpoint) — kom órka przestaje się dzielić (limit Hayflicka). Nie m a jednak bezpośrednich dow odów na to, że osiągnięcie tego punktu jest spow odow ane zmniejszaniem długości telomerów. H a r l e y sugeruje, że być może skracanie sekwencji telomerowej zmienia ważne ze względu na rozdzielanie chromosom ów acentrycznych oddziaływania typu: telomery — białka cytoszkieletu [46, 47, 61],

Limit Hayflicka może zostać przekroczony, co zaobserwowano w kom órkach gryzoni po działaniu m uta- genami, karcenogenam i i onkogenam i jak również w wyniku transfekcji [63, 64]. Częstość unieśm iertelniania tych kom órek jest większa niż ludzkich fibro- blastów. W przypadku tych ostatnich transform ację now otw orow ą wywołać m ogą takie czynniki jak małpi wirus SV40, adenowirusy, ludzki wirus brodaw czaka [63,65, 66]. W ykazano, że w dzielących się kom órkach now otw oru płuc, okrężnicy, jajników i now otw oru W ilma telomery ulegają skróceniu. Sekwencje telome- rowe D N A kom órek badanych nowotworów stanow ią od 20 do 90% ilości D N A telom erów norm alnych kom órek tego samego pacjenta [59]. M ogłoby to oznaczać, że w kom órkach, które pod wpływem wcześniej wymienionych czynników przekroczyły punkt kontroli podziałów, telom eraza jest nadal nieaktywna, co prowadzi do dalszych stra t m ateriału genetycznego z każdą rundą replikacyjną. W kom órkach now otworowych H eLa telom ery nie ulegają skróceniu, co sugeruje, że nastąpiła tu reaktywacja telom erazy [60].

W r i g h t i S h a y zaproponow ali model dw ustopniowego m echanizmu kom órkow ego starzenia się zależny od zmian długości telom erów [66-68]. K om órki hodow ane in vitro po w ykonaniu określonej liczby podziałów przestają dzielić się w wyniku włączenia pierwszego m echanizmu starzenia się M l (ang. mortality stage 1). Zgodnie z hipotezą geny regulujące etap M 1 m ogą być zlokalizowane w subtelom erowym DNA, który stanowi heterochrom atynow y obszar. Jego wielkość według autorów ma być proporcjonalna do długości telomerów. Tym samym u tra ta term inalnej części chrom osom u może prowadzić do zmniejszenia obszaru zajm owanego przez heterochrom atynę i uaktywnienia genów włączających M l. W iadom o, że mechanizm M 1 jest regulowany między innymi przez białko RB i białko p53, których inaktyw acja um ożliwia wejście w fazę S cyklu kom órkow ego [27, 65, 69-73]. Włączenie pierwszego m echanizm u starzenia się byłoby związane z niemożnością przeprow adzenia inaktywacji tych białek, co ma miejsce w starych kom órkach.

Możliwe jest jednak obejście tego etapu przez zastosowanie czynnika, który wiążąc białka RB i p53 inaktywuje je umożliwiając wykonanie dodatkow ych podziałów kom órkowych. W ten sposób działają białka onkogenne E6 i E7 wirusa papiliomy, białka E l A i E1B wirusa adenom y oraz antygen T wirusa SV40 [63-66, 70, 71]. Ominięcie M l nie oznacza, że pierwszy mechanizm starzenia się przestał funkcjonować. Pod nieobecność wyżej wymienionych czynników kom órka ponownie przestaje się dzielić. D latego, aby przekroczyć limit Hayflicka, wymagane jest dostarczanie inaktyw atorów białek RB i p53. Ominięcie M l nie uaktyw nia telomerazy, co prowadzi do dalszej redukcji m ateriału genetycznego [59], występowania licznych aberracji chrom osom owych i wysokiej śmiertelności wśród tych kom órek, które przekroczyły limit Hayflicka [14, 19, 21]. Ten kryzys został nazwany drugim mechanizmem starzenia się M2 (ang. mortality stage 2) i podobnie jak M l może zostać ominięty.

Wyłączenie M2 jest praw dopodobnie możliwe dzięki m utacji genu w arunkującego w sposób bezpośredni lub pośredni inaktywację represora telomerazy, co przywraca kom órkom aktyw ność telom erazow ą [70].

Doświadczenia z hybrydam i otrzym anym i w wyniku fuzji norm alnych, ludzkich fibroblastów z ludzkimi kom órkam i nieśmiertelnych linii pokazały, że fenotyp kom órkow ego starzenia się jest dom inujący. O kreślono cztery grupy kom plem entacyjne dla recesywnego fenotypu nieśmiertelności badając szereg różnych nieśmiertelnych linii ludzkich kom órek. Nie wykazano zależności między typem kom órek, ich pochodzeniem, rodzajem wywoływanego przez nie now otw oru a przynależnością do danej grupy kom plem entacyjnej. Ż adna z badanych linii kom órkow ych nie należała do więcej niż jednej takiej grupy. W yniki świadczyć mogą o tym, że unieśm iertelnianie zależy od nielicznych, specyficznych genów [27, 74-76].


Biorąc pod uwagę te wyniki zaproponow ano tetra- merową budowę represora telom erazy [70]. W yłączenie mechanizm u starzenia się kom órek M2 miałoby nastąpić z chwilą wywołanej m utacją inaktywacji choćby jednej z podjednostek represora.

W świetle przedstawionych tu prac starzenie się jest ucieczką przed nowotworzeniem zabezpieczaną w ludzkich kom órkach przez dwa różne, niezależnie działające mechanizmy. Ich włączenie według telomerowej hipotezy starzenia się nastąpiłoby po czasie odm ierzonym przez liczbę podziałów kom órkowych. W yłączenie zaś wymagałoby zaistnienia równocześnie aż dwóch niezależnych zdarzeń, co może tłumaczyć oporność ludzkich kom órek na transformację nowotworową.

Artykuł otrzymano 6 kwietnia 1994 r.Zaakceptowano do druku 3 czerwca 1994 r.

Piśmiennictwo

1. R u s t i g R L (1993) Św ia t N a u k i 2: 84-952. O 1 s o n C B (1987) M ech A geing Dev 41: 1-283. S o h a l R S (1993) A ging Clin E xp Res 5: 3-174. H a r m a n D (1992) M u ta tio n Research 275: 257-2665. S o h a l R S (1976) In terd iscip l Topics G eronto l 9: 25-406. C u 1 1 e r R G (1984) W: P ry o r W A (red) F ree R ad ica ls in

B iology 6. A cadem ic Press, N ew Y ork , s tr 371-4287. S a u l R L , G e e P, A m e s B N (1987) W: W a rn e r H R (red)

M o d e rn B iological T h eo ries o f Aging. R aven Press, N ew Y ork, s tr 113-129

8. R i c h a r d s o n A, B i r c h e n a l l - S p a r k s M C , S t a e c - k e r J L (1983) Rev B iol R es A ging 1: 275-294

9. R u s s e l l R L (1987) W: W a rn e r H R (red) M o d e rn B iological T h eo rie s o f Aging. R aven P ress, N ew Y ork , s tr 35-61

10. T o u s s a i n t O, H o u b i o n A, R e m a c l e J (1992) M ech A geing Dev 65: 65-83

11. S e n S (1992) Biol R ev 67: 287-31912. W i t k o w s k i J (1985) Trends B iochem Sei 10: 258-26013. H a y f l i c k L, M o o r h e a d P S (1961) E x p C ell R es 25:

585-62114. H a y f l i c k L (1965) E xp C ell R es 37: 614-63615. H a y f l i c k L (1992) E xp G erontol 27: 363-36816. G o l d s t e i n S (1990) Science 249: 1129-113317. G o l d s t e i n S (1974) E x p Cell R es 83: 297-30218. S a k s e l a E, M o o r h e a d P S (1963) P roc N a tl A cad Sei

U S A 50: 390-39519. T u f f e r y A A, B a k e r S U (1973) E xp C ell R es 76: 186-19020. S h e r w o o d S W , R u s h D, E l l s w o r t h J L , S c h i m k e

R T (1988) Proc N a tl A cad Sei U SA 85: 9086-909021. D e l l ’ O r e o R T , M e r t e n s J G, K r u s e P F (1974) E xp

C ell R es 84: 363-36622. C r i s t o f a l o VJ , P i g n o l o R J , C i a n c i a r u l o F L , D i -

P a o l o B R , R o t e n b e r g M O (1992) E x p G erontol 27:429-432

23. D e l l ’ O r e o R T , M e r t e n J G, K r u s e P F (1973) E x p Cell R es 77: 356-360

24. B r u n k U, E r i c s o n J L E , P o n t e n J, W e s t e r m a r k B (1973) E x p Cell R es 79: 1-14

25. D a n i e l C W , Y o u n g L J T (1971) E xp C ell R es 65: 27-3226. S m i t h J R, Y i N i n g , P e r e i r a - S m i t h O (1992) Am

J C lin N u tr 55: 1215S-1221S27. O l o v n i k o v A M (1973) J Theor B iol 14: 181-19028. B l a c k b u r n E H (1990) S co n ce 249: 489-490

29. B l a c k b u r n E H (1991) N a tu re (L ond) 350: 569-57330. S z o s t a k J W , B l a c k b u r n E H (1982) Cell 29: 245-25531. M o y z i s R K , B u c k i n g h a m J H, C r a m L S , D a n i M,

D e a v e n L L , J o n e s M D , M e y n e J , R a t l i f f P L , W u J R (1988) Proc N a tl A cad Sei U SA 85: 6622-6626

32. G r e i d e r C W , B l a c k b u r n E H (1985) Cell 43: 405-41333. Z a k i a n V A (1989) A nn R ev G enet 23: 57934. C r o s s S H , A l l s h i r e R C , M c K a y S J, M c G i l l N I ,

C o o k e H J (1989) N a tu re (L ond) 338: 771-77435. B r o w n W R (1989) N a tu re (L ond) 338: 774-77636. K i l i a n A , K l e i n h o f s A (1992) M o l Gen Genet 235: 153-15637. B i e s s m a n n H & M a s o n J M (1992) A dv G enetics 30:

185-24938. M e y n e J, R a t l i f f R L , M o y z i s R K (1989)P roc N a tl

Acad Sei U SA 86: 7049-795339. M u r r a y A W , S z o s t a k J W (1983) N a tu re (L ond) 305:

189-19340. M c C l i n t o c k B (1940) Genef/cs 26: 234-28241. M a s o n J M , S t r o b e l E, G r e e n M M (1984) Proc N a tl

A cad Sei U SA 81: 6090-609442. B i e s s m a n n H, C a r t e r SB, M a s o n J M (1990) Proc

N a tl A cad Sei U S A 87: 1758-176143. G o t t s c h l i n g D E , Z a k i a n V A (1986) Cell 47: 195-20544. R a g h u r a m a n M K , C e c h T R (1989) Cell 59: 719-72845. A g a r d D A , S e d a t J W (1983) N a tu re (L ond) 302: 676-68146. S h o e m a n R L , W a d l e S , S c h e r b a t h A, T r a u b (1988)

J B iol Chem 263: 18744-1874947. L i a n g - Y u G, B r a d l e y J D , A t t a r d i L D , B l a c k

b u r n E (1990) N a tu re (L ond) 344: 126-13248. G r e i d e r C W , B l a c k b u r n E (1989) N a tu re (L ond) 337:

331-33749. S h i p p e n - L e n t z D, B l a c k b u r n E (1990) Science 247:

546-55250. P u t r a m e n t A (1980) W: L a so ta Z (red) B iologia m o le k u la r

na, in fo rm acja g en etyczna t2. P W N , W arszaw a, s tr 411-43251. W a n g SS, Z a k i a n V A (1990) N a tu rę (L ond) 345: 456-45852. G r e i d e r C W, B l a c k b u r n E (1987) Celi 51: 887-89853. W e l l i n g e r RJ , W o l f AJ , Z a k i a n V A (1993) Celi 72:

51-6054. L u n d b l a d V, B l a c k b u r n E (1993) Celi 73: 347-36055. L u n d b l a d V, S z o s t a k J W (1989) Celi 57: 633-64356. L u n d b l a d V, B l a c k b u r n E (1990) Celi 60: 529-53057. H a r l e y C B , F u t c h e r AB , G r e i d e r C W (1990) N ature

(L ond) 345: 458-46058. A l l s o p p R C, V a z i r i H, P a t t e r s o n C, G o l d s t e i n S,

Y o u n g l a i V, F u t c h e r A B , G r e i d e r C W, H a r l e y C B (1992) Proc N a tl A cad Sei U SA 89: 10114-10118

59. H a s t i e N D , D e m p s t e r M, D u n l o p M G , T h o m p s o n A M , G r e e n D K , A l l s h i r e R C (1990) N a tu re (L ond) 346: 866-868

60. M o r i n G B (1988) Celi 59: 521-52961. H a r l e y C B (1991) M u ta tio n Res 256: 271-28262. H a r l e y C B, V a z i r i H, C o u n t e r M, A l l s o p p R C

(1992) E xp G erontology 27: 375-38263. S h a y J W , W r i g h t W E , W e r b i n H (1991) Biochim

B iophys A cta 1072: 1-764. M e e k R L, B o w m a n P D , D a m e 1 C W (1977) E xp Cell

R es 107: 277-28465. S h a y J W, W r i g h t W E (1989) E xp C ell R es 184: 109-11866. W r i g h t W E, S h a y J W (1992) E xp G erontol 27: 383-38967. W r i g h t W E , S h a y J W (1992.) Trends Genet 8: 193-19768. S h a y J W , W r i g h t W E , W e r b i n H (1993) In t J Oncol 3:

559-56369. W a r n e r H R , C a m p i s i J, C r i s t o f a l o VJ , M i l l e r

R A , P a p a c o n s t a n t i n o u J, P e r e i r a - S m i t h O, S m i t h J R, W a n g E (1992) J G erontol 47: B l82-B 189

70. S h a y J W , V a n D e r H a e g e n BA, Y i n g Y, W r i g h t W E (1993) E xp C ell R es 209: 45-52

71. S h a y J W , P e r e i r a - S m i t h O, W r i g h t W E (1991) E xp C ell R es 196: 33-39

72. K i r s c h n e r M (1992) Trends B iochem Sei 17: 281-28573. G r z e l a k o w s k a - S z t a b e r t B (1992) Post B iochem 38:

98-10774. P e r e i r a - S m i t h O, S m i t h J R (1988) Proc N a tl A cad Sei

U SA 85: 6042-604675. P e r e i r a - S m i t h O, S m i t h J R (1983) Science 2 21:964-96676. P e r e i r a - S m i t h O (1992) E xp G erontol 27: 441-445

POSTĘPY BIOCHEMII 4 0 (3 ) , 1994 165http://rcin.org.pl

Mechanizmy działania antysensownych oligodeoksyrybo- nukleotydów

Antisense oligodeoxyribonucleotides — mechanisms of action

ARKADIUSZ SZKLARCZYK*

Spis treści:

I. WprowadzenieII. Rozpoznawanie sekwencji docelowej przez antysensow-

ne oligodeoksyrybonukleotydy (asODN)-hybrydyzacja asO D N z RNAII-l. Powinowactwo asO D N do RNAII-2. Specyficzność rozpoznania sekwencji docelowej

III. Mechanizmy oddziaływania antysensownych O D N z mRNAIII-l. Sekwencje regulujące metabolizm RNA jako cel

dla asO D NIII-1-a. Sekwencje uczestniczące w cięciu i skła

daniu pre-mRNA III-1-b. Rejon 5 UTR mRNA III-l-c. Rejon 3 UTR mRNA III-1-d. Zahamowanie translacji

III-2. Aktywacja RNazy H za pomocą asO D NIV. Wybór optymalnej sekwencji mRNA jako miejsca

oddziaływania z asO DNV. Podsumowanie

Wykaz stosowanych skrótów: AMV — avian m ieloblastom a virus; asO D N — antysensow ne oligodeoksyrybonukleotydy; BP — punk t rozgałęzienia w procesie cięcia i składania pre-m RNA; e lF — eukariotyczny czynnik inicjujący translację; HSV — herpes simplex virus; IE — geny wczesne; M M LV — m urine M oloney leukemia virus; M -O D N — me- tylofosforanowy analog O D N ; nt — nukleotydy; O -O D N— oligodeoxyrybonukleotyd; R N aza H — rybonukleaza H; S-O D N — tiofosforanow y analog O D N ; TAT — białko transaktyw ujące oddziałujące z sekwencją TAR; TAR — sekwencja regulująca transkrypcję genów wirusa HIV; Tm— tem peratu ra topnienia; 5'ss — sekwencja donorow a w procesie cięcia i składania pre-mRNA; 3'ss — sekwencja akceptorow a; 5'UTR — rejon nieulegający translacji 5 'm RNA; 3 'U TR — rejon nieulegający translacji 3' mRNA.

I. Wprowadzenie

Antysensowne oligodeoksyrybonukleotydy (asODN) są to chemicznie zsyntetyzowane związki o długości10-30 nukleotydów. A sO D N znalazły zastosow anie jako związki selektywnie blokujące ekspresję genów poprzez oddziaływanie z mRNA. Isto ta ich działania polega na wysoce swoistym połączeniu (hybrydyzacji) z odpow iadającą im sensowną sekwencją RNA. Miejsce hybrydyzacji determ inuje następne etapy działania asO D N . N a przykład połączenie z sekwencją regulato-

* S tudent AM w W arszawie, P racow nia H odow li K om órek i Tkanek, Insty tu t Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, ul. P asteu ra 3, 02-093 W arszawa

Contents:

I. IntroductionII. Target sequence recognition by antisense oligodeoxyri

bonucleotides (asODN)-hybridization of a asO D N with RNAII-l. AsO DN affinity to RNAII-2. Specificity of target sequence recognition

III. Mechanisms of asO D N interacting with mRNAIII-l. Regulatory sequences of RNA as a target for

asO DN111-1-a. Sequences of pre-mRNA involved in

splicingIII-1-b. 5 UTR mRNA regionIII-l-c. 3'UTR mRNA regionIII-1-d. Translational arrest

III-2. RNase H activation by asO D NIV. Choice of optimal sequence of mRNA as a place of

interaction with asO DNV. Summary

rową może zablokow ać dostęp właściwego ligandu (np. białka) i zaburzyć proces cięcia i składania pre-m RNA (ang. splicing), jego transport, stabilność, przebieg translacji (Ryc. 1). N iektóre asO D N charak teryzuje zdolność aktyw ow ania enzymu kom órkow ego RNazy H m ogącego przeciąć RNA w miejscu hybrydyzacji asO D N .

Analogi asO D N otrzym uje się w wyniku m odyfikacji wiązania fosfodwuestrowego, deoksyrybozy oraz zasad purynowych i pirymidynowych. O trzym ane analogi asO D N różnią się wieloma cechami, takimi jak: stabilność, zdolność wnikania do kom órek, p a ra m etry hybrydyzacji oraz m echanizmy działania i efekty toksyczne [1], Jedyną wspólną cechą analogów asO D N jest wysoce specyficzne oddziaływanie z RNA zgodne z zasadą kom plem entarności. Rycina 2 przedstawia budowę kilku, najlepiej scharakteryzow anych w układach biologicznych, analogów O D N . Inne często stosowane modyfikacje asO D N polegają na dołączeniu różnych związków chemicznych np. cholesterolu (ułatwia wnikanie do kom órek), akrydyny (zwiększa siłę wiązania z RNA) [1].

Idea wpływania na ekspresję genów za pom ocą związków antysensow nych narodziła się ponad dw adzieścia pięć lat temu, jednakże dopiero w ostatnim czasie asO D N zyskały rangę narzędzia badawczego. A sO D N okazały się skuteczne in vitro, w hodowlach kom órkow ych a także w różnych układach in vivo.


c

Ryc. 1. M e tab o liz m R N A w k o m ó rce eu k ario ty czn e j. P o d czas tran sk ry p c ji n as tęp u je p rzep isan ie in fo rm acji genetycznej D N A n a p ie rw o tn y tra n sk ry p t (p re-m R N A ). P re -m R N A pod leg a p rzem ian ie p o tran sk ry p cy jn e j po legającej na w y cin an iu in tro n ó w i sk ła d an iu ek so n ó w w u k ład ch a ra k te ry s ty c z n y d la m R N A . D o jrza łe m R N A tra n sp o r to w a n e jes t d o cy to p lazm y gdzie n as tęp u je tran s lac ja czyli syn teza b ia łka . K o le jnym w ażnym procesem w m etab o lizm ie m R N A jes t jeg o d eg rad ac ja . W szystk ie w ym ien ione procesy pod leg a ją złożonej regu lacji czasow ej i p rzestrzennej. C — cy to p lazm a; J — ją d ro k o m ó rk o w e; R — ry b o so m ; R n a za — ry b o n u k leaza .

Czynione są próby zastosow ania asO D N w lecznictwie, np. jak o cytostatyków. Szczegółowe poznanie m echanizm ów działania, param etrów farm akokinety- cznych oraz efektów ubocznych zadecyduje o m ożliwości syntezy związku w pełni swoistego, aktywnego i bezpiecznego.

