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RESUMENLas Interacciones físico-químicas y la estimulación biológica son la base de algunas tecnologías aplicadas actualmente a la remediación de suelos contaminados. Se ha sugerido que el desarrollo de una tecnología combina de estos dos principios aumentará la eficiencia de recuperación de suelos contaminados. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de las lombrices de tierra (L) y los ácidos húmicos (AH), en la biorremediación de un suelo arcilloso muy contaminado con complejas mezclas de hidrocarburos totales del petróleo (HTP) intemperizados. Debido a la alta toxicidad de las sales minerales en las lombrices de tierra, fue usada vermicomposta (VC), como fuente de nitrógeno y de fósforo. Cuatro kg de suelo contaminado con 83000 mg HTP/kg de suelo (28.5% alifáticos, 15% aromáticos, 21.5% saturados y 35% asfaltenos) fueron bioestimulados con agua (60% de la capacidad de retención de agua, CRA) y VC; Relación C:N:P de 100:25:1. A continuación, L y AH, así como el bagacillo de caña (BC), se incorporaron de acuerdo a un diseño factorial 3 × 2 × 2, de la siguiente manera: L, tres niveles: 0, 20, 40; BC, dos niveles: 0%, 6%, y AH, dos niveles: 0%, 1%. Por otra parte, cuatro kg de suelo contaminado con 83000 mg HTP/kg de suelo, fueron lavados con una solución de ácidos húmicos (3g / L), con una relación 1:10 (suelo: solución) obteniéndose suelo contaminado con 50000 mg HTP/kg de suelo (35.7% de remoción de HTP’s). Este suelo se bioestimuló de acuerdo con el mejor tratamiento del suelo sin lavar (con BC, AH y 40 L). Los tratamientos se incubaron a temperatura ambiente (25 ± 2°C) y pH 7 ±0.5, durante 94 días, aireándolos diariamente. Las muestras fueron analizadas periódicamente para HTP residuales, producción de AH y crecimiento microbiano, como carbono de biomasa y unidades formadoras de colonias (UFC/g suelo). Según el ANDEVA, las variables L, AH y BC tienen un efecto significativo en la remoción de HTP con una p(F)
Citation preview
I
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS
DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD ZACATENCO
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOINGENIERÍA
Biorremediación de un Suelo Contaminado con Hidrocarburos,
empleando Ácidos Húmicos y Lombrices (Eisenia andrei)
Tesis que presenta:
César García Díaz
Para obtener el grado en:
MAESTRO EN CIENCIAS
EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA
Codirectores: Dra. Josefina Barrera Cortés
Dr. Ronald Ferrera Cerrato
México, D.F. 2008
II
Comité Tutorial
Dra. Josefina Barrera Cortés (Biotecnología y Bioingeniería, CINVESTAV-IPN)
Dr. Ronald Ferrera Cerrato (Colegio de Postgraduados)
Dr. Hector Mario Poggi Varaldo (Biotecnología y Bioingeniería, CINVESTAV-IPN)
Dr. Miguel Ángel Meléndez Lira (Física, CINVESTAV-IPN)
III
Agradecimientos
Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo
económico otorgado para la realización de esta tesis a través de la beca de estudios
No.199742 y a el proyecto ―SEMARNAT-2002-C01-0154―.
Agradezco al CINVESTAV por la beca terminal otorgada para la conclusión de la
tesis.
IV
A la Dra. Josefina por el apoyo incondicional tanto personal como académico, que me brindo
a lo largo de la realización del proyecto.
Al Dr. Ronald por sus consejos académicos y personales que me brindó en cada ocasión
que tuve la oportunidad de reunirme con él, de manera incondicional.
Al Dr. Hector por sus comentarios valiosos para llevar a buen término este proyecto.
Al Dr. Miguel por sus comentarios sobre las posibles formas de analizar los resultados
obtenidos.
Al Dr. Frédéric Thalasso y al Dr. Luc Dendooven por permitirme el acceso ilimitado a sus
laboratorios en la Planta Piloto del Departamento, para llevar a cabo los análisis de la
caracterización de los materiales empleados en este proyecto.
A los auxiliares de investigación M. en C. Joel Alba Flores y M. en C. Marcos Luna por su
apoyo técnico para la realización de la tesis.
Al Dr. Fernando Esparza por su consejos; así como, el auxiliar de investigación M. en C.
Carlos Cruz y el auxiliar técnico Teresa Rodríguez.
A los auxiliares de investigación Ing. Calixto Ortega y la M. en C. Beatriz Altamirano por su
gran apoyo técnico, académico y personal; así como, al auxiliar técnico Humberto Moreno.
A la especialista Elvira Rios Leal y el auxiliar técnico Cirino Chávez, por su apoyo técnico
cromatográfico y consejos académicos brindados.
V
A mis padres y hermano
Por estar siempre conmigo y apoyarme nuevamente en cada momento en esta etapa de mi
vida y seguir orientándome para ser una mejor persona, gracias.
A mi novia
Claudia Ivonne por apoyarme en cada momento, compartir buenos momentos a su lado y
brindarme su amor, gracias.
A mis amigos
Miguel Ángel Rodríguez Mesa e Ivonne Esquivel Ríos, que me brindaron infinidad de
consejos para mi superación personal y académica; y que me permitieron pasar buenos
momentos con ustedes, gracias.
A mis compañeros
Por su compañía y amistad que me brindaron; y porque con su compañía el camino recorrido
fue mucho más sencillo, gracias.
VI
CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................... 1
1.1. SUELO ..................................................................................................................................................... 1
1.1.1. Componentes del suelo .............................................................................................................. 3
1.1.2. Suelo y su dinámica .................................................................................................................... 4
1.1.2.1 Humus....................................................................................................................................... 5
1.1.2.1.1. Tipos de humus .............................................................................................................. 6
1.1.2.2. Composición del Humus (Substancias Húmicas) .............................................................. 6
1.1.2.3. Substancias Húmicas y sus propiedades............................................................................ 8
1.1.2.3.1. Propiedades detergentes de las Substancias Húmicas ......................................... 12
1.1.2.4. Humificación de HTP’s ......................................................................................................... 13
1.2. CONTAMINACIÓN DE SUELOS CON HIDROCARBUROS .......................................................................... 13
1.2.1. Petróleo y producción................................................................................................................ 14
1.2.2. Composición del Petróleo ......................................................................................................... 14
1.2.2.1. Complejos Altamente Recalcitrantes (Asfaltenos) ........................................................... 15
1.2.3. Transporte de los HTP’s en el ambiente ................................................................................ 16
1.2.4. Migración de la mezcla de HTP’s ............................................................................................ 17
1.2.5. Toxicidad de las fracciones recalcitrantes del petróleo........................................................ 19
1.2.5.1. Hidrocarburos Alifáticos (HA’s) ........................................................................................... 19
1.2.5.2. Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (HPA’s)................................................................ 19
1.2.5.3. Compuestos heterocíclicos con azufre o nitrógeno ......................................................... 19
1.2.5.4. Efecto de los HTP’s en la salud .......................................................................................... 20
1.2.6. Biodegradación de los Hidrocarburos Totales del Petróleo ................................................ 21
1.2.6.1. Microorganismos degradadores de hidrocarburos .......................................................... 21
VII
1.3. TECNOLOGÍAS DE REMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS (IN-SITU, EX-SITU) ............................... 23
1.3.1. Lavado de suelo ......................................................................................................................... 24
1.3.1.1. Surfactantes ........................................................................................................................... 24
1.3.2. Tecnologías de biorremediación de suelos contaminados .................................................. 26
1.3.2.1. Bioestimulación ..................................................................................................................... 27
1.3.2.2. Residuos agroindustriales ................................................................................................... 28
1.3.2.3. Vermicomposteo ................................................................................................................... 29
1.3.2.3.1. Las lombrices ............................................................................................................... 30
1.3.2.3.2. Las excretas de lombriz .............................................................................................. 30
1.3.2.3.3. Agregados de excretas ............................................................................................... 30
1.3.2.3.4. Canales o galerías formados por la lombriz ............................................................ 31
1.3.2.3.5. Enzimas de la lombriz ................................................................................................. 31
1.3.2.3.6. Efecto de fuentes orgánicas e inorgánicas de N sobre la población de lombrices
del suelo............................................................................................................................................. 33
1.3.2.3.7 Remoción de HTP’s empleando lombrices ............................................................... 33
1.3.3. Factores que afectan la biorremoción de hidrocarburos en el suelo ................................. 34
1.3.3.1. Relación Carbono Nitrógeno (C/N) .................................................................................... 35
2. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................................... 38
3. HIPÓTESIS .................................................................................................................................................. 38
4. OBJETIVOS ................................................................................................................................................. 39
4.1. OBJETIVO GENERAL .............................................................................................................................. 39
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................................... 39
5. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................................... 40
5.1. SUELO ................................................................................................................................................... 40
5.2. EXTRACTO DE LEONARDITA ................................................................................................................. 41
5.3. LOMBRIZ ................................................................................................................................................ 41
VIII
5.4. VERMICOMPOSTA .................................................................................................................................. 40
5.5. BAGACILLO DE CAÑA ............................................................................................................................. 40
5.6. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ................................................................................................................ 42
5.6.1. Caracterización del suelo contaminado, bagacillo de caña, extracto de leonardita y
vermicomposta............................................................................................................................................. 43
5.6.2. Selección de la fuente de nitrógeno y relación C/N .............................................................. 44
5.6.3. Fermentación sólida del suelo contaminado ......................................................................... 45
5.6.3.1. Dispositivo experimental ...................................................................................................... 45
5.6.3.2. Diseño experimental factorial general ............................................................................... 46
5.6.3.3. Acondicionamiento de los tratamientos ............................................................................. 47
5.6.4. Lavado de suelo con substancias húmicas ........................................................................... 48
5.6.4.1. Diseño experimental factorial completo............................................................................. 48
5.6.5. Fermentación sólida del suelo lavado .................................................................................... 49
5.6.5.1. Acondicionamiento del suelo lavado .................................................................................. 49
5.6.6. Lixiviado....................................................................................................................................... 49
5.6.7. Análisis estadístico .................................................................................................................... 49
6. RESULTADOS Y DISCUSION.................................................................................................................. 50
6.1. CARACTERIZACIÓN DEL SUELO CONTAMINADO ................................................................................... 50
6.2. CARACTERIZACIÓN DEL BAGACILLO DE CAÑA ...................................................................................... 57
6.3. CARACTERIZACIÓN DE LA VERMICOMPOSTA ........................................................................................ 58
6.4. CARACTERIZACIÓN DEL EXTRACTO DE LEONARDITA ........................................................................... 59
6.5. SELECCIÓN DE LA FUENTE DE NITRÓGENO (EN FUNCIÓN DE LA SOBREVIVENCIA DE LA LOMBRIZ,
EISENIA ANDREI) ................................................................................................................................................ 61
6.6. FERMENTACIÓN SÓLIDA DEL SUELO CONTAMINADO ........................................................................... 63
6.6.1. Remoción de HTP’s de acuerdo al DEFG planteado ........................................................... 63
6.6.1.1. Efecto del bagacillo de caña en la remoción de HTP’s ................................................... 66
6.6.1.2. Efecto del extracto de leonardita (ácidos húmicos) en la remoción de HTP’s ............ 68
IX
6.6.1.3. Efecto de la presencia de la lombriz (Eisenia andrei) en la remoción de HTP’s ......... 74
6.6.1.4. Efecto de la vermicomposta en la remoción de HTP’s ................................................... 79
6.6.1.5. Efecto de la humedad (blanco ―a‖) en la remoción de HTP’s ........................................ 80
6.6.1.6. Efecto de la bioestimulación con sales minerales (blanco ―c‖) en la remoción de HTP’s ......... 80
6.6.2. Eficiencia de remoción de HTP’s en los diferentes tratamientos........................................ 81
6.6.3. Niveles de remoción de HTP’s libres de la fracción de asfaltenos ..................................... 82
6.6.4. Remoción HTP’s a largo plazo (11 meses) ........................................................................... 83
6.6.5. Remoción de asfalteno contenidos en la mezcla compleja de HTP’s ............................... 84
6.6.6. Fraccionamiento de los HTP’s residuales .............................................................................. 88
6.6.7. Análisis Estadístico de la Fermentación Sólida del Suelo ................................................... 90
6.6.8. Monitoreo de la población microbiana .................................................................................... 93
6.6.8.1. Carbono de biomasa ............................................................................................................ 93
6.6.8.2. Cuenta total para Bacterias ................................................................................................. 95
6.6.8.3. Cuenta total para Levaduras ............................................................................................... 98
6.6.8.4. Cuenta total para Hongos .................................................................................................. 101
6.6.8.5. Cuenta total para Actinomicetos ....................................................................................... 103
6.6.9. Correlación de la población microbiana hidrocarbonoclasta y la remoción de HTP’s ... 105
6.6.10. Formación de ácidos húmicos ............................................................................................... 108
6.6.11. Correlación de la formación de ácidos húmicos y la remoción de HTP’s ....................... 110
6.7. LAVADO DE SUELO CON SUBSTANCIAS HÚMICAS ................................................................................ 112
6.7.1. Análisis Estadístico de la remoción HTP’s del suelo lavado ............................................. 112
6.7.2. Determinación de la Concentración Micelar Crítica (CMC) del EL en solución ............. 115
6.8. FERMENTACIÓN SÓLIDA DEL SUELO LAVADO ..................................................................................... 119
6.8.1. Eficiencia de remoción de HTP’s en los diferentes los tratamientos ................................... 122
6.8.2. Niveles de remoción de HTP’s libres de la fracción de asfaltenos ...................................... 123
6.8.3. Fraccionamiento de los HTP’s residuales ............................................................................... 126
6.8.4. Monitoreo de la población microbiana...................................................................................... 128
6.8.4.1. Carbono de biomasa (Cb) ................................................................................................. 128
X
6.8.4.2. Cuenta total para Bacterias y Carbono de biomasa (Cb) ............................................. 129
6.9. TRATAMIENTO DEL LIXIVIADO.............................................................................................................. 130
7. CONCLUSIONES ...................................................................................................................................... 133
8. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................................... 135
9. ANEXO........................................................................................................................................................ 153
XI
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Columna de suelo y la organización de sus diferentes horizontes 1
Figura 2. Componentes principales de los agregados del suelo 2
Figura 3. Propiedades fisicoquímicas de las substancias húmicas (SH), 7
Figura 4. Fragmento estructural hipotético de las Substancias Húmicas del suelo 11
Figura 5. Regeneración de la capacidad oxido-reducción de las quinonas 11
Figura 6. Regiones susceptibles de fragmentación y biodegradación en los asfaltenos 16
Figura 7. Migración de los HTP’s en el ambiente 18
Figura 8. Estrategia experimental para la remoción de HTP’s del suelo 42
Figura 9. Dispositivo experimental para llevar a cabo la fermentación sólida del suelo 45
Figura 10. Diseño Experimental Factorial General 46
Figura 11. Ácidos húmicos presentes en el suelo 51
Figura 12. Asfaltenos e hidrocarburos libres de asfaltenos, contenidos en el suelo 54
Figura 13. Perfil cromatográfico del hidrocarburo libre de asfaltenos 54
Figura 14. Perfil cromatográfico de los asfaltenos del suelo contaminado sin biotratar 55
Figura 15. Flora microbiana total asociada al suelo 56
Figura 16. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al suelo 57
Figura 17. Flora microbiana total asociada a la vermicomposta 58
Figura 18. Ácidos húmicos y ácidos fúlvicos aislados de la vermicomposta 59
Figura 19. Estructura hipotética de los ácidos húmicos 60
Figura 20. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al extracto de leonardita 60
Figura 20. Lombriz Eisenia andrei en los microcosmos 61
Figura 21. Lombriz Eisenia andrei 62
Figura 22. Hidrocarburos totales del petróleo remanentes 64
Figura 23. Efecto de la presencia de bagacillo de caña en la remoción de HTP’s 67
Figura 24. Efecto de la ausencia de bagacillo de caña en la remoción de HTP’s 67
Figura 25. Representación tridimensional de los ácidos húmicos 68
Figura 26. Efecto de la presencia de extracto de leonardita en la remoción de HTP’s 69
XII
Figura 27. Efecto de la ausencia de extracto de leonardita en la remoción de HTP’s 69
Figura 28. Modelo de interacción de los ácidos húmicos con xenobióticos 72
Figura 29. Estructura de los agregados de asfalteno y floculación de estos 73
Figura 30. Efecto de la presencia de ácidos húmicos en los suelos compactos 73
Figura 31. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices 75
Figura 32. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices y extracto de leonardita 75
Figura 33. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices y bagacillo de caña 76
Figura 34. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices, bagacillo de caña y extracto de leonardita 76
Figura 35. Cocón de la lombriz Eisenia andrei y lombrices recién nacidas 78
Figura 36. Efecto de la vermicomposta en la remoción de HTP’s 79
Figura 37. Remoción de HTP’s después de 11 meses de tratamiento 83
Figura 38. Perfil cromatográfico de los asfaltenos 85
Figura 39. Perfiles cromatográficos del mejor tratamiento 87
Figura 40. Fraccionamiento de los HTP’s residuales antes y después del tratamiento 89
Figura 41. Interacción BC-L en presencia de EL 91
Figura 42. Interacción BC-L en ausencia de EL 91
Figura 43. Interacción BC-EL sin lombrices 92
Figura 44. Interacción BC-EL en presencia de 20 lombrices 92
Figura 45. Interacción BC-EL en presencia de 40 lombrices 92
Figura 46. Comportamiento del carbono de biomasa para los tratamientos del DEFG 93
Figura 47. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos ―a‖ y ―c‖ 94
Figura 48. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de las bacterias 96
Figura 49. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de las levaduras 99
Figura 50. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de los hongos 102
Figura 51. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de los actinomicetos 103
Figura 52. Correlación entre el crecimiento microbiano y la remoción de HTP’s 106
Figura 53. Síntesis de AH’s para los tratamientos sin EL del DEFG, a lo largo del proceso 109
Figura 54. Síntesis de AH’s para los tratamientos con EL del DEFG, a lo largo del proceso 109
Figura 55. Correlación entre la formación de ácidos húmicos y la remoción de HTP’s 111
XIII
Figura 56. Superficie de respuesta de la interacción S-EL, en presencia de 50ml de agua 113
Figura 57. Superficie de respuesta de la interacción S-EL, en presencia de 100ml de agua 114
Figura 58. Superficie de respuesta de la interacción S-EL, en presencia de 150ml de agua 114
Figura 59. Determinación de la CMC del EL 116
Figura 60. Posible interacción de los ácidos húmicos con las moléculas de suelo y HTP’s 118
Figura 61. Cinética de remoción de HTP’s del suelo lavado 119
Figura 62. Hidrocarburos totales del petróleo remanentes 121
Figura 63. Perfil cromatográfico del tratamiento del suelo lavado 125
Figura 64. Fraccionamiento de los HTP’s del suelo lavado antes y después del biotratamiento 127
Figura 65. Fraccionamiento de los HTP’s del suelo lavado biotratado y el mejor biotratamiento del
suelo sin lavar 127
Figura 66. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos y el suelo lavado 128
Figura 67. Efecto del lavado de suelo en las bacterias del tratamiento 129
Figura 68. Efecto del lavado de suelo en el nivel de remoción de HTP’s 129
Figura 69. Lixiviado del proceso de lavado 130
Figura 70. Perfil cromatográfico del lixiviado antes (A) y después (B) del tratamiento 132
XIV
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación general de los compuestos del petróleo 14
Tabla 2. Facilidad de degradación de HTP’s y productos de su metabolismo 21
Tabla 3. Tecnologías de remediación Ex situ de acuerdo a la USEPA 23
Tabla 4. Tecnologías de remediación In situ de acuerdo a la USEPA 24
Tabla 5. Tecnologías de Biorremediación Ex situ e In situ, de acuerdo a la USEPA 27
Tabla 6. Actividad enzimática detectada en la flora microbiana intestinal de la lombriz 32
Tabla 7. Efecto de diversos hidrocarburos sobre la lombriz 34
Tabla 8. Factores limitantes en la remoción de hidrocarburos totales del petróleo 35
Tabla 9. Determinaciones analíticas aplicadas a los materiales empleados 43
Tabla 10. Factores y niveles usados en el diseño factorial 33 48
Tabla 11. Caracterización física y química de los materiales empleados 52
Tabla 12. Caracterización biológica de los materiales empleados 53
Tabla 13. Hidrocarburos identificados en el suelo contaminado 55
Tabla 14. Porcentaje de remoción de HTP’s al termino del tratamiento (94 días) 64
Tabla 15. Velocidad de remoción de HTP’s (mgHTP’s/cm3•día) durante el tratamiento (94 días) 65
Tabla 16. Disminución de la eficiencia de remoción de los tratamientos del DEFG 81
Tabla 17. Remoción de HTP’s con y sin asfaltenos 82
Tabla 18. Eficiencia de remoción de asfaltenos en los tratamientos seleccionados 86
Tabla 19. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales 86
Tabla 20. Porcentaje de remoción de HTP’s del DEFG 90
Tabla 21. Porcentaje de remoción de HTP’s del DEFC para el lavado de suelo 112
Tabla 22. HTP’s removidos mediante lavado con ácidos húmicos 117
Tabla 23. Velocidad de remoción de HTP’s (mgHTP’s/cm3•día) durante el tratamiento (94 días) 120
Tabla 24. Porcentaje de remoción de HTP’s al termino del tratamiento (94 días) 121
Tabla 25. Disminución de la eficiencia de remoción de los tratamientos del DEFG y el suelo lavado 122
XV
Tabla 26. Niveles de remoción de HTP’s en función de la presencia de asfaltenos 123
Tabla 27. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales, para el suelo lavado 124
Tabla 28. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales, para el lixiviado 131
XVI
INDICE DE ANEXOS
A Análisis estadísticos 153
A1. Porcentaje de contribución de los términos del DEFG al modelo 153
A2. Análisis de varianza de los efectos seleccionados como principales contribuyentes del
análisis estadístico del DEFG 153
A3. Graficas de residuales del DEFG 154
A4. Graficas de residuales del DEFC 156
A5. Porcentajes de remoción de los diferentes tratamientos y el suelo lavado, respecto a
los blancos ―a‖, ―b‖ y ―c‖ 158
B Determinaciones analíticas
B1. Extracción de HTP’s (EPA 3550b) 159
B2. Recuperación de Asfaltenos 160
B3. Fraccionamiento de Hidrocarburos Ligeros (sin asfaltenos) 160
B4. Análisis cromatográfico 161
B5. Capacidad de Retención de Agua (CRA) 162
B6. Método de extracción de Substancias Húmicas del Suelo, método de la IHSS
(International Humic Substances Society) modificado 162
B7. Cuenta total en placa 164
B8. Microorganismos hidrocarbonoclastas 165
B9. Carbono de Biomasa (Islam and Weil, 1998) 165
B10. Elaboración del alimento de lombriz 166
XVII
NOTACIÓN
SH’s Substancias húmicas
AH’s Ácidos húmicos
M.O.S. Materia Orgánica del Suelo
HPA’s Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos
HTP’s Hidrocarburos Totales del Petróleo
S Suelo
EL Extracto de Leonardita
BC Bagacillo de Caña
VC Vermicomposta
CRA Capacidad de Retención de Agua
XVIII
RESUMEN
Las Interacciones físico-químicas y la estimulación biológica son la base de algunas tecnologías aplicadas
actualmente a la remediación de suelos contaminados. Se ha sugerido que el desarrollo de una tecnología
combina de estos dos principios aumentará la eficiencia de recuperación de suelos contaminados. El objetivo de
este trabajo fue evaluar el efecto de las lombrices de tierra (L) y los ácidos húmicos (AH), en la biorremediación
de un suelo arcilloso muy contaminado con complejas mezclas de hidrocarburos totales del petróleo (HTP)
intemperizados. Debido a la alta toxicidad de las sales minerales en las lombrices de tierra, fue usada
vermicomposta (VC), como fuente de nitrógeno y de fósforo.
Cuatro kg de suelo contaminado con 83000 mg HTP/kg de suelo (28.5% alifáticos, 15% aromáticos, 21.5%
saturados y 35% asfaltenos) fueron bioestimulados con agua (60% de la capacidad de retención de agua, CRA) y
VC; Relación C:N:P de 100:25:1. A continuación, L y AH, así como el bagacillo de caña (BC), se incorporaron de
acuerdo a un diseño factorial 3 × 2 × 2, de la siguiente manera: L, tres niveles: 0, 20, 40; BC, dos niveles: 0%,
6%, y AH, dos niveles: 0%, 1%. Por otra parte, cuatro kg de suelo contaminado con 83000 mg HTP/kg de suelo,
fueron lavados con una solución de ácidos húmicos (3g / L), con una relación 1:10 (suelo: solución) obteniéndose
suelo contaminado con 50000 mg HTP/kg de suelo (35.7% de remoción de HTP’s). Este suelo se bioestimuló de
acuerdo con el mejor tratamiento del suelo sin lavar (con BC, AH y 40 L). Los tratamientos se incubaron a
temperatura ambiente (25 ± 2°C) y pH 7 ±0.5, durante 94 días, aireándolos diariamente. Las muestras fueron
analizadas periódicamente para HTP residuales, producción de AH y crecimiento microbiano, como carbono de
biomasa y unidades formadoras de colonias (UFC/g suelo).
Según el ANDEVA, las variables L, AH y BC tienen un efecto significativo en la remoción de HTP con una p(F)
<0,05. El mayor porcentaje de remoción de HTP (64 ± 2% en 94 días) se obtuvo con el tratamiento compuesto
por BC, AH y 40 L. Este tratamiento removió el 35% de los asfaltenos, 85% de alifáticos, 78% de aromáticos y
73% saturados. En términos generales, los porcentajes de eliminación de HTP estuvieron en el rango de 64% a
28%, el más bajo correspondió a una prueba control preparada con agua y VC. El crecimiento microbiano y la
producción de AH, se correlacionaron con la remoción de HTP. Estos resultados se pueden explicar desde dos
puntos de vista: i) una mejor disponibilidad de todas las fracciones de hidrocarburos degradables, cuando se
añadieron AH, ii) la presencia de una microflora (del BC y VC) con la capacidad de consumir hidrocarburos. El
suelo lavado biotratado, tuvo una remoción de TPH de sólo 47±2% en 94 días. Este tratamiento removió el 15.7%
de los asfaltenos, 69.9% de alifáticos, 64.3% aromáticos y 52.6% saturados. Este resultado se puede explicar
debido a la pérdida de microorganismos hidrocarbonoclastas, después de lavar el suelo.
XIX
ABSTRACT
Physico-chemical interaction and microbial stimulation are the base of some technologies currently applied to the
remediation of polluted soils. It has been suggested that the development of a hybride technology combining these
two cleaning principles would increase the efficiency of polluted soil recuperation. The purpose of this work was to
evaluate the effect of earthworms (EW) and humic acids (HA), on bioremediation of clay soi l highly polluted with
complex mixtures of weathered total petroleum hydrocarbons (TPH). Due to the highly toxic effect of the mineral
salts on the earthworms, vermicomposta (VC) was used as nitrogen and phosphorous source.
Four kg of soil polluted with 83,000 mg TPH/kg of dry soil (28.5% aliphatics, 15% aromatics, 21.5% saturates and
35% asphaltenes) were biostimulated with water (60% of the water holding capacity, CRA) and VC; relation C:N:P
of 100:25:1. Next, EW and HA, as well as sugar cane bagasse (SCB), were incorporated according to a factorial
design 3×2×2, as follows: EW, three levels: 0, 20, 40; SCB, two levels: 0%, 6%; and HA, two levels: 0%, 1%. On
the other hand, Four kg of soil polluted with 83,000 mg TPH/kg of dry soil, were washed with a solution of humic
acids (3g/L) with a ratio 1:10 (soil:solution) obtaining soil polluted with 50,000 mg TPH/kg of dry soil (35.7% of
TPH removal). This soil were biostimulated according to the best treatment from the soil unwashed (with SCB, HA
and 40 EW). The treatments were incubated at environmental room temperature (25 ±2°C) and pH 7 ±0.5, during
94 days; the treatments were daily aerated. Samples were periodically analyzed for residual TPH, HA production
and microbial growth as biomass carbon and colony forming units (UFC/g of dry soil).
According to the ANOVA, the EW, HA and SCB factors have a significant effect on the TPH removal with a
p(F)<0.05. The highest TPH removal percentage (64 ±2% in 94 days) was obtained with the treatment composed
by SCB, HA and 40 EW. This treatment removed 35% of asphaltenes, 85% of aliphatics, 78% aromatics and 73%
saturates. In general terms, the TPH removal percentages were in the range 64% to 28%, the lowest one
corresponded to the control test prepared with polluted soil, water and VC. The microbial growth and HA
production, were correlated with the TPH’s removal. These results could be explained from two points of view: i) a
better availability of all degradable hydrocarbon fractions, when HA were added. ii) the presence of a microflora
(from SCB and VC) with the ability to consume hydrocarbons. The soil washed and biotreated has a TPH removal
of only 47±2% in 94 days. This treatment removed 15.7% of asphaltenes, 69.9% of aliphatics, 64.3% aromatics
and 52.6% saturates. This result could be explained due to the loss of hydrocarbonoclast microorganisms, after
soil washing.
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Suelo
El suelo es definido como el manto de roca erosionada que contiene materia orgánica, minerales y
nutrientes capaces de soportar el crecimiento de plantas, mientras que la fertilidad del suelo, es
atribuida a la actividad de los microorganismos.
El suelo se encuentra formado por capas denominadas horizontes. Estos horizontes van a variar tanto
en su estructura como en su población microbiana. Los horizontes se encuentran ordenados
empezando por el "0" y luego por letras en orden alfabético (Figura 1). El horizonte "0" es el formado
por desechos animales y plantas, es el horizonte orgánico; los horizontes A y B son los principales
depósitos de compuestos como óxidos y salicilatos; en ellos se llevan a cabo los fenómenos de
lixiviación y deposito de materiales orgánicos e inorgánicos. El horizonte C se caracteriza por una baja
actividad biológica y contienen acumulaciones de carbonatos de Ca y Mg, es el último horizonte y
colinda con la roca madre. La actividad microbiana se da principalmente en los 15-20 cm superiores
de la columna del suelo, después de esta profundidad, el número así como la actividad microbiana
disminuye (Sylvia, 1998)
Figura 1. Columna de suelo y la organización de sus diferentes horizontes.
2
El suelo, posee características físicas y químicas como: textura, densidad, porosidad, estructura, pH,
intercambio iónico, humedad y nutrientes, que le confieren sus propiedades (Sylvia et al, 1999). La
textura está dada principalmente por las proporciones de arcilla, limo y arena, que influyen en la
densidad y porosidad de los suelos; los cuales son un factor importante en la ecología de los
microorganismos, debido a que determinan el área superficial disponible para el crecimiento
microbiano (Atlas-Bartha, 1998).
