Biotechnologia w analizie, ochronie środowiska, medycynie i

Biotechnologia w analizie,

ochronie środowiska,

medycynie i przemyśle

Biotechnologia w analizie,

ochronie środowiska,

medycynie i przemyśle

Redakcja:

Kinga Kropiwiec

Mirosław Szala

Lublin 2015

Recenzenci:

prof. dr hab. Stanisław Chibowski

dr hab. Małgorzata Cytryńska

prof. dr hab. n. med. Janusz Kocki

prof. dr hab. Jacek Goworek

dr hab. Krzysztof Grzywnowicz, prof. UMCS

dr hab. Waldemar Gustaw

dr hab. Jarosław Handzlik

dr Magdalena Jaszek

dr Anna Matuszewska

dr hab. Andrzej Mazur

dr hab. med. Radosław Rola

dr hab. Robert Stawarz, prof. UP

prof. dr hab. Ewa Solarska

prof. dr hab. Joachim Szulc

prof. dr hab. Krzysztof Winkler

Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje.

Skład i łamanie: Ilona Żuchowska

Projekt okładki: Agnieszka Ciurysek

© Copyright by Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL

ISBN 978-83-65272-06-5

Wydawca:

Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL

ul. Głowackiego 35/348, 20-060 Lublin

www.fundacja-tygiel.pl

Spis treści

Karolina Waleczek Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku w polskiej części syneklizy

perybałtyckiej na podstawie danych z otworów wiertniczych ..................... 7

Paulina Matysiak, Małgorzata Marczak, Anna Skorupska

Badanie oddziaływań między białkami zaangażowanymi w syntezę EPS

R. leguminosarum bv. trifolii..................................................................... 19

Izabela Podgórska, Monika Kordowska-Wiater, Monika Wójcik,

Łukasz Sęczyk

Enzymy lityczne – ich producenci i zastosowanie ..................................... 30

Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak

Zastosowanie grzybowej lakazy w procesie bioremediacji ....................... 41

Magdalena Czemierska, Aleksandra Szcześ, Anna Jarosz-Wilkołazka

Oczyszczanie roztworów wodnych w procesie flokulacji ......................... 53

Joanna Lach

Mikrosolwatacja cząsteczek iperytu siarkowego w ujęciu obliczeń

pierwszych zasad ....................................................................................... 67

Katarzyna Szewczuk-Karpisz, Małgorzata Wiśniewska, Małgorzata

Sęczkowska

Porównanie mechanizmu stabilności suspensji tlenku chromu(III) w

obecności poli(kwasu akrylowego) oraz polisacharydu pochodzenia

bakteryjnego .............................................................................................. 78

Mateusz Niścior

Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych ....................................................... 89

Mateusz Niścior

Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie ....................................... 110

Magdalena Bartosiak, Agnieszka Dobrzańska

Biosensory w służbie zdrowiu ................................................................. 127

Adrian Odrzywolski

Aptamery jako nowe narzędzie terapeutyczne ........................................ 138

Jan Sobstyl, Paulina Sobstyl, Karol Terlecki, Paulina Chwil, Katarzyna

Schab, Magdalena Amarowicz, Marcin Urbańczuk, Dominika Mulawka,

Paulina Mulawka, Lidia Kotuła

Charakterystyka oraz możliwości terapeutyczne wybranych przeciwciał

monoklonalnych ...................................................................................... 149

Katarzyna Szałapata, Monika Osińska-Jaroszuk, Anna Jarosz-Wilkołazka

Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia stosowane w różnych

dziedzinach życia .................................................................................... 158

Marta Głogowska

Zawartość sodu i potasu w tkankach ludzkiego przełyku ........................ 171

Kamila Wlizło, Jolanta Polak, Anna Jarosz-Wilkołazka

Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii ......................... 178

Ewelina Zielińska, Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński

Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów wybranych gatunków

pestkowców tropikalnych ........................................................................ 196


Zastosowanie enzymów amylolitycznych i proteolitycznych w przemyśle

spożywczym ............................................................................................ 209

Maciej Gierada, Rafał Rachwalik

Rola reakcji ubocznych w procesie izomeryzacji α-pinenu ..................... 221

Ewelina Zielińska, Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński

Suszenie sublimacyjne – aspekty technologiczne i wyzwania ................. 231

Indeks autorów: ....................................................................................... 243

7

Karolina Waleczek1

Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku

w polskiej części syneklizy perybałtyckiej

na podstawie danych z otworów wiertniczych

1. Wstęp

Przedstawione wyniki badań dotyczą osadów dolnego paleozoiku

należących do obszaru polskiej części platformy prekambryjskiej. Celem

analizy było zdefiniowanie typów litofacji budujących profil dolnego

paleozoiku obniżenia perybałtyckiego. Ustalono również ich sukcesję

czasową oraz skonstruowano typowe profile dla poszczególnych okresów.

Został stworzony schemat litostratygrafii dolnego paleozoiku dla badanego

terenu. Na końcu przedstawiono zbiorczy przekrój geologiczny prezentujący

zgeneralizowany rozkład litofacji dolnego paleozoiku.

Do wyżej zarysowanych celów badawczych wyznaczono linię przekroju,

wzdłuż której wybrano 18 najbardziej reprezentatywnych otworów wiertniczych

dochodzących głębokością do podłoża krystalicznego lub do kambru dolnego

i środkowego. Dane o otworach pochodzą z Centralnej Bazy Danych

Geologicznych Państwowego Instytutu Geologicznego [1].

2. Położenie obszaru badań

Badany obszar obejmuje rejon Polski północno-wschodniej rozciągający

się, w ujęciu geograficznym, od Pojezierza Wschodniopomorskiego na

zachodzie po Pojezierze Litewskie na wschodzie. Geologicznie teren ten

należy do jednostki tektonicznej platformy wschodnioeuropejskiej, która

jest, obok platformy zachodnioeuropejskiej i orogenu karpackiego, jedną

z trzech megajednostek tektonicznych Polski [2].

2.1. Synekliza perybałtycka – uwarunkowania geologiczne

Regionalnie badany teren należy do rozległego obniżenia południowej

części platformy określanego jako synekliza perybałtycka. Jej obszar

rozciąga się na północ i północny-wschód, poza teren Polski, aż po tarczę

bałtycką półwyspu skandynawskiego [3]. W pracy uwzględniona jest jedynie

[email protected], Uniwersytet Jagielloński, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Instytut

Nauk Geologicznych, http://www.ing.uj.edu.pl/

mailto:[email protected]

Karolina Korzeniowska

8

część należąca do Polski. Cechą charakterystyczną osadów wypełniających

obniżenie jest monoklinalne zaleganie z tendencją do pogłębiania się spągu

w kierunku południowo-zachodnim, do granicy ze strefą Teisseyre’a-

Tornquista [4]. Zasięg syneklizy na terenie Polski przedstawia Rys.1.

Rysunek 1 Położenie syneklizy perybałtyckiej na tle jednostek geologicznych Polski [2]

W okresie wczesnego paleozoiku platforma prekambryjska stanowiła

część mikrokontynentu Baltica. Teren syneklizy przez cały ten okres

znajdował się w obrębie płytkiego morza epikontynentalnego [5]. Stąd też

osady wypełniające obniżenie składają się głównie ze skał klastycznych oraz

z interkalacjami facji węglanowych.

2.2. Teren badań

Na obszarze syneklizy wyznaczono linię przekroju, wzdłuż której

dobrano otwory wiertnicze, których profile litologiczne posłużyły jako dane

wyjściowe do dalszych interpretacji. Pozycję linii na mapie wraz

z orientacyjnie zaznaczonymi otworami przedstawia Rys. 2.

Rysunek 2 Linia przekroju wraz z zaznaczonymi lokacjami otworów wiertniczych

wykorzystanych w badaniu [opracowanie własne]

Otworami wiertniczymi, których dane zostały wykorzystane na potrzeby

badania są odpowiednio (od zachodu): Niestopowo 1, Gdańsk IG-1,

Młynary-3, Żelazna Góra 5, Dębowiec Warmiński-2, Dębowiec Warmiński

3, Glądy 4, Gałajny 1, Piasek 1, Bąsze 1, Liski 1, Sępopol 2, Barciany 3,

Barciany-4, Lesieniec-1, Gołdap IG-1, Łopuchowi IG-1 oraz Zaboryszki. Ich

odwierty zostały sporządzone głównie w latach 70. i 80. ubiegłego wieku

jako wiercenia badawcze lub surowcowe (poszukiwawcze). Wszystkie

wybrane otwory głębokością dosięgają do spągu kambru dolnego,

,

Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku w polskiej

części syneklizy perybałtyckiej na podstawie danych z otworów wiertniczych

9

środkowego lub kambru górnego. Dane dotyczące otworów pobrane

z Centralnej Bazy Danych Geologicznych niezależnie od daty sporządzenia

opatrzone są w większości weryfikacją z 2008 roku. Dobadań wykorzystano

profile litologiczne oraz w pewnym stopniu dane litostratygraficzne

i chronostratygraficzne.

3. Wyniki badań

Interpretację profili uzupełniono danymi literaturowymi, z uwzględnieniem

dotychczasowych badań innych autorów, którzy prowadzili prace na danym

terenie.

3.1. Litologie dolnego paleozoiku

Poniższe podrozdziały zawierają szczegółowy opis wspomnianych

osadów dolnopaleozoicznych wypełniających obniżenie perybałtyckie.

3.1.1. Osady kambru

Sukcesja litologiczna kambru zdominowana jest klastycznymi utworami;

naprzemianległymi warstwami piaskowców, mułowców i iłowców.

Piaskowce są osadem wysokoenergetycznego środowiska pływowego

– pozostałe facje (bardziej drobnoziarniste – np. mułowce bitumiczne

formowały się w warunkach płytkiego morza epikontynentalnego [6].

Analizując profile litologiczne zauważa się, że przeważają ilościowo

piaskowce kwarcytowe, które często są przewarstwiane ciemnoszarymi

iłowcami. Zdarzają się w piaskowcach nagromadzenia glaukonitu, nawet

w większych ilościach. Rzadkie są warstwy wapieni gruzłowych lub wapieni

marglistych oraz zlepieńce i bituminy – te ostatnie są bardzo charakterystyczne

dla wczesnego kambru.

Na podstawie osiemnastu profili pobranych z bazy stworzono zbiorczy

profil, będący „typowym” profilem kambru.

Badania wykazały, że najczęściej kambr rozpoczyna się osadami

drobnoziarnistymi, będącymi piaskowcami lub piaskowcami mułowcowymi

o niewielkiej miąższości. Po nich następują osady mieszane, najczęściej

przewarstwienia piaskowców oraz iłowców, rzadziej mułowców. Powyżej

zalegają dużej miąższości piaskowce kwarcytowe, często z przewarstwieniami

iłowców lub mułowców. Można je podzielić na pakiety, które są

porozdzielane wkładkami naprzemianległych warstw jasnych piaskowców

i ciemnych iłowców. Zarówno w tych piaskowcach, jak i w piaskowcach

kwarcytowych znajdują się często nagromadzenia glaukonitu. Istnieje

zależność pomiędzy osadami mieszanymi a piaskowcami kwarcytowymi,

która polega na kompensowaniu miąższości – jeżeli piaskowce są dużej

miąższości, to osady mieszane małej i na odwrót. Profil najczęściej kończy się


10

piaskowcami kwarcytowymi lub przewarstwieniami iłowców i mułowców.

Zdarzają się także w stropie facje wapienne, kontynuujące się w późniejszej

sukcesji ordowickiej. Profil stanowi pewne uogólnienie, założyć trzeba więc, że

analizując dowolne pojedyncze profile, miąższości poszczególnych litologii

mogą być zmienne, niektóre osady mogą w ogóle nie występować,

a niektóre mogą mieć dodatkowe przewarstwienia.

Sporządzony ogólny profil przedstawia Rys. 3. Miąższości odzwierciedlają

częstość występowania poszczególnych litologii w profilu.

Rysunek 3 Zbiorczy profil osadów kambru [opracowanie własne]

3.1.2. Osady ordowiku

Utwory ordowiku reprezentują facje węglanowo-terygeniczne

deponowane w warunkach płytkiego morza szelfowego. Jako osady

o proweniencji terygenicznej wyróżnia się iłowce mułowcowe oraz cienkie

warstewki piaskowców. Fację węglanową, morską tworzą wapienie, margle

i iłowce margliste [7].

Wykazano, że najczęstszymi litologiami ordowiku są wapienie oraz

margle, znacząco przeważające nad resztą osadów. Występują one jako

wapienie organodetrytyczne, pelityczne, gruzłowe, dolomityczne, wapienie

zailone oraz jako forma pośrednia – wapienie margliste. Margle najczęściej

występują obocznie z wapieniami lub z marglami dolomitycznymi. Skały

silikoklastyczne reprezentowane są przez iłowce, w większości wapniste

,



11

i margliste oraz przez pojedyncze warstwy zlepieńców, mułowców

i piaskowców.

Profil zbiorczy dla ordowiku rozpoczynają osady terygeniczne głównie w

postaci wapnistych ciemnych iłowców lub miejscami wapieni. Powyżej

iłowce przechodzą już bezpośrednio w wapienie różnego rodzaju. Nad nimi

zalegają margle przeławicane wapieniami lub wapienie margliste. Ta seria

skalna jest dominująca w profilu. Powyżej często znajduje się niewielkiej

miąższości warstwa wapienia. Profil kończą przeważnie osady terygeniczne

w postaci iłowców, często łupkowatych, przewarstwianych wapieniami.

Całość zgeneralizowanego profilu ordowiku przedstawia Rys. 4.

Rysunek 4 Zbiorczy profil osadów ordowiku [opracowanie własne]

3.1.3. Osady syluru

Osady sylurskie przyjęto uważać jako przede wszystkim osady ilaste [8].

Później zaczęto wyróżniać w ich obrębie takie litologie, jak łupki ilaste, łupki

margliste i mułowce[3]. Pojawiające się w landowerze wapienie gruzłowe

interpretowane są, jako osady bardziej płytkomorskie w stosunku do reszty

sukcesji syluru – interpretowanej jako osady szelfu zewnętrznego [9].

Analizowane profile wiertnicze tylko częściowo zgadzają się z danym

z literatury. Osadami najczęściej występującymi są iłowce. Są to głównie

iłowce ciemnoszare, często o charakterze łupkowatym, wapniste, z dużą

ilością fauny graptolitowej. Pojawiają się także warstwy szarych

i szarozielonych iłowców pstrych, nie burzących z kwasem, bez fauny lub jej


12

bardzo małą ilością. Występują również iłowce szare, czekoladowe i czarne,

iłowce mułowcowe, iłowce łupkowate i inne, rzadsze. Poza dominującymi

iłowcami, w profilu występują niewielkie, acz wyraźne wkładki wapieni

i margli, najczęściej przeławicanych ze sobą. Wapienie występują też jako

pojedyncze warstwy wapieni gruzłowych, bulastych lub wapieni

marglistych. Inne osady klastyczne poza iłowcami są rzadkie i są to

najczęściej zlepieńce, piaskowce lub mułowce. Charakterystyczną litologią

syluru są diabazy i związane z nimi tufity i bentonity, będące zapisem

aktywności wulkanicznej pod koniec tego okresu.

Analiza ilości i prawidłowości w występowaniu poszczególnych

rodzajów litolofacji pozwoliła sporządzić zbiorczy profil dla syluru.

Sedymentację sylurską rozpoczyna cienka warstwa osadów płytkiego morza,

na którą składają się margle przeławicane wapieniami lub niewielkie ilości

szaro-zielonych iłowców. Powyżej, dominują osady iłowcowe, będące

zapisem transgresji morskiej. W ich obrębie, mniej więcej w ¾ profilu

znajdywane są w osadach pojedyncze warstewki bentonitu. Sedymentacja

iłowców najczęściej kończy się pojedynczymi warstwami grubszych osadów

klastycznych, - piaskowców i zlepieńców lub warstwą wapieni, zwykle

bulastych. Wymienione wcześniej diabazy pojawiają się pod koniec syluru,

w obrębie iłowców i piaskowców. Ogólny, zbiorczy profil przedstawia Rys. 5.

,



13

Rysunek 5 Zbiorczy profil osadów syluru [opracowanie własne]

3.2. Litostratygrafia

Obszar wzdłuż wyznaczonej linii przekroju, oprócz analizy litologicznej

został poddany badaniom litostratygraficznym. Posłużyły do tego profile

litostratygraficzne, pobrane z bazy CBDG, oraz dane z literatury.

Zestawienie pełnej litostratygrafii wzdłuż wyznaczonej linii profilu

badanego terenu przedstawia Rys.6.

Kambr syneklizy perybałtyckiej posiada 12 formalnych jednostek

litostratygraficznych wydzielonych przez Bednarczyk i Turnau-Morawską

w 1975 roku [10]. Wydzielenia te dotyczą całości terenu syneklizy,

uwzględniając wszystkie poznane wówczas osady.

Na obszarze badań zaobserwowano jedno z dwunastu wydzieleń:

formację smołdzińską, którą tworzą piaskowce i zlepieńce górnego wendu

i dolnego kambru. Brak innych wydzieleń formalnych kambru.

Osady ordowiku nie posiadają formalnych wydzieleń litostraty-

graficznych, jednakże próby formalizacji poskutkowały stworzeniem pełnej

serii wydzieleń nieformalnych. Najbardziej powszechny jest podział

ordowiku, który zaproponowali w 1997 roku Modliński i Szymański [11].

Wydzielili oni 14 jednostek litostratygraficznych, w tym 9 o randze formacji


14

i 5 o randze ogniwa. W swoich badaniach uwzględnili zmienność litologii ze

wschodu na wschód, ograniczając tym samym lateralnie zasięg poszcze-

gólnych formacji.

Na badanym obszarze rozpoznano 9 z 14 nieformalnych wydzieleń.

Sedymentację ordowicką rozpoczynają osady formacji zlepieńców

i piaskowców z Sępopola tremadoku, należącą do wschodniej części

syneklizy. Powyżej kolejnym wydzieleniem jest formacja czerwonych

wapieni z Pieszkowa, również w części wschodniej, natomiast na zachodzie

pojawia się formacja iłowców i glaukonitów ze Słuchowa. Obie należą do

arenigu. Lanwirn reprezentowany jest przez formację pstrych wapieni

z Kielna na wschodzie oraz częściowo przez formację wapieni z Kopalina na

zachodzie. Osady wapienne z Kielna kontynuują się wyżej w profilu, aż do

połowy karadoku, zazębiając się obocznie z formacją iłowców z Sasina,

która na zachodzie zaczyna się już w lanwirnie. Landeil jest całkowicie

wyerodowany na całej długości badanego obszaru. Formacja z Sasina

przechodzi w stropie w formację margli i iłowców z Prabut na zachodzie

i formację czerwonych margli i wapieni z Morąga na wschodzie. Bezpośred-

nio na formacji z Morąga zalegają osady formacji szarozielonych margli

z Ornety, która kończy sedymentację utworów aszgilu na wschodzie. Na niej

i na formacji z Prabut na zachodzie kończy się okres sedymentacji w ordowiku.

Nieformalnego podziału syluru dokonali Szymański i Modliński wraz

z Tellerem w 2006 roku [12], wydzielając 7 jednostek litostratygraficznych.

Dwie z siedmiu rozpoznano w obrębie badanych osadów, obie należące

wiekowo do landoweru: formacja iłowców z Pasłęka oraz, zazębiająca się

z nią na wschodzie formacja wapieni gruzłowych z Barcian. Znajdują się

one bezpośrednio nad osadami z aszgilu i zamykają serię wydzielonych

jednostek litostratygraficznych badanego terenu.

,



15

Rysunek 6 Zestawienie jednostek litostratygraficznych wzdłuż wyznaczonej linii przekroju

z zachodu na wschód [opracowanie własne]


16

4. Podsumowanie

Klastyczne osady kambryjskie charakteryzują się częstym występo-

waniem piaskowców kwarcytowych oraz sporą ilością przeławiceń

mułowców i iłowców. Osady ordowickie są wyraźnie wapienne, dominują

pakiety wapieni i margli, z niewielkimi ilościami osadów klastycznych na

początku okresu i na jego końcu. Sylur jest zdominowany przez różnego

rodzaju iłowce, które miejscami zastępowane są przez osady wapienne lub

grubsze osady klastyczne. W ujęciu litostratygraficznym badany obszar

odpowiada schematom poczynionym przez innych badaczy, z wyjątkiem

braku części jednostek, których nie zaobserwowano.

W celu podsumowania został sporządzony przekrój geologiczny przez

badany teren, przedstawiający litologię dolnego paleozoiku. Ma on charakter

ogólny – litologie podzielono na bardziej ogólne kategorie. Poza litologiami

głównymi, tzn. piaskowcami, mułowcami, itd. stworzono kategorie

mieszane, oznaczające przeławicenia poszczególnych osadów (np. mułow-

ców z iłowcami). Przekrój ten przedstawia Rys. 7.

Rysunek 7 Przekrój geologiczny wzdłuż sporządzonej linii przekroju z Rys. 2,

przedstawiający układ litofacji dolnego paleozoiku [opracowanie własne]

,



17

Literatura

1. Państwowy Instytut Geologiczny, Centralna Baza Danych Geologicznych –

Otwory wiertnicze, [dostęp 30 stycznia 2014] :

http://otworywiertnicze.pgi.gov.pl/

2. Żelaźniewicz A., Aleksandrowski P., Buła Z., et al., Regionalizacja tektoniczna

Polski, Wrocław, Komitet Nauk Geologicznych PAN, 2011

3. Stupnicka E., Geologia regionalna Polski, Warszawa, Wydawnictwa

Uniwersytetu Warszawskiego, 1997

4. Areń B, Wyniesienie Łeby i obniżenie perybałtyckiej, w: Skały platformy

prekambryjskiej w Polsce, część 2: Pokrywa osadowa, pod red. Łaszkiewicza

W., Warszawa, Wydawnictwa Geologiczne, 1974

5. Stanley S., Historia Ziemi, Warszawa, Wydawnictwa Naukowe PWN, 2002

6. Sikorska M., Pacześna J., Quartz cementation In Cambrian sandstones on the

background of their burial history (Polish part of East European Craton),

Geological Quarterly, 41 (3):265-272, 1997

7. Modliński Z., Nolvak J., Szymański B., Stratygrafia osadów pogranicza ordowiku i

syluru północno-wschodniej Polski i ich korelacja ze stratotypowymi profilami

Estonii, Biuletyn Państwowego Instytutu Geologicznego, 427:61-78, 2007

8. Tupolos T., Charakterystyka utworów sylurskich syneklizy perybałtyckiej na

podstawie badań geofizyki wiertniczej, Geological Quarterly, 21 (3):437-450, 1997

9. Podhalańska T., Późnoordowickie zlodowacenie Gondwany – zapis zmian

środowiskowych w sukcesji osadowej obniżenia bałtyckiego, Prace

Państwowego Instytutu Geologicznego, 193:1-132, 2009

10. Marcinowski R., Piotrowski J., Słownik jednostek litostratygraficznych Polki –

wersja podstawowa, Państwowy Instytut Geologiczny (online), 2004-2011:

http://slp.pgi.gov.pl/

11. Modliński Z., Szymański B., The ordovician lithostratigraphy of the Peribaltic

Depression (NE Poland), Geological Quarterly, 41 (3):273-288, 1997

12. Szymański B., Modliński Z., Teller L., Litostratygrafia syluru polskiej części

obniżenia perybałtyckiego – część lądowa i morska(N Polska), Przegląd

Geologiczny, 54 (9):787-796, 2006

http://otworywiertnicze.pgi.gov.pl/


18

Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku w polskiej części syneklizy

perybałtyckiej na podstawie danych z otworów wiertniczych

Streszczenie

Artykuł dotyczy dolnego paleozoiku syneklizy perybałtyckiej – osadów płytkiego morza epikontynentalnego kambru, ordowiku oraz syluru. Analizowano sukcesję litologiczną

osadów poszczególnych okresów oraz występujące na obszarze jednostki litostratygraficzne.

Do badań posłużyły dane pozyskane z Centralnej Bazy Danych Geologicznych PIG.

Sporządzono zbiorcze profile litologiczne badanych okresów, przekrój jednostek litostratygraficznych oraz ogólny przekrój litologiczny syneklizy, które pozwoliły na opis

specyfiki litologicznej obszaru. Pozwoliło to na porównanie wyników badań z danymi

dostępnymi w literaturze oraz potwierdzenie i uszczegółowienie trendów litologicznych

badanego terenu. Uzyskany zbiorczy profil kambru charakteryzuje się największym udziałem skał klastycznych, w tym typowych dla kambru piaskowców kwarcowych. Ordowik jest

głównie wapienno-marglisty, z pojedynczymi pakietami skał klastycznych na początku

okresu i na jego końcu. Sylur zaś zdominowany jest prawie całkowicie przez iłowce, które

jedynie w podstawie profilu rozpoczynają się warstwami grubiej ziarnistych klastyków i nimi się kończą. Uzyskane zbiorcze profile litologiczne mogą posłużyć analizom dynamiki

rozwoju basenu sedymentacyjnego i ustalaniu zmian poziomu morza.

Słowa kluczowe: synekliza perybałtycka, dolny paleozoik, sukcesja osadów, analiza litologiczna, profile litologiczne, Litostratygrafia

Analysis of sedimentary succession of lower Paleozoic in the Polish part

of the peribaltic syneclise basing on boreholes data

Abstract The article considers lithological studies on lower Paleozoic of the peribaltic syneclise

– Cambrian, Ordovician and Silurian sediments of shallow, epicontinental sea. In the research

the sediments succession of each period in the studied area and lithostratigraphic units were

analyzed. Data from The Central Geological Database was used while conducting the research. A summary lithological profiles of studied periods, the cross-section

of lithostratigraphy and the geological cross-section of lithology in general were prepared.

It was the base of lithological specificity of investigated area description. As an effect the

research results were compared to literature data. Lithological trends of analyzed region were confirmed and particularized. The collective profile of Cambrian period is characterized by

greatest amount of clastic rocks, including quartz sandstones typical for Cambrian sediments.

Ordovician profile contain mainly limestones and marls, with singular layers of clastic rocks

at the beginning of the profile and at its end. Silurian profile is dominated almost entirely by claystones. Coarse-grained clastic layers can be found only at the beginning and at the end of

the profile. The obtained collective and generalized lithological profiles can be used to

conduct sedimentation basin evolution analysis and to determine sea-level changes.

Keywords peribaltic syneclise, lower Paleozoic, sediments succession, lithological analysis,

lithological profiles, lithostratigraphy

19

Paulina Matysiak1, Małgorzata Marczak

2, Anna Skorupska

3

Badanie oddziaływań między białkami

zaangażowanymi w syntezę EPS

R. leguminosarum bv. trifolii

1. Wprowadzenie

Symbioza pomiędzy roślinami z rodziny bobowatych a bakteriami

z rodzaju Rhizobium umożliwia rozwój rośliny i wytworzenie obfitej w białko

biomasy, niezależnie od dostępności związków azotu w glebie. Z tego powodu

rośliny te pełnią istotną rolę w rolnictwie, ale ważne są również ze względu na

korzyści dla środowiska – wzbogacają glebę w azot bez potrzeby chemicznego

nawożenia [1]. Nawiązanie efektywnej symbiozy pomiędzy gospodarzem

roślinnym a bakterią jest procesem wysoce złożonym i uczestniczy w nim

wymiana odpowiednich cząsteczek sygnalnych pomiędzy partnerami

symbiotycznymi, czego wynikiem jest wzajemna koordynacja ekspresji ich

genów [2]. Jedną z takich cząsteczek jest wydzielany przez bakterie

egzopolisacharyd (EPS). EPS jest szczepowo specyficznym polisacharydem,

który gromadzony jest na powierzchni komórki lub wydzielany do podłoża [3].

Rys. 1. Schemat struktur powierzchniowych bakterii Gram-ujemnych

(IM – błona wewnętrzna) [4, z własnymi modyfikacjami].

1 [email protected], Uniwersytet Medyczny w Lublinie, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym,

Zakład i Katedra Medycyny Sądowej, http://www.umlub.pl/uczelnia/struktura-

organizacyjna/szczegoly,108.html 2 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii

i Biotechnologii, Zakład Genetyki i Mikrobiologii 3 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii

i Biotechnologii, Zakład Genetyki i Mikrobiologii




20

Egzopolisacharydy Rhizobium leguminosarum posiadają w większości

identyczną strukturę monomerów. Na monomer składa się pięć cząsteczek

glukozy, dwie cząsteczki kwasu glukuronowego i jedna galaktozy,

połączonych wiązaniami β-(1,4)-glikozydowymi. Monomery są mody-

fikowane podstawnikami takimi jak: grupy acetylowe, pirogronianowe

i hydroksybutanylowe. Poszczególne szczepy mogą różnić się wzorem

podstawników w monomerze. Zaburzenia w produkcji EPS skutkują

nieprawidłowościami w procesie symbiozy i wytwarzaniu prawidłowych

brodawek [5], dlatego istotnym jest poznanie wszystkich elementów

biorących udział w biosyntezie i transporcie na zewnątrz komórki tego

polisacharydu powierzchniowego. Celem niniejszej pracy było rozszerzenie

wiedzy o syntezie EPS w Rhizobium leguminosarum bv. trifolli poprzez próbę

zmapowania interakcji pomiędzy niektórymi białkami uczestniczącymi

w szlaku biosyntezy tego związku.

2. Biosynteza egzopolisacharydów i niektórych polisacharydów

kapsularnych

Białka uczestniczące w biosyntezie i transporcie EPS Rhizobium

leguminosarum bv. trifolli w większości wykazują homologię do systemu

biosyntezy i transportu polisacharydów kapsularnych, takich jak kwas

kolaninowy Escherichia coli. Jest to tak zwany system Wzx/Wzy-zależny.

Składa się on z białek zlokalizowanych zarówno w wewnętrznej,

jak i zewnętrznej błonie komórkowej, których zadaniem jest synteza,

polimeryzacja i transport polisacharydu na powierzchnię komórki [6].

Szlak biosyntezy rozpoczyna się, gdy pierwszy prekursor cukrowy jest

przenoszony w połączeniu z cząsteczką UDP na undekaprenylodifosforan

(und-PP), przy udziale transferazy WbaP. Do niego dołączane są kolejne

cząsteczki cukrów przy pomocy specyficznych glikozylotransferaz, które

mogą być modyfikowane poprzez enzymy przyłączające grupy

niekarboksylowe do łańcucha cukrowego. Und-PP jest zakotwiczony

w błonie wewnętrznej po jej cytoplazmatycznej stronie. Gotowy monomer

zostaje przerzucony przez wewnętrzną membranę, dzięki aktywności

flipazowej białka Wzx. Następnie polimeraza Wzy łączy monomery ze

sobą, a długość powstającego polimeru jest kontrolowana przez

kopolimerazę należącą do rodziny białek PCP (ang. polysaccharide

copolymerase). Lipoproteina Wza tworzy kanał w błonie zewnętrznej

i uczestniczy w wyprowadzaniu gotowego polimeru na powierzchnię

komórki [7].

,

Badanie oddziaływań między białkami zaangażowanymi

w syntezę EPS R. leguminosarum bv. trifolii

21

Rys. 2. Schemat przedstawiający polimeryzację i transport polisacharydu

z udziałem systemu Wzx/Wzy-zależnego [8].


22

2.1. Biosynteza EPS u R. leguminosarum bv. trifolii

Chrosomosom Rhizobium leguminosarum bv. trifolii ma wielkość około

5 Mpz. Oprócz chromosomu, materiał genetyczny tego szczepu

zlokalizowany jest w czterech megaplazmidach: pRtTA1a, pRtTA1b,

pRtTA1c i pRtTA1d.

Geny odpowiedzialne za syntezę polisacharydów zlokalizowano

dotychczas w pięciu regionach (Pss-I – Pss-V) w obrębie chromosomu oraz

na niesymbiotycznym plazmidzie pRtTA1b [9].

Geny kodujące glikozylotransferazy odpowiedzialne za biosyntezę

podjednostki egzopolisacharydu Rhizobium leguminosarum bv. trifolli

zlokalizowane są w regionie Pss-I razem z genami, których produkty biorą

udział w polimeryzacji i transporcie EPS. Region Pss-I ma wielkość 33,7

kpz, jest zlokalizowany na chromosomie i grupuje on geny, które noszą

wspólną nazwę pss, pochodzącą od ich funkcji, to jest syntezy

polisacharydu (ang. polysaccharide synthesis) [5].

Pierwszym krokiem w biosyntezie egzopolisacharydu R. leguminosarum

bv. trifolii jest przyłączenie glukozy do lipidowego nośnika, przy udziale

glukozylo-IP-transferazy PssA [10, 11]. Do glukozy dołączane są dwie

cząsteczki kwasu glukuronowego przy udziale glukuronozylo-β(1,4)-

glikozylotransferaz kodowanych przez pssC, pssE i pssD [12,13].

Białka uczestniczące w dalszym wydłużaniu powstającego oktameru nie

są znane. Najprawdopodobniej biorą w nim udział produkty genów pssF,

pssG, pssH, pssI, pssJ i pssS, które mogą być glikozylotransferazami. Geny

pssR i pssM przypuszczalnie kodują enzymy modyfikujące łańcuch

cukrowy poprzez przyłączanie grup acetylowych i pirogronianowych [5].

Kolejnymi genami zaangażowanymi w syntezę egzopolisacharydu są

pssP, pssO, pssN, pssT [14] oraz umieszczony dalej w genomie pssL [15].

Produkty tych genów są odpowiedzialne za polimeryzację i wyprowadzenie

z komórki polisacharydu [14].

Rys. 3. Schemat systemu polimeryzacji i transportu egzopolisacharydu

u Rhizobium leguminosarum bv. trifolii.

,



23

Badania prowadzone nad białkami zaangażowanymi w biosyntezę

polisacharydów wskazują na tworzenie złożonych kompleksów, w których

poszczególne białka mogą tworzyć homooligomery, a także oddziaływać

z innymi białkami kompleksu [16].

W niniejszej pracy analizom oddziaływań poddano te spośród

glikozylotransferaz, które zostały już scharakteryzowane funkcjonalnie,

tj. PssA i PssC oraz białka będące składnikami kompleksu polimeryzacji

i transportu EPS. Celem było zbadanie, czy glikozylotransferazy oddziałują

ze sobą oraz innymi białkami zaangażowanymi w biosyntezę EPS.

3. Materiały i metody

3.1. Bakteryjny System Dwuhybrydowy

Oddziaływania pomiędzy wybranymi białkami badane były przy użyciu bakteryjnego systemu dwuhybrydowego (BTH). System ten wykorzystuje szczep E. coli DHM1 z defektem genu cyklazy adenylowej (cya). Białko to można podzielić na dwa komplementarne polipeptydy, nazwane T18 i T25. Enzym jest aktywny tylko wtedy, gdy obie domeny są fizyczne połączone. Badanie oddziaływań między białkami polega na tworzeniu białek fuzyjnych, w skład których wchodzą komplementarne fragmenty katalitycznej domeny cyklazy adenylowej pochodzącej z Bordetella pertussis oraz badane białka. Interakcje pomiędzy nimi skutkują funkcjonalną komplementacją pomiędzy dwoma fragmentami cyklazy adenylowej, co prowadzi do syntezy cAMP, ten zaś łączy się z aktywatorem katabolicznym – CAP (ang. Catabolite Activator Protein). Kompleks cAMP-CAP ma plejotropowy wpływ na ekspresję genów, w tym indukuje operony kataboliczne, takie jak laktozowy czy maltozowy. Aktywowana przez kompleks ekspresja genu kodującego enzym β-galaktozydazę umożliwia bakterii rozkład cukrów takich jak maltoza, a tym samym wzrost na podłożu minimalnym z maltozą, jako jedynym źródłem węgla. Alternatywne dodanie do podłoża X-gal, który jest analogiem laktozy, umożliwia kolorymetryczną ocenę oddziaływań dzięki temu, że produkt jego rozkładu jest niebieski [17].

Wektory systemu BTH to plazmidy pochodne pUC19 i pSU40. Do pierwszego z nich, niosącego gen oporności na ampicylinę, sklonowano domenę T18 cyklazy adenylowej w pozycji 3’ (pUT18) lub 5’ (pUT18C) polinkera. Zatem kodowane w wektorze pUT18 białko fuzyjne zawiera domenę T18 na swoim końcu karboksylowym, a w pUT18C na końcu aminowym. pSU40 z kasetą oporności na kanamycynę został zmody-fikowany poprzez sklonowanie domeny T25, również w dwóch pozycjach w obrębie polilinkera. Powstały w ten sposób wektor pKT25 kodować będzie białko fuzyjne zawierające domenę cyklazy adenylowej na C-końcu, a pKTN25 na N-końcu badanego białka.


24

Rys. 4. Schemat obrazujący zasadę działania Bakteryjnego Systemu Dwuhybrydowego. A.

Aktywna cyklaza adenylowa produkowana przez szczep dziki, B. Fizycznie rozdzielone

podjednostki cyklazy adenylowej, które są nieaktywne, C. Interakcje pomiędzy białkami

fuzyjnymi zawierającymi fragmenty cyklazy adenylowej umożliwiają wytworzenie aktywnego białka, a tym samym syntezę cAMP, D. Tworzenie kompleksu cAMP-CAP i aktywacja genów

reporterowych [17, z własnymi modyfikacjami].