II-l. Powinowactwo asO D N do RNA

Powinowactw o O D N do RNA wynika z możliwości utworzenia wiązań wodorowych pomiędzy kom plem entarnym i zasadam i purynowym i i pirymidynowymi zgodnie z zasadą W atsona i Cricka oraz powstania

II. Rozpoznawanie sekwencji docelowej przez asODN-hybrydyzacja asO D N z RNA

Pierwszym etapem oddziaływania asO D N jest jego połączenie z docelowym RNA czyli hybrydyzacja. Pow stała hybryda pow inna być odpow iednio stabilna, co zależy od powinow actw a asO D N z docelową sekwencją RNA. Równie istom a jest specyficzność rozpoznania sekwencji docelowej. Jedynie w takiej sytuacji asO D N będą wpływały wyłącznie na ekspresję wybranego genu. O ba param etry hybrydyzacji: powinow actw o i specyficzność zależą od wielu czynników, z których część może podlegać pełnej kontroli d o świadczalnej. M iarą obu param etrów jest tem peratura topnienia (Tm) hybrydy asO D N -R N A , czyli tem peratura, w której połow a asO D N jest połączona z RNA (im bardziej stabilne wiązanie asO D N :R N A tym wyższa Tm) i zm iana wolnej energii hybrydy AG.

HO

Ryc. 2. B u d o w a najczęściej s to so w an y ch an a lo g ó w O D N . O -O D N — o lig o d eo k sy ry b o n u k leo ty d ; S -O D N — tio fo sfo ran o w y an a lo g O D N ; M P -O D N — m ety lo fo sfo ran o w y an a lo g O D N .


układu przestrzennego zasad o korzystniejszej energii wewnętrznej. Reakcja ta zależy od szeregu zmiennych takich jak: warunki reakcji (np. tem peratura i siła jonow a roztworu), długość i budow a oddziałujących cząsteczek. M inim alna długość antysensownego O D N konieczna do osiągnięcia specyficzności hybrydyzacji (rozdz. II-2) wynosi zwykle około 12-14 nukleotydów.

Budowa chemiczna O D N ma znaczny wpływ na powinowactwo wobec mRNA. Dla przykładu Tm hybrydy O -O D N (GCT CTC T G G C) z RNA wynosi 51°C (AG-11.2 kcal/mol), natom iast hybrydy 2 '-0 - m etylo-O D N (GCU C U C U G G C) z RNA 68.1°C (AG -18.6 kcal/mol) [2]. Różnica pow inowactwa dwóch najczęściej stosowanych analogów O -O D N i S-OD N , wyrażona przez tem peraturę topnienia Tm, wynosi 1/2°C na wiązanie na korzyść pierwszego. Oznacza to, że O -O D N tworzy z RNA trwalszą hybrydę, niż S-O D N [1]. Zwiększenie powinow actw a m ożna osiągnąć poprzez odpowiednią modyfikację O D N , np. przez przyłączenie związku interkalującego (np. akrydyny), dostarczającego dodatkow ą energię wiązania. W pewnych w arunkach jednak zbyt wysokie powinowactwo może zmniejszać specyficzność reakcji (rozdz. II-2).

Znaczący wpływ na pow inow actwo O D N wobec

3 ’

RNA ma struk tu ra RNA. RNA jest cząsteczką o złożonej konfiguracji przestrzennej. W wyniku międzycząs- teczkowych oddziaływań pow stają struk tury drugo- rzędowe typu szpilki do włosów (hairpin), pnia (stem ), złącza (junctions), wybrzuszenia (bulges), wewnętrznej pętli (internal loop) czy pseudowęzła (pseudoknots) (Ryc. 3).

Przy założeniu, że wiązanie z RNA następuje tylko w wyniku oddziaływań typu W atsona-C ricka, czyli, że jednoniciow y O D N hybrydyzuje z ciągłą sekwencją pojedynczej nici RNA istnieje kilka możliwych sytuacji:

1) O D N reaguje z naturalnym jednoniciowym fragm entem RNA

2) O D N konkuruje z jedną nicią struktury dwu- niciowej o połączenie z drugą nicią RNA jeśli struk tura ta ulega rozpleceniu w dowolnej sytuacji fizjologicznej.

3) reakcja z asO D N zaburza trw ałą struk turę RNA, co wymaga dostarczenia dodatkowej energii, zatem asO D N musi wykazywać wyższe powinow actw o wobec RNA niż naturalna sekwencja.

W ydaje się jednak, że reguły rządzące oddziaływ aniami pom iędzy O D N i m RNA są bardziej skom plikowane niż przedstawione wyżej sytuacje. Przykładem niech będą wyniki doświadczenia przeprowa-

SP - S Z P IL K A DO W Ł Ó S Ó W

Z P - Z E W N Ę T R Z N A P Ę T L A

P - P IEŃ

R - R O Z G A Ł Ę Z IE N IE

U - U W Y P U K L E N IE

W P - W E W N Ę T R Z N A P Ę T L A

PS - P S E U D O W Ę Z E L


dzonego in vitro, w którym badano wiązanie asO D N z różnymi odcinkam i syntetycznego RNA o strukturze szpilki do włosów [3]. Sekwencja docelowa dla asO D N m iała strukturę pnia, pętli lub obu fragm entów jednocześnie. O kazało się, że powinowactwo asO D N wobec odcinka jednoniciowego RNA przy końcu 5' pętli i w środku pętli jest takie jak wobec kontrolnego (sensownego) jednoniciowego OD N . Z kolei O D N kom plem entarne z sekwencją jedno- niciową końca 3' pętli, pnia (sekwencja dwuniciowa) lub sekwencją w miejscu przejścia struktury pnia w strukturę pętli (sekwencja m ieszana jedno- i dw uniciowa), hybrydyzowały 106 razy słabiej. Interesujące jest, że sam a obecność w pełni kom plem entarnej sekwencji jednoniciowej (koniec 3' pętli) nie zapewnia odpowiedniego powinowactwa, równie ważne jest jej umiejscowienie w cząsteczce RNA. M ożliwe jest, że przyłączenie O D N zmienia konfigurację przestrzenną RNA i jedynie w części przypadków energia wewnętrzna nowego układu jest korzystna.

Ilustracją drugiej sytuacji może być doświadczenie, w którym uzyskano efektywną hybrydyzację asO D N kom plem entarnego z sekwencją U6 RNA odpow iedzialną za połączenie z U4 RNA [4]. W naturze U6 i U4 RNA hybrydyzują ze sobą na kilku odcinkach podczas form ow ania aktywnego kom pleksu w procesie cięcia i składania pre-m RNA. W doświadczeniu asO D N efektywnie współzawodniczyły z U4 RNA0 związanie się z sekwencjami U6 RNA.

Przyjm uje się, że wiele sekwencji RNA zdolnych dowiązania białek regulatorowych, zawiera trwałe, konserwatywne ewolucyjnie struktury przestrzenne, stabilizowane dodatkow o przez wiążące się z nimi białka. Z m iana konfiguracji takiej sekwencji, np. po hybrydyzacji z asO D N , może ham ować działanie białka regulatorowego. Przykładem takich oddziaływań jest sekwencja regulatorow a TAR znajdująca się w każdym m RNA wirusa HIV-1. Z sekwencją tą wiąże się białko transaktyw ujące TAT, co pow oduje zwiększenie ekspresji genów wirusowych. Sekwencja TAR tworzy pętle (6 nukleotydów, nt), k rótki pień (4 nt)1 wewnętrzne wybrzuszenie (3 nt). Rozplecenie k ró tkiego pnia umożliwia powstanie jednoniciowej struktury o długości 17 nt. Koszt energetyczny takiej reakcji wynosi 5.2 kcal/m ol, podczas gdy koszt rozplecenia kolejnego fragm entu pnia (3 nt) i pow stania pętli o długości 23 nt wynosi 12.3 kcal/m ol [5]. Zatem w przypadku sekwencji TAR dostarczenie już niewielkiej energii np. przez związanie asO D N o wysokim powinowactwie z RNA, um ożliwia pow stanie sekwencji oddziałującej z asO D N . W ykazano także, że an ty-T A R -O D N skutecznie ham ują ekspresję genów wirusowych i replikację wirusa HIV-1 in vivo [6].

Cząsteczka RNA, transportow ana poprzez różne przedziały kom órkow e o odm iennych własnościach fizyko-chemicznych, podlegać może różnorodnym przem ianom w wyniku zm ian środow iska fizycznego, oddziaływ ania z białkam i i innymi RNA, dojrzewania,

translacji, degradacji. Podczas translacji rybosom y przesuwające się wzdłuż cząsteczki m RNA destabilizują jego strukturę drugorzędową. Ograniczone zdolności rozplatania struktury drugorzędowej rejonu 5'UTR (ang. 5' untraslated region) wykazuje kom pleks preinic- jujący 43S (rozdz. III). W ydaje się, że wszystkie te zjawiska m ogą wpływać na przebieg hybrydyzacji. Jednakże słabe ich poznanie stoi na przeszkodzie w pełni kontrolow anego zastosow ania asO D N w regulacji ekspresji genów.

II-2. Specyficzność rozpoznania sekwencji docelowej RNA przez asODN

Specyficzność hybrydyzacji asO D N i RNA pojm ow ana jest jako zdolność rozpoznania jedynej, w pełni kom plem entarnej sekwencji m RNA i oparta jest na zasadzie kom plem entarności W atsona-Cricka. A, T, G , C asO D N łączą się odpowiednio z U, A, C, G RNA. Teoretycznie przy odpow iednio długiej sekwencji RNA układ nukleotydów w sekwencji jest niepow tarzalny (a więc charakterystyczny dla danego genu). Z atem asO D N w pełni kom plem entarny do tej sekwencji powinien oddziaływać tylko z wybranym mRNA. M inim alna długość O D N rozpoznającego swoiście wybrane m RNA w kom órce ludzkiej wynosi11-15 nukleotydów (nt) a zależy od składu zasad O D N (11 w przypadku O D N zawierającego wyłącznie nukleotydy G i C, 15 w przypadku O D N zawierającego jedynie A i T; różnica wynika z przewagi A i T nad G i C w genomowym DNA) [7]. W ydaje się, że jest to jednocześnie długość optym alna. Przy zwiększeniu długości O D N praw dopodobieństw o rozpoznania innej sekwencji maleje. Jednakże istnieje możliwość hybrydyzacji fragm entu O D N z m RNA (O D N o długości 20 nt to jednocześnie 9 różnych O D N o długości 12 nt itd., każdy z tych odcinków może hybrydyzować z kom plem entarną sekwencją [8]).

M ożliwa jest też hybrydyzacja z błędam i (połączenie niezgodne z zasadą kom plem entarności). W arunki doświadczenia powinny zatem sprzyjać procesowi swoistej hybrydyzacji oraz ograniczać reakcje niespecyficzne (patrz niżej).

Teoretyczna długość zapewniająca swoistość asO D N odnosi się do układu doskonałego, tj. takiego, w którym RNA i O D N istnieją w formie jednoniciowej, a sekwencje docelowe RNA są jednakow o dostępne i jednakow o ważne (urucham iające mechanizmy efektorowe). W rzeczywistości specyficzność wynika z w arunków doświadczenia oraz param etrów danego układu i zależy od analogu, długości i stężenia O D N oraz jego powinowactwa do sekwencji docelowej.

W ykazano, że poprzez odpowiedni dobór stężenia asO D N oraz ich długości m ożna zwiększyć swoistość działania pięciokrotnie [2]. W doświadczeniu porów nywano asO D N o długości 17 nt (kom plem entarny wobec sekwencji od nukleotydu 27 do 43 m RNA genu Ha-ras), 15 nt (28-42) i 19 nt (26-44) w stosunku do


m R N A prawidłowego i zm utowanego genu Ha-ras. N ajbardziej skuteczny (hamowanie ekspresji genu docelowego) był asO D N o długości 19 nt, ale jednocześnie działał najmniej specyficznie (hamował ekspresję obu genów, zm utow anego i prawidłowego). A sO D N0 długości 15 n t działał wyłącznie na zm utowany gen, ale jego skuteczność była 8-krotnie niższa od poprzedniego. N ajbardziej swoiście i skutecznie działał asO D N o długości 17 nt, jednakże jego specyficzność bliska 100% przy stężeniu lOOnM m alała do 60% przy stężeniu 2.5 raza większym.

Specyficzność staje się podstawowym problem em w sytuacji, gdy celem dla asO D N jest gen różniący się od genu prawidłow ego sekwencją zm utow aną w wyniku m utacji punktowej. W takim przypadku jedynie w ybór sekwencji zm utowanej może zapewnić odpowiednią selektywność działania asO D N . Z am iana G na T w 12 kodonie protoonkogenu Ha-ras prowadzi do w budow ania glicyny w miejscu waliny w białko Ras1 pow stania białka onkogennego. Połączony z akrydy- ną asO D N o długości 9 nukleotydów, kom plem entarny z sekwencją obejm ującą 10, 11 i 12 kodon m RNA onkogenu Ha-ras ham ował ekspresję tego genu, podczas gdy ekspresja protoonkogenu Ha-ras pozostała niezm ieniona [9,10]. A sO D N powodował zaham ow anie proliferacji kom órek T24 raka pęcherza m oczowego (mających zm utow any protoonkogen Ha-ras) [9], podczas gdy wzrost kom órek HBL100 zaw ierających dwie kopie dzikiego genu Ha-ras, pozostaw ał niezaburzony.

Niepełna kom plem entarność asO D N i sekwencji docelowej pow inna uniemożliwiać ich połączenie. Destabilizująca w artość mutacji zależy od jej rodzaju i miejscowienia. K oszt energetyczny zam iany G na A wynosi -3.6 ATm (°C, różnica w temp. topnienia), podczas gdy zam iana C na G -19.4 ATm [2]. K orzystając z tej prawidłowości, w przypadku obecności kilku zm utow anych punktow o sekwencji mRNA, m ożna wybrać sekwencję z m utacją, k tó ra zapewni największą specyficzność. Zgodnie z przewidywaniem delecje nukleotydów w środku sekwencji bardziej destabilizują hybrydę, niż delecje umiejscowione na krańcach sekwencji.

O dm ienną ocenę specyficzności działania asO D N sugerują wyniki doświadczenia z użyciem żabich oocytów, do których wstrzyknięto egzogenne m RNA [8]. P orów nano efekt asO D N w pełni i częściowo kom plem entarnych z badaniam i mRNA. O kazało się, że asO D N działały również przy niepełnej kom plem en- tarności. Jednak w arunki doświadczenia, takie jak tem peratu ra (23°C), czy w ybór miejsca m utacji (jedynie na krańcach asO D N ), zdecydowanie sprzyjały oddziaływ aniom niespecyficznym.

Przedstaw ione wyżej prawidłowości dotyczą sytuacji, w których hybrydyzacja przebiega według zasady kom plem entarności W atsona i Cricka pom iędzy ciągłymi sekwencjami. Połączenie asO D N z RNA może także zaistnieć w wyniku utw orzenia potrójnej helisy

pomiędzy dwuniciowym pniem i jednoniciow ym O D N[11]. Poza tym asO D N może hybrydyzow ać z sekwencją nieciągłą np. z krótkim i jednoniciow ym i sekwencjam i poprzedzielanym i odcinkam i o strukturze szpilki do włosów. T rudno jest obecnie ocenić, jak bardzo zjawiska takie m ogą wpływać na swoistość działania asO D N .

Podsum ow ując, skuteczne i swoiste połączenie asO D N z m RN A to pierwszy etap działania antysensownych oligodeoksyrybonukleotydów . Zależy ono od ich powinow actw a do docelowej sekwencji RNA. Nie wszystkie sekwencje RNA są równie dostępne dla asO D N . Specyficzność hybrydyzacji może ulec poprawie poprzez dobór sekwencji RNA oraz długości i stężenia asO D N .

III. Mechanizmy oddziaływania antysensownych O D N z mRNA

Swoista i skuteczna hybrydyzacja zapoczątkow uje kolejne etapy oddziaływania asO D N z sekwencjami mRNA. Jednym z głównych m echanizm ów końcowych jest współzawodnictwo z naturalnym ligandem np. czynnikam i m ontażu m RNA, białkam i aktyw ującymi translację, rybosom am i, o związanie z odpow iednią sekwencją mRNA. Innym mechanizm em jest ak tywacja RN azy H, enzymu hydrolizującego RNA w hybrydzie O D N -R N A .

III-l. Sekwencje regulujące metabolizm RNA jako miejsce docelowego działania asODN

III-1-a. Sekwencje pre-mRNA uczestniczące w cięciu i składaniu pre-mRNA

Proces cięcia i składania pre-m RN A (ang. splicing) polega na wycięciu intronów i połączeniu eksonów w układ sekwencji stanowiący dojrzałe m RNA [12]. Jest to proces wysoce specyficzny i zależny od działania złożonego układu m olekularnego, w skład którego wchodzą peptydy i RNA tworzące U snR N P (ang. U small nuclear ribonucleoproteins) oraz inne czynniki regulatorowe. SnRNA (ang. small nuclear R N A ) rozpoznają (poprzez specyficzną hybrydyzację) kluczowe sekwencje pre-mRNA: 5'ss i 3'ss (ang. 5' splicing site), leżące odpowiednio na granicy ekson-intron i intron-ekson, a zatem określające pozycje in tronu (5'-intron-3') oraz sekwencje BP (ang. branching point). Rozpoznanie miejsca 3'ss rozpoczyna kaskadę reakcji umożliwiających odpowiednie zorientow anie cząsteczki pre-m RN A , przecięcie jej w 5'ss, tymczasowe połączenie 5'ss z BP i końcowe połączenie sąsiadujących eksonów.

W ykazano, że asO D N kom plem entarne z w ybranych sekwencji snRNA skutecznie blokują proces cięcia i składania pre-m RN A in vitro [4, 13, 14].

W yniki innych doświadczeń wskazały na możliwość zaham ow ania ekspresji genów za pom ocą asO D N


swoiście wpływających na proces cięcia i składania pre-m RNA [15, 16]. Zastosow ano M -O D N (metylo- fosforanowy analog) kom plem entarny z 5'ss pre-mRNA genu wczesnego 4 (IE-4) w irusa opryszczki (HSV-1). Nieprawidłowej wielkości m RNA IE-4 (z d o datko wym fragmentem intronu) stanowił ok. 20% ogólnej ilości transkryptu tego genu. Jednocześnie obserwow ano prawie całkowite zaham ow anie syntezy białek wirusowych i replikacji wirusa. O bserw ow any efekt był wysoce specyficzny w odniesieniu do badanej sekwencji (asO D N do przypadkowej sekwencji in tro nu nie miały żadnego efektu), jak i w odniesieniu do wirusa (asO D N nie ham ow ały replikacji w irusa HSV- 2, pom im o że hom ologia sekwencji docelowej wynosiła 65%). Podobne wyniki uzyskano stosując asO D N kom plem entarne z sekwencją 3'ss pierw otnych trans- kryptów genów IE-22 i IE-47 wirusa HSV-1 [17].

W jednej z rzadkich form ß-talasemii (choroba wywołana nieprawidłową struk tu rą łańcucha ß hem oglobiny) m utacja punktow a w drugim intronie genu ß-globiny tworzy nieprawidłowe sekwencje 5'ss oraz aktywuje ukryte sekwencje 3'ss. W takiej sytuacji apara t cięcia i składania pre-m RN A wykorzystuje zarów no prawidłowe sekwencje ss, jak i nowo powstałe w wyniku mutacji. Pow oduje to powstanie transkryp- tów: prawidłowych i nieprawidłowych w proporcji 1:2. 2 '-0-m etylooligorybonukleotydy kom plem entarne z błędnymi sekwencjami 3'ss lub 5'ss przywarły prawidłowy proces cięcia i składania pre-m RN A ß- globiny [18]. P raw dopodobnie asO D N po hybrydyzacji ze zm utow anym i sekwencjami i utw orzeniu stabilnej struktury drugorzędowej blokowały dostęp czynników m ontażu do błędnych sekwencji ss, co um ożliwiło wykorzystanie sekwencji prawidłowych.

III-1-b. Rejon nieulegający translacji 5'RNA

Eukariotyczne m RNA oraz RNA niektórych w irusów zawierają rejon niekodujący w pozycji 5' od kodonu startowego (ang. 5' untranslated region, 5'U TR ) zakończony struk turą czapeczki (ang. cap), O dpowiedzialny jest on za stabilność RNA w jądrze kom órkow ym , regulację wycięcia pierwszego intronu, transport m RNA z jąd ra do cytoplazm y oraz inicjację translacji [19]. W obrębie tej sekwencji powinny się zatem znajdow ać miejsca rozpoznaw ane przez czynniki regulujące wyżej wymienione procesy. Efekt asO D N byłby wynikiem ich współzawodnictw a z naturalnym i czynnikami regulatorowym i o miejsce w iązania. Zaznaczyć należy, że choć efekty anty-5 'U T R -O D N , takie jak zm iana stabilności m RN A, zaburzenie obróbki pierwszego in tronu i transportu m RNA z jąd ra do cytoplazm y są bardzo pradopodobne, jak do tąd brak bezpośrednich dow odów na ich obecność.

Pierwszym etapem procesu inicjacji translacji jest połączenie białkowego czynnika inicjującego translację eIF-4F (ang. eukaryotic initiation factor 4F) ze

struk tu rą czapeczki. Umożliwia to oddziaływanie z rejonem 5'U TR innyh czynników eIF-4A i eIF-4B i aktywację kom pleksu preinicjującego 43S (podjednostka 40S rybosom u z czynnikiem eIF-2 oraz M et- tR N A Met). Aktywny kom pleks preinicjujący przesuwa się w kierunku 3', aż napo tka kodon startowy. P rzyłączenie podjednostki 60S umożliwia rozpoczęcie tran slacji [20].