La composición heterogénea (sólido, líquido, gaseoso) tanto a lo largo como a lo profundo del suelo,
permite el crecimiento microbiano formando un hábitat complejo (Figura 2), en donde existe una gran
competencia de los microorganismos por nutrientes, espacio y humedad. Los microorganismos que
conforman el suelo son numerosos y diversos, los más pequeños (bacterias, actinomicetos, levaduras
y hongos) son denominados microflora (Sylvia, et al, 1999). De los microorganismos que forman la
microflora, las bacterias son los más abundantes (108), seguidos por actinomicetos (10
6-10
7) y hongos
(104-10
6) (Sylvia, 1999).
Figura 2. Componentes principales de los agregados del suelo.
3
1.1.1. Componentes del suelo
Los componentes primarios del suelo son: 1) compuestos inorgánicos no disueltos, producidos por la
meteorización y la descomposición de las rocas superficiales; 2) los nutrientes solubles utilizados por
las plantas; 3) distintos tipos de materia orgánica, viva o muerta y 4) gases y agua requeridos por las
plantas y por los microorganismos. La naturaleza física del suelo está determinada por la textura. Los
suelos con un porcentaje elevado de arcilla, tienen baja porosidad (30-45%) y capacidad de retención
de agua. Si el suelo tiene mayor contenido de arcilla que arena con la misma cantidad de limo, el
suelo es cohesivo, teniendo una mayor capacidad de retención de agua y por lo tanto velocidades de
infiltración y aireaciones bajas. Esto se debe a que los poros de mayor tamaño son vaciados
rápidamente y la cantidad de agua que queda en la matriz del suelo es pequeña. En los suelos
arcillosos, el agua es absorbida en los poros pequeños y la disminución de su contenido es más
gradual. Por otro lado, la superficie neta negativa de las arcillas favorece la formación de agregados
que ocasionan el secuestramiento de nutrientes. Los agregados se forman por los enlaces iónicos
mediante catiónes polivalentes presentes en el suelo, entre arcillas y materia orgánica. Estos
complejos favorecen una gran adsorción de compuestos orgánicos hidrofóbicos (Soderstrom, 2000).
Las grandes partículas del suelo, como la arena y la grava, son en su mayor parte químicamente
inactivas; mientras que las pequeñas partículas inorgánicas, como las arcillas, presentan actividad
iónica, y además determinan en gran medida la capacidad de un suelo para almacenar agua. La parte
orgánica del suelo está formada por restos vegetales y animales, junto a cantidades variables de
materia orgánica amorfa llamada humus. Se forma a partir del proceso metabólico de los
microorganismos, al consumir compuestos orgánicos complejos que constituyen la materia viva. La
fertilidad de un suelo está relacionada directamente con el contenido de materia orgánica; ya que
mejora la estabilidad del suelo, aumentando su porosidad y capacidad de retención de agua; lo que
favorece el intercambio de gases y agua para los microorganismos. El humus además, favorece la
fijación de nutrientes y los mantiene más tiempo a disposición de los vegetales y los microorganismos.
4
La materia orgánica presenta una gran área superficial con propiedades de intercambio iónico, donde
se lleva a cabo la adsorción de compuestos orgánicos, lo cual puede limitar su biodisponibilidad. Las
componentes del suelo determinan la zona donde los microorganismos estarán adheridos. El 60% de
las bacterias se localizan en partículas recubiertas con materia orgánica; y solo se encuentran en el
0.02% de la superficie de partículas arenosas (Mihelcic, 1993). El componente liquido o solución de
suelo, está formado por agua con varias sustancias minerales, oxígeno y dióxido de carbono disueltos.
A través de esta solución, los nutrientes son absorbidos por los microorganismos. Los principales
gases contenidos en el suelo son oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono.
1.1.2. Suelo y su dinámica
El suelo es un organismo vivo: un consorcio de células vivas en una matriz orgánico-mineral. Ni las
células vivas, ni la composición de esta matriz son constantes: ambas varían con el tiempo y el lugar..
De hecho, existen muchas y variadas interacciones entre el suelo, los microorganismos y las plantas,
que influyen en gran medida sobre el crecimiento y el desarrollo de estas últimas. La macrofauna
conduce a la depredación de los microbios, a la estructura del suelo y a la descomposición de la
materia orgánica. Por ejemplo, las lombrices de tierra afectan en gran medida a la estructura física del
suelo: fomentan el crecimiento de las raíces y la ventilación del suelo gracias a las galerías que
fabrican en él, al tiempo que remueven la materia orgánica.
El suelo es una matriz compleja donde interactúa permanentemente el agua y el aire (Schwarzenbach
et al., 2003) y por lo tanto su contaminación puede propagarse directamente a las superficies, aguas
subterráneas y aire (Fent, 2003).
Cuando se sobrepasa la capacidad detoxificadora natural de la tierra, se alteran los ciclos
biogeoquímicos y la calidad del suelo se ve seriamente afectada, debido a una disminución de la
micro y macrofauna autóctona (Martín, 2004). La cual tiene la función de acelerar la descomposición
de la materia orgánica (mineralización que involucra la transformación de compuestos orgánicos en
inorgánicos) y su fijación a estructuras complejas estables como las substancias húmicas
5
(humificación que es la síntesis y/o unión química y/o biológica de compuestos de degradación de
residuos de origen vegetal y animal), que constituyen un 80% de la materia orgánica del suelo, y es
denominada Humus (Fründ, 1994).
1.1.2.1. Humus
En toda materia orgánica se deben presentar los procesos de mineralización (transformación de
compuestos orgánicos en inorgánicos) y humificación (síntesis y/o unión química y/o biológica de
compuestos de degradación de residuos de origen vegetal y animal), que conducen a la producción de
humus. Estos procesos son lentos, de varios meses a decenas de años, en función del tipo de materia
orgánica y los factores del medio ambiente (Perminova, 2005).
El humus se encuentra en la capa superior del suelo. Es producto de transformaciones,
descomposiciones y resíntesis de moléculas orgánicas, en las cuales no quedan vestigios
microscópicos visibles de los tejidos o células originales. Su color es oscuro y está conformado
básicamente por carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno, lo que contribuye a la agregación del suelo
(formación de terrones). El humus favorece la acción microbiana y su alta capacidad de intercambio
catiónico le permite retener nutrientes (Tan, 2003).
La composición del humus depende en parte del tipo de suelo, ya que éste puede favorecer el
desarrollo de las sustancias orgánicas. Tiende a favorecer la aireación o, por el contrario, puede
paralizarla, originando condiciones de anaerobiosis (por ejemplo en suelos hidromorfos o arcillosos).
También participan en su formación la microflora, micro y mesofauna del terreno. El principal factor
que determina la composición del humus es el tipo de vegetación existente, pues de ella deriva la
materia prima cuyas sucesivas descomposiciones originan el humus. También el clima resulta
decisivo en este proceso, ya que la humedad y la temperatura influyen esencialmente sobre la
composición del humus y sobre los microorganismos que transforman la sustancia orgánica. Puede
ocurrir que la oxidación del producto bacteriano sea incompleta y los azúcares se caramelizan y
formen sustancias parecidas a las melaninas, de naturaleza cíclica, que engrosan el grupo aromático
6
de los precursores húmicos. También se producen condensaciones entre los aminoácidos y los ácidos
alcohólicos para generar cadenas alifáticas que constituirán los terminales activos de las sustancias
húmicas. (Perminova, 2005)
Las paredes bacterianas pueden dar lugar, mediante un proceso de carbonización en ambientes
reductores, a unas sustancias oscuras y poco activas que se conocen como huminas microbianas o
huminas heredadas, ya que se sitúan al margen del proceso general de humificación.
Los compuestos aromáticos, por la acción de grupos de bacterias específicas se fragmentan y
generan quinonas que son susceptibles de polimerizarse y generar núcleos aromáticos, de masa
molecular elevada, que son la base de todas las sustancias húmicas. Sobre estos núcleos aromáticos
se insertan la cadenas alifáticas ya citadas, ricas en grupos carboxílicos, amínicos y alcohólicos, para
generar los ácidos fúlvicos, ácidos húmicos y huminas de condensación que son los componentes
primordiales del humus (Tan, 2003).
1.1.2.1.1. Tipos de humus
Desde un punto de vista global (evolución, morfología, propiedades, unión a la fracción mineral) el
material orgánico se clasifica en tres tipos básicos de humus (Tan, 2003):
Mor. Materia orgánica muy poco transformada.
Moder. Mayor transformación de la materia orgánica (Fúlvicos y precursores).
Mull. Materia orgánica evolucionada (ácidos húmicos, coloración del horizonte muy oscura).
1.1.2.2. Composición del Humus (Substancias Húmicas)
El humus suele fraccionarse en tres compuestos, siguiendo su extracción del NaOH: humina, ácido
fúlvico y ácido húmico (Figura 3). La humina es la fracción que no contiene NaOH y que es susceptible
de ser dispersada. El ácido húmico, por su parte, es una fracción de humus soluble en NaOH, que
resulta insoluble cuando el pH es 2. El peso molecular del ácido húmico varía de 10.000 a 100.000
7
Daltones y está compuesto por anillos aromáticos, compuestos cíclicos de nitrógeno y cadenas
peptídicas de estructura indeterminada. El ácido húmico presenta una composición general de 57% de
carbono y 4% de nitrógeno. Los grupos funcionales del ácido húmico son el COOH, el OH fenólico, el
OH alcohólico y las cetonas. El ácido fúlvico es soluble en NaOH y a un pH 2. Resulta más pequeño
que el ácido húmico, con un peso molecular que va de 1.000 a 30.000 Daltones. No obstante, los
procedimientos de extracción sólo recuperan de un 10 a un 20% de los ácidos húmico y fúlvico que
hay en el suelo. Durante la extracción de los ácidos fulvicos, podemos recuperar también una gran
variedad de carbohidratos del suelo, como monosacáridos (hexosas como la glucosa y la galactosa,
así como pentosas como la arabinosa y la xilosa), disacáridos (sacarosa y celobiosa), olisacáridos
(celotriosa) polisacáridos (celulosa y hemicelulosa), aminoazúcares (glucosamina), alcoholes del azú-
car (como el manitol), ácidos azucarados (como los ácidos, galacturónico y glucurónico) y azúcares
mediados (Tan, 2003).
Figura 3. Propiedades fisicoquímicas de las substancias húmicas (SH), Stevenson
8
1.1.2.3. Substancias Húmicas y sus propiedades
La característica más importante de ácidos húmicos recae en su capacidad de unir iones metálicos
insolubles, los óxidos e hidróxidos, y liberarlos lenta y continuamente a las plantas cuando son
requeridos (Tan, 2003). Debido a estas propiedades, los ácidos húmicos son conocidos por producir
tres tipos de efectos: físico, químico y biológico.
Físicos
Los ácidos húmicos modifican físicamente la estructura del suelo.
Mejorar la estructura del suelo: Previenen la perdida elevada de agua y nutrientes en días
calurosos y suelos arenosos. En suelos pesados y compactos, la aireación del suelo y
retención de agua se mejora
Previenen el agrietamiento y la erosión de suelo, aumentando la capacidad de de la formación
de agregados.
Incrementan la capacidad de retención de agua y previenen la sequía.
Obscurecen el color del suelo y así ayudan a la absorción de la energía del sol.
Químicos
Los ácidos húmicos químicamente cambian las características de fijación del suelo.
Neutralizan los suelos ácidos y alcalinos; regulan el pH de los suelos.
Mejoraran y optimizan la absorción de nutrientes; así como, agua por las plantas.
Aumentaan la característica reguladora del suelo.
Actuar como quelador natural para iones metálicos bajo condiciones alcalinas y promueven su
transporte a las plantas.
Ricos tanto en sustancias orgánicas y minerales esenciales para el crecimiento vegetal.
Conservan los fertilizantes inorgánicos solubles en agua en las zonas de la raíz y reducen su
lixiviación.
9
Poseen capacidades extremadamente altas de intercambio catiónico.
Promueven la conversión de los nutrientes (N, P, K + Fe, Zn y otros oligoelementos) en las
formas disponibles para las plantas.
Realzan la absorción del nitrógeno por las plantas.
Reducen la reacción del fósforo con: Ca, Fe,Mg y Al de manera que los liberan en una forma
que sea disponible y beneficiosa a las plantas.
La productividad de fertilizantes minerales se aumenta considerablemente.
Liberan el dióxido de carbono del carbonato de calcio del suelo y permitir su uso en
fotosíntesis.
Ayudar a eliminar la clorosis debido a la deficiencia de hierro en plantas.
Reducir la disponibilidad de sustancias tóxicas en suelos.
Biológicos
Los ácidos húmicos estimulan la planta y la actividad de los microorganismos.
Estimulan las enzimas de la planta y aumentar su producción.
Actuan como catalizadores orgánicos en muchos procesos biológicos.
Estimulan el crecimiento y la proliferación de microorganismos en suelo.
Realzan la resistencia natural de la planta contra enfermedades y parásitos.
Estimulan el crecimiento de la raíz, especialmente verticalmente y permitir una mejor
absorción de alimentos.
Aumentan la respiración de la raíz y la formación de la raíz.
Promueven el desarrollo de la clorofila, de los azúcares y de los aminoácidos en plantas y
ayuda en la fotosíntesis.
Aumentan las vitaminas y el contenido mineral de plantas.
Espesan las membranas celulares en frutas y prolongan el tiempo de anaquel.
Aumentan la germinación y la viabilidad de semillas.
10
Estimulan el crecimiento vegetal (una producción más alta de la biomasa) acelerando la
división de célula, aumentando el índice de desarrollo en sistemas de la raíz y aumentando la
producción de la materia seca.
Aumentan la calidad de producciones; mejorar su aspecto físico y valor alimenticio.
La gran mayoría de los investigadores de las substancias húmicas, concuerdan en que gracias a los
grupos funcionales de éstas, se debe su actuación en las propiedades físicas y químicas del suelo, así
como en las funciones fisiológicas de las plantas y en la nutrición vegetal.
Se cree que las substancias húmicas intervienen directamente en una gran cantidad de procesos
fisiológicos involucrados con el crecimiento de las plantas e indirectamente en la nutrición vegetal en
forma similar a los intercambiadores de iones sintéticos (agentes quelatantes), sin embargo, este
mecanismo no está bien dilucidado (Schnitzer, 2000).
En la estructura de los AH, una de las formas muy interesantes, es la presencia de vacíos de variadas
dimensiones, los cuales pueden atrapar o unir otros componentes orgánicos como carbohidratos,
proteínas y lípidos o bien inorgánicos como arcillas minerales y oxihidróxidos. Además, los
carbohidratos y las proteínas, son adsorbidos en la superficie externa y en los vacíos internos, los
puentes de hidrógeno juegan un importante papel en su inmovilización, junto con el agua (Tan, 2003).
Los grupos funcionales, principalmente los oxigenados, están involucrados en reacciones con metales
y minerales, los que proveen elementos nutrimentales para las raíces de los vegetales. Los AH y los
AF pueden complejar y/o quelatar cationes, debido a su alto contenido de grupos funcionales libres
(Figura 4). La reducción de humus fue reconocida como un camino respiratorio en 1996 (Lovley, et.
al., 1996) y que las sustancias húmicas pueden desempeñar un papel importante en la biodegradación
anaerobia y la biotransformación de compuestos orgánicos así como inorgánicos. El humus puede
servir como un aceptador de electrones terminal que apoya la oxidación microbiana anaerobia de una
amplia variedad de substratos orgánico. El humus microbianamente reducido puede transferir
electrones a óxidos metálicos, como Fe (III) y Mn (IV), teniendo la regeneración humus a la forma
11
R
O H
O H
R
O
O
Bacterias reductoras
de humus
Bacterias oxidantes
de humus
oxidada. Así, las sustancias húmicas puede mediar tanto oxidación anaerobia como la reducción de
óxido metálica (Figura 5).
Figura 4. Fragmento estructural hipotético de las Substancias Húmicas del suelo (Kleinhempel, 1970). Los círculos indican
algunos de los grupos funcionales de la molécula como son: péptidos, carbohidratos, quinonas, moléculas aromáticas, etc.
Figura 5. Regeneración de la capacidad oxido-reducción de las quinonas, mediante bacterias oxidantes y reductoras de humus;
así como, procesos anaeróbicos.
Humus Oxidado
Humus Reducido
Acetato
CO2 Microorganismos
Nitrato
Amoniaco o N2
Fe3+
Fe2+
Proceso Abiótico
Microorganismos
12
Además, las substancias húmicas reducidas también pueden servir como un donante de electrones
para conseguir la reducción microbiana de aceptadores de electrones más oxidados, como el nitrato,
fumarato y clorato. Diversas pruebas indican que las quinonas en el humus pueden desempeñar
papeles diferentes que contribuyen a la biodegradación anaerobia y la biotransformación de
substratos ecológicamente importantes, así como contaminadores de prioridad (Field and Cervantes,
2005). Los Ácidos Húmicos y los compuestos de modelo de quinona apoyaron la oxidación microbiana
anaerobia de varios substratos importantes sirviendo como un aceptador de electrones terminal en
muchos ambientes diferentes. Los consorcios que respiran humus también mostraron la capacidad de
mineralización de contaminantes, como el tolueno, cuando el humus y quinonas fueron
proporcionados como un aceptador de electrones final (Field and Cervantes, 2005). Así, una
tecnología basada en la inyección substancias húmicas en acuíferos y sedimentos para estimular la
biorremediación de sitios contaminados puede ser considerada. Las substancias húmicas no
necesariamente tienen que ser suministradas en abundancia para estimular el biorremediación de
estos sitios (Tan, 2003).
1.1.2.3.1. Propiedades detergentes de las Substancias Húmicas
Recientemente se ha sugerido que los ácidos de húmicos son especies anfipáticas, cuyo
comportamiento en solución sugiere que forman pseudomicelas y agregados semejantes a las micelas
formadas por las familias de surfactantes sintéticos. Un modelo alternativo recientemente concebido
sugiere que los ácidos húmicos consisten en subunidades relativamente pequeñas que se asocian a
través de las interacciones moleculares débiles formando pseudomicelas (Conte, 2005; Quagliotto et.
al., 2006). Se piensa que las pseudomicelas de los ácidos húmicos pueden ser formadas por
enrollamiento y asociación intermolecular, dependiendo del peso molecular, características
estructurales y la polidispersión del ácido húmico en cuestión (Wandruszka, 2000).
13
1.1.2.4. Humificación de HTP’s
Diversos estudios han demostrado la posibilidad de polimerizar y humificar los HPA’s como el pireno
en periodos de un año (Nieman, 1998). Otros investigadores han demostrado que un cambio en los
grupos funcionales de los compuestos aromáticos permiten que estos sean más susceptibles a la
polimerización, en presencia o no de enzimas como la lacasa o polifenoloxidasa. Por otro lado, se ha
demostrado que estos compuestos pueden ser humificados o incorporados a precursores de
sustancias húmicas como ubiquinonas, compuestos fenólicos o compuestos derivados de la celulosa y
la lignina (Nieman, 1998). Estos experimentos han sido llevados en laboratorio en la mayoría de los
casos en forma muy controlada, como es el empleo de substratos de estudio marcados
radiactivamente y su cuantificación posterior mediante el análisis de seguimiento de la molécula
marcada. Sin embargo, este proceso de humificación no solo esta limitado a condiciones controladas,
ya que; en la naturaleza ocurre este proceso de humificación dando como resultado el denominado
―humus‖. La importancia de promover la formación y el uso de substancias húmicas en la remediación
de suelos altamente contaminados es evidente por sí misma. Las substancias húmicas pueden
mejorar la actividad de la biomasa en suelos lavados y contribuir a una adicional atenuación natural
después de haber sido sometido a un proceso de biorremediación.
1.2. Contaminación de Suelos con Hidrocarburos
La contaminación del suelo puede ser debida a los accidentes industriales tales como:
derramamientos, goteras, escapes de tanques de almacenamiento subterráneos (Ballarin-Denti et al.,
1999; Lee et al., 2002; Kiem et al., 2003) y actividades antropogénicas (combustión de combustibles
fósiles) (Simcik et al., 1999; Venkataraman et al. 2002) los cuales representan una fuente de
contaminación del medioambiente a largo plazo.
14
1.2.1. Petróleo y producción
En todo el mundo, aproximadamente 4 billones de toneladas métricas por año son producidas, y se ha
estimado que del 0.08 al 0.4% de la producción mundial termina por contaminar los océanos (Bartha,
1986, BP, 2008). No se tienen estimados de la cantidad de HTP’s que contaminan los suelos, pero se
considera que gran parte del petróleo producido se derrama de manera accidental, así como también
gran parte; se vierte al ambiente de manera ilegal. Aproximadamente el 90% de la contaminación
ocasionada por los HTP’s se debe a la actividad antropogénica, el otro 10 % se debe a derrames
accidentales tales como accidentes ocasionados durante su transporte, desastres en tanques de
almacenamiento, así como también por la ruptura de algunas tuberías.
1.2.2. Composición del Petróleo
Los hidrocarburos del petróleo crudo son clasificados como alcanos (iso y normal), cicloalcanos y
aromáticos. Los alquenos (compuestos insaturados análogos a los alcanos) raramente se encuentran
en el petróleo crudo. Frecuentemente estos se producen como consecuencia de los procesos de
craque. Los heterocompuestos que tienen en su estructura átomos de oxígeno (fenoles, ácidos
nafténicos), nitrógeno (piridina, pirrol, indol) y azufre (alquiltiol y tiofeno); son denominados resinas. El
petróleo crudo también contiene una fracción altamente asfáltica condensada que se encuentra
parcialmente oxigenada. En la Tabla 1 se enlista una clasificación de los componentes del petróleo.
Tabla 1. Clasificación general de los compuestos del petróleo. Fuente: Machin-Ramírez, 2000
Nombre Formula General
Algunos compuestos representativos
Hidrocarburos saturados CnH2n + 2 Metano, etano, butano,hexano
Hidrocarburos nafténicos CnH2n Ciclopentano, ciclohexano
Hidrocarburos aromáticos
Variable Benceno, tolueno, xileno, etilbenceno
Resinas Variable Piridinas, quinolinas, carbazoles, tiofenos
Asfaltenos Variable Agregados de poliaromáticos, como ácido nafténico, metaloporfirinas
15
1.2.2.1. Complejos Altamente Recalcitrantes (Asfaltenos)
Los asfaltenos del petróleo son hidrocarburos que presentan una estructura molecular
extremadamente compleja, los cuales están conformados por diferentes proporciones de nitrógeno,
azufre y oxígeno (Pineda and Mesta-Howard, 2001). Estos compuestos ocasionan diversos problemas
como el bloqueo de tuberías de extracción y transporte de crudo, reducción de su aprovechamiento
económico y contaminación de los ecosistemas. La biodegradación de los asfaltenos es un proceso
que constituye un importante método para eliminar a estos compuestos y tratar de reducir los
problemas que ocasionan, sin embargo es un proceso que ocurre en proporciones muy reducidas. La
eliminación de la estructura micelar por la aplicación de solventes no polares o surfactantes y la
fragmentación de los asfaltenos por fotooxidación son los procesos iniciales necesarios para poder
degradar a estos compuestos.
Las estructuras que conforman a los asfaltenos como: los hidrocarburos lineales y ramificados,
heteropoliaromáticos y aromáticos, podrían degradarse en este orden a través de reacciones
bioquímicas como oxidaciones omega, beta y aromáticas respectivamente, que son procesos
distribuidos en una variedad importante de microorganismos (Pineda and Mesta-Howard, 2001).
Uno de los problemas más graves relacionados con éstos compuestos en el medioambiente, reside en
su resistencia a la biodegradación por actividad metabólica microbiana. Debido a éste hecho, las rutas
metabólicas involucradas en este proceso son de las menos conocidas en estos días, aunque, hay
ciertas evidencias que sugieren que algunos microorganismos tienen la capacidad potencial de
transformar asfaltenos y el mejor de los casos, eliminarlos (Figura 6).
Las comunidades microbianas en ecosistemas contaminados de esta manera tienden a ser
dominadas por aquellos organismos capaces de utilizar y/o de sobrevivir en presencia de los
compuestos tóxicos. Como resultado, estas comunidades son menos diversas que aquellos sistemas
de referencia no contaminados, aunque la diversidad también puede estar influenciada por la
16
complejidad de la mezcla de compuestos presentes y por el tiempo que las poblaciones han estado
expuestas.
Figura 6. Regiones susceptibles de fragmentación y biodegradación en los asfaltenos. 1: fotoxidación, 2: β-oxidación, 3: Ruta
metabólica del dibenzopireno, 4: Ruta metabólica similar al benzopireno, 5: Ruta metabólica del pireno, 6: Ruta metabólica
similar a la del benzo(a)pireno, 7: Ruta metabólica similar a los carbazoles.
1.2.3. Transporte de los HTP’s en el ambiente
Los HTP’s dispersados en el ambiente migran a través del suelo como: a) mezcla completa que se
infiltra en el suelo por la fuerza de la gravedad y acción capilar; b) componentes individuales que se
separan de la mezcla y se disuelven en el aire o el agua contenida en el suelo.
17
1.2.4. Migración de la mezcla de HTP’s
Cuando migra la mezcla completa, se tiene poca o nula separación de los componentes individuales y
la infiltración es normalmente rápida en comparación con la velocidad de disolución (Eastcott, et al.,
1989). Muchos compuestos del suelo que son insolubles en agua, son solubles en la mezcla y migran
junto con ella. Los factores que afectan la velocidad de infiltración son: tipo de suelo, tamaño de
partícula, contenido de humedad del suelo, vegetación, temperatura, y viscosidad de la mezcla.
Conforme la mezcla migra a través de la columna de suelo, pequeñas cantidades son
adsorbidas/absorbidas por partículas de este; produciéndose el fenómeno conocido como saturación
residual. Dependiendo de la resistencia de permanencia de la mezcla, el suelo puede estar saturado
por años (Dragun, 1988). La saturación residual determina el grado de contaminación del suelo, y
puede convertirse en una fuente continua de contaminación por los compuestos individuales que se
separen de la mezcla (Bauman, 1988).
Si el derrame es persistente, una extensa área puede verse afectada conforme los compuestos
individuales continúan separándose y migran lejos de la zona inicialmente contaminada. Cuando la
cantidad derramada es pequeña en comparación con la extensión de suelo disponible, se produce una
saturación residual y la migración de la mezcla normalmente cesa, antes de afectar los mantos
acuíferos. Si el agua pluvial se infiltra a través del suelo que contiene saturación residual, existe la
posibilidad de que se contaminen las aguas subterráneas debido a la migración de los componentes
individuales.
Si la cantidad derramada es grande en relación con el suelo disponible, la migración cesa conforme
llega a espacios porosos saturados con agua. En este caso, si la densidad de la mezcla es menor que
la del agua, el producto tiende a flotar a lo largo de la interface entre las zonas saturadas de agua y
las insaturadas, dispersándose horizontalmente en una capa delgada, normalmente en la dirección de
la corriente de agua subterránea, (Knox, 1993; Mackay, 1988). Si la densidad es mayor, la mezcla
migra hasta el manto acuífero por gravedad y cesa cuando ocurre saturación residual o cuando la
mezcla alcanza una superficie impermeable.
18
Conforme la mezcla migra a través de la columna de suelo, los componentes pueden separarse de la
mezcla y migrar independientemente, dependiendo de su volatilidad, solubilidad, potencial de sorción
y coeficiente de partición carbono orgánico-agua (Figura 7).
Figura 7. Migración de los HTP’s en el ambiente.
19
1.2.5. Toxicidad de las fracciones recalcitrantes del petróleo
1.2.5.1. Hidrocarburos Alifáticos (HA’s)
Se ha encontrado que los hidrocarburos alifáticos con cinco o más carbonos presentan propiedades
toxicas, causando efectos narcóticos, a causa de inhalaciones prolongadas o por exposición a altas
concentraciones de los mismos. Asimismo, se sabe que los hidrocarburos alifáticos no saturados y
cíclicos exhiben propiedades toxicas un poco menores que los de cadena lineal. No obstante, los
efectos anestésicos que presentan éstos últimos afectan seriamente el sistema nervioso central.
1.2.5.2. Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (HPA’s)
Se ha observado que en suelos contaminados con hidrocarburos existe un grupo de compuestos
sumamente recalcitrantes como los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA), los cuales
independientemente del porcentaje que representan con respecto a la totalidad de compuestos de que
ésta constituido el petróleo, se ha comprobado su carcinogenicidad o mutagenicidad en seres vivos.
En Estados Unidos, la Agencia de Protección al Ambiente (EPA) regula actualmente 16 de estos HPA
como compuestos altamente peligrosos, como contaminantes de prioridad en agua y suelo. Estos
compuestos son nocivos al ambiente aun en pequeñas cantidades, como lo marcan los experimentos
que se han realizado con microorganismos y animales. En ratas se presentan problemas mutagénicos
con 2 ppm o efectos tumorogénicos con 3.5 ppm (ATSDR, 1995), los cuales son solo un ejemplo de la
diversidad de reportes existentes.
1.2.5.3. Compuestos heterocíclicos con azufre o nitrógeno
Aun cuando existen muy pocos trabajos sobre la toxicidad de los compuestos heterocíclicos con
azufre y nitrógeno, McFall et al. (1984) los han reportado como compuestos tóxicos con propiedades
mutagénicas y carcinogénicas. Por otro lado, un derrame de hidrocarburos en el suelo, interrumpe en
todos los casos, la vocación natural o uso antropogénico del suelo.
20
1.2.5.4. Efecto de los HTP’s en la salud
Los efectos en la salud se basan en compuestos específicos y dependen de factores como son: tipo
de compuesto (o fracciones presentes en los HTP’s), tiempo de exposición, concentración y cantidad
de compuestos detectados. Las fracciones de HTP’s se clasifican en grupos con características
similares de movilidad en el ambiente, determinadas por sus propiedades físicas y químicas
(densidad, solubilidad, presión de vapor, y tendencia a enlazarse con el suelo o partículas orgánicas).
Las fracciones de HTP’s con densidad menor o cercana a la del agua, como los compuestos no
acuosos en fase liquida (NAPLs), flotan formando capas superficiales muy delgadas (Mackay, 1984).
Dadas sus propiedades fisicoquímicas, pueden afectar a algunos organismos de la superficie;
mientras que, algunas clases de bacterias y hongos, degradan estas fracciones en compuestos más
simples. Las fracciones más pesadas de los hidrocarburos, como los poliaromáticos (PAH’s), son más
densas que el agua, y se acumulan en los substratos afectando a la fauna y flora marina de la zona.
La degradación parcial de HTP’s presenta efectos nocivos, como son la bioconcentración, la cual
aumenta en forma proporcional al peso molecular (PM) de los HTP’s, bioacumulación especialmente
PAH’s; alifáticos y aromáticos de bajo PM no son bioacumulables (Farrington, et al., 1982), y
biomagnificación. En algunos casos, estos efectos pueden ser eliminados, si la fuente contaminante
es removida (Cox et al., 1975; Williams et al., 1989).
21
1.2.6. Biodegradación de los Hidrocarburos Totales del Petróleo
La degradación microbiana de HTP’s se inicia por el ataque a fracciones alifática y aromática ligeras.