3.2. Konstruowanie wektorów kodujących badane białka fuzyjne

Geny kodujące glikozylotransferazy pssA i pssC które wybrano

do niniejszych badań amplifikowano w PCR z wykorzystaniem par

starterów zaprojektowanych w sposób umożliwiający klonowanie genu

w zgodnej ramce odczytu względem fragmentów kodujących domeny

cyklazy adenylowej. Do amplifikacji wykorzystano polimerazę o wysokiej

wierności (Pfu). Amplikony poddano trawieniu enzymami XbaI i BamHI

(dla pssC), BamHI i SalI (pssA do wektorów pUT18/pUT18C) oraz XbaI

i BamHI (pssA do wektorów pKT25/pKTN25). Po trawieniu DNA

oczyszczono i poddawano ligacji z właściwymi wektorami systemu BTH

(pUT18/pUT18C, pKT25/pKTN25). Wektory przed ligacją trawiono

odpowiednimi restryktazami, a następnie defosforylowano, aby zwiększyć

wydajność efektywnej ligacji wektora ze wstawką. Szczep E. coli DH5α

transformowano mieszaninami ligacyjnymi, a klony komórek, które

pobrały plazmidy selekcjonowano na podłożu LB zawierającym ampicylinę

lub kanamycynę. Wyszukiwanie klonów niosących plazmidy zrekombi-

nowane prowadzono metodą PCR z kolonii.

Wyizolowane DNA klonów, które dały pozytywny wynik w PCR

z kolonii poddano analizie restrykcyjnej i sekwencjonowaniu.

,



25

W kolejnych doświadczeniach wykorzystano plazmidy skonstruowane

w tej pracy, jak również plazmidy skonstruowane wcześniej, w których

sklonowano wybrane geny polimeryzacji i transportu EPS [16].

3.3. Analiza oddziaływań między białkami fuzyjnymi

w szczepie DHM1

Przygotowanymi konstruktami kodującymi białka fuzyjne

transformowano E. coli DHM1 (szczep reporterowy cya) i wysiewano

na selekcyjne podłoże LB z ampicyliną, X-gal i IPTG. Wszystkie kolonie

były koloru białego, co świadczy o tym, że obecność jednego plazmidu

BTH nie przyczynia się do komplementacji i przywrócenia aktywności

cyklazy adenylowej. Dla wybranych klonów oznaczono aktywność

β-galaktozydazy – w każdym przypadku oscylowała ona wokół wartości

300 U/mg (suchej masy bakteryjnej) zgodnie z charakterystyką zawartą

w opisie systemu BTH.

Do komórek zawierających pierwszy konstrukt wprowadzano w drodze

transformacji drugi plazmid, tj. pochodną wektora pKT25/pKTN25

kodującą białka fuzyjne. Mieszaniny po transformacji wysiewano na

podłoże selekcyjne LB z kanamycyną, ampicyliną, X-gal i IPTG.

Równocześnie wykonano kontrolę pozytywną z plazmidami kodującymi

fragmenty cyklazy adenylowej T25 i T18 połączonych z zamkiem

leucynowym z białka GCN4. Zamkiem leucynowym (ang. leucine zipper)

nazywany jest dimer złożony z dwóch α-helis bogatych w leucynę, dzięki

którym białko dimeryzuje.

Kolonie, które obserwowano na podłożach selekcyjnych po

wprowadzeniu drugiego konstruktu wykazywały różną barwę: białą lub

niebieską o różnej intensywności. Białe kolonie świadczą o braku

oddziaływań, a niebieskie o ich występowaniu.

Siłę interakcji mierzono aktywnością enzymu β-galaktozydazy, którego

gen jest pod kontrolą promotora regulowanego pozytywnie przez kompleks

cAMP-CAP. Wynik przynajmniej 4-5-krotnie wyższy od aktywności

uzyskanej dla komórek przed wprowadzeniem drugiego wektora uważany

jest za występowanie interakcji [18].


26

4. Wyniki i wnioski

Siłę oddziaływania pomiędzy danymi białkami w określonej orientacji

wobec fragmentu cyklazy adenylowej zobrazowano w postaci średniej

aktywności z niezależnych oznaczeń trzech wybranych klonów (rys. 5 i 6).

Rys.5. Zestawienie siły oddziaływań białka PssA z pozostałymi badanymi białkami Pss

mierzone aktywnością β-galaktozydazy w szczepie DHM1 niosącym dwa zgodne plazmidy

kodujące białka fuzyjne

Rys. 6. Zestawienie siły oddziaływań białka PssC z pozostałymi badanymi białkami Pss

mierzone aktywnością β-galaktozydazy w szczepie DHM1 niosącym dwa zgodne plazmidy

kodujące białka fuzyjne

,



27

Uzyskane wyniki świadczą o występowaniu złożonych zależności

między badanymi białkami. PssA i PssC w większości kombinacji

(zarówno orientacji wstawki wobec domeny cyklazy oraz kolejności

wprowadzania wektorów do szczepu reporterowego) wykazują bardzo dużą

aktywność (wielokrotnie przewyższając aktywność dla kontroli

negatywnej). Jedynie w przypadku pary plazmidów pUT18-A i pKT25-C

aktywność β-galaktozydazy jest równa kontroli negatywnej. Porównując

wyniki otrzymane dla par plazmidów niosących te same geny, czyli

zawierające dwa geny pssA lub pssC, również zauważyć można, że

większość z tych kombinacji wykazuje wysoką aktywność. Świadczyć to

może o zdolności do homodimeryzacji białek PssA i PssC.

W następujących parach plazmidów: pUT18-A i pKT25-T, pUT18C-A

i pKT25-L, pUT18-C i pKT25-T, pUT18C-C i pKT25-T, pUT18C-T

i pKT25-C, pUT18C-T i pKTN25-C, pUT18-C i pKT25-L, pUT18C-C

i pKT25-L notuje się wysoką aktywność β-galaktozydazy. Oznaczać to

może interakcje pomiędzy glikozylotransferazami PssA i PssC a białkami

systemu transportu PssT i PssL.

Uważa się, że regulacja procesu polimeryzacji EPS może odbywać się

na poziomie regulacji przepływu prekursorów cukrowych w wyniku

oddziaływania ko-polimerazy z inicjującą glikozylotransferazą.

Glikozylotransferazy PssA i PssC nie wykazały w systemie BTH interakcji

z białkiem PssP, które jest homologiczne do białek z rodziny kopolimeraz

PCP2a. Wynik taki oznacza prawdopodobny brak interakcji między

białkami, nie wyklucza natomiast ich roli w procesie regulacji stopnia

polimeryzacji i współdziałania na poziomie innym niż potranslacyjny.

Literatura

1. Kozłowski S., Swędrzyński A., Zielewicz W., 2011, Rośliny motylkowe

w środowisku przyrodniczym, Woda-Środowisko-Obszary Wiejskie 2011: T.

11 Z. 4 (36) Water-Environment-Rural Areas s. 161-181

2. Kopcewicz J., Lewak S., 2007, Fizjologia roślin, Wydawnictwo Naukowe

PWN, 246-258

3. Fraysse N., Couderc F., Poinsot V., 2003, Surface polysaccharide involvement

in establishing the rhizobium-legume symbiosis, Eur J Biochem. 270, 1365-

1380

4. Lepek V. C., D´Antuono A. I., 2005, Bacterial surface polysaccharides and

their role in the rhizobia-legume association, Lotus Newsletter 35, 1, 93-105

5. Skorupska A., Janczarek M., Marczak M., Mazur A., Król J., 2006, Rhizobial

exopolysaccharides: genetic control and symbiotic functions, Microbial Cell

Factories, 5:7

6. Marczak M., Mazur A., Gruszecki W.I., Skorupska A., 2008, PssO, a unique

extracellular protein important for exopolysaccharide synthesis in Rhizobium

leguminosarum bv. trifolii, Biochimie 90, 1781-1790


28

7. Islam S. T., Lam J. S., 2013, Wzx flippase-mediated membrane translocation

of sugar polymer precursors in bacteria, Environmental Microbiology 15, 4,

1001-1015

8. http://www.uoguelph.ca/~cwhitfie/bacterial_capsules.htmlł

9. Skorupska A., Król J., Mazur A., Marczak M., 2008, Genomika Rhizobium

leguminosarum – badanie genów syntezy polisacharydów powierzchniowych,

Biotechnologia, 27, 27-40

10. Janczarek M., Mazur A., Wielbo J., Król J., Skorupska A., 1999,

Egzopolisacharydy rizobiowe: struktura, biosynteza i funkcja w symbiozie, Post.

Mikrobiol., 38, 3, 217-244

11. van Workum W.A.T., Canter Cremers H.C.J., Wijfies A.H.M., van der Kolk

C., Wijffelman C.A., Kijne J.W., 1997, Cloning and characterization of four

genes of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii involved in exopolysaccharide

production and nodulation, Mol Plant Microbe Interact. 10, 290-301

12. Mazur A., Król J. E., Wielbo J., Urbanik-Sypniewska T., Skorupska A., 2002,

Rhizobium leguminosarum bv. trifolii PssP Protein Is Required

for Exopolysaccharide Biosynthesis and Polymerization, MPMI 15, 4, 388-397

13. Król J.E., Wielbo J., Mazur A., Kopcinska J., Łotocka B., Golinowski W.,

Skorupska A., 1998, Molecular characterization of pssCDE genes of

Rhizobium leguminosarum bv. trifolii strain TA1: pssD mutant is affected

in exopolysaccharide synthesis and endocytosis of bacteria, Mol Plant-

Microbe Interact. 11, 1142-1148

14. Wielbo J., Mazur A., Król J.E., Marczak M., Skorupska A., 2004,

Environmental modulation of the pssTNOP gene expression in Rhizobium

leguminosarum bv. trifolii, Can J Microbiol. 50, 201-211

15. Mazur A., Król J.E., Marczak M., Skorupska A., 2003, Membrane topology

of PssT, the transmembrane protein component of the type I exopolysaccharide

transport system in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii strain TA1; J Bacteriol.

185, 2503-2511

16. Marczak M., Dźwierzyńska M., Skorupska A., 2013, Homo – and heterotypic

interactions between Pss proteins involved in the exopolysaccharide transport

system in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, Biol. Chem. 394: 541-559

17. Karimova G., Pidoux J., Ullmann A., Ladant D., 1998, A bacterial two-hybrid

system based on reconstituted signal transduction pathway, Microbiology, 95,

5752-5756

18. Karimova G., Dautin N., Ladant D., 2005, Interaction network among

Escherichia coli membrane protein involved in cell division as revealed

by Bacterial Two-Hybrid analisis, Journal Od Bacteriology, 187, 2233-2243

http://www.uoguelph.ca/~cwhitfie/bacterial_capsules.html

,



29

Badanie oddziaływań między białkami zaangażowanymi w syntezę

EPS R. leguminosarum bv. trifolii

Streszczenie

Do wytworzenia efektywnej symbiozy pomiędzy bakterią wiążącą azot a jej roślinnym gospodarzem potrzebne jest nawiązanie swoistego dialogu pomiędzy partnerami

symbiotycznymi. Jest to proces złożony a czynnikami w nim uczestniczącymi są zarówno

sygnały roślinne (flawonoidy) jak i bakteryjne (białko NodD, czynniki Nod

i zewnątrzkomórkowe polisacharydy). W Rhizobium leguminosarum bv. trifolli ważnym czynnikiem umożliwiającym zakażenie jest egzopolisacharyd, będący cząsteczką szczepowo

specyficzną. Jest on wydzielany na powierzchnię komórki bakteryjnej a szlak jego syntezy

wykazuje homologię do tak zwanego systemu Wzx/Wzy-zależnego odpowiedzialnego za

produkcję polisacharydów kapsularnych E. coli. Geny odpowiedzialne za jego wytwarzanie oraz potencjalne interakcje pomiędzy poszczególnymi białkami biosyntezy EPS nie zostały dogłębnie

zbadane. W tej pracy analizie wzajemnych oddziaływań poddano glikozylotransferazy PssA

i PssC oraz składniki kompleksu polimeryzacji i transportu EPS, czyli PssP, PssT i PssL. Białka

te wybrano do badań, ponieważ ich geny zostały scharakteryzowane funkcjonalnie. Wykazano, że powyższe glikozylotranserazy homodimeryzują oraz mają zdolność do oddziaływania

z białkami PssT i PssL.

Słowa kluczowe: bakteryjny system dwuhybrydowy, egzopolisacharydy, rizobia, symbioza

The study of interactions between proteins involved in the synthesis

of EPS in R. leguminosarum bv. trifolii

Abstract

To produce an effective symbiotic interaction between rhizobia and the host plant, it is necessary to establish a specific dialogue between symbiotic partners. This complex

process involves signals of both leguminous plant (flavonoids) and bacteria (NodD protein,

Nod factors and extracellular polysaccharides). In Rhizobium leguminosarum bv. trifolli an

important enabling infection factor is exopolysaccharide, which is a strain-specific molecule. It is assembled in a Wzx/Wzy-dependent manner occurs in capsular

polysaccharide biosynthesis in E.coli and excreting to the bacterial cell surface. Genes

responsible for the production of EPS and the potential interactions between the proteins

of EPS’s biosynthesis pathway has not been fully explored. In this work were analyzed interactions between glycosyltransferases PssA and PssC and with the components of the

complex of polymerization and transport of EPS: PssP, PssL and PssT. These proteins were

chosen, because their genes were functionaly analyzed. It has been demonstrated that the

above glycosyltransferases interact with each other and in addition, both have a ability to interact with PssL and PssT proteins.

Keywords: bacterial two-hybrid system, exopolysaccharides, Rhizobia, symbiosis

30

Izabela Podgórska1, Monika Kordowska-Wiater, Monika Wójcik,

Łukasz Sęczyk

Enzymy lityczne – ich producenci i zastosowanie

1. Wstęp

Produkcja enzymów jest procesem wchodzącym w zakres zastosowań

białej biotechnologii, zajmującej się wykorzystaniem systemów biolo-

gicznych w przemyśle i ochronie środowiska [1]. Enzymy nie zużywają się,

dlatego w sprzyjających warunkach, przy braku czynników destrukcyjnych,

mogą działać nieskończenie długo. Zachowują aktywność poza komórką,

dlatego też poszczególne rodzaje enzymów mogą być z powodzeniem

izolowane, a po odpowiednim utrwaleniu, stanowią preparat charakter-

ryzujący się zdolnością do katalizowania określonego typu reakcji. W skali

przemysłowej enzymy otrzymuje się wykorzystując do tego celu mikro-

organizmy. Obecnie dzięki inżynierii genetycznej możemy otrzymać

preparaty o wybranej i ściśle określonej specyficzności, a dzięki temu

o nowych właściwościach i zastosowaniach w przemyśle. Organizmy

genetycznie zmodyfikowane charakteryzuje jednak duża zmienność i niska

stabilność w procesach technologicznych. W związku z tym doświadczenia

prowadzone są bardzo często na szczepach pochodzących ze środowiska

naturalnego [2].

W obecnych czasach globalnym trendem wydaje się być przesunięcie

w kierunku ograniczenia zużycia środków chemicznych, a tym samym

dostrzega się silne i narastające pragnienie poszukiwania bezpieczniejszych

i ekologicznych alternatyw walki z chorobami roślin. Produkcja enzymów

litycznych przez mikroorganizmy jest skutecznym czynnikiem

w biokontroli grzybów fitopatogennych. Właściwość tą dobrze poznano

przede wszystkim u grzybów strzępkowych, ale odkryto ją również

u drożdży. Enzymy lityczne (chitinazy, proteazy i glukanazy) wykazują

uzdolnienia do lizy ściany komórkowej grzybów patogennych [3]. Poza

bezpośrednim udziałem w antagonistycznych interakcjach pomiędzy

różnym organizmami, pełnią one także rolę w procesie żywienia, rozwoju,

różnicowania oraz autolizie [4]. Enzymy lityczne mają także szerokie

zastosowanie w innych dziedzinach np. w farmaceutyce, medycynie,

przemyśle spożywczym i chemicznym.

1 [email protected], Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Wydział Nauk o Żywności i Biotechnologii,

Katedra Biotechnologii, Żywienia Człowieka i Towaroznawstwa Żywności



,


31

2. Poszukiwanie mikroorganizmów produkujących enzymy

Zróżnicowanie drobnoustrojów w naturze jest ogromne, lecz nie wszystkie

z nich stanowią źródło enzymów przydatnych przemysłowo. Istotnym

zagadnieniem decydującym o powodzeniu produkcji enzymów przez

mikroorganizmy jest wyselekcjonowanie spośród wielu z nich odpowiednio

aktywnego szczepu, który odpowiada stawianym wymaganiom

technologicznym [1].

Najstarszą metodą pozyskiwania szczepów produkcyjnych jest ich

izolacja ze środowisk naturalnych, np. z gleby czy powierzchni roślin [5].

Innym źródłem szczepów przydatnych biotechnologicznie są kolekcje

placówek naukowych i wybranych zakładów przemysłowych lub duże

kolekcje centralne, w których zdeponowane są tysiące szczepów

muzealnych. Jednak przechowywana jest w nich tylko znikoma część

gatunków, szczepów i odmian występujących w przyrodzie, dlatego też nie

konkurują one skutecznie z naturalnym środowiskiem bytowania

drobnoustrojów, a dodatkowo długotrwałe utrzymywanie drobnoustrojów

w warunkach laboratoryjnych może prowadzić do utraty wielu pierwotnych

ich cech [6].

Poszukiwanie mikroorganizmów o oczekiwanych cechach, bytujących

w środowisku naturalnym, obejmuje następujące etapy:

wybór miejsca oraz pobranie próbek;

wstępną obróbkę próbek;

namnażanie drobnoustrojów i selekcje czystych kultur wyprowa-

dzonych z pojedynczych komórek;

testowanie przydatności wyizolowanych szczepów do wytwarzania

danych produktów [5].

Nowoczesne podejście w poszukiwaniu wydajnych enzymów wymaga

przetestowania około tysiąca mikroorganizmów z wykorzystaniem

szybkich, prostych oraz dobrze poznanych metod detekcji, w celu

eliminacji mało przydatnych wariantów. Następnie liczba wybranych

potencjalnych producentów zostaje zawężona w następstwie większego

zróżnicowania warunków hodowli i wykonania zaadaptowanej do tego celu

charakterystyki biochemicznej. Z wybranych szczepów izolowane są

enzymy, oczyszczane i testowane w specjalnie skonstruowanych na skalę

laboratoryjną układach modelowych, odzwierciedlających optymalne

warunki procesu.

Wydajne zastosowanie nowo poznanych enzymów w procesach

biotechnologicznych wymaga uzyskania dużej ilości białka o stosunkowo

wysokiej czystości. Z reguły naturalni producenci tych enzymów

wytwarzają je z niewielką wydajnością, tak więc wykorzystanie tych

szczepów w przemyśle jest ekonomicznie nieopłacalne. Z tej przyczyny

Izabela Podgórska, Monika Kordowska-Wiater, Monika Wójcik, Łukasz Sęczyk

32

istnieje ogromne zapotrzebowanie na ulepszone szczepy drobnoustrojów,

charakteryzujące się wysoką aktywnością metaboliczną i potrafiące

wytwarzać pożądane enzymy z nawet tysiąc krotnie większą wydajnością

niż ich pierwotni producenci. Metody ulepszania drobnoustrojów oparte są

w dużej mierze na technologii rekombinacji DNA. Obecnie m. in. dzięki tej

metodzie szeroko wykorzystuje się w biotechnologii rekombinowane

szczepy drożdży, grzybów strzępkowych czy bakterii. Szczepy przemysłowe

udoskonalane są także na drodze mutacji indukowanych i selekcji [1].

Istotnym zagadnieniem decydującym o powodzeniu mikrobiologicznej

produkcji określonych substancji, w tym enzymów, jest wyselekcjonowanie

odpowiednio aktywnego szczepu, który powinien odpowiadać następującym

kryteriom:

musi być niepatogenny;

nie może wytwarzać szkodliwych i toksycznych produktów;

musi wykazywać stabilność biologiczną [5].

3. Charakterystyka enzymów litycznych

Ważną rolę w zwalczaniu fitopatogenów pełnią enzymy lityczne,

tj. chitynazy, β-1,3-glukanazy i proteazy oddziałujące na ściany komórkowe

grzybów patogennych. Ich obecność w filtratach pohodowlanych może

wpływać niekorzystnie na wzrost oraz zdolności produkcyjne komórek [7].

Chitynazy (EC 3.2.1.14) należą do grupy enzymów zdolnych do

degradacji chityny bezpośrednio do niskocząsteczkowych produktów.

Degradacja enzymatyczna chityny następuje w dwóch etapach, mianowicie

endochitynazy rozkładają polimer do oligomerów, które następnie są

degradowane przez egzochitynazy do monomerów [8]. Chitynazy są

wytwarzane przez szeroką gamę mikroorganizmów, mianowicie bakterie,

grzyby, owady, rośliny wyższe oraz zwierzęta.

Na podstawie podobieństwa sekwencji aminokwasów, chitynazy zostały

zaliczone do 18, 19 i 20 rodziny hydrolaz glikozydowych. Rodzina 18 jest

zróżnicowana ewolucyjnie i zawiera chitynazy bakteryjne, grzybowe,

wirusowe, zwierzęce, a także kilka roślinnych. Rodzina 19 złożona jest

z chitynaz roślinnych (klasa I, II i III) oraz kilku chitynaz pochodzących ze

Streptomyces. Te dwie rodziny nie wykazują podobieństwa w sekwencji

aminokwasowej. Posiadają one zupełnie inną trójwymiarową strukturę

i mechanizmy molekularne, więc prawdopodobnie pochodzą od ewolucyjnie

różnych przodków. Rodzina 20 obejmuje β-N-acetyloheksoaminidazy

pochodzące z bakterii, Streptomyces oraz ludzi. Bakteryjne chitynazy są

wyraźnie podzielone na trzy główne podrodziny - A, B i C, ze względu na

sekwencję aminokwasową w indywidualnej domenie katalitycznej [9].

https://www.google.com/search?hl=pl&q=%CE%B2-N-acetyloheksoaminidaza&spell=1&sa=X&ei=OXdUUal4waM9wPeB6AE&ved=0CC0QBSgA

https://www.google.com/search?hl=pl&q=%CE%B2-N-acetyloheksoaminidaza&spell=1&sa=X&ei=OXdUUal4waM9wPeB6AE&ved=0CC0QBSgA

,


33

Analiza chitynaz z bakterii, grzybów i roślin pozwoliła zidentyfikować

w nich odrębne domeny. Badania wykazały, że chitynazy z roślin takich jak

tytoń, fasola, burak cukrowy, itp. zawierają tylko jedną domenę katalityczną.

Natomiast zewnątrzkomórkowe chitynazy drożdżowe posiadają cztery

domeny, mianowicie sekwencję sygnałową, domenę katalityczną, region

bogaty w serynę/treoninę (akceptorowa strona dla O-glikozylacji) oraz C-

końcową domeną wiążącą chitynę. Chitynazy grzybów Rhizopus

oligosporus, R. niveus oraz pasożyta Brugia malayi także wykazały obecność

regionów bogatych w ser/thr. Opisano sześć różnych chitynaz (A1, A2, B1,

B2, C, i D), które były wydzielone do podłoża przez Bacillus circulans.

Wśród nich chitynaza A1 jest najobficiej produkowana i wykazuje silne

powinowactwo do nierozpuszczalnej chityny [10].

W hodowlach laboratoryjnych Trichoderma mających na celu ocenę

uzdolnień enzymatycznych wykazano, że najlepszymi warunkami indukcji

zewnątrzkomórkowych chitynaz jest wzrost w podłożu zawierającym

oczyszczoną chitynę, grzybnię lub ścianę komórkową jako jedyne źródło

węgla. Zauważono także, że glukoza, sacharoza albo produkty degradacji

chityny mogą powodować inhibicję chitynaz, co może sygnalizować

o regulacji ich biosyntezy na poziomie represji katabolicznej. Chitynazy

pochodzące z różnych źródeł wykazują inne mechanizmy indukcji,

tzn. podczas zjawiska mykoparazytyzmu (rozkładanie ściany komórkowej

innych grzybów) rodzaj wydzielanego enzymu związany jest z grzybem

– gospodarzem. Kolejne badania chitynaz wskazały, że niektóre z nich

(jednakże w niewielkich ilościach) są produkowane konstytucyjnie,

np. CHIT 42, CHIT 33 czy N-acetylo-β-D-glukozoaminidaza (102 kDa).

Chitynazy mogą być także syntetyzowane w warunkach stresowych lub

głodowych, obniżając sztywność ściany komórkowej.

Obok chitynaz znaczący udział w degradacji biopolimerów ścian

komórkowych grzybów patogennych mają również β-1,3-glukanazy (EC

3.2.1.39) [4]. Szereg endo- i egzo- β-1,3- glukanaz zawierają drożdże

Saccharomyces cerevisiae. Przypuszcza się, że około 15 genów tych

drożdży koduje glukanazy oraz enzymy o pokrewnych aktywnościach.

Niektóre z tych glukanaz odgrywają rolę podczas separacji komórek, inne zaś

wykazują aktywność transglikozylazy i mogą być związane z rozbudową

i przekształcaniem łańcuchów β-1,3-glukanu oraz sieciowaniem tego

polimeru do innych komponentów ściany komórkowej. Dowiedziono, iż

usunięcie genu ENG1, kodującego u S. cerevisiae endo-β-1,3-glukanazę,

doprowadziło do zbrylania komórek. Pojedyncze usuwanie genów SCW3,

SCW4 i SCW10, które mogą kodować rozpuszczalne glukanazy ściany

komórkowej, nie miało istotnego wpływu na fenotyp, ale zakłócenie

pokrewnego genu SCW11 powoduje wyraźne hamowanie separacji

komórek po podziale. Dowiedziono również, że usunięcie genu GAS1


34

u S. cerevisiae doprowadziło do kilku wad morfogenetycznych oraz do

wyraźnego spadku w stopniu usieciowania β-1,3-glukanu do innych

polimerów ściany.

Aktywność glukanolityczna została także wykryta w ścianie

komórkowej patogenów układu oddechowego Aspergillus fumigatus,

Coccidioides posadasii i Coccidioides immitis. Niektóre ze znalezionych

enzymów wykazują zarówno aktywność glukanazy i transglikozydazy,

podobnie jak w przypadku glukanaz drożdżowych, co może odgrywać rolę

w przebudowie ściany komórkowej podczas morfogenezy. U A. fumigatus

wykryto monomeryczne i dimeryczne egzo-β-1,3-glukanazy o masie

cząsteczkowej odpowiednio 82 kDa i 230 kDa oraz endo-β-1,3-glukanazy

o masie 74 kDa [11].

Proteazy są enzymami proteolitycznymi mającymi zdolność hydrolizy

wiązania peptydowego. Termin „proteazy” można używać zamiennie

z określeniem „peptydazy”- obydwa jako ogólne określenie dla egzo-

i endopeptydaz. Podział podklasy peptydaz jest kłopotliwy przez wzgląd na

to, iż specyficzność tych enzymów jest na ogół trudna do zdefiniowania

i zależy od budowy kilku aminokwasów znajdujących się w sąsiedztwie

hydrolizowanego wiązania oraz od konformacji całego łańcucha

polipeptydowego substratu. Z tej przyczyny dodatkowym kryterium

klasyfikacji tej podklasy jest mechanizm katalizy enzymatycznej

aminopeptydazy [12].

Enzymy te można podzielić na endo- i egzopeptydazy. Endopeptydazy

(EC 3.4.21-24 i EC 3.4.99) hydrolizują wiązania peptydowe wewnątrz

łańcucha polipeptydowego białek na fragmenty peptydowe różnej długości,

natomiast egzopeptydazy (EC 3.4.11-19) rozkładają wiązania peptydowe

na końcach łańcucha peptydowego. Egzoproteazy odszczepiające skrajne

C- oraz N- końcowe reszty aminokwasowe klasyfikuje się jako

karboksypeptydazy oraz aminopeptydazy [12, 13].

4. Enzymy lityczne- zastosowanie

Produkcja enzymów hydrolitycznych jest skutecznym czynnikiem

biokontroli grzybów fitopatogennych. Właściwość tą dobrze poznano

i opisano przede wszystkim u grzybów strzępkowych. Grzyby z rodzaju

Trichoderma przy udziale kompleksu enzymów litycznych, określanych

skrótem CWDEs (Cell Wall Degrading Enzymes), skutecznie degradują

ścianę komórkową fitopatogenów. Wśród tych enzymów kluczową rolę

w kontroli biologicznej odgrywają enzymy chitynolityczne, β-1,3-glukanazy

i proteinazy [14]. Zdolność produkcji enzymów litycznych została także

poznana u niektórych drożdży. Badania wykazały, że β-1,3-glukanazy

wytwarzane są przez drożdże C. laurentii, R. glutinis, P. membranifaciens,

,


35

Pichia anomala, A. pullulans, Tilletiopsis albescens, T. pallescens.

Produkcję chitynaz natomiast stwierdzono u drożdży Candida saitoana,

A. pullulans, T. albescens i T. pallescens. Enzymy te hamowały wzrost

licznych patogenów grzybowych, co przedstawia tabela nr 1 [15].

Tab. 1. Enzymy lityczne wybranych antagonistycznych drożdży [15]

Produkowany

enzym

Antagonistyczny producent Wrażliwy fitopatogen

chitynaza

Aureobasidium pullulans,

Tilletiopsis albescens,

Tilletiopsis pallescens,

Candida saitoana

Penicillium expansum,

Puccinia xanthii, Botrytis

cinerea

β-1,3-glukanaza

Rhodotorula glutinis,

Pichia anomala,

Pichia membranifaciens,

Cryptococcus laurentii,

Aureobasidium pullulans,

Tilletiopsis albescens,

Tilletiopsis pallescens

Botrytis cinerea, Penicillium

expansum, Rhizopus

stolonifer, Sphaerotheca

fuliginea, Aspergillus niger,

Puccinia xanthii

Enzymy lityczne mogą być wykorzystywane w bardzo szerokim

zakresie, nie tylko w biologicznej ochronie przeciwko niektórym

fitopatogenom grzybowym, ale też np. przy produkcji protoplastów,

w medycynie, przemyśle farmaceutycznym, spożywczym i chemicznym.

Grzyby zawierają w swojej ścianie komórkowej chitynę, dlatego

zastosowanie enzymów chitynolitycznych wraz z innymi enzymami

degradującymi ścianę komórkową, pozwala na otrzymanie protoplastów.

Protoplasty grzybów są stosowane jako efektywne narzędzie eksperymentalne

w poznawaniu mechanizmów syntezy ściany komórkowej, czy w nauce

o syntezie i sekrecji enzymów. W przeprowadzonych badaniach potwierdzono

efektywność chitynaz Enterobacter sp. NRG4 w tworzeniu protoplastów

z Trichoderma reesei, Pleurotus florida, Agaricus bisporus i Aspergillus niger.

Wyizolowano również protoplasty z Schizophylum commune używając w tym

celu filtraty B. circulans KA-304. Kompleks enzymów B. circulans WL-12

o wysokiej aktywności chitynolitycznej okazał się skuteczny w wytwarzaniu

protoplastów z drożdży Phaffia rhodozyma.

Tempo narastania deficytu białka na świecie oraz jego skala

spowodowały, że poza tradycyjnymi metodami biosyntezy białka, podjęto

się opracowania niekonwencjonalnych mikrobiologicznych sposobów.

Produkty takie określono skrótowo SCP (single cell protein), czyli białko


36

z pojedynczych komórek. Obejmują one preparaty pochodzenia

grzybowego, bakteryjnego, jak również z glonów. W celu otrzymania SCP

z odpadów zawierających chitynę zastosowanie znalazły chitynazy.

Zazwyczaj do pozyskania SCP stosuje się grzyby oraz drożdże takie jak

Hansenula polymorpha, Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae

i Myrothecium verrucaria. Kryteriami do oceny produkcji SCP są: wzrost

wydajności, ogólne białko oraz zawartość kwasów nukleinowych.

Zawartość białek w wykorzystywanych mikroorganizmach powinna

mieścić się między 39 a 73%, natomiast kwasy nukleinowe w granicy 1-11%.

Najlepszym mikroorganizmem stosowanym w tym celu jest S. cerevisiae,

ponieważ zawiera >60% białka i 1-3% kwasów nukleinowych.

Istnieje wiele metod oceny ilościowej grzybów znajdujących się w glebie.

Techniki te obejmują bezpośrednią obserwację mikroskopową, a także

ekstrakcję z mikroorganizmu pewnych specyficznych cząsteczek

sygnalizacyjnych. Oceny tej dokonać można też przy pomocy chitynaz.

Istnieje silna korelacja pomiędzy aktywnością chitynaz a populacją grzybów

w glebie, zatem aktywność tych enzymów wydaje się być odpowiednim

wskaźnikiem oceny pojawienia się tych drobnoustrojów. Takie powiązanie

nie jest widoczne w przypadku bakterii czy promieniowców. Podobnie

chitynazy i białka związane z chityną, mogą być użyte w celu detekcji

zakażeń grzybowych u ludzi [9].

Chitynazy odgrywają również ważną rolę w morfogenezie drożdży

i owadów. Wykazano, iż chitynazy mają wpływ na separacje komórek

podczas wzrostu drożdży S. cerevisiae. Ekspresja genu chiA u S. pombe

powodowała opóźnienie wzrostu komórek i ich wydłużanie, natomiast

kiedy ekspresja dotyczyła genu choA nastąpił obrzęk komórek. Ekspresja

obu genów na raz powodowała wydłużenie i pogrubienie komórek [16].

Enzymy lityczne stosowane są także w produkcji chitooligosacharydów,

glukozaminy i GlcNAc. Substancje te mają szerokie zastosowanie

farmaceutyczne. Chitoheksozy i chitoheptozy wykazują działanie przeciw-

nowotworowe. Chitynazy z Vibrio alginolyticus są używane do wydzielenia

chitopentoz i chitotrioz z koloidalnej chityny. Produkcja chitooligo-

sacharydów wymaga wysokiego poziomu endochitynaz i niższego poziomu

N-acetyloglukozaminidazy i egzochitynaz, natomiast w celu wytworzenia

GlcNAc niezbędny jest wysoki poziom egzochitynaz i N-acetyloglukoza-

minidazy. Enzymy chitynolityczne z N. orientalia IFO12806 są stosowane

do wydzielenia GlcNAc z chitooligosacharydów.

Enzymy chitynolityczne mają także zastosowanie medyczne, bowiem

wzmacniają one aktywność leków przeciwgrzybicznych, a także mogą być

dodawane do kremów i balsamów stosowanych na te schorzenia miejscowo [9].

Opisano aktywność chitynaz w surowicy ludzkiej, co sugeruje, iż może

to być mechanizm obronny przeciwko patogenom grzybowym. Enzym

,


37

chitotriozydaza służy jako marker w chorobie Gauchera – uwarunkowanej

genetycznie lizosomalnej chorobie spichrzeniowej, która spowodowana jest

odkładaniem glukozyloceramidu w komórkach [10].

β-glukanazy mogą być stosowane jako dodatki do pasz zwierząt

gospodarskich. Dodaje się je głównie do paszy opartej na jęczmieniu, który

jest bogaty w β-glukany. Dodatek enzymu ma na celu przede wszystkim

podniesienie strawności jelitowej białka i β-glukanów u karmionych daną

paszą zwierząt [17].

Innym przemysłowym zastosowaniem β-glukanazy jest degradacja

β-glukanu podczas filtrowania brzeczki lub piwa. β-glukan występujący

w słodzie wpływa niekorzystnie, bowiem generuje powstawanie zmętnień,

osadów lub żelu w gotowym piwie. Powoduje on także wolną separację

brzeczki oraz słabą filtrację piwa, jak też powstawanie osadów w czasie

jego przygotowywania. Kluczową rolę w degradacji β-glukanu w warunkach

przemysłowych z całą pewnością odgrywają endo-β-glukanazy. Zastosowanie

optymalnych warunków zacierania, powodujących zachowanie Endo-

gennych β-glukanaz czy też dodanie ich podczas zacierania lub leżakowania

może obniżyć ilość β-glukanu w piwie poniżej dopuszczalnego poziomu.

Enzymy te mogą zmniejszyć masę cząsteczkową β-glukanów lub też

całkowicie je degradować [18].

Preparaty β-glukanaz są wykorzystywane przy produkcji win,

szczególnie do otrzymywania win wytwarzanych z winorośli

zaatakowanych przez patogen Botrytis cinerea. Enzym ten jest najczęściej

dodawany pod koniec procesu fermentacji alkoholowej lub przed wtórną

fermentacją jabłczanowo- mleczanową. Preparaty enzymatyczne są

stosowane w procesach maceracji, polepszających smak i intensywność

koloru produktu oraz klarowania przyspieszającego sedymentację,

stabilizację, filtrację, a także wzmocnienie potencjału dojrzewania [1].

Enzymy proteolityczne produkowane m.in. przez drożdże:

Debaryomyces hansenii, Geotrichum candidum, Kluyveromyces lactis,

Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Rhodotorula mucilaginosa,

Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Trichosporon

cutaneum (beigelii) razem z enzymami lipolitycznymi znalazły

zastosowanie w dojrzewaniu serów. Enzymy te umożliwiają bardziej

zaawansowaną i szybszą hydrolizę protein (także niskocząsteczkowych

tzw. gorzkich peptydów) oraz tłuszczu mlecznego, do prekursorów

substancji aromatycznych, takich jak aminokwasy czy kwasy tłuszczowe.