Przyjmuje się, że podstawowy proces inicjacji tran slacji może być dodatkow o regulowany. D obrze po znana jest regulacja translacji m RNA ferrytyny (białka magazynującego żelazo) [20, 21]. W rejonie 5 'U TR (ok. 30-40 nt od czapeczki) znajduje się sekwencja0 konfiguracji szpilki do włosów IRE (ang. iron responsiue element) miejsce wiązania białka IR E-B P (ang. IR E binding protein). N a oddziaływanie IR E-B P z m RNA wpływają jony F e2 + . Zaham ow anie inicjacji translacji zależy od stabilizacji struktury IR E przez białko (przy niskim stężeniu F e2 + ), co uniem ożliwia prawidłow e oddziaływanie czynników inicjujących1 kom pleksu 43S z RNA. Z innych badań wynika, że sam o istnienie rejonu o strukturze przestrzennej wyższego rzędu (bez stabilizującego białka, o energii do AG < -50 kcal/mol) nie blokuje inicjacji translacji, jeśli miejsce jego pow stania znajduje się w kierunku 3' od miejsca przyłączenia kom pleksu 43S. W ynika to z ak tywności helikazowej (rozplatającej) kom pleksu p reinicjującego.

M ożna wyróżnić kilka mechanizmów oddziaływ ania asO D N w rejonie 5'UTR. W szczególności hybrydyzacja asO D N :

1. zmienia strukturę przestrzenną odcinka RNA i zaburza przyłączanie podstawowych czynników inicjujących translację;

2. blokuje przyłączanie białek regulatorowych (aktyw atorów lub represorów). M echanizm pierwszy m oże być uniwersalny, drugi zaś specyficzny dla określonej populacji mRNA.

W jednym z doświadczeń badano oddziaływanie pomiędzy czynnikami inicjującymi translację, rejonem 5'U TR m RN A reowirusów a asO D N . O D N kom plem entarne wobec pierwszych 15 nukleotydów tej sekwencji ham owały wiązanie podjednostki a czynnika eIF-4F z czynnikami eIF-4A oraz eIF-4B [22], W innym doświadczeniu wykazano, że asO D N do końcowych sekwencji rejonu 5'UTR syntetycznego RNA i wystające kilka nukleotydów poza czapeczkę pow odow ało zaś ham ow anie wiązania czynnika e lF - 4E do RNA. W tym przypadku efekt ten był zależny od liczby i rodzaju nukleotydów wystających poza koniec 5'RNA [23].

W ostatnim czasie zidentyfikowano sekwencje regulatorow e RNA wirusa HIV-1 np. TAR i RRE, wiążące odpowiednio białka transaktyw ujące TA T i REV. TAT po połączeniu z TAR nasila transkrypcję RNA wirusowego. W ykazano, że asO D N kom plem entarne z sekwencją TAR (rozdz. I I -1) blokow ał ekspresję genów wirusowych i replikację wirusów.


N iektóre geny zawierają kilka miejsc startu transkrypcji. Pow oduje to powstanie transkryptów różniących się długością, sekwencją i struk tu rą rejonu 5'UTR [19]. W mRNA ICAM-1 (kodującego białko zaliczane do rodziny adheryn) 5'UTR może mieć długość 41,124 i 319 nukleotydów długości, w zależności od rodzaju kom órki lub w arunków środowiska. W ybór rejonu 5'UTR jako miejsca oddziaływania asO D N stw arza możliwość wybiórczego zablokow ania ekspresji określonej subpopulacji mRNA.

III-l-c. Rejon niekodujący 3 mRNA

tarne wobec kodonu startowego A U G i początkowych sekwencji kodujących [26]. N iestety m echanizm tego procesu nie jest znany. W ydaje się, że asO D N blokują przyłączenie podjednostki rybosom alnej 60S do kom pleksu 43S i m RNA w miejscu startu translacji. Sprzeczne doniesienia dotyczą skuteczności asO D N kom plem entarnych wobec środkow ych i końcowych sekwencji kodujących [24, 27-31]. Nie wyjaśnione jest też oddziaływanie hybrydy a sO D N :m R N A z rybosomami. W iadom o, że organella te rozpla tają strukturę drugorzędow ą RNA, powinny też destabilizować hybrydę asO D N :m R N A [20, 32, 33].

Spośród kilkunastu O D N , kom plem entarnych wobec różnych sekwencji m RNA ICAM -1, najbardziej efektywne były O D N hybrydyzujące z sekwencją położoną 300 nt za miejscem zakończenia translacji, w rejonie 3 'UTR (ang. 3' untranslated regiń) (Ryc. 4) [24]. asO D N specyficzne wobec innych sekwencji rejonu 3 'U T R były mniej lub całkowicie nieskuteczne. W doświadczeniu opisanym wyżej możliwe jest, że odszcze- pienie końca 3' (w wyniku działania RN azy H, rozdz. III-3) w określonym miejscu 3'U TR (inne 3'UTR- asO D N były mniej skuteczne) powodow ało zmianę w układzie sekwencji destabilizujących i wyzwalało szybką degradację m RNA kodującego ICAM-1.

5 . 3 • 6 . 1

5'UTR

5'UTR

1 2 444 35 ’UTR

5'UTR

I ICAM-1 .I

3

RP

3I p120I

4 •

RP

c-mycRP

4 1 2

-j pro-a

2 * . 4 .3 ’UTR

A A A AA A

2 . 1 • • ■ 3'UTR

3'UTR

RP3 ’UTR

A AA A A A

A A A A A A

A A A A A A

R yc. 4. W y b ó r o p ty m aln e j sekw encji m R N A — m iejsca o d d z ia ły w an ia z a s O D N . C yfry o k re ś la ją p rzy b liżo n ą lokalizac ję sekw encji, k tó re s tan o w iły cel d la a s O D N . M iejsce h y b rydyzacji a sO D N , k tó ry najsiln iej h a m o w a ł eksp resję genu, o zn acz o n e je s t cyfrą 1. M ie jsca hybry d y zac ji in nych a sO D N o zn acz o n e są w ko le jnośc i p rzez cyfry o d 2 d o 6. * ozn acza m iejsce hyb ryd y zac ji as O D N o sku teczn o śc i poniżej 50% . 5 'U T R — re jon n ieu legający tran slac ji 5 'm R N A ; R P — re jo n u legający tran slac ji (kodu jący ) m R N A ; 3 'U T R — rejon n ieu legający tran slac ji 3 'm R N A ; IC A M -1 — a d h e ry n a , k o m ó rk i H U V E C [2 4 ]; p !2 0 — cyk lina , k o m ó rk i H eL a [31 ]; c-m yc — czynn ik tran sk ry p cy jn y , k o m ó rk i H L -6 0 [3 0 ]; p ro-a — p ro th y m o z y n a a, k o m ó rk i R P M I 8226 [29].

III-1-d. Zahamowanie translacji

Z ebrano wiele dow odów na możliwość skutecznego zablokow ania translacji przez asO D N , kom plem en-

III-2. Aktywacja RNazy H przez asODN

Substratem RNazy H jest hybryda R N A : DNA. RNAza H występuje zarów no w jądrze, jak i w cytoplazmie, aktywnie dzielących się kom órek i uczestniczy w procesie replikacji DNA, podczas k tórego hydrolizuje oligorybonukleotydy służące jak o startery.

Pierwsze doświadczenia, sugerujące możliwość aktywacji RNazy H przez asO D N , przeprow adzono w systemie translacji in vitro z użyciem lizatu z retikulo- cytów królika [34,35]. Pom im o, że aktyw ność RNAzy H w preparacie lizatu retikulocytów stanowi 1-2% aktywności występującej w kom órkach jądrow ych okazało się, że zaham owanie ekspresji badanych genów było wynikiem fragm entacji mRNA. Analiza RNA wykazała obecność fragm entów m RNA ot i P globiny, zaś miejsce cięcia odpow iadało miejscu wiązania asO D N . D odanie inhibitora RNAzy H poli(rA)-oli- go(dT) przwracało ekspresję genów globin. Podobne obserwacje poczyniono analizując losy endogennego i egzogennego mRNA w oocytach mysich i żabich po zastosow aniu odpowiednich asO D N kom plem entarnych wobec sekwencji kodujących [36, 37].

Inne dowody potwierdzające udział RNazy H w procesie ham ow ania ekspresji genów przez asO D N pochodzą z badań nad retrow irusam i. K luczowym enzymem cyklu życiowego retrow irusów jest odw rotna transkryptaza. O kazało się, że jedna z podjednostek odwrotnej transkryptazy m a aktywność RNazy H. W jednym z doświadczeń uzyskano zahamowanie syntezy cD NA wirusów AM V (ang. avian mieloblastoma virus) i M M LV (ang. murine Moloney leukemia virus) stosując asO D N . Analiza RNA wykazała jego przecięcie w miejscu hybrydyzacji z asO D N . Jeśli odw rotna transkryptaza została pozbaw iona (w wyniku mutacji) aktywności RN azy H, asO D N nie ham owały odwrotnej transkrypcji [38-40]. W ydaje się, że taki układ powinien być szczególnie efektywny i specyficzny w blokowaniu ekspresji genów wirusowych. Przy obecności asO D N , odw rotnej transkrypcji (pierwszemu etapowi ekspresji genów wirusowych) będzie towarzyszyła degradacja RNA wirusowego.

RNAza H hydrolizuje w kom pleksie RNA-DNA jedynie RNA, zatem jedna cząsteczka O D N może wyzwalać degradację wielu cząsteczek RNA. Pseudo-

172 POSTĘPY BIO C H EM II 4 0 (3 ) , 1994http://rcin.org.pl

katalityczne działanie O D N w obecności RNAzy H sugerowały wyniki doświadczenia, w którym S- O D N kom plem entarne wobec sekwencji kodującej mRNA (Tglobiny króliczej w strzyknięto do ooctów żaby razem z docelowym m RNA [37]. Przy stężeniu O D N czterokrotnie niższym od stężenia RNA obserwowano degradację połowy cząsteczek mRNA.

W ydawać by się m ogło, że aktywacja RNazy H powinna być kluczowym m echanizm em efektorowym asO D N . Bez względu na lokalizację hybrydy przecięcie RNA niszczyłoby tę cząsteczkę nieodwracalnie. O k azało się jednak, że tak a prawidłowość nie zawsze istnieje. K om órki białaczki m onocytarnej U937 zawierają aktyw ną RNazę H. A sO D N kom plem entarne wobec pierwszych kodonów m RNA c-myc ham owały syntezę białka Myc w tych kom órkach. Jednocześnie nie w ykazano degradacji m RNA c-myc [41].

IV. Wybór optymalnej sekwencji mRNA jako miejsca oddziaływania z asO D N

W ybór optym alnej sekwencji docelowej m RNA i odpowiednie zaprojektow anie asO D N jest sprawą kluczową dla zapew nienia skuteczności i swoistości jego działania. Stosuje się tu kilka m etod. Jedna z nich polega na opracow aniu m odelu struktury drugorzędo- wej m RNA docelowego, wyliczeniu energii w iązania z poszczególnymi sekwencjami i wreszcie na wyborze najbardziej odpowiedniej sekwencji w danym układzie doświadczalnym [42, 43]. Inną m etodą, jak dotąd najczęściej stosow aną, jest testowanie wielu O D N kom plem entarnych wobec wybranych sekwencji m RNA, pod względem skuteczności [24, 29-31], Rycina 4 przedstaw ia skuteczność asO D N w stosunku do różnych sekwencji kilku mRNA. Dużą skuteczność wykazują asO D N kom plem entarne wobec sekwencji z kodonem startowym . Jest to istotne, gdyż dla większości genów znane są jedynie sekwencje cDNA. W tym przypadku m echanizm em działania będzie zatrzym anie translacji. Skuteczność asO D N hybrydy- zujących w rejonie 5 'U T R lub 3'UTR świadczyć może o decydującym znaczeniu tych sekwencji w regulacji ekspresji genów. M echanizm em działania może być tu blokow anie dostępu naturalnych ligandów (aktyw atorów lub represorów ) lub przecięcie mRNA. Pam iętać jednak należy, że brak lub mniejszy efekt danego O D N może świadczyć zarów no o nikłym znaczeniu dla ekspresji genu wybranej sekwencji RNA, jak również o słabym pow inowactwie asO D N wobec RNA.

V. Podsumowanie

asO D N stanow ią now ą klasę narzędzi badawczych oraz potencjalnych terapeutyków pozwalających na wysoce specyficzną ingerencję w proces ekspresji genu na etapie m etabolizm u mRNA. Pierwszym etapem działania asO D N jest seektywne rozpoznanie i po łączenie czyli hybrydyzacja z docelową sekwencją

mRNA. Selektywność działania asO D N m ożna p o prawić poprzez w ybór odpowiedniego analogu, długości i stężenia asO D N oraz sekwencji mRNA. asO D N oddziałując z sekwencją m RNA blokują dostęp n a tu ralnych ligandów regulujących m etabolizm m RNA lub wyzwalają enzym atyczną hydrolizę m RNA. M echanizmy efektorowe, wtórne do hybrydyzacji, zależą od lokalizacji sekwencji docelowej w cząsteczce mRNA oraz od właściwości samego układu dośw iadczalnego. W yboru najbardziej optymalnej sekwencji docelowej, w większości przypadków, dokonuje się m etodą prób i błędów spośród puli wielu asO D N .

PodziękowanieSerdecznie dziękuję Panu Docentowi Leszkowi K a c z

m a r k o w i , P anu M agistrow i K ubie F i l i p k o w s k i e - m u, Pani D ok to r Bożenie K a m i ń s k i e j - K a c z m a - r e k , Pani M agister Izabelli F i g i e l i Panu D ocentow i Cezarem u S z c z y l i k o w i za dyskusję i cenne uwagi.

A rtykuł otrzymano 18 kwietnia 1994 r.Zaakceptowano do druku 3 czerwca 1994 r.

Piśmiennictwo

1. C o o k P D (1993) W: C ro o k e ST, L ebleu B (red) A n tisen se R esearch a n d A p p lica tio n s, C R C Press, s tr 149-189

2. F r e i e r S M (1993) W: C ro o k e ST, L ebleu B (red) A n tisense R esearch an d A pp lica tio n s, C R C P ress, s tr 67-82

3. L i a W F, M o n i a B P , E c k e r D J , F r e i e r S M (1992) B iochem istry 31: 12055-12061

4. B l e n c o w c e BJ , S p r o a t BS, R y d e l U, B a r a b i n o S, L a m o n d A l (1989) C eli 59: 531-539

5. E c k e r D J (1993) W: C r o o k e S T , L e b l e u B (red) A ntisense R esearch an d A pp lica tio n s, C R C Press, s tr 387-399

6. V i c k e r s T, B a k e r B F, C o o k P D , Z o u n e s M, B u c k - h e i t R W, G e r m a n y J, E c k e r D J (1991) N uc le ic A cids R es 19: 3359-3368

7. H e l e n e C (1991) Eur J C ancer 27: 1466-14718. W o o l f T M , M e l t o n D A , J e n n i n g s C G B (1992) Proc

N a tl A cad Sei U SA 89: 7305-73099. S a i s o n - B e h m o a r a s T , T o c q u e B, R e y 1, C h a s s i g -

n o l M, T h o u n g N T , H e l e n e C (1991) The E M BO J 10: 1111-1118

10. M o n i a B P , J o h n s t o n J F, E c k e r D J , Z o u n e s M A , L i m a W F , F r e i e r S M (1992) J B iol Chem 267: 189954- 19962

11. B r o s s a l i n a E, P a s c o l o E, T o u l m e J J (1993) N u c le ic A cids R es 21: 5616-5622

12. G r e e n M R (1991) A nn R ev C ell B iol 7: 559-59913. B l a c k D L , S t e i t z J A (1986) C ell 46: 697-70414. B l a c k D L , C h a b o t B , S t e i t z J A (1985) Cell 42: 737-75015. S m i t h C C , A u r e l i a n L, R e d d y M P , M i l l e r P S ,

T s ’ o P O P (1986) Proc N a tl A cad Sei U SA 83: 2787-279116. K u l k a M, S m i t h C C , A u r e l i a n L, F i s h e l e v i c h R,

M e a d e K , M i 1! e r P , T s’ o P O P (1989) Proc N a tl A ca d Sei U SA 86: 6868-6872

17. J a c o b A, D u v a l - V a l e n t i n , I n g r a n d D, T h u o n g N T , H e l e n e C (1993) Eur J B iochem 2 1 6 :1 9 -2 4

18. D o m i n s k i Z, K o l e R (1993) Proc N a tl A cad Sei U S A 90: 8673-8677

19. B a k e r B F (1993) W: C ro o k e ST, Lebleu B (red) A n tisense R esearch a n d A p p lica tio n s, C R C P ress, s tr 37-49

20. K o z a k M (1992) A nnu R ev Cell B iol 8: 197-22521. M e l e f o r s O, H e n t z e M W (1993) B ioE ssays 15: 85-9022. L a w s o n G T , R a y B K, D o d d s J T , G r i f o J A , A b

r a m s o n R D , M e r r i c k W C , B e t s c h D F , W e i t h H L , T h a c h R E (1986) J B iol C hem 261: 13979-13989

23. B a k e r B F , M i r a g l i a L, H a g e d o r n C H (1992) J B iol Chem 267: 11495-11499


24. C h i a n g M Y , C h a n H, Z o u n e s M A, F r e i e r S M , L i m a W F , B e n n n e t F C (1991) J B io l C hem 266: 18162- 18171

25. S a c h s A (1993) C ell 74: 413-42126. M i r a b e l l i C H , C r o o k e S T (1993) W : C ro o k e ST, L ebleu

B (red) A n tisense R e search a n d A p p lica tio n s, C R C P ress, s tr 7-36

27. H a e u p t l e M T , F r a n k R, D o b b e r s t a i n B (1986) N uc l A cids R es 14: 1427-1448

28. N o m o k o n o v a N Y , G o r n V V , V l a s o w V V (1993) M o lec B io l 27: 193-199

29. S b u r l a t i A R , M a n r o w R E , B e r g e r S L (1991) Proc N a tl A ca d Sei U S A 88: 253-257

30. B a c o n T A , W i c k s t r o m E (1991) O ncogene R es 6: 13-1931. P e r l a k y L, S a i j o Y, B u s c h R K , B e n n e t t C F, M i

r a b e l l i C K , C r o o k e S T , B u s c h H (1993) A ntiC ancer Drug Design 8: 3-14

32. S A L i e b h a b e r , C a s h F E , S h a k i n S H (1984) J Biol C hem 259: 15597-15602

33. S h a k i n S H , L i e b h a b e r S A (1986) J B io l C hem 261: 16018-16025

34. M i n s h u l l J, H u n t T (1986) N uc l A cids R es 14 :6433-645135. W ä l d e r R Y, W ä l d e r J A (1988) Proc N a tl A ca d Sei U SA

85: 5011-501536. D a s h P, L o t a n I, K n a p p M, K a n d e l E R , G o e l e t

P (1987) Proc N a tl A cad Sei U S A 84: 7896-790037. S h u t t l e w o r t h J, C o l m a n A (1988) E M BO J 7: 427-43438. L o r e a u N, B o i z i a u C, V e r s p i e r e n P, S h i r e D ,

T o u 1 m e J J (1990) F E B S L e tt 252: 53-5639. B o i z i a u C, T h o u n g N T , T o u l m e J J (1992) P roc N a tl

A cad Sei U SA 89: 768-77240. H a t t a T, K i m S S G , N a k a s h i m a H, Y a m a m o t o N,

S a k a m o t o K, Y o k o y a m a S, T a k a k u H (1993) F E B S L e tt 330: 161-164

41. R o s o l e n A, K y l e E, C h a v a n y C, B e r g a n R, K a l m a n E T , C r o u c h R, N e c k e r s L (1993) B iochim ie 75: 79-87

42. S t u l l R, T a y l o r L A , S z o k a F C (1992) N u c le ic A c id s R es 20: 3501-3508

43. M i t s u h a s h i M, C o o p e r A, O g u r a M, S h i n a g a w a T, Y a n o K, H o s o k a w a T (1994) N a tu re (L o n d ) 367: 759-761

Apirazy — enzymy kontrolujące stężenie wolnych nukleo- tydów w komórkach i tkankach

Apyrases — enzymes involved in the control of nucleotides level in cells and tissues

MICHAŁ ALEKSANDER KOMOSZYŃSKI*

Spis treści:

I. WstępII. Klasyfikacja apirazIII. Charakterystyka apirazIV. Mechanizm katalizyV. Funkcja ektoapiraz w układzie nerwowymVI. Apirazy a purynoreceptoryVII. Udział apiraz w regulacji aktywności 5'-nukIeotydazy,

cyklazy adenylowej i recyklizacji nukleotydówVIII. Rola ektoapiraz w układzie krwionośnym

VIII-1. Udział w procesach agregacji płytek VIII-2. Udział w procesach regulacji ciśnienia krwi

IX. Regulacja przepuszczalności błon i transport substancji wysokocząsteczkowych

X. Metaboliczna rola endoapirazX-1. Udział apiraz w procesach syntezy skrobi X-2. Apirazy regulują poziom P¡ w komórkach

XI. Uwagi końcowe

Contents:

I. IntroductionII. Classification of apyrasesIII. Characteristic of apyrasesIV. Mechanism of catalysisV. Role of ectoapyrases in nervous systemVI. Apyrases as purinoreceptorsVII. Apyrases function in regulation of the activity of

5'nucleotidase, adenyl cyclase and nucleotide recyclingVIII. Role of apyrases in vascular system

VIII-1. Apyrases participate in platelet agrégation VIII-2. Apyrases participate in vasodilation and vaso-

constructionIX. Regulation of permeability of membranes and transport

of some large macromoleculesX. Metabolic function of endoapyrases

X-1. Participation of apyrases in synthesis of starch X-2. Apyrases are involved in regulation of the Pj level

in the cellXI. Concluding remarks

Wykaz stosowanych skrótów: E D R F — endotelialny czynnik relaksujący; FSBA — 5'p(fliiorosulfonylo)benzyloadenozyna; K sh = v A TP/v A D P (v = szybkość hydrolizy substratów).