Los compuestos aromáticos de alto peso molecular, las resinas y los asfaltenos se consideran
recalcitrantes, o en el mejor de los casos son biodegradados muy lentamente (Shiaris, 1989). En la
Tabla 2 se muestra una clasificación de hidrocarburos, en términos del nivel de transformación y
recalcitrancia. De acuerdo a la facilidad de degradación, los hidrocarburos pueden ser secuenciados
de la siguiente manera (Perry and Cerniglia 1973): Alcanos lineales (C10 - C19) — Alcanos lineales
(C12 - C18) — Gases (C2 – C4) — Alquenos (C5 - C9), Alquenos ramificados hasta C12 — Alquenos
(C3 - C11) — Alquenos ramificados — Aromáticos — Cicloalcanos.
Tabla 2. Facilidad de degradación de HTP’s y productos de su metabolismo.
Facilidad de degradación Productos Compuestos fácilmente degradables
Alifáticos volátiles, n-parafinas, aromáticos Alquenos, alcadienos, alquinos
Alifáticos pesados, aromáticos Alcanos saturados, hidrocarburos cíclicos
Compuestos fenólicos Fenol, cresol, naftol, xilenol
Compuestos intermedios
Hidrocarburos poliaromáticos Aromáticos mono-, di- y trinucleares
Recalcitrantes
Residuos pesados Asfaltos, resinas
Alquitranes, ceras Ceras parafínicas Fuente: Lapinskas, J., 1989.
1.2.6.1. Microorganismos degradadores de hidrocarburos
La preferencia en el consumo de HTP’s está determinada por la fisiología del microorganismo, así
como por las características físicas y químicas del ambiente donde se desarrolla. De estos tres
factores, se considera que el primero es el más importante; ya que las condiciones ambientales
pueden ser controladas de alguna manera. Los diversos componentes de los HTP’s son degradados
principalmente en condiciones aerobias y la presencia de oxigenasas, mediante diversas rutas
metabólicas. Los microorganismos con capacidad degradadora de HTP’s han sido aislados en zonas
contaminadas. Puede considerarse que los microorganismos aclimatados, preferentemente de
22
naturaleza endógena, generaran mejores resultados que floras microbianas externas (Leahy and
Colwell, 1990). La aclimatación puede llevarse a cabo por un enriquecimiento selectivo de nutrientes,
o mediante la ingeniería genética; inserción de genes que favorezcan el catabolismo de hidrocarburos.
Algunos microorganismos que utilizan HTP’s como fuente de carbono, son Alcaligenes, Nocardia,
Pseudomonas, Mycobacterium. Es importante mencionar que las comunidades microbianas
aclimatadas, están conformadas principalmente por bacterias.
Se ha identificado una gran variedad de microorganismos con capacidad para degradar compuestos
derivados del petróleo; interesantemente, casi todos son eubacterias, aunque en algunos casos se
encontraron arqueobacterias y eucariotes (Vázquez-Duhalt, 2000). Aunque no han sido caracterizados
en su totalidad, muchos de estos microorganismos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas,
que permiten la oxidación más ó menos específicas de algunas fracciones del petróleo. Esta oxidación
cambia las propiedades de los compuestos, haciéndolos susceptibles de ataques secundarios y
facilitando su conversión a bióxido de carbono y agua. En algunas ocasiones no es necesario llegar a
la mineralización, sino que basta una oxidación para disminuir notablemente su toxicidad o aumentar
su solubilidad en agua, incrementando su biodisponibilidad (Vázquez-Duhalt, 2000).
Uno de los géneros bacterianos más explotados en bioprocesos no-convencionales es Rhodococcus,
un grupo único consistente en microorganismos que presentan una gran diversidad metabólica,
particularmente hacia la utilización de compuestos hidrofóbicos tales como hidrocarburos, fenoles
clorados, esteroides, lignina, carbón y petróleo (Finnerty, 1992; Warhurst and Fewson, 1994).
Las bacterias del género Rhododoccus poseen una gran variedad de vías metabólicas para la
degradación y modificación de compuestos aromáticos, incluyendo las actividades de di-oxigenasa y
mono-oxigenasa sobre anillos así como la actividad de ruptura de catecol. Algunos aislados presentan
también la vía del 3-oxoadipato. La tolerancia de éstas bacterias a la falta de nutrientes, su carencia
de un sistema de represión catabólica y su persistencia ambiental las hace excelentes candidatas
para los tratamientos de biorremediación (Warhurst and Fewson, 1994).
23
Por otra parte, la inoculación con microorganismos exógenos, incluso cuando estos microorganismos
hayan sido aislados del mismo emplazamiento contaminado, no es en general efectiva (Martín, 2004).
Los microorganismos endógenos resultan efectivos, siempre y cuando, dispongan de los nutrientes
adecuados y se les suplemente con oxígeno, como tal o en forma de peróxido de hidrógeno. La mayor
eficiencia se obtiene probablemente optimizando la capacidad de la microflora indígena que es
prácticamente ubicua.
1.3. Tecnologías de remediación de suelos contaminados (in-situ, ex-situ)
La necesidad de restaurar los sitios contaminados con hidrocarburos, propicio el desarrollo de
tecnologías físicas y químicas, exclusivamente. Posteriormente después de la década de los 70's se
inicio el desarrollo de la biorremediación. De esta manera en la actualidad, la remediación de un suelo
puede llevarse a cabo por dos diferentes métodos, la Agencia de Protección Ambiental de Estados
Unidos (USEPA por sus siglas en inglés) clasifica a las tecnologías de remediación en dos grandes
grupos: las tecnologías ex-situ, y las tecnologías in-situ (USEPA 2008). En la primera se requiere de
excavación, o de cualquier otro proceso para remover el suelo contaminado antes de su tratamiento
que puede realizarse en el mismo sitio (on site) o fuera de él (off site) y las tecnologías in-situ, que se
refieren al tratamiento del sitio contaminado en el mismo lugar. En la Tabla 3 y 4, se presentan las
tecnologías de remediación ex-situ e in-situ respectivamente, comprendidas dentro de la EPA (USEPA
2008).
Tabla 3. Tecnologías de remediación Ex situ de acuerdo a la USEPA.
Tecnologías (Ex situ)
Principio
Tratamiento químico Se basa en la adición de agentes químicos oxidativos
Incineración On-site Tratamiento térmico hasta CO2 en el mismo tugar
Biorremediación Empleo de organismos vivos
Incineración Off-site Tratamiento térmico hasta CO2 en incineradores especiales fuera del área
Solidificación y estabilización
Empleo de materiales de la construcción, cemento, limos hidratados entre otros para inmovilizar al contaminante
Neutralización Empleo de agentes alcalinos para neutralizar suelos ácidos y permitir la remediación.
Vitrificación El suelo contaminado se mezcla con arena de vidrio y se hace pasar una corriente eléctrica; para formar bloques de vidrio con el suelo contaminado.
Aireación mecánica Se emplea para eliminar compuestos volátiles empleando la aireación.
Separación física Los contaminantes se extraen y/o separan del medio contaminado, aprovechando sus propiedades físicas o químicas (volatilización, solubilidad, carga eléctrica).
Lavado de suelos Los contaminantes adsorbidos en las partículas finas del suelo son removidos con el uso de soluciones acuosas en un suelo excavado
24
Tabla 4. Tecnologías de remediación In situ de acuerdo a la USEPA.
Tecnologías (In situ)
Principio
Extracción de vapor Recuperación de componentes volátiles empleando corrientes de vapor
Solidificación y extracción
Empleo de materiales de la construcción, cemento, limos hidratados entre otros para inmovilizar al contaminante
Biorremediación Empleo de organismos vivos para la desintoxicación de los suelos contaminados
Lavado de suelo Los contaminantes sorbidos en las partículas finas del suelo son removidos con el uso de soluciones acuosas en un suelo excavado
Recuperación térmica
Utilizan calor para incrementar la volatilización (separación) de los contaminantes en un suelo
Fitorremediación La fitorremediación es un proceso que utiliza plantas para remover, transferir, estabilizar, concentrar y/o destruir contaminantes (orgánicos e inorgánicos) en suelos, lodos y sedimentos
Extracción doble fase
Este tipo de procesos, utiliza solventes orgánicos para disolver los contaminantes y así removerlos del suelo.
1.3.1. Lavado de suelo
Se utiliza para remover y/o concentrar contaminantes absorbidos en suelo, como son los metales,
hidrocarburos y PAH’s (Preslo, 1989). El suelo contaminado es excavado y alimentado a un sistema
que contiene una solución de lavado y algunos aditivos de pH controlado. Si el suelo tiene un alto
contenido de humus y/o arcilla, se deben realizar pre-tratamientos de separación y cribado, lo cual
incrementa Ios costos de operación. Estos también son incrementados por Ios post-tratamientos de
las corrientes acuosas.
1.3.1.1. Surfactantes
Los detergentes, también conocidos como surfactantes debido a que reducen la tensión superficial del
agua, son moléculas ―anfipáticas‖ formadas por grupos polares (cabeza) y largas cadenas carbonadas
hidrofóbicas (cola). Sus grupos polares forman puentes hidrógeno con las moléculas de agua,
mientras que las cadenas carbonadas se agregan debido a interacciones hidrofóbicas. En soluciones
acuosas, los surfactantes forman estructuras esféricas organizadas llamadas micelas, que por su
naturaleza anfipática, tienen la capacidad de solubilizar compuestos hidrofóbicos (Bhairi, 2001).
25
El empleo de surfactantes, se ha propuesto como una técnica para incrementar la biodisponibilidad de
contaminantes orgánicos hidrofóbicos (HOC’s) como HTP’s, PCB’s, explosivos, clorofenoles,
pesticidas, entre otros, y así facilitar su biodegradación (Majer et al..1999). Los surfactantes pueden
ser sintetizados químicamente o bien por algunos microorganismos, en este último caso se les conoce
como biosurfactantes. Estos compuestos incrementan la solubilidad de los HOCs a través de una fase
micelar (hidrofílica/hidrofóbica), la cual propicia la desorción de los contaminantes del suelo hacia la
fase líquida, lográndose así un incremento en la biodisponibilidad de los HOC’s. La solubilización de
los contaminantes se lleva a cabo solamente cuando se forma la fase micelar, la cual se obtiene
cuando la concentración del surfactante es superior a la concentración micelar critica (CMC), es decir,
arriba de la concentración máxima a la cual el monómero del surfactante aún se mantiene en solución
(Ko et al., 2000).
La CMC es una propiedad muy sensible a la temperatura y polaridad del medio, y generalmente su
valor se reporta a temperaturas entre 20 y 25°C. El número de agregados para formar una micela, es
el valor promedio del número de monómeros en una micela. Los diferentes tipos de surfactantes que
son empleados para lavar el suelo, están en función de la naturaleza del contaminante a ser removido.
Por ejemplo, los pesticidas son eliminados por surfactantes no-iónicos como el Tritón X-100 y
biosurfactantes como los ramnolípidos (Noordman et al. 2000; Mata-Sandoval, 2002). Los
Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (PAH) pueden ser lavados por alquilfenol etoxilato (Garon et al.,
2002), (Cuypers et al., 2002) y otro surfactantes aniónicos como SDS (Chun et al.2002).
El uso de surfactantes no iónicos, es una de las prácticas más comunes y efectivas empleadas para la
desorción de compuestos orgánicos hidrofóbicos (HOCs) (Kotterman at al., 1998; Ghosh, 1997). La
eficiencia de desorción de un surfactante depende de su naturaleza, de la dosis empleada, de la
hidrofobicidad del contaminante, de la interacción surfactante-suelo y del tiempo de contacto
surfactante-suelo (Guha et al., 1996).
Sin embargo, la mejor eficiencia de desorción no está siempre relacionada con la mejor eficiencia de
degradación, debido principalmente a que el empleo de una alta concentración de surfactante puede
26
inhibir la degradación (Laha y col., 1992). Stelmack y col. (1999), demostraron que el uso de
surfactantes reduce la adhesión de las bacterias en la superficie hidrofóbica, dando como resultado
una baja actividad de biodegradación. Para solucionar este tipo de problema, algunos investigadores
recomiendan la utilización de surfactantes fácilmente biodegradables, como el Brij 30, Brij 35 y Tween
80 (Ghosh, 1997).
Abiola y col. (1997), determinaron que el uso de surfactantes favorece la remoción de HTP en un
suelo contaminado con 20,000 mg/kg de suelo. Los sistemas experimentales fueron biopilas estáticas
y alargadas con y sin surfactante. El grupo observó que solamente en las biopilas alargadas
adicionadas de surfactante se favoreció la biodegradación de hidrocarburos.
Kotterman y col. (1998), evaluaron la oxidación de PAHs utilizando diversos surfactantes. En este
estudio se determinó que el surfactante Tween 80 (1 - 2.5 g/L), presentó la menor toxicidad sobre el
sistema ligninolítico de la bacteria Bjerkandera sp., así como un mayor estímulo en la velocidad de
oxidación del antraceno y del benzo(a)pireno. Por su parte, Ghosh en 1997, evaluó la biodegradación
de PAHs en suelos utilizando cuatro diferentes surfactantes no iónicos, en este estudio observó
degradaciones de fenantreno de 70 - 80% en 98 días, al emplear concentraciones de surfactantes de
2.5 g/L o mayores; este resultado fue atribuido principalmente a que arriba de este valor se presenta la
formación de micelas, además de que se aumenta el tiempo de vida del surfactante en el suelo.
1.3.2. Tecnologías de biorremediación de suelos contaminados
En lo que se refiere a la Biorremediación, esta tiene como antecedente el tratamiento biológico de
efluentes, lo cual permitió que la investigación en esta área se desarrollara de manera rápida. El
termino biorremediación, se utiliza para describir una variedad de sistemas que utilizan organismos
vivos (plantas, hongos, bacterias entre otros, para remover (extraer), degradar (biodegradar) o
transformar (biotransformar) compuestos orgánicos tóxicos en productos metabólicos menos tóxicos o
inocuos.
27
Dentro de los procesos biológicos que suceden en la biorremediación, las enzimas funcionan como
catalizadores, dado que pueden modificar moléculas orgánicas (contaminantes) produciendo cambios
en su estructura así como en sus propiedades toxicológicas incluso, dar como resultado la completa
conversión de dichos compuestos en productos inorgánicos como agua, CO2 o formas inorgánicas de
N, P y S (Alexander 1994). En lo que se refiere a las tecnologías de Biorremediación, la Tabla 5
resume estas empleando el mismo criterio de las tecnologías de remediación: Ex-situ e In-situ.
Tabla 5. Tecnologías de Biorremediación Ex situ e In situ, de acuerdo a la USEPA.
Tecnología (Ex-situ)
Principio
Biopila Es un tratamiento en fase solida, aerobio en el que se trata fuera del sitio contaminado, utiliza equipo para airear mecánicamente, mezclar el suelo y nutrientes.
Bioreactores Se basa en la remoción de contaminantes empleando reactores en un sistema de lodos. Permite la combinación controlada y eficiente de procesos químicos, físicos y biológicos, que mejoran y aceleran la biodegradación.
Composta o vermicomposta
El composteo es un proceso biológico mediante el cual es posible, convertir residuos orgánicos en materia orgánica estable, gracias a la acción de diversos microorganismos o el efecto de las lombrices.
Biolabranza El suelo contaminado se mezcla con agentes de volumen y nutrientes, y se remueve (labra) periódicamente para favorecer su aireación.
Tecnologías (In situ)
Principio
Lagunas Se basa en el tratamiento de suelo inundándolos con agua para recuperar compuestos volátiles.
Bioventeo Se basa en la aireación a través de columnas, para estimular la actividad microbiana y la degradación del contaminante
Fitorremediación Es un proceso que utiliza plantas junto con microorganismos para remover, transferir, estabilizar concentrar y/o destruir contaminantes (orgánicos e inorgánico) en suelos o sedimentos
1.3.2.1. Bioestimulación
De las tecnologías de biorremediación, la bioestimulación es una tecnología atractiva ya que utiliza
los microorganismos autóctonos para la remoción de hidrocarburos y es in situ. En esta tecnología de
biorremediación, se suministran nutrientes a los microorganismos capaces de degradar hidrocarburos,
lo que les permite llevar a cabo tanto un crecimiento, como una actividad metabólica. En suelos
contaminados con hidrocarburos, la deficiencia de N y P en relación al C, generada por la
contaminación, es un factor limitante para que los microorganismos autóctonos puedan llevar a cabo
la remoción de hidrocarburos (Atlas, 1981; Leahy and Colwell, 1990). Esta deficiencia de nutrientes
28
puede ser balanceada utilizando como método de remediación a la bioestimulación (Boopathy et al,
1997; Leahy and Colwell, 1990).
Los nutrientes son clasificados en macronutrientes y micronutrientes. Los macronutrientes son
aquellos compuestos requeridos en grandes cantidades y que forman parte de las macromoléculas de
las células como carbohidratos, lípidos y ácidos nucleídos; entre los macronutrientes se tiene al C,
seguido del N, P y S (Atlas 1981; Sylvia et al, 1999). Los micronutrientes, a diferencia de los
macronutrientes, son requeridos en menor cantidad y sirven como componentes estructurales o bien
como elementos que favorecen la actividad enzimática capaz de degradar los contaminantes. Entre
estos elementos se encuentran el Ca, Zn, Mo, Cu, Mn, y Mg (Sylvia et al, 1999).
Algunos microorganismos pueden sintetizar todos sus componentes a partir de una fuente de carbono
como los hidrocarburos y algunos nutrientes minerales, mientras que otros requieren nutrientes más
complejos e inclusive de compuestos más específicos como aminoácidos, purinas, pirimidinas y/o
vitaminas (Atlas, 1981; Sylvia et al, 1999). Para que estos componentes puedan ser asimilados por los
microorganismos, se necesita que estos sean disponibles, se encuentren en cantidades suficientes y
como moléculas fáciles de asimilar. En la bioestimulación el N y el P son los nutrientes
frecuentemente adicionados a suelos contaminados (Atlas 1981; Leahy and Colwell, 1990).
1.3.2.2. Residuos agroindustriales
El adicionar un texturizante al suelo contaminado con hidrocarburo permite incrementar la actividad
microbiana, debido a que mejora el transporte de los contaminantes hacia los microorganismos;
además incrementa la porosidad en la mezcla suelo-agua-texturizante. La adsorción con carbón
activado puede ser altamente eficiente en la remoción de muchos elementos traza en el agua, pero su
alto costo prohíbe su aplicación a gran escala, además de los problemas que presenta en cuanto a su
disposición una vez que ha sido usado. Los desechos agrícolas representan recursos naturales no
utilizados y en algunos casos presentan serios problemas de disposición final, de ahí que se busquen
alternativas para convertirlos en productos útiles. El aserrín ha merecido diversos estudios para la
29
remoción de contaminantes tales como colorantes, sales y metales pesados a partir de agua y
efluentes acuosos (Shukla et al., 2002). Las paredes celulares del aserrín consisten principalmente de
celulosa y lignina, además de muchos grupos hidroxilos provenientes de taninos u otros compuestos
fenólicos. Esos grupos a un pH apropiado son intercambiadores iónicos efectivos. La lignina, un
componente de la madera, es un hetreopolímero constituido por unidades de fenilpropano. La
interacción con los grupos funcionales de este compuesto da la capacidad de adsorción de la madera
hacia compuestos orgánicos (Kubick and Apitz, 1999). En un estudio realizado para la eliminación de
cobre con aserrín de mango se encontró que el tamaño de partícula mas apropiado para la adsorción
fue de 100 µm, logrando una eficiencia de adsorción del 81% en una solución que contenía 17 mg/L
de Cu (II) a pH de 6.25°C y 50 g/L de aserrín (Ajmal et al., 1998). Gupta et al., (2002), usaron
residuos de la industria azucarera (bagacillo de caña), para la remoción de lindano y malatión, para un
tiempo de contacto de 60 min a pH de 6 la remoción fue del 97-98%. Resultados similares obtuvieron
utilizando DDT y DDE. Se ha reportado que cuando se utilizan soportes en procesos biológicos, la
eficiencia del proceso se mejora cuando los contaminantes son adsorbidos reversiblemente (Fava,
1996).
1.3.2.3. Vermicomposteo
El vermicompostaje es una forma alternativa de generar abono y eliminar desechos orgánicos. La
acción de la lombriz en su proceso digestivo produce un agregado notable de bacterias que actúan
sobre los nutrientes macromoleculares, elevándolo a estados directamente asimilables por las plantas,
lo cual se manifiesta en notables respuestas de las cualidades organolépticas de frutos y flores, como
así también resistencia a los agentes patógenos (Ferruzzi, 1994).
El vermicompostaje de hecho es la actividad de alimentar lombrices con restos vegetales y recoger los
excrementos, de alto poder fertilizante. Es una actividad limpia que no produce mal olor y que genera
un fertilizante seco.
30
Durante el proceso de vermicompostaje se generan compuestos bioactivos que son de importancia
para los procesos bioquímicos y reguladores de los suelos, como las enzimas: amilasa, celulosa,
lipasa, invertasa, proteasa, amidasa, ureasa, monoestereasa (fosfatasa acida y alcalina), arilsulfatasa
y deshidrogenase. Además, se generan distintos tipos de antibióticos, vitaminas, hormonas y
substancias húmicas (ácidos húmicos, fúlvicos y huminas), de gran valor (Quintero, 2002).
1.3.2.3.1. Las lombrices
El cuerpo de las lombrices, interna y externamente, es el sitio de los procesos metabólicos, como son
la producción interna y externa de moco, respiración, paso de material por su intestino y excreción de
compuestos nitrogenados. A este nivel la actividad microbiana es estimulada en el intestino por un
sistema mutualístico de digestión, que aumenta la capacidad de las lombrices para ingerir residuos
orgánicos. Similarmente, la producción de moco externo actúa como un estimulador para el
crecimiento y producción de microorganismos (Ferruzzi, 1994).
1.3.2.3.2. Las excretas de lombriz
Las excretas de lombriz son productos del material que pasa a través de su intestino de la lombriz son
excretados en dos principales formas: globular y granular, las cuales tienen diferentes tamaños,
estabilidad y duración, contenido de nutrientes y sus efectos sobre la dinámica de la materia orgánica
y la actividad microbiana es muy diferente (Ferruzzi, 1994).
1.3.2.3.3. Agregados de excretas
Los agregados de excretas son creados por lombrices anécicas (lombrices que viven dentro del suelo,
cavan galerías verticales y durante la noche suben a la superficie del suelo alimentándose de materia
orgánica) y consisten en la acumulación de excretas depositadas en la superficie y material orgánico
dentro y fuera de las galerías o canales abiertos en la superficie del suelo. Estas estructuras pueden
31
ser consideradas como hábitat de los microorganismos y fauna del suelo, así como aceleradoras de la
descomposición de la materia orgánica (Ferruzzi, 1994).
1.3.2.3.4. Canales o galerías formados por la lombriz
Los canales formados son producidos por el trabajo de las lombrices por su trayecto en el suelo,
llegan a ser permanentes (algunos años) o temporales, también pueden ser abiertos o llenos de
excretas y son principalmente importantes por su intercambio de agua, gases y movimiento de suelo.
Además, sirven como ruta preferencial para la expansión de las raíces de las plantas (Ferruzzi, 1994).
1.3.2.3.5. Enzimas de la lombriz
Las lombrices tienen un sistema digestivo muy completo, debido a la asimilación y al impacto en la
actividad microbiana, este proceso de digestión es muy importante en la regulación de la dinámica de
la materia orgánica. A través del paso por su intestino, los materiales ingeridos son rápidamente re-
estructurados de manera física, química y biológica hasta convertirlos en las excretas. Esto lo logran
por medio de la ayuda de diferentes enzimas que producen (Tabla 6). De las principales enzimas
encontradas en el intestino se pueden citar: quitinasas, proteasas, fosfatasas, celulasas, y algunas
otras enzimas glucosídicas (Lattaud et al., 1999).
Estas enzimas les permiten digerir bacterias, protozoarios, hongos y descomponer parcialmente
residuos de plantas. Algunas especies pueden participar en la descomposición de lignina y el proceso
de humificación ya que poseen peroxidasas, las cuales destruyen el enlace aromático de la lignina, las
enzimas peroxidasas han sido encontradas en el intestino de Eisenia foetida (Hassett et al., 1988;
Quintero, 2002).
El origen de estas enzimas, ya sea por la lombriz o por microorganismos, han sido encontradas en
diferentes géneros; sin embargo, el complejo enzimático es distinto para cada especie y su origen
32
puede ser de la pared intestinal y así presumiblemente, propia de la lombriz o de la microbiota que
vive en el intestino de la lombriz (Hassett et al., 1988).
Se ha encontrado que las lombrices posee citocromo P-450, actividad monooxigenasa, que son
enzimas responsables del metabolismo de HPA’s en hongos y algas (Cerniglia, 1993). Además
Eisenia foetida presenta un complejo glicolipoproteinico (G-90) con actividad mitogenica y antioxidante
esto hace pensar que la lombriz se sirve de dicho complejo para protegerse del daño celular contra
contaminantes como los xenobióticos (Grdisa et at, 2001).
Se han reportado diferentes bacterias asociadas al intestino, a las excretas o en el fluido interno de
sus huevecillos, como son: Pseudomonas, Acidobacterium, Nocardia, Alcaligenes, Rhodococus,
Azotobacter y algunos hongos como son Penicillum, Mucor, Aspergillus entre otro gran número de
microorganismos (Morgan and Burrows, 1982; Singleton et al., 2003; Pizl and Nováková, 2003).
Algunos de estos microorganismos pueden degradar HPA’s, tal es el caso de Pseudomonas,
Alcaligenes, Nocardia, Rhodococus, Azotobacter y Penicillum (Cerniglia, 1993; Johnsen et al., 2005).
Tabla 6. Actividad enzimática detectada en la flora microbiana intestinal de la lombriz.
Especie Enzimas Observaciones Referencia
E. andrei Fosfotriesterasa Hidroliza fosfotriesteres pesticidas Lee et al., 2001
E. andrei Catalasa, citocromo reductasa acetil colin esterasa, Glutatión
Actividad con metales: Pb, Cu, Zn, Hg, Co, Fe, Cd Denis-Saint et al., 2001
E. andrei Citocromo P-450, Peroxidación lipídica
Con benzo(a)pireno la actividad aumenta Saint-Denis et al., 1999
E. fetida Complejo glicolípido proteínico (G-90)
Actividad anticoagulante y fibrinolítica Hrzenjak et al., 1998
E. fetida Complejo glicolípido proteínico (G-90)
Aumenta la proliferación celular, actividad mitogénica y actividad antioxidante
Grdisa et al., 2001
E. fetida Citocromo P-450, monooxigenasa
Citocromo P-420 y Citocromo P-450, NADPH citocromo C-reductasa y actividad monooxigenasa
Achazi et al., 1998
33
1.3.2.3.6. Efecto de fuentes orgánicas e inorgánicas de N sobre la población de lombrices
del suelo
Investigaciones realizadas por Edwards and Lofty (1982) en Rothamsted, y otros trabajos citados por
Lampkin, (2002) encontraron que la remoción de la paja y ciertas técnicas de cultivo afectan a las
lombrices y otros organismos del suelo. También se encontró un mayor número de especies de
lombrices en suelos tratados con fertilizantes orgánicos que en suelos no tratados. Se observó una
alta correlación positiva entre dosis de N inorgánico y población de lombrices, probablemente por la
mayor producción de raíces y residuos, aunque también se observó que las fuentes orgánicas de N
aumentaban más la población que fuentes inorgánicas. Sin embargo, los suelos que recibieron ambas
fuentes de N, orgánico e inorgánico resultaron con las más alta población de lombrices. Edwards and
Lofty (1982) consideran que el efecto prejudicial de fertilizantes informado en otras publicación se
puede deber al aumento de la acidez del suelo causada por su uso.
1.3.2.3.7. Remoción de HTP’s empleando lombrices
La lombriz en su hábitat natural está expuesta a una variedad de compuestos alcaloides de plantas,
hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA’s) y pesticidas que inducen sistemas de citocromo P-450
(enzima que inicia la ruta de degradación de los HPA’s en algunas algas, bacterias y hongos; así
como, compuestos persistentes en el ambiente producidos por el hombre), y otros sistemas
enzimáticos que las protegen y ayudan a metabolizar diferentes compuestos (Achazi et al., 1998). Las
lombrices acumulan muchos contaminantes orgánicos lipofílicos (xenobióticos y metales pesados,
entre otros) de su medio ambiente. Son capaces de acumular compuestos lipofílicos no solo por
absorción pasiva de la fracción disuelta en el agua intersticial a través de la pared del cuerpo (Belfroid
et al., 1993), también por asimilación intestinal durante el paso de suelo contaminado a través del
intestino (Belfroid et al., 1994).
Liste and Alexander (2002) encontraron que las lombrices son capaces de asimilar HPA’s de la
porción remanente en suelos, que no son disponibles por otras técnicas de extracción convencionales.
34
Está demostrado que la desaparición de fenantreno y fluoranteno en suelos se acelera por la
presencia de lombrices del tipo Lumbricus rubellus (Ma et al., 1995). Belfroid et al. (1995) reportaron
que compuestos del tipo PCB’s (Bifenilos policlorados) son asimilados por lombrices de E. andrei,
después de la exposición alimenticia a pesar de su gran tamaño molecular y que un aumento en la
concentración de dichos compuestos en el alimento, resulta en un aumento proporcional en la
concentración en las lombrices.
La capacidad de un número de especies poliquetes y oligoquetos para metabolizar en vivo una
variedad de xenobióticos, incluyendo hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA’s) y aromáticos
clorados, sugieren que sistemas de citocromo P-450 son activos en este grupo de anélidos, los cuales
pudieran facilitar la eliminación de estos compuestos de la lombriz (Lee, 1985), en el Tabla 7 se
muestran algunos estudios que demuestran la capacidad enzimática de las lombrices para vivir en
presencia de hidrocarburos y otros compuestos xenobióticos.
Tabla 7. Efecto de diversos hidrocarburos sobre la lombriz.
Especie Contaminante Observaciones Referencia
E. fetida Petróleo crudo Tolera y sobrevive a 1.5% de petróleo Safwat et al., 2002
Lumbricus terrestris
Petróleo crudo Es muy sensible no tolera 0.5% Safwat et al., 2002
E. fetida Antraceno, criseno, pireno y benzo(a)pireno
Asimilación mayor en suelos con poca materia orgánica
Tang et al., 2002
E. fetida Fenantreno, pireno y criseno
Asimila compuestos que no son disponibles por extracción soxhlet
Liste y Alexander, 2002
Lumbricus rubellus
Fenantreno y fluoranteno Mayor bioacumulación bajo estrés nutricional Wei-Chun et al., 1995
E. andrei Hexabromobenceno y octacloronaftaleno
Mayor asimilación y con mayor contaminante en tejidos y una lenta aliminación
Belfroid et al., 1995
E. fetida CClorobencenos La eliminación aumenta con materia orgánica
Belfroid y Sijm, 1998
1.3.3. Factores que afectan la biorremoción de hidrocarburos en el suelo
En las superficies activas del suelo donde prevalecen las condiciones aerobias, la biodegradación de
estos compuestos es usualmente rápida y extensiva a condiciones de temperatura y humedad
favorables. Sin embargo, son muchas las limitantes para que el proceso de biodegradación se lleve a
cabo de manera eficiente. Existen otros como los asfaltenos que mediante periodos prolongados de
35
tiempo pueden se biodegradados en solo un 5 al 35% (Pineda and Mesta-Howard, 2001). El estado
físico de los HTP’s determina el área superficial inicial donde puede comenzar la biodegradación, un
incremento en el área superficial correlaciona positivamente con la biodegradación.