Gatunek drożdży D. hanseni oprócz aktywności proteolitycznej

i lipolitycznej wykazuje zdolności do hamowania m.in. germinacji

przetrwalników Clostridium butyricum oraz wzrostu niektórych gatunków

grzybów pleśniowych i drożdży, głównie za sprawą wydzielanych

do środowiska toksyn killerowych. Antagonistyczne uzdolnienia drożdży

http://pl.wikipedia.org/wiki/Choroby_genetyczne

http://pl.wikipedia.org/wiki/Choroby_genetyczne

http://pl.wikipedia.org/wiki/Lizosomalne_choroby_spichrzeniowe


38

D. hansenii w stosunku do innych mikroorganizmów wskazują na

potencjalną możliwość zastosowania tego gatunku jako czynnika

biokontroli mlecznych produktów spożywczych [19].

Enzymy proteolityczne są wykorzystywane także w przemyśle

detergentów. Te biologiczne katalizatory stosowane są jako dodatkowe

komponenty proszków do prania, środków myjących do zmywarek

i detergentów. Korzyści wynikające z zastosowania enzymów w środkach

piorących to przede wszystkim: lepszy efekt doczyszczania, krótszy czas

prania (mniejsze zużycie wody), obniżenie temperatury prania (obniżenie

ilości zużywanej energii), ograniczenie negatywnego wpływu na

środowisko (biodegradowalność enzymów).

Stosowanie enzymów w środkach piorących cieszy się coraz większym

zainteresowaniem, ponieważ w ostatnich latach, szczególnie w Europie,

obserwuje się rosnące zainteresowanie procesami prania prowadzonymi

w niższych temperaturach [1].

5. Podsumowanie

Zróżnicowanie mikroorganizmów w przyrodzie jest ogromne. Każdego

roku odkrywane są nowe szczepy, jednak spośród wielu z nich należy

wyselekcjonować odpowiednio aktywne drobnoustroje, które spełniają

określone wymagania technologiczne. Konieczne są ciągłe badania nad

poznaniem ich szlaków metabolicznych oraz substancji biorących w nich

udział. Enzymy lityczne wytwarzane przez mikroorganizmy znalazły

szerokie zastosowanie, m.in. w biokontroli grzybów fitopatogennych.

Obecnie biologiczne metody walki z chorobami grzybowymi cieszą się

rosnącym zainteresowaniem i stanowią alternatywę dla metod chemicznych.

Enzymy lityczne wykorzystywane są jednak nie tylko w ochronie

biologicznej, ale też w innych gałęziach przemysłu. Z ich praktycznym

zastosowaniem spotykamy się w życiu codziennym, używając detergentów,

środków piorących, sięgając po niektóre leki, czy produkty żywnościowe.

Literatura

1. Ratledge C., Kristiansen B.: Podstawy biotechnologii, PWN, Warszawa 2011

2. Nowak D., Nowak A.: Kinetyka wzrostu biomasy oraz biosyntezy enzymów

amylolitycznych przez drożdże Saccharomycopsis fibuligera podczas hodowli

w bioreaktorze, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 1(62), 28-36, 2009

3. Gohel V., Singh A., Vimal M., Ashwini P., Chatpar H. S.: Bioprospecting and

antifungal potential of chitinolytic microorganisms, African Journal

of Biotechnology Vol. 5 (2), 54-72, 2006

4. Witkowska D., Stolaś J., Kancelista A., Piegza M.: Uzdolnienia lityczne

grzybów z rodzaju Trichoderma w obecności biomasy fito patogenów, Acta

Sci. Pol., Biotechnologia 8(2), 17-25, 2009

,


39

5. Bednarski W., Fiedurek J.: Podstawy biotechnologii przemysłowej, Wyd.

Naukowo-Techniczne, Warszawa 2004

6. Chmiel A.: Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN,

Warszawa 1998

7. Janas P., Podgórska E., Mleko S., Pielecki J.: Biosynteza enzymów

proteolitycznych i ich wpływ na aktywność celulaz Trichoderma reesei.

Annales UMCS, Sec. E, 59 (1), 461-469, 2004

8. Sandhya C., Binod P., Nampoothiri K. M., Szakacs G., Pandey A.: Microbial

synthesis of chitinase in solid cultures and its potential as a biocontrol agent

against phytopathogenic fungus Colletotrichum gloeosporioides, Appl.

Biochem. Biotechnol., 127 (1), 1-15, 2005

9. Dahiya N., Tewari R., Hondal G. S.: Biotechnological aspects of chitinolytic

enzymes: a review, Appl. Microbiol. Biotechnol. 71, 773-782, 2006

10. Patil R. S., Ghormade V., Deshpande M. V.: Chitinolytic enzymes: an

exploration, Enzyme and Microbial Technology 26, 473-483, 2000

11. Adams D. J.: Fungal cell wall chitynases and glucanases, Microbiology, 150,

2029-2035, 2004

12. Baraniak B., Gawlik- Dziki U., Karaś M., Kowalczyk D., Szymanowska U.,

Świeca M., Wójcik W., Złotek U.: Enzymologia w zarysie, Wydawnictwo

CZELEJ, Lublin 2011

13. Włóka E.: Zewnątrzkomórkowe enzymy hydrolityczne wytwarzane przez grzyby

owadobójcze- rola w procesie infekcji, Postępy Biochemii, 57 (1), 115-121, 2011

14. Wojtkowiak- Gębarowska E.: Mechanizmy zwalczania fitopatogenów glebowych

przez grzyby z rodzaju Trichoderma, Post. Mikrobiol. 45, 261-273, 2006.

15. El-Tarabily K. A., Sivasithamparam K.: Potential of yeasts as biocontrol

agents of soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters,

Mycosci. 47, 25-35, 2006

16. Shimono K., Matsuda H., Kawamukai M.: Functional expresion of chitinase

and chitosanase, and their effects on morphologies in the yeast

Schizosaccharomyces pombe, Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1143-1147, 2002

17. Hanczakowska E., Koczywąs E.: Zastosowanie enzymów rozkładających

polisacharydy nieskrobiowe w żywieniu świń, Wiadomości Zootechniczne,

R. XLVI, 2: 9-16, 2008

18. Czarnecki Z., Czarnecka M., Śpiewak A.: Zmiany wysokocząsteczkowych

β-glukanów i aktywności β-glukanazy w procesie słodowania jęczmienia

browarnego, Acta Sci. Pol., Technologia Alimentaria 3 (2), 137-146, 2004

19. Szczepaniak G., Wojtatowicz M.: Dobór szczepów Yarrowia lipolytica

i Debaryomyces hansenii do szczepionki wspomagającej proces dojrzewania

sera, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 6 (79), 192-203, 2011


40


Streszczenie Intensywny rozwój technik współczesnej biotechnologii, wydzielenie indywidualnych

enzymów komórkowych oraz identyfikacja nowych enzymów, o nieznanych dotąd

właściwościach, spowodowały, iż stały się one nowym elementem kształtowania procesów

technologicznych. W komórkach mikroorganizmów znajduje się ogromna różnorodność enzymów, a w zależności od warunków środowiska, uruchamiana jest synteza takiego

enzymu, który w danych warunkach jest komórce niezbędny. Nie wszystkie drobnoustroje

stanowią źródło enzymów przydatnych przemysłowo, dlatego istotnym zagadnieniem jest

wyselekcjonowanie spośród wielu mikroorganizmów odpowiednio aktywnego szczepu, który odpowiada stawianym wymaganiom technologicznym. Produkcja enzymów

hydrolitycznych, w szczególności chitynaz i glukanaz jest cechą powszechną u wielu

efektywnych czynników kontroli biologicznej. Cecha ta została dobrze poznana u grzybów

strzępkowych z rodzaju Trichoderma, ale stwierdzono ją także u niektórych drożdży.

Enzymy lityczne wykazują ogromny potencjał i mogą być wykorzystywane w bardzo

szerokim zakresie, nie tylko w biologicznej ochronie roślin przeciwko niektórym patogenom

grzybowym, ale też między innymi przy produkcji pasz, w farmaceutyce, medycynie,

czy przemyśle detergentów.

Słowa kluczowe: biokontrola, enzymy lityczne, skrining

Lytic enzymes – their producers and application

Abstract

Intensive development of the modern biotechnology techniques, secretion of individual

cellular enzymes and identification of new enzymes with unknown properties, caused that they have become a new element in shaping technological processes. The microbial cells

have a great variety of enzymes. Not all microbes are the source of industrially useful

enzymes, therefore an important issue is to select the most active strain, from a variety

of microorganisms, which corresponds to the particular requirements for technology. The production of hydrolytic enzymes, especially chitinases and glucanases is a common feature

of many effective agents of biological control. This feature is well known in the filamentous

fungi of the genus Trichoderma, but it can also be found in some yeasts. Lytic enzymes have

enormous potential and can be used in a very wide range, not only in biological plant protection against some phytopathogenic fungi, but also in the production of animal feed,

pharmaceutical, medical, and industrial detergents.

Keywords: biocontrol, lytic enzymes, screening

41

Magdalena Bartosiak1, Anna Cieślak

Zastosowanie grzybowej lakazy

w procesie bioremediacji

1. Wstęp

Grzyby to niewątpliwie bogate źródło cząsteczek enzymatycznych,

zdolnych do przyspieszania skomplikowanych reakcji chemicznych. Ze

względu na potencjalne zastosowanie w detoksykacji zanieczyszczeń

i bioremediacji związków fenolowych, w ostatnim czasie wzrosło

zainteresowanie grzybową laktazą [1]. Za pomocą tego enzymu możliwe

jest przekształcenie drewna, tworzyw sztucznych, farb, paliw i wielu

innych materiałów w składniki odżywcze. Obecnie wykorzystuje się je

m.in. w przetwórstwie celulozy. Ponadto, ostatnie badanie sugerują, że

użycie grzybów degradujących ligninę, takich jak Phanerochaete

chrysosporium może w przyszłości zastąpić niektóre chemiczne etapy

produkcji papieru [2]. Stosowanie enzymów do usuwania zanieczyszczeń

przyciąga uwagę naukowców ze względu na dużą skuteczność metody,

wysoką selektywność i bezpieczeństwo dla środowiska. Prowadzone są

także badania nad ulepszeniem produkcji lakazy, a mianowicie testowanie

nowych szczepów, modyfikowanie warunków wzrostu, stosowanie

induktorów czy wykorzystanie nowych podłóż wzrostowych

pozyskiwanych z odpadów spożywczych i rolnych [3].

2. Charakterystyka lakazy

Lakaza to oksydoreduktaza zawierająca w swojej cząsteczce atom

miedzi. Katalizuje reakcje jednoelektronowego utlenienia różnorakich

substratów, np. fenoli bądź aromatycznych lub alifatycznych amin, do

odpowiednich rodników, przy użyciu tlenu cząsteczkowego jako

końcowego akceptora elektronów, tzn. katalizuje redukcję tlenu

cząsteczkowego do wody z pominięciem etapu powstawania nadtlenku

wodoru [3,4]. Lakaza jest jednym nielicznych enzymów, nad którym

nieustannie od XIX wieku, trwają prace mające na celu poznanie ich

innowacyjne właściwości i zastosowanie. Po raz pierwszy opisana została

1 Email: [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii

i Biotechnologii, Zakład Biochemii, Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron”



42

w 1883 roku przez Yoshidam. Naukowiec wizował enzym z japońskiego

drzewa Rhus vernicifera [3].

Lakazy to glikoproteiny o masie cząsteczkowej 50-130 kDa. Część

węglowodanowa zawiera głównie mannozę, N-acetyloglukozaminę,

galaktozę i stanowi 45% masy cząsteczkowej enzymu pochodzenia

roślinnego. Grzybiczne lakazy charakteryzują się niższą zawartością

węglowodanów (10-20%), np.: w składzie lakazy pochodzącej z P.eryngii

ilość oligosacharydów waha się od 1 do 7% [8]. Rolą tej części enzymu jest

stabilizacja globularnej struktury białka oraz ochrona przed procesem

proteolizy i inaktywacją cząsteczki przez wolne rodniki [9, 10].

2.1. Źródła lakazy

Enzym lakaza rozpowszechniony jest szczególnie wśród

ligninolitycznych podstawczaków, ale występują również w komórkach

niektórych prokariotów, owadów i roślin. Fakt ten sugeruje, że białko

występuje dość powszechnie w naturze [4].

Poza wyizolowaniem lakazy przez Yoshidam z drzewa, enzym

pochodzenia roślinnego jest rzadkością. Wykrywanie i oczyszczanie

enzymu w roślinach jest często trudne z powodu obecności w surowym

ekstrakcie roślinnym dużej ilości enzymów oksydacyjnych o szerokiej

speficzności substratowej. W literaturze można znaleźć jedynie częściową

charakterystykę lakazy pochodzącej z Rhus succedanea, Acer

pseudoplatanus, Pinus taeda, Populus euramericana, Liriodendron

tulipifera, Nicotiana tobacco, Lolium perenne i Zea mays.

Większość opisywanych lakaz wyizolowane zostały z grzybów

wyższych, głównie grzybów ligninolitycznych, glebowych saprofitów

i fitopatogenów grzybowych oraz jadalnych grzybów kapeluszowych,

np.: pieczarki Agaricus bisporus, boczniaka Pleurotus ostreatus. Po raz

pierwszy dokonali tego Bertrand i Laborde w 1896 roku. Większość

ligninolitycznych gatunków grzybów jest zdolna do konstytutywnego

wytwarzania przynajmniej jednego izoenzymu lakazy. Największa

aktywność enzymu występuje u workowców i podstawczaków. Przykładem

fitopatogenicznych grzybów typu ascomycetes będących źródłem lakazy są

Melanocarpusalbomyces, Cerrena unicolor, Magnaporthe grisea, Trametes

versicolor, Trichoderma reesei oraz Xylaria polymorpha. Producentami

lakazy są również saprofityczna Myceliophthora thermophila i Chaetomium

thermophilum, które biorą udział w procesie humifikacji. Ponadto enzym

i geny go kodujące zidentyfikowano u Botrytis cinerea – patogena moszczu

winogronowego [3].

Wśród drożdży źródło lakazy wykryto dotychczas tylko u ludzkiego

patogena drożdżowego Cryptococcus (Filobasidiella) neoformans. Ten typ

,

Zastosowanie grzybowej lakazy w procesie bioremediacji

43

drożdży zdolny jest do wytwarzania lakazy, ściśle związanej ze ścianą

komórkową, zdolnej do utleniania fenoli i aminofenoli i przyczyniającej się

do oporności na fungicydy [6].

Pierwsza bateryjna laktaza wyizolowana została z wolno żyjących

glebowych bakterii azotowych Azospirillum lipoferum . Bacillus subtilis

zdolny jest do produkcji termostabilnej CotA lakazy, który uczestniczy

w wytwarzaniu pigmentu osłonki endospor. Z kolei endospory Bacillus

licheniformis, po ówczesnej izolacji z gleby, wytwarzają lakazę

zaangażowaną w degradację fenoli. Ponadto, producentem enzymu jest

Streptomyces lavendulae oraz Streptomyces cyaneus [3].

2.2. Lokalizacja lakazy w komórce

Biorąc pod uwagę specyficzność substratową, enzymy biorące udział

w degradacji ligniny są wyłącznie zewnątrzkomórkowe. Fakt ten jest

prawdziwy dla peroksydaz ligninowych i peroksydaz manganowych.

W przypadku lakazy jest inaczej. Prawda jest, że większość poznanych

lakaz pochodzenia grzybowego należy do białek zewnątrzkomórkowych.

Niemniej jednak opisane są także przykłady enzymu występującego

wewnątrzkomórkowo, przede wszystkim u grzybów powodujących biała

zgniliznę drewna [7]. Grzyby te zdolne są do produkcji zarówno

wewnątrzkomórkowej, jak i zewnątrzkomórkowej lakazy. Jednak enzym

w większości (95%) występuje na zewnątrz komórki. Niewielkie ilości

enzymu wewnątrzkomórkowego znaleziono u A.bisporus. W dwojaki

sposób lakazę wydzielają także Phanerochaete chrysosporium i Suillus

granulatu. Wewnatrzkomórkowe lakazy grzybowe mogą być wykorzystane

do transformacji niskocząsteczkowych związków fenolowych

produkowanych w komórce, a zlokalizowane w ścianie komórkowej

i sporach do syntezy melaniny oraz innych substancji chroniących ścianę

komórkową [5].

2.3. Budowa centrum aktywnego lakazy

W centrum aktywnym enzymu znajdują się cztery sąsiadujące ze sobą

atomy miedzi, reprezentujące trzy typy, wyróżnione ze względu na

specyficzne właściwości. Typ I miedzi (miejsce T1) jest miejscem

utleniania substratu oraz nadaje niebieski kolor cząsteczce enzymu, dlatego

lakaza określania jest „niebieska oksydazą”. Utleniona forma tego typu

miedzi wykazuje absorbancję przy długości fali 610nm. Dwa atomy miedzi

typu III (miejsce T3) i jeden atom miedzi typu II (miejsce T2) tworzą

trójpierścieniowy klaster.


44

Rys. 1. Trójatomowy zespół, w którym każdy atom miedzi związany jest w grupą

imidazolowi histydyny. Miedź oznaczona została kolorem brązowym, a azot niebieskim

Takie ugrupowanie jest miejscem wiązania i redukcji tlenu

cząsteczkowego do wody. W każdym cyklu katalitycznym redukcji

1 cząsteczki tlenu do 2 cząsteczek wody towarzyszy utlenienie 4 cząsteczek

substratów do 4 rodników substratów. Podczas utleniania substratu

powstają reaktywne rodniki, które z kolei mogą pełnić rolę substratów

w innych nieenzymatycznych reakcjach. Atomy miedzi centrum aktywnego

lakazy, w spektroskopowej analizie elektronowego rezonansu magnetyce-

nego, wykazały charakterystyczne właściwości, tj. aktywność

paramagnetyczną dla miedzi typu I i II oraz, w skutek antyferromagne-

tycznego sprzężenia pary atomów miedzi typu III, brak sygnału dla

trzeciego typu miedzi [11]. Odległość między miejscem T2 i T3 wynosi

4A⁰, natomiast T1 oddalone jest od dwóch pozostałych o 12A⁰. Ligandami

dla T1 są grupy imidazolowi dwóch histydyn oraz grupa tiolowa cysteiny,

które tworzą strukturą trójkątną. Ten jon miedzi może zostać zastąpiony

atomem rtęci lub kobaltu [5]. Miedź w miejscu T2 występuje

w tetragonalnym kompleksie i może zostać selektywnie usunięte z

cząsteczki enzymu, czemu towarzyszy znaczne zmniejszenie aktywności

lakazy [12]. Dwa jonu miedzi ,wchodzące w skład miejsca T3, o cechach

antyferromagnetycznych połączone są ze sobą za pomocą mostka

wodorotlenkowego [5].

,


45

Rys. 2. Schemat rozmieszczenia atomów miedzi w miejscach T1, T2 i T3

w cząsteczce lakazy

2.3.1. Mechanizm katalizy enzymatycznej

Mimo ogromnej liczby badan dotyczących niebieskiej oksydazy

zawierającej miedź, brak jest jednego, ogólnego stwierdzenia dotyczącego

drogi transferu elektronu w białku i mechanizmu redukcji tlenu

cząsteczkowego w cząsteczce. Miejsce T1 centrum aktywnego lakazy jest

akceptorem elektronów pochodzących ze zredukowanego substratu, które

następnie transportowane są do klastra T2/T3, gdzie tlen molekularny ulega

aktywacji i redukcji do cząsteczki wody [13].

W wyniku interakcji zredukowanej formy enzymu z tlenem

cząsteczkowym powstają dwa produkty pośrednie: nadtlenkowy oraz

natywny. Natywny produkt pośredni odgrywa ważną rolę w cyklu

katalitycznym enzymu. Podczas reakcji z 17

O2 produkt ten działa jako

rodnik tlenowy, a jego struktura różni się od enzymu w stanie pierwotnym,

brakiem Kołacznie jonów miedzi w miejscu T2 i T3 [5].


46

Rys. 2. Cykl katalityczny lakazy pokazujący mechanizm redukcji i utleniania

miejsc zawierających jon miedzi.

Przedstawiony schemat pokazuje czteroelektrodowa redukcję tlenu

atmosferycznego to cząsteczki wody przy użyciu lakazy. W wyniku

całkowitej redukcji klastra T2/T3 cząsteczki białka dochodzi do powstania

nadtlenkowego produktu pośredniego. Wykorzystanie lakazy, która

w miejscu T1, zamiast jonu miedzi, zawiera jon rtęci powoduje

wytworzenie mostka nadtlenowego pomiędzy zredukowanym miejscem

T2, a utlenionym T3. Rozerwanie wiązania nadtlenkowego O-O podczas

przekształcenia w natywny produkt pośredni, nie ma jasno wytłuma-

czonego mechanizmu. Energia aktywacji, potrzebna do zajścia procesu,

wynosi ok.9 kcal/mol. Taki poziom energii odpowiada mechanizmowi

jednoelektronowej redukcji rozkładającej wiązanie nadtlenkowe

,


47

w produkcie przejściowym. Następnie natywny produkt pośredni ulega

powolnej transformacji do formy utlenionej, często określanej jako forma

spoczynkowa. Miejsce T1 tej formy enzymu może ulec redukcji w wyniku

oddziaływania z substratem. Tempo transferu elektronów do 3-

miedziowego klastera jest jednak zbyt wolne, by redukcja ta miała

znaczenie dla procesu katalizy [14].

3. Praktyczne zastosowania lakazy

Katalityczne i elektrokatalityczne właściwości lakazy dają duże

możliwości ich zastosowania w przemyśle papierniczym, tekstylnym

i kosmetycznym w celu detoksyfikacji odpadów chemicznych, syntezie

organicznej, degradacji ksenobiotyków i bioremediacji, w celu utworzenia

sterylnych produktów, w produkcji płyt pilśniowych, bloczków drewna

oraz tektury bez użycia toksycznych półśrodków, w produkcji detergentów

oraz w tworzeniu biosensorów i katod dla biopaliw [15, 16].

Zastosowanie lakazy w praktyce jest oparte na dwóch powiązanych ze sobą

środkach: poszukiwaniu enzymów z fizykochemicznymi właściwościami

oraz wydajnych wzmacniaczy i induktorów aktywacyjnych tych enzymów.

Wszystkie cele w zastosowaniu lakazy w biotechnologii oparte są na ich

zdolności do produkcji wolnych rodników podczas oksydacji różnych

substratów. W przemyśle spożywczym lakaza używana jest do stabilizacji

i poprawienia jakości napojów oraz deoksygenacji produktów

zawierających tłuszcze roślinne, które łatwo ulegają zepsuciu [17].

Bezpośredni transfer elektronów z elektrody do cząsteczek lakazy został

wykorzystany w produkcji biopaliw [3]. Lakaza używana jest również do

delignifikacji lignocellulozy oraz modyfikacji lignino-pochodnych

materiałów. Ponadto biosensory amperometryczne oparte na lakazie znajdują

zastosowanie w analizie fenolopochodnych (chlorofenole, katecholaminy,

ligninę, taninę). Lakaza używana jest również jako marker enzymatyczny

w analizie zawartości pestycydów.


48

Rys.3 Zastosowanie lakazy w biotechnologii

3.1. Zastosowanie lakazy w bioremediacji

Bioremediacja jest technologią usuwania zanieczyszczeń z gleby i wód

podziemnych z użyciem żywych mikroorganizmów do katalizowania,

destrukcji lub transformacji różnego rodzaju zanieczyszczeń w mniej

szkodliwe pochodne tych związków. Zdolność grzybów do transformacji

szerokiego zakresu niebezpiecznych związków chemicznych wzbudziła

zainteresowanie użyciem ich do bioremediacji [18]. Enzymatyczne

oczyszczanie jest uznawanie za alternatywną metodę usuwania

toksycznych ksenobiotyków ze środowiska.

3.1.1 Degradacja ksenobiotyków

Lakazy charakteryzuje szeroki zakres substratów, dlatego zdolne są do

utleniania większości ksenobiotyków, związków składających się

z chlorofenoli, pestycydów i policyklicznych węglowodorów aromatycz-

nych. Ponadto, policykliczne węglowodory aromatyczne pochodzące

z naturalnych składów ropy oraz utylizacji paliw kopalnych mogą być

degradowane przez lakazy.

Badania laboratoryjne wykazały, że fenole i aminy aromatyczne mogą

być usuwane z wody z zastosowaniem lakazy [5]. Mechanizm oczyszczania

wymaga utleniania enzymatycznego zanieczyszczeń do wolnych rodników

lub chinonów, które przechodzą polimeryzację i częściowe wytrącenie się

w postaci osadu. Ponadto, lakazy mogą również immobilizować zanieczy-

,


49

szczenia gleb, poprzez ich przemianę do gleb humusowych – w procesie

analogicznym do procesu syntezy kwasów humusowych w glebach.

Ksenobiotyki, które mogą być zimmobilizowane w ten sposób składają się

z pochodnych fenoli. Immobilizacja obniża biologiczną dostępność

ksenobiotyków i co za tym idzie – ich toksyczność.

Lakaza produkowana przez drożdże została zmodyfikowane tak aby

zwiększyć poziom transferu elektronów pomiędzy zawierającym miedź

miejscem aktywnym lakazy i elektrodą [19]. Genetyczne modyfikacje dają

lakazie możliwość zwiększenia jej wydajności w procesie bioremediacji.

3.1.2 Dekoloryzacja barwników

Chemiczne środki używane w przemyśle tekstylnym są bardzo

zróżnicowane pod względem składu chemicznego. Struktura chemiczna

barwników daje im odporność na blaknięcie pod wpływem światła

słonecznego, wody i innych środków chemicznych co sprawia, że są bardzo

trudne do dekoloryzacji [5]. Część barwników składa się ze znanych

kancerogenów takich jak benzydyna i inne węglowodory aromatyczne.

Najpopularniejsze procesy odbarwiania ścieków z produkcji barwników

są niewydajne i nieopłacalne [3]. Dlatego też, rozwój procesu z użyciem

lakazy jest atrakcyjną alternatywą ze względu na ich zdolność do

degradacji barwników o zróżnicowanej chemicznej strukturze. Kultury

Pycnoporus sanguineus produkują lakazę w postaci fenolooksydazę, która

umożliwia częściową dekoloryzację dwóch barwników azotowych i dwóch

barwników trifenylometanowych. Natomiast lakaza wyizolowana z grzyba

Trametes hirsuta jest w stanie zdegradować barwniki triarylometanowe,

indygoidowe i azotowe powszechnie używane do barwienia tekstyliów oraz

23 inne barwniki przemysłowe.

3.1.3 Oczyszczanie ścieków

Lakazy izolowane z grzybów znajdują swoje biotechnologiczne zasto-

sowanie w oczyszczaniu ścieków przemysłowych. Ze względu na ich szeroki

zakres substratów, używane są do wybielania miazgi drzewnej albo do

detoksyfikacji rolniczych produktów ubocznych takich jak miąższ kawowy lub

ścieki z wytłaczarni oliwy [3]. Lakazy uzyskane z Trametes villosa degraduje

bisfenol A – powodujący zaburzenia endokrynologiczne związek chemiczny.

Nonylofenole są obecnie przedmiotem zainteresowania naukowców ze

względu na ich zdolność do naśladowania działania naturalnych hormonów

u wyższych kręgowców [20]. Nonylofenole powstają podczas niecałkowitej

biodegradacji oksyetylenowanych nonylofenoli (NPEO), które są używane

jako niejonowe surfaktanty w procesach przemysłowych. Zarówno NPEO jaki


50

i nonylofenole są odprowadzane do środowiska, głównie poprzez niecałkowite

usunięcie ich ze ścieków wodnych [20].

Nonylofenole są bardziej odporne na biodegradację niż NPEO, dlatego

są obecne w rzekach i roślinach narażonych na działanie ścieków. Lakazy

produkowane przez Clavariopsis aquatica wykazują zdolność do

degradacji nonylofenoli. Dlatego też, trwają badania nad zastosowaniem

lakazy w celu oczyszczania ścieków na szeroką skalę [5].

3.1.4 Bioremediacja miazgi drzewnej w przemyśle papierniczym

Obecnie wybielanie miazgi drzewnej prowadzi się za pomocą środków

chemicznych opartych głównie na chlorze. To prowadzi do utworzenia się

chloropochodnych związków alifatycznych i aromatycznych, które mogą

być ostro trujące, mutageniczne i kancerogenne [21]. W ostatnich latach

prowadzone są intensywne badania nad opracowaniem nowoczesnej

technologii wybielania za pomocą enzymów. Zastosowanie lakazy na

szerszą w celu „biowybielania” miazgi drzewnej ograniczają jedynie

wysokie koszty otrzymywania, a jej zastosowanie w bioremediacji

w przemyśle drzewnym i papierniczym jest utrudniona przez zasadowy

charakter ścieków. Lakazy izolowane z Coriolopsis gallica są

wykorzystywane do dekoloryzacji zasadowych ścieków przemysłowych,

do ich dechloracji oraz oczyszczenia z chloropochodnych związków takich

jak chloroligniny z wybielonych ścieków [3].

Inne zastosowania lakazy w przemyśle papierniczym to ulepszanie

właściwości miazgi drzewnej. Lakazy wyizolowane z grzybów są

wykorzystywane do oczyszczania ścieków z przetwórni drewna lub innych

zawierających chloroligniny lub związki fenolowe. Lakazy neutralizują

związki fenolowe przez ich degradację lub polimeryzację lub krzyżowe

łączenie zanieczyszczonych fenoli z tymi które naturalnie występują

w środowisku.

4. Podsumowanie

Lakazy to enzymy należące do oksydaz, które katalizują

jednoelektronowe utlenianie szerokiego spektrum substancji takich jak

orto- i para-difenoli, aminofenoli, związków aromatycznych i amin.

Dlatego też lakazy posiadają zdolność do degradacji ligniny i są obecne

u wielu grzybów. Lakazy są używane do dekoloryzacji i detoksyfikacji

ścieków przemysłowych oraz oczyszczaniu wód. Działają zarówno na

niefenolowe związki ligniny jak i na zanieczyszczenia środowiskowe.

Mogą być efektywnie wykorzystywane w przemyśle papierniczym,

tekstylnym i drzewnym do degradacji ksenobiotyków i bioremediacji.

,


51

Ze względu na ich specyficzną naturę, lakazy obecnie są w centrum

zainteresowania naukowców.

Od czasu odkrycia lakaz u grzybów trwają badania nad ich

biotechnologicznym zastosowaniem. Nowe technologie związane

z częściową delignifikacją w produkcji celulozy, przekształceniem

ligninocelulozy w biopaliwo oraz oczyszczanie ścieków przemysłowych są

niedoskonałe, dlatego poszukuje się nowych lepszych rozwiązań,

bezpiecznych dla środowiska. Idealnym rozwiązaniem wydają się być

właśnie lakazy, które posiadają zdolność do degradacji i modyfikacji

różnych związków chemicznych oraz remediacji gleb i ścieków. Ten

artykuł ukazuje potencjalne zastosowania lakaz izolowanych z grzybów

w celu ochrony środowiska, ich budowę, źródła oraz mechanizm działania.

Literatura

1. Shekher R i in., Laccase: microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications, Enzyme research, 2011

2. Singh G i in., Laccase from prokaryotes: a new source for an old enzyme, Reviews in Environmental Science and Biotechnology, 2011, s.309-326

3. Viswanath B i in., Fungal laccases and their applications in bioremediation, Enzyme Research, 2014

4. Jong-Rok J i in., Laccase-catalysed oxidations of naturalny occurring phenols: from in vivo biosynthetic pathways to green synthetic applications, Microbial biotechnology, 2012, s.318-332

5. Morozova OV i in., „Blue” laccases, Biochemistry, 2007, s.1396-1412 6. De Jesus M i in., Capsular localization of the Cryptococcus neoformans

polysaccharide component galactoxylomannan, Eukaryotic Cell, 2009, s.96-103 7. Blaich R, Esser K, Function of enzymes in Wood destroying fungi. II. Multiple

forms of laccase in white rot fungi, Arch. Microbiol., 1975, s. 271-277 8. Munoz C i in., Laccase isoenzymes of Pleurotus eryngii: characterization,

catalytic properties, and participation in activation of molecular oxygen and Mn

2+ oxidation, Appl. Environ. Microbiol., 1997, s. 2166-2174

9. Ko E.-M. i in., Purification and characterization of laccase isozymes from the white-rot basidiomycete Ganoderma lucidum, Appl.Microbiol. Biotechnol., 2001, s.98-102

10. Yoshitake A i in., N-linked carbohydrate chains protect laccase-III proteolysis in Coriolus versicolor, J. Gen. Microbiol., 1992, s.179-185

11. Polak J, Jarosz-Wilkołazka A, Reakcje katalizowane przez lakazę – mechanizm i zastosowanie w biotechnologii, Biotechnologia, 2007, s.82-94

12. Malkin R i in., The reversible removal of one specific cooperII from fungal laccase, Eur. J. Biochem., 1969, s.253-259

13. Bento I i in., Dioxygen reduction by multi-copper oxidases; structural perspective, Dalton Trans., 2005, s.3507-3513

14. Lee SK i in., Nature of the intermediate formed in the reduction O(2) to H(2)O at the trinuclear copper cluster active site in native laccase, J. Am. Chem.Soc., 2002, s.6180-6193

15. Yaropolov, A. I. i in., Appl. Biochem. Biotechnol., 1994, 257-280

http://biblioteka.pollub.pl/wydawnictwa/index.php?m=1&i=1


52

16. Bolobova, A, V. i in., Theoretical Principles ofTechnology of Wood Composites. Book II, 2002

17. Mayer, A. M., i in., 2002, Phytochemistry, 60, 551-565 18. Bollag J.M i in., 2003 Enzymatic oxidative transformation of chlorophenolmixtures,

Journal of Environmental Quality, vol. 32, no. 1, pp. 63-69 19. Riu J. i in., Determination of sulfonated azo dyes in groundwater and

industrial effluents by automated solid-phase extraction followed by capillary electrophoresis mass spectrometry, Journal of Mass Spectrometry, 1998, s. 653-663

20. Lyons J. I. i in., Diversity of ascomycete laccase gene sequences in a southeastern US salt marsh, Microbial Ecology, 2003, s. 270-281, 2003

21. Taspinar A., Kolankaya N. Optimization of enzymatic chlorine removal from Kraft pulp, Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 1998, s. 15-21, 1998


Streszczenie

Grzyby stanowią bogate źródło różnych cząsteczek enzymatycznych, przyspieszających skomplikowane reakcje enzymatyczne. Jednym z enzymów produkowanych przez

te organizmy jest lakaza, czyli oksydoreduktaza zawierająca w swojej cząsteczce atom

miedzi. Lakaza katalizuje jednoelektronowe utlenianie różnych substratów, np. fenoli bądź

aromatycznych lub alifatycznych amin, do odpowiednich rodników, przy użyciu tlenu

cząsteczkowego. Enzym charakteryzuje się szerokim zakresem substratów, dlatego zdolne

są do utleniania większości ksenobiotyków, związków składających się z chloro fenoli,

pestycydów i policyklicznych węglowodorów aromatycznych. Ponadto, degradowane mogą być policykliczne węglowodory aromatyczne pochodzące z naturalnych składów ropy oraz

utylizacji paliw kopalnych. Dzięki temu enzym znalazła zastosowanie w procesie

bioremediacji – usuwania zanieczyszczeń z gleby i wód.

Słowa kluczowe: lakaza, bioremediacja

Fungal laccase and its application in bioremediation

Summary

Fungi are a rich source of different enzyme molecules, which accelerate complex enzymatic

reactions. One of the enzymes produced by these organisms is laccase – oxidoreductase

which contains a copper atome in its structure. Laccase catalyzes one-electron oxidation of various substrates like phenols or aromatic and aliphatic amines to the radicals, using

molecular oxygen. This enzyme has a wide range of substrates, therefore it’s able to oxidize

most of the xenobiotic compounds like chlorophenols, pesticides and polycyclic aromatic

hydrocarbons. In addition, aromatic hydrocarbons derived from natural oil deposits can be degraded by laccase as well as fossil fuels. Hence, laccase can be used in the

bioremediation process which is removing contaminants from soil and groundwater.

Key words: laccase, bioremediation

53

Magdalena Czemierska1, Aleksandra Szcześ

2, Anna Jarosz-Wilkołazka

1

Oczyszczanie roztworów wodnych

w procesie flokulacji

1. Wprowadzenie

Woda, pomimo prostej budowy chemicznej, stanowi podstawę życia

na Ziemi. Ze względu na swoje właściwości jest najcenniejszym surowcem

dostępnym człowiekowi, dlatego też jej zanieczyszczenie może okazać się

zgubne dla ludzkości. Problem czystości wody nadającej się do spożycia od

wielu lat znajduje się w grupie tematów analizowanych w środowisku

naukowym. Wszelkie badania prowadzone w tym kierunku mają na celu

uzyskanie najbardziej wydajnej metody oczyszczania, pozwalającej na

usunięcie szkodliwych produktów powstających w procesach

technologicznych. Istotny aspekt tych rozważań stanowi flokulacja,

uznawana za dynamiczny i wyjątkowo wydajny proces usuwający

zawieszone cząstki stałe, koloidy czy też szczątki komórek organizmów.