* Dr, Z akład Biochemii, Insty tu t Biologii, U M K , ul. G agarina 7, 87-100 T oruń

I. Wstęp

Apirazy (dwufosfohydrolazy A TP — EC 3.6.1.6) są enzymami znanymi od ponad 40-tu lat. O dkryte i opisane po raz pierwszy w 1945 r. przez M e y e r - h o f a [1] są jedynym i enzymami hydrolizującymi ATP, których funkcja m etaboliczna nie została dotąd w pełni poznana.


Badania ostatnich dziesięciu lat udowodniły, że adenozytrójfosforan jest nie tylko źródłem energii w komórce, lecz również nośnikiem inform acji [2-4]. Podobną funkcję pełnią powstające w wyniku hydrolizy tego nukleotydu ADP, A M P i adenozyna [2, 5, 6]. Związki te kontro lu ją różne, często przeciwstawne, procesy m etaboliczne, w związku z tym w kom órkach i tkankach m uszą istnieć m echanizmy regulujące ich stężenie. A TP i A D P są substratam i wielu enzymów. N iektóre z nich, w tym ATPazy, w ykorzystują energię wiązań pirofosfosforanowych do syntez, transportu jonów i m etabolitów [7]. Apirazy również hydrolizują ATP jednak nie uczestniczą w żadnym z wcześniej wymienionych procesów. Specyficzny mechanizm hydrolizy substratów przez apirazę wskazuje, że może ona kontrolow ać, w kom órkach i tkankach, stężenie nukleotydów bogatych w energię i powstających w wyniku ich hydrolizy produktów o niskim potencjale energetycznym. Celem mojego artykułu jest prezentacja wyników, które po około 50 latach, pozwoliły na sform ułowanie hipotezy o udziale apiraz w regulacji poziom u nukleotydów w kom órkach i tkankach.

II. Klasyfikacja apiraz

Apirazy charakteryzują się zbliżonymi właściwościami kinetycznymi i strukturalnym i [8-15] tworząc wyrazistą grupę systematyczną. Różnią się jednak rozpuszczalnością i lokalizacją co stanowi podstawę ich klasyfikacji (Ryc. 1). M ożemy wyróżnić dwie formy tego enzymu: rozpuszczalną „R” uzyskaną z super- natantów kom órek roślinnych i ze śliny owadów [9,16], oraz związaną z m em branam i formę „M ” [9-12, 17]. Obie formy m ogą występować jako endoapirazy „I” („RI” i „M I”) o centrum katalitycznym znajdującym się we wnętrzu kom órki [14, 17] i ektoapirazy „O ” („RO” i „M O ”) o centrum katalitycznym zlokalizowanym poza kom órką [12, 18, 19].

III. Charakterystyka apiraz

Obecność dwufosfohydrolaz A TP stw ierdzono we wszystkich dotychczas przebadanych tkankach euka- riontów [8-16, 18] oraz w kom órkach now otw orowych [10]. Brak jest jednak jednoznacznych danych0 obecności ektoapirazy w kom órkach i tkankach roślin.

W iększość dotychczas opisanych dw ufosfohydrolaz A TP zbudow anych jest z pojedynczego polipeptydu1 charakteryzuje się brakiem grup -SH [10, 11, 15,19-22], M asa cząsteczkowa większości apiraz roślinnych w aha się od 40-51 kD a, podczas gdy apirazy zwierzęce charakteryzują się większą i bardziej zróżnicow aną wielkością cząsteczek [13, 23]. E ktoapirazy izolowane z w ątroby szczura, śledziony wołu oraz trzustki świni są glikoproteinam i [11,18, 23]. K arb o k sylowy koniec łańcucha białkowego ek toapiraz znajduje się po stronie cytoplazmatycznej błony. Po stronie ekstracytoplazm atycznej występują 2 fragm enty struk

tury o sekwencji odpowiadającej miejscom wiązania nukleotydów oraz am inowy koniec łańcucha białkowego [18].

Apirazy niezależnie od źródła ich pochodzenia są enzymam i o niskiej specyficzności substratowej i k a ta lizują rozpad zarów no nukleotydów dw u-jak i trójfos- foranowych oraz pirofosforanu tiam iny [8, 15, 21, 23]. Oczyszczone preparaty apiraz nie hydrolizują nieograniczonego pirofosforanu i estrowych wiązań fosforanowych [8, 21, 23]. Enzymy z różnych źródeł różnią się szybkością hydrolizy A TP i ADP. Stosunek hydrolizy A TP do A D P (Ksh [A T P/A D P ]) większości apiraz zawiera się pom iędzy 1 i 2 [8, 9, 14, 24]. O ptim um pH apiraz roślinnych jest bliskie 6.5 [8 ,9 ,14 , 24], podczas gdy optim um pH enzymów zwierzęcych znajduje się w przedziale alkalicznym [9, 10, 12]. Apirazy są silnie ham ow ane przez związki chelatujące [8, 11, 22], i azydki [2, 10, 12], a w niektórych przypadkach przez H gC l2 [19, 25] i analogi A TP [10, 11, 26]. Silnym inhibitorem apirazy z m ikrosom ów pszenicy oraz rozpuszczalnego enzymu z bulw ziemniaka jest trifluprom azyna [17, 27].

APIRAZY

fo rm y ro z p u s z c z a ln e form y membranowe

"R " "M "

irEKTOAPIRAZY ENDOAPIRAZY EKTOAPIRAZY

"RO" "RI" "Ml" "MO"

ap irazy cyfozo lo aprazy nabłonek

ś lin y wa ap i* memb. ja d ro - i mięśnie g ł.owadów raza zie wych, ER.A.Gol- naczyń krw.,

m n iaka gi, m ikrosom y komórki w ą -

troby, płuc,R yc. 1. S ch em at k lasyfikacji ap iraz . t r z u s tk i ,

syn a p sy

IV. Mechanizm katalizy

Poznanie m echanizm u katalizy stanowi podstawę dla zrozum ienia metabolicznej roli apirazy. Apiraza hydrolizuje A TP do A M P i 2 cząsteczek ortofosforanu. Adenozyna, jako produkt, pojawia się we wczesnym stadium reakcji, przy ogrom nym nadm iarze sub- stra tu w stosunku do produktów [8, 24, 26]. Inaczej zachow ują się ATPazy, które w analogicznych w arunkach hydrolizują A TP do A D P i ortofosforanu [7].

Stosując y [ 32P ]A T P i (3 [ 32P ]A D P wykazano, że dodanie do znakow anego A TP rów nom olarnych ilości nieznakow anego A D P powoduje obniżenie o 50% ilości (3 lub y 32Pj uwalnianego z A TP [24]. Sugeruje to, że nieradioaktyw ny A D P konkuruje o miejsce aktyw ne tylko z wolnym enzymem. N a tej podstawie autorzy zaproponow ali następujący mechanizm hydrolizy:

A TP + E ¿> E-A TP E-A D P -» A M P + P= (1)IP,

POSTĘPY BIO CHEM II 40 (3 ), 1994 175http://rcin.org.pl

Tę hipotezę w pełni potwierdzają nasze badania nad apirazą z m ikrosom ów kiełków pszenicy [8, 26], w k tórych wykazaliśmy, że dodanie do optymalnych stężeń ATP — 1 mM A D P nie przyspiesza, ale też nie hamuje szybkości reakcji. Szybkość hydrolizy nie jest więc ograniczona stężeniem wolnego ADP. Ponadto analog ATP z dołączną do y fosforanu siarką hamuje hydrolizę obu substratów , podczas gdy A D P-S jest słabym inhibitorem enzymu i dlatego powinow actwo enzymu do A TP wydaje się być większe niż do A D P [26]. W tej sytuacji niewielkie ilości powstającego w początkowej fazie reakcji A D P i ogrom ny nadm iar A TP w mieszaninie reakcyjnej nie pozwala na ponow ne wiązanie A D P z centrum katalitycznym apirazy [8]. Powyższe dane oraz zbliżone wartości K m dla A TP i A D P potw ierdzają, że prezentowany powyżej schemat jest zgodny z mechanizm em działania enzymu (1).

V. Funkcja ektoapiraz w układzie nerwowym

Już w latach siedemdziesiątych wysunięto hipotezę o udziale pochodnych adenozyny w procesach neurotransm isji [2], ponieważ w zakończeniach synaptycznych oprócz pęcherzyków wypełnionych neurotrans- m iteram i stw ierdzono grom adzenie się pęcherzyków zawierających ATP. D rogą egzocytozy pęcherzyki przedostają się do przestrzeni synaptycznej, a uwolniony z nich ATP powoduje depolaryzację błony postsynaptycznej i transm isję sygnału do następnego neuronu lub płytki nerwowo-mięśniowej [2, 28-30] (Ryc. 2). Podanie do przestrzeni śródsynaptycznej a,P-m etyleno-ATP (analogu ATP) związku, k tóry nie ulega hydrolizie enzymatycznej, powoduje 100-krotne wzmocnienie sygnału nerwowego [2]. Ten fakt, podobnie jak i grom adzenie w przestrzeni synaptycznej A M P i adenozyny potw ierdzają udział A TP w neuro- transmisji. Badania ostatnich trzech lat wykazały, że A TP gra rolę neurotransm itera w centralnym i obwodowym układzie nerwowym. W ostatnich dwóch latach stwierdzono, że transm isja sygnału między neuronam i uzdeczki mózgu szczura i w nerwach obwodowych świnki morskiej trw a mimo obecności substancji blokujących receptory nikotynowe, gluta- m inianowe, y-aminom asłowe, noradrenalinow e oraz adenozynowe [31, 32]. Jedynym inhibitorem tego sygnału okazała się suram ina substancja ham ująca wiązanie A TP z receptorem, typu P 2. N atom iast analog A TP — a ,(3 metyleno A TP usuwał wywołaną suram iną blokadę sygnału [31]. Powyższe dane w skazują na obecność purynoreceptorów również w centralnym i obwodowym układzie nerwowym ssaków. Dotychczasowe badania pozwoliły na wyodrębnienie w kom órkach zwierzęcych purynoreceptorów charak teryzujących się wysokim powiniowactwem wobec A TP i A DP, określanych jak o receptory P 2, P y2, P y2, P x 2) [2-4] oraz receptorów P 1 o niskim pow inow actwie do w spom nianych nukleotydów, a wysokim wobec A M P i adenozyny. Receproty P t są blokow ane przez

metyloksantynę, a ich aktywacja powoduje wzrost ilości cA M P [2, 3, 5]. Receptor P 2 blokuje suramina, a analogi ATP powodują wzmocnienie sygnału [1, 2, 7]. ATP jest bardzo szybkim przekaźnikiem sygnałów wywołujących ostry wzrost i równie gwałtowny spadek pobudzenia nerwowego [2, 3, 31]. Potw ierdza to błyskawiczna degradacja znajdującego się w szczelinie synaptycznej ATP, w wyniku której powstają duże ilości adenozyny oraz inozyny i niewielkie ilości A M P i A D P [2,4,33]. Tak więc, ATP spełnia 4 z 5 warunków stawianych neurotransm iterom , mianowicie:1 — synteza i przechowanie przekaźnika odbyw a się

w zakończeniu nerwowym;2 — stym ulacja nerwów uwalnia neurotransm iter;3 — użyty egzogennie wyzwala odpowiedź postsyna-

ptyczną;4 — niehydrolizujące analogi tego związku wzmac

niają stymulację nerwową;5 — w zakończeniach nerwowych występują enzymy

powodujące modyfikację nauro transm iteraa tym samym przerwanie sygnału.

W przypadku A TP enzymem degradującym agonistę może być apiraza, k tóra z innym ektoenzym em — 5'- nukleotydazą, występuje w dużych ilościach w błonach synaptycznych [2, 33, 34], Apiraza hydrolizując oba wiązania pirofosforanowe substratu produkuje A M P oraz ortofosforan. Ponieważ A M P wykazuje niewielkie powinowactwo wobec purynoreceptorów P 2, recep to r zostaje uwolniony, a stym ulacja efektora przerw ana (Ryc. 2) [2, 31, 33, 34]. W skazuje to, że w procesie neurotransm isji apirazy grają podobną rolę jak acetylocholinesterazy. Nie biorą w nim udziału ATPazy, ponieważ podstawowym i produktam i reakcji z ich udziałem jest A D P i ortofosforan [35], a A D P ma również wysokie powinowactwo wobec receptora P 2[2]. O udziale apirazy w przekazywaniu sygnałów świadczą również niektóre dane kinetyczne. Dane te wskazują, że analogi ATP ham ują większość dotychczas opisanych apiraz zwierzęcych i roślinnych [2, 10, 11, 26], podobnie jak silny lek psychotropow y trifluprom azyna [17, 27], P onad to K sh apiraz izolowanych z tkanki nerwowej jest większa od 1, podczas gdy K sh enzymów z aorty uczestniczących w metabolizm ie A D P zbliżona jest do jedności [12].

VI. Ektoapirazy a purynoreceptory

W yniki niektórych badań sugerują, że ektoapiraza m em branow a jest purynoreceptorem typu P 2. K om órki i narządy zawierające receptory P 2 wykazują również wysoką aktywność dwufosfohydrolazy ATP [2, 33, 34, 12]. Receptor P 2 i apiraza wykazują niewielką specyficzność względem nukleotydów, jed nak apiraza nie hydrolizuje, a receptor P 2 nie wiąże A M P [2, 3]. Suram ina, antagonista receptora P 2 silnie ham uje apirazę [36]. Najnow sze badania nad ekto- apirazą w ątroby wykazały, że jest ona fosforylowana przez kinazę tyrozynow ą insuliny [3, 37, 38]. Analiza

176 POSTĘPY BIOCHEM II 4 0 (3 ), 1994http://rcin.org.pl

struktury tego enzymu wskazuje, że ma ona dom enę (Lys-Arg-X-...-X-Ser) fosforylowaną przez zależną od c-AM P kinazę białkową. Enzym zawiera również fragment sekwencji o strukturze podobnej jak białka fosforylowane przez kinazę tyrozynow ą [18, 39], D omena ta znajduje się wewnątrz kom órki, podczas gdy centrum aktywne enzymu po zewnętrznej stronie jej błony. Powyższe dane pozw alają sądzić, że apirazy uczestniczą nie tylko w degradacji związanych z receptorem A TP i ADP, lecz również w przetw arzaniu lub m odulow aniu sygnałów na purynoreceptorach P 2.

VII. Udział apirazy w regulacji aktywności 5-nukleotydazy, cyklazy adenylowej i recyklizacji nukleotydów

O prócz apirazy w przestrzeni synaptycznej występują duże ilości 5 '-nukleotydazy [2 ,33], której aktywność jest ham ow ana przez A D P i A TP i aktyw ow ana przez A M P (Ryc. 2) [40]. Apiraza zm ieniając stosunek (ATP + A D P)/A M P reguluje działanie tego enzymu. W ynikiem dwóch kolejnych reakcji z udziałem obu enzymów (reakcja 2a, b i 3) jest adenozyna. Adenozyna, w przeciwieństwie do A M P, przenika przez błony kom órkowe, a następnie ulega fosforylacji uzupełniając pulę nukleotydów w kom órce (Ryc. 2) [2]

A P l

ATP + 2 H 20 > A M P + 2P,

A O P + H 20 A M P + P,

5'NA M P + H 20 -------► adenozyna -I- P¡

d A M I N

A d en o zy n a * inozyna + NH

(la)

(lb)

(2)

(3)

Fakt, że m etyloksantyna blokuje receptory P j i ham uje aktywność cyklazy adenylowej, sugeruje, że receptor P t związany jest z cyklazą [2,41], A denozyna stym uluje cyklazę, powodując wzrost zawartości cA M P w k o m órkach [6] i z udziałem dezam inazy ulega dalszej przem ianie do inozyny (reakcja 3) [2, 42], Być może, podczas uwolnienia receptora P j dezam inaza pełni taką sam ą funkcję jak apiraza w przypadku recepto ra P 2.

O m ówione w tym rozdziale badania wskazują na możliwość kooperacji apirazy i 5 '-nukleotydazy. W yjaśn ia to dlaczego w przestrzeni synaptycznej znajdujemy dużo adeniny oraz inozynę, a nie A D P lub AM P. W spółdziałanie obu enzymów uw alnia receptor od agonisty oraz indukuje syntezę cA M P (Ryc. 2, 3) [5 ,4 1 ].

EDRF

recep tor P.kom órek endotelium

w zrost ciśnienia krw i

L -ATP — ¡r - » AP =

receptor komórek mięśni g ładkich inhibicja

■ ADP=

AMP

5-1

agregacja p ły te k krw i•AD

resorbcja przez kom órki odnowienie puli ATP

P ,- receptor

ICA

ATP- T •cAMP

re laksacja . J dezagregacja

Ryc. 3. U d z ia ł e k to a p ira z w regulacji ak ty w n o śc i n ie k tó ry c h e n zym ów i p rocesów zach o d zący ch w uk ład z ie k rw io n o śn y m . A P — ap iraza ; 5M 5' — n u k leo ty d aza ; C A — cy k laza ad en y lo w a E D R F N O — tlenek az o tu — „en d o te lia ln y czynn ik re lak su jący ”.

VIII. Rola ektoapiraz w układzie krwionośnym

VIII-1. Udział w procesach agregacji płytek

Ryc. 2. P rz em ian y n u k leo ty d ó w w p rzestrzen i synap ty czn e j p o d czas tran sm isji sygnału nerw o w eg o z udzia łem A T P. A P— ap iraza ; 5M — 5 '-n u k leo ty d aza ; Ad — ad en o zy n a ; DA— d ezam in aza adenozyny ; In — inozyna; L O V A T P— eg zo cy ta rn e pęcherzyk i w ype łn io n e A T P.

Proces agregacji płytek może przebiegać trzem a różnymi szlakami: z udziałem trom biny, kolagenu, lub poprzez wzrost poziom u A D P [5]. W przestrzeni okołokom órkow ej nieuszkodzonych tkanek stężenie A D P < 10 7M, a podczas ich uszkodzenia gw ałtow nie rośnie wywołując agregację płytek [5, 43], P o d o b ne zjawisko pow odują niektóre substancje regulujące metabolizm układu krwionośnego [2,44], Dwie obserwacje sugerują, że apiraza uczestniczy w ham ow aniu

S Y N A P S A

RESYN.A TP

RECEPTOR

M IĘ Ś N IA G Ł A D K IE G O

POSTĘPY BIOCHEMII 4 0 (3 ) , 1994 177http://rcin.org.pl

zależnej od A D P agregacji płytek. Po pierwsze, na powierzchni kom órek nabłonka i mięśni gładkich naczyń krw ionośnych ssaków występują duże ilości ektoapirazy [12], a po drugie, występują tam wcześniej om ówione purynoreceptory [3, 5]. Ślina wielu gatun ków pluskwiaków i pajęczaków odżywiających się krwią, zawiera apirazę jako czynnik antyhem ostatycz- ny [43]. W doświadczeniach in vitro wykazano też, że hydroliza A D P przez apirazę izolow aną z naczyń krw ionośnych wołu i śliny owadów zapobiega agregowaniu płytek [13, 16, 43, 44]. Naszym zdaniem, antyhem ostatyczna rola om awianego enzymu polega nie tylko na obniżaniu ilości A D P w układzie. Równie istotna jest aktyw acja (przez powstający AM P) 5'nukleotydazy i wzrost stężenia adenozyny, k tó ra wiążąc się z receptoram i P i stymuluje cyklazą adenylow ą (Ryc.3). W wyniku tych przem ian w kom órkach endotelium powstaje cA M P, które również zapobiega agregacji płytek [5]. Reasumując, apirazy ham ują agregację płytek— bezpośrednio, przez obniżenie stężenia A D P

w układzie oraz— pośrednio, przez wzrost stężenia AM P.

VIII-2. Udział w procesach regulacji ciśnienia krwi

E ktoapirazy biorą również udział w regulacji ciśnienia krwi. Związanie A TP z receptoram i P 2 kom órek endotelium układu krw ionośnego uwalnia czynnik0 nazwie „endothelium derived relaxing fa c to r ’ (ED RF) (Ryc. 2). Czynnik ten łatwo przenika przez błony kom órkow e i powoduje relaksację mięśni gładkich naczyń obniżając ciśnienia krwi [30, 43], Badania ostatnich lat wskazują, że w tkankach ssaków rolę E D R F gra powstający w wyniku przem ian argininy tlenek azotu (NO) [5]. W nika on łatwo do kom órki1 aktywując cyklazę guanylową pow oduje wzrost stężenia cG M P, k tóry niezależnie od cA M P ham uje agregację płytek [5]. Apirazy, tak jak w poprzednich przypadkach hydrolizują agonistę uwalniając receptor i A M P [30, 43].

Inny efekt wywołuje transm isja bodźca nerwowego do kom órek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Związanie A TP z receptorem P 2 płytki nerwowo- mięśniowej powoduje depolaryzację błony, co wyzwala skurcz mięśni gładkich i wzrost ciśnienia krwi (Ryc. 3). Zw iązana z powierzchnią kom órek apiraza degraduje ATP, uwalnia receptor i A M P. Powstająca, w wyniku kooperacji z 5 '-nukleotydazą, adenozyna stymuluje cAM Pazę. Rośnie poziom cA M P, który włącza m echanizmy obniżające ciśnienie krwi [2, 5, 30, 33, 45]. Stw ierdzono również, ża analogi A TP pow odują wzrost ilości A TP w erytrocytach i nie ham ują aktywności kinazy nukleotydowej [46]. N iektóre z tych analogów są inhibitoram i apiraz [26], w związku z tym prawdziwym wydaje się stwierdzenie, że apirazy uczestniczą w regulacji poziomu ATP w komórce.