Las variables más importantes que limitan la biorremoción de Hidrocarburos Totales del Petróleo
(HTP’s) son: la biodisponibilidad, la transferencia de masa, las heterogeneidades espaciales y las
pérdidas abióticas. Dada la baja solubilidad de estos compuestos en agua, una de las estrategias para
la biorremediación en suelo es la adición de surfactantes naturales o sintéticos, que solubilicen a los
HTP’s y aumenten su biodisponibilidad (Ghosh, 1997).
La escasez de nutrientes, especialmente nitrógeno y fósforo limitan el crecimiento de microorganismos
degradadores de hidrocarburos. Otros micronutrientes como el hierro o azufre también son
indispensables aunque en pequeñas cantidades para mejorar el proceso de remoción. En la Tabla 8
se resume algunos de los factores que son limitantes en el proceso de biodegradación.
Tabla 8. Factores limitantes en la remoción de hidrocarburos totales del petróleo
Factor limitante Ejemplos Composición de los hidrocarburos
Estructura, cantidad, toxicidad
Estado físico Agregación, propagación, dispersión, adsorción
Potencial de agua Fuerza osmótica, exclusión de agua de agregados hidrofóbicos
Temperatura Influencia en la evaporación y velocidades de degradación
Oxidantes O2, NO3- o SO4=
Nutrientes minerales N, P, Fe
Reacción Valores bajos de pH son limitantes
Microorganismos Los microorganismos degradadores por lo general se encuentran en poca cantidad
1.3.3.1. Relación Carbono Nitrógeno (C/N)
La transformación del N orgánico a N disponible realizada por microorganismos está influenciada por
la relación C/N de la sustancia agregada al suelo. Si la relación C/N es menor que 20 la
transformación orgánica ocurre y se libera al suelo N disponible para las plantas. Sin embargo, si la
36
relación C/N es mayor que 30 el desbalance debido al exceso de carbono impide que la
transformación ocurra, a no ser que exista N disponible en el suelo que pueda ser usado por los
microorganismos. El resultado neto es una disminución o inmovilización del N disponible del suelo.
Para relación es C/N entre 20 y 30 puede no ocurrir ni liberación ni inmovilización de N disponible
(Tisdale, et al., 1993).
La descomposición de la materia orgánica es llevada a cabo por los organismos vivos, los cuales
utilizan el carbón como fuente de energía y el nitrógeno para construir su estructura. Mas nitrógeno
que carbono es necesario, pero si el exceso de carbono es muy grande, la descomposición decrece
cuando el nitrógeno es empleado y algunos microorganismos mueren, el nitrógeno almacenado es
entonces utilizado por otros microorganismos para formar nuevo material celular, y en el proceso más
carbono es empleado. Así la cantidad de carbono es reducida a un nivel más accesible mientras que
el nitrógeno es reciclado (Gotaas, 1956).
Los microorganismos utilizan cerca de 30 partes de carbono por cada parte de nitrógeno, una relación
C/N de 30 (en cantidades disponibles), por lo que esta relación parecería ser la más favorable para la
descomposición de la materia orgánica.
El nitrógeno es más difícil de conservar que el fósforo, potasio, y los micronutrientes los cuales, de
acuerdo a su condición química en la cual están presentes, son perdidos solo por lixiviación. El
nitrógeno puede ser perdido por lixiviación, pero la mayor pérdida viene del escape de amonio u otros
gases volátiles nitrogenados a la atmósfera (Gotaas, 1956).
La pérdida de nitrógeno como amoniaco durante la degradación aeróbia es afectada por la relación
C/N, el pH, el contenido de humedad, aireación, temperatura, forma de los compuestos nitrogenados
al inicio de la degradación, y la capacidad adsorptiva y de capacidad de retención de nitrógeno por la
materia presente.
37
El contenido de humedad de los proceso de degradación afecta la conservación del nitrógeno. El agua
sirve como solvente y diluyente del amoniaco, de manera que reduce la presión de vapor y
volatilización. Un contenido de humedad en el rango de 50 – 70%, asistirá a la conservación del
nitrógeno. La aireación y volteo afectan de manera adversa la conservación de nitrógeno. Si el
amoniaco está presente, éste escapará más fácilmente cuando el material es mezclado y expuesto a
la atmósfera. Aunque, si la relación C/N es suficientemente alta la perdida de nitrógeno durante el
mezclado será baja (Gotaas, 1956). Algunos materiales como la celulosa y materia fibrosa porosa,
tienen la capacidad de absorber o mantener la humedad y las sustancias volátiles, y disminuyen su
tendencia a escapar. Existe evidencia considerable que los materiales de este tipo juegan una parte
en la reducción de las pérdidas de nitrógeno.
38
2. JUSTIFICACIÓN
La degradación de hidrocarburos totales del petróleo (HTP’s) intemperizados de suelos reales
contaminados, es una prioridad mundial debido a su efecto tóxico sobre los seres vivos, es por esta
razón que es de interés desarrollar tecnologías de remediación efectivas y económicamente viables.
Las tecnologías de biorremediación han demostrado ser eficientes y económicas; sin embargo,
pueden ser lentas y poco eficientes en la remoción de las fracciones más recalcit rantes de los HTP’s
como son los asfaltenos e hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA’s). Entre las principales
limitaciones se encuentran la ausencia de nutrientes, la biodisponibilidad de los hidrocarburos y la
diversidad de microorganismos hidrocarbonoclastas. La degradación de estos hidrocarburos se puede
llevar a cabo por procesos de co-metabolismo, donde participen microorganismos característicos de la
transformación de moléculas aromáticas como la lignina presente en residuos celulolíticos y los
microorganismos asociados a la flora intestinal de la lombriz. La desorción de hidrocarburos de las
partículas de suelo ha sido comúnmente realizada a base de tensoactivos sintéticos. Aunque,
materiales tensoactivos de origen orgánico, tales como los biotensoactivos y ácidos húmicos, son una
opción interesante. En lo que concierne a los ácidos húmicos, moléculas complejas que evolucionan
en el curso del tiempo, existen reportes científicos acerca de su poder tensoactivo y capacidad para
incorporar estructuras aromáticas en su molécula.
En el presente trabajo se propuso evaluar el efecto de la presencia de lombrices (Eisenia andrei) y la
adición de ácidos húmicos en forma de extracto de leonardita con el objetivo de reducir los tiempos de
remediación de suelos arcillosos contaminados.
3. HIPÓTESIS
Las propiedades fisicoquímicas de los Ácidos Húmicos; así como, la flora microbiana asociada al
intestino de lombriz Eisenia andrei y su efecto mecánico sobre el suelo, permitirán reducir el tiempo de
restauración de un suelo contaminado.
Se ha considerado que el lavado de suelo con ácidos húmicos, reducirá aún más el tiempo de
restauración del suelo contaminado.
39
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Evaluar el efecto de la implementación de una tecnología en serie: lavado-fermentación sólida,
enfocado a reducir los tiempos de restauración de suelos altamente contaminados con hidrocarburos
totales del petróleo (HTP’s) e hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA’s) intemperizados.
4.2. Objetivos específicos
4.2.1. Determinar la fuente de nitrógeno para bioestimular el suelo contaminado, en función de la
sobrevivencia de la lombriz.
4.2.2. Evaluar el efecto de la incorporación de la lombriz (Eisenia andrei) con o sin alimento
(bagacillo de caña), en el proceso de remoción de HTP’s y HPA’s del suelo contaminado
en fermentación sólida.
4.2.3. Evaluar el efecto de la adición de ácidos húmicos, en el proceso de remoción de HTP’s y
HPA’s del suelo contaminado en fermentación sólida.
4.2.4. Determinar el efecto y niveles de remoción de HTP’s del suelo contaminado, mediante
lavados con soluciones de ácidos húmicos.
4.2.5. Evaluar el efecto de biotratar el suelo contaminado lavado con ácidos húmicos, en el
proceso de remoción de HTP’s y HPA’s en fermentación sólida.
40
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Suelo
Se utilizó un suelo proveniente del campo 10 perteneciente a la petroquímica Escolin, ubicada en el
municipio de Poza Rica, Veracruz, localizada en la zona central del estado a 20° 32" latitud norte y 97°
27" longitud oeste, a una altura de 50 metros sobre el nivel del mar. La zona pertenece a la región
hidrológica RH-27 "Tuxpan Nautla", que forma parte de las cuencas de los ríos Nautla, Tecolutla,
Cazones y Tuxpan además de la laguna de Tamihua. La zona se considera con un clima cálido, una
temperatura promedio de 24.2°C, su precipitación pluvial media anual es de 1,010mm y su humedad
relativa varía entre 76 y 80%. El suelo se obtuvo mediante una serie de muestras que se tomaron
desde una profundidad de 50 cm de diferentes puntos del sitio y posteriormente estas muestras se
secaron y mezclaron entre sí para tener una muestra representativa del suelo. El suelo fue
homogenizado, triturado y cribado en malla 25 para su caracterización.
5.2. Bagacillo de caña
Producto de desecho de un procesadora de hojas de papel (Kimberly-Clarck) del estado de Veracruz,
previamente precomposteada. El bagacillo de caña fue homogenizado y triturado para su
caracterización.
5.3. Vermicomposta
Producto de la vermicomposta de paja y estiércol bovino previamente precomposteados.
Proporcionada por el modulo de vermicompostaje del área de microbiología del Colegio de
Postgraduados del Departamento de Edafología. La vermicomposta fue homogenizada y cribada en
malla 10 para su caracterización.
41
5.4. Extracto de Leonardita (EL)
La leonardita son depósitos de un tipo de carbón suave usualmente encontrados en conjunto con
depósitos de lignita. La leonardita es el producto final del proceso de humificación a lo largo de 70
millones de años aproximadamente. Se empleo el producto comercial Humintech® Powhumus® el
cual es un acondicionador natural del suelo y bioestimulante de las plantas que contiene substancias
húmicas naturales incluyendo, ácidos húmicos y ácidos polihidroxicarboxílicos derivados de
Leonardita.
5.5. Lombriz
Eisenia andrei (Bouché 1972) con clitelio, proporcionada por el Dr. Ronald Ferrera Cerrato del Colegio
de Postgraduados del programa de postgrado en Edafología.
42
Fermentación Sólida
del Suelo
Caracterización del
suelo, bagacillo de
caña, vermicomposta
y leonardita
Selección de la fuente
de nitrógeno
Lavado de Suelo
Fermentación Sólida
del Suelo LavadoEmpleo de ácidos
húmicos
Tratamiento de
Lixiviados
5.6. Estrategia Experimental
La estrategia experimental estuvo dividida en seis etapas, como se indica en la Figura 8. El primer
bloque comprende la caracterización física, química y biológica del suelo, bagacillo de caña,
vermicomposta y extracto de leonardita. Posteriormente se llevó a cabo la selección de la fuente de
nitrógeno para la fermentación sólida, en función de la sobrevivencia de la lombriz; así mismo, se
establecieron las condiciones para el lavado de suelo empleando soluciones de ácidos húmicos. Una
vez seleccionada la fuente de nitrógeno, se llevó a cabo la fermentación sólida del suelo, previo a su
acondicionamiento de acuerdo a un diseño experimental indicado en la sección 5.6.3.2. El suelo
lavado, se acondicionó en función al mejor tratamiento obtenido en la fermentación sólida. Los
lixiviados fueron analizados para su posterior tratamiento.
Figura 8. Estrategia experimental para la remoción de HTP’s del suelo de Poza Rica, Veracruz.
43
Determinación Unidades Método Referencia S VC EL BC
Físicas
Humedad % Gravimétrico AS-05*
Capacidad de Retención de Agua % Gravimétrico AS-06*
Densidad % Gravimétrico AS-04*
Químicas
Materia orgánica % Oxidación de la
materia orgánica AS-07*
Carbono total % Oxidación del
carbono total
TOC-Vcsn
Shimadzu
Carbono orgánico % Oxidación del
carbono orgánico
TOC-Vcsn
Shimadzu
Carbono inorgánico %
Oxidación del
carbono inorgánico
TOC-Vcsn
Shimadzu
Nitrógeno Total % micro kjeldahl Fernández, 2006
Fósforo asimilable % Extracción del
fósforo disponible AS-10*
pH Potenciométrico AS-02*
Ácidos Húmicos % Extracción y
asilamiento IHSS
Ácidos Fúlvicos % Extracción y
asilamiento IHSS
HTP's mg/Kg de
suelo
Extracción por
sonicación EPA 3550b
Asfaltenos (Asf) mg/Kg de
suelo Extracción
ASTM D 6560-
00 (2005)
H. Libres de Asfaltenos (HLA)
H. Alifáticos (HA) % Fraccionamiento Fernández, 2006
H. Aromáticos (HAr) % Fraccionamiento Fernández, 2006
H. Policíclicos Aromáticos (HPA) % Fraccionamiento Fernández, 2006
Biológicas
Carbono de Biomasa % Irradiación-Extracción
Islam y Weil 1998
Bacterias UFC/g de muestra
Cuenta en placa Fernández, 2006
Actinomicetos UFC/g de
muestra Cuenta en placa Fernández, 2006
Levaduras UFC/g de muestra
Cuenta en placa Fernández, 2006
Bacterias hidrocarbonoclastas UFC/g de
muestra Cuenta en placa Fernández, 2006
Levaduras hidrocarbonoclastas UFC/g de
muestra Cuenta en placa Fernández, 2006
Hongos hidrocarbonoclastas UFC/g de
muestra Cuenta en placa Fernández, 2006
5.6.1. Caracterización del suelo contaminado, bagacillo de caña, extracto de leonardita y
vermicomposta
La caracterización de los elementos indicados anteriormente se llevó a cabo empleando los métodos
analíticos mostrados en la Tabla 9.
Tabla 9. Determinaciones analíticas aplicadas a: el suelo, vermicomposta, leonardita y bagacillo de caña.
*NOM-021-SEMARNAT-2000, S Suelo, VC Vermicomposta, EL Extracto de Leonardita, BC Bagacillo de caña
44
5.6.2. Selección de la fuente de nitrógeno y relación C/N
La metodología empleada se basó en las Normas de la Organisation for Economic Co-operation and
Development (OECD) test guidelines for the testing of chemicals: Earthworm, acute toxicity tests (207)
and Earthworm reproduction test (222). Se realizaron microcosmos con 100 gramos de suelo
adicionado con Sulfato de Amonio como fuente de nitrógeno y Fosfato Monobásico de Potasio como
fuente de fósforo, propuesta por diversos autores para propósitos de bioestimulación de suelos
contaminados (Atlas and Bartha, 1973; Espitia, 2002; Corona e Iturbide, 2005), hasta obtener una
relación C/N/P de 100/10/1 que corresponde a una relación C/N 10. Se probó además una relación
C/N/P de 100/4/1 que corresponde a una relación C/N 25, con la finalidad de que no ocurra ni
liberación ni inmovilización de nitrógeno disponible (Tisdale, 1993). A cada microcosmo se le
incorporaron 10 lombrices y la humedad se mantuvo a 60%.CRA-Suelo. El experimento se llevó a
cabo por duplicado.
45
5.6.3. Fermentación sólida del suelo contaminado
5.6.3.1. Dispositivo experimental
En un contenedor de 50×40×20 cm aprox., se elaboraron dos compartimientos de 20×30×20 cm
aprox. de malla 40 de plástico para retener el suelo del sistema y a las lombrices, alrededor de ellas
se colocó unicel de una pulgada de ancho, con la finalidad además de formar los dos tratamientos, de
aislarlos del frío y mantener una temperatura entre 15 y 20ºC. Se colocaron piedras de mármol en el
fondo de las cajas con la finalidad de evitar anaerobiosis en el fondo de los tratamientos, permitir flujo
de aire y evitar en lo posible que se formen colonias microbianas en la superficie de este soporte y
que pudieran interferir con los resultados (Figura 9).
Figura 9. Dispositivo experimental para llevar a cabo la fermentación sólida del suelo.
20cm
20cm
30cm
46
S/BC
S/EL 0
S/BC
S/EL 20
S/BC
S/EL 40
S/BC
N/EL 0
S/BC
N/EL 20
S/BC
N/EL 40
N/BC
S/EL 0
N/BC
S/EL 20
N/BC
S/EL 40
N/BC
N/EL 0
N/BC
N/EL 20
N/BC
N/EL 40
Número de Lombrices
0 20 40
Ex
tra
cto
de
Le
on
ard
ita
(EL
)
No
Si
Ex
tra
cto
de
Le
on
ard
ita
(EL
)
No
Si
Ba
ga
cil
lo d
e C
añ
a (B
C)
No
Si
5.6.3.2. Diseño experimental factorial general
Un Diseño Experimental Factorial General (DEFG), se empleó para evaluar los efectos de: Extracto de
Leonardita (EL) a dos niveles: 0%/1%; la presencia de bagacillo de caña (BC) a dos niveles: 0%/6%;
así como, la aplicación y actividad de lombrices (L) a tres niveles: 0/20/40; en la remoción de HTP’s
(Fig 10). Los tratamientos control fueron: a) suelo al 60% CRA, b) suelo al 60% de la CRA y
bioestimulado con vermicomposta (blanco del DEFG → N/BC, N/EL,0) y c) Bioestimulación con
Sulfato de Amonio y Fosfato Monobásico de Potasio hasta una relación C/N/P 100/4/1. Se
realizaron blancos estériles de ―a‖ y ―b‖.
Figura 10. Diseño Experimental Factorial General (S Si/Presencia; N No/Ausencia)
47
5.6.3.3. Acondicionamiento de los tratamientos
Se colocaron cuatro kilogramos de suelo contaminado en un mezclador de 100 Kg de capacidad,
marca Ortiz Conrado. Posteriormente dos litros de agua se adicionaron gradualmente hasta obtener
una mezcla homogénea con aproximadamente 60% de la capacidad de retención de agua (CRA). Se
adicionó 250 g de bagacillo de caña (alimento para la lombriz, texturizante y fuente de
microorganismos) cuando el tratamiento lo requería, este fue calculado de acuerdo al número máximo
de lombrices por tratamiento (40 lombrices) y la cantidad de alimento ingerido por lombriz por día
(anexo). Se mantuvo el pH en aproximadamente 7 y la temperatura del sistema alrededor de 20°C. La
humedad del suelo se mantuvo y monitoreó semanalmente empleando un medidor del contenido
volumétrico de agua presente en el suelo TDR 200 Fieldscout de Spectrum Technologies. Cada
semana se mezcló de forma manual todo el tratamiento, con la finalidad de homogenizar e incorporar
aire al sistema. Los tratamientos fueron analizados periódicamente para determinar remoción de
HTP’s, producción de ácidos húmicos (AH), crecimiento microbiano como carbono de biomasa (Cb) y
unidades formadoras de colonias (UFC). Así mismo, se llevó a cabo el fraccionamiento de los
hidrocarburos al inicio y al final del tratamiento, para ser analizarlos mediante cromatografía de gases.
48
5.6.4. Lavado de suelo con substancias húmicas
5.6.4.1. Diseño experimental factorial completo
Un Diseño Experimental Factorial Completo (DEFC) fue empleado para evaluar los efectos de la
relación EL(Extracto de Leonardita)/Agua/Suelo en la remoción de HTP’s. Con la finalidad de elegir las
mejores condiciones de remoción de HTP’s en el lavado estas 3 variables independientes fueron
consideradas a 3 niveles, que de acuerdo a los Diseños Factoriales corresponde a un diseño 33. La
Tabla 10 resume el diseño factorial.
Tabla 10. Factores y niveles usados en el diseño factorial 33
Cada tratamiento fue diseñado de la siguiente manera:
En frascos de 200 ml se adicionaron los componentes EL, suelo y agua de acuerdo al DEFC
de la Tabla 10.
A continuación se llevó a cabo el lavado, mediante agitación orbital a 200 rpm durante 24
horas.
Después la mezcla se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min.
El suelo lavado (precipitado) se secó a 40ºC durante 24 horas.
Por último se cuantificó HTP’s residuales y extraídos, del suelo lavado y el lixiviado
respectivamente; empleando el método EPA 3550b.
Factores Rango de los Niveles -1 0 1 X1 Extracto de Leonardita (g) 0.1 1 10 X2 Suelo (g) 5 10 15 X3 Agua (ml) 50 100 150
49
5.6.5. Fermentación sólida del suelo lavado
5.6.5.1. Acondicionamiento del suelo lavado
Cuatro kilogramos de suelo fueron lavados bajo las mejores condiciones determinadas en la sección
5.6.4.1. El suelo se seco, trituró, homogenizó y se acondicionó como se describió en la sección
5.6.3.3. A continuación se adicionó o no BC, EL y lombrices en función del mejor tratamiento obtenido
del DEFG de la sección 5.6.3.2.
5.6.6. Lixiviado
Al lixiviado obtenido se le analizó contenido de HTP’s, para poder tratarlo posteriormente.
5.6.7. Análisis estadístico
La evaluación de los resultados de los diseños experimentales del ensayo de remoción de
hidrocarburos del suelo contaminado en cultivo sólido, así como; el lavado de suelo contaminado con
soluciones de ácidos húmicos; se realizó mediante Design Expert (versión 6.0) con un nivel de
significancia del 95% (p<0.05).
50
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Caracterización del Suelo Contaminado
El suelo posee una concentración de materia orgánica media (6.1-10.9% para suelos volcánicos), así
como un contenido de fósforo disponible y nitrógeno bajos; menor a 15 mg/kg de suelo y menor a
10mg/Kg de suelo respectivamente, lo cual indica la necesidad de incorporar ambos nutrientes (Tabla
11). La baja disponibilidad de nitrógeno y fósforo puede ser causada por una relación C/N elevada,
debido a que bajo estas condiciones existe un consumo instantáneo de nitrógeno por los
microorganismos presentes en el suelo para generar biomasa, este fenómeno es conocido como
―robbing‖ (Gotaas, 1956). Se determinó una concentración elevada de carbono inorgánico por lo cual
se considera un suelo de tipo volcánico o calcáreo (NOM-021-SEMARNAT-2000); debido a que tiene
suficiente carbonato de calcio como para que haga efervescencia cuando se trata con una solución de
HCl al 10%, caso común de los suelos de tipo molisol.
De acuerdo con la NOM-021-SEMARNAT-2000 por el valor del pH, el suelo contaminado es
considerado neutro (pH 6.6 -7.3). En este caso el pH que presenta el suelo contaminado, presenta un
pH dentro del rango sugerido (6 a 8) para crecimiento microbiano (Alexander, 1994). El pH del suelo
juega un papel muy importante en el proceso de degradación. Su magnitud determina el tipo de flora
microbiana activa, la actividad enzimática, la disociación y solubilidad de moléculas de CO2, la
disponibilidad de nutrientes y la degradación de los contaminantes (Alexander, 1994).
La concentración de substancias húmicas fue de 1.6% (ácidos húmicos y ácidos fúlvicos) valor
considerado bajo debido a que el rango de substancias húmicas presentes en el suelo varía entre:
0-1.6% bajo, 1.6-3% medio y de 3% en adelante es alto de acuerdo a la clasificación propuesta por
Tan (2003). La concentración y tipo de substancias húmicas en el suelo está determinada por la
actividad microbiana, tipo de vegetación y temperatura entre otros. La temperatura determina el grado
de descomposición de la materia orgánica; así como, de las substancias húmicas, ya que en un clima
cálido como lo es el estado de Veracruz, la degradación de estas estructuras es más activa. Como el
51
suelo de Poza Rica ha estado contaminado por alrededor de 30 años relación C/N ≈ 76 es muy
elevada para propósitos de humificación, que implica una nula o lenta formación de ácidos húmicos.
Los ácidos húmicos obtenidos fueron de color gris (Figura 11), los cuales están asociados con los
suelos de tipo molisol.
Figura 11. Ácidos húmicos presentes en el suelo
El suelo presentó una concentración de hidrocarburos menor a la máxima recomendada en la Norma
Oficial Mexicana para propósitos de biorremediación <10%HTP’s (NOM-138-SEMARNAT/SS-2003).
La composición de hidrocarburos en términos de las fracciones de asfaltenos, alifática, aromática y
policíclica aromática se presenta en la Tabla 11. Se observa una alta concentración de las fracciones
asfáltica y policíclica aromática, ambos, considerados como recalcitrantes. Este suelo posee un valor
promedio de 35±1% de asfaltenos lo que indica un proceso de intemperización avanzado (Figura 12).
De acuerdo a la composición de hidrocarburos considerados como degradables, la máxima remoción
de hidrocarburos esperada sería del 65%. Muchos compuestos del petróleo, especialmente los
alcanos lineales, son conocidos por su fácil degradación. No obstante, su baja solubilidad en agua
puede limitar su transformación hasta su mineralización.
La intemperización podría afectar el proceso de biodegradación, por la adsorción/absorción de los
hidrocarburos a las partículas de suelo; así como, a la ausencia de hidrocarburos de fácil degradación.
52
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54
Figura 12. Asfaltenos (A) e hidrocarburos libres de asfaltenos (B), contenidos en el suelo.
El hidrocarburo libre de asfalteno se sometió a un análisis cromatográfico de gases, obteniéndose un
perfil cromatográfico con 130 señales, de las cuales 18 fueron identificadas como: Tolueno, Xileno,
C12, C14, Acenafteno, C16, Antraceno, C18, Fenantreno, C20, Fluoranteno, C22, C24, Criseno, C26,
C28, Benzo(a)pireno y C30, como se muestra en la Figura 13.
Figura 13. Perfil cromatográfico del hidrocarburo libre de asfaltenos del suelo contaminado sin biotratar.
A B
55
Figura 14. Perfil cromatográfico de los asfaltenos del suelo contaminado sin biotratar.
Los asfaltenos mostraron un perfil cromatográfico en su
mayoría, revelando compuestos con elevado peso
molecular (Figura 14). Estructuralmente los asfaltenos son
moléculas muy complejas que contienen cicloalcanos,
alcanos de cadenas largas, naftenos, pirenos, etc. (Martín-
Gila, 2007); lo cual se observa en el perfil cromatográfico
obtenido. La concentración de hidrocarburos considerados
potencialmente tóxicos, carcinogénicos y mutagénicos
como el Criseno y el Benzo(a)pireno se detectaron por
encima de la concentración máxima permitida por la NOM-
138-SEMARNAT/SS-2003. Estos datos revelan la
necesidad de remediar este suelo. Así mismo se
identificaron compuestos aromáticos, policíclicos
aromáticos e hidrocarburos de cadenas largas (C28), tanto
para los HTP’s como para los asfaltenos (Tabla 13).
Tabla 13. Hidrocarburos identificados en el
suelo contaminado
56
La población mínima requerida para llevar acabo procesos de biorremediación es de 103 UFC/gramo
de suelo (Providenti, 1993). De acuerdo a la Tabla 12, la población microbiana está dentro de este
parámetro. El sitio ha estado expuesto a la contaminación por varios años, induciendo la aclimatación
de algunos microorganismos hidrocarbonoclastas y la desaparición de los susceptibles. Esto puede
ser observado, por el contenido y variedad de microorganismos cultivados en caja petri (Figura 11).
Se ha reportado que bacterias, hongos, levaduras y actinomicetos, están implicados en la degradación
de hidrocarburos. No obstante, gran parte de la remoción ha sido realizada mediante consorcios y
actividad enzimática presente en algunos géneros de estos microorganismos.
Figura 15. Flora microbiana total asociada al suelo: bacterias (Agar nutritivo), actinomicetos (Agar czapeck) y levaduras (Agar
maltosa sabouraud) bajo una dilución 1×103.
La flora microbiana total asociada a este suelo no es muy variada (Figura 15); ya que, se observaron
no más de 3 cepas distintas en el caso de bacterias y levaduras; no obstante, su número es elevado
(UFC). Estos resultados podrían predecirse, dada la selección natural de la flora microbiana de los
suelos en presencia de algún agente xenobiótico. Ha sido reportado que solo sobrevivirán aquellas
cepas o aquellos microorganismos con capacidad de formar consorcios y que tengan la capacidad
enzimática para emplear los xenobióticos. La flora microbiana hidrocarbonoclasta es ligeramente
superior a la total (Tabla 12); sin embargo, es pobre en diversidad microbiana (Figura 15). Lo cual
indica que la mayor parte de los microorganismos presentes en el suelo es tolerante al contaminante.
Esta relación de floras microbianas indica un proceso de añejamiento e intemperización del suelo
contaminado.
57
Figura 16. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al suelo (Agar Mineral + queroseno, dilución 1×103).
6.2. Caracterización del Bagacillo de Caña
El bagacillo de caña con el que se trabajo ya ha pasado por el proceso de composteo natural, lo cual
permite que sea muy adsorbente como lo muestra su CRA ≈ 700% (Tabla 11). Al ser una fibra
orgánica ligera posee una densidad muy baja y posee un alto contenido de carbono orgánico
considerando que es prácticamente celulosa 41%, fibra 16% y lignina 21% (Alvarado 1989). El análisis
microbiológico mostró que posee una población y diversidad microbiana elevada (2×107 UFC), en
todos los niveles estudiados aún para microorganismos hidrocarbonoclastas (Tabla 12). Como se
puede observar, las bacterias hidrocarbonoclastas, son como en el caso del suelo, muy abundantes
debido a que existe una presión de selección por substrato; la flora asociada a el bagacillo de caña
debe de ser capaz de degradar lo componentes principales del bagacillo antes mencionados
(Alvarado 1989). Existen diversas enzimas involucradas en el rompimiento de estructuras ligninolíticas
como son la polifenol oxidasa, manganeso peroxidasa o lacasa, para el caso de los hongos o en
enzimas tipo oxigenasas en el caso de las bacterias. Esta actividad enzimática sugiere que los
microorganismos asociados al bagacillo de caña son capaces de consumir hidrocarburos alifáticos y
aromáticos.