Substancje przeprowadzające proces flokulacji nazywane są flokulantami

i ze względu na źródło pochodzenia dzielimy je na trzy grupy: flokulanty

nieorganiczne (siarczan glinu, chlorek żelaza), syntetyczne flokulanty

organiczne (pochodne poliakrylamidu) i flokulanty naturalne (bioflokulanty).

Wiele flokulantów znajduje zastosowanie w oczyszczaniu ścieków,

usuwaniu zanieczyszczeń z przemysłu paliwowego, spożywczego oraz

metalurgicznego [1].

Bioflokulanty otrzymywane są jako naturalne produkty przemian,

zachodzących w czasie wzrostu mikroorganizmów. Podstawowymi

składnikami tych agregatów są glikoproteiny, polisacharydy, białka, kwasy

nukleinowe. Obecnie to właśnie bioflokulanty znalazły się w obszarze

zainteresowań badaczy opracowujących metody wydajnego oczyszczania

wody. Głównym powodem jest bezpieczeństwo tych polimerów dla

zdrowia człowieka, ich biodegradowalność oraz brak ryzyka wtórnego

zanieczyszczenia środowiska [2].

1 [email protected] Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie,

Wydział Biologii i Biotechnologii, Zakład Biochemii, (http://www.fungi.umcs.lublin.pl); 2 Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Chemii, Zakład Zjawisk Międzyfazowych;


http://www.fungi.umcs.lublin.pl/


54

2. Mechanizm flokulacji

Flokulacja jest procesem, podczas którego bardzo rozdrobnione

i rozproszone cząstki są zbierane razem tak aby mogły utworzyć większe

zgrupowania o masie pozwalającej na ich osiadanie, oczyszczając w ten

sposób środowisko, w którym zachodzi reakcja [3]. Przeprowadzone

badania pozwoliły na szczegółowe poznanie sił działających w trakcie tego

zjawiska i opracowanie modeli przedstawiających oddziaływania cząsteczek

w roztworach wodnych.

Obecnie znane są dwa podstawowe mechanizmy wyjaśniające przebieg

procesu flokulacji: mostkowanie i łatkowanie [4]. Wiele opracowań

naukowych wyróżnia dodatkowe etapy występujące na granicy faz ciecz-

ciało stałe, które są określane jako sprzężenie zwrotne i flokulacja

wymiatająca.

2.1. Mostkowanie

Mostkowanie (ang. bridging) - zachodzi, gdy segmenty łańcucha

polimeru adsorbują się na więcej niż jednej cząstce, łącząc je razem.

Kontakt z koloidami powoduje, że grupy reaktywne związku

wielkocząsteczkowego nie tylko osiadają na powierzchni cząstki, ale

również rozprzestrzeniają go w środowisku reakcji. Polimer adsorbuje się

na koloidzie w formie pętli (części rozpościerające się w roztworze)

i w formie łańcuchów (segmentów przyłączonych tylko do powierzchni).

Jeżeli druga cząstka, posiadająca wolne miejsce adsorpcyjne, wejdzie

w kontakt z pętlami i łańcuchami, wówczas następuje jej przymocowanie do

takiej struktury [3]. Ten agregat sprawia, że związek wielkocząsteczkowy

staje się swoistym mostem łączącym poszczególne koloidy (cząsteczka-

polimer-cząsteczka). Przebieg tego mechanizmu pozwala stwierdzić, że

długość polimeru jest najistotniejszym czynnikiem wpływającym na

efektywne mostkowanie. Można również założyć, że liniowy polimer (bez

łańcuchów bocznych), byłby najlepszy do zastosowania. Dłuższe łańcuchy

zwiększałyby szansę interakcji takiego związku z więcej niż jedną

cząsteczką jednocześnie, co zaburzyłoby cały proces [4].

,

Oczyszczanie roztworów wodnych w procesie flokulacji

55

Rys. 1. Mechanizm mostkowania: a) adsorpcja polimeru i formowanie pętli zdolnych do

tworzenia wiązań b) wytworzenie mostka pomiędzy polimerem a cząsteczkami (agregacja) c)

restabilizacja cząsteczek koloidów (rozpad flokuł) [3]

2.2. Łatkowanie

Łatkowanie (ang. patching) - mechanizm ten często określany jest jako

elektrostatyczny, gdyż obejmuje nierównomierną dystrybucję ładunków,

wynikającą z adsorpcji niewielkich łatek polimeru na powierzchni cząstek.

Związek wielkocząsteczkowy o ładunku silnie dodatnim jest przyłączany

do negatywnie naładowanych koloidów w postaci płaskich konformacji.

Większość naładowanych grup znajduje się blisko powierzchni cząstki, co

inicjuje flokulację, poprzez uprzednią redukcję całkowitego ujemnego

ładunku. W ten sposób obniżana jest awersja cząsteczek względem

polimeru i zjawisko to określane jest jako neutralizacja ładunków [3].

Dodatkowo obszary adsorpcji polimeru mogą posiadać ładunek dodatni ze

względu na wysoką gęstość ładunku związku wielkocząsteczkowego.

Dodatnie energetycznie regiony są również przyciągane do negatywnych

regionów innych cząsteczek, co określane jest terminem heterokoagulacji.

W wyniku tego zjawiska powstają spoiste flokuły, bardzo odporne na siły

redyspersji. Należy podkreślić, że mechanizm łatkowania zachodzi

w przypadku zastosowania polimerów o niskiej masie cząsteczkowej

z wysoką gęstością ładunku. Tak, więc jeżeli polimer jest za krótki by

wiązać wiele komórek jednocześnie, wówczas adsorbuje się na

powierzchni koloidu w formie łatki, tworząc lokalnie dodatni ładunek [4].


56

Rys. 2. Mechanizm łatkowania: a) ujemnie naładowane cząsteczki b) flokulant o ładunku

dodatnim c) neutralizacja ładunków łączących się cząsteczek i łatkowanie, strzałki pokazują

przyciąganie przeciwnych jonów [3]

2.3. Dwuwarstwowe sprzężenie/ flokulacja wymiatająca

Oprócz mostkowania i łatkowania, znane są jeszcze dwa mechanizmy

opisujące powstawanie flokuł a mianowicie dwuwarstwowa kompresja

(znana również jako sprzężenie) oraz tzw. flokulacja wymiatająca [5].

Flokulacja wymiatająca jest połączeniem destabilizacji oraz transportu

i znajduje zastosowanie w oczyszczaniu zmętnienia wody, w rozpuszczaniu

organicznego węgla w połączeniu z szybkim mieszaniem oraz w procesie

ulepszania filtracji. Mechanizm ten stosowany jest w przypadku cząstek,

które nie mają zdolności bezpośredniego łączenia się z polimerem.

Ostrożne dodanie materiału stałego (np. glina, nieorganiczne sole) do

koloidu, powoduje jego większe powinowactwo do polimeru a pierwotne

cząstki zawieszone w roztworze zostają uwięzione pomiędzy materiałem

stałym tworzącym flokuły przez zwykły mechanizm mostkowania.

Flokulacja wymiatająca jest więc modyfikacją podstawowego procesu

mostkowania, w którym stosuje się dodatkowe ,,aktywatory’’ flokulacji [3].

Dwuwarstwowe sprzężenie (tzw. teoria DLVO, skrót pochodzi od

nazwisk jej twórców: Derjaguin, Landau, Verwey i Overbeek) jest zwykle

związane z akumulacją flokulantów nieorganicznych takich jak sole żelaza

i ałunu. Proces ten występuje np. w przypadku cząstek o niskiej sile

jonowej, zawieszonych w wodach słodkich, które mieszają się

z wysokozjonizowanymi cząsteczkami wody morskiej [3]. Powierzchnia

bakteryjnych komórek otoczonych polimerem zewnątrzkomórkowym jest

naładowana ujemnie, co pozwala wyznaczyć potencjał elektrokinetyczny

dzeta (δ), który jest napięciem elektrycznym wywołanym przez akumulację

jonów na powierzchni bakterii [6]. Warstwa jonów o przeciwstawnych

ładunkach, dość mocno przylegająca do powierzchni, nazywana jest

powłoką surową (Rys. 3). Na zewnątrz tej warstwy leży kolejna warstwa

(powłoka rozproszona), na którą składają się jony tworzące

,


57

chmuropodobną strukturę o ładunku neutralnym [7]. Począwszy od

warstwy surowej aż do dyfuzyjnej, potencjał dzeta stopniowo spada, aż

osiągnie wartość otoczenia zbliżoną do zera. Gdy taka cząsteczka

flokulantu porusza się, wówczas niektóre ładunki powłoki dyfuzyjnej są

gubione, powodując powstanie nowej warstwy o mniejszej liczbie

ładunków, determinującej potencjał dzeta. Dzięki równomiernemu

rozłożeniu ładunków, cząsteczki są utrzymywane w rozproszeniu,

kontrolowanym przez siły van der Waalsa. Wiązania te wywołane

polaryzacją cząsteczek w dipole i pobudzające siły przyciągania, powodują

agregację flokuł. Tak więc trwałość powstałych komponentów zależy

przede wszystkim od potencjału dzeta i sił van der Waalsa [6]. Jeżeli

potencjał dzeta jest wysoki a siły odpychające cząsteczki są mocniejsze niż

siły van der Waalsa, wówczas cząstki nie będą tworzyły agregatów,

pozostając w dyspersji. W sytuacji odwrotnej, przy niskim potencjale dzeta

i słabych oddziaływaniach ładunku cząsteczek, agregaty są otrzymywane [7].


58

Rys. 3. Schematyczny obraz naładowanych cząsteczek w dwuwarstwowym sprzężeniu,

zaznaczono ładunek i potencjał dzeta w poszczególnych [8]

3. Flokulacja a koagulacja

Omawiając mechanizmy tworzenia agregatów przez bakterie, nie

sposób pominąć zjawiska koagulacji – procesu bardzo zbliżonego do

flokulacji. Koagulacja jest procesem, w którym cząsteczki koloidalne oraz

ciała stałe zawieszone w roztworze, są destabilizowane, co sprzyja ich

aglomeracji. Koloidy obecne w ściekach cechują się dużą stabilnością

z powodu ładunku elektrycznego, który posiadają. Ładunek ten może być

dodatni lub ujemny, jednakże cząstki występujące powszechnie

,


59

w roztworach mają ujemny ładunek [9]. Dodatkowo koagulacja może

powodować usunięcie cząsteczek większych niż koloidy poprzez

uwięzienie takich cząstek we flokułach tworzonych podczas procesu [10].

Tak więc koagulacja polega na łączeniu nierozpuszczalnej materii

organicznej, zawieszonej w roztworze, w większe agregaty, co skutkuje

późniejszą ich sedymentacją, flotacją i w konsekwencji filtracją. Proces ten

angażuje zwykle rozproszenie kilku chemicznych reagentów

(koagulantów), które destabilizują cząstki koloidalne, prowadząc do

utworzenia mikroflokuł. Takimi koagulantami są nieorganiczne sole metali

np. siarczany oraz chlorki żelaza i glinu. Dodanie tych kationów

zapoczątkowuje neutralizację negatywnego ładunku koloidów [11].

Rys. 4. Schematyczne porównanie procesów koagulacji i flokulacji u bakterii [12]

Przykładowo wprowadzenie jonów Fe3+ do środowiska reakcji

spowoduje ich gwałtowną hydrolizę, a powstałe w ten sposób hydrolizaty

pełnią podstawową rolę w destabilizacji cząstek koloidalnych. Obecnie

stosowane koagulanty (pre-hydrolizowane formy glinu i żelaza jak

np. siarczan poli-żelaza) są wydajniejsze ze względu na to, że ich hydroliza

przebiega w ściśle określonych warunkach przed dodaniem do środowiska

reakcji. Umożliwia to lepszą kontrolę nad całą procedurą [11]. Koagulacja

znalazła zastosowanie w oczyszczaniu ścieków, przede wszystkim

z barwników przemysłowych, a wybór odpowiedniego koagulantu

i zmniejszenie kosztów są obecnie głównymi parametrami analizowanymi

w badaniach nad czystością wody. Analizowane są możliwości połączenia


60

działania większej liczby koagulantów, tak aby zwiększyć wydajność

procesu koagulacji.

Warto podkreślić, że koagulacja stanowi zwykle pierwszy etap

przemian, po którym zachodzą procesy związane z flokulacją. Powstałe

podczas koagulacji mikroflokuły, dzięki polimerom zewnątrzkomórkowym

adsorbowanym na powierzchni bakterii, mogą łączyć się w większe

aglomeracje, tworząc makroflokuły.

Rys. 5. Model flokulacji dla biologicznie modyfikowanego kwarcu obrazujący

oddziaływania pomiędzy cząsteczkami; IEP – punkt izoelektryczny [13]

Hirajima i wsp. [13] przeprowadzili badania nad wpływem wartości pH

na flokulację, stosując jako podłoże modyfikowany biologicznie kwarc

(Rys. 5). Okazało się, że jeżeli wartość pH reakcji jest zbliżona do wartości

punktu izoelektrycznego bakterii, wówczas elektrostatyczne odpychanie

zanika, siły van der Waalsa przeważają i flokulacja jest możliwa.

W przypadku gdy wartości pH są dalekie od punktu izoelektrycznego

bakterii to oddziaływania van der Waalsa są zbyt niskie i preferowanym

procesem jest dyspersja. Wynika z tego, że aby proces flokulacji zachodził

we właściwy sposób, należy zwrócić uwagę na wiele czynników

oddziaływujących na przebieg tego mechanizmu.

,


61

4. Czynniki wpływające na aktywność flokulacyjną hodowli

mikroorganizmów

Flokulacja, jak każdy proces biochemiczny, przebiega w określonych

warunkach i nawet niewielka anomalia powoduje mniejszą jej wydajność.

Ponadto wykorzystanie tego mechanizmu w nowoczesnych technologiach

wymaga zwrócenia uwagi na aspekty środowiskowe, fizjologiczne

i genetyczne [5]. Dlatego też wyodrębniono główne czynniki mające znaczący

wpływ na regulację wzrostu i aktywności hodowli, a tym samym na proces

bioflokulacji.

4.1. Rodzaj mikroorganizmu i faza wzrostu

Flokulacja jest procesem wymagającym nakładu energii, dlatego też nie

wszystkie mikroorganizmy są zdolne do jej inicjowania. Obecnie znanych jest

wiele gatunków wytwarzających flokuły i na podstawie badań tych

mikroorganizmów można stwierdzić, że intensywność flokulacji jest różna

w zależności od rodzaju organizmu. Dzieje się tak, ponieważ występują

różnice w składach chemicznych poszczególnych związków wielko-

cząsteczkowych, a nawet niewielka zmiana proporcji poszczególnych

składników może wpływać na otrzymanie wysokoaktywnego polimeru.

Badania przeprowadzone na bioflokulantach różnych organizmów

wykazały ponadto zależność aktywności procesu flokulacji od fazy wzrostu

danej hodowli. Jia i wsp. badali działanie czasu hodowli na wytwarzanie

egzopolisacharydów w osadzie czynnym i stwierdzili, że podczas

wykładniczej fazy wzrostu, zawartość polisacharydów zewnątrz-

komórkowych zwiększała się w miarę upływu czasu, natomiast w fazie

stacjonarnej ilość wytwarzanego polimeru malała [14]. Z kolei

w przypadku bakterii fotosyntetycznych sytuacja przedstawiała się skrajnie

odwrotnie. Podczas fazy wykładniczej zawartość egzopolisacharydów

spadała w czasie, a w fazie stacjonarnej ich ilość pozostała prawie

niezmieniona [15]. Obecnie przyjmuje się, że najwyższa aktywność

flokulacyjna występuje w fazie stacjonarnej, ale u wielu organizmów

pojawia się już pod koniec fazy wykładniczej i trwa aż do stacjonarnej.

4.2. Źródło węgla i azotu

Substancje odżywcze użyte jako substrat w metabolizmie komórkowym

mają ogromny wpływ na funkcjonowanie organizmu. Szczególnie ważne

jest zastosowane źródło węgla i azotu, gdyż to te składniki odpowiadają za

cykl komórkowy. Stwierdzono, że zawartość źródeł azotu i węgla

w znaczący sposób wpływa na wytwarzanie i aktywność bioflokulantów

[16]. Przykładowo wytwarzaniu polimerów zewnątrzkomórkowych przez

Rhodococcus erythropolis sprzyjał dodatek sorbitolu, mannitolu i etanolu,


62

natomiast w przypadku Alcaligenes cupidus był to dodatek glukozy,

galaktozy i fruktozy [17]. Organicznym źródłem azotu najlepiej

oddziałującym na otrzymywanie flokulantów okazały się ekstrakt

drożdżowy i kazeina, z kolei najbardziej wydajnymi nieorganicznymi

formami azotu był siarczan amonowy i mocznik [18]. Użycie chlorku

amonu i azotanu amonu obniża aktywność flokulacji o 30-40%,

w porównaniu z zastosowaniem ekstraktu drożdżowego. Oprócz rodzaju

źródła azotu i węgla, istotny jest także stosunek węgla do azotu (C/N),

gdyż bezpośrednio wpływa na wytwarzanie egzopolisacharydów.

Yoshitaka i Aida stwierdzili, że jeżeli proporcja C/N wynosi od 60 do 114,

wówczas aktywność flokulacyjna jest wyższa, wartości poza granicą

powodują gwałtowny jej spadek [19]. Durmaz i Sanin zaobserwowali, że

w przypadku osadu czynnego bogatego w białka i o niższej zawartości

węglowodanów- stosunek C/N wynosił 5 [20]. Jeżeli wartość wzrosła do

40, wtedy ilość białek spadała, podczas gdy ilość węglowodanów rosła.

4.3. Temperatura i wartość pH hodowli

Temperatura to jeden z parametrów regulujących wytwarzanie

flokulantów przez mikroorganizmy. Przyjęto, że optimum temperaturowe

dla hodowli bakterii zawiera się w granicach 25-35°C [8]. Badania

pokazały, iż wyższe wartości (>35°C) mogą obniżać powstawanie

polimerów zewnątrzkomórkowych o 75% w porównaniu z niższymi

temperaturami. Wpływ temperatury na aktywność bioflokulacyjną jest

złożony, gdyż z jednej strony może powodować zmiany w strukturze

substancji wielkocząsteczkowych, prowadzące do degradacji, z drugiej zaś

dodatnio oddziaływać na wytwarzanie flokuł [18]. W 2000 roku

przeprowadzono serię doświadczeń w celu znalezienia związku pomiędzy

temperaturą a wielkością i strukturą morfologiczną cząstek osadu

czynnego. Willen i wsp. stwierdzili, że deflokulacja cząstek zachodzi

znacznie częściej w niższych temperaturach niż wyższych,

prawdopodobnie w wyniku obniżenia aktywności metabolicznej mikro-

organizmów [21]. Z kolei Krishna i Loosdrecht wykazali, że przy

30-35°C następuje zwiększenie masy cząsteczek osadu czynnego

z jednoczesnym nadmiernym wytwarzaniem polimerów zewnątrz-

komórkowych [22]. Tak, więc optymalne temperatury 20-25°C wydają się

najlepszymi wartościami parametru, w celu uzyskania stabilnych flokuł

o średnich objętościach wynoszących około 200 ml [8].

Wykazano, że aktywność flokulacyjna w znacznym stopniu zależy

od wartości pH hodowli, którego wartości są bardzo różnorodne

w zależności od gatunku organizmu wytwarzającego flokuły. Zakres

wartości pH, w którym bakteria jest zdolna do wytwarzania bioflokulantów

,


63

nieznacznie różni się od wartości optymalnej dla wzrostu hodowli. Badania

Endo i wsp. pokazały, że jeżeli wartość pH zostanie utrzymana na

optymalnym poziomie (pH 6,0) - wzrost Aspergillus sojae będzie

intensywny, ale nie zaobserwujemy aktywności bioflokulacyjnej [23].

Dopiero w środowisku neutralnym następuje uruchomienie procesów

powodujących powstawanie makrocząstek. Natomiast Kurane i wsp. [17]

wykazali efektywniejsze wytwarzanie flokuł przez Rhodococcus

erythropolis w środowisku alkalicznym, gdy wartości optymalne pH

wynosiły 8-9,5. Flokulacja Streptomyces griseus zachodzi w środowisku

kwaśnym (pH 2-6), a maksymalna wydajność tego mechanizmu występuje

przy wartości pH 4 [24]. Pomimo tego, że wartość pH nie jest wartością

łatwą do regulowania, jej zmiany są ograniczone przez optymalny zakres,

w jakim organizm może przeżyć, nie narażając się na poważniejsze

uszkodzenia [8].

4.4. Obecność jonów metali

Jony metali jako kofaktory wielu reakcji chemicznych stanowią czynnik

odpowiedzialny za zmiany aktywności cząsteczek flokulujących. Kationy

stymulują flokulację przez neutralizację i stabilizację ujemnych ładunków

grup funkcyjnych oraz formowanie mostków (swoistych połączeń) między

cząsteczkami. Podstawową rolą dwu- i trójwartościowych jonów jest

zwiększenie początkowej adsorpcji polimerów zewnątrzkomórkowych

na zawieszonych cząstkach, poprzez obniżenie negatywnego ładunku

łańcuchów bocznych zarówno biopolimeru jak i substancji z nim

połączonych [25]. Wpływ obecności jonu na proces flokulacji zależy od

stężenia tego jonu. Dlatego też po osiągnięciu pewnej krytycznej wartości,

oddziaływanie danego kationu na polimer jest znikome. Yin i wsp. badając

zależność aktywności flokulantu GS7 od obecności jonów metali, zauważyli,

że pewne stężenia naładowanych dodatnio jonów (Ca2+

, Mg2+

, Fe3+

, A13+

)

pełnią katalityczną rolę w procesie flokulacji i im większa gęstość ładunku

kationu tym proces jest bardziej wydajny [26]. Z kolei badania Kurane i wsp.

[17] wykazały, że wytwarzanie flokulantu przez Rhodococcus erythropolis

i Alcaligenes cupidus jest intensywniejsze w obecności jonów Ca2+

i Al3+

.

W przypadku Nocardia amarae aktywność flokulacji została zwiększona

przez kationy Na+, Ca

2+, Al

3+, Fe

3+, jednakże nadmierne stężenia jonów Fe

3+

powodowały inhibicję tego procesu.

Opisane czynniki w istotny sposób wpływają na aktywność flokulacyjną

i powinny być brane pod uwagę przy zastosowaniu tego procesu

w przemyśle technologicznym. Najbardziej znanym przykładem

wykorzystania flokulacji jest oczyszczanie wody z barwników, metali,

odpadów chemicznych, gdzie wydajność procesu zależy przede wszystkim


64

od właściwości biopolimeru takich jak: masa cząsteczkowa, stężenie

i ładunek danego związku [27]. Ponadto niezwykle istotne są fizyczne

parametry procesu (dawkowanie, intensywność mieszania, czas trwania)

i cechy oczyszczanych ścieków (wielkość i stężenie cząsteczek,

temperatura i wartość pH wody zanieczyszczonej). Dlatego też wybór

właściwej metody oczyszczania musi być poparty licznymi testami,

dopasowującymi technikę do konkretnego zanieczyszczenia ścieku.

Wyzwaniem staje się poszukiwanie polimeru spełniającego wymagane

parametry [27].

5. Podsumowanie

Flokulacja stanowi ważny aspekt procesów zachodzących w układach fizyko-chemicznych. Pomimo tego że jest zjawiskiem dosyć dobrze poznanym, nadal cieszy się zainteresowaniem licznej grupy naukowców, poszukujących dalszych jej zastosowań. Obecnie prowadzone badania w tej dziedzinie mają na celu znalezienie nowych organizmów zdolnych do wytwarzania bioflokulantów o wysokiej aktywności flokulacyjnej, a przy tym niskich kosztach ich produkcji. Naukowcy dążą do uzyskania preparatów, których otrzymywanie na szeroką skalę będzie opłacalne. Niezwykle istotne jest to, że pomimo szeregu dostępnych na rynku syntetycznych flokulantów, działania nauki zwróciły się w stronę rozwiązań bardziej przyjaznych dla środowiska naturalnego, mających na celu ochronę otaczającego świata i jednocześnie nas samych.

Podziękowania

Praca współfinansowana ze środków Narodowego Centrum Nauki w ramach grantu badawczego (2012/07/B/ST5/01799).

Literatura

1. Wang S.G., Gong W.X., Liu X.W., Tian L., Yue Q.Y., Gao B.Y. Production of a novel bioflocculant by culture of Klebsiella mobilis using dairy wastewater, Biochemical Engineering Journal, 2007 vol. 36, s. 81-86

2. Yu G.H., He P.J., Shao L.M. Characteristics of extracellular polymeric substances (EPS) fractions from excess sludges and their effects on bioflocculability, Bioresource Technology, 2009 vol. 100, s. 3193-3198

3. Shrama B. R., Dhuldhoya N. C., Merchant U. C. Flocculants—an ecofriendly approach, Journal of Polymers and Environment, 2006 vol. 14, s. 195-202

4. Salim S., Bosma R., Vermuë M. H., Wijffels R. H. Harvesting of microalgae by bio-flocculation, Journal of Applied Phycology, 2011 vol. 23, s. 849-855

5. Salehizadeh H., Shojaosadati S. A. Extracellular biopolymeric flocculants: recent trends and biotechnological importance, Biotechnology advances, 2001 vol. 19, s. 371-385

6. Sobeck D. C., Higgins M. J. Examination of three theories for mechanisms of cation- induced bioflocculation, Water Research 2002 vol. 36, s. 527-538

,


65

7. Hermansson M. The DLVO theory in microbial adhesion, Colloids and Surfacies B: Biointerfaces, 1999 vol. 14 (1–4), s. 105-119

8. Schryver P. D., Crab R., Defoirdt T., Boon N., Verstraete W. The basics of bio-flocs technology: The added value for aquaculture, Aquaculture, 2008 vol. 277, s. 125-137

9. Koohestanian A., Hosseini M., Abbasian Z. The separation method for removing of colloidal particles from raw water, American-Eurasian Journal of Agricultural and Environmental Sciences, 2008 vol. 4, s. 266-273

10. Farajnezhad H., Gharbani P. Coagulation treatment of wastewater in petroleum industry using polyaluminum chloride and ferric chloride, International Journal of Research and Reviews in Applied Sciences, 2012 vol. 13, s. 306-310

11. Renault F., Sancey B., Badot P. M., Crini G. Chitosan for coagulation/flocculation processes–An eco-friendly approach, European Polymer Journal, 2009 vol. 45, s. 1337-1348

12. http://www.aquasure.fr/spip.php?article74 (11.02.2014 r.) 13. Hirajima T., Aiba Y., Farahat M., Okibe N., Sasaki K., Tsuruta T., Doi K.

Effect of microorganisms on flocculation of quartz, International Journal of Mineral Processing, 2012 vol. 102–103, s. 107-111

14. Jia X. S., Furumai H., Fang H. H. P. Extracellular polymers of hydrogen-utilizing methanogenic and sulfate-reducing sludges, Water Research, 1996 vol. 30, s. 1439-1444

15. Sheng G.-P., Yu H.-Q., Li X.-Y. Extracellular polymeric substances (EPS) of microbial aggregates in biological wastewater treatment systems: a review, Biotechnology Advances, 2006 vol. 28, s. 882-894

16. Bura R., Cheung M., Liao B., Finlayson J., Lee B. C., Droppo I. G. Composition of extracellular polymeric substances in the activated sludge floc matrix, Water Science and Technology, 1998 vol. 37 (4–5), s. 325-333

17. Kurane R., Hatamochi K., Kakuno T., Kiyohara M., Hirano M., Taniguchi Y. Production of a bioflocculant by Rhodococcus erythropolis S-1 grown on alcohols, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1994 vol. 58, s. 428-429

18. Bao-jun J. I. A., Jiang-mei Y. U. The research status and development trend of microbial flocculant, Physics Procedia, 2012 vol. 24, s. 425-428

19. Yoshitaka T., Aida K. Exocellular mucopolysaccharide closely related to bacterial floc formation, Applied and Environmental Microbiology, 1977 vol. 34 (3), s. 308-314

20. Durmaz B., Sanin F. D. Effect of carbon to nitrogen ratio on the composition of microbial extracellular polymers in activated sludge, Water Science and Technology, 2001 vol. 44 (10), s. 221-229

21. Willen B. M., Keiding K., Nielsen P. H. Anaerobic deflocculation and aerobic reflocculation of activated sludge, Water Research, 2000 vol. 34, s. 3933-3942

22. Krishna C., van Loosdrecht M. C. M. Effect of temperature on storage polymers and settleability of activated sludge, Water Research, 1999 vol. 33, s. 2374-2382

23. Endo T., Nakamura K., Takahashi H. Pronase susceptible floc forming bacteria: relationship between flocculation and calcium ion, Agricultural and Biological Chemistry, 1976 vol. 40, s. 2289-2295

http://www.aquasure.fr/spip.php?article74%20


66

24. Shimofuruya H., Koide A., Shirota K., Tsuji T., Nakamura M., Suzuki J. The production of flocculating substance(s) by Streptomyces griseus, Bioscience, Biotechnology and Biochememistry, 1996 vol. 60, s. 498-500

25. Levy N., Magdasi S., Bar-Or Y. Physico-chemical aspects in flocculation of bentonite suspensions by a cyanobacterial, Water Research, 1992 vol. 26, s. 249-254

26. Jin B., Wilén B. M., Lant P. A comprehensive insight into floc characteristics and their impact on compressibility and settleability of activated sludge, Chemical Engineering Journal, 2003 vol. 95, s. 221-234

27. Ebeling J. M., Rishel K. L., Sibrell P. L. Screening and evaluation of polymers as flocculation aids for the treatment of aquacultural effluents, Aquaculture Engineering, 2005 vol. 33, s. 235-249


Streszczenie Flokulacja jest procesem fizyko-chemicznym zachodzącym w roztworach wodnych na granicy fazy stałej i ciekłej. Zjawisko to występuje przy udziale związków zdolnych do agregacji cząstek fazy stałej, w wyniku czego możliwa jest ich sedymentacja, a w konsekwencji usunięcie z roztworu. Substancje przeprowadzające proces flokulacji nazywane są flokulantami i ze względu na źródło pochodzenia dzielimy je na trzy grupy: flokulanty nieorganiczne (siarczan glinu, chlorek żelaza), syntetyczne flokulanty organiczne (pochodne poliakrylamidu) i flokulanty naturalne zwane bioflokulantami. Bioflokulanty powstające jako produkty metabolizmu mikroorganizmów są nietoksyczne i biodegradowalne i mogą być stosowane bez szkody dla środowiska naturalnego. Proces flokulacji może zachodzić według dwóch podstawowych mechanizmów - mostkowania i łatkowania, przy czym znane są jeszcze inne procedury tłumaczące to złożone zjawisko jak dwuwarstwowe sprzężenie i flokulacja wymiatająca. Flokulacja, jako proces przebiegający w środowisku naturalnym, jest zależna od wielu czynników, które w mniejszym lub większym stopniu wpływają na jej wydajność. Umiejętne dostosowanie tych czynników w warunkach laboratoryjnych pozwala na efektywniejszy przebieg flokulacji na skalę przemysłową. Słowa kluczowe: flokulacja, bioflokulanty, oczyszczanie

Wastewater treatment using flocculation process

Abstract Flocculation is a physicochemical process taking place in water solutions on solid and liquid phase border. This phenomenon occurring with the participation of molecules, that are able to aggregate solid particles, which causes sedimentation and in the end - their removal from the solution. Substances carrying out the flocculation process are known as flocculants and can be classified in three groups: inorganic flocculants (polyaluminium sulphate, ferric chloride), synthetic organic flocculants (polyacrylamide derivatives) and natural flocculants called bioflocculants. Bioflocculants synthesized by microbial cultures are non-toxic and biodegradable and can be applied without damage for natural environment. Flocculation can occur according to two basic mechanisms - bridging and patching, beyond we know two more motion which can explain that phenomenon like double layer compression and sweep flocculation. Flocculation as natural running process is dependent on many factors, which can influence on its efficiency in different ways. Appropriate correlation between these factors during laboratory scale results in more effective working on industrial scale. Keywords: flocculation, bioflocculants, wastewater treatment

67

Joanna Lach1

Mikrosolwatacja cząsteczek iperytu siarkowego

w ujęciu obliczeń pierwszych zasad

1. Wstęp

To nie przypadek, że coraz więcej osób zaczyna się interesować

problemem zatopionych w Morzu Bałtyckim bojowych środków

chemicznych (BSCh). Według oficjalnych danych w czasie II wojny

światowej oraz tuż po zakończeniu w Bałtyku zostało zatopionych

w przybliżeniu 50 tysięcy ton amunicji zawierającej co najmniej 15 tysięcy

ton bojowych środków trujących [1]. W miarę wzrostu wartości

ekonomicznej Morza Bałtyckiego, problemy związane z tysiącami ton

pocisków oraz bomb zawierających bojowe środki chemiczne (głównie

gazy bojowe) zaczynają nabierać globalnego znaczenia.

To skłania do zastanowienia się, co zrobić, aby zminimalizować

zagrożenie związane z BSCh – lepiej zapobiegać niż leczyć. Do dziś, nie

znaleziono efektywnego sposobu, by zniszczyć lub zneutralizować środki

chemiczne wyprodukowane na potrzebny II wojny światowej, które do dziś

stanowią realne zagrożenie nie tylko dla państw nadbałtyckich, lecz

również tych położonych w bardziej w głąb lądu. Rozwiązanie problemu

neutralizacji gazów bojowych należy rozpocząć od zbadania, w jakich

formach związki te występują w roztworze wodnym, w warunkach

panujących na dnie Morza Bałtyckiego. Dopiero wtedy możemy zacząć

szukać rozwiązania problemu neutralizacji BSCh.

2. Od zatrutych strzał do II wojny światowej

Pierwsze doniesienia dotyczące użycia trucizn – szkodliwych substancji

chemicznych, sięgają epoki kamienia (10000 p.n.e.). Mieszkający w Afryce

łowcy, zwani Sanu, używali strzał namaczanych w jadach węży,

skorupiaków oraz w ekstraktach z trujących roślin. W Indiach, na polu

bitwy, stosowano toksyczne opary już około 2000 roku p.n.e. Znaleziono

setki chińskich receptur produkcji trujących i drażniących dymów

pochodzących z VII wieku p.n.e. Asyryjczycy około roku 600 p.n.e. zatruli

ziarnami sporyszu dopływ wody. W czasie oblężenia Cirrha w roku 590

zostały użyte korzenie ciemiernika, będące silnym środkiem przeczysz-

czającym. Za czasów naszej ery jednym z pierwszych przypadków

stosowania trucizn na polu walki było użycie przez Nerona kwasu

cyjanowodorowego. Lista przykładów stosowania substancji dziś

Joanna Lach

68

nazywanych gazami bojowymi, czy bojowymi środkami trującymi, jest

bardzo długa [2]. Mimo szybkiego rozwoju cywilizacyjnego, ludzie wciąż

używają przeciwko swoim wrogom szkodliwych substancji chemicznych.

Ze względu na wprowadzenie nowoczesnych, jak na tamte czasy, metod

użycia broni chemicznych, I wojna światowa nazwana została „wojną

chemików”. Większość użytych bojowych środków trujących została

odkryta w XVIII i XIX wieku, należą do nich między innymi: chlor,

fosgen, gaz musztardowy oraz chloropikryna [3]. Użycie broni chemicznej

na masową skalę w czasie I wojny światowej spowodowało wprowadzenie

Protokołu Genewskiego (1929). Mimo że produkcja i używanie bojowych

środków chemicznych zostały zabronione, na potrzeby II wojny światowej

zostały wyprodukowano tysiące ton amunicji. Na terenie Niemiec po

wojnie do 1948 roku znaleziono 296 103 ton chemicznej amunicji, głównie

bomby lotnicze i pociski artyleryjskie zawierające BSCh, w tym 40% to

gaz musztardowy [1, 4].

3. Powojenny sposób “neutralizacji”

Przywódcy koalicji antyhitlerowskiej w 1945 roku podpisali

Porozumienie Poczdamskie regulujące zasady neutralizacji bojowych

środków chemicznych pozostałych po II wojnie światowej. Wybrano

metodę zatapiania w morzu lub oceanie amunicji chemicznej, kierując się

niskimi kosztami oraz możliwością szybkiego pozbycia się arsenału broni

chemicznej. Trzecim powodem, o którym już tak głośno się nie wspomina,

był brak pomysłu, jak skutecznie i bezpiecznie zniszczyć tak duże ilości

trujących chemikaliów. Nie jest to zaskakujące, gdyż nawet w obecnych

czasach neutralizacja BSCh jest procesem skomplikowanym oraz bardzo

kosztownym [5, 6].

3.1. Drogi transportu oraz rejony zatapiania BSCh

Zatapianie amunicji polegało na wyrzucaniu za burtę amunicji

w drewnianych kratownicach, które często, przez długi czas unosiły się na

powierzchni wody. Na dnie Morza Bałtyckiego, zostały również znalezione

wraki okrętów z ładunkami BSCh. Systemy nawigacyjne na statkach

transportowych nie były tak dokładne jak dziś (np. GPS), co często

uniemożliwia podanie dokładnej lokalizacji zatopionych pocisków i bomb.