Reasumując, wysoka wartość ilorazu A TP + + A D P /A M P wskazuje, że uruchom ione są procesy stymulacji efektorów w układzie nerwowym i krw ionośnym. W ynikiem tego jest skurcz naczyń, wzrost ciśnienia krwi i agregacja płytek. W zrost stężenia A M P obniża wartość tego ilorazu i powoduje rozszerzenie naczyń i obniżenie ciśnienia krwi lub zapobiega agra- gacji płytek.

IX. Regulacja przepuszczalności błon i transport substancji wysokocząsteczkowych

M ilimolowe stężenia ATP, G D P lub G T P stym ulują wnikanie niektórych białek do kom órek lub frakcji jądrow ej (działania tego nie ma G M P) [47-51]. Białka i inne substancje o masie cząsteczkowej od 1 do 150 kD a dostają się do kom órek mysich fibroblastów w obecności 200/iM A TP [49,50]. W ielkość cząsteczek nie wpływa na szybkość ich przenikania przez błony, zależy ona od tem peratury i aktywujących apirazę jonów wapnia [49, 50]. K om órki wysepek Fangerhan- sa, które charakteryzują się odpornością na wnikanie do ich wnętrza dużych cząsteczek, zawierają duże ilości ektoapirazy. Pom im o tego znakow ane izotiocjania- nem przeciwciała dostają się do cytoplazm y tych kom órek w obecności nie ulegającego hydrolizie an alogu A TP (A M P-PN P) [50]. Przenikanie przez błony jest stym ulowane przez inhibitory apiraz tj. 5'-p(fluo- rosulfonylo)benzyloadenozyna (FSBA), k tó ra blokuje miejsca wiązania ATP w cząsteczkach fosfohydrolaz i EDTA, który wiąże jony dwuwartościowe. W obu przypadkach aktywność apiraz ulega zaham owaniu, a pozakom órkow y poziom A TP nie ulega zmianie. Powyższe fakty skojarzone z obecnością dużych ilości apirazy na powierzchni kom órek Fangerhansa sugerują, że A TP indukuje tworzenie się porów w strukturze plazmalemy, a ektoapiraza hydrolizując A TP zapobiega tym zmianom. Również R a i k h e 1 [48] w pracy przeglądowej o transporcie białek do jąd ra kom órkowego sugeruje, że apiraza związana z błoną jądrow ą uczestniczy w transporcie do jąd ra histonów, nukleo- plazm iny i polilizyny. Proces ten odbywający się z udziałem jednostek N FS (nuclear localisation signal) jest stym ulow any przez G T P i G D P oraz A T PyS, podczas gdy G M P nie wpływa na szybkość wnikania tych białek do jąder [42, 46].

X. Metaboliczna rola endoapiraz

Funkcja endoapirazy jest mniej poznana niż enzymów związanych z zewnętrzną powierzchnią błony kom órkowej. Jedną z podstawowych i najczęściej pow tarzających się hipotez jest sugestia, iż apirazy biorą udział w reakcjach syntezy skrobi, syntezie ścian kom órkow ych i glikoproteidów. W procesach tych oprócz podstawowego p roduktu pow stają duże ilości difosfonukleotydów (reakcja 5). Apiraza degradując je (reakcja 6) umożliwia stałą szybkość syntezy wielo-


cukrów [52-54]:

enzymX D P-A 2 + A t — A r A2 + X D P (5)

X D P + H 20 X M P + P, (6)

Dotychczas brakuje bezpośrednich danych wskazujących na udział apirazy w wymienionych procesach. Wiemy jednak, że synteza skrobi, ścian kom órkow ych i procesy glikozylacji białek zachodzą w aparacie Golgiego, i w retikulum endoplazm atycznym . O becność apirazy w błonach obu tych struk tu r subkom ór- kowych stwierdzono np. w gruczołach mlecznych szczura i kiełkach pszenicy [14, 17]. C entrum katalityczne enzymu z pszenicy znajduje się we wnętrzu pęcherzyków i kanalików tych struk tu r [17]. T aka lokalizacja endoapiraz sugeruje ich udział w procesach glikozylacji i syntezie ścian kom órkow ych.

X -l. Udział apiraz w procesach syntezy skrobi

F a n t a i w s p. [54] wykazali, że podczas 140 dni rozwoju bulw ziem niaka ilość skrobi i apirazy rośnie. Zgodnie z reakcją 4 wzrostowi ilości skrobi powinien towarzyszyć wzrost stężenia A D P jednak przeczą temu wyniki doświadczeń. Trzy fakty: śladowa aktywność kinazy adenylowej, obniżenie ilości A D P oraz wzrost aktywności apirazy sugerują, że podczas dojrzewania bulw apiraza może, podobnie jak ektoenzym z naczyń krwionośnych, regulować poziom ADP.

X-2. Apirazy regulują poziom P; w komórkach

Degradacja i synteza cukrów są podobne jak wiele innych procesów metabolicznych komórek roślinnych kontrolowane przez ortofosforan [51,52]. Nagły spadektem peratury otoczenia ( — 5 -------9°C) powoduje wzroststężenia cukrów prostych w kom órkach bulw ziemnika. M echanizm obrony polega na uruchomieniu zgrom adzonych w postaci skrobi zapasów m onocukrów [52, 54]. Fosforoliza skrobi (reakcja 7) wymaga zwiększenia ilości ortofosforanu w kom órkach bulw [54].

fosforylazaP j + sk ro b ia -g lu k o za j------------* G lukozo-1-P +

-I- Skrobia (7)

Poniew aż zaw artość Pj w glebie nie wpływa bezpośrednio na stężenie tego jo n u w kom órkach, gwałtowny wzrost zapotrzebow ania na ortofosforan, tow arzyszący hydrolizie skrobi, musi być pokryty ze źródeł znajdujących się w kom órce [57]. Apiraza może dostarczyć Pj do tego procesu hydrolizując ATP. M ożliwość udziału apirazy w regulacji poziom u Pj potw ierdzają wyniki naszych najnowszych badań. Badaliśm y wpływ stresu niskotem peraturow ego na ak tywność apirazy i na zm iany ilościowe niektórych m etabolitów i jonów w bulw ach ziem niaka [praca

przygotow ana do druku]. Badania te wykazały, że w niskich tem peraturach (7-9°C) aktywność apirazy w bulwach wzrasta 2.5 raza, podczas gdy aktywność fosfatazy g lukozo-1-fosforanu nie zmienia się, a aktyw ność 5'-nukleotydazy wyraźnie maleje. Towarzyszy tem u wzrost ilości wolnego ortofosforanu i cukrów redukujących. W prowadzenie, w tych samych w arunkach, do bulw T F P-inhib itora apirazy [17, 27] pow odow ała 25% obniżenie jej aktywności. Równocześnie m alało stężenie cukrów i fosforu. Wyniki te potw ierdzają wcześniejszą sugestię, że apirazy regulują poziom ortofosforanu w kom órkach bulw ziemniaka.

XI. Uwagi końcowe

M imo wyraźnego postępu badań nie wyjaśniono do tąd jednoznacznie roli fizjologicznej endoapiraz. Przedstaw ione wyniki pozwalają jednak na sform ułowanie następującej hipotezy: „Apirazy (ekto i endo) hydrolizując oba wiązania pirofosforanowe w nukleo- tydach uczestniczą w mechanizm ach regulujących poziom nukleotydów i ortofosforanu w kom órkach”. Szczególna rola apirazy polega na zmianie w kom órce i przestrzeni okołokom órkow ej równowagi opisanej następującym równaniem [A T P + A D P ]/[A M P + + (adenozyna) + P J. Przesunięcie równowagi w lewą lub praw ą stronę reguluje aktywność różnych, często przeciwstawnych procesów fizjologicznych. Powyższą hipotezę potw ierdzają następujące fakty. Przede wszystkim A TP i A D P stym ulują receptory układu nerwowego oraz ham ują aktywność 5'-nukleotydazy, a A D P aktywuje agregację płytek [2-5,40]. Przeciwnie A M P stym ulując 5 '-nukleotydazę i pośrednio cyklazę adenylow ą powoduje wzrost cA M P, który jest silnym inhibitorem agregacji oraz obniża ciśnienie krwi [5, 44], a pow stająca z udziałem 5'-nukleotydazy adenozyna jest silnym inhibitorem procesów pre- i post- synaptycznych [4], N ukleotydy, z kolei, posiadające w iązania wysokoenergetyczne po związaniu z purynoreceptorem P 2 mięśni gładkich naczyń krw ionośnych wywołują wzrost ciśnienia krwi [30]. O ba nukleotydy aktyw ują tworzenie porów w błonach i transport białek do jąd ra kom órkow ego [48, 51], podczas gdy A M P nie zmienia przepuszczalności błon i nie wpływa na szybkość transportu białek do jąd ra [48].

Powyższą hipotezę potw ierdza również obecność na powierzchni kom órek receptorów dwóch typów, o zdecydowanie różnym powinowactwie do nukleotydów zawierających wiązania pirofosforanowe oraz A M P i adenozyny [2-4]. Uwolnienie receptora wym aga przekształcenia A TP (i ADP) w A M P i taki jest mechanizm hydrolizy ATP z udziałem apiraz. P o wstający A M P charakteryzuje się niskim poziom em energii swobodnej wiązań (brak wiązań pirofosforano- wych) i znacznie mniejszym (ujemnym) ładunkiem . U łatw ia to dysocjację A M P z receptorów P 2 i wiązanie z receptoram i P x. Sądzimy więc, że receptory P 2 powinny charakteryzow ać się wyraźnym ładunkiem


dodatnim , podczas gdy P t wysoką hydrofobością. W sytuacjach stresowych A TP i inne nukleotydy trójfosforanowe m ogą z udziałem apirazy dostarczać ortofosforanu do tych miejsc, w których zapo trzebowanie na ten jon gwałtownie rośnie. Taki mechanizm jest bardzo ważny, ponieważ w fizjologicznych w arunkach poziom ortofosforanu w kom órce jest stały, a jego w ahania pow odują zm iany w aktywności niektórych enzymów [56, 58]. Rozstrzygnięcia wymaga rola an alogów kalm oduliny w procesach regulacji apiraz. N iektóre apirazy roślinne są silnie ham ow ane przez trifluprom azynę [17, 27] i związki o zbliżonej strukturze, które są silnymi neuroleptykam i używanymi w leczeniu chorób układu nerwowego [59], Związki te m ożna by wykorzystać do blokow ania receptorów ATP, w miejsce mniej specyficznej suraminy. N iezbędne wydają się badan ia nad zróżnicowaniem m olekularnym apiraz. Dalsze badania nad lokalizacją powinny dać odpowiedź na pytanie: Czy istnieją roślinne ektoapirazy? oraz opisać immunologiczne i struk turalne pow inowactw o błonow ych i rozpuszczalnych form tych enzymów.

A rtyku ł otrzymano 23 marca 1994 r.Zaakceptowano do druku 16 maja 1994 r.

Piśmiennictwo

1. M e y e r h o f O (1945) J B io l Chem 157: 105-1192. B u r n s t o c k G (1979) W: B aer H P , D ru m m o u n d G I (red)

Physio log ical an d reg u la to ry functions o f adenosine an d ad en in e nucleo tides . R aven P ress, N ew Y ork , s tr 3-32

3. E l - M o a t a s s i m C h , D o r n a n d J, M a n i J - C (1992) Biochim B iophys A c ta 1134: 31-45

4. E d w a r d s F A , G i b b A J (1993) F E B S L e tt 325: 86-895. A a r o n J, S a f i e r L B (1993) F A S E B J 7: 516-5226. S c h i m i z u H (1979) W: B aer H P , D ru m m o u n d G I (red)

P h y sio lo g ic a la n d re g u la to ry fu nctions o f ad en o s in e a n d ad e n in e nucleo tides . R aven P ress, N ew Y ork, s tr 243-248

7. P e d e r s e n P L , C a r a f o l i E (1987) Trends B iochem Sci 12: 146-150

8. K o m o s z y ń s k i M A , S k a l s k a E (1990) A c ta B iochim Polon 37: 405-416

9. V a l e n z u e l a M A , L o p e z J, D e p i x M, M a n c i l l a A M , K e t t l u n L, C a t a l a n L, C h i o n g M, G a r r i d o J, T r a v e r s o - C o r i A (1989) C om p B iochem P hysio l 93 B: 911-919

10. K n o w l e s A F , I s l e r R E , R e e c e J F (1983) Biochim B iophys A c ta 731: 88-96

11. M o o d i e F D L, B a u m H, B u t t e r w o r t h P J , P e t e r s T J (1991) Eur J B iochem 202: 1209-1215

12. Y a g i K, S h i n b o M, H a s h i z u m e M, S h i m b a L S , K u r i m u r a S, M i u r a Y (1991) Biochem B iophys Res Com m un 180: 1200-1206

13. C o t e Y P , F i l e p J G , B a t t i s t i n i B, G a u v r e a u J, S i r o i s P, B e a u d o i n A R (1992) Biochim B iophys A c ta 1139: 133-142

14. M a r t i n e z F, M o n c a d a R. B a r c e n a s F J , E s p i n o - s a - G a r c i a T (1992) P lacenta 13 :463-473

15. V a r a F, S e r r a n o R (1991) Biochem J 197: 637-64316. R i b e i r o J M C , E n d r i s T M , E n d r i s R (1991) Com p

B iochem P hysio l 100A: 109-11217. K o m o s z y ń s k i M (1993) P hytochem istry 34: 941-94818. L i n S - H (1990) A nn N Y A ca d Sci 603: 394-40019. H a m l y n J M, S e n i o r A E (1983) Biochem J 214: 59-6820. S a r k i s J J F , G u i m a r a e s J A, R i b e i r o J M C (1986)

Biochem J 233: 885-891

21. G u r a n o w s k i A, S t a r z y ń s k a E, R a t a j - G u r a n o w - s k a M , S i l l e r o M A G (1991) P rotein E xpression P urification 2: 235-239

22. C h e u n g P H , D o w d F J , P o r t e r J E , L i L - S ( l 992) Cell Signal 4: 25-35

23. L e B e l D, P o i r i e r G G , P h a n e u f S, S t - J e a n P, L a l i b e r t e J F , B e a u d o i n A R (1980) J B iol C hem 255: 1227-1233

24. T o g n o l i L, M a r r e E (1981) B iochim B iophys A cta 642: 1-14

25. P i c h e r M, C o t e Y P , B e l i v e a u R, P o t i e r M, B e a u d o i n A R (1993) J B io l Chem 268: 4699-4703

26. K o m o s z y ń s k i M A (1991) A cta B iochim Polon 38: 157-16327. M a n c i l l a M, V a l e n z u e l a M A, A n i c h M, K e t t l u n

A M , J a r a O, T r a v e r s o - C o r i A (1987 ) P h ytochem istry 26: 2471-2474

28. H e r l i h y J T (1979) W: B aer H P , D ru m m o u n d G I (red) P hysio logical an d reg u la to ry functions o f a d en o sin e an d aden in e nucleo tides. R aven P ress, N ew Y ork , s tr 95-105

29. R y a n J, R y a n W (1984) U S In t R ev E xp P a tho l 26: \ -4330. C o t e Y P , P i c h e r M, S t - J e a n P, B e l i v e a u R, P o

t i e r M, B e a u d o i n A R (1991) Biochim B iophys A c ta 1078: 187-191

31. E d w a r d s F A , G i b b A J , C o l q u h o u n D (1992) N a tu re (L ond) 359: 144-147

32. E v a n s RJ , D e r k a c h V, S u p r e n a n t A (1992) N a tu re (L ond) 357: 503-505

33. M a n e r y J F , D r y d e n E E (1979) W: B aer H P , D ru m m o u n d G I (red) Physio log ical an d regu la to ry functions o f ad en o sin e and aden ine nucleotides. R aven P ress, N ew Y ork , s tr 323-339

34. S a r k i s J J F , S a l t o C (1991) Brain R es B ulletin 26: 871 -87635. S t r o t m a n n H, B i c k e l - S a n d k ö t t e r S (1984) A n n Rev

P lant P hysio l 35: 97-12036. B a r r e t J - M , E r n o u l d A - P , R o u i l l o n M - H , F e r r y

G, G e n t o n A, B o u t i n J A (1993) C hem — B iol In teractions 86: 17-27

37. L i n S H , G u i d o t t i G (1989) J B iol C hem 264: 14408-1441438. M a r g o l i s R N , S c h e l l M J , T a y l o r SI , H u n n a r d

A L (1990) Biochem B iophys R es Com m un 166: 562-56639. N a j j a r S M , A c c i l i D, P h i l i p p e N, J e r n b e r g J,

M a r g o l i s R, T a y l o r S I (1993) J B iol C hem 268: 1201-120640. D o r n a n d J, B o n n a f o u s J - C , M a n i J - C (1978) Eur

J B iochem 87: 459-46541. K u k o v e t z W R , W u r m A, H o l z m a n n S, P ö c h G ,

R i n n e r 1 (1979) W: B aer H P , D ru m m o u n d G I (red) P h y sio lo gical an d reg u la to ry fu n c tio n s o f ad e n o s in e a n d a d en in e n u c leotides. R aven Press, N ew Y ork , s tr 206-213

42. M a r c u s A J, S a f i e r L B , H a j j a r K A, U l l m a n H L , I s l a m N, B r o e k m a n M J , E i r o a A M (1991) J Clin Invest 88: 1690-1696

43. L a w J H, R i b e i r o J M C , W e l l s M A (1992) A nnu R ev Biochem 61: 87-111

44. B u r n s t o c k G (1981) P u rin e rg ic recep to rs . R ecep to rs an d reg u la tio n , t 12B. C h a p m a n an d H all, L o n d o n

45. R u b i o R, B e l a r d i n e l l i L, T h o m p s o n C l , B e r n e R M (1979) W: B aer H P , D ru m m o u n d G I (red) P h ysio log ica l an d re g u la to ry fu n c tio n s o f ad en o s in e a n d ad e n in e nucleo tides. R aven P ress, N ew Y ork , s tr 167-182

46. S m o l e ń s k i R T , M o n t e r o C, D u l e y J A , S i m m o n d s H A (1991) Biochem Pharm acol 42: 1767-1773

47. R i e d e l N, B a c h m a n n M, P r o c h i n o w D, R i c h t e r H - P , F a s o I d H (1987) Proc N a tl A ca d Sci U SA 84: 3540-3544

48. R a i k h e l N (1992) P lant P hysio l 100: 1627-163249. S a r i b a s AS , L u s t i g K D , Z h a n g X, W e i s m a n G A

(1993) A na l B iochem 209: 45-5250. G i r o l o m o n i G, S a n t a n t o n i o M L , P a s t o r e S, B e -

r g s t r e s s e r P R , G i a n n e t t i A, C r u z J r P D (1993)J Invest D erm atol 100: 282-287

51. S i l v e r P A (1991) C ell 64: 489-49752. P r e i s s J (1982) Ann R ev P lant P hysio l 33: 431-45453. S a d l e r E, B e y e r T A, O p p e n h e i m e r C L , P a u l s o n

J C , P r i e e l s J - P , R e a r i c k J I, H i l l R L (1982) M eth o d s E n zym ol 83: 458-514

54. F a n t a N, A n i c h M, M a n c i l l a M, K e t t l u n A M , V a l e n z u e l a M A, T r a v e r s o - C o r i A (1988) A rch B iol M ed E x p 21: 129-133

180 POSTĘPY BIO CHEM II 4 0 (3 ), 1994http://rcin.org.pl

55. L i X - N , A s h i h a r a H (1990) P h yto ch em istry 29: 497-50056. I g l e s i a s A A , P l a x t o n W C , P o d e s t a F E (1993)

P hytosyn thes is R es 35: 205-211

57. L e e R B , R a t c l i f f e R G (1993) J E x p B ot an v 44: 587-59858. S m y t h D A , B l a c k C C (1984) Plant P hysio l 75: 862-86459. S u p n i e w s k i J (1966) W: F a rm a k o lo g ia , P Z W L , W arszaw a

Ekdysteroidy owadzie — biosynteza, metabolizm i funkcja

Ecdysteroids in insects: biosynthesis, metabolism and function

KRYSTYNA GRZELAK*

Spis treści:

I. WstępII. Ekdysteroidy aktywne pod względem biologicznymIII. Biosynteza

III-l. Szlaki biosyntezy ekdysteroidów III-2. Enzymy biosyntezy ekdysteroidówIII-3. Regulacje biosyntezy ekdysteroidów

III-3.1. PTTHIII-3.2. Regulacje poprzez sprzężenie zwrotneIII-3.3. Hormon juwenilny (JH)II 1-3.4. Czynnik pochodzący z ciała tłuszczowe

go i uwalniany do hemolimfyIII-3.5. Rola kontroli nerwowej w regulacji funk

cji PG II 1-3.6. Zegar biologiczny

IV. MetabolizmIV-1. Główne szlaki metabolizmu ekdysteroidówIV-2. Enzymy włączone w metabolizm ekdysteroidówIV-3. Regulacje metabolizmu ekdysteroidów

V. Miano ekdysteroidów w rozwoju owadaVI. TransportVII. Rola ekdysteroidów w rozwoju osobniczym

Contents:

I. IntroductionII. Biologically active ecdysteroidIII. Biosynthesis

III-l. Pathways of ecdysteroid biosynthesisIII-2. Enzymes of ecdysteroid biosynthesis HI-3. Regulation of ecdysteroid biosynthesis

III-3.1. PTTHUl-3.2. Regulation by feedback mechanism III-3.3. Juvenile hormone 1II-3.4. Factor released from fat body to haemo-

lymphII 1-3.5. Role of neural control in regulation of

PG functionIII-3.6. Circadian clock

IV. MetabolismIV-1. Main pathways of ecdysteroid metabolismIV-2. Enzymes of ecdysteroid metabolismIV-3. Regulation of ecdysteroid metabolism

V. Titer of ecdysteroids during the development of insectVI. TransportVII. Role of ecdysteroids in development

Wykaz stosowanych skrótów: 20-HE — 20-hydroksyekdyzon, JH — horm on juwenilny, PTT H — horm on protorakotropow y, CC — corpora cardiaca, CA — corpora allata, PG — gruczoły pro torakalne, N A D P H — form a zredukow ana fosforanu dinukleotydu nikotynam ido-adeninow ego, N A D H — form a zredukow ana d inukleotydu nikotynam ido- adeninow ego, A T P — adenozyno-5'-trifosforan, m.cz. — m asa cząsteczkowa, kD a — kilodalton.