58
6.3. Caracterización de la Vermicomposta
La vermicomposta, desecho metabólico de la digestión de la lombriz, no posee tanto carbono debido
al consumo de este por los microorganismos asociados. De acuerdo a la bibliografía, el pH cercano a
la neutralidad, contenido de nitrógeno y fósforo está dentro de los rangos descritos para el humus de
lombriz de acuerdo a Ferruzi (1994) como se observa en la Tabla 11. Una característica de la
vermicomposta es su alta cuenta microbiana y contenido de substancias húmicas, hecho que se
comprueba en los análisis realizados. Debido a que la vermicomposta posee un gran número de
nutrientes; entre los cuales figuran aminoácidos, vitaminas, azúcares, etc. (Ferruzi, 1994); posee una
elevada flora microbiana total muy diversa, con alrededor de 20 cepas distintas (Figura 17). Además
posee flora microbiana hidrocarbonoclasta (Tabla 12). La presencia de microorganismos
degradadores de hidrocarburos era de esperarse debido a la mezcla compleja de materia orgánica
transformada por este tipo de flora microbiana. En el presente estudio se utilizó vermicomposta
producida a partir de paja y estiércol bovino, previamente precomposteados. La paja al ser un
desecho agroindustrial al igual que el bagacillo de caña; poseen estructuras ligninolíticas y celulolíticas
que determinan la flora microbiana asociada. Como se indicó anteriormente el bagacillo de caña
posee microorganismos hidrocarbonoclastas, es probable que la paja también los posea, debido a que
está constituida por celulosa y lignina.
Figura 17. Flora microbiana total asociada a la vermicomposta: bacterias (Agar nutritivo), actinomicetos (Agar czapeck) y
levaduras (Agar maltosa sabouraud) bajo una dilución 1×103. Flora microbiana hidrocarbonoclasta, (Agar Mineral + queroseno,
dilución 1×103).
59
Por otro lado, durante el proceso de compostaje al cual fue sometido el estiércol bovino, diversos
microorganismos asociados a este fueron eliminados debido a las altas temperaturas generadas
durante el proceso (alrededor de 70ºC antes de estabilizarse la composta), dando como consecuencia
la presencia de microorganismos termofílicos y que pueden además estar involucrados en la
degradación de hidrocarburos.
Los ácidos húmicos y fúlvicos aislados de la vermicomposta, fueron de café oscuro y naranja/café,
respectivamente (Figura 18). El color café oscuro indica un grado de polimerización avanzado; en
tanto que el color naranja/café indica la presencia del ácido crénico (amarillo claro) y el ácido
apocrénico (amarillo-pardo) (Tan, 2003).
Figura 18. Ácidos húmicos y ácidos fúlvicos aislados de la vermicomposta.
6.4. Caracterización del Extracto de Leonardita
La Tabla 11 resume las características del extracto de leonardita del producto comercial PowHumus ®
de la empresa Humintech ®; a excepción de la flora microbiana analizada, los datos restantes fueron
proporcionados por la empresa Humintech. Como podemos observar la flora microbiana total asociada
es elevada no obstante su baja diversidad microbiana (Tabla 12). Esto podría indicar que las cepas
asociadas al extracto de leonardita están bien adaptadas a incorporar este material como fuente de
carbono, nitrógeno y energía, debido a su estructura molecular altamente recalcitrante. No obstante
los ácidos húmicos, poseen una estructura molecular diversa (Figura 19), conformada por péptidos,
oligosacáridos, quinonas, hidrocarburos, anillos aromáticos, etc.; que los hace adecuados para el
60
consumo microbiano en procesos co-metabólicos donde son reducidos u oxidados para consumir
diversas moléculas aledañas a estos (Tan, 2003). El extracto de leonardita posee además flora
microbiana hidrocarbonoclasta (Figura 20), que de acuerdo a lo mencionado con anterioridad acerca
de la gran diversidad estructural de su molécula, es de esperarse que si soporta actividad microbiana;
parte de esta, debe poseer la actividad enzimática capaz de interaccionar con moléculas altamente
recalcitrantes para emplearla como fuente de carbono y energía.
Figura 19. Estructura hipotética de los ácidos húmicos indicando las principales estructuras que la componen (Kleinhempel,
1970).
Figura 20. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al extracto de leonardita (Agar Mineral + queroseno, dilución 1×103).
61
6.5. Selección de la fuente de nitrógeno (en función de la sobrevivencia de la lombriz,
Eisenia andrei)
La adición de nitrógeno a través de sales como se indicó en la sección 5.6.2; mostraron efectos
tóxicos en las lombrices; ya que, éstas comenzaron a salirse de los microcosmos y a agruparse entre
sí o sobre restos de bagacillo de caña (Figura 20).
Figura 20. Lombriz Eisenia andrei en los microcosmos agrupándose debido a los efectos adversos del sustrato sólido.
Si las lombrices se enterraban manualmente resurgían a la superficie. Algunas murieron en
aproximadamente 1 hora. La cuenta de lombrices posterior a un tiempo de incubación de 1 hora,
mostró una mortalidad de 80%. La lombriz en contacto directo con el suelo contaminado permaneció
viva, es por ello que la adición de sales se consideró como un elemento tóxico para ésta.
La fuente de nitrógeno (Sulfato de Amonio) propuesta por diversos autores para propósitos de
bioestimulación de suelos contaminados (Atlas and Bartha, 1973; Espitia. 2002; Corona e Iturbide,
2005), provocó la muerte de la lombriz Eisenia andrei (Figura 21), con una de LD50 de 3g/kg. De
acuerdo a la bibliografía, se encontró que el Sulfato de Amonio es tóxico por encima de 2.8g/L en
ratones y por encima de 7.5g/l en bacterias (de acuerdo a la hoja de especificaciones de Merck). Al
probar otras fuentes de nitrógeno como: Nitrato de Sodio, Nitrato de Potasio y Urea; el resultado fue el
62
mismo. El suelo presentó un fuerte olor a amoniaco un día después de que se adicionó Sulfato de
Amonio (cantidad suficiente para obtener la relación C/N/P 100:10:1). Se consideró que la muerte
de la lombriz pudo ser por asfixia ya que respira por la piel. Entonces se procedió a disminuir la
cantidad de Sulfato de Amonio no obstante, las lombrices siguieron muriendo. Como fuente alternativa
de nitrógeno se utilizaron Nitratos; ya que, estos no presentan el proceso de descomposición y
amonificación. Con lo Nitratos se obtuvo el mismo resultado aun cuando el suelo no presentó olor
alguno a amoniaco. Posteriormente se optó por la adición de Urea. De acuerdo a la hoja de
seguridad, la urea no es tóxica para la micro y macroflora del suelo; no obstante concentraciones de
2g/kg de suelo provocó la muerte de la lombriz en un periodo de 5 días, aun cuando se adicionó para
una relación C/N de 25. Valor inferior al recomendado en literatura para propósitos de remediación de
suelos contaminados (C/N de 10). Dados estos resultados, finalmente se optó por utilizar la
vermicomposta disponible como fuente de nitrógeno. Su aplicación al suelo contaminado no mostró
efectos tóxicos. Esta se adicionó a manera de fijar una relación C/N de 25, valor que evita la liberación
e inmovilización del N disponible (Tisdale et al., 1993). Adicional al aporte de Nitrógeno, la
vermicomposta también sirvió como fuente de fósforo, por lo cual ninguna sal para proporcionar estos
elementos fue adicionada. La vermicomposta se adicionó en aproximadamente 16% por kilogramo de
suelo.
Figura 21. Lombriz Eisenia andrei
63
6.6. Fermentación Sólida del Suelo Contaminado
6.6.1. Remoción de HTP’s de acuerdo al DEFG planteado
El diseño experimental factorial general (DEFG) propuesto permitió determinar el efecto de las
variables independientes: bagacillo de caña, extracto de leonardita y lombrices (Eisenia andrei). Se
observan niveles de remoción en el rango de 15000 a 45000ppm, que corresponden a un 29 y 63% de
remoción respectivamente. El máximo nivel de remoción (63%) se obtuvo en el sistema conformado
por BC, EL y 40 lombrices. La línea punteada, indica el máximo nivel de remoción teórico debido al
contenido de 35% de la fracción asfáltica; es decir, 45500 mg HTP’s/Kg de suelo. El tratamiento
bioestimulado con EL (al 1%), BC (al 6%) y lombrices (40) produjo el porcentaje más alto del remoción
de HTP’s (63±1.5%). El rendimiento de este tratamiento fue 117% más, comparado con el tratamiento
control ―b‖ (remoción de HTP’s de 29±2.1%) y 385% más, si se compara con el tratamiento control ―a‖
(remoción de HTP’s de un 13±1.2%), al cual únicamente se le adicionó el 60% de la CRA. El peor
biotratamiento fue al que se le agregó solamente vermicomposta (VC); sin embargo, incluso su
resultado inferior, demuestra un mejor comportamiento si se compara con el tratamiento del control
(a). El funcionamiento relativamente bueno de la VC, se podría atribuir al cambio observado en la
textura del suelo contaminado y el posible aumento de la porosidad. La VC se utiliza generalmente
como fertilizante en el cultivo de cosechas debido a sus características nutrimentales (Ferruzzi, 1994);
se sugiere que tales características estimularon la actividad microbiana del suelo.
La Tabla 14 muestra un resumen condensado de los porcentajes de remoción alcanzados por los 12
tratamientos en un periodo de 94 días, incluyendo los 2 blanco adicionales y en la Figura 22 se
muestra a manera de resumen los HTP’s residuales. Como era de esperarse y en comparación con el
blanco ―b‖, la adición de BC y EL incrementa hasta un 59% los niveles de remoción HTP’s y el
tratamiento adicionado de BC, EL y 40 lombrices incrementa un 117% los niveles de remoción de
HTP’s. Si consideramos el blanco ―a‖, estamos hablando de un incremento del 385% en comparación
con el mejor tratamiento (BC, EL y 40 lombrices). Se obtiene un incremento del 174% de remoción en
comparación con el blanco ―c‖, cuando están presentes el BC, EL y 40 lombrices. La incorporación de
64
N/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 40 S/BC, N/EL, 40 S/BC, S/EL, 40 Suelo Lavado
Remoción HTP's 44 54 55 63 47
N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20 Blanco "a"
Remoción HTP's 36 48 48 56 13
N/BC, N/EL, 0 N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0 Blanco "c"
Blanco "b"
Remoción HTP's 29 40 37 46 23
N/BC S/BC
N/EL S/EL N/EL S/EL
vermicomposta incrementa hasta un 123% los niveles de remoción de HTP’s, respecto a blanco ―a‖, lo
cual nos indica la importancia de su presencia en los tratamientos.
Tabla 14. Porcentaje de remoción de HTP’s al termino del tratamiento (94 días), (S Si/Presencia; N No/Ausencia)
Blanco ―a‖ Suelo al 60% de la CRA-S
Blanco ―c‖ Suelo al 60% de la CRA-S; bioestimulado con sales minerales
Figura 22. Hidrocarburos totales del petróleo remanentes antes del tratamiento y después de éste.
65
N/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 40 S/BC, N/EL, 40 S/BC, S/EL, 40
0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095
1 semana 2.16 1.67 2.89 3.71
1 mes 0.88 0.7 1.29 1.22
2 meses 0.67 0.72 0.81 0.95
3 meses 0.46 0.57 0.57 0.67
N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20 Blanco (a)
0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095
1 semana 3.55 1.56 3.38 3.81 0.32
1 mes 0.81 0.77 1.03 1.21 0.2
2 meses 0.54 0.71 0.7 0.85 0.14
3 meses 0.37 0.51 0.5 0.58 0.14
N/BC, N/EL, 0
Blanco (b)
0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095
1 semana 1.03 0.9 2.76 3.42 0.27
1 mes 0.53 0.6 0.86 1.01 0.38
2 meses 0.38 0.65 0.54 0.65 0.25
3 meses 0.3 0.42 0.34 0.45 0.24
N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0 Blanco (c)
En la Tabla 15, se indica la evolución en la velocidad de remoción de HTP’s a lo largo de los 94 días
de tratamiento, observándose que todos los tratamientos estuvieron por encima de los indicados por
Bossert and Bartha, 1984; los cuales indican que entre 5000 – 10000 ppm HTP’s en suelos nativos la
velocidad de remoción esta alrededor de 0.08 a 1.38 mgHTP’s/cm3•día.
Tabla 15. Velocidad de remoción de HTP’s (mgHTP’s/cm3•día) durante el tratamiento (94 días), (S Si/Presencia; N
No/Ausencia).
Conversiones valor/1.43 = mgHTP’s/g•día; (valor×1000)/1.43 = mgHTP’s/día
66
6.6.1.1. Efecto del bagacillo de caña en la remoción de HTP’s
El bagacillo de caña se adicionó con la finalidad de nutrir a las lombrices y con la finalidad de evaluar
el efecto de su presencia en los tratamientos. No obstante, dadas sus propiedades este componente
probablemente impartió textura y porosidad extra al suelo.
La presencia del bagacillo de caña estimula la remoción de los hidrocarburos ya sea por:
la contribución de su elevada carga microbiana total e hidrocarbonoclasta como se demostró
durante la caracterización de este; a la cual seguramente están asociados diversos grupos
microbianos que secretan enzimas del tipo oxigenasas (ya que para poder sobrevivir en el
bagacillo de caña deben consumir celulosa y lignina; que a su vez son precursores de las
substancias húmicas) que tienen la capacidad de oxidar anillos aromáticos y estructuras
alifáticas para poder ser metabolizadas estas estructuras menos complejas.
el efecto texturizante que favorece la formación de poros o microporos de aire.
como una fuente más de alimento que permite un co-metabolismo del contaminante.
En la Figura 23, se observar que un 6% de bagacillo de caña adicionado al suelo, incrementó la
velocidad de remoción de HTP’s, desde 0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈3.4
mgHTP’s/cm3•día; durante la primera. Sin este componente (Figura 24) el incremento es de
0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈1 mgHTP’s/cm
3•día. Estas velocidades de remoción son
superiores a las reportadas por Bossert and Bartha (1984), de 0.095 a 1.38 mgHTP’s/cm3•día, no
obstante que la concentración inicial del contaminante fue mayor a la manejada por ellos de 5000 a
10000 ppm de HTP’s. El incremento en la velocidad de remoción permite que estos tratamientos
disminuyan el tiempo de tratamiento del suelo contaminado y por consiguiente se incremente la
eficiencia de remoción. Ya se ha reportado (Pandey, 2000), que la incorporación de bagacillo de caña
incrementa los niveles de remoción (dependiendo de la composición del tratamiento). En el presente
estudio los incrementos fueron en un 25 a un 33% ó dependiendo del tratamiento respecto al blanco
―b‖.
67
Figura 23. Efecto de la presencia de bagacillo de caña en la remoción de HTP’s, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)
Figura 24. Efecto de la ausencia de bagacillo de caña en la remoción de HTP’s, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)
68
6.6.1.2. Efecto del extracto de leonardita (ácidos húmicos) en la remoción de HTP’s
La adición de ácidos húmicos (AH’s) mediante el extracto de leonardita (EL) tuvo la finalidad de
determinar su efecto en la remoción de HTP’s. En las Figuras 26 y 27, podemos observar que la
adición de extracto de leonardita mejora la remoción de HTP’s, pero no de manera inmediata. Este
comportamiento puede sugerir que se está llevando a cabo interacciones del tipo fisicoquímicas sobre
las de tipo biológico. El investigador Nieman (1998) llevó a cabo estudios en los que demostró que el
pireno se unió más a los ácidos húmicos que a los ácidos fúlvicos en el proceso de humificación en un
suelo contaminado artificialmente. Una parte del contaminante fue adsorbida y/o absorbida de tal
manera que estos no fueron disponibles para los microorganismos como fuente de energía. Otro
estudio llevado a cabo por Feificova, et. al. (2005), demostró que la presencia de ácidos húmicos
mejora los niveles de remoción e incrementa la tolerancia a fenol y catecol. Estos autores reportan
que existe inhibición el crecimiento microbiano ligeramente, no obstante esto podría haber sido
provocado por la elevada interacción hidrofóbica de los ácidos húmicos con los HPA’s de acuerdo a lo
expuesto por Nieman. Estos experimentos sugieren que pudo existir la incorporación de hidrocarburos
aromáticos a los ácidos húmicos lo cual seguramente se llevó a cabo como se muestra en una
representación tridimensional en la Figura 25.
Figura 25. Representación tridimensional de los ácidos húmicos, en donde se observan restos de péptidos (A), oligosacáridos
(B) e interacciones con hidrocarburos aromáticos (C).
A
B
C
C
C
69
Figura 26. Efecto de la presencia de extracto de leonardita en la remoción de HTP’s, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)
Figura 27. Efecto de la ausencia de extracto de leonardita en la remoción de HTP’s, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)
70
Es por ello que se observa una fase de ―adaptación‖ en las cinéticas de remoción de HTP’s, lo cual
parece indicar que los microorganismos consumen el contaminante de manera gradual, por lo que los
niveles de remoción se ven favorecidos con el transcurso del tiempo.
La adición de ácidos húmicos tiene efectos similares a la adición de lombrices, pero a diferencia de
éstas, los ácidos húmicos pueden ser incorporados sobre grandes extensiones de suelo contaminado
aportando muchos beneficios atribuidos a los ácidos húmicos como: evitar la lixiviación y expansión
del contaminante, además de su bajo costo y abundancia en la tierra.
La incorporación de extracto de leonardita puede incrementar los niveles de remoción (dependiendo
de la composición del tratamiento), de un 23 a un 38% más dependiendo del tratamiento respecto al
blanco ―b‖, lo cual nos indica la importancia de la presencia de los ácidos húmicos.
La Figura 26 muestra que la adición de extracto de leonardita es un 1% incremento la velocidad de
remoción de HTP’s de 0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈1.7 mgHTP’s/cm
3•día en la primera
semana; mientras que la ausencia de este (Figura 27) solo incrementa de 0.095 mgHTP’s/cm3•día
(nivel basal) a ≈1 mgHTP’s/cm3•día. Estas velocidades de remoción son inferiores a las obtenidas
cuando está presente el bagacillo de caña, no obstante, al mismo tiempo son superiores a las
reportadas por Bossert and Bartha (1984); quienes han reportado incremento de 0.08 y 1.38
mgHTP’s/cm3•día en suelos intemperizados contaminados con 5000 a 10000ppm de HTP’s.
La flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al extracto de leonardita, pudo estar implicada en la
remoción del hidrocarburo; debido a que su única fuente de carbono y energía fue la estructura
altamente compleja de los ácidos húmicos; nos sugiere que estas deben de tener una amplia gama de
maquinarias enzimáticas capaces de degradar diversos tipos de estructuras aromáticas presentes en
éstas, además considerando que Lovley, et. al. (1996) demostró que los ácidos húmicos pueden ser
empleados como aceptores finales de electrones durante procesos aerobios o anaerobios en suelo
contaminado con HPA’s; estos pueden contribuir a la oxidación o reducción de los hidrocarburos
presentes; de esta manera favorecer la remoción más eficientemente ya sea debido a la flora
71
microbiana proporcionada por los ácidos húmicos o por el empleo de éstas por lo microorganismos
presentes en el suelo. Los ácidos húmicos contiene estructuras del tipo quinonas que están
involucradas en estos procesos de oxido reducción; Field and Cervantes (2005) demostraron la
interacción de microorganismos en reacciones REDOX empleando humus y quinonas relacionadas; lo
cual apoya nuestra suposición del efecto de los ácidos húmicos derivados del extracto de leonardita
en la remoción de HTP’s.
Estudios previos sobre el efecto de la incorporación de los AH’s en suelos contaminados con
hidrocarburos demostraron que estos mejoran la actividad microbiana (Mosley, 1998), incrementa la
retención de Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (HPA’s) (Soderstrom, 2000; Conte, 2001; Nieman
J. K. C., 2005), tienen actividad de tensioactivos (Guetzloff and Rice, 1994; Engebretson and
Wandrusrka, 1994; Wandruszka, 2000; Conte, 2005; Quagliotto et. al., 2006), etc. En estos
experimentos reportados la contaminación por hidrocarburos no superaba las 10000ppm, además de
que el tipo de hidrocarburo era ligero como aceites pesados o gasolinas; es decir, libre de la fracción
asfáltica. Es por ello que únicamente se trabajó con una concentración (1%) debido a que Mosley
(1998); indica que empleando concentraciones por encima o por debajo de este valor no se estimula
bien el crecimiento microbiano; sin embargo, Liem et. al. (2004) indica que el incremento de la
concentración de ácidos húmicos mejora la remoción de hidrocarburos.
En estudios previos llevados por nuestro grupo de trabajo (datos no mostrados), se observó que los
ácidos húmicos derivados del extracto de leonardita (sin modificaciones posteriores, como la
sulfonación para mejorar su solubilidad en agua), tienen la capacidad de ―solubilizar‖ la fracción ligera
de los HTP’s en la concentración presente en el suelo contaminado en estudio; empleando una
solución al 0.2% de EL; concentración mucho menor a la que se trabajo en los tratamientos. Se
emplean comillas para el término ―solubilizar‖, ya que se emplea en un sentido no convencional; lo
correcto sería decir que a partir de cierta concentración, las interacciones hidrófobas entre moléculas
de surfactantes se tornan suficientemente importantes respecto a las interacciones hidrofílicas
surfactante/agua para que se forme espontáneamente una asociación. Este conocimiento no ha sido
reportado en la literatura hasta lo mejor de nuestro conocimiento; es decir, para hidrocarburos totales
72
libres de asfalteno. Estos resultados nos indicaron la elevada probabilidad de interacción entre los
ácidos húmicos derivados de la leonardita y el contaminante a tratar.
Si al contaminante no se le remueven los asfaltenos la ―solubilización‖ se me muy disminuida.
Numerosos estudios indican la capacidad de los ácidos húmicos de interactuar con hidrocarburos
policíclicos aromáticos (Perminova, et al., 2006; Saparpakorn, Kim and Hannongbua, 2007). La
interacción comprende la incorporación de los HPA’s a su centro hidrofóbico al formar estructuras
semejantes a micelas o interaccionando con ellos mediante enlaces de tipo π (Kubicki and Apitz,
1999; Käcker, 2002; Wijnja, Pignatello and Malekani, 2004) (Figura 28); sin embargo, la mayoria de
ellos se enfocan a hidrocarburos policíclicos aromáticos modelo como el pireno y no en mezclas
complejas.
Figura 28. Modelo de interacción de los ácidos húmicos con xenobióticos. ( Wershaw, 1989; Engebretson and von Wandrusrka
1994; Perminova, 2005; Saparpakorn, Hyoun and Hannongbua 2007).
Los asfaltenos son moléculas polares y extremadamente compleja (Pineda and Mesta-Howard, 2001).
En forma natural usualmente se encuentran formando complejos con resinas y aceites (Subiaga and
73
Cuattrocchio, 2000). En la Figura 29, se muestra la composición de agregados de asfaltenos. La
complejidad de este tipo de estructuras dificulta la eficiencia de solubilización, aún con los ácidos
húmicos.
Figura 29. Estructura de los agregados de asfalteno y floculación de estos.
No obstante se ha considerado que una modificación estructural de los ácidos húmicos (AH’s) podría
incrementar la interacción AH’s-HPA’s descrita anteriormente e incluso permitir una mayor
biodisponibilidad (Perminova, et al., 2006). Los ácidos húmicos tienden a disminuir las cargas
positivas del suelo debidas a los iones sodio como se observa en la Figura 30, disminuyendo la
dureza y compactación del suelo (Tan, 2003). En el presente estudio la disminución de la resistencia a
la ruptura (dureza) registrada fue de 177.7Kg/cm2 a 33.3Kg/cm
2; es decir, 1/5 de la dureza inicial.
Figura 30. Efecto de la presencia de ácidos húmicos en los suelos compactos.
74
6.6.1.3. Efecto de la presencia de la lombriz (Eisenia andrei) en la remoción de HTP’s
Como era de esperarse entre mayor fuera el contenido de lombrices en los tratamientos, debería
mejorase el proceso de remoción de HTP’s, debido a los reportes del empleo de lombrices en suelos
contaminados con hidrocarburos (Singera, et al., 2001; Schaefera, 2005; Contreras-Ramos, 2006).
Estos resultados pueden ser debido a que las lombrices, durante el proceso de alimentación,
fragmentan los residuos, incrementan la actividad microbiana y los índices de descomposición y/o
mineralización de los residuos orgánicos, alteran las propiedades físicas y químicas de los materiales,
provocando un efecto de composteo o humificación mediante el cual la materia orgánica inestable es
oxidada y estabilizada. El producto final, comúnmente llamado vermicomposta (VC) es obtenido
conforme los residuos orgánicos pasan a través del intestino de la lombriz, y es bastante diferente al
material original (Atiyeh et al., 2000). Además, se ha demostrado que bajo la acción de las lombrices
se incrementa tanto la velocidad de mineralización del nitrógeno como los índices de conversión del
N-NH4+
a N-NO3-
(Atiyeh et al., 2002), lo cual contribuyen a mantener un ciclo del nitrógeno activo
mejorando los niveles de remoción de HTP’s.
Las Figuras 31, 32, 33 y 34 muestran que la presencia de un número creciente de individuos,
incrementa la velocidad de remoción de HTP’s durante la primera semana, incrementando de
0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈2.2 mgHTP’s/cm
3•día; mientras que la ausencia de estas solo
incrementa de 0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈1.1 mgHTP’s/cm
3•día. Estas velocidades de
remoción están por encima de las reportadas por Bossert and Bartha (1984); ya que indican que para
suelos contaminados con 5000 a 10000 ppm de HTP’s las velocidades de remoción oscilan entre 0.08
y 1.38 mgHTP’s/cm3•día.
La incorporación de lombrices y el numero de estas (20 40), puede incrementar los niveles de
remoción (dependiendo de la composición del tratamiento), de un 20 a un 52% más dependiendo del
tratamiento respecto al blanco ―b‖.
75
Figura 31. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)
Figura 32. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices y extracto de leonardita, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)
76
Figura 33. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices y bagacillo de caña, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)
Figura 34. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices, bagacillo de caña y extracto de leonardita, (S Si/Presencia; N
No/Ausencia)
77
Mientras los microorganismos son responsables de la degradación bioquímica de la materia orgánica
en el proceso de vermicomposteo, las lombrices acondicionan el sustrato y promueven la actividad
microbiana. Las lombrices podrían ser consideradas batidoras mecánicas ya que desintegran el
material orgánico, lo que incrementa el área superficial expuesta a los microorganismos y mueven los
fragmentos y los excrementos ricos en bacterias, en consecuencia homogenizan el material orgánico
(Domínguez et al., 2003). La bacterias Xanthomonas maltophilia ó Pseudomonas maltophilia son
especies de bacterias que residen en la cavidad coelomica de las lombrices, y por lo cual también
están fuertemente relacionadas con la vermicomposta. Estas bacterias han mostrado una eficiencia
elevada en la biorremediación de HPA’s (Lowry and Hurley, 2005) por lo que, la actividad de las
lombrices es considerada de tipo físico/mecánico y bioquímico. Los procesos mecánicos incluyen:
aeración del substrato, mezclado, y molienda. El proceso bioquímico es afectado por la
descomposición microbiana del substrato en el intestino de las lombrices (Buck et al., 2000).
Los resultados obtenidos indican que a mayor número de lombrices se mejora el nivel de remoción,
debido a que se incrementa el efecto de estas sobre el suelo. A pesar de los niveles de remoción
alcanzados, existió una pérdida dramática de peso de las lombrices. Al inicio del tratamiento las
lombrices pesaban alrededor de 0.4 g y después del tratamiento su peso disminuyó en alrededor de
un 70%. En aquellos tratamientos sin bagacillo de caña las lombrices perecieron en alrededor de dos
meses y medio. Algunos reportes indican que las lombrices pueden perder hasta un 50% de su peso,
después de no recibir alimento durante 64 días (Beyer, 1996). En este estudio la pérdida excesiva de
peso podría estar relacionada a la gradual eliminación de microorganismos, que son fuente de
nutrientes para ellas. Se observó que en presencia de bagacillo de caña, proliferaron bastante bien; ya
que, 10 lombrices al cabo de un mes generaron 30 cocones (datos no mostrados, Figura 35), por lo
tanto la dilución del alimento en el suelo y la presencia del contaminante pudieron provocar que la
lombriz tuviera que llevar a cabo una mayor ingesta de suelo más alimento, para cubrir sus
necesidades fisiológicas. Un mayor consumo de suelo por consiguiente estará asociado a una mayor
incorporación de tóxicos hacia el interior de la lombriz, provocando una intoxicación crónica que
gradualmente la llevara a la muerte. El los tratamientos que contenían ―VC, BC, EL, 40‖ y
―VC, EL, 40‖ se observaron nuevas lombrices (17 y 10 respectivamente), lo cual nos sugiere una
78
posible detoxificación del suelo ya que en los otros tratamientos no hubo reproducción. Es posible que
el incremento en el número de individuos permitiera un incremento en la remoción de aquellos
hidrocarburos presentes que eran tóxicos para las lombrices.
Figura 35. Cocón de la lombriz Eisenia andrei y lombrices recién nacidas
Pequeñas cantidades de HPA’s han sido encontradas en el tejido de la lombriz, cuando estos se
encuentra en el suelo. Se tiene el conocimiento de las lombrices acumulan contaminantes presentes
de su medioambiente y que esta acumulación no es solo por adsorción pasiva a través de la pared del
cuerpo de la lombriz, sino que también es durante el paso del suelo contaminado a través de su
intestino (Belford, 1998).
Contreras-Ramos (2006) al contaminar suelo con Fenantreno, Antraceno y Benzo(a)pireno con
alrededor de 500 mg/Kg de cada HPA en presencia de Eisenia foetida (especie muy emparentada con
Eisenia andrei); analizó el tejido de la lombriz y determinó concentraciones de alrededor de 0.1, 0.01
y 0.001 ppm del contaminante respectivamente; por lo que el nivel de adsorción de contaminantes por
la piel de la lombriz se considera bajo. Además la presencia de Eisenia foetida permitió obtener
niveles de remoción de estos contaminantes en alrededor de 99%, 91% y 61% respectivamente;
incrementando el nivel de remoción de estos compuestos al doble respecto al control. Estas
investigaciones presentan evidencia sobre el efecto que tiene la lombriz sobre algunos contaminantes;
sin embargo, las contaminaciones por TPH’s son mucho más complejas en cuanto a variedad de
contaminantes a remover.
79
6.6.1.4. Efecto de la vermicomposta en la remoción de HTP’s
Este efecto se observó en el sistema constituido por vermicomposta y agua al 60% de su CRA, el cual
corresponde al blanco ―b‖ (Figura 36). El nivel de remoción máximo fue de 29% en un tiempo de 94
días. Esta reportado que la vermicomposta mejora las características estructurales del terreno y
desliga suelos arcillosos. Por otra parte los agregados que posee, permiten obtener una gran área
superficial, que le permite adsorber y absorber fuertemente elementos nutritivos (Atiyeh, 2000), lo cual
presumiblemente favoreció la estimulación de la flora microbiana del suelo, capaz de consumir
hidrocarburos como fuente de carbono y/o energía. La presencia de flora microbiana
hidrocarbonoclasta presente en la vermicomposta (Tabla 12), pudo haber encontrado las condiciones
necesarias para sobrevivir en el suelo contaminado y desarrollarse, de esta manera contribuir a la
degradación del contaminante.
Figura 36. Efecto de la vermicomposta en la remoción de HTP’s.