Oficjalne rejony zatapiania BSCh:

wschodnia część Bornholmu;

południowa część Głębi Gotlandzkiej;

cieśnina Mały Bełt;

Skargerrak.

,

Mikrosolwatacja cząsteczek iperytu siarkowego w ujęciu obliczeń pierwszych zasad

69

Oprócz rejonów oficjalnych amunicję chemiczną odnaleziono również

w Głębi Gdańskiej oraz bruździe Słupskiej, czyli bardzo bliskopolskiej linii

brzegowej. Często, już nawet w drodze do rejonów zatapiania amunicja

była wyrzucana za burtę [1, 2].

Rys. 1. Rysunek przedstawia oficjalne oraz nieoficjalne rejony zatapiania (zaznaczone na

ciemny niebieski kolor), oficjalne (zaznaczone kropkami) oraz nieoficjalne (linia ciągła)

drogi transportu bojowych środków chemicznych [2].

W zależności od rejonu zatapiania inny jest rodzaj i ilość zatopionej

amunicji. W Basenie Bornholmskim oraz Głębi Gotlandzkiej znaleziono

głównie bomby lotnicze (K.C. 250) zawierające do 100 kg BSCh, głównie

iperytu siarkowego. W cieśninie Mały Bełt zlokalizowano amunicję

zawierającą w większości przypadków środek paralityczno-drgawkowy,

jakim jest tabun.

4. Przykłady chemicznych środków bojowych oraz zasady

pierwszej pomocy

Tabun

Jeden z najbardziej toksycznych bojowych środków trujących, które

zostały zatopione w Morzy Bałtyckim. Przenika do organizmu poprzez

skórę, oczy oraz drogi oddechowe. Mioza – zwężenie źrenicy oka, jest

jednym z pierwszych objawów działania tabunu. Ogólnie tabun powoduje

osłabienie widzenia, zmianę ostrości widzenia, zmniejszenie zdolności do

akomodacji oczu oraz ból gałek ocznych. Objawy te po kilku dniach

ustępują i nie pozostawiają żadnych trwałych skutków. Dawka śmiertelna

przy działaniu przez skórę wynosi 1 gram na człowieka, podczas działania

na drogi oddechowe z kolei wynosi 400 mg*min*m3 (śmierć następuje po

około 20 minutach). Ochrona przed działaniem tabunu polega na nałożeniu

pogumowanej odzieży ochronnej oraz maski przeciwgazowej.

Joanna Lach

70

W środowisku wodnym łatwo ulega degradacji, rozkładając się do

nietoksycznych związków. Jednym z produktów rozkładu jest kwas

cyjanowodorowy, który również ulega degradacji w tych warunkach.

W wypadku skażenia tabunem należy przemyć oczy dwu procentowym

roztworem kwaśnego węglanu sodu. Skażoną skórę przemyć bieżącą wodą

z mydłem. W razie skażenia wewnętrznego podać do wypicia zawiesinę

węgla aktywnego i wywołać wymioty.

Luizyt

Luizyt łatwo rozpoznać po charakterystycznym zapachu pelargonii.

Przenika do organizmu przez skórę i działa na układ oddechowy

wywołując ogólne zatrucie i nekrozę (martwicę). Podczas kontaktu ze

skórą pojawia się natychmiastowe pieczenie, przy większych dawkach

wiśniowo-czerwone pęcherze, które pękają tworząc trudno gojące się rany.

Porażenie dróg oddechowych wywołuje kaszel, duszności, utratę głosu,

często zapalenie płuc. Ochrona przed działaniem luizytu i pierwsza pomoc

wygląda identycznie jak w przypadku porażenie iperytem siarkowym

(opisane w rozdziale 5).

Chloroacetofenon

Należy do grupy lakrymatorów – łzawiących środków chemicznych.

Działa na błony śluzowe powodując silne łzawienie oczu. Gdy stężenie jest

duże może wywołać podrażnienia skóry twarzy. Objawy ustępują po

opuszczeniu skażonej strefy. Zabezpieczenie przed działaniem

chloroacetofenonu stanowi założenie maski przeciwgazowej. Pierwsza

pomoc polega na przemyciu oczu 2% roztworem kwaśnego węglanu sodu

(soda oczyszczona), przy obfitym łzawieniu z kolei 1% roztworem

Atropiny, przeciwbólowo można zastosować Nowokainę. Skażoną skórę

należy przemyć obficie wodą i acetonem [1,2,4].

Adamsyt

Środek bojowy drażniący błony śluzowe i górne drogi oddechowe.

Wywołuje natychmiastowy silny ślinotok, ból w płucach i trudności

z oddychaniem. Nie wywołuje nieodwracalnych zmian w organizmie – po

opuszczeniu skażonego terenu objawy znikają bez trwałych następstw.

W wypadku skażenia należy przemyć oczy i jamę ustną 2% roztworem

kwaśnego węglanu sodu. Jeśli jest to konieczne należy podać

poszkodowanemu środki przeciwbólowe, uspokajające i hamujące kaszel [2].

Iperyty azotowe

Wykazują właściwości oraz objawy porażenia podobne do iperytu

siarkowego (podane w rozdziale 5). Różnicą między iperytami azotowymi

,


71

a iperytem siarkowym jest to, iż okres utajonego działania iperytów

azotowych jest znacznie krótszy i może wynosić nawet kilka minut.

Charakteryzują się kwiatowym zapachem, co ułatwia ich rozpoznanie.

Zachowanie iperytów azotowych w środowisku wodnym do dziś nie jest

dokładnie poznane.

5. Iperyt siarkowy – główny cel badań

Pierwsze użycie iperytu siarkowego odnotowano w 1917 roku w Belgii,

nieopodal miejscowości Ypres we Flandrii. Alianci byli wtedy ostrzeliwani

pociskami artyleryjskimi zawierającymi gaz musztardowy. Początkowo nie

były odczuwalne żadne skutki niepożądanego działania, dopiero po

2 godzinach, gdy stężenie par znacznie wzrosło, zaczęły pojawiać się

charakterystyczne objawy. Gaz musztardowy wykazuje toksyczność

w postaci par, cieczy i roztworów. W czasie I Wojny Światowej, wojskowe

laboratoria starały się prześcignąć w produkcji coraz nowszych gazów

bojowych oraz środków ochrony osobistej. Gaz musztardowy był jednym

z pierwszych bojowych środków chemicznych, który wnikał do organizmu

całą powierzchnią ciała i przez drogi pokarmowe, a nie tylko przez drogi

oddechowe.

Po okresie utajonego działania można zaobserwować następujące

skutki:

pojawienie się pęcherzyków na skórze łączących się później

w duże pęcherze, które po kilku dniach pękają (gojenie się ran trwa

nawet do kilku miesięcy pozostawiając po sobie blizny i brązowe

plamy);

bolesny, suchy kaszel, zanik głosu, zapalenie płuc;

uszkodzenie spojówek i rogówki oczu, trwałe uszkodzenia w zarodku;

trwałe osłabienie (cherlactwo poiperytowe);

działanie teratogenne;

działanie kancerogenne [1, 2].

Zabezpieczenie przed działaniem iperytu siarkowego jest dość trudne,

gdyż należy osłonić całą powierzchnię ciała poprzez nałożenie

pogumowanej odzieży ochronnej oraz maski.

Leczenie w każdym wypadku wymaga opieki medycznej. W wypadku

skażenie powierzchni ciała należy usunąć pozostałości iperytu

z powierzchni skóry przy pomocy gazy (tamponu) oraz 5-10% roztworu

węglanu sodu, wody amoniakalnej czy 1-2% roztworu nadmanganianu

potasu. Usunięcie iperytu siarkowego z układu pokarmowego polega na

wywołaniu wymiotów lub zastosowaniu płukania żołądka. Powierzchnię

śluzówek i ran należy przemyć 5% roztworem węglanu sodu, oczy

0,2% roztworem węglanu sodu.

Joanna Lach

72

5.1. Budowa i właściwości

Rys. 2. Struktura iperytu siarkowego w fazie gazowej. Oznaczenie atomów: węgiel – kolor

niebieski, wodór – kolor biały, siarka – kolor żółty, chlor – kolor zielony

[Opracowanie własne]

Iperyt siarkowy należy do tioeterów (sulfidów) organicznych związków

chemicznych. Zbudowany jest z siarki będącej centralnym heteroatomem

z przyłączonymi do niego dwoma grupami 2-chloroetylowymi.

Jest oleistą cieczą, jego temperatura topnienia wynosi 13-14°C,

temperatura wrzenia zaś 215-217°C. Masa cząsteczkowa gazu musztar-

dowego wynosi 159,08 u. Produkt techniczny ma barwę żółtobrunatną

i charakterystyczny zapach czosnku, po oczyszczeniu jest bezbarwny oraz

bezwonny [3, 4].

Niektóre źródła podają, że iperyt siarkowy w środowisku wodnym ulega

hydrolizie, w wyniku której powstają nieszkodliwe produkty [6].

Zakładając samoistną hydrolizę iperytu w wodzie należałoby uznać, że

problem zatopionych BSCh zostanie sam rozwiązany. Zawarte w beczkach

BSCh ulegną degradacji i zagrożenie zniknie po kilku latach. Okazuje się,

że tak nie jest. Badania podwodne nie wskazują na ubytek masy BSCh na

dnie Bałtyku.

Wyrzucane na brzeg morza grudy iperytu pokazują, że może on

przetrwać w formie niezhydrolizowanej przez wiele lat. W wodzie morskiej

iperyt siarkowy, być może ze względu na stosowane w amunicji

wypełniacze, nie hydrolizuje (lub dzieje się to bardzo wolno). Przyjmuje on

stabilną formę o konsystencji gliny, którą trudno rozdrobnić [2, 7].

6. Metoda badawcza

W celu zbadania rzeczywistego zachowania się iperytu siarkowego

w wodzie morskiej należy zachować wszystkie warunki środowiska,

w jakim się on znajduje. Wyciągnięcie próbek iperytu na powierzchnię

i kontakt z powietrzem powodują zachodzenie reakcji uniemożliwiających

,


73

analizę procesów chemicznych w głębi morza. Zebranie próbek, które

znajdowały się na powierzchni w stanie takim, jak na dnie morza jest

bardzo trudne, a czasami wręcz niemożliwe do zrealizowania. Podwodne

laboratoria, no cóż, nie istnieją.

Teoretyczne modelowanie molekularne oparte na metodach chemii

kwantowej otwiera wiele możliwości. Jest to metoda znacznie

bezpieczniejsza, bo nieinwazyjna oraz pozwala na dokładne określenie

przebiegu procesu chemicznego. Modelowanie molekularne pozwala na

opis reakcji solwatacji iperytu siarkowego na poziomie molekularnym.

Obliczenia kwantowo-mechaniczne dla cząsteczki iperytu siarkowego

oraz cząsteczki wody zostały przeprowadzone przy pomocy pakietu

GAUSSIAN. Wykorzystana została teoria funkcjonałów gęstości DFT

(ang. Density Functional Theory), przy użyciu funkcjonału PBE oraz bazy

funkcyjnej cc-pVDZ. Obliczenie energii izolowanych cząsteczek iperytu

siarkowego, wody oraz układów złożonych z obu cząsteczek pozwoliło na

wyznaczenie energii odziaływań międzycząsteczkowych. Jako struktury

początkowe dla kompleksów iperyt siarkowy – woda wzięto różne

konfiguracje różniące się rodzajem oraz ilością wiązań wodorowych.

Wykonano optymalizację geometrii dla struktur początkowych. Wybrano

najbardziej stabilne minima lokalne, dla których przeprowadzono później

dokładną analizę parametrów strukturalnych.

Joanna Lach

74

7. Wyniki

A B

C

D

Rys. 3. Zoptymalizowane struktury kompleksu iperyt siarkowy – woda (A, B, C) oraz

struktury izolowanej cząsteczki w fazie gazowej (D). Na rysunkach zaznaczone zostały wiązania wodorowe powstające między cząsteczkami oraz ich długość [Å]

[opracowanie własne]

A B C Ebezwzg [kJ/mol] -49,75 -36,15 -28,73

Ewzgl [kJ/mol] 0 13,60 21,02

Tabela 1.Energia bezwzględna oraz energia względna odziaływań cząsteczek iperytu

siarkowego z wodą wyrażone w kJ/mol. Struktura A jest najbardziej stabilna i stanowi

minimum globalne [opracowanie własne]

Obliczono energię układów iperyt siarkowy-woda oraz energię

izolowanych cząsteczek. Różnica pomiędzy kompleksem iperyt siarkowy-

,


75

woda a monomerami wody oraz iperytu siarkowego wyraża energię

odziaływań międzycząsteczkowych. Oddziaływanie pomiędzy cząsteczkami

wody i gazu musztardowego wyrażane jest głównie, jako odziaływanie

elektrostatyczne wskutek powstającego wiązania wodorowego.

Najbardziej stabilną strukturą (o najniższej energii) jest struktura A, zwana

minimum globalnym. Optymalizacja geometrii spowodowała wygięcie się

cząsteczki iperytu siarkowego w stosunku do izolowanej struktury

monomeru w fazie gazowej. W minimum globalnym występują dwa

wiązania wodorowe typu C-H …

O oraz jedno typu O-H …

Cl. Obliczona

energia wiązania jest wartością szacunkową i może się nieznacznie zmienić

w zależności od metody obliczeniowej. Nie zmienia to jednak faktu, że

wartość 30 kJ/mol wskazuje na silne łączenie się iperytu siarkowego

z wodą i tworzenie trwałego kompleksu.

Wartość energii wiązania dla struktury B wynosi -36,15 kJ/mol, energia

względna wynosi 13,60 kJ/mol. Między cząsteczkami powstaje jedno

wiązanie C-H …

O oraz jedno O-H …

S.

Najmniej stabilną strukturą jest struktura B, w której obserwujemy

oddziaływania C-H …

O oraz O-H …

Cl. Obliczona energia osiąga

najwyższą wartość -28,73 kJ/mol. Różnica energii względem struktury

najbardziej stabilnej wynosi 21,02 kJ/mol.

8. Wnioski

Na podstawie otrzymanych wyników widzimy, że obecność większej

ilości wiązań C-H …

O powoduje stabilizację struktury (A), obecność trzech

wiązań wodorowych sprawia, że energia osiąga najniższe wartości. Mimo

że w układach B i C występuje taka sama liczbą wiązań, ich oddziaływania

mają różną siłę. Na podstawie wartości energii możemy wnioskować, że

wiązanie O-H …

S jest silniejsze od wiązania wodorowego O-H …

Cl.

Energia wiązania C-H …

O ma podobną wartość we wszystkich układach,

co sugeruje, że układ B jest stabilniejszy ze względu na większą moc

wiązania O-H …

S.

Cząsteczka iperytu siarkowego dąży do maksymalizacji energii

oddziaływania z wodą. Struktura A znacznie odbiega od struktury gazu

musztardowego w środowisku gazowym (D).

Podziękowania

Serdecznie dziękuję kmdr. por. dr. inż. Jackowi Fabisiakowi oraz

dr. Jackowi Bełdowskiemu za umożliwienie wykorzystania materiałów

opracowanych w projekcie CHEMSEA (www.chemsea.eu).

http://www.chemsea.eu/

Joanna Lach

76

Literatura

1. CHEMSEA FINDINGS Results from the CHEMSEA Project – Chemical

muniions search and assessment

2. Zatopiona amunicja chemiczna – poradnik dla załóg kutrów rybackich

3. Chemical Warfare Agents, J. A. Romano, B. J. Lukey, H. Salem, 2008 Taylor

& Framcis Group, LLC

4. The war gases, M. Sartori, 1939, New York, D. VAN NOSTRAND CO., INC.

5. www.chemsea.eu

6. Parameters for Evaluation of the Fate, Transport, and Environmental Impacts

of Chemical Agents in Marine Environments. George O. Bizzigotti, Harry

Castelly, Ahmed M. Hafez, Wade H. B. Smith, and Mark T. Whitmire. Chem.

Rev. 2009, 109, 236-256

7. Polska dla Bałtyku, Główny Inspektorat Ochrony Środowiska, Warszawa

2012

Mikrosolwatacja częsteczek iperytu siarkowego w ujęciu obliczeń

pierwszych zasad

Wartość ekonomiczna Morza Bałtyckiego w ciągu ostatnich lat zaczęła wzrastać, głównie

jest to spowodowane transportem dóbr i nośników energii. Czynnikiem ograniczającym dalszy rozwój jest obecność na dnie morza chemicznych środków bojowych (BSCh)

zatopionych po drugiej wojnie światowej (ich ilość szacuje się na 50 tysięcy ton). Koszt ich

wydobycia i neutralizacji jest bardzo wysoki, co zmusza nas do odnalezienia sposobu na

oszacowanie potencjalnego zagrożenia i zrozumienia procesu degradacji BSCh w środowisku wodnym.

Spośród wszystkich BSCh zrzuconych do Morza Bałtyckiego, największy odsetek stanowi

gaz musztardowy (znany także jako iperyt siarkowy, H czy HD). Cząsteczka iperytu

siarkowego jest idealnym modelem do badania procesu solwatacji BSCh w wodzie przy

pomocy technik modelowania molekularnego. Przewidywanie natury oddziaływań

rozpuszczalnika z cząsteczkami substancji rozpuszczonej przy pomocy obliczeniowych

metod kwantowo-chemicznych są bezpieczne oraz mniej kosztowne w porównaniu do

analizy laboratoryjnej. Głównym celem naszej pracy było teoretyczne opisanie procesu mikrosolwatacji gazu

musztardowego w wodzie. W celu znalezienia struktur lokalnych minimów gazu

musztardowego wykorzystaliśmy teorię funkcjonałów gęstości (DFT – density functional

theory). W celu przewidzenia stabilności badanych systemów obliczono energię wiązań.

Słowa kluczowe: mikrosolwatacja, iperyt siarkowy, gazy bojowe, DFT, Morze Bałtyckie

http://www.chemsea.eu/

,


77

Microsolvation of sulphur yperite from first principles calculation

Economical value of Baltic Sea is increasing due to new investments, mainly to the transfer

of goods and energy carriers. The limiting step in further development is the presence of dumped chemical warfare agents (CWA's) from the Second World War. The costs of taking

out and neutralization of CWA's are very high so we have to find way to estimate the

potential danger and understand the process of CWA degradation in the water solution.

Among the CWA dumped in Baltic Sea, the amount of sulfur mustard (also known as mustard gas, sulfur yperite, H or HD) is estimated as the highest. The molecule of sulfur

mustard is an ideal model to study the solvation process of CWA's in water using molecular

modeling techniques. The laboratory analysis of CWA are of the high risk, therefore the

theoretical approaches based on quantum chemical seems to be safe and low cost method to investigate the nature of solute-solvent interactions.

The main aim of this work is the theoretical description of the process of sulphur mustard

solvation in water. We used the density functional theory (DFT) to obtain local minima

structures of sulphur mustard – water complexes with different stechiometry. We calculated binding energies to estimate the relative stability of the system

Keywords: microsolvation, sulphur mustard, CWA, DFT, Baltic Sea

78

Katarzyna Szewczuk-Karpisz1, Małgorzata Wiśniewska, Małgorzata

Sęczkowska

Porównanie mechanizmu stabilności suspensji

tlenku chromu(III) w obecności

poli(kwasu akrylowego)

oraz polisacharydu pochodzenia bakteryjnego

1. Wstęp

Skład fizyczno-chemiczny wód powierzchniowych jest w wysokim

stopniu uzależniony od działalności gospodarczej człowieka.

Zanieczyszczenia antropogeniczne, stanowiące często poważny problem

wielu ekosystemów, przyczyniają się do różnorodności oraz zmienności

udziału procentowego poszczególnych związków chemicznych w wodach

powierzchniowych [1]. W ostatnich latach stale rośnie zainteresowanie

mikrozanieczyszczeniami wód. Objawia się to coraz większą liczbą

normowanych wskaźników jakości wody przeznaczonej do spożycia

i celów gospodarczych oraz tendencją do ciągłego obniżania

dopuszczalnych stężeń mikrozanieczyszczeń do takich, przy których nie

wywołują one patologicznych zmian u konsumentów [2].

Flokulacja to proces powstawania agregatów cząstek, tzw. „kłaczków”

lub inaczej „flokuł”, w wyniku łączenia zdestabilizowanych cząstek

koloidalnych za pośrednictwem makrocząsteczek wprowadzonego do

układu polimeru. Łańcuchy polimerowe adsorbują się na powierzchni

cząstek koloidalnych tworząc „mostki” pomiędzy nimi, co prowadzi do

destabilizacji układu. Powstałe skupiska cząstek, które dzięki wysoce

rozwiniętej powierzchni właściwej mogą dodatkowo adsorbować

mikrozanieczyszczenia wody występujące w postaci rozpuszczonej lub

zawiesin, usuwane są na drodze sedymentacji i/lub filtracji [3, 4]. A zatem,

zjawisko destabilizacji suspensji jest wysoce pożądane w procesie

oczyszczania wód i ścieków. W układzie zdestabilizowanym powstają

agregaty o znacznie większych rozmiarach w porównaniu do tych,

powstających w układzie o wysokiej stabilności. Dzięki swojej masie

1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Chemii,

Zakład Radiochemii i Chemii Koloidów, www.radiochemistry.umcs.lublin.pl


,

Porównanie mechanizmu stabilności suspensji tlenku chromu(III)

w obecności poli(kwasu akrylowego) oraz polisacharydu pochodzenia bakteryjnego

79

skupiska te znacznie szybciej opadają na dno osadników, przez co ich

usunięcie z roztworu jest łatwiejsze.

Jako flokulanty określa się rozpuszczalne w wodzie, naturalne lub

syntetyczne polimery, które znacząco podnoszą efektywność procesu

destabilizacji. Związki uczestniczą w tworzeniu trójwymiarowych struktur

ze znajdującymi się w wodzie cząstkami koloidalnymi. Zastosowanie

odpowiednich substancji polimerowych ułatwia opadanie osadu oraz

umożliwia przebieg procesu w niskich temperaturach [5, 6].

Głównym celem przeprowadzonych prac doświadczalnych było

zbadanie zdolności flokulacyjnych polimeru syntetycznego – poli(kwasu

akrylowego), oraz polimeru naturalnego – egzopolisacharydu bakterii

Sinorhizobium meliloti, w odniesieniu do koloidalnego tlenku chromu(III).

To intensywnie zielone ciało stałe ze względu na szerokie wykorzystanie

w wielu gałęziach przemysłu w charakterze barwnika może stanowić

wysoce niepożądany składnik ścieków przemysłowych [7].

2. Materiały

W przeprowadzonych pracach doświadczalnych jako adsorbent

wykorzystano tlenek chromu(III) – Cr2O3. Jego powierzchnia właściwa

określona metodą BET wynosiła 7,12 m2/g. Przed rozpoczęciem badań

adsorbent odmyto wodą redestylowaną do przewodności poniżej 3 µS/cm

w celu usunięcia zanieczyszczeń nieorganicznych.

Z kolei, jako adsorbaty wykorzystano dwa rodzaje polimerów o różnym

pochodzeniu. Pierwszym z nich był anionowy poli(kwas akrylowy) – PAA,

o średniej wagowo masie cząsteczkowej równej 240 000 (Aldrich). Zawiera

on w swojej makrocząsteczce jeden rodzaj grup funkcyjnych – grupy

karboksylowe (rys. 1), które ulegają dysocjacji wraz ze wzrostem pH

roztworu.

Rys. 1. Wzór strukturalny poli(kwasu akrylowego) [8]

Wartość pKa, tj. pH roztworu, przy którym połowa grup

karboksylowych w makrocząsteczkach PAA występuje w formie

zdysocjowanej, jest równa 4,5 [9]. Korzystając z poniższego wzoru:

1logapKpH (1)

Katarzyna Szewczuk-Karpisz, Małgorzata Wiśniewska, Małgorzata Sęczkowska

80

obliczono stopnie dysocjacji (α) PAA w roztworach o różnym pH (w pH

3 α = 0,03, w pH 4,5 α = 0,5, natomiast w pH 9 α = 0,99).

Drugim wykorzystanym adsorbatem był egzopolisacharyd (EPS)

syntetyzowany przez bakterie Sinorhizobium meliloti podczas ich wzrostu.

Wyizolowany EPS to głównie sukcynyloglikan złożony z oktasacharydowych

podjednostek zawierających siedem cząsteczek glukozy oraz jedną

cząsteczkę galaktozy połączonych wiązaniami β-1,3, β-1,4 oraz

β-1,6 glikozydowymi [10]. Sukcynyloglikan ma szkielet cukrowy

modyfikowany podstawnikami bursztynylowymi, pirogronylowymi

i acetylowymi [11] (rys. 2).

Rys. 2. Struktura sukcynyloglikanu [12]

Masa frakcji wysokocząsteczkowej (HMW) wyizolowanego EPS

wynosi od 1 000 000 do 10 000 000 [13]. Makrocząsteczki EPS zawierają

głównie grupy karboksylowe oraz hydroksylowe, z których tylko te

pierwsze ulegają dysocjacji i są źródłem ujemnego ładunku biopolimeru.

Na podstawie wyników przeprowadzonego miareczkowania potencjo-

metrycznego wyznaczono wartość pKa dla EPS, która wynosi ok. 3,8.

Ponadto, korzystając ze wzoru (1) obliczono, że stopień dysocjacji

egzopolisacharydu w pH 3 wynosi 0,14, w pH = 3,8 α = 0,5, natomiast

w pH 9 α = 0,99.

3. Metody

Miareczkowanie potencjometryczne rozpoczynano od przygotowania

50 cm3 roztworu zawierającego 0,01 M NaCl (elektrolit podstawowy).

Następnie dodawano 0,2 cm3 0,1 M roztworu HCl, otrzymując w ten

sposób roztwór o pH wyjściowym ok. 3,5, Po wprowadzeniu 1,5 g tlenku

chromu(III) suspensję miareczkowano 0,1 M NaOH. W identyczny sposób

przeprowadzono miareczkowanie suspensji zawierającej odpowiedni

polimer (0,1 ppm). Gęstość ładunku powierzchniowego adsorbentu przy

braku i w obecności PAA lub EPS wyliczono przy wykorzystaniu

programu ‘titr_v3’ opracowanego przez W. Janusza.

,



81

Wielkość adsorpcji wybranego związku wielkocząsteczkowego na

powierzchni ciała stałego mierzono spektrofotometrycznie na podstawie

różnicy w jego stężeniu w roztworze przed i po procesie adsorpcji. Do

oznaczenia ilościowego poli(kwasu akrylowego) wykorzystano metodę

Crummeta i Hummela [14], natomiast do oznaczenia stężenia

egzopolisacharydu – metodę Dubois i współpr. [15]. Pomiar wielkości

adsorpcji rozpoczynano od przygotowania szeregu roztworów polimeru

(10 cm3) o stężeniach: 10, 30, 50, 70, 100, 150 i 200 ppm, które

równocześnie zawierały 0,01 M NaCl. Następnie dodawano odpowiednią

naważkę tlenku chromu(III) oraz ustalano pH roztworów (3 lub 9 ± 0,05).

Proces adsorpcji prowadzono przez 24 godziny, po czym suspensje dwukrotnie

odwirowano i mierzono stężenie związku wielkocząsteczkowego

w supernatancie.

Pomiary stabilności suspensji tlenku chromu(III) przy braku

i w obecności polimeru wykonano przy wykorzystaniu turbidymetru.

Podczas pomiaru przez badaną próbkę przechodziła wiązka światła

z zakresu podczerwieni ( = 880 nm). Wyniki pomiarów rejestrowano

w postaci krzywych transmisji i rozproszenia wstecznego światła

przechodzącego przez suspensję. Uzyskane dane umożliwiły wyznaczenie

współczynników stabilności TSI (ang. Turbiscan Stability Index), których

wartości zostały obliczone przez specjalistyczne oprogramowanie

komputerowe współpracujące z turbidymetrem na podstawie wzoru:

1

)(1

2

n

xx

TSI

n

i

BSi

(2)

gdzie: xi – średnie rozproszenie wsteczne dla każdej minuty pomiaru,

xBS – średnie xi, n – ilość skanów.

Ponadto, powyższe oprogramowanie pozwoliło na uzyskanie średniego

rozmiaru agregatów tlenku chromu(III) oraz jego flokuł utworzonych

w obecności PAA lub EPS w badanych próbkach. Suspensje nie

zawierające polimeru przygotowywano poprzez dodanie 0,02 g tlenku

chromu(III) do 20 cm3 roztworu 0,01 M NaCl. Z kolei, próbki ze

związkiem wielkocząsteczkowym sporządzano poprzez wprowadzenie

identycznej naważki do 20 cm3 roztworu zawierającego polimer oraz

0,01 M NaCl. Po 3-minutowej sonifikacji oraz ustaleniu określonego pH

roztworu (3 lub 9 ± 0,05) rozpoczynano pomiar stabilności. Pojedynczy

pomiar trwał 15 godzin, w ciągu których co 15 minut rejestrowano

odpowiednie dane.


82

4. Wyniki pomiarów oraz ich interpretacja

4.1. Gęstość ładunku powierzchniowego tlenku chromu(III) przy

braku i w obecności PAA oraz EPS

Na podstawie wyników przeprowadzonego miareczkowania

potencjometrycznego stwierdzono, że wartość pHpzc (punkt zerowego ładunku)

tlenku chromu(III) wynosi ok. 7,6. Oznacza to, że w roztworze o pH równym

7,6 wypadkowy ładunek powierzchniowy adsorbentu jest równy 0.

W roztworach o pH powyżej tej wartości powierzchnia tlenku chromu(III) jest

naładowana ujemnie, natomiast w pH poniżej tej wartości – dodatnio. Dodatek

zarówno poli(kwasu akrylowego), jak i egzopolisacharydu powoduje

przesunięcie pHpzc układu w kierunku kwaśnych wartości pH. W obecności

PAA wartość ta wynosi ok. 3,8, natomiast w obecności0 EPS – 6,7. Dane te

zestawiono w poniższej tabeli.

Tab. 1. Wartości pHpzc tlenku chromu(III) w roztworze elektrolitu

podstawowego oraz w roztworach zawierających PAA lub EPS

0,01 M NaCl 0,1 ppm PAA 0,1 ppm EPS

pHpzc 7,6 3,8 6,7

Warto również zauważyć, że adsorpcja PAA lub EPS na powierzchni

tlenku chromu(III) powoduje obniżenie ładunku powierzchniowego ciała

stałego w całym badanym zakresie pH w stosunku do układu pod ich

nieobecność. Co więcej, obniżenie to jest tym większe, im wyższe jest pH

roztworu. Wzrost pH skutkuje zwiększeniem ilości zdysocjowanych grup

karboksylowych w makrocząsteczkach zastosowanych polimerów. Grupy

COO- występujące w segmentach polimerowych niezwiązanych

bezpośrednio z adsorbentem (tworzących struktury typu pętli i ogonów

zaadsorbowanych łańcuchów) odpowiadają za obniżenie ładunku

powierzchniowego tlenku metalu.

,



83

4.2. Wielkość adsorpcji PAA oraz EPS na powierzchni tlenku

chromu(III)

Uzyskane wyniki pomiarów adsorpcyjnych przedstawiono na

poniższym rysunku.

Rys. 3. Wielkość adsorpcji PAA oraz EPS na powierzchni tlenku chromu(III) w pH 3 i 9

(stężenie początkowe polimeru wynosiło 150 ppm)

Analiza danych zamieszczonych na rysunku 3 wykazała, że zarówno

w pH 3, jak i pH 9 oba badane związki wielkocząsteczkowe adsorbują się

na powierzchni tlenku metalu. Jednakże, wielkość adsorpcji obu polimerów

jest wyższa w roztworze o pH 3. Ilość zaadsorbowanego polimeru

uzależniona jest przede wszystkim od siły i charakteru oddziaływań

elektrostatycznych adsorbent-adsorbat. Ma to bezpośredni wpływ na

konformację makrocząsteczek polimeru związanych z powierzchnią Cr2O3.

Jak wspomniano w poprzednim rozdziale, w pH 3 powierzchnia tlenku

chromu(III) jest naładowana dodatnio. Z kolei, makrocząsteczki PAA oraz

EPS na skutek dysocjacji małej części ich grup karboksylowych posiadają

niewielki ładunek ujemny. Dzięki temu możliwe jest słabe przyciąganie

elektrostatyczne pomiędzy powierzchnią tlenku metalu i łańcuchami

związku wielkocząsteczkowego. Ponadto, niewielki stopień dysocjacji

badanych polimerów w pH 3 (dla PAA 0,03; dla EPS 0,14) sprawia, że

adsorbujące się łańcuchy polimerowe przyjmują bardziej skłębioną

konformację. Taka struktura makrocząsteczek umożliwia adsorpcję ich

dużej liczby na jednostkowej powierzchni adsorbentu.

W pH 9 zarówno makrocząsteczki polimeru, jak i powierzchnia tlenku

chromu(III) są naładowane ujemnie. Skutkiem tego jest odpychanie

elektrostatycznego pomiędzy powierzchnią cząstek tlenku metalu

0

0,5

1

1,5

2

pH 3 pH 9

wielkość adsorpcji [mg/m2]

PAA

EPS


84

a segmentami polimeru, które utrudnia im wzajemny kontakt. Zjawisko to

powinno wykluczać adsorpcję, jednakże, uzyskane wyniki wykazują, że

pewna ilość polimerów adsorbuje się na powierzchni ciała stałego. Jest to

prawdopodobnie związane z tworzeniem mostków wodorowych pomiędzy

wszystkimi rodzajami grup powierzchniowych tlenku chromu(III)

a grupami karboksylowymi polimeru. Co więcej, w pH 9 stopnie dysocjacji

poli(kwasu akrylowego) oraz egzopolisacharydu są sobie równe i wynoszą

0,99. Oznacza to, że praktycznie wszystkie grupy karboksylowe w ich

łańcuchach są zdysocjowane i na skutek wzajemnego odpychania

pomiędzy segmentami, makrocząsteczki przyjmują silnie rozwiniętą

konformację. Ich adsorpcja powoduje zablokowanie części miejsc

aktywnych na powierzchni ciała stałego, co objawia się niższą wielkości

adsorpcji polimeru w tych warunkach pH.

Większa ilość zaadsorbowanego EPS w porównaniu do PAA przy obu

wartościach pH roztworu jest spowodowana znacznie wyższą masą

cząsteczkową EPS.

4.3. Stabilność suspensji tlenku chromu(III) przy braku

i w obecności PAA oraz EPS

W tabeli 2 zestawiono uzyskane wartości TSI dla badanych układów.

Natomiast w tabeli 3 umieszczono uzyskane rozmiary agregatów tlenku

chromu(III) oraz flokuł powstających w obecności wybranych polimerów.

Tab. 2. Wartości współczynnika stabilności (TSI) dla suspensji tlenku

chromu(III) przy braku i w obecności PAA oraz EPS

Współczynnik stabilności (TSI)

pH 3 pH 9

Tlenek chromu(III) 12,76 29,28

Tlenek chromu(III) + PAA 65,55 10,63

Tlenek chromu(III) + EPS 25,59 61,85

Tab. 3. Średnia wielkość agregatów (flokuł) w suspensji tlenku chromu(III)

przy braku i w obecności PAA oraz EPS

Średni rozmiar agregatów (flokuł) [µm]

pH 3 pH 9

Tlenek chromu(III) 0,077 0,127

Tlenek chromu(III) + PAA 0,156 0,109

Tlenek chromu(III) + EPS 0,085 0,625

,



85

Suspensja tlenku chromu(III) jest stosunkowo stabilna zarówno w pH 3

(TSI=12,76). Natomiast w pH 9 układ charakteryzuje się niższą

stabilnością (TSI=29,28). Adsorpcja poli(kwasu akrylowego) i egzopoli-

sacharydu wyraźnie wpływa na stabilność badanych suspensji.

W obecności PAA w pH 3 dochodzi do znacznego obniżenia stabilności

układu (TSI=65,55), z kolei w pH 9 do jej podwyższenia (TSI=10,63).

Natomiast, dodatek EPS zarówno w pH 3, jak i pH 9 powoduje spadek

stabilności układu. Jednakże, spadek ten jest znacznie większy w pH 9

(TSI= 61,85). W próbkach o niższej stabilności powstają większe agregaty

oraz flokuły w porównaniu do próbek bardziej stabilnych. Przykładowo,

w pH 3 w suspensji tlenku chromu(III) zawierającej poli(kwas akrylowy)

charakteryzującej się niską stabilnością tworzą się flokuły o średnicy 0,156

µm. Natomiast w pH 9 w identycznej suspensji, która w tych warunkach

odznacza się stosunkowo wysoką stabilnością, powstają flokuły o średnicy

0,109 µm.

4.4. Mechanizm stabilności suspensji tlenku chromu(III) przy

braku i w obecności PAA oraz EPS

Analiza otrzymanych wyników pozwoliła na określenie mechanizmu

stabilności suspensji tlenku chromu(III) przy braku i w obecności

syntetycznego oraz naturalnego polimeru w pH 3 oraz 9.