I. Wsięp

W roku 1954 Adolf B u t e n a n d t i Peter K a r 1 s - o n [1] wyizolowali ekdyzon z poczwarek jedw abnika Bom byx mori. W połowie lat 60-tych została ustalona s tru k tu ra tego horm onu. O kazało się, że jest to związek sterydowy o szkielecie węglowym cholesterolu. Od tego czasu wyizolowano wiele strukturalnych analo-

* Dr, Z akład Biochemii Porównawczej, Insty tu t Biochemii i Biofizyki PAN , Rakow iecka 36, 02-532 W arszawa

gów tego polihydroksysterydu dla których przyjęto ogólną nazwę „ekdysteroidy” [2]. Tylko kilka ekdysteroidów występujących u owadów wykazuje aktyw ność biologiczną (Ryc. 1), większość z nich to związki pośrednie biosyntezy ekdyzonu lub jego metabolity. Tak więc, term in ekdysteroidy jest chemicznym określeniem tych związków.

Ekdysteroidy są najpowszechniej występującymi horm onam i sterydowymi. Ich obecność wykazano zarów no u owadów, jak i u innych stawonogów (Arthropoda), oraz u niższych zwierząt, takich jak pierścienice (Annelida), nicienie (Nem atoda) czy mięczaki (M olusca) [3]. Ekdysteroidy występują również w roślinach [4]. Porów nując ekdyzon z horm onam i sterydow ymi kręgowców wykazano nie tylko ich struk tu ralne podobieństwo, lecz również hom ologię w biosyntezie, transporcie, m etaboliźm ie i mechanizmie działania. Jednakże u kręgowców występuje kilka klas horm onów sterydowych regulujących różne procesy fizjologiczne, natom iast u owadów tylko jedna — ekdysteroidy. O kreśla się je jako „horm ony linienia”.

POSTĘPY BIO C H EM II 4 0 (3 ) , 1994 181http://rcin.org.pl

OH

Ryc. 1. S tru k tu ry chem iczne e k d y s te ro id ó w ak ty w n y ch pod w zględem b io log icznym .

Jednak term in ten nie obejmuje wszystkich funkcji ekdysteroidów w rozwoju osobniczym. K ontrolują one nie tylko procesy związane z linieniem, lecz również morfogenezę i różnicowanie się tkanek oraz rozm nażanie się. Zdaniem K o o 1 m a n a [5] ekdysteroidy m ożna uważać za wielofunkcyjny system ho rm onalny wytyczający kierunek rozwoju owada.

II. Ekdysteroidy aktywne pod względem bilo- gicznym

Struktury chemiczne tych ekdysteroidów ilustruje rycina 1. N ajbardziej aktywną, funkcjonalną formą horm onu u większości gatunków owadów jest 20- hydroksyekdyzon (20-HE, ekdysteron) [6]. Jak dotąd, jest on jedynym ekdysteroidem , którego wiązanie się z receptorem zostało wykazane u owadów [5]. Ek- dyzono, znacznie niższej aktywności biologicznej niż 20-HE, jest nie tylko prekursorem (prohorm onem ) 20-HE, ale również horm onem [7]. 2-deoksyekdyzon i 26-hydroksyekdyzon są praw dopodobnie aktywnym i formami horm onu podczas oogenezy i w stadium em brionalnym niektórych gatunków owadów [6]. N atom iast m akisteron A (24-metylo-20-hydroksyekdyzon) jest funkcjonalnym horm onem u owadów należących głównie do Hemiptera i Hymenoptera [6].

III. Biosynteza

Głównym miejscem biosyntezy ekdysteroidów są gruczoły p ro torakalne (PG) [8]. G ruczoły te rozwijają się i stają się aktywne już pod koniec embriogenezy.

Funkcjonują w okresie larwalnym , a ich inwolucja, u większości owadów, rozpoczyna się po ostatniej lince larwalnej [5]. U dorosłych owadów funkcję PG przejm ują gonady [9, 10]. W ykazano, że ekdysteroidy syntetyzowane są de novo zarów no w jajn ikach dorosłych samic [9-12], jak i w gonadach męskich [13]. Wiele danych wskazuje, że ekdysteroidy syntetyzow ane są również w innych tkankach owada, mianowicie w epidermie czy oenocytach [14].

Badania nad biosyntezą ekdysteroidów prowadzi się w układach in vitro i in vivo w PG i jajnikach. D o badań używa się znakow anych substratów np. cholesterolu czy też przypuszczalnych związków pośrednich szlaku biosyntezy. Identyfikację powstających produktów reakcji prowadzi się takim i m etodam i jak: metody radioim m unologiczne (RIA), enzymoim m unologiczne (EIA), chrom atografia cienkow arstwowa (TLC), spektroskopia m asowa sprzężona z chrom atografią gazową (GC-M S) czy też w ysokospraw na chrom atografia cieczowa (HPLC) [15].

III-l. Szlaki biosyntezy ekdysteroidów

Postulow ane szlaki biosyntezy przedstawia rycina 2. Ekdysteroidy syntetyzowane są z cholesterolu [16] powszechnie występującego w świecie zwierzęcym. Owady, podobnie jak inne stawonogi (Arthropoda) nie są zdolne do syntezy cholesterolu de novo [17]; jest on dostarczany z pożywieniem. Nie stanowi to problem u dla owadów mięsożernych. N atom iast owady roślinożerne spożywają w pokarm ie fitosterole, analogi cholesterolu. Typowe roślinne sterole: sitosterol, stigmas- terol, kam pesterol posiadają dodatkow e grupy m etylowe i etylowe w łańcuchu bocznym cholesterolu w pozycji C-24. Większość owadów roślinożernych zdolna jest do przem iany fitosteroli w cholesterol poprzez ich dealkilację [12, 18, 19]. Jednak niektóre z nich, głównie Hemiptera i Hymenoptera, pozbawione są zdolności przekształcania fitosterolu w cholesterol [5, 12, 18]. U owadów tych zamiast ekdyzonu czy innego ekdysteroidu wykrywany jest m akisteron A:24-metylo-20-hydroksyekdyzon [6, 20] syntetyzowany bezpośrednio z fitosterolu. Przebieg biosyntezy m akisteronu A nie został dotychczas wyjaśniony. Przypuszczalnym prekursorem jest kam pesterol (Ryc. 2) [6, 12, 20],

Również przebieg biosyntezy ekdysteroidów z cholesterolu nie jest dokładnie poznany (Ryc. 2) [5 ,12,21]. N atom iast dobrze udokum entow ana jest przem iana cholesterolu w 7-dehydrocholesterol [5, 22, 23, 24], jednak następne reakcje szlaku biosyntezy prowadzące do pow stania 5 /Lketodiolu (2,22,25 trideoksyekdyzon) nie są znane. Przypuszcza się, że 3-okso, 4-en sterole m ogą być związkami pośrednim i w ciągu reakcji między 7-dehydrocholesterolem a 5 /Tketodiolem [12, 19]. N atom iast według powszechnie panującej opinii 5 /Lketodiol jest prekursorem ekdyzonu u wielu gatunków owadów [12,25]. Podlega on najpierw hydroksy-

182 POSTĘPY BIOCHEMII 40(3), 1994http://rcin.org.pl

POKARM FITOSTEROL

CHOLESTEROL CHOLESTEROL

22 - d e o ksy e kd yzo n 2 - d e o ks ye k d yz o n

3 ,6 - d io k s o - ś - e n s te ro l

„ 5 /3 -k e to d io l "2, 2 2 ,2 5 - t r id e o k s y e k d y z o n

22 , 2 5 -d id e o k s y e k d y z o n

ilii

2 , 22 - d id e o k s y e k d y z o n

HO

OH

3 - d e h y d ro e k d y z o n

( 3 -o k s o e k d y z o n )

E k d y z o n

2, 2 2 - d id e o k s y - 2 0 - h yd ro k s y e k d y z o n

20 - h y d ro k s y e k d y z o n

Ryc. 2. Szlaki b iosy n tezy e k d y s te ro id ó w w g 12, 25, zm odyfikow ane.

POSTĘPY BIO C H EM II 4 0 (3 ) , 1994 183http://rcin.org.pl

lacji w pozycji C-25, a następnie C-22, co prowadzi do pow stania 2-deoksyekdyzonu [12, 19, 26, 27]. Ten z kolei jest hydroksylowany w pozycji C-2, w wyniku czego powstaje ekdyzon [12, 27]. Zdaniem R e e s a[12] jest to główna droga przem iany 5 /Fketodiolu w ekdyzon u owadów. Przypuszcza się, że możliwa jest również odm ienna kolejność, mianowicie 5 /Fketodiol uległaby najpierw hydroksylacji w pozycji C-2 a następnie C-25 i C-22 [12, 25], Przekształcenie ekdyzonu w bardziej aktywny biologicznie 20-HE zachodzi w tkankach peryferyjnych owada [28]. Z badań O h n i s h i i w s p . [11] wynika, że w jajnikach dorosłych samic Bombyx mori 5 /Fketodiol jest prekursorem 20-HE, a nie ekdyzonu. W wyniku hydroksylacji 2,22-dideoksyekdyzonu, najpierw w pozycji C-20, a n astępnie C-22 i C-2 powstaje 20-HE. Podobnie jak u Bombyx mori, w jajn ikach Schistocerka gregaria [12] hydroksylacja 2-deoksyekdyzonu w pozycji C-20, a następnie C-2, prowadzi do pow stania 20-HE. W ja jnikach, w przeciwieństwie do gruczołów protorakalnych, w ykazano aktywność 20-m onooksygenazy ekdyzonowej, odpowiedzialnej za hydroksylację ekdyzonu do 20-H E [28, 29].

Z ostatnich badań zespołu G i l b e r t a [23, 24, 30, 31] wynika, że głównym, jeśli nie jedynym , ekdysteroidem wydzielonym przez PG Manduca sexta i innych Lepidoptera, jest nie ekdyzon, lecz 3-dehydroek- dyzon (3-oksoekdyzon), który dopiero w hemolimfie jest przekształcony w ekdyzon. W edług przypuszczeń G r i e n e i s e n a i w s p . [24] związkami pośrednim i między 7-dehydrocholesterolem , a 3-dehydroekdyzo- nem byłyby pochodne 3,6-diokso-4-en steroli (Ryc. 2). W yniki badań zespołu G i l b e r t a [23, 24, 30, 31] potw ierdzają więc istnienie w gruczołach protorakalnych owadów więcej niż jednego szlaku biosyntezy ekdysteroidów .

III-2. Enzymy biosyntezy ekdysteroidów

B adania nad enzymami włączonymi w cykl biosyntezy ekdysteroidów u owadów są mało zaawansowane. D otyczą one wyłącznie enzymów związanych z o sta tnimi etapam i szlaku biosyntezy charakteryzującym i się reakcjam i hydroksylacji.

C-22 i C-25 hydroksylazy katalizują procesy przekształcania 5 /Fketodiolu (2,22,25 trideoksyekdyzonu) do 2-deoksyekdyzonu. Są one typowymi m ono- oksygenazam i zależnymi od cytochrom u P-450, tlenu cząsteczkowego i N A D PH [25, 32]. C-22 hydroksylaza 2,22-dideoksyekdyzonowa jest zw iązana z mito- chondriam i, natom iast aktywność C-25 hydroksylazy 2,22,25 trideoksyekdyzonowej występuje zarów no we frakcji m itochondrialnej jak i m ikrosom alnej [27], W badaniach in vitro i in vivo wykazano, że znakow any 5 /Fketodiol może się przekształcać w ekdyzon nie tylko w gruczołach pro torakalnych i jajnikach, lecz również w ciele tłuszczowym, epidermie, cewkach M alpighiego, jelicie środkow ym [33, 34]. M oże to

wskazywać na inną jeszcze, poza biosyntezą ekdysteroidów rolę tych enzymów u owadów [9].

C-2 hydroksylaza związana jest z ostatnim etapem biosyntezy ekdyzonu, a jej substratem jest 2-deoksyekdyzon. C-2 hydroksylaza 2-deoksyekdyzonowa wykryw ana we frakcji m itochondrialnej została określona jako „nietypowa m onooksygenaza” [25, 35, 36]. W spółdziała ona z cytochrom em P-450, jest jednak prawie niezależna od N A D PH . Również w przeciwieństwie do typowych m onooksygenaz enzym ten nie jest wrażliwy na działanie CO. Aktywność tego enzymu m ożna wykryć również w innych niż PG i jajniki tkankach owada [35].

III-3. Regulacje biosyntezy ekdysteroidów

Badania koncentrow ały się na stadium larwalnym , a więc dotyczyły regulacji syntezy zachodzącej w PG. Powszechnie uważa się, że głównym jej regulatorem jest horm on pro torakotropow y (PTTH) [7, 37, 38]. Syntezę ekdysteroidów może również regulować p ro dukt według m echanizm u sprzężenia zw rotnego [5, 37, 39,40]. Funkcję PG regulują ponadto horm on juwenilny, czynnik tropow y uwalniany z ciała tłuszczowego, czynniki neurogenne, a także tzw. zegar biologiczny [37, 41].

Synteza ekdysteroidów zachodząca poza PG w ta kich tkankach, jak gonady [9-13] przebiega pod kontro lą właściwego dla danej tkanki horm onu tro p o wego [5]. N eurohorm ony te określa się jako ekdyzot- ropiny. Np. synteza ekdysteroidów w nabłonku foliku- larnym jajników stym ulow ana jest przez horm on zwany FCSH (ang.Jollicle celi stimulating hormone) [5] natom iast synteza w gonadach męskich — TE (ang. testis ecdysiotropin) [42].

III-3.1. PPTH

Synteza horm onu protorakotropow ego zachodzi w kom órkach lateralnych mózgu owadów [43]. H o rmon przejściowo grom adzi się w narządach neuro- hemalnych: corpora cardiaca (CC) czy corpora allata (CA) [44,45], a następnie uwalniany jest do hemolimfy w ściśle określonych przedziałach czasowych stym ulując gruczoły pro torakalne do syntezy i wydzielania ekdysteroidów [8].

U Lepidoptera występują co najmniej dwie różniące się wielkością formy neurohorm onu: tzw. duży PTTH o m.cz. od 22 do 29 kD i mały od 4 do 7 kD [8, 37, 38],

M echanizm działania PTTH na poziomie kom órkowym nie został jeszcze dokładnie poznany. W przedstawionym przez G i l b e r t a i ws p . modelu działania tego neuropeptydu na kom órki PG Manduca sexta [7] duży PTTH , wiążąc się z receptoram i zlokalizow anymi w błonach kom órkowych, urucham ia łańcuch reakcji, w którym drugim przekaźnikiem jest cAM P. Zasadniczą rolę w tym procesie odgrywa C a2 + . D ziałając poprzez kalm odulinę podwyższa on poziom

184 POSTĘPY BIOCHEMII 4 0 (3 ), 1994http://rcin.org.pl

w ewnątrzkom órkowego cAM P. Cykliczny nukleotyd aktywuje cA M P — zależną kinazę białkową, co p ro wadzi do fosforylacji białka o m.cz. 34 kD. Fosforylacja tego białka, identyfikowanego jako białko S 6 podjednostki 40 S rybosom u, może być sygnałem do syntezy specyficznych białek limitujących szybkość cyklu przemian w szlaku biosyntezy ekdysteroidów.

III-3.2. Regulacje poprzez sprzężenie zwrotne

Ekdysteroidy (ekdyzon i 20-HE) m ogą regulować swą własną syntezę działając bezpośrednio na gruczoły protorakalne lub drogą pośrednią wpływając na syntezę i wydzielanie PTTH [37, 39, 40]. Z badań S a k u r a i ’ a i W i l l i a m s a [39] wynika, że ekdyzon czy 20-HE stymuluje bądź ham uje gruczoły (dodatnie lub ujemne sprzężenie zwrotne) w zależności od stężenia ekdysteroidów w hemolimfie i od aktyw ności wydzielniczej PG. W końcowym okresie ostatniego stadium larwalnego zachodzi jedynie sprzężenie do d atnie [39]. Tak jak przedstawiono na rycinie 3 regulacje te zachodziłyby na kilku poziomach: syntezy PTTH , jego uwalniania z CC lub CA, lub na poziomie PG , tzn. w miejscu syntezy i wydzielania ekdysteroidów [5 ,40]. O statn io [40, 46] wykazano obecność jądrow ych receptorów ekdysteroidowych zarówno w kom órkach neurosekrecyjnych mózgu, jak i w CA, CC i PG — co potwierdziło wrażliwość tych tkanek na sygnał h o rm onalny. W ykazano również [46] obecność receptorów w ciele tłuszczowym, cewkach M alpighiego oraz w jelicie środkowym Manduca sexta , a więc w tk an kach w których zachodzi hydroksylacja ekdyzonu do 20-HE. B i d m o n i ws p . [46] sugerują, że 20-HE może regulować swoje m iano zależne od stadium rozwoju, poprzez długą lub k ró tką pętlę sprzężenia zwrotnego. D ługa pętla obejmuje miejsca syntezy i uw alniania PTTH , natom iast k ró tka — gruczoły protorakalne, ciało tłuszczowe, cewki M alpighiego oraz jelito (Ryc. 3).

III-3.3. Hormon juwenilny (JH)

JH w zależności od stadium rozwoju ham uje bądź stymuluje biosyntezę ekdysteroidów [47-50]. Np. p o danie horm onu larw om Lepidoptera w początkow ym okresie ostatniego stadium larwalnego opóźnia lub całkowicie ham uje metamorfozę, wskutek ham ow ania syntezy ekdysteroidów. JH działa albo bezpośrednio na P G lub też za pośrednictwem mózgu ham uje wydzielanie PT T H [37, 49, 50]. N atom iast u larw pochodzących z końcowego okresu ostatniego stadium larwalnego JH stymuluje syntezę ekdysteroidów, jednak mechanizm tej stymulacji nie jest jeszcze wyjaśniony [37]. Zdaniem G i l b e r t a [7] JH nie działa bezpośrednio na PG , lecz stymuluje uwalnianie z ciała tłuszczowego do hemolimfy czynnika tropowego, k tó ry pobudza gruczoły do wzmożonej syntezy ekdysteroidów.

Bodźce zewnętrzne np. fotoperiod

temperatura

w

Ryc. 3. R egulacja b iosyn tezy ek d y s te ro id ó w p o p rzez sprzężen ie zw ro tn e wg 5, 46, zm odyfikow ane.

III-3.4. Czynnik pochodzący z ciała tłuszczowego i uwalniany do hemolimfy

Został on wyizolowany z hemolimfy larw Manduca sexta i wstępnie scharakteryzowany. Jest białkiem o m.cz. około 30 kD wrażliwym na proteazy i term o- stabilnym [51]. W w arunkach in vitro stymuluje syntezę ekdysteroidów około 5-krotnie [51]. W ykazano, że odgrywa on znaczącą rolę podczas m etam orfozy owadów [37]. Postuluje się, że czynnik ten bierze udział w transporcie sterydów do PG co powoduje wzmożenie syntezy ekdysteroidów [51, 52].

POSTĘPY BIOCHEMII 4 0 (3 ), 1994 185http://rcin.org.pl

III-3.5. Rola kontroli nerwowej w regulacji funkcji PG

Gruczoły pro torakalne owadów wielu gatunków są dobrze unerwione, jednak rola kontroli nerwowej w regulacji biosyntezy ekdysteroidów jest ciągle niejasna [37]. Z badań R i c h t e r a i G e r s h a [53] wynika, że u Periplaneta americana istnieje korelacja między aktywnością zwoju nerwowego gruczołu a m ianem ekdysteroidów w hemolimfie. W ykazano również, że stymulacje elektroniczne nerwu dochodzącego do gruczołu m ogą pow odow ać wzrost wydzielania ekdyzonu [54]. O statn io M u s z y ń s k a - P y t e l i w s p. [55] wykazali, że aktyw ność syntetyczna gruczołów protorakalnych u diapauzujących larw Galleria mellonella ham ow ana jest przez mózg na drodze nerwowej.

Zdaniem W a t s o n a i ws p . [37], jeśli nawet gruczoły pro torakalne owadów podlegają kontroli nerwowej, to jej rola w regulacji biosyntezy ekdysteroidów jest mniej istotna niż rola kontroli humoralnej.