80
6.6.1.5. Efecto de la humedad (blanco “a”) en la remoción de HTP’s
El blanco “a”, al solo poseer la humedad necesaria para mantener una actividad de agua adecuada
para el crecimiento de microorganismos de acuerdo con Smith, (1985); permitió un nivel de remoción
de un 13%, lo cual nos indica que existen muy pocos recursos nutricionales para llevar a cabo la
mineralización del contaminante; ya que, existe flora microbiana hidrocrabonoclasta considerable en el
suelo (7×106 UFC/g de suelo) como se comentó anteriormente, la población mínima requerida para
llevar acabo procesos de biorremediación es de 104 a 10
7 UFC/gramo de suelo. En las cinéticas de
remoción de HTP’s se observar una muy baja velocidad de remoción durante la primera semana y
durante el resto del periodo, incrementando de 0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈0.32
mgHTP’s/cm3•día; mientras que al final del tratamiento esta tiene una velocidad de solo 0.095
mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈0.14 mgHTP’s/cm
3•día. Estas velocidades de remoción a pesar de
ser demasiado bajas, están por encima de las reportadas por Bossert and Bartha (1984).
6.6.1.6. Efecto de la bioestimulación con sales minerales (blanco “c”) en la remoción de
HTP’s
El blanco “c”, debido a que contiene nutrientes en forma de sales minerales para obtener una
relación C/N 25 se obtuvo una remoción del 23%. Las sales minerales adicionadas, a pesar de su
rápida asimilación, pueden causar intoxicación en los ecosistemas debido a su concentración (Merck)
por lo que se ve disminuido o atenuado el proceso de remoción de HTP’s. Este efecto se pudo
apreciar cuando se realizaba la cuenta total; ya que, la flora microbiana del blanco (a) era más rica en
variedad de cepas que el blanco (c). Las velocidades de remoción también fueron bajas respecto a los
tratamientos del DEFG (Diseño experimental factorial general), llegando como máximo a un 0.27
mgHTP’s/cm3•día.
Los blancos estériles “a” y “c” removieron 3%, indicando que es muy necesaria la flora microbiana
del suelo.
81
día de inicio
disminución HC Totales HC teóricos removibles %R de los HC del tratamiento
eficiencia % R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos) (HC libres de Asfaltenos)
N/BC, N/EL, 0
Blanco (b)
N/BC, N/EL, 20 36 30 47 83
N/BC, N/EL, 40 44 41 63 93
S/BC, N/EL, 0 36 32 51 86
S/BC, N/EL, 20 44 44 67 91
S/BC, N/EL, 40 44 50 78 92
N/BC, S/EL, 0 44 33 50 82
N/BC, S/EL, 20 44 47 72 97
N/BC, S/EL, 40 44 44 68 82
S/BC, S/EL, 0 44 39 60 84
S/BC, S/EL, 20 63 54 83 97
S/BC, S/EL, 40 63 61 93 96
Blanco (a) 83 11 17 83
Blanco (c) 83 19 29 81
863022 19
6.6.2. Eficiencia de remoción de HTP’s en los diferentes tratamientos
Durante la evolución de remoción de HTP’s de los tratamientos, su eficiencia disminuyó a las pocas
semanas o se extendió a meses, si consideramos el porcentaje de remoción de hidrocarburos de cada
tratamiento de manera individual como 100% la eficiencia comenzó a disminuir a partir del día
indicado en la Tabla 16.
Tabla 16. Periodo de tiempo a partir del cual comenzó la disminución de la eficiencia de remoción para cada tratamiento.
El blanco ―b‖, parece que consume la mayor parte de sus nutrientes al día 22, por lo que su remoción
es lenta a los largo del tiempo de tratamiento, en comparación con el blanco ―a‖ y ―c‖ los cuales tardan
hasta cerca de 83 días en obtener alrededor de un 83% de remoción pero el tratamiento es muy lento.
El tratamiento compuesto por BC, EL y 40 lombrices es eficiente hasta el día 63 indicando que el
efecto de todas las variables involucradas mantiene activo a este sistema por un periodo prolongado
de tiempo; lo mismo ocurre con la mayoría de los tratamientos; sin embargo, algunos de ellos dejan de
ser eficientes a los 44 días posiblemente debido a la carencia de algún componente, lo que puede
llevar a un disminución de flora microbiana compleja o consorcio altamente degradador de
hidrocarburos.
82
HC Totales HC teóricos removibles
% R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos)
N/BC, N/EL, 0
Blanco (b)
N/BC, N/EL, 20 35 55
N/BC, N/EL, 40 43 68
S/BC, N/EL, 0 34 56
S/BC, N/EL, 20 48 73
S/BC, N/EL, 40 57 84
N/BC, S/EL, 0 42 61
N/BC, S/EL, 20 51 74
N/BC, S/EL, 40 57 84
S/BC, S/EL, 0 43 71
S/BC, S/EL, 20 58 86
S/BC, S/EL, 40 64 98
Blanco (a) 13 20
Blanco (c) 23 36
28 45
6.6.3. Niveles de remoción de HTP’s libres de la fracción de asfaltenos
Si a la concentración inicial de HTP’s de 69000ppm de los tratamientos, le restamos la fracción
recalcitrante representada por los asfaltenos (35%), la concentración teórica de HTP’s removible sería
de 44850ppm, los niveles de remoción se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17. Remoción de HTP’s con y sin asfaltenos
Se ha indicado la importancia de la presencia de cada uno de los componentes de los tratamientos y
el efecto que implicó su presencia; por lo que los resultados reflejan que se puede mejorar y disminuir
el tiempo de remoción de HTP’s de este suelo contaminado, a pesar de que estos resultados indican
que es posible la remoción hasta un 98% sin considerar la fracción de asfaltenos. Sin embargo,
independientemente de los resultados es necesario determinar la composición real o aproximada del
hidrocarburo remanente. Ya se ha indicado que los asfaltenos e inclusive diversos hidrocarburos como
los carbazoles, son estructuras altamente recalcitrantes (Pineda and Mesta-Howard, 2001), por lo que
no necesariamente un 98% de remoción de hidrocarburos libres de asfaltenos indican que se ha
removido totalmente y el hidrocarburo residual es únicamente asfalteno.
83
6.6.4. Remoción HTP’s a largo plazo (11 meses)
La Figura 37 presenta la concentración de HTP’s residuales para el mejor tratamiento (S/BC, S/EL, 40
lombrices) y algunos que contrastan en su composición; hasta el día 94 y posteriormente al día 330.
Figura 37. Remoción de HTP’s después de 11 meses de tratamiento, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)
Los análisis de HTP’s posteriores al día 330 para el mejor tratamiento no muestra diferencias
significativas; sin embargo, el tratamiento sin lombrices al cabo de 6 meses removió una
concentración similar demostrando la importancia de éstas. La ausencia de extracto de leonardita (EL)
incrementa casi 9 meses el proceso de tratamiento. La ausencia de BC, EL y lombrices conlleva a un
tiempo de tratamiento de alrededor de 11 meses. El blanco ―a‖ removió un 20% aproximadamente
después de 11 meses de tratamiento.
84
Estos resultados sugieren que no existen las condiciones nutricionales adecuadas para llevar a cabo
la remoción total del contaminante en algunos tratamientos. Se asume que la flora microbiana se
atenúa ó simplemente no se dispone de la maquinaria enzimática necesaria para poder continuar con
la remoción del hidrocarburo remanente dado su carácter excesivamente recalcitrante. La
comparación de los diferentes tratamientos refleja la capacidad de los diferentes sistemas para
remover HTP’s, no obstante solo uno de los tratamientos es altamente eficiente para realizar dicha
tarea en menor tiempo.
6.6.5. Remoción de asfalteno contenidos en la mezcla compleja de HTP’s
El análisis de los asfaltenos remantes se observa en la Tabla 18. Existen fracciones de la molécula de
asfalteno susceptibles a mineralizarse como las cadenas alifáticas laterales, posteriormente las
estructuras aromáticas y en mucho menor grado las estructuras policondensadas (Rontani et. al.
1985), por lo cual bajo las condiciones adecuadas es posible removerlos. Martín-Gila, et al. (2007)
determinaron parcialmente la composición de los asfaltenos identificando los siguientes hidrocarburos:
Alcanos (n-hexano; 2-metilpentano, C6H14; y fitano, C20H42); cicloalcanos o naftenos
(ciclopentano, C5H10; ciclohexano, C6H12 y metilciclopentano, C6H12); hidrocarburos aromáticos
(tetralino, C10H12; acenafteno, C12H10; y metilnafteno, C11H10) and policíclicos, como el pireno.
Otros sistemas sulfurados no de hidrocarburos como derivados tiol: etanotiol, C2H6S o
dimetilsulfuro, C2H6S; tiofeno, C4H4S and benzotiofeno C8H6S, los cuales se asume se
producen durante la degradación de los asfaltenos.
Compuestos nitrogenados como: 2-metilpiridina, C6H7N; quinolina, C9H7N e indol, C8H7N; y
compuestos que contienen oxígeno como: ácido esteárico, C18H36O2; ciclopentano ácido
carboxílico, C6H10O2; o fenol, C6H6O, han sido caracterizados.
85
Algunos de estos hidrocarburos fueron identificados en el sobrenadante muestras de asfaltenos
suspendidos en hexano. El análisis cromatográfico de estas muestras permitió observar hidrocarburos
de alto peso molecular (Figura 38).
Figura 38. Perfil cromatográfico de los asfaltenos.
La presencia de VC, EL, BC y 40 lombrices permitió obtener el mayor grado de remoción de
asfaltenos en un menor tiempo; sin embargo, los otros tratamientos también presentaron las
condiciones necesarias para llevar a cabo su remoción aunque en menor proporción y en un periodo
de tiempo mayor. Pineda and Mesta-Howard (2001) indican que se han reportado casos de niveles de
remoción de asfaltenos de entre 5 y 35%. Como se había indicado anteriormente, con el mejor
tratamiento (VC, EL, BC y 40 lombrices) se obtuvo 63% de remoción de HTP’s que corresponden a
24409ppm residuales, los cuales corresponden a un 98% de remoción de hidrocarburos teóricos
removibles, por lo que se puede suponer que el hidrocarburo restante sería únicamente asfalteno.
Como podemos observar en la Tabla 18, de los 24409ppm de HTP’s remantes de este tratamiento,
63.5% corresponden a asfaltenos y el resto a hidrocarburos degradables.
86
Suelo inicial HTP's Asfaltenos VC + EL + BC + L %R VC + EL + BC %R VC + EL %R VC %R
Tolueno* 163.4 * N/D N/D N/D N/D
Xileno* 46.1 N/D N/D N/D N/D
C12* 187.9 537.8 186 7.3 96 243.2 29 14.6 92
C14* 162.3 207.8 28 5.2 97 94.4 42 4.1 97
Acenafteno* 111.2 N/D N/D N/D N/D
C16* 173.1 N/D N/D N/D N/D
Antraceno* 182.2 N/D N/D N/D N/D
C18* 294.1 16.1 95 72.4 75 84.3 71 6.3 98
Fenantreno* 731.3 * N/D 45.2 94 N/D 3.6 99.5
C20* 780.4 * N/D N/D N/D N/D
Fluoranteno* 959.6 * N/D N/D 450.0 53 264.6 72
C22* 931.6 * N/D N/D N/D 144.9 84
C24* 1038.7 * N/D 403.5 61 611.6 41 444.2 57
Criseno* 569.3 * N/D N/D 63.3 89 N/D
C26* 1883.4 N/D 302.0 84 524.0 72 259.2 86
C28* 1255.7 * N/D N/D N/D N/D
Benzo(a)pireno* 703.5 * N/D N/D N/D N/D
C30* 181.1 N/D N/D N/D N/D
señales
cromatográficas 18 9 3 6 7 8
identificadas
señales
cromatográficas 130 30 28 37 48 40
totales
mg*/Kg de suelo
Tabla 18. Eficiencia de remoción de asfaltenos en los tratamientos seleccionados.
Tratamiento Días de
tratamiento
mg A*/Kg de
suelo
mg HCLA*/Kg de
suelo %A %HCLA
%Remoción de
A
VC 330 19800.83 12369.11 61.58 38.42 18
VC+EL 280 17948.34 7655.63 70.25 29.75 26
VC+EL+BC 180 17320.47 7638.63 69.39 30.61 28
VC+EL+BC+L 94 15505.9 8903.28 63.48 36.52 38
24500 mg A/Kg de suelo iniciales; *A: Asfaltenos; *HCLA: hidrocarburos libres de asfaltenos
El tipo y la cantidad de hidrocarburo presente en la fracción libre de asfalteno, se analizó mediante
cromatografía de gases. Los resultados se muestran en la Tabla 19.
Tabla 19. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales; así como, su porcentaje de remoción.
Concentración mínima detectada: 0.1 mg HTP’s/Kg de suelo; N/D: no detectado; %R: porcentaje de remoción
87
De acuerdo con los resultados obtenidos el mejor tratamiento (VC, BC, EL y 40 lombrices), permitió
reducir hasta concentraciones inferiores a 0.1mg HTP’s/Kg de suelo, los hidrocarburos Criseno y
Benzo(a)pireno considerados por la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 como hidrocarburos prioritarios
tóxicos. Las 25 señales cromatográficas no identificadas para este tratamiento indica la presencia de
hidrocarburos del tipo recalcitrante. La superposición de cromatogramas correspondientes a la
muestra de asfaltenos y el mejor tratamiento de HTP’s residuales extraídos al día 94, se presenta en
la Figura 39. De acuerdo a los perfiles mostrados, los hidrocarburos remanetes podrían ser los
presentes en las estructuras de los asfaltenos (Martín-Gila J., et al., 2007). La señal cromatográfica
observada a los 44.6 min no fue identificada; sin embargo, de acuerdo a los hidrocarburos presentes
ántes y despés de esta señal puede corresponder al pentacosano (C25). Este puede ser producto de
la degradación de hidrocraburos alifáticos de mayor peso molecular o producto de degradación de
algun hidrocarburo de alto peso molecular.
Figura 39. Perfiles cromatográficos del mejor tratamiento (BC, EL y 40 L) en comparación con los HTP’s iniciales y asfaltenos.
De acuerdo a los resultados de la Tabla 19, existió ―generación‖ de los hidrocarburos C12 y C14 para
este tratamiento, lo cual nos indica que pueden ser estos, producto de la degradación de los
hidrocarburos de cadena más larga o de la biosíntesis de hidrocarburos por las bacterias presentes en
el tratamiento. Rapp and Gabriel-Jürgens (2003) reportaron que el género Rhodococcus sp., tiene la
capacidad de degradar hidrocarburos alifáticos de 16 carbonos. Park, et.al. (2001, 2005) reportaron
que la bacteria Vibrio furnissii es capaz de sintetizar hidrocarburos de 14 a 27 carbonos. Todos los
88
tratamientos removieron Tolueno y Xileno presente en el hidrocarburo inicial; así como,
Benzo(a)pireno y Criseno con excepción del tratamiento con VC y EL (89%R) totalmente. Los niveles
máximos de HTP’s residuales permitidos reportados en la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 indica que,
todos los suelos biotratados pueden ser considerados para uso de suelo de tipo agrícola, forestal,
recreativo y de conservación; debido a que los hidrocarburos mencionados estan por debajo de la
norma. Los tratamientos que contiene VC y EL; así como, el blanco ―b‖ aún poseen remantes de
fluoranteno, a pesar de los 10 meses de tratamiento. La estructura molecular del fluoranteno es
relativamente compleja y probablemente es más difícil se asimilar para la flora microbiana presente en
estos tratamientos.
6.6.6. Fraccionamiento de los HTP’s residuales
La concentración de las cuatro fracciones del hidrocarburo, antes y después del mejor biotratamiento,
se muestra en la Figura 40. Se muestra que el porcentaje del retiro fue relacionado con la clase de
estructura del hidrocarburo. La composición de los hidrocarburos residuales sugiere que la continuidad
de los procesos de remoción podría ser posible solamente si los nutrientes requeridos están
disponibles. Interesantemente, los procesos del bioestimulación empleados aquí, removieron
hidrocarburos de peso molecular elevado y de estructura compleja (≈35%) contenidos en un suelo de
baja porosidad. Tales resultados fueron asociados al aumento de la porosidad del suelo, debido a la
adición de vermicomposta y el efecto de los ácidos húmicos; así como, al posible co-metabolismo
presente entre la diversa fuente de microorganismos agregados, de bagacillo de caña y las lombrices..
89
Figura 40.Fraccionamiento de los HTP’s residuales antes y después del tratamiento.
90
6.6.7. Análisis Estadístico de la Fermentación Sólida del Suelo
En la Tabla 20 se muestran los resultados obtenidos del nivel de remoción de HTP’s de los
tratamientos del DEFG (Diseño Experimental Factorial General).
Tabla 20. Porcentaje de remoción de HTP’s del DEFG.
BC (%) EL (%) L %R
0 0 0 29
6 0 0 37
0 1 0 40
6 1 0 46
0 0 20 36
6 0 20 48
0 1 20 48
6 1 20 56
0 0 40 44
6 0 40 55
0 1 40 54
6 1 40 63
Empleando el Programa Design Expert versión 7 se obtuvo el Análisis Estadístico de la remoción de
HTP’s obtenido del DEFG para la fermentación sólida del suelo, para ello se obtuvo un primer
diagnóstico de efectos principales que involucra la suma de cuadrados y el ―% de Contribución‖ que
mide la contribución porcentual de cada uno de los términos del modelo a la suma de cuadrados total
(Anexo A1). Debido a que el porcentaje de contribución es con frecuencia una guía aproximada pero
efectiva de la importancia relativa de cada término del modelo, se seleccionaron aquellos términos
cercanos al 1%. Posteriormente el ANDEVA (Anexo A2), indicó que todas las variables involucradas
en el modelo son significativas; sin embargo, las interacciones BC-EL y BC-L también son
significativas.
Debido a que las interacciones BC-EL y BC-L fueron significativas, estas se graficaron.
La interacción entre BC-L, indica que la presencia de BC mejora el nivel de remoción hasta en un
33%. La presencia de EL, mejora hasta en 38% la remoción de HTP’s, como se muestra en las
Figuras 41 y 42.
91
0
10
20
30
40
50
60
70
N/BC S/BC
%R
em
oci
ón
de
HTP
's
Interacción Bagazo de Caña (BC) - Lombrices (presencia de EL)
0 lombrices 20 lombrices 40 lombrices
0
10
20
30
40
50
60
70
N/BC S/BC
%R
em
oci
ón
de
HTP
's
Interacción Bagazo de Caña (BC) - Lombrices (ausencia de EL)
0 lombrices 20 lombrices 40 lombrices
Figura 41. Interacción BC-L en presencia de EL
Figura 42. Interacción BC-L en ausencia de EL
La interacción de BC-EL, indica que las lombrices y el número de individuos presentes incrementa
significativamente la remoción de HTP’s durante el tratamiento hasta en un 52%, como se muestra en
las gráficas 43, 44 y 45.
92
0
10
20
30
40
50
60
70
80
N/BC S/BC
%R
em
oci
ón
de
HTP
's
Título del eje
Interacción Bagazo de Caña (BC) - Extracto de Leonardita (EL) (0 lombrices)
S/EL N/EL
0
10
20
30
40
50
60
70
80
N/BC S/BC
%R
em
oci
ón
de
HTP
's
Título del eje
Interacción Bagazo de Caña (BC) - Extracto de Leonardita (EL) (20 lombrices)
S/EL N/EL
0
10
20
30
40
50
60
70
80
N/BC S/BC
%R
em
oci
ón
de
HTP
's
Título del eje
Interacción Bagazo de Caña (BC) - Extracto de Leonardita (EL) (40 lombrices)
S/EL N/EL
Figura 43. Interacción BC-EL
sin lombrices
Figura 44. Interacción BC-EL
en presencia de 20 lombrices
Figura 45. Interacción BC-EL
en presencia de 40 lombrices
93
6.6.8. Monitoreo de la población microbiana
6.6.8.1. Carbono de biomasa
Esta metodología permite analizar toda la biomasa viva contenida en la muestra; es decir, bacterias,
levaduras, hongos y actinomicetos. La Figura 46, muestra la tendencia de los resultados obtenidos
durante los 94 días de tratamiento.
Figura 46. Comportamiento del carbono de biomasa para los tratamientos del DEFG, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)
Se observa un incremento y disminución drástica de la biomasa microbiana durante el primer mes de
tratamiento, posiblemente debida a la actividad de agua presente durante el acondicionamiento de los
tratamientos al inicio del experimento, que permite un desarrollo momentáneo de la flora microbiana
presente. La repentina disminución sugiere una preselección de la flora microbiana debido a los altos
niveles del contaminante. Después de 44 días de tratamiento se observa una recuperación aparente
94
de la actividad microbiana, que sugiere el inicio de la detoxificación del suelo, provocando como
consecuencia el establecimiento y desarrollo de microorganismos hidrocarbonoclastas más
específicos y tolerantes. Al cabo de 60 días de tratamiento se observa una recuperación de la flora
microbiana lo cual sugiere una restauración de esta.
En los blancos ―a‖ y ―c‖, el carbono de biomasa (Cb) presenta un crecimiento durante las primeras
semanas (Figura 47); sin embargo, después de este tiempo no vuelve a incrementar
significativamente. Lo cual indica la atenuación de estos sistemas. El blanco ―c‖, corresponde al
tratamiento bioestimulado con sales minerales (sulfato de amonio, como fuente de nitrógeno). Podría
decirse que estos nutrientes son tóxicos a la flora microbiana nativa del suelo. En el caso del blanco
―a‖ se esperaba que la flora microbiana se mantuviera constante a lo largo del proceso dado que solo
se le adicionó agua y por lo tanto no se tienen las condiciones nutricionales adecuadas para llevar a
cabo la remoción del contaminante.
Figura 47. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos ―a‖ y ―c‖
95
6.6.8.2. Cuenta total para Bacterias
La cuenta bacteriana mostró una variación acorde a la composición de los tratamientos (Figura 48).
Los sistemas adicionados con BC, presentaron un incremento de bacterias totals entre 108 a 10
9; sin
embargo, se vio afectada la flora hidrocarbonoclasta. El mayor incremento se observó en los sistemas
que contenían adicionalmente EL y 40 lombrices (108 UFC/g de suelo). En todos los casos la flora
microbiana total fue mayor hasta un orden de magnitud (10 veces mayor) con relación a la
hidrocarbonoclasta. La relación flora microbiana total/flora microbiana hidrocarbonoclasta se vio
disminuida en los sistemas adicionados con EL. Solo en el sistema preparado con BC, EL y 40
lombrices, la relación de floras microbianas se aproximó a 1. Detalles del efecto de la composición de
los sistemas en el crecimiento bacteriano se describen a continuación.
Nota: Únicamente se presentarán los gráficos de aquellos tratamientos representativos en donde se
observe el efecto de cada variable (S ó N/BC, S ó N/EL y S ó N/40 lombrices), ya que se observó un
comportamiento similar para aquellos tratamientos con 20 lombrices.
En la Figura 48-A se observa que la ausencia de BC, EL y lombrices mantuvo prácticamente
constante a las bacterias totals; sin embargo existió una disminución de las hidrocarbonoclastas,
probablemente por ausencia de nutrientes, lo cual se ve reflejado en el carbono de biomasa después
de 15 días. Por otra parte, la presencia de lombrices estimula la actividad microbiana total y en menor
proporción la hidrocarbonoclasta, debido a las razones explicadas con anterioridad (Figura 48-B).
El extracto de leonardita incrementa la flora microbiana hidrocarbonoclasta (Figura 48-C), debido a
que se ha demostrado que los ácidos húmicos incrementan la tolerancia de bacterias y levaduras ante
hidrocarburos aromáticos, permitiendo que se desarrollen mejor (Feificova, et. al., 2005). Este efecto
se observa entre los días 30-50, ya que el carbono de la biomasa no cae drásticamente. La presencia
de BC no mejora el crecimiento heterótrofo e hidrocarbonoclasta, pero tampoco lo perjudica (Figura
48-D).
96
Figura 48. Efecto del BC, EL y L en las cinéticas de crecimiento de las bacterias
Hidrocarbonoclastas Totales Carbono de biomasa (Cb)
A B
C D
E F
G H
97
Cuando en el tratamiento está presente tanto el BC como las lombrices, se estimula el crecimiento de
la flora microbiana total e hidrocarbonoclasta, además no se ve disminuido el carbono de biomasa
durante un largo periodo, permitiendo así una restauración de la flora microbiana en menor tiempo. La
presencia de BC y EL (Figura 48-E), mejora la flora hidrocarbonoclasta y en general evita en gran
medida el descenso del carbono de biomasa, lo que nos indica los beneficios de los ácidos húmicos.
Cuando el tratamiento posee BC, EL y lombrices (Figura 48-F), la flora hidrocarbonoclasta se ve
favorecida a lo largo del tiempo y tiende a ser prácticamente equivalente a la total. Respecto al
carbono de biomasa éste disminuye poco respecto a su valor inicial. Se observa una rápida
recuperación de la flora microbiana lo que indica que se lleva a cabo una detoxificación rápida del
suelo contaminado.
Los blancos ―a‖ y ―c‖ (Figuras 48-G y 48-H), mantuvieron una concentración de microorganismos
constante a lo largo del tiempo del tratamiento. Debido a que el blanco ―a‖ únicamente tiene agua pero
no nutrientes necesarios para remover el hidrocarburo, la flora microbiana se mantuvo en un estado
basal, por otra parte el blanco ―c‖ al poseer nutrientes en forma de sales minerales, favoreció el
crecimiento al parecer de la flora total (datos no mostrados), pero no de la hidrocarbonoclasta. De
acuerdo a las hojas de especificaciones de Merck, el sulfato de amonio puede llegar a ser tóxico para
las bacterias, de hecho advierte sobre su incorporación a suelos y acuíferos.
98
6.6.8.3. Cuenta total para Levaduras
Las levaduras presentaron un comportamiento semejante a las bacterias (Figura 49); debemos de
tomar en cuenta que conforme transcurre el tiempo del tratamiento, se van llevando a cabo
adaptaciones y substituciones de la flora microbiana.
Como se observa las levaduras tendieron a mantenerse estables conforme transcurrió el tiempo lo
cual nos puede indicar que se adaptaron al contaminante, de hecho fueron identificadas algunas de
las cepas por nuestro grupo de trabajo como Candida tropicallis y Pichia sp., géneros identificados
como degradadores de hidrocarburos (Duursma, Dowson, 1983).
Se observó en general que la ausencia de BC, EL y lombrices; es decir, únicamente el sistema
bioestimulado con vermicomposta (Figura 49-A), no afectó negativamente el crecimiento microbiano;
de hecho, hubo un crecimiento considerable de las levaduras totals presentes pero no en el caso de
las hidrocarbonoclastas; lo cual sugiere que las levaduras se encontraban posiblemente es fase de
latencia esperando las condiciones favorables para reproducirse. Este comportamiento nos indica que
las levaduras presentes en el suelo, son capaces de tolerar periodos prolongados de sequia y
carencia de nutrientes, por lo que una caracterización de estas pueden ser de gran ayuda al realizar
bioaumentación en otros suelos semejantes.
La sola presencia de lombrices favorece a las levaduras totals (Figura 49-B), pero interfiere
gradualmente con las hidrocarbonoclastas, es posible que la flora microbiana asociada al intestino de
la lombriz compita con la flora microbiana nativa del suelo y la desplace gradualmente. La sola
presencia de EL (Figura 49-C), por otro lado favorece el crecimiento de la población de levaduras
como lo ha demostrado Feificova, (2005).
99
Figura 49. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de las levaduras
Hidrocarbonoclastas Totales Carbono de biomasa (Cb)
A B
C D
E F
100
La incorporación de BC en los tratamientos mantiene activo el crecimiento microbiano e incrementa la
flora total (Figura 49-D), posiblemente debido a la elevada cuenta microbiana natural que posee. Si al
tratamiento se adicionan lombrices (Figura 49-E), se mejora ambos tipos de floras microbianas, lo cual
sugiere que el efecto de mezclado, aireación, distribución de nutrientes y flora microbiana por la
lombriz actúa de manera sinérgica con la presencia de la flora microbiana asociada al BC.
El EL en conjunto con BC (Figura 49-F), mejoran el crecimiento de las levaduras y los mantuvieron
casi constantes a los largo del proceso, se observa claramente el efecto sobre las levaduras totals
propiciado por el BC. Si el BC, EL y las lombrices están presentes se observa un crecimiento máximo
de las levaduras totals, lo cual refleja el sinergismo de los componentes mencionados.
101
6.6.8.4. Cuenta total para Hongos
La Figura 50 muestra la cuenta de hongos en el curso del tiempo. En general la cuenta de hongos
totales e hidrocrabonoclastas se mantuvo en el rango de 104 y 10
5, respectivamente. El máximo
crecimiento detectado fue hasta 106. Se observa que los hongos presentes en los distintos sistemas
son en su mayoría hidrocrabonoclastas. Hacia el final del tiempo de tratamientos, el tipo de hongo que
predomina es el hidrocrabonoclasta. La diferencia de la cuenta total de hongos totales e
hidrocarbonoclastas, pueden ser ocasionada por el tipo de nutrientes empleados para llevar a cabo la
cuenta total.
La evolución de los hongos se vio favorecida con el transcurso del tiempo, la mayoría de los
tratamientos comenzaron a tener un incremento en la población microbiana a partir del primer mes,
algunos investigadores (Yateem et al., 1998; Mollea et al., 2005; Mancera at al., 2007) han
demostrado la capacidad de ciertos hongos como Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus,
Trametes versicolor, Rhizopus sp., Penicillium funiculosum y Aspergillus sydowii; de mineralizar HPA’s
y HTP’s.
El crecimiento de hongos en los tratamientos solo se vio favorecido al principio de los tratamientos,
posiblemente debido a la presencia de agua, ya que en general todos los tratamientos alcanzaron un
crecimiento alrededor de las 1,000,000 UFC/g suelo seco, al cabo de 2 meses de tratamiento; por lo
que la presencia o ausencia del BC, EL o las lombrices no tuvieron un efecto muy significativo en el
crecimiento de los hongos.
102
Figura 50. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de los hongos
Hidrocarbonoclastas Totales Carbono de biomasa (Cb)
A B
C D
E F
103
6.6.8.5. Cuenta total para Actinomicetos
Los actinomicetos se desarrollaron en gran medida en mayor proporción a partir del primer mes
(Figura 51). Su cuenta microbiana inicial y final se encuentra dentro de los rangos reportados por
Pizzul (2006), cuyo rango es de 105-10
6 UFC/gramo de suelo. Pérez-Armendáriz (2004) reporta una
concentración de entre 107-10
8 durante la remoción de hidrocarburo en suelo. Los actinomicetos como
Streptomyces, Nocardia, etc., son capaces de generar antibióticos para limitar el crecimiento
bacteriano desfavorable, lo cual puede tener efecto negativo en el crecimiento de bacterias y
levaduras; por lo que su crecimiento puede afectar a los microorganismos que los rodean.