Suspensja tlenku chromu(III) jest stosunkowo stabilna w pH 3. W tych

warunkach w układzie zachodzi stabilizacja elektrostatyczna. W roztworze

o pH 3 cząstki tlenku metalu są naładowane dodatnio i dookoła każdej

z nich zostaje utworzona dyfuzyjna warstwa ładunku ujemnego, czyli

warstwa jonów chlorkowych pochodzących z roztworu elektrolitu

podstawowego. Warstwa tych jonów stanowi barierę, która skutecznie

zapobiega zderzaniu się cząstek, a tym samym znacznie ogranicza

tworzenie się agregatów.

W obecności poli(kwasu akrylowego) w pH 3 dochodzi do wyraźnego

spadku stabilności układu. Jest ona przede wszystkim związana

z neutralizacją dodatniego ładunku cząstek adsorbentu przez

makrocząsteczki polimeru obdarzone niewielkim ładunkiem ujemnym.

W roztworze o pH poniżej wartości pKa w makrocząsteczkach PAA

przeważają niezdysocjowane grupy karboksylowe w stosunku do grup

zdysocjowanych. Jednakże, ich ilość jest wystarczająca do skutecznego

zobojętnienia ładunku cząstek ciała stałego. Ponadto, jak już wcześniej

wspomniano w pH 3 makrocząsteczki PAA przyjmują bardziej skłębioną

konformację na skutek niewielkiej zawartości grup COO-. Prowadzi to do

praktycznie całkowitego pokrycia powierzchni cząstek tlenku chromu(III)

skłębionymi łańcuchami polimerowymi.


86

W pH 9 adsorpcja PAA powoduje wyraźne podwyższenie stabilności

suspensji tlenku chromu(III). W tych warunkach w układzie ma miejsce

stabilizacja elektrosteryczna układu. Wynika ona zarówno z odpychania

elektrostatycznego pochodzącego od ładunków ujemnych zaadsorbowanych

makrocząsteczek, jak i odpychania sterycznego warstewek polimerowych.

W układzie są więc obecne siły odpychania elektrosterycznego, które

przyczyniają się do znacznego wzrostu jego stabilności.

Natomiast w obecności egzopolisacharydu bez względu na pH roztworu

dochodzi do obniżenia stabilności suspensji tlenku chromu(III). W pH 3,

podobnie jak w przypadku PAA, zachodzi destabilizacja układu na skutek

neutralizacji ładunku dodatnich cząstek tlenku metalu przez zaadsorbowane

łańcuchy polimerowe. W tych warunkach makrocząsteczki EPS podobnie

jak makrocząsteczki PAA są skłębione ze względu na niewielką zawartość

zdysocjowanych grup karboksylowych, dzięki czemu możliwe jest

całkowite pokrycie powierzchni adsorbentu polimerem.

W pH 9 suspensja tlenku chromu(III) zawierająca EPS charakteryzuje

się jeszcze niższą stabilnością niż w pH 3. W tym przypadku praktycznie

wszystkie grupy karboksylowe makrocząsteczek polisacharydu są

zdysocjowane. Jednakże, ujemny ładunek powierzchniowy cząstek ciała

stałego sprawia, że destabilizacja układu poprzez neutralizację ładunku

adsorbentu nie jest możliwa. W pH 9 destabilizacja suspensji jest wynikiem

tworzenia mostków polimerowych przez zaadsorbowane makrocząsteczki

egzopolisacharydu. Ze względu na wysoką masę cząsteczkową EPS

łańcuchy polimerowe charakteryzują się wystarczającym rozwinięciem,

aby możliwa była ich jednoczesna adsorpcja na powierzchni co najmniej

dwóch cząstek ciała stałego. Zjawisko to sprzyja tworzeniu flokuł

o znacznych rozmiarach – średnio pięć razy większych niż w pozostałych

układach (tabela 3), które szybko opadają na dno fiolki pomiarowej. Taką

destabilizację na skutek tworzenia mostków polimerowych określa się jako

flokulację mostkową.

5. Wnioski

Analiza rezultatów przeprowadzonych prac doświadczalnych

(tj. miareczkowania potencjometrycznego, pomiarów stabilności układu

oraz wielkości adsorpcji) pozwoliła na określenie mechanizmu stabilności

suspensji tlenku chromu(III) przy braku i w obecności poli(kwasu

akrylowego) oraz egzopolisacharydu syntetyzowanego przez bakterie

Sinorhizobium meliloti w pH 3 i 9. Suspensja tlenku chromu(III) nie

zawierająca polimeru charakteryzuje się stosunkowo wysoką stabilnością

zarówno w pH 3, co jest związane ze stabilizacją elektrostatyczną układu.

Poli(kwas akrylowy) wywołuje destabilizację suspensji w pH 3, co jest

,



87

podyktowane neutralizacją ładunku powierzchniowego adsorbentu przez

makrocząsteczki polimeru. Natomiast egzopolisacharyd przyczynia się do

najwyższej destabilizacji układu w pH 9, powodując flokulację mostkową.

Reasumując, zarówno poli(kwas akrylowy), jak i polisacharyd bakteryjny

mogą być wykorzystane jako substancje zwiększające efektywność procesu

usuwania tlenku chromu(III) z wody i ścieków. W pewnych warunkach pH

roztworu oba zastosowane związki wielkocząsteczkowe powodują destabi-

lizację suspensji, która jest równoznaczna z powstawaniem flokuł

o znacznych rozmiarach, szybko opadających na dno zbiornika.

Literatura

1. Kowal A. L., Świderska-Bróż M., Oczyszczanie wody. Podstawy teoretyczne i technologiczne, procesy i urządzenia, Warszawa, PWN, 2009

2. Świderska-Bróż M., Mikrozanieczyszczenia wód i możliwości ich usuwania, Ochrona środowiska, 1993 vol. 3, s. 23-28

3. Adamski W., Modelowanie systemów oczyszczania wód, Warszawa, PWN, 2002 4. Beddow V., Coagulation and flocculation in water and wastewater

treatement, http://iwawaterwiki.org/xwiki/bin/view/Articles/CoagulationandFlocculationinWaterandWastewaterTreatment

5. Kaleta J., Puszkarewicz A., Uzdatnianie wody do spożycia przez ludzi, Rzeszów, Oficyna Wydawnicza Politechniki Rzeszowskiej, 2011

6. Magrel L., Uzdatnianie wody i oczyszczanie ścieków, Urządzenia, procesy, metody. Białystok, Wydawnictwo Ekonomia i Środowisko, 2000

7. Gattens R. J., Stout G. L., Painting materials: a short encyclopaedia, New York, Dover Publications, 1966

8. Szewczuk K., Badanie możliwości usuwania tlenku chromu(III) z suspensji wodnej przy użyciu poli(kwasu akrylowego), Praca magisterska,UMCS, Wydział Chemii

9. Minczewski J., Marczenko Z., Chemia analityczna t.1, Warszawa, PWN, 1965 10. Skorupska A., Janczarek M., Marczak M., Mazur A., Król J., Rhizobial

exopolysaccharides: genetic control and symbiotic functions, Micro. Cell. Factor., 2006 vol. 5, s. 5-17

11. Reinhold B. B., Chan S. Y., Reuber T. L., Marra A., Walker G. C., Reinhold V. N., Detailed structural characterization of succinoglycan, the major exopolysaccharide of Rhizobium meliloti Rm1021, J. Bacteriol., 1994 vol. 176, s. 1997-2002

12. Simsek S., Ojanen-Reuhs T., Stephens S. B., Reuhs B. L., Strain-ecotype specifity in Sinorhizobium meliloti-Medicago truncatula symbiosis is correlated to succinoglycan oligosaccharide structure, J. Bacteriol., 2007 vol. 189, s. 7733-7740

13. Gharzouli R., Cerpene M. A., Couderc F., Benguedouar A., Poinsot V., Relevance of Fucose-Rich Extracellular Polysaccharides Produced by Rhizobium sullae strains nodulating Hedysarum coronarium L. Legumes, Appl. Env. Microbiol., 2013 vol. 79, s. 1764-1776

http://iwawaterwiki.org/xwiki/bin/view/Articles/CoagulationandFlocculationinWaterandWastewaterTreatment

http://iwawaterwiki.org/xwiki/bin/view/Articles/CoagulationandFlocculationinWaterandWastewaterTreatment


88

14. Crummet W. B., Hummel R. A., The determination of traces of polyacrylamides in water, J. Am. Water works Accos., 1963 vol. 55, s. 209

15. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith F., Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Analytical Chemistry, 1956 vol. 28, s. 350-356


w obecności poli(kwasu akrylowego) oraz polisacharydu pochodzenia

bakteryjnego

Streszczenie Ograniczona dostępność wody pitnej to problem dotyczący wielu regionów świata. W celu jego rozwiązania wielu naukowców poszukuje substancji pozwalających na zwiększenie efektywności oczyszczania wód i ścieków. Ogromną szansą dla poprawy wydajności tego procesu są flokulanty – polimery przyspieszające proces tworzenia agregatów cząstek stałych. W tej pracy zbadano zdolności flokulacyjne polimeru syntetycznego PAA – poli (kwasu akrylowego) oraz polimeru naturalnego EPS – polisacharydu pochodzenia bakteryjnego, względem tlenku chromu(III). Wybór tlenku metalu był podyktowany jego szerokim wykorzystaniem w przemyśle, a tym samym wysokim prawdopodobieństwem jego obecności w ściekach. Prace doświadczalne obejmowały szereg metod badawczych, tj. miareczkowanie potencjometryczne, spektrofotometryczne oznaczenie ilościowe polimeru, turbidymetryczny pomiar stabilności układu. Analiza otrzymanych wyników wykazała, że w określonych warunkach pH roztworu zarówno PAA, jak i EPS wykazują zdolności flokulacyjne w stosunku do cząstek tlenku chromu(III). Poli(kwas akrylowy) powoduje najsilniejszą destabilizację suspensji w pH 3, natomiast egzopolisacharyd w pH 9. A zatem, powyższe związki wielkocząsteczkowe mogą znaleźć potencjalne wykorzystanie w procedurze usuwania tlenku chromu(III) z wód i ścieków. Słowa kluczowe: poli(kwas akrylowy), polisacharyd bakteryjny, adsorpcja, stabilność, tlenek chromu(III)

The comparison of chromium(III) oxide suspension stability

mechanism in the presence of polyacrylic acid and bacterial

polysaccharide

Abstract The limited availability of drinking water is a problem in many world regions. To partly solve it, many scientists is looking for the substances enhancing the efficiency of water and wastewater treatment. Flocculants, i.e. polymers accelerating the formation of solid particle aggregates, are a great opportunity to improve the efficiency of this process. In this paper the flocculating ability of synthetic polymer PAA - polyacrylic acid, and natural polymer EPS - polysaccharide of bacterial origin, relative to the chromium(III) oxide was determined. The metal oxide choice was dictated by its extensive use in the industry and thus a high probability of its presence in wastewaters. Experiments included many research methods, such as potentiometric titration, spectrophotometric polymer quantification as well as turbidimetric measurement of the system stability. The result analysis showed that under certain pH conditions both PAA and EPS possess the chromium(III) oxide flocculation ability. Polyacrylic acid causes the highest suspension destabilization at pH 3, whereas exopolysaccharide – at pH 9. Thus, these macromolecules can be used in the chromium(III) oxide removal procedure from water and wastewaters. Keywords: polyacrylic acid, bacterial polysaccharide, adsorption, stability, chromium(III) oxide

89

Mateusz Niścior1

Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych

1. Podstawowe pojęcia i definicje

Adsorpcja to zjawisko występujące na granicy zetknięcia się dwóch

faz, związane z występowaniem pewnego pola niewysyconych sił

międzycząsteczkowych np. sił Van der Waalsa. W rezultacie

oddziaływania tych sił następuje zmiana stężenia określonego składnika

(adsorbatu) w fazie ciekłej lub gazowej oraz jego stężenia na granicy faz.

Materiałem, na powierzchni, którego zachodzi zjawisko adsorpcji

nazywamy adsorbentem. Najczęściej jest to porowate ciało stałe.

Adsorpcja dodatnia ma miejsce wtedy, gdy wzrasta stężenie substancji na

powierzchni adsorbentu, natomiast w odwrotnej sytuacji mówimy

o adsorpcji ujemnej. Adsorpcja to w większości przypadków proces

egzotermiczny. Cząsteczka, która uległa adsorpcji na powierzchni, traci

stopnie swobody, w wyniku, czego zmiana entropii jest ujemna, ΔS<0. Aby

proces był samorzutny zmiana entalpii swobodnej, określona zależnością

ΔG= ΔH - TΔS, musi być mniejsza od zera, ΔG<0, zatem zmiana entalpii

ΔH również musi być ujemna (proces egzotermiczny). W zależności od

rodzaju działających na powierzchni sił rozróżniamy adsorpcję fizyczną

i chemiczną [1].

Adsorpcja fizyczna (fizysorpcja), jest zjawiskiem, w którym cząsteczki

adsorbatu znajdujące się na granicy faz podlegają niezrównoważonym

siłom Van der Waalsa, skierowane prostopadle do powierzchni granicznej.

Fizysorpcja jest procesem egzotermicznym, a w podwyższonej

temperaturze następuje odwrócenie procesu, którego szybkość jest

ograniczona głównie przez szybkość dyfuzji adsorbatu do powierzchni.

W adsorpcji tego rodzaju pojedyncza cząsteczka ma dwa stopnie swobody,

umożliwia jej to przemieszczanie się po powierzchni. Zaadsorbowane

cząsteczki często mogą tworzyć więcej niż jedną warstwę [1, 2].

W przypadku adsorpcji chemicznej (chemisorpcji), cząsteczki

adsorbatu wiążąc się z powierzchnią tworząc pewien rodzaj połączeń

chemicznych – powstaje wówczas wiązanie kowalencyjne bądź

koordynacyjne. W takiej sytuacji możliwa jest tylko adsorpcja w postaci

monowarstwy, przy czym pojedyncza cząsteczka ma zero stopni swobody.

1 [email protected], UMCS, Wydział Biologii I Biotechnologii, Instytut Biologii i Biochemii,

http://www.binoz-programy.umcs.lublin.pl


Mateusz Niścior

90

Oczywiście obok sił natury chemicznej równocześnie zawsze występują

siły dyspersji i odpychania, niezależnie od charakteru adsorpcji i granic

fazowych. Chemisorpcja jest procesem często nieodwracalnym. Entalpia

chemisorpcji jest dużo większa niż w przypadku fizysorpcji - wynosi

średnio od 100 do 400 kJ/mol. Oznacza to, że cząsteczki ulegające

adsorpcji chemicznej są silniej związane z powierzchnią adsorbentu

i trudniej ulegają wymianie z innymi cząsteczkami. Na podstawie

porównania efektów energetycznych towarzyszących procesowi adsorpcji

możemy wówczas określić jej charakter – czy jest to adsorpcja fizyczna

bądź chemiczna. Adsorpcja może być monowarstwowa (jedna,

niekoniecznie pełna warstwa adsorbatu na powierzchni adsorbenta) bądź

wielowarstwowa [1].

Adsorpcja na granicy różnych faz

Proces adsorpcji zachodzi na granicy faz. Ze względu na rodzaj granicy

faz, zjawisko adsorpcji można rozpatrywać w następujących układach:

ciało stałe-ciecz;

ciało stałe-gaz;

ciecz-gaz;

ciecz-ciecz [2].

Proces adsorpcji substancji rozpuszczonej na powierzchni swobodnej

roztworu opisujemy najczęściej równaniem Gibbsa. Proces adsorpcji gazu

na powierzchni ciał stałych opisuje teoria adsorpcji jednowarstwowej

Langmuira i teoria adsorpcji wielowarstwowej BET (skrót od nazwisk

autorów). Adsorpcję na granicy ciało stałe roztwór opisywana jest za

pomocą empirycznego równania Freundlicha [2].

Pomiar adsorpcji - desorpcji

Pomiar adsorpcji - desorpcji (proces odwrotny do adsorpcji) ma na celu

określenie, na podstawie analizy zmian stężenia lub ciśnienia w fazie

gazowej lub ciekłej, jaka ilość adsorbatu przemieściła się do lub

z adsorbentu [1].

2. Podstawowa klasyfikacja adsorbentów ze względu na:

2.1. Porowatość:

Adsorbent nieporowate - mają one niewielką powierzchnię właściwą,

rzadko przekraczającą 10 m2/g. Zazwyczaj powierzchnia ta wynosi

od 0,1 do 1 m2/g. Powierzchnię właściwą ciał nieporowatych określa

się ich powierzchnią zewnętrzną, którą można zwiększyć poprzez

rozdrabnianie. Przykładem tego typu adsorbentów są: dymy sadze

(sadza grafitowana), BaSO4, aerożele krzemionkowe [2];

,


91

Adsorbenty porowate - są to ciała stałe o powierzchniach

właściwych od setek do tysiąca m2/g. Adsorbenty takie stosuje się

w postaci ziarnistej (tabletki, granulki, kulki) w celu nadania im

odpowiedniej wytrzymałości i zmniejszenia oporu w stosunku do

strumienia gazu bądź cieczy. Wielkości ziaren wynoszą zwykle od

0,1 do 2 nm. [2].

Rodzaje porowatości:

Porowatość adsorbentów może być różna. Pory mogą różnić się

zarówno rozmiarami jak i kształtem. W wielu przypadkach jednak

najważniejszym rozróżnieniem porowatości adsorbelit6w jest szerokość

por6w. Przyjmując cylindryczny kształt porów mówimy o ich średnicy.

W przypadku szczelinowych porów można mówić o ich szerokości.

Dubinin [3] podał klasyfikację porów według ich promieni:

Mikropory – pory o promieniach mniejszych od 2 nm;

Pory pośrednie (mezopory) – pory o promieniach większych

od 2 nm.a mniejszych od 50nm;

Makropory – pory o promieniach większych od 50 nm.

Klasyfikacja porów według Dubinina została dość powszechnie przyjęta

w literaturze naukowej dotyczącej zagadnienia adsorpcji i adsorbentów.

2.2. Podział adsorbentów ze względu na charakter powierzchni

(uwzględnia rozmieszczenie ładunków elektrycznych na

powierzchni):

Adsorbenty niespecyficzne –charakteryzujące się oddziaływaniami

powszechnymi, które występują miedzy dowolnymi partnerami, są to

przede wszystkim oddziaływania dyspersyjne, związane z uzgodnionym

ruchem elektronów (np. grafitowane sadze, polimery);

Adsorbenty specyficzne – charakteryzujące się oddziaływaniami

spowodowanymi niejednorodną gęstością elektronów zewnętrznych

(peryferyjnych), związane jest to z miejscowym zagęszczeniem

ujemnych lub dodatnich ładunków (np. SiO2 x nH2O, zeolity) [2, 4].

2.3. Klasyfikacja adsorbentów według Kisielewa

Typ I – adsorbenty niespecyficzne – na ich powierzchni nie ma grup

funkcyjnych zdolnych do wymiany jonu. Do tej grupy należą przede

wszystkim grafitowane sadze, a także węglowodory nasycone

i polimery (np. polietylen);

Typ II – adsorbenty specyficzne dodatnie na swojej powierzchni

mają grupy OH o kwasowym charakterze np. zhydroksylowane

Mateusz Niścior

92

powierzchnie tlenków kwasowych, w szczególności SiO2 x nH2O.

Do adsorbentów grupy drugiej zaliczamy zeolity;

Typ III – adsorbenty specyficzne ujemne – na powierzchni mają

wiązania lub grupy atomów ze skupionym na ich peryferiach

ładunkiem ujemnym [2, 5].

Otrzymuje się je przeważnie przez nałożenie na powierzchnię

niespecyficznego adsorbentu (typu I), a w szczególności na powierzchnię

grafitowanej sadzy, monomolekularnej warstwy cząsteczek lub

mikrocząstek grupy B. Innym sposobem jest chemiczne modyfikowanie

powierzchni adsorbentów innych typów, wbudowując odpowiednie grupy

funkcyjne jak np. – CN [4, 6].

3. Parametry charakteryzujące strukturę porów ciał stałych:

Powierzchnia właściwa ciała stałego (S) – równa jest sumie

powierzchni zewnętrznej i wewnętrzne wyrażana jest w m2/g ciała stałego.

Możliwa jest odwrotna relacja między powierzchnią właściwą a średnim

promieniem porów. Im większa jest powierzchnia właściwa (S>500 m2/g),

tym mniejsze są wartości promieni porów (R). Stąd duża powierzchnia

właściwa wskazuje na obecność niewielkich porów, natomiast o obecności

makroporów świadczy mała powierzchnia właściwa (S<10 m2/g) [2].

Średni promień porów (wyrażany w nm. lub Å) – jest on wartością

średnią promieni porów dla danego materiału porowatego [1].

Całkowita objętość porów (Vp) jest wyrażana w cm3 czystego

adsorbatu na 1g porowatego ciała stałego. Objętość całkowita porów

odpowiada objętości ciekłego adsorbatu, który wypełnia pory zawarte w

jednostce masy adsorbatu [4].

4. Metody otrzymywania adsorbentów

4.1. Adsorbenty nieporowate otrzymuje się poprzez:

strącanie krystalicznych osadów, jak np. BaSO4;

mielenie ciał stałych (szklistych lub krystalicznych);

niepełne spalanie substancji organicznych (tzw. czarne sadze) lub

krzemoorganicznych (tzw. białe sadze);

hydrolizę chlorowcobezwodników kwasu ortokrzemowego np. SiCl4

lub SiF4 w silnie przegrzanej parze wodnej, uzyskując tzw. aerozole

krzemionkowe;

obróbkę zwykłej sadzy polegającą na ogrzewaniu jej w temperaturze

3000°C pod zmniejszonym ciśnieniem, w atmosferze gazu

obojętnego. W tej temperaturze cząsteczki sadzy przybierają postać

wielościanów pokrytych grafitem (sadze grafitowane) [1, 7].

,


93

4.2. Adsorbenty porowate otrzymuje się przez:

syntezę (aglomerację) - która polega na zbudowaniu sztywnego

szkieletu adsorbentu z małych cząstek o rozmiarach koloidalnych;

cząstki te (korpuskuły) zlepiają się lub zrastają w miejscach zetknięcia,

tworząc szkielet o olbrzymiej powierzchni wewnętrznej; w ten sposób

otrzymuje się m.in. żele krzemionkowe, uwodniony Al2O3;

wywarzanie porów w litym materiale wyjściowym – polega na

działaniu na porowate lub nieporowate ciała (koks, szkło),

aktywnymi gazami lub cieczami [1, 5, 7].

Przykłady:

Węgiel aktywny - z bardzo rozwiniętą powierzchnią (rozmiary porów

od kilku do kilkudziesięciu nm.) – powstaje podczas działania na

nieaktywny węgiel gazami utleniającymi w temperaturze od 1123 do 1223 K;

wówczas część węgla ulega spaleniu [1].

Szkła porowate - otrzymuje się działając kwasami na szkło sodowo-

borowe. Rozmiary porów zależą od obróbki cieplnej szkła i końcowego

przemywania roztworami NaOH lub KOH [1].

Metale porowate, jak np. nikiel Raney’a otrzymuje się poprzez

wyługowanie NaOH stopu Ni z Al; w stopie tym podczas krzepnięcia

wydzielają się obydwa metale, jako oddzielne fazy; po rozpuszczeniu glinu

w NaOH pozostaje porowaty szkielet niklowy [1].

5. Podstawowe modele i równania izoterm adsorpcji

5.1. Równowaga adsorpcyjna.

W stanie równowagi, który ustala się pomiędzy gazem lub parą

a powierzchnią ciała stałego, stężenie gazu na tej powierzchni jest z reguły

większe niż wewnątrz fazy gazowej, bez względu na rodzaj i własności

gazu i powierzchni. W każdym ciele stałym atomy na powierzchni

podlegają działaniu niezrównoważonych sił przyciągania, skierowanych

prostopadle do płaszczyzny powierzchni. Przywrócona zostaje częściowo

równowaga sił dzięki adsorpcji cząsteczek gazu [8].

Dane eksperymentalne dowodzą, że niezależnie od sposobu opisu

zjawisk adsorpcyjnych, równowagowy rozkład cząsteczek adsorbatu

pomiędzy powierzchnią adsorbentu i fazą gazową, zależy od ciśnienia

adsorbowanego gazu i temperatury procesu, tj.

𝑎 = 𝑓 (𝑝,𝑇)T) (1)

Mateusz Niścior

94

gdzie:

a – ilość zaadsorbowanej substancji przypadająca na jednostkę powierzchni

lub masyadsorbentu,

p – ciśnienie adsorbatu w warunkach równowagi,

T – temperatura [8].

5.1.1. Stan równowagi adsorpcyjnej rozpatrywanyw trojaki

sposób

W zależności od warunków eksperymentu mierzalność adsorpcji może

być przedstawiona w następującej postaci:

Jeżeli temperatura jest stała (T=const), wówczas równowagę można

opisać równaniem izotermy adsorpcji:

a=f(p)T

Rys. 1 Izotermy adsorpcji [8]

Jeżeli ciśnienie jest stałe (p=const), równowagę adsorpcyjną można

opisać równaniem izobary adsorpcji:

a = f (T)p

Rys. 2 Izobary adsorpcji [8]

,


95

Gdy ilość zaadsorbowanej substancji jest stała (a=const.),

równowagę można opisać równaniem izostery adsorpcji:

a = f (T)a

Rys. 3 Izostery adsorpcji [8]

Spośród wielu modeli teoretycznych opisujących równowagę adsorpcji

można wymienić najbardziej znane i popularne: r-nie Gibbsa, Henry’ego,

Freundlicha, Langmuira, BET oraz teoria potencjałowa. Niektóre z wyżej

wymienionych równań izoterm oparte są na modelu siatkowym natomiast

teoria potencjałowa zakłada dyfuzyjny charakter warstwy adsorpcyjnej.

5.2. Równanie powierzchniowej adsorpcji Gibbsa

Gibbs (1878) wyprowadził matematycznie uniwersalne równanie,

opisujące adsorpcję. W przypadkucząsteczek substancji rozpuszczonej

np. związków organicznych, adsorpcję określa się terminem nadmiaru

powierzchniowego: ,który oznacza różnicę między liczbą moli substancji

nagromadzonej w fazie powierzchniowej o jednostkowej powierzchni,

a ilością tejże substancji zawartej w równoważnej ilości fazy objętościowej

[2, 4].

Równanie to ma następującąpostać:

(2)

gdzie:

Ž2– nadmiar powierzchniowy składnika 2,

a – aktywność substancji rozpuszczonej w roztworze,

ζ– napięcie powierzchniowe,

R – stała gazowa,

T – temperatura [2, 4].

Mateusz Niścior

96

Nadmiar powierzchniowy może być dodatni lub ujemny.Równanie

adsorpcji Gibbsa wiąże adsorpcję cząstek substancji rozpuszczonej na

powierzchni rozpuszczalnika ze zmianą napięcia powierzchniowego.

Cząsteczki substancji rozpuszczonej gromadzą się na powierzchni

swobodnej roztworu, powodując obniżenie napięcie powierzchniowe

rozpuszczalnika, gdy:

podczas, gdy cząsteczki substancji podwyższających napięcie

powierzchniowe „uciekają” z powierzchni do wnętrza cieczy [2].

5.3. Równanie adsorpcji Henry’ego

Równowagę adsorpcyjną w układzie gaz – ciało stałe można

przedstawić następująco:

W przypadku jednorodnej powierzchni stężenie substancji w warstwie

powierzchniowej ajest proporcjonalne do stężenia substancji c w fazie

gazowej:

(3)

gdzie K jest stałąrównowagi adsorpcji [2].

Wiadomo, że dla gazów doskonałych i dlatego możliwe jest

wyznaczenie całkowitej ilości zaadsorbowanej N w stałych warunkach

temperatury i objętości [2,4]:

(4)

WielkośćN wyraża sięczęsto liczbąmoli adsorbatu na 1g adsorbentu.

Zamiast wielkości N można wielkość adsorpcji, wyrazić, jako ilość

substancji zaadsorbowanej Nt, przypadającą na jednostkę powierzchni

adsorbentu:

a (5)

gdzie:

Nt- wyraża liczbęmikromoli na 1 cm2lub liczbęcząsteczek na 1nm2 ,

ls-grubośćwarstwy adsorpcyjnej,

s -powierzchnia właściwa adsorbentu [2, 4].

Przy małym ciśnieniu gazu wielkośćjego adsorpcji N (na 1g adsorbentu)

lub Nt (na jednostkę powierzchni adsorbentu) jest proporcjonalna do

stężenia lub ciśnienia w fazie objętościowej. Jest to zależnośćanalogiczna

do równania Henry’ego opisującego rozpuszczalność gazów w cieczach.

Równanie(4) jest postacią najprostszego równania izotermy adsorpcji,

zwane równaniem Henry’ego, a jego stała– stała Henry’ego [2].

,


97

W odróżnieniu od wielkości N, zależnej od powierzchni właściwej

adsorbentu, wielkości Nt zależy jedynie od natury składników układu

adsorbent + adsorbat przy stałych p i T [2].

Wielkości te określane sąabsolutnymi wielkościami adsorpcji dla

nieporowatych lub szeroko porowatych adsorbentów o jednorodnej

powierzchni stałymi fizyko-chemicznymi [2, 9]

Zamiast stężenia powierzchniowego a lub całkowitej ilości zaadsorbowanej

substancji N często wygodniej jest stosować wielkość wyrażająca

stopień pokrycia powierzchni adsorbentu:

(6)

gdzie: amoraz nmoznaczająwielkości odpowiadające całkowitemu

pokryciu powierzchni jednocząsteczkowąwarstwa danego adsorbatu [9].

Z równania (6) wynika, że pokrycie powierzchni w obszarze Henry’ego

jest proporcjonalne do ciśnienia substancji w fazie gazowej [2, 9].

5.4. Równanie adsorpcji Freundlicha

Adsorpcja na granicy faz ciało stałe - roztwór ciekły, jest bardziej

złożona od adsorpcji gazów. Wielkość adsorpcji zależy od oddziaływania

pomiędzy każdym ze składników roztworu,a adsorbentem.

Niezależnie od tego czy mamy do czynienia z adsorpcją z fazy gazowej

lub ciekłej, stan równowagi adsorpcyjnej opisywany jest przez empiryczne

równanie Freundlicha.

Równanie to ma postać:

a=kcn (7)

gdzie:

a – oznacza liczbę moli substancji zaadsorbowanej przez 1g adsorbentu,

c – stężenie molowe roztworu w stanie równowagi adsorpcyjnej,

w przypadku gazu stężenie zastępujemy ciśnieniem,

k i n – wielkości stałe (zależne od temperatury, rodzaju adsorbentu

i substancji adsorbowanej), gdzie n<1 [4, 10].

Przeważnie stosuje się równanie, które określa masę substancji

zaadsorbowanej i ułamkową wartość wykładnika potęgowego:

(8)

gdzie:

x – oznacza masę substancji zaadsorbowanej z roztworu przez

m gramów adsorbentu,

k, c, n – pozostałe oznaczenia jak wyżej [2].

Mateusz Niścior

98

Rys. 4. Izoterma adsorpcji Freundlicha [2].

Wykres izotermy Freundlicha w ogólnym jego przebiegu jest zbieżny

do wykresu izotermy Langumira, różni się tylko od niej jednakże brakiem

prostej proporcjonalności między ilością zaadsorbowanej substancji

a stężeniem w zakresie małych stężeń [2]:

(9)

Równanie Freundlicha jest rzadko stosowane.Zjawisko adsorpcji na

ciele stałym jest szeroko wykorzystywane w praktyce laboratoryjnej m.in.

w przemyśle.Stanowi ono podstawę oczyszczania i rozdzielania związków

w chromatografii. Ma ogromne znaczenie w reakcjach heterogenicznych –

w katalizie kontaktowej [11].

5.5. Równanie adsorpcji Langmuira

Langmuir podał model adsorpcji opisującej maksymalną adsorpcję

w postaci monowarstwy.

Model ten bazuje na następujących założeniach:

na powierzchni adsorbentu jest określona liczba miejsc aktywnych

(proporcjonalna do wielkości powierzchni), którymi mogą być

określone ściany mikrokrystalitów, defekty sieciowe lub

w przypadku adsorbentów złożonych, granice faz;

na każdym z tych miejsc może zaadsorbować sie tylko jedna

cząsteczka adsorbatu, czyli adsorbent pokrywa się warstwą

monomolekularną;

proces adsorpcji zachodzi na miejscach aktywnych;

cząsteczki zaadsorbowane na miejscach adsorpcji nie oddziałują

wzajemnie na siebie;

proces adsorpcji charakteryzuje się dynamiczną równowagą

pomiędzy adsorpcją i procesem odwrotnym do adsorpcji – desorpcją.

wiązanie z adsorbentem może mieć charakter fizyczny lub

chemiczny, lecz dostatecznie silne, aby cząsteczki zaadsorbowane

,


99

nie przemieszczały sie po powierzchni- mamy, więc tu do czynienia

ze zlokalizowana adsorpcja [2, 4].

Przy takich założeniach równowagę adsorpcyjna można przedstawić

następująco:

cząsteczka gazu + wolne miejsce na powierzchni ↔ zlokalizowany

kompleks adsorbentu adsorpcyjny [1]

Równanie na stałą równowagi tego procesu można zapisać w postaci:

(10)

gdzie:

Nt0 - stężenie powierzchniowe wolnych miejsc aktywnych na

powierzchni adsorbentu,

- stopień pokrycia powierzchni adsorbentu wolnymi miejscami

aktywnymi,

Nt – stężenie powierzchniowe zajętych miejsc aktywnych (stężenie

powierzchniowe substancji zaadsorbowanej) [2,4, 12].

Stopień pokrycia powierzchni θ lub tak zwany, ułamek zapełnienia

powierzchni określa wzór:

(11)

gdzie:

n - liczba moli substancji zaadsorbowanej przez daną masę adsorbentu

(liczba zajętych centrów adsorpcyjnych),

nm - liczba moli, przy której następuje zapełnienie wszystkich centrów

adsorpcyjnych [10].

Zgodnie z tą definicją ( )

Szybkość adsorpcji jest proporcjonalna do ciśnienia gazu i do ułamka

powierzchni nieobsadzonej [1, 2]:

(12)

Szybkość desorpcji jest proporcjonalna do ułamka powierzchni pokrytej

[1,2]:

(13)

Szybkość adsorpcji i desorpcji w stanie równowagi są sobie równe [2]:

(14)

Po prostych przekształceniach otrzymujemy związek między stopniem

pokrycia powierzchni, a ciśnieniem w postaci:

(15)

gdzie: - nazywany współczynnikiem adsorpcji [4, 13].

Uwzględniając definicję stopnia pokrycia :

Mateusz Niścior

100

(16)

lub oznaczając przez: a – liczbę moli substancji zaadsorbowanej przez

jednostkową masę adsorbentu i odpowiednio ,

otrzymujemy:

(17)

Powyższa zależność nosi nazwę izotermy Langmuira[1, 13].

Przebieg tej zależności a=f(p) przedstawia rys. 5:

Rys. 5. Adsorpcja wg teorii Langmuira, powierzchnia pokryta warstwą adsorbatu: a)

schemat b) izoterma adsorpcji [9].

Można spostrzec, że adsorpcja związków powierzchniowo czynnych

przebiega zgodnie z izotermą Langmuira [9].

Dla małych ciśnień p wyraz bp jest dużo mniejszy od jedności i można

go (w mianowniku) pominąć, wówczas a=bp. Odpowiada to odcinkowi

OR na wykresie, czyli takiego etapowi adsorpcji, w którym cała

powierzchnia adsorbentu jest zajęta cząsteczkami adsorbowanymi.W miarę

wzrostu ciśnienia p ilość adsorbowanej substancji na powierzchni wzrasta

coraz wolniej i w końcu przestaje wzrastać. Równowaga adsorpcyjna

normuje się i dalszy wzrost ciśnienia nie zmienia ilości zaadsorbowanej

substancji – odcinek Rμ [2].

Przy dużych wartościach ciśnienia p wyraz . W mianowniku

możemy pominąć 1, wówczas otrzymujemy [1,14]:

(18)

Krzywa adsorpcji w stosunku do osi p jest w tym przypadku

równoległa.

,


101

Stałe ami b w równaniu Langmuira można wyznaczyć w prosty sposób

z danych doświadczalnych, wystarczy przekształcić równanie do postaci

[4,14]:

(19)

Kreśląc zależność , otrzymujemy linię prostą o nachyleniu

, przecinającą oś rzędnych w punkcie. Znając am, można obliczyć liczbę

centrów aktywnych na powierzchni 1g adsorbentu [14].

5.6. Równanie adsorpcji BET

Izoterma Langmuira służy do opisu wielu przypadków adsorpcji

fizycznej. W tego typu adsorpcji następuje,jednak często tworzenie wielu

warstw molekularnych. Spowodowane jest to tym, że, ten sam rodzaj sił,

odpowiedzialnych za adsorpcję fizyczna pierwszej warstwy adsorbatu,

oddziałuje również pomiędzy nią a dalszymi cząsteczkami, zbliżającymi się

do powierzchni adsorbentu [13].

Ilość substancji zaadsorbowanej przez jednostkową masę adsorbentu

opisuje równanie, które wyprowadzili S. Brunauer, H. Emmett, J. Teller

(1938r), jako funkcję ciśnienia gazu. Równanie to znane jest pod nazwą

BET [1].

Równanie BET ma postać:

(20)

gdzie:

a, am, p – mają znaczenie identyczne jak w równaniu Langumira,

p0 –

jest prężnością pary nasyconej adsorbatu,

C – jest pewną funkcją temperatury, określoną przez różnicę między

ciepłem adsorpcji w pierwszej monomolekularnej warstwie i ciepłem

skraplania. [14].