III-3.6. Zegar biologiczny

Jest to wewnętrzny mechanizm organizm u kierujący dobow ą rytm iką procesów fizjologicznych oraz zachow ania się zwierząt [41]. Szczególne miejsce zajm ują rytm y dobow e w rozwoju owadów. W ykazano, że uwalnianie PTTH , czy też synteza i wydzielanie ekdysteroidów odbywa się w sposób rytm iczny w tzw. rytmie okołodobow ym (ang. circadian). Z badań M i - z o g u c h i i I s h i z a k i [56], wynika, że zegar biologiczny wraz z jego fotoreceptoram i może być zlokalizow any nie tylko w mózgu ow ada (wydzielanie PTTH ), lecz również w gruczołach protorakalnych. W ykazali oni, że zegar biologiczny obecny w PG Sarnia cynhia ricini kontroluje syntezę i wydzielanie ekdysteroidów. Badania C y m b o r o w s k i e g o i ws p . [57, 58] potw ierdzają istnienie zegara biologicznego w P G innego ow ada Galleria mellonella oraz wskazują, że może być on jednym z czynników regulujących syntezę i wydzielanie ekdysteroidów u owadów. M olekularny m echanizm działania tego zegara nie jest jeszcze znany.

IV. Metabolizm

Ekdysteroidy m etabolizow ane są głównie w ciele tłuszczowym cewkach M alpighiego i jelicie środkowym [59]. M etabolity — aktywne biologicznie jak i nieaktyw ne produkty — są albo w ydalane albo kum ulow ane w organizm ie [60]. W ydalanie odbyw a się przez jelito i cewki M alpighiego [61], natom iast zapasowe m etabolity stanow ią źródło aktywnego ekdysteroidu [14, 61].

D o badań m etabolizm u ekdysteroidów (in vitro i in vivo) powszechnie używa się znakow anego ekdyzonu [60]. D o oznaczania aktywności m etabolitów służą

testy biologiczne [62], natom iast chemiczną ich identyfikację prowadzi się głównie m etodą spektroskopii masowej (MS) i jądrow ego rezonansu m agnetycznego (NM R) [15, 63],

IV-1. Główne szlaki metabolizmu ekdysteroidów

Ekdysteroidy, podobnie jak sterydy kręgowców, m etabolizow ane są wewnątrz kom órki [5]. Jedynym wyjątkiem jest przem iana 3-dehydroekdyzonu w ekdyzon zachodząca w hemolimfie owadów należących do Lepidoptera [7, 64].

O pisano wiele szlaków m etabolizm u ekdysteroidów, wykazując znaczne różnice w ich przebiegu w zależności od gatunku owada, stadium rozwoju i tkanki [60]. Reakcje, którym podlega cząsteczka ekdyzonu, przedstaw ia rycina 4.

H ydroksylacja w pozycji C-20 aktywuje cząsteczkę ekdyzonu. 20-HE jest aktyw ną formą horm onu co najmniej w stadium larwalnym [5, 60]. N atom iast w wyniku hydroksylacji ekdyzonu w pozycji C-26 powstaje 26-hydroksyekdyzon, który następnie albo utleniany jest do kwasu ekdyzonowego albo też ulega sprzężeniu z fosforanem. C-20 i C-26 hydroksylacje, jak również powstawanie kwasu ekdyzonowego zachodzą powszechnie w tkankach owadów [60, 65].

U tlenianie dotyczy grupy hydroksylowej znajdującej się w pozycji C-3 ekdyzonu lub innego ekdysteroidu. Ekdyzon utlenia się do 3-dehydroekdyzonu który z kolei może się albo redukow ać z pow rotem do ekdyzonu albo też do jego 3 a-epim eru [29, 60]. O dw racalne pow stawanie 3-dehydroekdysteroidów zachodzi w tkankach różnych grup owadów, n a to m iast 3-epimeryzację w ykazano jedynie w jelicie nielicznych ich gatunków [60, 66, 67].

Sprzężone ekdysteroidy pow stają w wyniku reakcji estryfikacji, zachodzącej najczęściej w pozycji C-22 a znacznie rzadziej w pozycjach C-2, C-3 i C-26 cząsteczki ekdysteroidu [5, 60]. C-22 i C-26 estry ekdysteroidów najczęściej z wyższymi kwasami tłuszczowymi czy fosforanem (donorem fosforanu jest najpraw dopodobniej ATP) m ogą się kum ulow ać w o rganizmie ow ada stanow iąc tzw. zapasowe m etabolity [5, 61, 65, 68]. Ich obecność w ykazano w jajnikach i jajach niektórych gatunków owadów [61]. Podczas embriogenezy estry te ulegają hydrolizie i uwalniają się aktyw ne ekdysteroidy [60, 61, 65, 69], C-2 i C-3 sprzężone ekdysteroidy wykazano zarów no w okresie późnej embriogenezy, jak i w rozwoju postem brionalnym owadów [65]. N ależą one praw dopodobnie do tej grupy m etabolitów , k tóre jako nieaktywne produkty katabolizm u są wydalane z organizm u owada [5, 65].

IV-2. Enzymy włączone w metabolizm ekdysteroidów

20-m onooksygenaza ekdyzonowa (oksydoredukta- za; ekdyzon, zredukow any N A D P: tlen, 20-/?-hydro-


Sprzęganie z:

fosforanem kwasami tłuszczowymi

Kw. octowym

Sprzęganie z fosforanem

Epimeryzacja Sprzęganie z:f o s f o r a n e m R yC 4 R eakcje k tó ry m p o d leg a cząs teczk a e k d y zo n u w g 5, 26, 59.k w . O C tO W y m R eakcje zach o d z ące pow szechnie w tk a n k a c h o w ad ó w u ję to w ram k ę .

ksylująca, EC 1.14.99.22). Enzym katalizuje przem ianę ekdyzonu w 20-hydroksyekdyzon. Reakcja zależy od cytochrom u P-450 i wymaga N A D PH jako koenzymu [27-29]. Aktywność tego enzymu zw iązana jest zarów no z frakcją m ikrosom alną jak i m itochondrialną [29].20-m onooksygenaza ekdyzonow a nie wykazuje specyficzności substratow ej. Wiele danych wskazuje, że ten sam enzym katalizuje C-20 hydroksylację również innych ekdysteroidów , np. 2-deoksyekdyzonu czy 26- hydroksyekdyzonu [7, 65]. Aktywność 20-m onoek- sygenazy wykazano w różnych tkankach owadzich, jak ciało tłuszczowe, cewki M alpighiego, jelito środkowe, epiderm a, jajniki [28, 29].

Enzym am i biorącym i udział w 3-epimeryzacji ekdysteroidów są: oksydaza ekdyzonow a i 3 a-reduktaza 3-oksoekdysteroidow a. O ksydaza ekdyzonow a (3-ok- sydoreduktaza; ekdyzon: tlen, EC 1.1.3.16) jest enzymem katalizującym przem ianę ekdyzonu i innych ekdysteroidów do 3-dehydroekdysteroidów [29, 59, 65]. Enzym ten, obecny w wielu różnych tkankach owadzich [65], jest białkiem rozpuszczalnym o m.cz. 240 kD [59]. U owadów w ykazano obecność dwóch typów 3-reduktaz: 3 a-reduktazy odpowiedzialnej za przem ianę 3-dehydroekdysteroidów (3-oksoekdyste- roidów) do odpowiednich 3-epiekdysteroidów oraz 3 /1-reduktazy katalizującej przem ianę 3-dehydroekdysteroidów z pow rotem do początkow ego ekdys-

teroidu [29]. Te rozpuszczalne enzymy działają w obecności zarów no N A D H , jak i N A D PH [29, 59, 65]. Aktywność 3 /1-reduktazy 3-oksoekdysteroidowej wykazano w wielu tkankach owadzich co tłumaczyłoby, dlaczego 3-dehydroekdysteroidy nie kum ulują się in vivo, nawet w obecności aktywnej oksydazy ekdyzonowej [65]. N atom iast 3 a-reduktaza 3-oksoekdysteroidow a występuje jedynie w jelicie środkowym nielicznych gatunków owadów [29, 66, 67]. Z badań W e i - r i c h a i w s p. [70] wynika, że 3-epimeryzacja ekdysteroidów zależy od połączonego działania oksydazy ekdyzonowej i 3 a-reduktazy. Reakcje te zachodzą wg schematu:

o2Ekdysteroid < ' > 3-Dehydroekdysteroid x,łrx n „ >J N A D ( P ) H J J N A D ( P ) H

3-Epiekdysteroid

D ane dotyczące enzymów włączonych w proces pow staw ania i hydrolizy sprzężonych ekdysteroidów są szczątkowe. O becność fosfotransferaz wykazano u kilku gatunków owadów [65]. Praw dopodobnie enzymem włączonym w powstawanie sprzężonych z fosforanem ekdysteroidów jest: fosfotransferaza ATP: ekdysteroidow a [29]. I s a a c i w s p . [71] otrzym ali p reparat enzymatyczny z em brionów Schis- tocerca gregaria hydrolizujący C-22 fosfoestry ekdysteroidów. Ta em brionalna fosfohydrolaza działa w pH poniżej 5 i jest zw iązana z frakcją m itochondrialno-


lizosomalną.Badania S a k u r a i ’ a i ws p . [31] wskazują, że

enzymem katalizującym przem ianę 3-dehydroekdyzonu do ekdyzonu w hemolimfie Manduca sexta jest reduktaza 3-ketoekdysteroidowa działająca w obecności N A D PH . O statn io w hemolimfie Ostrinia nubilalis wykazano wysoki poziom ketoreduktazy odpowiedzialnej za przem ianę 3-dehydroekdyzonu w ekdyzon[72]. Zapewne enzym z hemolimfy Manduca sexta i Ostrinia nubilalis jest 3 /Treduktazą 3-oksoekdys- teroidową, której aktywność w ykazano również w jelicie środkow ym Manduca sexta [25, 70].

IV-3. Regulacje metabolizmu ekdysteroidów

Stężenie krążącego w organizm ie horm onu, tzn. jego m iano, zależy nie tylko od procesów związanych z jego biosyntezą i wydzielaniem, ale również od m etabolizmu i wydalania. Już w 1969 r. K a r l s o n i B o d e[73] twierdzili, że inaktywacja horm onu może mieć znaczący wpływ na regulację jego miana. Potwierdziły to dalsze badania. U owadów należących do Díptera i Lepidoptera wykazano, że w czasie gdy m iano endogennego horm onu szybko wzrasta następuje znaczne obniżenie szybkości katabolizm u 20-HE, jak i przem iany ekdyzonu w 20-HE [74]. Przy czym spadek szybkości katabolizm u 20-HE (o około 90% u Caliphora vicina) jest znacznie większy niż spadek C-20 hydroksylacji [75]. T rudno jest odpowiedzieć na pytanie, w jakim stopniu obniżony m etabolizm wpływa na wzrost m iana 20-HE. Szacuje się, że gdyby nie było tak drastycznego obniżenia katabolizm u, m iano endogennego horm onu byłoby zredukow ane o połowę [76]. Dane te nie m ogą jednak odnosić się do wszystkich grup owadów. U Orthoptera zaobserw ow ano nie obniżenie lecz wzrost C-20 hydroksylacji zgodny ze wzrostem m iana 20-HE [77, 78]. Jednak i u tych owadów wykazano znaczne obniżenie szybkości wydalania produktów katabolizm u w czasie, gdy m iano horm onu było najwyższe [79].

L e h m a n i K o o l m a n [80] wysunęli hipotezę, że neuropeptydy biorą udział w regulacji m etabolizm u ekdyzonu. N europeptydy za pom ocą kinazy białkowej zależnej od cA M P regulowałyby fosforylację enzymów katalizujących przem iany ekdyzonu w 20-HE, a następnie w 20,26 dihydroksyekdyzon [7, 80]. Badania H o g g a r d a i R e e s a [81] potw ierdzają tę hipotezę. W yniki ich badań wskazują, że 20-m onooksygenaza ekdyzonowa może występować w dwóch formach: aktywnej ufosforylowanej i nieaktywnej nie- ufosforylowanej. Jednak w dalszym ciągu brak jest danych pozwalających w pełni wyjaśnić m echanizmy związane z regulacją m etabolizm u ekdysteroidów.

V. Zmiany stężenia ekdysteroidów w rozwoju owada

Ekdysteroidy aktywne pod względem horm onal

nym występują u owadów w stężeniach od 10~8 do 10“ 5 M [5], a ich m iano w hemolimfie zmienia się cyklicznie w rozwoju [82]. Pod koniec każdego sta dium larwalnego występuje szczyt ekdysteroidów, a następnie stężenie bardzo szybko spada i tuż przed linką i w okresach międzywylinkowych jest niskie. U wielu ow adów holom etabolicznych, które charak teryzuje cykl rozwojowy z przeobrażaniem zupełnym, pojawia się dodatkow y mały szczyt ekdysteroidów w środkow ym okresie ostatniego stadium larwalnego. Inicjuje on zm iany w zachow aniu larwy oraz wywołuje przełączenie program u przem ian z larwalnego na poczwarkow y [83, 84]. W trakcie rozwoju osobniczego obserwuje się zarów no zmiany bezwzględnego stężenia ekdysteroidów , jak i zmiany w ilości różnych ekdysteroidów względem siebie. W stadium poczwarki występuje bardzo rozległy szczyt ekdysteroidów niezbędny do prawidłowego zakończenia metam orfozy owada. U Manduca sexta składa się on z kilku zachodzących na siebie szczytów. Najpierw wzrasta m iano ekdyzonu, następnie zaś 20-HE i na końcu pojawia się najmniejszy szczyt 20,26-dihydroksyek- dyzonu [7], Tak więc zarów no ekdyzon, jak i 20-HE, a możliwe, że również 20,26-dihydroksyekdyzon, od grywają swoistą rolę w rozwoju owada [7]. N atom iast pojawienie się ekdysteroidów u dorosłej postaci owada jest związane z reprodukcją [82].

VI. Transport

Ekdysteroidy krążące w hemolimfie występują w dwóch formach: nie związanej i związanej białkami [5, 85]. Nie związane stanow ią aktywną formę h o rm onu, natom iast związane z białkiem (białkami) są nieaktywne biologicznie. Ich funkcja może się sprow adzić do utrzym ania „rezerwy horm onalnej” w ciele ow ada [5]. W hemolimfie w ykazano obecność zarów no specyficznych [86], jak i niespecyficznych białek wiążących ekdysteroidy [87] różnych strukturalnie od wew nątrzkom órkow ych białkowych receptorów ekdysteroidowych [88, 89],

Przenikanie wolnych ekdysteroidów z hemolimfy do wnętrza komórki odbywa się za pomocą dwóch różnych mechanizmów: transportu aktywnego z udziałem przenośników lub też drogą dyfuzji [5,90]. Transport aktywny dotyczy niskich stężeń ekdysteroidów i może być ham owany przez czynniki blokujące grupy tiolowe [90].

VII. Rola ekdysteroidów w rozwoju osobniczym

Ekdysteroidy kontro lu ją takie procesy, jak linienie, wzrost czy gametogenezę. Najlepiej poznanym zjawiskiem kontrolow anym przez ekdysteroidy jest linienie (zrzucanie starej kutikuli i produkcja nowej) zachodzące zarów no w stadium em brionalnym jak i w rozwoju postem brionalnym [10, 91]. K ontrola ta przejawia się w stymulacji takich procesów, jak: apoliza, podziały


kom órek epidermy, odkładanie nowych warstw kutikuli i ham ow aniu tych, które związane są z końcowymi etapam i linienia — trawieniem starej kutikuli czy melanizacją nowej [84, 91]. Ekdysteroidy kontrolują procesy linienia przy współudziale horm onu juwenil- nego [91]. W obecności JH ekdysteroidy indukują odkładanie kutikuli larwalnej, podczas gdy nieobecność tego horm onu prowadzi do wytworzenia kutikuli poczwarkowej [92].

Ekdysteroidy regulują morfogenezę i różnicowanie się dysków im aginalnych, tzn. grup kom órek pochodzenia em brionalnego niezróżnicowanych, stanow iących zalążki s truk tu r dorosłego owada, które w stadium larw alnym ulegają jedynie podziałom kom órkowym. Dyski te w czasie m etam orfozy rozwijają się w struktury dorosłego ow ada [7, 93].

W ykazano również, że ekdysteroidy stym ulują ga- metogenezę, podczas m etam orfozy [91, 94],

M echanizm działania ekdysteroidów na poziomie kom órkow ym jest przedm iotem oddzielnego artykułu 1.

A rtykuł otrzymano 24 lutego 1994 r.Zaakceptowano do druku 26 maja 1994 r.

Piśmiennictwo

1. B u t e n a n d t A, K a r l s o n P (1954) Z N aturforsch 9b: 389-391

2. G o o d w i n T W , H o r n D H S , K a r l s o n P. K o o l m a n J , N a k a n i s h i K, R o b b i n s W E , S i d d a l l J B , T a k e m o - t o T (1978) N a tu re 272: 122

3. K o o l m a n J (1982) Insect B iochem 12: 225-2504. L a f o n t R, H o r n D H S (1989) W: K o o lm a n J (red) Ec-

d y so n e G e o rg T h iem e V erlag , S tu ttg a rt s tr 39-645. K o o l m a n J (1990) Z o o l Science 7: 563-5806. F e l d l a u f e r M F (1989) W: K o o lm an J (red) E cdysonc

G e o rg T h iem e V erlag , S tu ttg a rt s tr 308-3127. G i 1 b e r t L I (1989) W: K o o lm a n J (red) E cd y so n e G eo rg

T h iem e V erlag, S tu ttg a rt, s tr 448-4718. B o l l e n b a c h e r W E , G r a n g e r N A (1985) W: K erk u t

G A , G ilb e r t LI (red) C o m p reh en s iv e Insect P h y sio logy , B ioch em istry an d P h a rm a c o lo g y t 7 P eg am o n Press, O xfo rd , 109-151

9. R e d f e r n C P F (1989) W: K o o lm an J (red) E cd y so n e G e o rg T h iem e V erlag , S tu ttg a rt, s tr 182-187

10. L a n o t R, D o r n A, G u n s t e r B, T h i e b o l d J, L a g u - e u x M, H o f f m a n n J A (1989) W: K o o lm an J (red) E cdysone G e o rg T h iem e V erlag , S tu ttg a r t s tr 262-270

11. O h n i s h i E, M i z u n o T, I k e k a w a N, I k e d a T (1981) Insect B iochem 11: 155-159

12. R e e s H H (1989) W: K o o lm a n J (red) E cdysone G e o rg T h iem e V erlag , S tu ttg a rt, s tr 152-160

13. L o e b M J, W o o d s C W , B r a n d t E P , B o r k o v e c A B (1982) E xperien tia 218: 896-898

14. D e l b e q u e J - P , W e i d n e r K, H o f f m a n n K H (1990) Invert R eprod D evel 18: 29-42

15. M o r g a n E D , M a r c o M P (1990) Invert R eprod Devel 18: 55-66

16. K a r l s o n P, H o f f m e i s t e r H (1963) Z P hysio l C hem 331: 298-300

1 A rtykuł „R eceptor ekdysteroidow y Drosophila melano- gaster — jeden z czynników transkrypcji kontrolujących m etam orfozę” au torstw a A. O ż y h a r a ukaże się w następnym zeszycie P o s t . B i o c h e m .