Figura 51. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de los actinomicetos.
Desempeñan un papel importante en el reciclaje del carbón orgánico y pueden degradar los polímeros
complejos. Muchas cepas tienen la capacidad de solubilizar la lignina y de degradar compuestos
relacionados con la lignina; produciendo enzimas degradadoras de celulosa/hemicelulosa; así como
104
enzimas extracelulares tipo peroxidasas, por lo que también están involucrados en la formación de
substancias húmicas.
En general las condiciones óptimas para su crecimiento son temperaturas de 25-30°C y en pH neutro
(Pizzul, 2006). La temperatura promedio de los sistemas fue de 28ºC por lo que se pudo desarrollar
las condiciones necesarias para su reproducción. Los actinomicetos poseen muchas características
que les permiten ser buenos candidatos para su uso en el biotratamiento de suelos contaminados con
agentes orgánicos. Producen enzimas extracelulares que degradan una amplia gama de compuestos
orgánicos complejos y esporas que son resistentes a la desecación. Además, su crecimiento
filamentoso con frecuencia favorece la colonización de las partículas de suelo.
Otra característica interesante dentro de este grupo de microorganismos, especialmente con respecto
a la degradación de compuestos hidrofóbicos, es su producción de tensioactivos (Pizzul, 2006). En el
caso de los actinomicetos, la actividad de sus tensioactivos es debido: a) a la producción de los
biosurfactantes extracelulares, especialmente glicolípidos, como los lípidos del trealosa producidos por
la especie de Rhodococcus o lipopeptidos producidos por una especie de Arthrobacter. Muchos
actinomicetos pueden degradar diversos agentes contaminantes, incluyendo varios pesticidas. Por
ejemplo, los miembros del género Arthrobacter degradan el 4-clorofenol, la atrazina y alaclor por
Streptomyces.
Además los actinomicetos nocardioform (e.g. Rhodococcus, Gordonia, micobacteria) son
degradadores conocidos de hidrocarburos alifáticos e HPA’s en suelo (Piñero and Rivas, 2004).
Además, en algunos sitios contaminados representan un grupo dominante entre los degradadores
(Pizzul, 2006).
105
6.6.9. Correlación de la población microbiana hidrocarbonoclasta y la remoción de HTP’s
Cada una de las variables de estudio, afecta positivamente la flora microbiana hidrocarbonoclasta y
por lo tanto se ve reflejado en los niveles de remoción de HTP’s alcanzados por los diferentes
tratamientos (Figura 52). Como se observa en la Figura 52-A, la ausencia de BC, EL y lombrices,
provocó una pérdida de la flora hidrocarbonoclasta. Después de de la segunda semana, es posible
que los nutrientes aportados por la vermicomposta se hallan consumido rápidamente por lo que
durante las primeras semanas existió cierto nivel de remoción acelerado. Si el ciclo de nitrógeno no se
regenera de la manera adecuada, existe el denominado ―robbing‖ de nitrógeno (Gotaas, 1956), por lo
que los microorganismos ya no tienen suficiente nitrógeno para crecer y por lo tanto dejan de
consumir hidrocarburo.
Es posible que las lombrices con el paso del tiempo consuman la flora microbiana nativa, las cuales
no están es las mejores condiciones ambientales para reproducirse; por lo que la remoción se
favorece pero a largo tiempo. El EL al favorecer el crecimiento microbiano (Figura 52-B), permite que
estas actúen poco a poco sobre el contaminante permitiendo tolerar mejor los contaminantes
(Ferficova, 2005), es posible y de acuerdo a Nieman (1998) que parte de los hidrocarburos se hayan
incorporado a las substancias húmicas.
Cuando está presente el BC (Figura 52-C), se mejora el crecimiento de la flora microbiana
hidrocarbonoclasta durante las primeras semanas, pero estas después se atenúan indicando que
existe probablemente una sucesión microbiana o existe hidrocarburos más recalcitrante o tóxicos. La
presencia simultánea del BC y lombrices (Figura 52-D), ejercen un efecto sinérgico en la remoción de
hidrocarburos, lo cual se ve reflejado en un incremento en la remoción de HTP’s.
106
Figura 52. Correlación entre el crecimiento microbiano y la remoción de HTP’s, ante la presencia o ausencia de BC, EL y L
Hidrocarbonoclastas Remoción de HTP’s
A B
C D
E F
G H
107
El EL y el BC, permiten que la flora microbiana sea más activa durante todo el proceso (Figura 52-E),
lo cual nos indica por un lado que los ácidos húmicos, favorecen la remoción de los hidrocarburos ya
sea por efecto directo sobre la flora microbiana o por su acción fisicoquímica sobre estas moléculas; y
por otro lado la presencia de bagazo de caña al estimular la flora microbiana debido a las presencia de
su elevada flora microbiana hidrocarbonoclasta. Si además están presentes las lombrices se obtiene
las mejores condiciones para la remoción (Figura 52-F).
La ausencia del VC, BC, EL y lombrices (Figura 52-G); mantiene constante la flora microbiana nativa,
pero a pesar de esto, es probable que esta no sea lo suficientemente especializada como para llevar a
cabo la remoción; ya que, esta flora microbiana está presente desde tiempo atrás. Por lo tanto ésta ya
esta aclimatada a las condiciones del suelo, pero aún con la adición de nutrientes salinos
(Figura 52-H) no se mejora la remoción por lo que este suelo requirió la presencia de la flora
microbiana proporcionada el BC, EL y lombrices, para llevara a cabo la remediación del suelo.
108
6.6.10. Formación de ácidos húmicos
La formación y descomposición de ácidos húmicos (AH’s), se lleva a cabo de manera natural en los
suelos; sin embargo, la cantidad presente está influenciada por el tipo y cantidad de materia orgánica;
así como, de la flora microbiana presente. Se ha mencionado el rol de los AH’s a nivel biológico y
fisicoquímico en los procesos de remoción de HTP’s en los tratamientos; sin embargo, debemos de
tomar en cuenta la síntesis de éstos y su evolución a lo largo del tiempo, en cada tratamiento en
particular; ya sea, de los AH’s nativos o los adicionados de manera exógena.
Es imprescindible la síntesis de AH’s para que los sistemas funcionen mejor. Se ha demostrado que la
incorporación exógena de AH’s permite en general incrementar los niveles de remoción en función al
tipo de hidrocarburo presente (Mosley, 1998). Además permiten que se generen más AH’s en menor
tiempo, debido tal vez a que funcionan como céntros de nucleación, a partir de los cuales los
microorganismos presentes los emplean en reacciones redox (Field and Cervantes, 2005), pero a la
vez reaccionan con moléculas orgánicas presentes lo que contribuye a que se formen en mayor
cantidad y complejidad.
Las Figuras 53 y 54, indican cómo afectan positivamente las variables en estudio en la formación de
AH’s, durante el tiempo de tratamiento. La presencia de BC o las lombrices o ambos, incrementa
hasta en un 100% la síntesis, respecto a los AH’s nativos.
109
Figura 53. Síntesis de AH’s para los tratamientos sin EL del DEFG, a lo largo del proceso.
Figura 54. Síntesis de AH’s para los tratamientos con EL del DEFG, a lo largo del proceso.
110
6.6.11. Correlación de la formación de ácidos húmicos y la remoción de HTP’s
A pesar de que la VC incorpora una pequeña cantidad de AH’s (0.03%) parece no ser suficientes
como para incrementar los niveles basales de AH’s presentes en el suelo (0.5%) (Figura 55). La
presencia de lombrices incrementa la generación de AH’s, estudios llevados a cabo por Pramanik
(2007) en sistemas de vermicompostas empleando la lombriz Eisenia foetida, indican que existe
formación de AH’s aún cuando el alimento para la lombriz este desprovisto de estos. La diversa flora
microbiana asociada al intestino de la lombriz, puede ser la causante de su formación acelerada de
AH’s; ya que, en un sistema de composta su generación es casi la mitad. En el presente estudio el
incremento de AH’s puede estar relacionado a la remoción de HTP’s, ya que estos pueden
interaccionar con los hidrocarburos.
Se observó que en los tratamientos adicionados con BC (Figura 55-D), incremento la síntesis de AH’s
en un 25%. Los AH’s se generan a partir de restos de células animales, vegetales y bacterianas;
algunas hipótesis de su síntesis podría ser a partir de la lignina, que es un polisacárido presente en el
BC en un 20% aproximadamente, por lo que la presencia de éste puede propiciar la formación de más
AH’s. La presencia de lombrices pude incrementar un 60% la formación de AH’s (Figura 55-B). El
efecto combinado de la presencia de BC y lombrices puede incrementar hasta un 87% la generación
de AH’s. Los tratamientos adicionados únicamente con AH’s en forma de extracto de leonardita
(Figura 55-C), se incrementa la formación de estos y se mejora los niveles de remoción de HTP’s,
únicamente se adicionó 1% (40g por tratamiento) de AH’s a este tratamiento, por lo que la flora
microbiana hidrocarbonoclasta incorporada por estos, es muy baja en comparación, por ejemplo de la
VC que se adicionó alrededor de 600g o el BC con 250g. Se asume que los incrementos de HTP’s
removidos fue gracias a las interacciones de tipo fisicoquímico (Perminova, 2006; Saparpakorn 2007)
sobre los hidrocarburos presentes y el efecto de amortiguación ante condiciones adversas que
imparten estos (Mosley R. 1998). La Figura 55, indica el efecto sinérgico ocasionado por cada una de
las variables presentes en cada tratamiento en específico. La formación de ácidos húmicos se
mantuvo constante en el caso de los blancos ―a‖ y ―c‖ (alrededor de 0.5%), debido a que no existieron
las condiciones necesarias para poder sintetizarlos.
111
Figura 55. Correlación entre la formación de ácidos húmicos y la remoción de HTP’s, ante la presencia o ausencia de BC, EL y L
Ácidos Húmicos Remoción de HTP’s
A B
C D
E F
112
6.7. Lavado de suelo con substancias húmicas
6.7.1. Análisis Estadístico de la remoción HTP’s del suelo lavado
En la Tabla 21 se muestran los porcentajes de HTP’s removidos mediante lavado de suelos con
ácidos húmicos de acuerdo al diseño experimental planteado.
Tabla 21. Porcentaje de remoción de HTP’s del DEFC para el lavado de suelo.
EL (g) Suelo (g) Agua (ml) Concentración
del EL (g/L) %R
0.1 5.0 50.0 2.0 3.1
1.0 5.0 50.0 20.0 16.5
10.0 5.0 50.0 200.0 22.5
0.1 10.0 50.0 2.0 45.3
1.0 10.0 50.0 20.0 1.0
10.0 10.0 50.0 200.0 1.0
0.1 15.0 50.0 2.0 50.1
1.0 15.0 50.0 20.0 16.2
10.0 15.0 50.0 200.0 34.5
0.1 5.0 100.0 1.0 0.3
1.0 5.0 100.0 10.0 19.4
10.0 5.0 100.0 100.0 12.1
0.1 10.0 100.0 1.0 3.9
1.0 10.0 100.0 10.0 33.4
10.0 10.0 100.0 100.0 8.1
0.1 15.0 100.0 1.0 30.2
1.0 15.0 100.0 10.0 11.8
10.0 15.0 100.0 100.0 20.2
0.1 5.0 150.0 0.7 1.0
1.0 5.0 150.0 6.7 1.0
10.0 5.0 150.0 66.7 7.4
0.1 10.0 150.0 0.7 1.7
1.0 10.0 150.0 6.7 13.8
10.0 10.0 150.0 66.7 1.0
0.1 15.0 150.0 0.7 19.6
1.0 15.0 150.0 6.7 21.2
10.0 15.0 150.0 66.7 5.0
1.0 10.0 100.0 10.0 33.4
Para poder determinar si las variables en estudio son significativas estadísticamente y si tiene un
efecto significativo, se llevó a cabo el análisis estadístico.
113
Empleando el Programa Design Expert versión 7 se obtuvo el análisis de estadístico del experimento
del porcentaje de remoción de HTP’s después del lavado del suelo, para ello se obtuvo un primer
diagnóstico de efectos principales que involucra la suma de cuadrados y el ―% de Contribución‖ que
mide la contribución porcentual de cada uno de los términos del modelo a la suma de cuadrados total
(Anexo A3). De acuerdo al análisis de datos, se sugiere un modelo factorial 2FI. Posteriormente el
ANDEVA, indicó que todas las variables involucradas en el modelo son significativas; sin embargo, la
interacción EL-S fue significativa. A continuación se analizaron las graficas de interacciones, así como,
la de los residuales (Anexo A4).
Debido a que la interacción EL-S fue significativa, esta se graficó.
La interacción entre S-EL a niveles de concentración bajos; es decir, 2g/L permite obtener el mayor
nivel de remoción de HTP’s como se observa en las Figuras 56, 57 y 58.
Figura 56. Superficie de respuesta de la interacción S-EL, en presencia de 50ml de agua.
114
Figura 57. Superficie de respuesta de la interacción S-EL, en presencia de 100ml de agua.
Figura 58. Superficie de respuesta de la interacción S-EL, en presencia de 150ml de agua.
115
En este estudio se trabajaron concentraciones que van desde las 666ppm hasta las 200,000ppm.
Estas concentraciones se establecieron en base al trabajo realizado por (Conte, 2005; Quagliotto, et.
al., 2006), el cual es el trabajo más reciente que indica por primera vez que un surfactante natural no
tóxico como los ácidos húmicos (HA) aislados de leonardita, son capaces de remover cantidades
similares de hidrocarburos en suelos contaminados, tal y como lo hace un surfactante sintético. En
este trabajo se emplearon concentraciones de 10ppm basándose en el trabajo de Guetzloff and Rice,
1994., a pesar de que éste indica que los ácidos húmicos (de síntesis química de Aldrich) poseen la
capacidad de generar micelas y solubilizar DDT (hidrofóbico) a una concentración de 7.4g/L. Este
último artículo es cuestionado debido a que el empleo de la solubilidad como único factor para
determinar la concentración micelar crítica (CMC) puede ser cuestionado. Cuando se adiciona un
agente tensioactivo al agua, éste comienza a desplazar a las moléculas de agua, evitando su unión
mediante puentes de hidrógeno, dando como consecuencia una disminución de la tensión superficial.
La CMC es el punto en el cual la superficie del liquido (en este caso agua), se encuentra
completamente saturada del componente en estudio y la adición de una molécula mas de este
compuesto genera la formación de micelas con la capacidad de incorporar en su centro hidrofóbico
moléculas hidrofóbicas como los HPA’s (Wandruszka, 2000). Las pruebas hidrofóbicas tienden a
interaccionar con los núcleos aromáticos y complejos de los ácidos húmicos y por lo tanto los valores
de la CMC para un compuesto en específico depende de su solubilidad. Sin embargo existen otros
artículos que mencionan una CMC tan baja como 4mg/L Quagliotto, et. al. (2006).
6.7.2. Determinación de la Concentración Micelar Crítica (CMC) del EL en solución
Graficando la disminución de la tensión superficial contra la concentración del EL en solución, se
observa un comportamiento asintótico, del cual para poder determinar la CMC es necesario interpolar
este comportamiento y leer el valor obtenido en el eje de las abscisas (método empleado por diversos
investigadores como Salager, 1993; Wandruszka and Young, 2001; Liang, 2007). De acuerdo a los
resultados obtenidos se determinó la CMC del EL en 2g/L; este resultado estuvo de acuerdo al
obtenido mediante el DEFC planteado para el lavado de suelo contaminado. Por debajo de la CMC es
116
como si solo existiera agua en el tratamiento; sin embargo, por encima las micelas se deforman y
pierden sus cualidades de emulsificar moléculas hidrofóbicas; por esta razón al disminuir o
incrementar la concentración de EL en solución, se disminuyó la capacidad de ―disolver‖ el
hidrocarburo.
Se empleó un tensiómetro (LAUDA - TD1C), para determinar la Concentración Micelar Crítica (CMC)
del EL en solución obteniéndose el comportamiento que muestra la Figura 59.
Figura 59. Determinación de la CMC del EL.
De acuerdo al ANOVA del DEFC del lavado de suelo, en promedio se removió un 30% de HTP’s a
concentraciones de 2g/L de EL en una relación 10:1 (solución de ácidos húmicos:suelo); por lo tanto
está relación se empleó para llevar a cabo el lavado de 10Kg de suelo contaminado para llevar a cabo
la fermentación sólida del suelo lavado (se empleo una concentración de 3g/L, como medida de
seguridad). La Tabla 22, indica la cantidad de hidrocarburo removido durante el lavado de 10Kg de
suelo; así como, la cantidad de hidrocarburos en cada fracción que se obtuvo como consecuencia del
117
proceso. Se removió 35.7% de HTP’s, nivel semejante al obtenido en el diseño experimental,
planteado para el lavado de suelo con ácidos húmicos (DEFC).
Tabla 22. HTP’s removidos mediante lavado con ácidos húmicos.
Durante el proceso de lavado, las partículas de suelo de menor diámetro formaron una especie de
―emulsión‖ estable (favorecida por la presencia de ácidos húmicos), la cual solo pudo ser rota por
centrifugación, con lo cual se obtuvo un lodo. El análisis de HTP’s contenidos en esta especie de
―lodo‖ arrojó valores altos de HTP’s (30000 mg HTP’s/Kg de suelo).
El nivel de remoción está en función del tipo de contaminante, la intemperización y el tipo de
surfactante empleado. Estudios realizados por nuestro grupo de trabajo (datos no mostrados)
indicaron que los ácidos húmicos son capaces de ―solubilizar‖ 0.2g de hidrocarburo libre de asfalteno
de este suelo a una concentración de 0.2% de EL en un volumen de 50ml, en menor tiempo y con
mayor eficiencia que los surfactantes sintéticos SDS, Tritón X100 y Tergitol. Conte, et. al. (2005)
también empleó ácidos húmicos para remover una contaminación de 5000ppm de HPA’s en
comparación con SDS, Tritón X100 y agua; demostrando que los tres surfactantes remueven
cantidades semejantes de HPA’s (alrededor de 60%, siendo ligeramente mejor los ácidos húmicos).
Cho, et. al. (2002) realizó un estudio sobre la capacidad de los ácidos húmicos para mejorar la
biodisponibilidad de los HPA’s (naftaleno, fenantreno y pireno) en comparación con los surfactantes
sintéticos SDS y Tritón X100, indicando que los ácidos húmicos fueron más eficaces. Bhandari et. al.
(2000) quienes aplicaron Citrikleen ® para llevar a cabo el lavado de 20000ppm de diesel lograron
remover 65% de éste contaminante. Torres, et. al. (2005) contaminó suelo 100000ppm de petróleo del
Batab (Campeche, México), el cual fue lavado con SDS y E600 al 1%. Estos autores determinaron
niveles de remoción de 20.4-32.9%.
118
Balcke, et. al., (2005) ha demostrado que los ácidos húmicos pueden recubrir diversas partículas o
arcillas, debido a las diversas cargas que poseen (Figura 60). Esta propiedad es de interés para
aplicar los ácidos húmicos en la elaboración de soportes inertes para realizar biorremediación in-situ.
Figura 60. Posible interacción de los ácidos húmicos con las moléculas de suelo y HTP’s, que permitió la formación de un ―lodo‖
en el lixiviado.
119
6.8. Fermentación Sólida del Suelo Lavado
6.8.1. Remoción de HTP’s debido al lavado de suelo
El suelo lavado, se acondicionó de acuerdo al mejor tratamiento del DEFG de la fermentación sólida
del suelo: BC, EL y 40 lombrices. La cinética de HTP’s removidos se muestra en la Figura 61.
Figura 61. Cinética de remoción de HTP’s del suelo lavado en comparación con los blancos y el mejor tratamiento del DEFG.
Se puede apreciar que a pesar de que el proceso de lavado permitió remover 36% de HTP’s
(20000 mg HTP’s/Kg de suelo), el desempeño del biotratamiento es inferior. Se había considerado
que el lavado previo del suelo permitiría incrementar la eficiencia del biotratamiento y como
consecuencia disminuir el tiempo remoción del contaminante. No obstante, se asume que es posible
que se haya eliminado parte de la flora microbiana hidrocarbonoclasta; así como, nutrientes presentes
en el suelo. En este sistema nacieron 40 lombrices y no hubo muerte de las lombrices incorporadas
120
N/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 40 S/BC, N/EL, 40 S/BC, S/EL, 40 Suelo Lavado
0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095
1 semana 2.16 1.67 2.89 3.71 0.36
1 mes 0.88 0.7 1.29 1.22 0.32
2 meses 0.67 0.72 0.81 0.95 0.26
3 meses 0.46 0.57 0.57 0.67 0.2
N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20 Blanco (a)
0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095
1 semana 3.55 1.56 3.38 3.81 0.32
1 mes 0.81 0.77 1.03 1.21 0.2
2 meses 0.54 0.71 0.7 0.85 0.14
3 meses 0.37 0.51 0.5 0.58 0.14
N/BC, N/EL, 0
Blanco (b)
0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095
1 semana 1.03 0.9 2.76 3.42 0.27
1 mes 0.53 0.6 0.86 1.01 0.38
2 meses 0.38 0.65 0.54 0.65 0.25
3 meses 0.3 0.42 0.34 0.45 0.24
N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0 Blanco (c)
inicialmente, lo cual sugiere la eliminación de hidrocarburos tóxicos para está durante el proceso de
lavado; no obstante, hubo una dramática disminución en la velocidad de remoción.
En la Figura 61 se observar que el lavado de suelo provocó una fuerte disminución en la velocidad de
remoción de HTP’s durante la primera semana, incrementando de 0.092 mgHTP’s/cm3•día (nivel
basal) a solo ≈0.36 mgHTP’s/cm3•día. Estas velocidades de remoción están entre las reportadas por
Bossert and Bartha (1984); ya que indican que para suelos contaminados con 5000 a 10000 ppm de
HTP’s han determinado velocidades de remoción entre 0.08 y 1.38 mgHTP’s/cm3•día. En la Tabla 23,
se indica la evolución en la velocidad de remoción de HTP’s a lo largo de los 94 días de tratamiento.
Se observa que en todos los tratamientos la tasa de remoción fue superior a las reportadas por
Bossert and Bartha, 1984; a excepción de la obtenida con el suelo lavado. Este último valor es
prácticamente igual al obtenido con el blanco ―c‖ (bioestimulado con sales minerales). Este hecho
puede ser debido a que se removieron hidrocarburos más fácilmente asimilables.
Tabla 23. Velocidad de remoción de HTP’s (mgHTP’s/cm3•día) durante el tratamiento (94 días)
Conversiones valor/1.43 = mgHTP’s/g•día; (valor×1000)/1.43 = mgHTP’s/día
La Tabla 24 muestra un resumen condensado de los HTP’s residuales; así como, los porcentajes de
remoción alcanzados por los 12 tratamientos en un periodo de 94 días, incluyendo los 2 blanco
adicionales y el suelo lavado; en la Figura 62 se muestra a manera de resumen los HTP’s residuales.
Como era de esperarse y en comparación con el blanco ―b‖, el suelo lavado incremento en un 62% la
121
N/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 40 S/BC, N/EL, 40 S/BC, S/EL, 40 Suelo Lavado
Remoción HTP's 44 54 55 63 47
N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20 Blanco "a"
Remoción HTP's 36 48 48 56 13
N/BC, N/EL, 0 N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0 Blanco "c"
Blanco "b"
Remoción HTP's 29 40 37 46 23
remoción de HTP’s, un 260% en comparación con el blanco ―a‖ y un 100% con relación al blanco ―c‖.
A pesar de estos incrementos en los niveles de remoción y con relación a los tratamientos control, su
desempeño fue inferior debido a que removió 30% menos HTP’s que el mejor tratamiento del suelo sin
lavar. Realizar este tratamiento; aparte de ser más costoso, equivale a incorporar 40 lombrices
únicamente; EL y 40 lombrices; BC y 40 lombrices ó BC y EL, de los cuales el más económico y viable
sería la incorporación de BC y EL.
Tabla 24. Porcentaje de remoción de HTP’s al termino del tratamiento (94 días).
Blanco ―a‖ Suelo al 60% de la CRA-S
Blanco ―c‖ Suelo al 60% de la CRA-S; bioestimulado con sales minerales
Figura 62. Hidrocarburos totales del petróleo remanentes antes del tratamiento y después de éste.
122
día de inicio
disminución HC Totales HC teóricos removibles %R de los HC del tratamiento
eficiencia % R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos) (HC libres de Asfaltenos)
N/BC, N/EL, 0
Blanco (b)
N/BC, N/EL, 20 36 30 47 83
N/BC, N/EL, 40 44 41 63 93
S/BC, N/EL, 0 36 32 51 86
S/BC, N/EL, 20 44 44 67 91
S/BC, N/EL, 40 44 50 78 92
N/BC, S/EL, 0 44 33 50 82
N/BC, S/EL, 20 44 47 72 97
N/BC, S/EL, 40 44 44 68 82
S/BC, S/EL, 0 44 39 60 84
S/BC, S/EL, 20 63 54 83 97
S/BC, S/EL, 40 63 61 93 96
SL 63 46 70 95
Blanco (a) 83 11 17 83
Blanco (c) 83 19 29 81
863022 19
6.8.2. Eficiencia de remoción de HTP’s en los diferentes los tratamientos
La eficiencia de remoción de HTP’s disminuyó a las pocas semanas o se extendió a meses, si
consideramos el porcentaje de remoción de hidrocarburos de cada tratamiento de manera individual
como 100% la eficiencia comenzó a disminuir a partir del día ―x‖, como muestra la Tabla 25.
Tabla 25. Periodo de tiempo a partir del cual comenzó la disminución de la eficiencia de remoción para cada tratamiento.
El tratamiento del suelo lavado acondicionado con VC, BC, EL y 40 lombrices es eficiente hasta el día
63 indicando que el efecto de todas las variables involucradas mantiene activo a este sistema por un
periodo prolongado de tiempo; sin embargo, alrededor del día 44 se tiene un nivel de remoción del
80% de su tratamiento lo que nos indica que puede existir un rompimiento de una flora microbiana
compleja o consorcio altamente degradador de hidrocarburos de este tratamiento. La remoción para
este tratamiento es creciente a los largo de todo el proceso, pero muy lenta como se indico
anteriormente.
123
HC Totales HC teóricos removibles
% R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos)
N/BC, N/EL, 0
Blanco (b)
N/BC, N/EL, 20 35 55
N/BC, N/EL, 40 43 68
S/BC, N/EL, 0 34 56
S/BC, N/EL, 20 48 73
S/BC, N/EL, 40 57 84
N/BC, S/EL, 0 42 61
N/BC, S/EL, 20 51 74
N/BC, S/EL, 40 57 84
S/BC, S/EL, 0 43 71
S/BC, S/EL, 20 58 86
S/BC, S/EL, 40 64 98
SL 47 73
Blanco (a) 13 20
Blanco (c) 23 36
28 45
6.8.3. Niveles de remoción de HTP’s libres de la fracción de asfaltenos
Si a la concentración inicial de HTP’s de 69000ppm de los tratamientos, le restamos la fracción
recalcitrante representada por los asfaltenos (35%), la concentración teórica de HTP’s removible sería
de 44850ppm, los niveles de remoción se muestran en la Tabla 26.
Tabla 26. Niveles de remoción de HTP’s en función de la presencia de asfaltenos.
Se ha indicado la importancia de la presencia de cada uno de los componentes de los tratamientos y
el efecto que implicó su presencia; por lo que los resultados reflejan que se puede mejorar y disminuir
el tiempo de remoción de HTP’s de este suelo contaminado aún cuando este ha sido lavado, pero se
obtiene un 73% de remoción de la fracción libre de asfalteno. En este tratamiento los asfaltenos
remantes siguieron siendo unas 22400ppm, que son aproximadamente un 33% de asfaltenos en el
suelo contaminado lavado, lo cual demuestra que el lavado de suelo eliminó cierta flora microbiana,
hidrocarburos o nutrientes indispensables para llevar a cabo una remoción mayo de la fracción
asfáltica.
124
Suelo inicial HTP's Asfaltenos SL (ántes) %R SL (después) %R
Tolueno* 163.4 * 65.1 60 N/D
Xileno* 46.1 N/D N/D
C12* 187.9 193.7 3 N/D
C14* 162.3 70.1 57 N/D
Acenafteno* 111.2 N/D N/D
C16* 173.1 N/D N/D
Antraceno* 182.2 94.1 48 75.0 59
C18* 294.1 N/D 141.1 52
Fenantreno* 731.3 * 103.7 86 N/D
C20* 780.4 * N/D N/D
Fluoranteno* 959.6 * N/D 393.4 59
C22* 931.6 * N/D 589.5 37
C24* 1038.7 * 607.4 42 N/D
Criseno* 569.3 * N/D N/D
C26* 1883.4 1116.1 41 904.6 52
C28* 1255.7 * 272.8 78 210.0 83
Benzo(a)pireno* 703.5 * 558.3 21 N/D
C30* 181.1 N/D N/D
señales
cromatográficas 18 9 9 6
identificadas
señales
cromatográficas 130 30 80 40
totales
mg*/Kg de suelo
Para conocer el tipo y la cantidad de hidrocarburo presente en la fracción libre de asfalteno, las
muestras fueron analizadas mediante cromatografía de gases obteniéndose los resultados que se
muestran en la Tabla 27.
Tabla 27. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales, para el suelo lavado.
Concentración mínima detectada: 0.1 mg HTP’s/Kg de suelo; N/D: no detectado; %R: porcentaje de remoción
El proceso de lavado de suelo permitió eliminar Xileno, Acenafteno, Fluoranteno, Criseno; así como,
algunos hidrocarburos alifáticos de cadena larga, pero no del todo al Antraceno, Fenantreno y al
Benzo(a)pireno. Se ha indicado la capacidad que tiene los ácidos húmicos de ―solubilizar‖ los
hidrocarburos libres de la fracción asfáltica y como estos actúan sobre los HPA’s; por lo que se
esperaba que fueran capaces de interaccionar con algunas de estas moléculas; no obstante el nivel
125
de remoción del 36% de HTP’s se detectaron 80 señales cromatográficas no identificadas, que nos
indica que este suelo aún está muy contaminado.
Por otro lado, el nivel de remoción obtenido por el tratamiento de suelo lavado que contiene VC, BC,
EL y 40 lombrices después de la fermentación sólida, permitió eliminar por completo los hidrocarburos
Criseno y Benzo(a)pireno considerados por la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 como hidrocarburos
prioritarios tóxico. Aún existe la presencia de 40 señales cromatográficas no identificadas para este
tratamiento lo que indica que aún existen diversos hidrocarburos recalcitrantes. Aun existe la
presencia de Antraceno y Fluoranteno, los cuales son hidrocarburos carninogénicos, aunque en
menor concentración; así como, la presencia de hidrocarburos alifáticos de cadena larga debido
posiblemente como consecuencia de la degradación de hidrocarburos más complejos. Los perfiles
cromatograficos superpuestos de este tratamiento, de los asfaltenos y de los HTP’s inciales
(Figura 63), indican que los hidrocarburos remantes pueden ser muy semejantes a los encontrados en
los asfaltenos, si consideramos la degradación de estos; ya que, pueden liberar hidrocarburos muy
diversos (Martín-Gila et al., 2007). Se observa una señal cromatográfica a los 44.6min muy elevada la
cual no fue identificada; sin embargo, de acuerdo a los hidrocarburos presentes ántes y despés de
esta señal puede corresponder al pentacosano (C25).