Równanie (20) jest izotermąwielomolekularnej adsorpcji pary Brunauera,

Emmetta i Tallera. Równanie BET wypełniło lukę w interpretacji izoterm

adsorpcji. Przyjęte ono zostało, jako ogólna metoda wyznaczania

powierzchni właściwej adsorbentów na podstawie danychdotyczących

adsorpcji. Równanie to można, bowiem przedstawić w postaci liniowej:

(21)

Mateusz Niścior

102

i wówczas przedstawiając izotermę adsorpcji w układzie współrzędnych

vs. można nm i c wyznaczyć z nachylenia prostej i punku

przecięcia jej z osia rzędnych. Mianowicie zaś odcinek

. Znając wartość nm można przy pomocy powyższego równania

obliczyć powierzchnie właściwą danego adsorbentu. Podstawowy pomiar

powierzchni właściwej adsorbentów metodą BET sprowadzi sie przy

pomocy niskotemperaturowej (-195ºC) izotermy adsorpcji azotu

przyjmując [2,14].

Szczególnie typowe odchylenie dopasowania krzywej teoretycznej do

danych doświadczalnych polega na tym, że równanie BET zakłada zbyt

małą adsorpcjępod niskimi ciśnieniami i zbyt dużąpod wysokimi [13, 14].

Typowy wykres izotermy BET przedstawiony jest na rys. 6:

Rys. 6. Izotermy adsorpcji typu BET [14].

Na wykresie zaznaczono punkt przegięcia krzywej. Położenie tego

punktu szacunkowo określa wartość am na podstawie, której obliczono

powierzchnię właściwą adsorbentu.

W przypadku, gdy i ciśnienie gazu zaadsorbowanego jest

znacznie mniejsze od prężności pary nasyconej, równanie BET przechodzi

w równanie Langmuira [7].

6. Równanie Kelvina

6.1. Kondensacja kapilarna

W przypadku porowatych adsorbent6w na powierzchni kapilar,

zwyjątkiem miejsc ich silnego zwężenia, adsorpcja w obszarze małych

wartości p/p0, zachodzi podobnie jak adsorpcja na adsorbentach

nieporowatych. Na ścianach szerokich kapilar w obszarze podwyższonego

,


103

ciśnienia paryadsorpcja jest wielowarstwowa. Ciepło adsorpcji przy

tworzeniu siętakich warstw jest bliskie ciepłu kondensacji. Z tego powodu

własności adsorbatu w tym przypadku są podobne do własności cieczy.[9].

Kondensacją tego typu nazywamy zjawisko wcześniejszej kondensacji

adsorbatu w porach, za nim zostanie osiągnięte ciśnienie pary nasyconej po

nad płaską powierzchnią [9].

Zjawisko kondensacji kapilarnej wynika stąd, że adsorpcyjne warstwy

adsorbatu, zgromadzone na ścianach kapilar porowatego adsorbentu mają

wklęsłą powierzchnię i ciśnienie pary nasyconej nad nimi jest niższe niż

nad równą powierzchnią. Z tej przyczyny kondensacja pary na tych

zakrzywionych warstwach zachodzi przy mniejszych ciśnieniach niż

wynosi ciśnienie pary nasycone adsorbowanej substancji [9].

Przypadki kondensacji kapilarnej i kapilarnego odparowania, biegnące

w porach adsorbentów wykorzystuje się do ilościowego opisu rozkładu

objętości i powierzchniporów według ich wielkości [2, 9]

W sytuacji cieczy znajdującej się w cylindrycznej kapilarze istnieje

pewna zależność pomiędzy promieniami kapilary rk, a krzywizny menisku

cieczy rl (rys.7):

Rys. 7. Zależność pomiędzy promieniami kapilary rk, a krzywizny menisku cieczy rl [4].

𝑟𝑘 = 𝑟𝑙𝑐𝑜𝑠𝜑 (22)

gdzie: jest kątem zwilżania ścianek porów ciekłym adsorbatem [4].

Zależność między prężnością pary nasyconej p nad powierzchnią

zakrzywioną o promieniu krzywizny rl i prężnością pary nasyconej p0 nad

płask powierzchnią cieczy opisuje równanie Kelvina:

𝑙𝑛𝑝

𝑝0= −

2𝜎∗𝑉𝑚𝑜𝑙

𝑟𝑙∗𝑅𝑇 (23)

gdzie:

p – prężnością pary nasyconej nad zakrzywionym meniskiem cieczy

po – prężnością pary nasyconej nad płaską powierzchnią cieczy

Vmol – objętość molowa ciekłego adsorbatu

Mateusz Niścior

104

rl – promień krzywizny menisku cieczy

R – stała gazowa

T – temperatura bezwzględna [8]

Po podstawieniu równania (22) do wyrażenia (23) otrzymamy równanie

opisujące zależność prężności pary nasyconej od promienia kapilary [2]:

(24)

W sytuacji, gdy ciecz silniej zwilża ściany kapilar kąt = 0 i wówczas

cos= 1. W takim przypadku promień kapilary jest praktycznie równy

promieniowi krzywizny menisku cieczy [4].

Danemu ciśnieniu względnemu p/po odpowiada, więc ściśle określona

wartość szerokości kelvinowskich dk [9].

Ponieważ najpierw następuje proces adsorpcji, a dopiero potem proces

kondensacji kapilarnej, wobec tego skroplona para adsorbatu nie zwilża

bezpośrednio ścianek kapilar, ale znajdujące się już na nich warstwy

zaadsorbowane. Z uwagi na obecnośćwielowarstwowego filmu pomierzch-

niowego w obszarze występowania kondensacji kapilarnej, szerokości

kelvinowskie dknie sąszerokościami porów, tylko wolnych przestrzeni,

zawartych między warstewkami adsorpcyjnymi, pozostając na ściankach

porów opróżnionych z ciekłego adsorbatu podczas desorpcji, przy

określonym ciśnieniu względnym p/po. Szerokości tych porów dpsą, więc

większe od ich szerokości kelvinowskich dko grubośćwarstwy adsorpcyjnej

l [1, 4]:

(25)

Grubość warstwy adsorpcyjnej l, będąca funkcją ciśnienia względnego

p/po, może być określona z izotermy adsorpcji par danego adsorbatu na

adsorbencie nieporowatym, o podobnymcharakterze chemicznym, co

badany adsorbent i o znanej wielkości powierzchni właściwej - adsorbent

standardowy. Dla węglowych substancji takim adsorbentem standardowym

jestgrafityzowana nieporowata sadza [2, 4, 9].

Na każdym n-tym etapie desorpcji zachodzi wyparowanie ciekłego

adsorbatu z porów, których efektywne szerokości mieszcząsię w przedziale

wielkości odpowiadających temu etapowi. Równolegle z procesem

wyparowywania skondensowanego adsorbatu z porów o szerokościach

odpowiadających temu etapowi, maleje również grubość warstwy

adsorpcyjnej w porach już opróżnionych na wszystkich dotychczasowych

etapach z n-tym włącznie [2].

Objętość adsorbatu V, która desorbowała na n-tym etapie przy

określonym ciśnieniu względnemu p/po, określamy na podstawie

otrzymanej doświadczalnie izotermy sorpcji danego adsorbatu na badanym

adsorbencie uwzględniając poprawkę na zmianę grubości warstwy

adsorpcyjnej w porach jużopróżnionych (wyznaczoną z izotermy adsorpcji

,


105

par danego adsorbatu na adsorbencie standardowym). Pamiętając, że

określonemu ciśnieniu względnemu p/po odpowiada ściśle określona

wartość szerokości kelvinowskich dk, którą możemy obliczyćz równania

Kelvina przy założeniu odpowiedniego kształtu porów oraz znając grubość

warstwy adsorpcyjnej przy danym p/powyznaczamy rozkład objętości

i powierzchni mezoporów względem ich średnicy [1, 2].

Teoria objętościowego wypełniania mikroporów

Podstawowe rozróżnienie zjawisk adsorpcyjnych przebiegających

w mikroporach i na powierzchni porów przejściowych (mezoporów) lub

adsorbentów nieporowatych wymaga różnych ujęć teoretycznych przy ich

opisie i interpretacji. Wszystkie rozpatrywane powyżej teorie adsorpcji

fizycznej, niezależnie od ich pozornychróżnic, wychodzą z tego samego

wzorca fizycznego. Wzorzec ten sprowadza się do pojęcia geometrycznej

powierzchni rozdziału faz, na której występuje adsorpcja z wytworzeniem

jednej lub kilku kolejnych warstw adsorpcyjnych [5, 15]

Wyobrażenie o mikroporach, jako o obszarach przestrzeni w ciele

stałym, współmiernych rozmiarami z cząsteczkami adsorbowanymi,

pozwala wnioskować, że przy dowolnym charakterze oddziaływań

adsorpcyjnych (pod wpływem sił dyspersyjnych, elektrostatycznych i in.),

warunkujących adsorpcję fizyczną w całym obszarze mikroporów,

występuje pole adsorpcyjne wytwarzane przez ciało stałe. Ograniczona

przestrzeń adsorpcyjna mikroporów uwarunkowuje fakt, że następne

adsorbujące się w mikroporach cząsteczki nie tworzą warstw

adsorpcyjnych. W mikroporach adsorpcja charakteryzuje się objętościowym

wypełnieniem przestrzeni adsorpcyjnej, z tej racji podstawowym

parametrem geometrycznym charakteryzującym adsorbent mikroporowaty

jest objętość mikroporów, a nie ich „powierzchnia” [5].

Teorię dobrze opisującą przebieg izoterm adsorpcji uzyskanych

w układach:mikroporowate sorbenty węglowe – pary dobrze adsorbujących

się na nich substancji jest, opracowana przez Dubinina i współpracowników,

teoria objętościowego wypełniania mikroporów – umożliwia ona ilościową

charakterystykę zjawisk zachodzących w najdrobniejszych porach [3, 9].

6.2. Równanie Dubinina-Raduszkiewicza

Podstawowe równanie teorii objętościowego wypełniania mikroporów,

znane, jako równanie Dubinina-Raduszkiewicza, ma ogólną postać:

(26)

gdzie:

V – ob.jętość przestrzeni adsorpcyjnej zajęta przez adsorbat

w temperaturze pomiaru T i przy ciśnieniu względnym [p/po, cm3/g]

Vo – graniczna objętość przestrzeni adsorpcyjnej [cm3/g]

Mateusz Niścior

106

A – różniczkowa molowa praca adsorpcji [kJ/mol]

- współczynnik określający adsorbat;

Eo – charakterystyczna energia adsorpcji dla adsorbatu standardowego

[kJ/mol] [5,9].

Różniczkowa molowa praca adsorpcji A opisywana, jako zmiana

swobodnej energii adsorpcji Gibbsa (potencjał termodynamiczny):

𝐴 = −∆𝐺 = 𝑅𝑇𝑙𝑛𝑝

𝑝0 (27)

gdzie:

po – ciś. pary nasyconej adsorbowanej substancji w temperaturze T [mm

Hg]

p – ciśnienie tej pary w warunkach równowagi adsorpcyjnej, [mmHg]

R – stała gazowa, kJ/(mol K)

T – temperatura, [K][9].

Iloczyn Eo jest równy E, gdzie E jest charakterystyczną energią adsorpcji

dla adsorbatu właśnie stosowanego (parametr charakteryzujący adsorbent).

Współczynnik , charakteryzujący adsorbat, można w przybliżeniu obliczyć,

jako:

𝛽 =𝑃

𝑃0=

𝛼

𝛼0=

𝑉𝑚𝑜𝑙

𝑉𝑚𝑜𝑙 0

(28)

gdzie: P, , Vmol oznaczają kolejno parachorę, polaryzowalność

i objętość molową adsorbatu użytego w procesie adsorpcji, natomiast P0

,a0,Vmol 0– oznaczają te same wielkości odnoszące się do adsorbatu

przyjętego, jako standard (najczęściej benzen) [7, 13].

Podstawiając do równania (26) zależność (27) na różniczkową molową

pracę adsorpcji A otrzymujemy [12,14]:

𝑉 = 𝑉0 ∗ 𝑒−

𝑅𝑇𝑙𝑛𝑝0𝑝

𝛽𝐸0

(29)

6.3. Metoda wyznaczania objętości mikroporów z danych

izoterm adsorpcji

Zlogarytmowanie wzoru (29) daje nam równanie Dubinina–

Rduszkiewicza w postaci liniowej:

(30)

Przedstawiając izotermę adsorpcji w układzie współrzędnych lnV od

otrzymamy prostą, a z niej wartości Vo oraz E, które zgodnie

z teorią Dubinina objętościowego wypełniania mikroporów, oznaczają

kolejno: objętość mikroporów oraz charakterystyczną energię adsorpcji

(rys. 8) [4, 9].

,


107

Rys. 8. Wyznaczanie parametrów równania Dubinina-Raduszkiewicza [9].

7. Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu przedstawiono charakterystykę procesu

adsorpcji, podstawową klasyfikację adsorbentów wraz z metodami ich

syntezy oraz opisano podstawowe modele i równania izoterm adsorpcji.

Proces adsorpcji to niezwykłe zjawisko, a jego odkrycie pozwoliło na

dalszy rozwój nauki i techniki. Na całym świecie istnieją ośrodki naukowe

zajmujące sie badaniem tego procesu oraz możliwym wykorzystaniem go

w życiu codziennym. Naukowcy prześcigają się w produkcji, co raz to

nowszych adsorbentów o jeszcze lepszych właściwościach.

To właśnie za sprawą swoich wyjątkowych właściwości takim jak

m.in. duża objętość porów, duża powierzchnia właściwa, uniwersalność

syntezy, stabilność chemiczna, łatwość modyfikacji – adsorbenty znalazły

szereg istotnych zastosowań w życiu codziennym, które postaram się

przedstawić w następnym artykule.

Podziękowania

Chciałbym szczególnie podziękować Panu Profesorowi Jackowi

Goworkowi za wsparcie merytoryczne w opracowaniu niniejszego

artykułu.

Mateusz Niścior

108

Literatura

1. Natkański P.,2010: Procesy sorpcyjne. Zakład Technologii Chemicznej,

Uniwersytet Jagielloński, Kraków

2. Ościk J., 1983: Adsorpcja, PWN,Warszawa

3. Dubinin M. M., Quart.,1959: Rev., 9, 101; 1960: Chem. Rev., 60, 235

4. Sarbak Z., 2000: Adsorpcja i adsorbenty – Teoria i zastosowanie,

Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań

5. Barczak M., Dąbrowski A., 2008:Wiad. Chem.,62

6. Jaroszewska-Manaj J, Metody identyfikacji związków

organicznych.chem.uw.edu.pl [Dostęp 23.07.14]. Dostępny w Internecie:

7. Atkins P.W., 2001: Chemia Fizyczna, PWN, Warszawa

8. Praca zbiorowa (red. Janusz Ryczkowski ) 2012: Adsorbenty i katalizatory.

Wybrane Technologie a Środowisko. Uniwersytet Rzeszowski, Rzeszów

9. Procesy katalityczne i adsorpcyjne w ochronie środowiska.

nw.pwr.wroc.pl [Dostęp 27.07.14]. Dostępny w Internecie:

http://www.nw.pwr.wroc.pl/~trawczynski/wyklady/Procesy_katalityczne_i_ad

sorpcyjne_CWICZENIA_lab_INSTRUKCJE/(_346wiczenie_4).pdf

10. Redlich O,. Paterson D.L.O., 1959: J. Phys. Chem.,63, 1024

11. PigońK, Z. Ruziewicz, 2005: Chemia Fizyczna, PWN, Warszawa

12. DutkiewiczE.T.,1998: Fizykochemia powierzchni, WNT, Warszawa

13. AGH im. Stanisława Staszica w Krakowie, Adsorpcja,

home.agh.edu.pl[Dostęp 05.07.14]. Dostępny w Internecie:

home.agh.edu.pl/~stypula/wyk8.doc

14. Snyder R.L., 1964: J. Chromatogr.,16, 55

15. Kokotailo G.T., Lawton S.L., Olson D.H., Meier W.M., 1978:Nature.272, 437

http://www.nw.pwr.wroc.pl/~trawczynski/wyklady/Procesy_katalityczne_i_adsorpcyjne_CWICZENIA_lab_INSTRUKCJE/(_346wiczenie_4).pdf


http://home.agh.edu.pl/

http://home.agh.edu.pl/~stypula/wyk8.doc

,


109


Streszczenie W niniejszym opracowaniu zarysowano charakterystykę procesu adsorpcji – jednego

z podstawowych zjawisk powierzchniowych, występujący na granicy zetknięcia się dwóch

faz. Proces ten polega na zmianie stężenia substancji na powierzchni właściwej. Zmiana

stężenia na granicy faz może być procesem fizycznym przebiegającym dzięki ogólnie siłom van der Waalsa lub też może być spowodowana procesem chemicznym z tworzeniem

związków chemicznych.

Przedstawiono również charakterystykę struktury porowatych ciał stałych określanych

wspólnym mianem adsorbentów, na powierzchni, których zachodzi zjawisko adsorpcji. Opisano także ich podstawową klasyfikację wraz z metodami syntezy.

Opisano również podstawowe modele i równania izoterm adsorpcji. Spośród wielu modeli

teoretycznych opisujących równowagę adsorpcji wymieniono najbardziej znane takie jak:

równanie Gibbsa, Henry’ego, BET, Freundlicha czy Langmuira. Wyjaśniono zjawisko

kondensacji kapilarnej oraz teorię objętościowego wypełniania mikroporów.

Proces adsorpcji to niezwykłe zjawisko, a jego odkrycie pozwoliło na dalszy rozwój nauki

i techniki. Na całym świecie istnieją ośrodki naukowe zajmujące się badaniem tego procesu

oraz możliwym wykorzystaniem go w życiu codziennym. Naukowcy prześcigają się w produkcji co raz to nowszych adsorbentów o jeszcze lepszych właściwościach.

To właśnie za sprawą wyjątkowych właściwości takich jak m.in. duża objętość porów, duża

powierzchnia właściwą, uniwersalność syntezy, stabilność chemiczna, łatwość modyfikacji,

znalazły szereg istotnych zastosowań w życiu codziennym, które postaram się przedstawić w następnym artykule.

Słowa kluczowe: adsorpcja, adsorbenty, powierzchnia właściwa, równania adsorpcji,

metody otrzymywania.

The phenomenon of adsorption on the solids

Abstract In this paper outlines the characteristics of the adsorption process - one of the fundamental surface

phenomena, occurring at the interface of the two phases. This process involves changing the

concentration of the specific surface area. The change in concentration at the interface of a

physical process can be generally extending through van der Waals forces, or may be due to a chemical process with the formation of chemical compounds.

It also presents the structural characteristics of porous solids referred to collectively as adsorbents,

which occurs on the surface adsorption phenomenon. Also described is the primary classification,

together with synthetic methods. Also describes the basic models and equations of adsorption isotherms. Among the many

theoretical models describing adsorption equilibrium lists the best-known such as Gibbs, Henry,

BET, Freundlich and Langmuir. Clarified the phenomenon of capillary condensation and the

theory of volume filling of micropores. The adsorption process is an extraordinary phenomenon, and its discovery led to further

development of science and technology. All over the world there are research centers involved in

the study of this process and the possible use of it in everyday life. Scientists are trying to make

the production what it once newer adsorbents with even better properties. This is due to unique properties such as, but large pore volume, high surface area proper, versatile

synthesis, chemical stability, ease of modification, were a number of important applications in

everyday life, which will try to explain in the next article.

Keywords: adsorption, adsorbents, surface area, adsorption equation, the method of preparation.

110

Mateusz Niścior1

Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie

1. Wstęp

Na dzień dzisiejszy znamy bardzo wiele adsorbentów o różnym

charakterze chemicznym i różnej strukturze geometrycznej powierzchni.

W niniejszej pracy chciałbym przedstawić jedynie niektóre podstawowe

zagadnienia dotyczące struktury, metod otrzymywania i zastosowania

adsorbentów, a właściwie opiszę najważniejsze z nich i najczęściej

stosowane.

2. Materiały porowate

Materiały porowate według IUPAC (International Union of Pure and

Applied Chemistry) to ciała stałe posiadające pory, jamy, kanały lub

szczeliny, których głębokość jest większa niż szerokość [1]. Należące do

tej grupy zeolity, węgle aktywne, żele krzemionkowe czy stosunkowo

niedawno odkryte uporządkowane materiały mezoporowate skupiają na

sobie uwagę ze względu na potencjalne wykorzystanie ich np. w adsorpcji,

katalizie i nanotechnologii. Ze względu na właściwości sorpcyjne materiały

te wykorzystywane są do rozdzielania mieszanin ciekłych i gazowych,

usuwania zanieczyszczeń z gleby i wody oraz wielu innych procesach.

3. Charakterystyka podstawowych grup adsorbentów

3.1. Żele krzemionkowe

Żele krzemionkowe stanowią jedną z podstawowych grup adsorbentów

stosowanych komercyjnie. Jest to ciało stałe o ogólnym wzorze xSiO2

x yH2O występujące w licznych formach bezpostaciowych. Cząstki żelu

krzemionkowego zbudowane są z tetraedrów SiO4 ułożonych w postaci

przestrzennej nieuporządkowanej sieci [2].

1 [email protected], UMCS, Wydział Biologii I Biotechnologii, Instytut Biologii i Biochemii,

http://www.binoz-programy.umcs.lublin.pl


,


111

Rys. 1 Układ tetraedrów SiO4 w krystalicznym (a) i amorficznym szklistym

(b) żelu krzemionkowym [2]

Porowate żele krzemionkowe otrzymuje się według poniższych metod:

polikondensacji kwasu ortokrzemowego – jest to podstawowa

i najczęstsza metoda syntezy żelu krzemionkowego, w wyniku której

początkowo powstają łańcuchy krzemowo-tlenowe, a następnie

poprzez wzrost łańcucha oraz liczne rozgałęzienia tworzy się hydrożel,

stosunek SiO2 do H2O nie jest stały i zależy przede wszystkim od

warunków syntezy żelu;

agregacja cząstek koloidalnej krzemionki - reakcja kwasu siarkowego

z krzemianem sodu, następnie poddanie otrzymanej mieszaniny

koagulacji dzięki siłom Van der Waalsa oraz usunięciu powstałego

siarczanu sodu; proces ten można regulować dodając do układu

koagulantu. [3, 4].

Odpowiednio dobierając parametry syntezy jak m.in. stężenie

krzemionki, temperatury czy pH możemy regulować właściwości

końcowego materiału (np. objętość porów, powierzchnię właściwą).

Żele krzemionkowe w zależności od rozmiarów porów dzielą się na trzy

grupy:

wąsko-porowate żele krzemionkowe – posiadają powierzchnia

właściwą rzędu 600 m2/g, objętość porów ok. 0,7 cm

3/g, średnica

porów poniżej 2 nm;

średnio-porowate żele krzemionkowe – ich powierzchnia właściwa

wynosi od 550 do 650 m2/g, objętość porów ok. 1 cm

3/g, średnica porów

2-50 nm;

szeroko-porowate żele krzemionkowe – powierzchnia wewnętrzna od

250 do 270 m2/g, objętość porów ok. 0,7 cm

3/g, średnica porów powyżej

50 nm. [5].

Ze względu na silne powinowactwo z wodą, a także dużą pojemność

adsorpcyjną żele krzemionkowe znalazły zastosowanie przede wszystkim

do osuszania gazów przemysłowych, powietrza, freonów, różnych

produktów (pochłaniacze pary wodnej, oparów w kuchniach domowych,

Mateusz Niścior

112

gazów w ekstraktorach). W przemyśle petrochemicznym stosuje się je do

oddzielania węglowodorów alifatycznych od aromatycznych w lżejszych

frakcjach ropy naftowej, chromatograficznego rozdziału substancji

organicznych, pochłaniania tlenków siarki i azotu [4].

3.2. Uporządkowane mezoporowate materiały krzemionkowe (OMS)

Mezoporowate adsorbenty krzemionkowe stanowią szeroką grupę

nieorganicznych uporządkowanych materiałów porowatych. Otrzymanie

jednorodnej i uporządkowanej porowatej struktury o charakterze

mezoporów jest o wiele trudniejsze niż w przypadku innych adsorbentów.

Dzięki takim właściwościom jak wysoki stopień uporządkowania oraz

możliwość modyfikacji powierzchni materiały te są idealne w roli

adsorbentów. Ponadto materiały te wykazują wysoką odporność

hydrotermalną oraz uniwersalność syntezy, co spowodowało duże

zainteresowanie tymi materiałami [6]

W latach 90-tych XX wieku, firma Mobil wytworzyła materiały zwane

M41S. Ogromną zaletą syntezy tych związków była możliwość regulacji

wielkości porów, gęstości rozmieszczenia centrów aktywnych na

powierzchni oraz składu chemicznego. Tradycyjne zeolity nie miały takiej

zalety. Szczególne znaczenie dla przemysłu paliwowego było otrzymanie

adsorbentów dla związków wielkocząsteczkowych [6]

Materiały krzemionkowe MCM-41 (MCM – Mobil Composition

of Matter) stanowią grupę związków z rodziny M41S – są to pierwsze

zsyntetyzowane materiały mezoporowate o uporządkowanej strukturze.

Charakteryzują się heksagonalnym ułożeniem cylindrycznych porów

o wąskiej średnicy oraz dużą powierzchnią wewnętrzną. Cechą różniącą je

od typowych zeolitów jest wielkość porów, dzięki której są cenne, jako

adsorbenty dla cząstek o dużych rozmiarach. Ściany materiałów MCM-41

są amorficzne, pomimo to mają one budowę krystaliczną ze względu na ich

uporządkowaną i powtarzającą się strukturę [6]

Mezoporowate materiały krzemionkowe MCM-48 posiadają regularną

trójwymiarową strukturę. Syntetyzowane są przy wysokim stosunku

krzem/surfaktant (0,65-1,5) i w obecności innych związków organicznych

np. etanolu, metanolu. Źródłem krzemu jest tetraetoksysilan (TEOS) [6]

Materiały M41S z powodu dużych rozmiarów porów przykuły uwagę

wielu badaczy. Mimo to rozmiary te nadal miały pewne ograniczenia ze

względu na cienkie ściany, które były termicznie niestabilne. Dlatego też,

w 1998 roku, otrzymano nowe związki nazywane SBA. Najlepiej

zbadanym adsorbentem z tej grupy jest SBA-15 o heksagonalnej symetrii,

hydrotermiczny, różniący się od MCM-41 budową: grubością ścian,

średnicą porów, stabilnością [4, 6]

,


113

Powierzchnia właściwa SBA-15 wyznaczona doświadczalnie jest

pięciokrotnie większa niż obliczona teoretycznie. Wynika z tego, że

w budowie SBA-15 oprócz heksagonalnych mezoporów, znajdują się

w całej objętości materiału również pory o mniejszych rozmiarach,

stanowiące ponad ¾ jego powierzchni właściwej, Te mikropory są

zlokalizowane w dużej części w ścianach SBA-15 [6]

Grubsze ściany krzemionkowe to cecha odróżniająca SBA-15 od materiału

MCM-41, posiadającego znacznie cieńsze ściany. Rozmiar porów oraz

grubość ścian mogą być dopasowywane po przez zmiany temperatury

ogrzewania (35-140ºC) oraz czasu prowadzenia syntezy (11-72h) [7].

3.3. Aluminożele – tlenek glinowy

Tlenek glinowy (aktywowany tlenek glinu) – jest przedstawicielem

adsorbentów, których główny składnik stanowią różne typy tlenku glinu

(powyżej 90%) oraz zwierają również niewielkie ilości innych tlenków

(np. Na, Si, Fe,Ti). Otrzymywane są na drodze dehydratacji wodorotlenku

glinu [2].

Ze względu na zakres temperatur, w których otrzymuje się tlenek glinu,

aluminożele dzielą się na dwie główne grupy:

tlenki niskotemperaturowe, oznaczane jako γ-Al2O3, uzyskiwane są

w temperaturach do 600oC. Są to uwodnione tlenki zawierające

w cząsteczce 0-6 cząsteczek wody;

tlenki wysokotemperaturowe (δ- Al2O3) to bezwodny Al2O3,

otrzymywany w temperaturach z zakresu 900-1000oC [2].

Poza tą klasyfikacją występuje także α- Al2O3, otrzymywany powyżej

1200oC.

Aluminożele znalazły zastosowanie głównie do osuszania powietrza

z lotnych związków fluoru [8].

Najczęściej stosowaną, jako adsorbent strukturą tlenku glinu jest

γ-Al2O3 o powierzchni właściwej 100-200 m2/g. Według badań Lippensa

i Periego adsorbent ten ma budową podaną na rys. 2. Według tego modelu

powierzchnię tworzą jony tlenu O2-

oraz jony glinu Al3+

, przy czym tylko

¾ pozycji odpowiadających jonom glinu jest wypełnione, pozostałe zaś

tworzą tzw. defekty powierzchni [2].

Mateusz Niścior

114

Rys. 2 Model budowy powierzchni γ-Al2O3; 1- defekty powierzchniowe,

2- jony Al3+, 3- jony O2-[2]

3.4. Węgle aktywne

Węgle aktywne są najstarszymi adsorbentami szeroko stosowanymi

także obecnie. Otrzymywane są na drodze karbonizacji materiału

węglowego bez dostępu powietrza. W wyniku przeprowadzonej

karbonizacji otrzymuje się węgle aktywne o bardzo małej powierzchni

właściwej rzędu kilku m2/g. Aby zwiększyć porowatość takiego materiału,

poddaje się go aktywacji najczęściej dwutlenkiem węgla lub parą wodną

w temperaturach 700-1100oC [9].

Węgle aktywne należą do grupy ciał grafitowych. Kryształy węgli

aktywnych zbudowane są z nieregularnych ułożonych sześcioczłonowych

pierścieni węglowych. Rozmiary tych krystalitów osiągają wymiary

2,3x0,9 nm. Szkielet węgli aktywnych zbudowany jest z krystalitów

nieregularnie ze sobą powiązanych. W zależności od stopnia wzajemnego

ułożenia krystalitów tylko część wewnętrznej powierzchni węgli

aktywnych, osiągającej 2000 m2/g, dostępna jest dla adsorbujących się

cząsteczek. Z tego powodu powierzchnia właściwa węgli aktywnych,

określana przede wszystkim przez mikropory, zawiera się w przedziale od

400 do 900 m2/g [10, 11].

Powierzchnia węgli aktywnych jest bardzo niejednorodna

geometrycznie i chemicznie. Do sieci węglowych na krawędziach

pierścieni sześcioczłonowych przyłączone są różne grupy, wodór, związki

tlenowe itp. Zależy to od metody otrzymywania i obróbki węgla [11, 12].

Dubinin wyróżnił dwa krańcowe typy strukturalne ze względu na

złożoną strukturę porowatą węgli aktywnych:

,


115

I typ strukturalny – węgle zawierające przede wszystkim mikropory

o rozmiarach promieni 1-3 nm. (10-30Å).

II typ strukturalny – węgle zawierające zarówno mikropory, jak i pory

o promieniu większym niż 3 nm. [2].

Surowcami wyjściowymi do produkcji mogą być zarówno substancje

naturalne jak: węgle kopalne, materiały pochodzenia drzewnego, pestki

owoców; a także tworzywa syntetyczne: żywice syntetyczne (np. fenolowo-

formaldehydowe), włókna wiskozowe czy polimery i kopolimery chlorku

winylu czy akrylonitrylu. Dodatkowe informacje dotyczące tej grupy

adsorbentów zostały zawarte w rozdziale [9].

3.5. Zeolity

Bardzo ważną grupą adsorbentów porowatych są zeolity, zaliczane do

klasy tzw. sit molekularnych. Grupę tę stanowią krystaliczne

glinokrzemiany metali alkalicznych, metali dwuwartościowych lub ziem

alkalicznych składające się z przestrzennie ułożonych tetraedrów

(czworościanów) SiO4 i AlO4-. Czworościany glinowo tlenowe różnią się

od krzemowo tlenowych ładunkiem elektrycznym [13].

Tetraedry - podstawowe jednostki strukturalne zeolitów, łącząc się ze

sobą wspólnymi atomami tlenu, tworzą trójwymiarową strukturę, przy

czym:

8 tetraedrów tworzy sześcian;

12 tetraedrów tworzy piramidę heksagonalną;

24 tetraedry tworzą kubooktaedr [2‚4].

Część z atomów krzemu jest zwykle podstawiona atomami glinu

(o mniejszej wartościowości), w wyniku czego w strukturze generowany

jest ładunek ujemny. W wolnych przestrzeniach struktury zeolitu, prócz

cząsteczek wody, znajdują się kationy metali grup I i II, które kompensują

ten ładunek. Najczęściej spotykanymi kationami są: Na+, K

+, Ca

2+,

Mg2+

,Sr2+

i Ba2+

. Kationy te mają pewną swobodę poruszania się [2].

Skład chemiczny zeolitów przedstawia uproszczony wzór sumaryczny:

𝑀2 𝑛 𝑂 ∗ 𝐴𝑙2𝑂3 ∗ 𝑥𝑆𝑖𝑂2 ∗ 𝑦𝐻2𝑂

gdzie:

n – oznacza wartościowość kationu,

x i y – są liczbami charakterystycznymi dla danego zeolitu, [2,14].

Regularna struktura szkieletu sit molekularnych skutkuje

jednorodnością średnicy porów (od 0,3 do 1,1 nm.). Wolne przestrzenie

wewnątrz zeolitów tworzą systemy kanałów, wpływające na właściwości

Mateusz Niścior

116

sorpcyjne tej grupy materiałów. Wyróżnia się trzy typy kanałów, system

nieprzenikających kanałów o jednakowych rozmiarach; dwuwymiarowe

systemy kanałów oraz trójwymiarowy układ przecinających się kanałów [14].

Kubooktaedry zeolitów maja na swej powierzchni sześć pierścieni

czteroczłonowych o symetrii oktaedrycznej i osiem pierścieni sześciu-

członowych tworzących dwie grypy o symetrii tetraedrycznej [2].

Rys. 3 a) Model kubooktaedru; b) połączenie tetraedrów w kubooktaedr (kółka biało

oznaczają atomy tlenu, a kółka czarne atomy krzemu bądź glinu [2]

Najbardziej rozpowszechnionymi w praktycznym zastosowaniu

zeolitami są zeolity typu :

typu A (rys 4.a) charakteryzują się niską zawartością krzemu, przy

czym stosunek molowy SiO2 do Al2O3 jest bliski 2. Struktura komórki

elementarnej tego typu zeolitów składa się z 12 tetraedrów SiO4 oraz

12 tetraedrów AlO4 oraz odpowiedniej liczby kationów metali.

W szkielecie struktury zeolitu A każdy kubooktaedr połączony jest

z sześcioma sąsiednimi kubooktaedrami za pośrednictwem

czteroczłonowych pierścieni. Osiem połączonych w taki sposób

kubooktaedrów glinokrzemianowych zamyka pomiędzy sobą

sferyczną przestrzeń, do której w czasie procesu adsorpcji mogę

dostać się cząsteczki adsorbatu poprzez sieć prowadzących do niej

ośmioczłonowych okien [15, 16];

typu X i Y w przeciwieństwie do zeolitów typu A wykazują

zwiększoną odporność względem kwasów oraz odporność na

podwyższoną temperaturę. Zeolity te zbudowane są ze 192 tetraedrów,

przy czym podstawową jednostką strukturalną są kubooktaedry,

zbudowane z 24 tetraetrów SiO4 i AlO4. Moduł krzemowy waha się od

2,2 do 3 dla zeolitów typu X oraz od 3,1 do 6 dla typu Y [2, 14].

,


117

a) b)

Rys. 4. Zeolity typu: a) A, b) X [2]

Na rozmiar okien prowadzących do wnętrza przestrzeni w sieciach

krystalicznych zeolitów ma wpływ także ładunek i wymiary kationów

wchodzących w ich skład. Średnica okien w przypadku odmiany sodowej

zeolitu A (4A) wynosi ok. 0,42 nm., odmiany wapniowej (5A) ok. 0,48 nm.,

a odmiany potasowo-sodowej (3A) ok. 0,38 nm. W przypadku odmiany

sodowej zeolitu X (13X) średnica okien wynosi ok. 0,8-1 nm., natomiast

w przypadku odmiany wapniowej (10X) ok. 0,7 nm. Podobnie dla

wszystkich odmian zeolitu Y [2].

Klasyfikacja krystalograficzna znanych aktualnie zeolitów, zapro-

ponowana przez Meiera dzieli je na 7 grup. Zeolity typu A, X oraz

Y mieszczą się w tzw. grupie fojazytu [2,4]

Zeolity są minerałami występującymi w przyrodzie, jak i mogą być

otrzymywane syntetycznie. Syntetyczne zeolity stanowią znacznie większą

grupę materiałów (ponad 150). Zeolity pochodzenia naturalnego powstały

w wyniku wietrzenia skał wulkanicznych. Obecnie znanych jest około

40 grup [2,17].

Spotykanymi na terenie Polski przykładami zeolitów są:

klinoptylolit;

chabazyt;

filipsyt;

natrolit [4].