17. C l a y t o n R B (1964) J L ip id R es 5: 3-1918. S v o b o d a J A, T h o m p s o n M J (1985) W: K e rk u t G A ,

G ilb e rt LI (red) C o m p reh en s iv e Insect P hysio logy , B iochem istry an d P h a rm a c o lo g y t 10 P e rg am o n P ress, O xfo rd , s tr 137-175

19. R e e s H H (1985) W: K e rk u t G A , G ilb e rt LI (red) C o m p re h e n sive Insect P hysio logy , B iochem istry an d P h a rm a c o lo g y t 7 P e rg am o n P ress, O xfo rd , s tr 249-293

20. F e l d l a u f e r M F , S v o b o d a J A (1986) Insect B iochem 16: 45-48

21. I k e k a w a N (1983) E xperien tia 39: 466-47222. M i l n e r N P , N a l i M, G i b s o n J M, R e e s H H (1986)

In sect B iochem 16: 17-2323. W a r r e n J T , S a k u r a i S, R o u n t r e e D B , G i l b e r t L I

(1988a) J In sect Physio l 34: 571-57624. G r i e n e i s e n M L , W a r r e n J T , S a k u r a i S, G i l b e r t

L I (1991) Insect B iochem 21: 41-5125. W a r r e n J T , H e t r u C (1990) Invert R eprod Devel 18: 91-9926. H o f f m a n n J A (1986) In sect B iochem 16: 1-927. K a p p l e r C, H e t r u C, D u r s t F, H o f f m a n n J (1989) W:

K o o lm a n n J (red) E cdysone G e o rg T h iem e V erlag, S tu ttg a rt , s tr 161-166

28. S m i t h S L , M i t c h e l M J (1986) Insect B iochem 16: 49-5529. W e i r i c h G F (1989) W: K o o lm an J (red) E cdysone G e o rg

T h iem e V erlag, S tu ttg a rt , s tr 174-18030. W a r r e n J T , S a k u r a i S, R o u n t r e e D B , G i l b e r t LI ,

L e e SS , N a k a n i s h i K (1988b) Proc N a tl A cad Sei U SA 85: 958-962

31. S a k u r a i S, W a r r e n J T , G i l b e r t L I (1989) Arch Insect Biochem P hysio l 10: 179-197

32. K a p p l e r C, K a b b o u h M, H e t r u C, D u r s t F, H o f f m a n n J A (1988) J S tero id B iochem 31: 891-898

33. M e i s t e r M F , B r a n d t n e r H M , K o o l m a n J, H o f f m a n n J A (1987) In t J Invertehr R eprod Dev 12: 13-28

34. D e l b e c q u e J P, M e i s t e r M F , Q u e n n e d e y A (1986) In sect B iochem 16: 57-63

35. K a p p l e r C, K a b b o u h M, D u r s t F, H o f f m a n n J A(1986) In sect Biochem 16: 25-32

36. K a b b o u h M, K a p p l e r C, H e t r u C, D u r s t F (1987) Insect B iochem 17: 1155-1161

37. W a t s o n R D , S p a z i a n i E, B o l l e n b a c h e r W E (1989) W: K o o lm an J (red) E cdysone G e o rg T h iem e V erlag, S tu ttg a rt, s tr 188-203

38. I h i z a k i H (1989) W: K o o lm an J (red) E cdysone G e o rg T h iem e V erlag, S tu ttg a rt , s tr 204-210

39. S a k u r a i S, W i l l i a m s C M (1989) Gen com p E ndocr 75: 204-216

40. B i d m o n H J , K o o l m a n J (1989) E xperien tia 45: 106-10941. C y m b o r o w s k i B (1984) W: Burg I (red )Z eg a ry b io log iczne,

P W N , W arszaw a42. L o e b M J , B r a n d t E P , W o o d s C W , B o r k o v e c A B

(1987) J exp Z o o l 243: 275-28243. A g u i N, G r a n g e r N A, G i l b e r t LI , B o l l e n b a c h e r

W E (1979) Proc N a t A cad Sei U SA 76: 5694-569844. A g u i N, B o l l e n b a c h e r W E , G r a n g e r N A, G i l b e r t

L I (1980) N a tu re (L ond) 285: 669-67045. R a a b e M (1983) A d v Insec t P hysio l 17: 205-30346. B i d m o n H J , S t u m p f W E , G r a n g e r N A (1992) E x

perientia 48: 42-4747. C y m b o r o w s k i B, S t o l a r z G J Insect Physio l 25: 939-94248. S a f r a n e k L, C y m b o r o w s k i B, W i l l i a m s C M (1980)

Biol B ull 158: 248-25649. C y m b o r o w s k i B, Z i m o w s k a G (1984) J Insect P hysio l

30: 911-91850. R o u n t r e e D B , B o l l e n b a c h e r W E (1986) J E xp Biol

120: 41-5851. W a t s o n R D , C i a n c i o MJ , G u n n a r W P , G i l b e r t

L I , B o l l e n b a c h e r W E (1985) J Insect P hysio l 31: 487-49452. G r u e t z m a c h e r M C , G i l b e r t LI , B o l l e n b a c h e r

W E (1984) J Insect P hysio l 30: 771-77853. R i c h t e r K, G e r s c h M (1983) E xperien tia 39: 917-91854. R i c h t e r K (1990) W: IX th E cdysone W o rk sh o p . P a ris In v ert

R ep ro d D evel 18: 1-2 s tr 12555. M u s z y r i s k a - P y t e l M, T r z c i r i s k a R, A u b r y M,

P s z c z o l k o w s k i M A, C y m b o r o w s k i B (1993) In sect B iochem M olec B iol 23: 33-41

56. M i z o g u c h i A, I s h i z a k i H (1982) Proc N a t A cad Sei U SA 79: 2726-2730


57. C y m b o r o w s k i B, Ś m i e t a n k o A, D e l b e c q u e J P(1989) C om p B iochem P hysio l 94a: 431-438

58. C y m b o r o w s k i B, Ś m i e t a n k o A, D e l b e q u e J P(1990) W : IX th E cd y so n e W o rk sh o p P aris, In v e rt R e p ro d Devel 18: 1-2 s tr 109

59. K o o l m a n J, K a r l s o n P (1985) W: K e rk u t G A , G ilb e r t LI (red) C o m p reh en s iv e In sec t P h y sio logy , B iochem istry an d P h a r m aco lo g y t 10 P e rg a m o n Press, O x fo rd 343-361

60. L a f o n t R, C o n n a t J L (1989) W: K o o lm a n J (red) E cd y so n e G e o rg T h ie m e V erlag , S tu ttg a rt, s tr 167-173

61. I s a a c R E , S l i n g e r A J (1989) W: K o o lm a n J (red) E cd y so n e G e o rg T h ie m e V erlag , S tu ttg a rt, s tr 250-253

62. C y m b o r o w s k i B (1989) W: K o o lm a n J (red) E cdysone G e o rg T h ie m e V erlag , S tu ttg a r t s tr 144-149

63. T h o m s o n M J, L u s d y W R (1989) W: K o o lm an J (red) E cd y so n e G e o rg T h ie m e V erlag , S tu ttg a rt, s tr 65-74

64. K i r i i s h i S, R o u n t r e e D B , S a k u r a i S, G i l b e r t L I (1990) E xp erien tia 46: 716-721

65. L a f o n t R, K o o l m a n J (1984) W: H o ffm an n J, P o rc h e t M (red) B iosyn thesis , M e tab o lism a n d M o d e of A ction o f In v e r te b ra te H o rm o n e s S p rin g e r-V erlag Berlin H eid e lb erg s tr 196-226

66. B l a i s C, L a f o n t R (1984) H oppe-Seylers Z P hysio l Chem 365: 809-818

67. M i l n e r N P , R e e s H H (1985) Biochem J 231: 369-37468. W h i t i n g P, D i n a n L (1989) In sec t B iochem 19: 759-76769. W h i t i n g P, S p a r k s S, D i n a n L (1993) In sect B iochem

M o lec B io l 23: 319-32970. W e i r i c h G F , T h o m p s o n M J , S v o b o d a J A (1990)

In ver t R ep ro d D evel 18: 13271. I s a a c R E , S w e e n e y F P , R e e s H H (1983) Biochem Soc

Trans 11: 379-38072. G e l m a n D B , T h y a g a r a j a BS , K e l l y T J , M a s l e r

E P , B e l l R A , B o r k o v e c A B (1990) Invert R eprod Devel 18: 114

73. K a r l s o n P, B o d e C (1969) J In sect P hysio l 15: 111-11874. K o o l m a n J (1981) W: S ehnal F , M en u JJ , C y m b o ro w sk i

B (red) R e g u la tio n o f In sect D ev e lo p m en t an d B ehav iour, W ro c law , T ech n ica l U n iv ersity s tr 93-106

75. K o o l m a n J (1980) W: H offm ann JA (red) P ro g ress in E cdysone R esearch , E lse v ie r /N o rth -H o lla n d B iom ed ical P ress, A m ste rd am s tr 187-209

76. Y o u n g N L , Y o u n g P R (1976) In sect B iochem 6: 169-17777. J o h n s o n P, R e e s H H (1977) B iochem J 168: 513-52078. F e y e r e i s e n R, D u r s t F (1980) M olec C ell E ndocrinol 20:

157-16979. H o f f m a n n J A , K o o l m a n J, K a r l s o n P, J o l y

P (1974) Gen C om p E ndocrinol 22: 90-9780. L e h m a n M, K o o l m a n J (1986) Biol C hem H oppe-Seyler

367: 387-39381. H o g g a r d N, R e e s H H (1988) J Insect P hysio l 34: 647-65382. S t e e l C G H , V a f o p o u l o u X (1989) W: K o o lm a n J (red)

E cdyso n e G e o rg T h iem e V erlag, S tu ttg a r t s tr 221-23183. R i d d i f o r d L M (1981) A m er Z o o l 21: 751-76284. T r u m a n J W (1988) W: E v an s P D , W ig g lesw o rth VB (red)

A dvances in In sect P hysio logy , A cadem ic P ress, L o n d o n t 21 s tr 1-34

85. W h i t e h e a d D L (1989) W: K o o lm a n J (red) E cd y so n e G e o rg T h iem e V erlag , S tu ttg a r t s tr 232-249

86. F e y e r e i s e n R (1985) W: L aw JH , R illing H C (red) M e th o d s in E n zy m ology t i l l , A cadem ic Press, N Y s tr 442-453

87. K o o l m a n J (1985) W: L aw JH , R illing H C (red) M e th o d s in E nzy m o lo g y t i l l , A cadem ic Press, N Y str 429-437

88. C h e r b a s L, Y o n g e C D , C h e r b a s P, W i l l i a m s C M (1980) R o u x 's A rch Dev B iol 189: 1-15

89. L e h m a n n M, K o o l m a n J (1988) M o l C ell E ndocrinol 57: 239-249

90. S p l i n d l e r K D , S p l i n d l e r - B a r t h M (1989) W: K o o lm an J (red) E cdy so n e G e o rg T h iem e V erlag , S tu ttg a r t s tr 245-249

91. S e h n a l F (1989) W: K o o lm a n J (red) E cd y so n e G e o rg T h iem e V erlag , S tu ttg a r t s tr 271-278

92. M i c h a l i k J (1991) P ost B io c h e m i i : 172-17893. Y u n d M A (1989) W: K o o lm a n J (red) E cd y so n e G eo rg

T h iem e V erlag , S tu ttg a rt s tr 384-39294. R a a b e M (1986) A dv Insec t P hysio l 19: 29-154

U p rze jm ie z a w ia d a m ia m y PT K o leżanki i PT K o le g ó w o p rze n ie s ie n iu s ie d z ib y Zarządu G łó w n e g o

P o lsk ie go T o w a rz y s tw a B io ch e m iczn e g o na te re n In s ty tu tu B io lo g ii D o św ia d cza ln e j im . M . N e n ck ie go

p o kó j 632 i 633

O becny adres:

P o lsk ie T o w a rz y s tw o B io ch e m iczn e ul. P asteura 3, 02-093 W a rsza w a

Tel. bezpo śre dn i 658 20 99 Tel. przez c e n tra lę 659 85 71 w . 352

Fax 22 5342

D yżu ry b iu ra Zarządu o d b y w a ć się będą ja k d o tych cza s w e w to r k i w godz 12-18


Do członków Polskiego Towarzystwa Biochemicznego

Zarząd P.T.Bioch. uprzejmie prosi wszystkich członków o wpłatę zaległych i bieżących składek członkowskich. Zachęcamy także do zaprenumerowania „Postępów Biochem ii” .

Aby zaprenumerować „P o stępy Biochemii” w 1995 r. należy wpłycić odpow iednią kwotę na konto bankowe wydawcy (Polskiego Towarzystwa Biochemicznego) za pomocą przekazu zamieszczonego na odw rocie. Zamówione egzemplarze będziemy wysyłać pocztą na adres podany nam na przekazie. Ponieważ odcinek przekazu docierający do nas jest jednocześnie zamówieniem, prosimy o bardzo wyraźne napisanie

imienia, nazwiska (lub nazwy instytucji) i dokładnego adresu wraz z kodem pocztowym (DRUKOW ANYMI LITERAMI) na wszystkich trzech odcinkach przekazu.

Prenumerata krajowa dla instytucji:580 000 zł.

Prenumerata krajowa indywidualna:280 000 zł, (50% zniżki dla członków Polskiego Towarzystwa Biochemicznego).

Prenumerując „Postępy Biochemii” wspierasz s wo j eczasopismo!


Komunikat Zarządu Głównego

20.06.1994 roztrzygnięty został konkurs na najlepszy w ykład akademicki. Przyznano dw ie równorzędne nagrody:

— Panu dr Januszow i Siedleckiemu z Centrum O nko log ii w W arszawie za wykład p.t. „M o leku la rne podstaw y chorób n o w o tw o ro w y ch "

— Panu dr A dam ow i Szewczykow i z Instytutu B io log ii Dośw iadczalnej im. Nenckiego PAN w W arszawie za w ykład p.t. „A TP — w ew nątrzkom órkow y przekaźnik in fo rm ac ji"

Przyznano także dw ie równorzędne drugie nagrody:

— Pani mgr M irosław ie Siatockiej z Instytutu Chemii B ioorganicznej PAN w Poznaniu za wykład p.t. „S truktura i w łaściw ości syntetaz a m inoacy lo -tR N A "

— Pani mgr Elizie W yszko z Instytu tu Chemii B ioorganicznej PAN w Poznaniu za wykład p.t. „S truktura i w łaściw ości czynnika transkrypcyjnego IMA (TF III A) Xenopus levis"

Pokwitowanie dla wpłacającego Odcinek dla posiadacza rachunku Odcinek dla poczty lub banku

zł ..................... z ł......................... z ł ........................słow nie......... ............ słow nie ....................... słownie............................................

wpłacający................ wpłacający................ wpłacający.....................................

imię, nazwisko, d o k ład n y adres z kodem pocztow ym imię, nazwisko, dokładn y adres z kodem pocztowym imię, nazwisko, do kład ny adres z kode m pocztowym

na rachu nek na rachunek na rachu ne k

Polskie Towarzystwo Biochemiczne Polskie Towarzystwo Biochemiczne Polskie Towarzystwo Biochemiczne

0 2 -0 9 3 W a rsza w a , ul. P asteu ra 3 0 2 -0 9 3 W a rsza w a , ul. P asteu ra 3 0 2 -0 9 3 W a rsza w a , ul. P asteu ra 3P.B.K. X III/0 W -wa, Al. Jerozolimskie P.B.K. X III/0 W -wa, Al. Jerozolimskie P.B.K. X III/0 W -w a, Al. Jerozolimskie

37 0 0 4 4 -1 225 -13 9-11 37 00 44-1225-139-11 37 00 44 -1225-139-11

ste mpe l stempelPo b ra n o opłatę P o b r a n o op łatę P o b ran o opłatę

Zł.............. Zł............... Zł...............podpis prz y jm ują cego pod p is p rz yjm ują ceg o pod p is prz yj m ują ceg o

192 POSTĘPY BIO C H EM II 4 0 (3 ), 1994http://rcin.org.pl

Wskazówki dla autorów

W ydawany przez Polskie Tow arzystw o Biochem iczne kw arta ln ik „Postępy B iochem ii” pub liku je prace przeglądow e om aw ia jące bieżące osiągnięcia , koncepcje i kierunki badawcze w dziedzin ie biochem ii i nauk pokrew nych; publiku je też noty z h is to rii b iochem ii, zasady polskiego słow nictw a b iochem icznego, recenzje nadesłanych książek oraz spraw ozdania ze zjazdów, konferencji i szkół, w których b iorą udzia ł członkow ie Towarzystwa.

Prace przeznaczone do publikacji w „Postępach B iochem ii” mogą mieć charakter artyku łów m onograficznych (do 20 stron tekstu licząc p iśm iennictw o i tabele), m in ire- views (do 10 stron tekstu), oraz krótkich not o najnowszych osiągnięciach i poglądach (do 5 stron tekstu).

Autorzy artykułu odpow iadają za praw id łow ość i ścisłość podawanych inform acji oraz poprawność cytow ania piśm iennictwa. U jęcie prac w inno być syntetyczne, a przedstawione zagadnienie z ilustrow ane za pomocą tabel, rycin, (wykresy, schem aty, reakcje), w zorów i fo tografii.

W skazany jest podzia ł a rtyku łów m onograficznych na rozdziały i podrozdzia ły, których rzeczowe ty tu ły tw orzą spis treści. Zgodnie z przyję tą konw encją rozdzia ły noszą cyfry rzym skie podrozdzia ły odpow iednio rzym skie i arabskie np. 1-1, I-2. Poprawność logiczna i sty lis tyczna tekstu w arunkuje jego jednoznaczność i czytelność. Autorzy przeto w inni unikać składni obcojęzycznej, gw ary laboratoryjne j, a także ograniczać stosow anie doraźnie tw orzonych skrótów, nawet jeże li bywają używane w pracach specjalistycznych. Każda z nadesłanych do Redakcji prac podlega ocenie specja listów i opracow aniu redakcyjnemu. Redakcja zastrzega sobie m ożliw ość skrócenia tekstu i w prow adzenie zm ian nie w pływ ających na treść pracy, deklaru je też gotowość konsultow ania tekstu z Autoram i.

Przekazanie artykułu do redakcji jest rów noznacznie z ośw iadczeniem , że nadesłana praca nie była i nie będzie publikowana w innym czasopiśm ie, jeże li zostanie og łoszona w „Postępach B iochem ii” . W przypadku, gdy Au- tor(zy) zam ierza(ją) w łączyć do swego autora artykułu ilustracje publikow ane przez autorów prac cytowanych, należy uzyskać i przekazać nam odpow iednią zgodę na przedruk.

Redakcja prosi Autorów o przestrzeganie następujących wskazówek szczegółowych:

TEKST: Maszynopis powinien być napisany jednostronnie, czcionką wielkości standardowej, z podwójną interlinią, z lewym marginesem ok. 4 cm z trzydziestoma wierszami na stronie i 60 znakami w wierszu (litery + odstęp), odstępy pomiędzy wyrazami powinny odpowiadać jednemu znakowi (nie równać do prawego marginesu).W tekście nie należy stosować żadnych podkreśleń, ani rozstrzelonego druku. Ewentualne sugestie co do charakteru czcionki drukarskiej mogą Autorzy zaznaczyć o łów kiem na marginesach maszynopisu. W przypadku stosowania w tekście liter alfabetu greckiego trzeba na marginesie wpisać ołówkiem ich fonetyczne brzmienie.

Strona informacyjna m aszynopisu jest n ienum erow ana, zaw iera im iona i nazw isko (a) autora (ów ), nazwy, adresy wraz z num erem telefonu zakładów (w języku polskim

i angie lskim ), w których pracują autorzy, adres do korespondencji nr telefonu i ew entualn ie fax, adresy prywatne autorów, ty tu ł artykułu w języku polskim i angie lskim oraz — w prawym dolnym rogu — liczbę tabel, rycin, w zorów i fo togra fii oraz skrót tytułu pracy (do 25 znaków).

Strona 1 (tytułowa) zaw iera im iona i nazw iska autorów, ty tu ł pracy w języku polskim i’ ang ie lskim , rzeczowy spis treści też w obu językach, ty tu ł naukowy każdego z autorów i ich m ie jsce pracy z adresem pocztowym oraz wykaz stosowanych skrótów.Kolejno numerowane dalsze strony obejm ują tekst pracy, p iśm iennictw o, tabele, podpisy i ob jaśn ien ia rycin, wzorów i fo tografii.

PIŚMIENNICTWO: Wykaz p iśm iennictw a obejm uje prace w kolejności ich cytow ania w tekście, zaznacza się je liczbam i porządkow ym i ujętym i w naw iasy kwadratowe, np. [3,7,9,— 26]. Odnośniki b ib liogra ficzne w inny mieć nową uproszczoną form ę. Sposób cytow ania czasopism (1), m onografii (2), rozdzia łów z książek jednotom ow ych(3), rozdzia łów z tom ów serii opracow anej przez tych samych redaktorów (4), rozdzia łów z tom ów serii opracowanych przez różnych redaktorów (5) w skazują poniżej podane przykłady:

1. H ildenbrandt GR, Aronson NN (1980) B iochim Bio- phys Acta 631: 499— 502

2. Bostock CJ, Sum ner AT (1978) The Eukaryotic Chromosom e, E lsevier, North-Holand, Am sterdam

3. Norberth T, Piscator M (1979) W: Friberg L, Nordberg GF, Von VB (red) Handbook on the Toxicology of Metals. E lsevier, N orth-Holland, Am sterdam , str 541-553

4. Delej J, Kesters K (1975) W: Florkin M, Stotz EH (red) C om prehensive B iochem istry t 29B. Elsevier, North-Holland Am sterdam , str 1-77

5. Franks NP, Lieb WR (1981) W: Knight CG (red) Research M onographs in Cell and Tissue Physiology, t 7. E lsevier, North-Holland, Am sterdam , str 243-272

ILUSTRACJE: Ryciny winny być gotowe do reprodukcji. Fotografie czarno-białe (kontrastowe), powinny być w ykonane na papierze matowym. Pozostałe ryciny należy wykonać tuszem na białym papierze lub kalce technicznej. Wskazane jest, aby ryciny były dwukrotnie większe od przyszłej reprodukcji, tj. w skali 2:1. Cyfry i litery służące do opisu rysunku powinny mieć wysokość nie mniejszą niż 5 mm. Na rysunkach nie należy umieszczać opisów słownych, lecz posługiwać się skrótami. Osie wykresów winny być opatrzone napisem łatwo zrozumiałym. Decyzję o stopniu zmniejszenia ryciny podejmie redakcja. Ilustracji nie należy włączać w tekst maszynopisu, lecz odpowiednio ponumerować: tabele i ryciny noszą cyfry arabskie, wzory zaś rzymskie. Na marginesie tekstu należy zaznaczyć ołówkiem preferowane miejsce umieszczenia tabeli, ryciny, czy wzoru. Tabele odpowiednio porub- rykowane, winny być opatrzone jednoznacznym tytułem i ewentualnie także niezbędnymi objaśnieniami. Słowne objaśnienia znaków graficznych można umieścić w podpisie pod ryciną, rysunkowe zaś jedynie na planszy ryciny. Tytuły i objaśnienia rycin sporządza się w postaci oddzielnego wykazu. Ilustracje należy podpisać nazwiskiem pierwszego z autorów i pierwszym słowem tytułu pracy oraz oznaczyć „góra-dół" (ołówkiem na odwrocie). Ze względu na wewnętrzną spoistość artykułu wskazane jest konstruowanie orginalnych rycin i zbiorczych tabel na podstawie danych z piśmiennictwa.

Maszynopis i za łączniki (w dwu egzem plarzach), w łaściw ie zabezpieczone przed uszkodzeniem w czasie transportu, należy przesłać na adres:

Redakcja kw arta ln ika „Postępy B iochem ii”Instytut B io log ii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, ul. Pasteura 3,02-093 W arszawahttp://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

Documents

RCINBIOREAGR. ACTUAL ANALYSIS. ŁOT . £07700. te*0* £L„,100 g 4U __ Cesium . C hioride. SgHR «* ****** 0****Mi>nUrtu?«!

RCINBIOREAGR. ACTUAL ANALYSIS. ŁOT . £07700. te0 £L„,100 g 4U __ Cesium . C hioride. SgHR «* ** 0Mi>nUrtu?«!