Figura 63. Perfil cromatográfico del tratamiento del suelo lavado acondicionado con VC, BC, EL y 40 lombrices en comparación
con la muestra inicial y los asfaltenos.
126
Esta ―generación‖ de hidrocarburos de cadena larga en comparación con el suelo lavado pueden tener
un origen natural, más que de origen antropogénico. Duursma and Dowson, (1983), nos indica que
pueden ser producto de biosíntesis de hidrocarburos por las bacterias presentes en el tratamiento ya
que estas pueden producir hidrocarburos alifáticos con cadenas de entre 13 y 31 carbonos. Conforme
a la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003, el tratamiento del suelo lavado se pueden considerar para su
uso de suelo de tipo agrícola, forestal, recreativo y de conservación; debido a que los hidrocarburos
mencionados estan por debajo de la norma.
6.8.4. Fraccionamiento de los HTP’s residuales
El proceso de lavado permitió remover cerca del 60% y 30% de la fracción alifática y aromática
respectivamente (Figura 64). De acuerdo a experimentos previos, realizados por el grupo de trabajo;
se observó la capacidad de los ácidos húmicos, de ―solubilizar‖ a los hidrocraburos libres de
asfaltenos provenientes de este suelo contaminado. De acuerdo a las propiedades fisicoquímicas de
los ácidos húmicos se esperaba que durante el proceso de lavado, estos tuvieran cierto grado de
interacción del contaminante. Se nota una fuerte interacción sobre hidrocraburos de cadena lineal
sobre los aromáticos.
La concentración de las cuatro fracciones del hidrocarburo, antes y después del mejor biotratamiento,
se muestra en la Figura 65. Se muestra que el porcentaje del retiro fue relacionado con la clase de
estructura del hidrocarburo. La composición de los hidrocarburos residuales sugiere que la continuidad
de los procesos de remoción podría ser posible solamente si los nutrientes requeridos están
disponibles. Interesantemente, los procesos del bioestimulación empleados aquí, removieron
hidrocarburos de peso molecular elevado y de estructura compleja (≈ 35%) contenidos en un suelo de
baja porosidad. Tales resultados fueron asociados al aumento de la porosidad del suelo, debido a la
adición de vermicomposta y el efecto de los ácidos húmicos; así como, al posible co-metabolismo
presente entre la diversa fuente de microorganismos agregados, de bagacillo de caña y las lombrices.
127
Figura 64. Fraccionamiento de los HTP’s del suelo lavado antes y después del biotratamiento.
Figura 65. Fraccionamiento de los HTP’s del suelo lavado biotratado y el mejor biotratamiento del suelo sin lavar.
128
6.8.5. Monitoreo de la población microbiana
6.8.5.1. Carbono de biomasa (Cb)
La Figura 66, muestra la tendencia de los resultados obtenidos durante los 94 días de tratamiento.
Figura 66. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos y el suelo lavado.
El suelo lavado presentó un comportamiento muy similar a los obtenidos para la fermentación sólida
del suelo sin lavar del DEFG (Diseño experimental factorial general), a pesar de que mostró
incremento el carbono de biomasa significativo durante las primeras semanas no se recuperó después
de los 20 días de tratamiento, indicando que la flora microbiana presente fue muy pobre ó los
microorganismos indispensables que formaban parte de consorcios fueron eliminados durante el
proceso de lavado.
129
6.8.5.2. Cuenta total para Bacterias y Carbono de biomasa (Cb)
La flora hidrocarbonoclasta total con el tiempo fue disminuyendo (Figura 67), lo cual se ve reflejado en
el carbono de biomasa, como consecuencia de este descenso el nivel de remoción de HTP’s fue muy
lento y muy pobre (Figura 68).
Figura 67. Efecto del lavado de suelo en las bacterias del tratamiento.
Figura 68. Efecto del lavado de suelo en el nivel de remoción de HTP’s.
130
6.9. Tratamiento del Lixiviado
Este lixiviado presentó la formación de una capa grasosa y viscosa, lo que sugiere la formación de
una biopelícula de microorganismos y la presencia de hidrocarburos en su superficie (Figura 69). Este
fue tratado inyectándole aire para favorecer la remoción de los hidrocarburos remanentes. Como se
indicó anteriormente el lixiviado tuvo una concentración de 3000ppm.
Figura 69. Lixiviado del proceso de lavado.
Para conocer el tipo y la cantidad de hidrocarburo presente en el lixiviado, las muestras fueron
analizadas mediante cromatografía de gases obteniéndose los resultados que se muestran en la
Tabla 28. Únicamente se detectaron los hidrocarburos Fluoranteno, C24 y C26, los cuales se
encontraban en mayor concentración en el suelo antes del tratamiento. Debido a la dilución que hubo
sobre el contaminante del suelo durante el proceso de lavado (100 litros de solución de ácidos
húmicos: 10 kilogramos de suelo contaminado) por lo que es posible que los hidrocarburos
monitoreados no se hayan detectado. Después del tratamiento del lixiviado, no se detectaron los
hidrocarburos monitoreados. No obstante se detectaron 6 señales cromatográficas, lo cual sugiere
que sean hidrocarburos recalcitrantes. La concentración final de hidrocarburos en la muestra fue de
250ppm.
131
Suelo inicial HTP's Asfaltenos SN (ántes) %R SN (después) %R
Tolueno* 163.4 * N/D N/D
Xileno* 46.1 N/D N/D
C12* 187.9 N/D N/D
C14* 162.3 N/D N/D
Acenafteno* 111.2 N/D N/D
C16* 173.1 N/D N/D
Antraceno* 182.2 N/D N/D
C18* 294.1 N/D N/D
Fenantreno* 731.3 * N/D N/D
C20* 780.4 * N/D N/D
Fluoranteno* 959.6 * 270.8 72 N/D
C22* 931.6 * N/D N/D
C24* 1038.7 * 553.4 47 N/D
Criseno* 569.3 * N/D N/D
C26* 1883.4 781.8 58 N/D
C28* 1255.7 * N/D N/D
Benzo(a)pireno* 703.5 * N/D N/D
C30* 181.1 N/D N/D
señales
cromatográficas 18 9 3 0
identificadas
señales
cromatográficas 130 30 31 6
totales
mg*/Kg de suelo
Tabla 28. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales, para el lixiviado
Concentración mínima detectada: 0.1 mg HTP’s/Kg de suelo; N/D: no detectado; %R: porcentaje de remoción
La Figura 70, muestra los perfiles cromatográficos obtenidos de lixiviado antes y después del
tratamiento. El lixiviado tratado no mostró casi hidrocarburos. Lo cual sugiere que durante el proceso
de lavado, se incorporaron microorganismos hidrocarbonoclastas contenidos en el suelo e el lixiviado,
lo que permitió remover los hidrocarburos
132
Figura 70. Perfil cromatográfico del lixiviado antes (A) y después (B) del tratamiento.
133
7. CONCLUSIONES
Caracterización de los materiales
Todos los materiales empleados presentaron crecimiento microbiano hidrocarbonoclasta, lo
cual indica que cada material puedo contribuir a la remoción de HTP’s del suelo contaminado.
Selección de la fuente de nitrógeno
La lombriz Eisenia andrei, no sobrevive a la relación C/N: 10 ó 25, adicionando sulfato de
amonio, nitrato de sodio, nitrato de potasio o urea, como fuente de nitrógeno, propuesta para
la remoción de hidrocarburos de este suelo.
Fermentación sólida del suelo
Se obtuvo un 63% de remoción de HTP’s con el tratamiento adicionado con BC, EL y 40
lombrices, en un periodo no mayor a 3 meses.
Se removieron los hidrocarburos alifáticos en un 85.5%, los policíclicos aromáticos en un
78.4%, los saturados en un 73.2%y los asfaltenos en un 35.8%; con el tratamiento adicionado
con BC, EL y 40 lombrices.
El empleo de VC como bioestimulante, permite una remoción del 23% de HTP’s.
La presencia de Bagacillo de caña y Extracto de Leonardita en los tratamientos, mejora la
remoción de hidrocarburos e incrementa la actividad de la flora microbiana.
Los niveles de remoción de hidrocarburos se ven favorecidos ante la presencia de la lombriz y
mejora con el número de individuos presentes en presencia de alimento.
134
Lavado de suelo con ácidos húmicos
Se removió un 35.7% de HTP’s mediante el proceso del lavado con ácidos húmicos (Con una
concentración de 2g/L de Extracto de Leonardita), 65% del total de hidrocarburos extraíbles
del suelo.
Fermentación sólida del suelo lavado
Se obtuvo un 47% de remoción de HTP’s con el tratamiento adicionado con BC, EL y 40
lombrices, en un periodo no mayor a 3 meses.
Se removieron los hidrocarburos alifáticos en un 69.9%, los policíclicos aromáticos en un
64.3%, los saturados en un 52.6%y los asfaltenos en un 15.7%; con el tratamiento adicionado
con BC, EL y 40 lombrices.
La velocidad de remoción de HTP’s se ve seriamente afectada por el proceso de lavado,,
siendo 10 veces menor que el mejor biotratamiento de suelo sin lavar, bajo las mismas
condiciones.
135
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http://www.epa.gov/tio/remed.htm.
http://www.bp.com
http://www.frtr.gov/matrix2/top_page.html
153
9. ANEXO
A1. Porcentaje de contribución de los términos del DEFG al modelo.
Término Suma Cuadrados % Contribución Términos implicados en el Modelo (M)
o como parte del error (e)
A-BC 243 23 M
B-EL 280 27 M
C-L 515 49 M
AB 5 1 M
AC 6 1 M
BC 1 0 e
ABC 1 0 e
Residuales 0
A2. Análisis de varianza de los efectos seleccionados como principales contribuyentes del
análisis estadístico del DEFG.
ANDEVA para el modelo factorial seleccionado cuadrático Tabla de análisis de varianza
Suma de
Significado de los F p-valor
Cuadrados g.l. Cuadrados Valor Prob > F
Modelo 1049.3 7.0 149.9 449.7 < 0.0001 significantivo
A-BC 243.0 1.0 243.0 729.0 < 0.0001 B-EL 280.3 1.0 280.3 841.0 < 0.0001 C-L 514.7 2.0 257.3 772.0 < 0.0001 AB 5.3 1.0 5.3 16.0 0.0161 AC 6.0 2.0 3.0 9.0 0.0331 Residual 1.3 4.0 0.3
Total 1050.7 11.0
El valor F del modelo (449.71) indica que el modelo es significativo. Solo hay un
0.01% de probabilidad de que " El valor F del modelo" sea debido a ruido.
Valores de "Prob > F" menores que 0.0500 indican que los términos del modelo son significativos.
En este caso A, B, C, AB, AC son términos significativos del modelo. Valores superiores a 0.1000 indican que los términos del modelo no son significativos.
Desv. Estd. 0.577350269
R-cuadrada 0.99873096 Significado 46.33333333
Adj R-cuadrada 0.99651015
C.V. % 1.246079718
Pred R-cuadrada 0.98857868 PRESS 12
Adeq Precision 72.4784451
154
Design-Expert® Software
Remoción de HTP's
Color points by value of
Remoción de HTP's:
63
29
Internally Studentized Residuals
No
rma
l %
Pro
ba
bili
ty
Normal Plot of Residuals
-1.50 -0.75 0.00 0.75 1.50
1
5
10
20
30
50
70
80
90
95
99
Design-Expert® Software
Remoción de HTP's
Color points by value of
Remoción de HTP's:
63
29
Run Number
Inte
rna
lly S
tud
en
tiz
ed
Re
sid
ua
ls
Residuals vs. Run
-3.00
-1.50
0.00
1.50
3.00
1 3 5 7 9 11
A3. Graficas de residuales del DEFG.
Los puntos de la gráfica de residuales (Figura A3-1), se localizan razonablemente próximos a una
línea recta, brindando apoyo a la conclusión de que BC (A), EL (B), L (C), BC-EL (AB) y BC-L (AC),
son los principales efectos significativos y que satisfacen los supuestos fundamentales del análisis.
Figura A3-1. Gráfica normal de residuales.
Se observa una dispersión equitativa de los residuales entre + 3.0 y – 3.0 (Figura A3-2).
Figura A3-2. Gráfica de residuales contra tratamiento.
155
Design-Expert® Software
Remoción de HTP's
Color points by value of
Remoción de HTP's:
63
29
2
2
2
2
22
BC
Inte
rna
lly S
tud
en
tiz
ed
Re
sid
ua
ls
Residuals vs. BC
-3.00
-1.50
0.00
1.50
3.00
1 2
Design-Expert® Software
Remoción de HTP's
Color points by value of
Remoción de HTP's:
63
29
2
22
B:EL
Inte
rna
lly S
tud
en
tiz
ed
Re
sid
ua
ls
Residuals vs. EL
-3.00
-1.50
0.00
1.50
3.00
1 2
Design-Expert® Software
Remoción de HTP's
Color points by value of
Remoción de HTP's:
63
29
2
C:L
Inte
rna
lly S
tud
en
tiz
ed
Re
sid
ua
ls
Residuals vs. L
-3.00
-1.50
0.00
1.50
3.00
1 2 3
Como se observa en estas gráficas (Figura A3-3) la varianza no es demasiada para cada uno de los
efectos.
156
Design-Expert® Software
Sqrt(Remoción + 1.00)
Color points by value of
Sqrt(Remoción + 1.00):
7.14533
1.1351
Internally Studentized Residuals
No
rma
l %
Pro
ba
bili
ty
Normal Plot of Residuals
-1.99 -1.12 -0.25 0.63 1.50
1
5
10
20
30
50
70
80
90
95
99
Design-Expert® Software
Sqrt(Remoción + 1.00)
Color points by value of
Sqrt(Remoción + 1.00):
7.14533
1.1351
Run Number
Inte
rna
lly S
tud
en
tiz
ed
Re
sid
ua
ls
Residuals vs. Run
-3.00
-1.50
0.00
1.50
3.00
1 10 19 28
A4. Graficas de residuales del DEFC.
Los puntos de la gráfica de residuales (Figura A4-1), se localizan razonablemente próximos a una
línea recta, brindando apoyo a la conclusión de que S (B), Agua (C) y EL-S (AB), son los principales
efectos significativos y que satisfacen los supuestos fundamentales del análisis.
Figura A4-1. Gráfica normal de residuales.
Se observa una dispersión equitativa de los residuales entre + 3.0 y – 3.0 (Figura A4-2).
Figura A4-2. Gráfica de residuales contra tratamiento.
157
Design-Expert® Software
Sqrt(Remoción + 1.00)
Color points by value of
Sqrt(Remoción + 1.00):
7.14533
1.1351 2
EL
Inte
rna
lly S
tud
en
tiz
ed
Re
sid
ua
ls
Residuals vs. EL
-3.00
-1.50
0.00
1.50
3.00
0.10 2.57 5.05 7.53 10.00
Design-Expert® Software
Sqrt(Remoción + 1.00)
Color points by value of
Sqrt(Remoción + 1.00):
7.14533
1.1351 2
B:Suelo
Inte
rna
lly S
tud
en
tiz
ed
Re
sid
ua
ls
Residuals vs. Suelo
-3.00
-1.50
0.00
1.50
3.00
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Design-Expert® Software
Sqrt(Remoción + 1.00)
Color points by value of
Sqrt(Remoción + 1.00):
7.14533
1.1351 2
C:Agua
Inte
rna
lly S
tud
en
tiz
ed
Re
sid
ua
ls
Residuals vs. Agua
-3.00
-1.50
0.00
1.50
3.00
50 67 83 100 117 133 150
Como se observa en esta Figura A4-3, la varianza no es demasiada para cada uno de los efectos.
158
N/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 40 S/BC, N/EL, 40 S/BC, S/EL, 40
respecto a filas 52 35 49 37
N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20
24 20 30 22
N/BC, N/EL, 0 N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0
Blanco "b"
0 0 0 0
N/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 40 S/BC, N/EL, 40 S/BC, S/EL, 40
respecto a columnas 0 23 25 43
N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20
0 33 33 56
N/BC, N/EL, 0 N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0
Blanco "b"
0 38 28 59
N/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 40 S/BC, N/EL, 40 S/BC, S/EL, 40
respecto al blanco 52 86 90 117
del tratamiento N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20
24 66 66 93
N/BC, N/EL, 0 N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0
Blanco "b"
0 38 28 59
N/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 40 S/BC, N/EL, 40 S/BC, S/EL, 40
respecto al blanco 91 135 139 174
bioestimulación N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20
57 109 109 143
N/BC, N/EL, 0 N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0
Blanco "b"
26 74 61 100
N/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 40 S/BC, N/EL, 40 S/BC, S/EL, 40
respecto al blanco 238 315 323 385
suelo + agua N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20
177 269 269 331
N/BC, N/EL, 0 N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0
Blanco "b"
123 208 185 254
respecto al blanco 62
del tratamiento
respecto al blanco 104 Suelo Lavado
bioestimulación
respecto al blanco 262
suelo + agua
Porcentaje de remoción entre tratamientos
A5. Porcentajes de remoción de los diferentes tratamientos y el suelo lavado, respecto a los
blancos “a”, “b” y “c”.
159
Determinaciones Analíticas
Para evaluar las determinaciones que a continuación se enlistan, se tomó una muestra
completamente al azar de los tratamientos; para ello se dividió la caja del tratamiento en 9 segmentos
imaginarios y empleando una calculadora se seleccionó la función de ―random‖ la cual permite obtener
al azar tres números; de esta manera se tomó la muestra desde la superficie hasta el fondo del
tratamiento para posteriormente mezclarlos en lo posible de manera homogénea las tres
sub-muestras. De la muestra mencionada anteriormente se tomaron 50g para realizar los análisis
mencionados en la sección de materiales y métodos.
B1. Extracción de HTP’s (EPA 3550b)
Se elabora un cartucho de papel filtro Whatman de tal forma que pueda almacenar suelo en su interior
y se pone a peso constante (colocarse guantes de látex para evitar transferir humedad y grasa a los
cartuchos). Se determina la humedad del suelo a analizar. Posteriormente se pesa aproximadamente
un gramo de suelo colocándolo en el cartucho. Se coloca el cartucho con muestra en un frasco de
vidrio de 4.5 × 10cm con tapa y se adicionan 40ml de diclorometano. Se sónica la muestra empleando
un equipo de ultrasonido Branson® DHA-1000 durante 40min. Esta operación se hace por triplicado.
El sobrenadante se trasvasa a otro frasco de vidrio y se permite la evaporación del diclorometano
hasta sequedad para llevar a cabo la recuperación de asfaltenos. El cartucho posteriormente se lleva
a peso constante, para determinar la concentración de HTP’s (ppm) se aplica la siguiente fórmula:
160
B2. Recuperación de Asfaltenos
Empleando los HTP’s obtenidos se la etapa anterior se adicionan 40ml de pentano y se coloca en el
frasco un agitador magnético y se agita por 10min (se observa inmediatamente la precipitación del
asfalteno). Posteriormente la mezcla se centrifuga a una velocidad de 10,000 rpm, a una temperatura
de 4 °C, también por 10 minutos, se realiza una decantación y con el precipitado que se vaya
obteniendo, se repite la misma operación cuatro ocasiones, (dilución, agitación y centrifugación), el
sobrenadante se va aclarando en cada operación pero no llega a ser incoloro.
Tanto del precipitado como del sobrenadante se evapora el solvente y se cuantifica asfaltenos en el
primero e hidrocarburos ligeros en el segundo.
B3. Fraccionamiento de Hidrocarburos Ligeros (sin asfaltenos)
Los hidrocarburos ligeros se separan en tres fracciones que son alifáticos, aromáticos poli cíclicos y
saturados por el método de cromatografía en columna.
Se emplea una columna de vidrio de 20 cm de longitud con diámetro interior de 0.85 cm, empacada
con sílica gel (malla 60 – 200); primero se coloca en su parte interior un tapón de fibra de vidrio para
evitar la sílica sea arrastrada por el solvente, después la columna se llena con hexano, purgando en
repetidas ocasiones para sacar todas las burbujas de aire atrapadas y después se adiciona sílica gel
activada previamente (24 horas a 100°C), cuidando que no queden burbujas de aire atrapadas.
Primera fracción (hidrocarburos Alifáticos). Se pesan 0.1 g de hidrocarburos ligeros (libres de
asfaltenos), se disuelven en hexano y se colocan en la parte superior de la columna. El eluyente para
la primer fracción es hexano con este solvente se obtienen los hidrocarburos alifáticos, que producen
una coloración verde-amarillo tenue, esta y todas las fracciones a recuperar se deben recibir en un
vaso de precipitados de 100 ml puestos anteriormente a peso constante, para cuantificar los
hidrocarburos correspondientes. La obtención de esta primera fracción tarda aproximadamente 6:30 h,
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siendo el criterio para concluir esta separación la aparición gradual de una mancha amarilla. Se
recomienda montar en la parte superior de la columna de fraccionamiento un matraz de separación
con el solvente que se esté alimentando a la columna, igualando los flujos de entrada y de salida de la
columna que es aproximadamente de 20 gotas por minuto.
Segunda fracción (hidrocarburos Aromáticos). Se adicionó un eluyente compuesto por benceno –
hexano (1:3). Con éste se fraccionarán los hidrocarburos aromáticos que producen una coloración
amarillo brillante. La obtención de esta fracción demora unas 5:00 h misma que se da por terminada
cuando el efluente sea incoloro.
Tercera fracción (hidrocarburos Policíclicos Aromáticos). Se cambia la adición del solvente a otro
compuesto por acetona – metanol (1:1), con el que se obtiene la tercera fracción que componen los
hidrocarburos saturados y que producen una coloración café, esta fracción se obtiene en
aproximadamente 3:00 horas y el criterio para concluir la recuperación de ésta es también cuando el
efluente sea totalmente incoloro.
B4. Análisis cromatográfico
Se empleo un cromatógrafo de gases Perkin Elmer, Auto System con detector de ionización de flama
(FID), las condiciones bajo las cuales se operó el equipo fueron; columna capilar SIL 8CV de 25m de
longitud y de 0.32×0.4µm, que utiliza helio, como gas acarreador a un flujo de 6 mL/min. La
temperatura del inyector y detector se mantuvo a 240 y 280ºC respectivamente, la temperatura del
horno se programó a 60ºC por 4min; con rampas de temperatura de 60 a 140ºC a 10ºC/min; de 140ºC
a 180ºC a 2ºC/min y de 180 a 280ºC a 15ºC/min.
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B5. Capacidad de Retención de Agua (CRA)
Pesar 10g de muestra a peso constante y determinar humedad inicial posteriormente colocar la
muestra en un vaso de precipitados de 250mL y adicionar 100mL de agua, mezclar mediante
agitación magnética durante 20min. Colocar la muestra húmeda en un embudo con papel filtro ambos
a peso constante y permitir que el agua absorbida a la muestra se libere de este de manera natural.
En el momento en que ya no salga más agua por el cuello del embudo, pesar la muestra más el
embudo y por diferencia de pesos determinar la CRA.
B6. Método de extracción de Substancias Húmicas del Suelo, método de la IHSS (International
Humic Substances Society) modificado
1. Equilibrar la muestra a un valor de pH entre 1-2 con 1 M HCl a temperatura ambiente. Ajustar
el volumen de la solución con 0.1 M HCl para proveer una concentración final en un rango
comprendido de 10 mL liquido/1 g muestra seca. Agitar la suspensión por una hora, con la
finalidad de eliminar carbonatos adheridos a las substancias húmicas y que interfieran con la
determinación.
2. Separar el sobrenadante del residuo por decantación después de permitir que la solución
descanse (o mediante centrifugación a baja velocidad 10000rpm – 10min). Conservar el
sobrenadante para el tratamiento con la resina XAD-7.
3. Neutralizar el residuo del suelo con 1 M NaOH a pH=7.0 entonces adicionar 0.1 NaOH bajo
una atmósfera de N2 hasta obtener una relación de 10:1.
4. Extraer la suspensión bajo N2 con agitación intermitente por un mínimo de 4 horas. Permitir
que la suspensión alcalina descanse toda la noche y recolectar el sobrenadante por
decantación o centrifugación.
5. Acidificar el sobrenadante con 6 M HCl con agitación constante hasta pH=1.0 y después
permitir que la suspensión descanse de 12 – 16 horas.
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6. Centrifugar para separar las fracciones de ácido húmico (precipitado) y el ácido fúlvico
(sobrenadante – FA Extracto 2).
7. Redisolver la fracción de ácido húmico adicionando un volume mínimo de 0.1 M KOH bajo N2.
Adicionar KCl sólido hasta obtener 0.3 M (K+) y después centrifugar a una velocidad alta para
remover los sólidos suspendidos.
8. Reprecipitar el ácido húmico como en el paso 5. Centrifugar y descartar el sobrenadante.
9. Suspender el ácido húmico precipitado en una solución 1:1 de 0.1 M HCl/0.3 M HF. Agitar
toda la noche a temperatura ambiente. Esto con la finalidad de eliminar silicates adheridos a
las ácido húmico.
10. Centrifugar y repetir el tratamiento de HCl/HF (Paso 9), si es necesario, hasta que el
contenido de cenizas sea inferior a 1%.
11. Transferir el precipitado a un tubo de dialisis con agua destilada y dializar en un frasco con
agua destilada, hasta que el agua del recipiente de una reacción negativa de Cl- cuando se
adiciona AgNO3 al 1%. Esto tiene la finalidad de eliminar el exceso de acido clorhídrico en la
muestra.
12. Liofilizar el ácido húmico o secar a 60ºC.
13. Pasar el sobrenadante del paso 2 a través de una columna con resina XAD-7. Descartar el
efluente, eluir la columna de XAD-7 que contiene sorbido al ácido fúlvico con 0.65 volúmenes
de la columna de agua destilada. No conservar esta agua destilada.
14. Desorber la columna XAD-7 con un volumen de columna de 0.1 M NaOH, seguido de 2-3
volúmenes de agua destilada.
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15. Inmediatamente acidificar con 6 M HCl a pH=1. Adicionar HF concentrado a una
concentración final de 0.3 M HF. El volumen de la solución debe de ser suficiente para
mantener la solubilidad del ácido fúlvico.
16. Pasar el sobrenadante del paso 6 a través de de la columna con XAD-7.
17. Repetir los pasos 14 y 15
18. Combinar los eluyentes finales de los pasos 15 y 17, y pasarlos de Nuevo por la columna.
Eluir con 0.65 volúmenes de la columna de agua destilada.
19. Obtener el eluato final con un volumen de columna de 0.1 M NaOH seguido de 2 columnas de
agua destilada.
20. Liofilizar la elución para recuperar el ácido fúlvico.
Crecimiento microbiano
B7. Cuenta total en placa
Para evaluar el crecimiento microbiano por cuenta en placa; se realizaron diluciones seriales del
suelo, bagacillo de caña, vermicomposta y extracto de leonardita (de 1×10-1
a 1×10-10
) a partir de 1
gramo de muestra. Una muestra de 100µL de cada dilución fue distribuida en cajas Petri previamente
preparadas con medio sólido. Se emplearon medios de cultivo complejos para el crecimiento de todo
tipo de bacterias, hongos, levaduras y actinomicetos en el menor tiempo, agar nutritivo (Bioxon) para
bacterias, agar maltosa sabouraud (DB Difco) para hongos y levaduras; así como, agar czapeck
(Bioxon) para actinomicetos. Las cajas Petri fueron incubadas a 32ºC durante 7 días, realizando la
cuenta total después de éste periodo.
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Criterio para el conteo de colonias: 20-200 por caja
El número de UFC/g de suelo (peso seco) se obtuvo de la siguiente manera:
UFC/mL = (No. de colonias / 0.1 mL de inóculo) x factor de dilución
UFC/g = (UFC/mL) x (9 mL) / peso de la muestra (g)
B8. Microorganismos hidrocarbonoclastas
Se realizaron diluciones seriales del suelo, bagacillo de caña, vermicomposta y extracto de leonardita
(1×10-1
a 1×10-10
) a partir de 1 gramo de muestra. Una muestra de 100µL de cada dilución fue
distribuida en cajas Petri previamente preparadas con medio sólido. El criterio para la selección de
cepas hidrocarbonoclastas, fue su capacidad de crecer en medio mineral adicionado de queroseno
como fuente de carbono. El medio mineral (1 L) consistió de dos soluciones; solución A (0.9L):
K2HPO4 (0.8g), KH2PO4 (0.2g), KCl (0.1g), Na2FeEDTA (0.014g), Na2MoO4·2H2O (0.025g), NH4NO3
(1g) y Agar-Agar (15g) y la solución B (0.1L): MgSO4·7H2O (0.2g) y CaCl2 (0.06g) (Renie, 1981;
modificado por R. Ferrera-Cerrato). Ambas soluciones, previamente preparadas y ajustadas a pH 7,
fueron esterilizadas por separado a 121ºC por 18 min, antes de ser mezcladas bajo condiciones de
esterilidad; por último se adicionó biotina y ácido p-aminobenzoico (10 mg/L). Se impregna un papel
filtro con 0.5mL de queroseno y se coloca en la tapa superior de la caja Petri. Las cajas Petri fueron
incubadas a 32ºC durante 7 días, realizando la cuenta total después de éste periodo.
B9. Carbono de Biomasa (Islam and Weil, 1998)
Colocar en dos frascos 10g de suelo del tratamiento, irradiar una de las muestras en microondas
(700W de potencia) por 7 segundos (para proporcionar 800kJ/g de suelo), adicionar 25ml de una
solución de K2SO4 0.5M a cada frasco y agitar por 1 hora. Centrifugar la mezcla a 10000rpm por 10
minutos, transferir 5ml de sobrenadante a otro frasco, adicionar 5ml de Ácido Sulfúrico y 1ml de
K2Cr2O7 0.1M. Irradiar las muestras 13 segundos, dejar enfriar y adicionar 19ml de agua destilada
desionizada (para completar 30ml de volumen final). Leer en espectrofotómetro a 590nm. Realizar una
curva tipo de sacarosa con las siguientes concentraciones: 0, 10, 20, 40, 80, 200, 400ppm realizar los
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mismo pasos mencionados anteriormente. Realizar blanco de reactivos y hacer la prueba por
duplicado.
Cálculos varios
B10. Elaboración del alimento de lombriz
La preparación del alimento (bagacillo de caña) se fundamentó en que las lombrices en promedio
consumen su peso en un día, excretando el 60% de éste.
El promedio en peso de las lombrices es de 0.375g, que se colocaron en el sistema, si se colocan 40
lombrices y en un periodo de 90 días consumirán:
0.375g/lombriz,día x 40 lombrices x 90 días = 1350g de alimento
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