Ogólny schemat syntezy zeolitów ma następujący przebieg:

Otrzymanie żelu z wodnych roztworów glinianu i krzemianu sodu,

w stałym, wysokim pH (dodatek NaOH lub KOH);

Krystalizacja w autoklawie, przy niskim ciśnieniu pary wodnej,

w temperaturach z zakresu 25-175oC;

Sprasowanie kryształków z lepiszczem i uformowanie granulek [18].

Otrzymane w ten sposób zeolity poddaje się zwykle różnym

modyfikacjom, w celu poprawy ich właściwości sorpcyjnych.

Działanie sitowe zeolitów polega na tym, że cząsteczki różnych

adsorbatów, dzięki różnicy w wielkościach i strukturze, przedostają się lub

Mateusz Niścior

118

nie przez opisane okna do wewnętrznych obszarów sieci krystalicznej sit

molekularnych. Zatrzymywane są oczywiście tylko te cząsteczki adsorbatu,

które przechodzą do wnętrza zeolitów [2].

3.6. Szkła porowate

Szkła porowate są otrzymywane ze szkła sodowo – boro krzemowego

w wyniku obróbki termicznej i działania kwasami. Rozpuszczają się

wówczas tlenki Na2O i B2O3. Wiązania Si – O – Si w sieci krzemowo

tlenowej nie ulegają rozerwaniu i szkielet krzemionki stanowi podstawową

strukturę szkła porowatego. Struktura ta zależy od struktury szkła

wyjściowego oraz warunków jego termicznej obróbki. Zmiana składy szkła

wyjściowego i obróbka termiczna pozwalają otrzymać szkła porowate

o określonych wymiarach porów. Przez zmianę czasu trawienia roztworem

kwasu solnego można regulować głębokość porów szkła porowatego.

Średnie wymiary porów nie ulegają wówczas zmianie, W celu otrzymania

szerszych porów szkło otrzymane przez trawienie kwasem można

potraktować dodatkowo 0,5N roztworem KOH w ciągu 1-2 godzin w temp.

293K. Rozpuszcza się wówczas drobno zdyspergowana krzemionka

i zwiększa się ogólna objętość porów, maleje zaś wielkość powierzchni

właściwej szkła porowatego. Wymiary (szerokość) porów szkieł

porowatych mogą zawierać się w przedziale od kilku do kilki tysięcy Å [2].

4. Zastosowanie adsorbentów porowatych w procesie adsorpcji

W związku z ciągłym zaostrzaniem dopuszczalnych limitów emisji

zanieczyszczeń, przemysł został zmuszony do ulepszania technologii

pozwalających na usuwanie zanieczyszczeń z wody i gazów

poprodukcyjnych. Dwie główne stosowane do tego celu metody to

adsorpcja i rozdział za pomocą membran. Dzięki nim udaje się

z powodzeniem usuwać np. takie związki chemiczne, jak SO2, NOx oraz

lotne związki organiczne [6].

Zhao i wsp. dowiedli, że materiały MCM-41 zatrzymują lotne związki

organiczne, takie jak benzen, czterochlorek węgla czy n-heksan znacznie

lepiej niż dotychczas stosowane adsorbenty np. zeolity i węgle aktywne

[19]. Ueno i wsp. badali przydatność materiałów SBA-15 i SBA-16 do

adsorpcji benzenu, toluenu i ksylenu. Wyniki tych badań wskazują, że

wymienione materiały mają lepszą selektywność dla benzenu niż dla

toluenu i ksylenu [20]. W 2002 przedstawili konstrukcję mikrofluidalnego

urządzenia, które zawiera sproszkowany uporządkowany mezoporowaty

materiał krzemionkowy i ma służyć do wykrywania mieszaniny benzenu,

toluenu i o-ksylenu. Urządzenie to wykrywa benzen na poziomie już

ok. 100 ppb [21].

,


119

Mezoporowate materiały używane do oczyszczania wody z zanieczyszczeń

zarówno antropogenicznych, jak i naturalnych powinny spełniać kilka

głównych kryteriów. Wymagania stawiane przed takim materiałem to

przede wszystkim: sprawny rozdział, szybka kinetyka reakcji, wysoka

pojemność i selektywność oraz możliwość łatwej regeneracji.

Liu i wsp. zaprojektowali adsorbent dla rtęci wykorzystując metodę

posyntezowej funkcjonalizacji materiału MCM-41 grupami merkapto-

propylowymi [22]. Pojemność sorpcyjna tego materiału dla rtęci wynosiła

505 mg/g a oczyszczana przez niego woda spełniała wymagania stawiane

wodzie pitnej [23].

Metale toksyczne takie, jak arsen i chrom tworzą w wodach gruntowych

i ściekach przemysłowych aniony tlenkowe. Liu i wsp. opracowali selektywny

adsorbent dla tych jonów otrzymywany na drodze posyntezowej

funkcjonalizacji nanoporowatej krzemionki N-(2-etyloamino)-3-

propyloamino-trimetoksysilanem i traktowaniu otrzymanego produktu

roztworami soli Cu(II). Adsorbent ten jest selektywny dla chromianów

i arsenianów nawet w obecności konkurencyjnych anionów siarczanowych.

Niestety w warunkach kwasowych, jakie panują w wodach, w których

odnotowano zanieczyszczenia wymienionymi anionami tlenowymi,

etylenodiaminowe grupy funkcyjne ulegają protonacji i w związku z tym

mogą uwalniać toksyczne jony Cu2+. Yoshitake i wsp. zsyntetyzowali

sorbent dla anionów tlenowych poprzez funkcjonalizację materiałów z grup

SBA i MCM grupami aminowymi [6]

Przydatność tego adsorbenta była oceniana w warunkach kwasowych,

a protonowane aminy wykazały sprawną adsorpcję chromianów

i arsenianów bez ryzyka powstania

5. Adsorpcja zmiennociśnieniowa (PSA)

Adsorpcja zmiennociśnieniowa (PSA) jest techniką rozdzielania

i oczyszczania gazów [24]. Istnieje obecnie kilka technologii opartych na

podobnych zasadach selektywnej sorpcji wybranych związków. Na bazie

technologii PSA opracowano wiele zbieżnych procesów, stosowanych do

separacji różnych gazów. Należą do nich TSA (adsorpcja zmienno-

temperaturowa), VSA (adsorpcja zmiennociśnieniowa, pod niskimi

ciśnieniami), VPSA i TPSA (hybrydy powyższych metod) [13, 25].

Najistotniejsze procesy przemysłowe dokonywane przy jej użyciu to:

Osuszanie gazów;

Odzysk rozpuszczalników: benzyny, benzenu, toluenu, ksylenów,

acetonu, niższych alkoholi, eterów, estrów, węglowodorów

parafinowych, chlorowcopochodnych węglowodorów;

Frakcjonowanie powietrza: na tlen, azot i inne;

Mateusz Niścior

120

Produkcja i separacja wodoru z gazów procesowych (np. reforming

metanu, przemysł rafineryjny);

Separacja metanu i ditlenku węgla z gazów wysypiskowych;

Rozdział propanu i butanu z gazu ziemnego;

Separacja izoparafin;

Odwodnianie alkoholu, [3, 26-27].

5.1. Rozdzielanie analityczne substancji organicznych metodą

chromatograficzną

Chromatografia adsorpcyjna – podstawą rozdziału jest niejednakowa

skłonność składników mieszaniny do adsorpcji fizycznej i chemicznej na

powierzchni fazy stacjonarnej (ciało stałe). Jako fazę stacjonarną stosuje się

np. żel krzemionkowy, węgiel aktywny, tlenki, siarczany i fosforany

wapnia. Fazę ruchomą stanowią ciecze bądź gazy [11, 24].

Adsorbenty stosowane w chromatografii adsorpcyjnej powinny

charakteryzować się szczególnie rozwiniętą powierzchnią, bowiem

substancja adsorbowana wiąże się z nią pod postacią warstewki

monomolekularnej. Tego typu właściwości wykazują szczególnie tlenek

glinu i węgiel aktywny [24].

Zastosowanie tlenku glinowego jako adsorbenta z reguły ogranicza się

do związków o niezbyt wielkiej polarności. Związki silnie polarne (cukry,

aminokwasy), związane z Al2O3, niełatwo ulegają elucji [2].

Węgiel aktywny szczególne wykazuje powinowactwo do związków

aromatycznych; ich elucja może być przeprowadzona przy użyciu

rozpuszczalników o budowie aromatycznej [6].

Zdolność adsorpcyjna związków organicznych zależy więc od ich

polarności oraz wielkości i polaryzowalności cząsteczek. Konkretne grupy

związków można ułożyć w niżej przytoczony szereg, w zależności od ich

wzrastającego powinowactwa do polarnych środków adsorbujących:

chlorowcopochodne węglowodorów < etery < aminy trzeciorzędowe,

związki nitrowe < estry < ketony, aldehydy < aminy pierwszorzędowe

< amidy kwasowe < kwasy karboksylowe [24].

Podobne obserwacje odnoszą się do stosowanych rozpuszczalników.

Wynika z nich, że zaadsorbowana substancja może zostać wyparta

z adsorbenta przez rozpuszczalnik wykazujący większe powinowactwo do

tego adsorbenta niż wymywana substancja [2, 3].

,


121

5.2. Osuszanie powietrza przy wykorzystaniu adsorbentów

Osuszanie powietrza polega na zmniejszaniu zawartości wilgoci

w powietrzu.

Wymagane cechy adsorbentów:

znaczna intensywność pochłaniania wilgoci z powietrza;

stałe własności chemiczne i mechaniczne w procesie osuszania

i regeneracji;

możliwość łatwej i niezbyt kosztownej regeneracji;

brak własności toksycznych, korozyjnych, przykrego zapachu;

niska cena [28].

Osuszanie przez uzdatnianie powietrza wentylacyjnego:

hale basenów i pływalni: dla zapobieżenia skraplaniu wody na

ścianach, a tym samym rozwojowi grzybów i pleśni;

hale lodowisk: dla usuwania usuwanie wilgoci znad tafli lodu w celu

zapobieżenia zamgleniu i narastaniu lodu na powierzchni tafli;

kuchnie, łazienki, jadalnie, szatnie: dla obniżenie ilości pary wodnej,

usunięcia przykrych zapachów;

pralnie, suszarnie: dla obniżenia poziomu zawilgocenia, skrócenia

czasu suszenia i poprawienia komfortu pracy [28].

Osuszenie powietrza w pomieszczeniu:

biblioteki, galerie, muzea, archiwa - przechowywane obiekty są

podatne na oddziaływanie wilgoci, utrzymanie wilgotności

względnej φ<55%;

przechowywanie materiałów higroskopijnych, wrażliwy na zbrylanie

i pleśnienie;

niektóre procesy produkcyjne (przemysł spożywczy - przy produkcji

suchego makaronu, suszenie drewna, φ <15%;

ochrona maszyn i urządzeń podatnych na korozję (np. w stacjach

pomp, przepompowniach, φ 5-35%. [28].

Adsorpcyjne środki suszące:

Żel krzemionkowy nasączony chlorkiem kobaltu zwany jest

niebieskim żelem – chlorek kobaltu po nasączeniu wodą zmienia

barwę z jaskrawo niebieskiej na czerwoną. Ta zmiana następuje przy

ściśle określonej zawartości wody w żelu, dzięki czemu można

uchwycić moment nasycenia środka osuszającego wodą. Czas

oddziaływania do nasycenia wynosi 0,5 do 1s;

Zeolity – glinokrzemiany alkaliczne lub wapniowe, bardzo silnie

porowate. Nazwa pochodzi z gr. dzeo = wrzeć (kipieć), zein =

gotować i lithos = kamień (skała) co oznacza "wrzące kamienie"

i nawiązuje do ich cechy charakterystycznej : pod wpływem

Mateusz Niścior

122

ogrzewania zawarta w nich woda "wrze" = "pieni się" pokrywając

powierzchnię pęcherzykami i uwalniając zawartą w nich wodę.

Występują w przyrodzie, ale znaczenie mają produkowane

syntetycznie zeolity Bayera [28].

5.3. Ochrona środowiska

Oczyszczanie wód i ścieków: usuwanie pestycydów, detergentów,

substancji odpowiedzialnych za smak, barwę, i zapach, wody,

węglowodorów alifatycznych i aromatycznych, fenoli i ich pochodnych,

metali ciężkich, bakterii i wirusów, niskocząsteczkowych związków

organicznych, odchlorowania;

Oczyszczanie przemysłowych gazów odlotowych: adsorpcja SO2,

SO3, H2S, CS2, NH3, NOx i innych gazów toksycznych. Biorąc pod

uwagę obecność w gazach odlotowych tlenu i pary wodnej to obok

adsorpcji na węglu aktywnym zachodzi także m.in. katalityczne

utlenianie i inne reakcje wtórne;

Oczyszczanie powietrza: zabezpieczenie dróg oddechowych przed

substancjami toksycznymi (we wszystkich dziedzinach przemysłu

chemicznego i innych, w technice wojskowej; pochłanianie chloru,

tlenków siarki, tlenków azotu, siarkowodoru amoniaku merkaptanów

, rtęci, substancji promieniotwórczych i innych);

Dezodoryzacja powierza; usuwanie nieprzyjemnych zapachów

z powietrza, np. fenoli, merkaptanów pirydyny, amin, i innych;

Oczyszczanie spalin pojazdów samochodowych: na nośniku

węglowym z osadzonymi katalizatorami następuje dopalanie nie

spalonego w silniku paliwa a także adsorpcja tlenków siarki i azotu;

Rolnictwo: oczyszczanie ścieków, adsorpcja środków ochrony

roślin;

Górnictwo: utylizacja zasolonych wód kopalnianych [26, 29‚30].

5.4. Inne

Magazynowanie energii: adsorpcyjne gromadzenie gazu ziemnego,

metanu, wodoru i innych nośników energii pod ekonomicznym

i bezpiecznym ciśnieniem;

Przemysł chemiczny: eliminacja substancji szkodliwych,

odbarwianie roztworów, odzyskiwanie cennych składników z gazów

produkcyjnych itd.;

Przemysł petrochemiczny: izomeryzacja i uwodornienie, wytwarzanie

nośników węglowych, niezbędnych do utrzymania fazy aktywnej

,


123

katalizatora w stanie zdyspergowanym, w procesach katalitycznych

takich jak hydroodsiarczanie, hydroodazotowanie;

Przemysł farmaceutyczny: synteza, rozdział i oczyszczanie

niektórych preparatów;

Przemysł spożywczy: dekofinacja kawy, oczyszczanie i odbarwianie

syropów cukrowych, odbarwianie olejów i tłuszczów, odbarwianie

oraz polepszanie własności i smaku napojów alkoholowych

(spirytus, koniak, piwo);

Przemysł metalurgiczny: do otrzymywania metali szlachetnych z ich rud;

Medycyna: do oczyszczania krwi, do dializy, w zatruciach

pokarmowych;

Przemysł elektrotechniczny: jako produkt elektrodowy [11, 29, 31].

6. Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu zarysowano charakterystykę podstawowych

typów adsorbentów porowatych, ich strukturę, metody otrzymywania oraz

ogromny wachlarz zastosowań.

Materiały porowate stanowią bardzo niezwykle interesującą grupę

adsorbentów z uwagi na liczne zalety predestynujące ich zastosowania

w adsorpcji. Do zalet tych należą m.in. rozwinięta powierzchnia właściwa,

duża stabilność hydrotermalna, uniwersalność syntezy, stabilność

chemiczna, łatwość modyfikacji.

Potencjalne zastosowania owych materiałów obejmują przede

wszystkim procesy adsorpcyjne i katalityczne, oczyszczanie wód i ścieków,

przemysłowych gazów odlotowych, oczyszczanie i osuszanie powietrza

czy magazynowanie energii (metan, wodór).

Od jakiegoś czasu obserwujemy znaczny wzrost zainteresowania

materiałami porowatymi, co przekłada się na powstawanie, co raz to

nowych, bardziej udoskonalonych materiałów. Prym wiodą w tym

Chińczycy oraz badacze krajów wysokorozwiniętych, którzy nieustanie

odkrywają nowe adsorbenty, tzw. materiały nowej generacji, o lepszych

właściwościach, a co za tym idzie zastosowaniach.

Przedstawione powyżej liczne przykłady wykorzystania adsorbentów

w wielu sferach życia pokazują jak bardzo są one przydatne a czasami

nieodzowne w dzisiejszym świecie.

Mateusz Niścior

124

Literatura

1. IUPAC, 1994: Recommendations for the characterization of porous solids,

Pure Appl. Chem.,66, 1739

2. Ościk J., 1983: Adsorpcja, PWN, Warszawa

3. Natkański P.,2010: Procesy sorpcyjne, Zakład Technologii Chemicznej,

Uniwersytet Jagielloński, Kraków

4. Sarbak Z., 2000: Adsorpcja i adsorbenty – Teoria i zastosowanie,

Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań

5. Sing K. S., Everett D. H., Haul R. A., Moscov L., Pierotti R. A., Rouquerol J.,

Siemieniewska T., 1985: Pure Appl. Chem., 603

6. Zhao D., Huo Q., Feng, Chmelka B.F, Stucky G.D., 1998: J Am. Chem. Soc.,

120, 548

7. Kokotailo G.T., Lawton S.L., Olson D.H., Meier W.M., 1978: Nature 272, 437

8. Barczak M., Dąbrowski A., 2008: Wiad. Chem.,62

9. Chand Bansal R., Goyal M, 2009: Adsorpcja na węglu aktywnym, WNT,

Warszawa

10. Jankowska H., Świątkowski A., Choma J., 1985: Węgiel aktywny., WNT,

Warszawa

11. Dubinin M. M., Walker Jr., P. L. 1966: Structure and properties of activated

carbons, Chemistry and Physics of Carbon, London

12. Wastewater Engineering; Metcalf & Eddy; third edition, 317,1991: Adsorpcja

na węglu aktywnym, lenntech.pl [Dostęp 06.07.14]. Dostępny w Internecie:

http://www.lenntech.pl/adsorpcja.htm

13. Redlich O,. Paterson D.L.O., 1959: J. Phys. Chem., 63, 1024

14. Pigoń K, Z. Ruziewicz, 2005: Chemia Fizyczna, PWN, Warszawa

15. Atkins P.W., 2001: Chemia Fizyczna, PWN, Warszawa

16. Barrer R.M., 1949: Nature, 164, 112

17. AGH im. Stanisława Staszica w Krakowie, Adsorpcja, home.agh.edu.pl

[Dostęp 05.07.14]. Dostępny w Internecie:

home.agh.edu.pl/~stypula/wyk8.doc

18. Dutkiewicz E.T., 1998: Fizykochemia powierzchni, WNT, Warszawa

19. X.S. Zhao, Q. Ma, G.Q.M. Lu, 1998: Energy fuels, 12, 1051-1054

20. Y. Ueno, A. Tate, O. Niwa, H. Szhou, T. Yamada, I. Honma, 2005: Anal.

Bioanal. Chem., 382, 804-809

21. Y. Ueno, T. Horiuchi, M. Tomita, O. Niwa, H.-S. Zhou, T. Yamada, I.

Honma, 2002: Anal. Chem., 74, 5257-5262

22. J. Aguado, J.M. Arsuaga, A. Arencibia, 2008: Micropor. Mesopor. Mater.,

109, 513-524

23. A.M. Liu, K. Hidajat, S. Kawi, D.Y. Zhao, 2000: Chem. Commun, 1145-1146

24. Chromatograficzne metody rozdziału substancji, umb.edu.pl [Dostęp

05.07.14]. Dostępny w Internecie:

http://www.umb.edu.pl/photo/pliki/WF_jednostki/zaklad-chemii-

organicznej/kosmetologia-chemia_kosmetyczna-2013-2014/skrypt-

chromatografia.pdf

http://www.lenntech.pl/adsorpcja.htm

http://home.agh.edu.pl/

http://home.agh.edu.pl/~stypula/wyk8.doc

http://www.umb.edu.pl/photo/pliki/WF_jednostki/zaklad-chemii-organicznej/kosmetologia-chemia_kosmetyczna-2013-2014/skrypt-chromatografia.pdf



,


125

25. Brunauer S., Emmett P. H., Teller E., 1938: Adsorption of gasses in

monomolecularlayers, Journal of the American Chemical Society, 60, 309-319

26. Warych J.,1994: Oczyszczanie przemysłowych gazów odlotowych, WNT,

Warszawa

27. Procesy katalityczne i adsorpcyjne w ochronie środowiska.


http://www.nw.pwr.wroc.pl/~trawczynski/wyklady/Procesy_katalityczne_i_ad

sorpcyjne_CWICZENIA_lab_INSTRUKCJE/(_346wiczenie_4).pdf

28. Politechnika Śląska, 2014: Osuszanie powietrza przy wykorzystaniu

sorbentów, pdf

29. Kokotailo G.T., Chu P., Lawton S.L., Meier W.M., 1978: Nature, 275, 119

30. Zarzycki R., Pustelnik P., Wolborska A., Rzeczyńska B., Solnica J., 1993:

Ochrona środowiska, 4, 35

31. Procesy katalityczne i adsorpcyjne w ochronie środowiska,


32. http://www.nw.pwr.wroc.pl/~trawczynski/wyklady/Procesy_katalityczne_

i_adsorpcyjne_CWICZENIA_lab_INSTRUKCJE/(_346wiczenie_3).pdf





Mateusz Niścior

126

Adsorbenty porowate - rodzaje i zastosowanie

Streszczenie W niniejszym artykule przedstawiono charakterystykę podstawowych grup adsorbentów

porowatych takich jak żele krzemionkowe, zeolity, aluminożele, węgle aktywne, uporządkowane

mezoporowate materiały krzemionkowe czy szkła porowate. Porowate materiały są bardzo

ciekawą grupą adsorbentów ze względu na liczne zalety, które określają ich zastosowanie w adsorpcji. Korzyści te obejmują między innymi: bardzo dobrze rozwiniętą powierzchnię

właściwą, dużą stabilność hydrotermalną, wszechstronność syntezy stabilność chemiczną,

łatwość modyfikacji.

Opisano również szereg zastosowań adsorbentów porowatych w procesie adsorpcji. Do najważniejszych z nich należą: oczyszczanie powietrza z przemysłowych gazów odlotowych,

oczyszczenie wód i ścieków, frakcjonowanie powietrza na tlen i azot, magazynowanie energii,

osuszanie powietrza, w zatruciach pokarmowych i wiele innych zastosowań. Opisano także

analityczny sposób rozdzielania substancji metodą chromatograficzną oraz technikę rozdzielania

i oczyszczania gazów - tak zwaną adsorpcję zmiennociśnieniową (PSA).

Powyższe liczne przykłady wykorzystania adsorbentów w wielu sferach życia, pokazują nam, jak

bardzo są one przydatne i niezbędne w dzisiejszym świecie.

Słowa kluczowe: adsorpcja, adsorbenty porowate, adsorpcja zmiennociśnieniowa,

chromatografia adsorpcyjna, zastosowanie adsorbentów

Porous adsorbents - types and application

Abstract

This article presents the characteristics of the main groups of porous adsorbents such

as silica gels, zeolites, activated carbons, ordered mesoporous silica materials or porous

glass. Porous materials are very interesting group of adsorbents because of the numerous advantages that determine their application in adsorption. These benefits include: a well-

developed surface area, high stability hydrothermal synthesis versatility chemical stability,

ease of modification.

Also described is a variety of uses porous adsorbents adsorption process. The most important of these include: air purification of industrial waste gases, water and sewage

purification, fractionation of air into oxygen and nitrogen, energy storage, drying air and

food poisoning, and many other applications. Also describes the analytical method for the

separation of substances by chromatography and separation technique and purification of gas - the so-called pressure swing adsorption (PSA).

These numerous examples of the use of adsorbents in many spheres of life show us how

they are useful and necessary in today's world.

Keywords: adsorption, porous adsorbents, pressure swing adsorption, adsorption

chromatography, the use of adsorbents

127

Magdalena Bartosiak1, Agnieszka Dobrzańska

Biosensory w służbie zdrowiu

1. Wstęp

Temat biosensorów jest obecnie dynamicznie rozwijającą się dziedziną

biotechnologii, przeżywa swój renesans, zwłaszcza w obszarze

diagnostycznym. Idea bioczujników zrewolucjonizowała samokontrolę

chorych dotkniętych wieloma różnymi schorzeniami, w szczególności

pacjentów z cukrzycą. W artykule omówione zostaną zagadnienia

biosensorów, ich podział, mechanizm działania oraz zastosowanie

diagnostyczne.

2. Rys historyczny

W środowisku specjalistów za „ojca biosensorów” uważa się profesora

Lelanda Clarka, amerykańskiego biochemika, twórcę słynnej elektrody

Clarka. Opublikował on pracę na temat elektrody tlenowej – ten pierwszy

bioczujnik zawierał oksydazę glukozową (GOx) immobilizowaną na

elektrodzie platynowej. Został on wykorzystany do wykrywania oraz

mierzenia poziomu glukozy [1].

Od tamtego momentu wielu naukowców podejmowało temat

biosensorów zapoczątkowany przez Clarka. Z biegiem czasu opracowano

różnorodne rodzaje przetworników oraz znacząco urozmaicono część

receptorową sensorów; Liedberg oraz jego zespół opracowali podstawy

wykorzystywania przeciwciał w immunosensorach [2,3], natomiast pomysł

włączenia bakterii jako biologicznego elementu w elektrodach

mikrobiologicznych zrewolucjonizował przemysł bioczujników [4,5].

Obecnie biosensory są szeroko wykorzystywane w medycynie, zarówno

do celów diagnostycznych jak i leczniczych, ale także w przemyśle

spożywczym, monitoringu środowiska czy walce z bioterroryzmem.

1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii

i Biotechnologii, Zakład Biochemii, Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron”


Magdalena Bartosiak , Agnieszka Dobrzańska

128

3. Charakterystyka biosensorów

3.1. Budowa biosensorów

IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry,

pol. Międzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej) definiuje

biosensory jako urządzenia wykorzystujące reakcje biochemiczne

przeprowadzane przez wyizolowane enzymy, organelle lub całe komórki,

do detekcji związków chemicznych na drodze sygnałów elektrycznych,

termicznych lub optycznych [6].

Newman wraz ze współpracownikami zaproponowali następującą

definicję biosensora: „niewielkie narzędzie analityczne zawierające

detektor biologiczny lub pochodzący od biologicznego, zintegrowany

wewnątrz lub ściśle powiązany z fizykochemicznym przetwornikiem;

zazwyczaj celem takiego urządzenia jest nadanie dyskretnego lub ciągłego

cyfrowego sygnału elektronicznego który jest proporcjonalny do sygnału

analitu lub pokrewnej grupy analitów” [7].

W praktyce, biosensory to urządzenia zdolne do detekcji specyficznych

biologicznych próbek oraz zamiany samej ich obecności lub stężenia na

sygnały, które mogą być łatwo wykryte i zanalizowane. W budowie

wszystkich bioczujników wyróżniamy 3 zasadnicze elementy:

element rozpoznający, zwany także elementem czułym czy częścią

receptorową: na przykład przeciwciała, białka receptorowe, kwasy

nukleinowe, antygeny czy enzymy; wykrywają one „sygnał”

ze środowiska;

przetwornik: zamienia sygnał biologiczny na elektroniczny;

wzmacniacz, procesor: przekazuje i prezentuje wynik [8].

,


129

Rys. 1 Schematyczna budowa biosensora; na podstawie: Muszyńska M. Biosensory

http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Biosensory

Kluczowym elementem każdego biosensora jest przetwornik.

Wykorzystuje on zmianę właściwości fizycznych towarzyszącą zachodzącej

reakcji. Może to być zmiana ciepła zaabsorbowanego lub wyemitowanego

podczas reakcji (sensory korzystające z tego typu przetworników to

biosensory kalorymetryczne), ale także zmiana rozkładu ładunków

prowadząca do powstania potencjału elektrycznego (biosensory potencjo-

metryczne) czy ruch elektronów powstających podczas reakcji redoks

(biosensory amperometryczne). Opracowano także przetworniki

korzystające z różnicy w świetle wyemitowanym lub zaabsorbowanym

pomiędzy reagentami i produktami (biosensory optyczne), lub takie opierające

się o masę reagentów lub produktów (biosensory piezoelektryczne) [9].

Sygnał elektryczny pochodzący z przetwornika jest często słaby,

posiada wysokie szumy. Aby podnieść stosunek sygnału do szumu

wykorzystuje się „wzorcowy” sygnał linii bazowej pochodzący

z podobnego przetwornika, nie dającego sygnału od próbki. Znikoma

różnica pomiędzy sygnałami jest wzmacniana i podawana jako

odczytywalny sygnał wyjściowy. Opisany powyżej proces redukuje


130

niechciany szum sygnałowy. Analogiczny sygnał generowany przez

wzmacniacz jest najczęściej zamieniany na impuls cyfrowy

i przekazywany do mikroprocesora. Dane są przetwarzane, zamieniane na

jednostki stężenia i transmitowane na urządzenie prezentujące wyniki lub

magazynowane w pamięci aparatu [10].

3.2. Podział biosensorów

Wyróżnia się dwa zasadnicze systemy klasyfikacji biosensorów:

na podstawie typu użytego materiału biologicznego (elementu czułego)

oraz na podstawie rodzaju przetwornika.

Wśród bioczujników pierwszego typu występują biosensory w których

element czuły działa na zasadzie biologicznego powinowactwa: pomiędzy

analitem i elementem czułym wytwarza się selektywne wiązanie na

zasadzie ligand-receptor [11];elementem tym mogą być immunoglobuliny

– biosensory tego typu wykrywają interakcje antygen-przeciwciało [12];

w ich budowie wykorzystywane są zarówno przeciwciała mono- jak

i poliklonalne; takie czujniki nazywane są inaczej immunosensorami.

Kolejnym rodzajem elementu receptorowego mogą być kwasy nukleinowe –

może to być jednoniciowy lub dwuniciowy łańcuch DNA lub RNA;

hybrydyzuje on ze specyficznymi dla siebie komplementarnymi sekwencjami,

niskocząsteczkowymi związkami chemicznymi lub białkami które posiadają

powinowactwo do kwasów nukleinowych. Takie biosensory wykorzys-

tywane są do szybkiej, prostej i ekonomicznej diagnostyki chorób

genetycznych i zakaźnych, umożliwiają także detekcję interakcji i uszkodzeń

DNA [13]. Ostatnim rodzajem elementu rozpoznającego opartego o zjawisko

powinowactwa są receptory – elementem czułym jest białkowy receptor

który ma za zadanie wyzwolić kaskadę sygnałową przekazującą informację

na przetwornik.

W klasyfikacji na podstawie elementu czułego kolejna grupa

biosensorów to urządzenia biokatalityczne: elementem czułym są

unieruchomione cząsteczki enzymu; przykład: paski wskaźnikowe

z immobilizowaną GOx używane przez cukrzyków do samodzielnej

kontroli poziomu glukozy we krwi [11].

Ostatnimi w tej grupie są biosensory komórkowe: ich elementem

rozpoznającym są całe komórki lub tkanki [14]. Łączą one system

biokatalityczny z wykorzystaniem powinowactwa, dlatego w różnych

źródłach bywają wyodrębniane lub zaliczane do grupy biologicznego

powinowactwa lub biokatalitycznej. Tu zaliczamy czujniki posiadające

bakterie jako materiał biologiczny. Sensory te są tańsze w produkcji oraz

nie wymagają tak dokładnego oczyszczania jak w przypadku enzymów

[15] lecz mają dłuższe czas odpowiedzi i regeneracji (patrz punkt 3.3) [16].

,


131

Wśród biosensorów komórkowych wyróżnia się typ jednokomórkowy,

stosowany między innymi przy szacowaniu poziomu cholesterolu

– mikroorganizmy będące źródłem oksydazy cholesterolowej immobilizowane

na poliakryloamidzie lub agarze na elektrodzie tlenowej [17].

Wyodrębniono również typ wielokomórkowy oraz połączenie biosensora

komórkowego z enzymem: na przykład skojarzenie oczyszczonego NAD

(dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy) pochodzącego od Neurospora

crassa z bakteriami z gatunku Escherichia coli (o dużej zawartości

deaminazy nikotynamidowej); w reakcji katalizowanej przez deaminazę

powstaje amoniak, którego detekcja jest podstawą do oszacowania ilości

NAD+ [18]. Ostatnim wyszczególnianym wśród biosensorów komór-

kowych typem jest typ komórkowy nie wykorzystujący mikroorganizmów

– ciekawą ilustracją tego rodzaju sensora jest przytwierdzenie miazgi

bananowej do elektrody tlenowej, które zaowocowało powstaniem

dopamino-wrażliwego bioczujnika; miazga bananowa jest bogata

w oksydazę polifenolową, a izoforma enzymu wykryta w bananach cechuje się

wysoką selektywnością w stosunku do dopaminy [19].

Klasyfikacja biosensorów na podstawie rodzaju przetwornika obejmuje

czujniki elektrochemiczne (a wśród nich potencjometryczne, amperometryczne

i kalorymetryczne), a także optyczne, piezoelektryczne oraz termiczne [10].

Podstawa działania tych biosensorów została opisana powyżej.

3.3. Wymogi dla biosensorów

Każdy nowo opracowywany biosensor musi spełniać kilka wymagań

– tylko wtedy jest on uznawany za sprawny, udany i możliwy do

komercyjnej produkcji. Pośród tych wymogów znajduje się selektywność

– bioczujnik powinien być wysokoselektywny w stosunku do analizowanej

substancji; powinien także odznaczać się minimalną (a najlepiej zerową)

aktywnością krzyżową z cząstkami mającymi podobną strukturę

chemiczną, a także czułość - urządzenie powinno być zdolne do pomiaru

w takim zakresie jaki spodziewamy się otrzymać od analizowanej

substancji, z minimalnymi dodatkowymi krokami takimi jak wstępne

czyszczenie i wstępne zagęszczenie próbek. Sensor musi odznaczać się

liniowością odpowiedzi – zakres liniowej odpowiedzi systemu powinien

pokrywać się z zakresem stężeń w którym w którym substancja będzie

analizowana. Kolejnym istotnym kryterium jest powtarzalność wyników

– próbki o tym samym stężeniu analizowane kilkukrotnie powinny dawać

tą samą odpowiedź urządzenia. Ważną kwestią jest szybki czas odpowiedzi

oraz szybki czas regeneracji – odpowiedź urządzenia powinna być

wystarczająco szybka aby można uznać, iż monitoruje ono stan w czasie

rzeczywistym. Czas regeneracji powinien być szybki aby urządzenie można


132

było jak najszybciej wykorzystać ponownie. Ostatnim wymienianym

warunkiem jest stabilność i długość życia urządzenia. Większość związków

chemicznych jest niestabilna w różnych warunkach biochemicznych

i środowiskowych. Element biologiczny wykorzystany w urządzeniu

powinien być dobrany tak, aby biosensor był aktywny na długi czas – wtedy

czujnik jest użyteczny, nadaje się do sprzedaży.

4. Diagnostyczne zastosowanie biosensorów

Wykazując dużą czułość i specyficzność, biosensory znajdują szerokie

zastosowanie przy monitorowaniu zmian fizykochemicznych w organizmie.

Umożliwia to wczesną diagnozę i leczenie wielu przewlekłych chorób.

Wczesne wykrycie choroby może zapobiec jej dalszemu rozwojowi oraz

znacznie obniżyć koszty opieki medycznej pacjenta.

Jednymi z najpopularniejszych chorób przewlekłych, których przebieg

monitoruje się za pomocą bioczujników są cukrzyca i choroby układu

krążenia. W przypadku chorób układu krążenia uzyskanie prawidłowego

stanu fizjologicznego organizmu wymaga utrzymania stałego poziomu

cholesterolu, a cukrzycy – glukozy [20].

4.1. Biosensory stosowane do pomiaru glukozy

U podstaw cukrzycy leżą zaburzenia poziomu glukozy we krwi.

Zarówno wyższy, jak i niższy poziom cukru może stanowić zagrożenie

życia człowieka. W diagnostyce i leczeniu niewątpliwie kluczowy jest

nieustanny monitoring poziomu glukozy we krwi. W 2012 roku biosensory

glukozowe stanowiły około 85% światowego rynku biosensorów [21].

Ogromna liczba diabetyków sprawdzających poziom cukru sprawiła, że

glukoza jest najczęściej badanym parametrem. Pierwszy bioczujnik do

pomiaru cukru, zawierający immobilizowany na elektrodzie tlenowej

enzym, stworzyli w 1962r. Lyons i Clark. Pomiar poziomu cukru mierzony

był pośrednio przez pomiar tlenu potrzebnego do ultlenienia cząsteczki

glukozy przez immobilizowany enzym – oksydazę glukozy. W 1973 roku,

Guilbault i Lubrano zaprojektowali amperometryczny (anodowy) biosensor

do monitorowania cukru za pomocą nadtlenku wodoru – produktu

pośredniego rozkładu glukozy [20]. Istnieją różne rodzaje czujników

glukozowych, które można podzielić na dwie grupy: enzymatyczne

(nakłucie palca i pomiar gleukometrem oraz badanie poziomu glukozy

z moczu) oraz ciągły (nieinwazyjne, minimalnie inwazyjne i inwazyjne)[22].

Zdecydowana większość bioczujników glukozowych należy do

biosensorów elektrochemicznych. Charakteryzują się one wysoką

czułością, powtarzalnością, niskim kosztem oraz łatwością w eksploatacji

i konserwacji. Wśród glukozowych sensorów elektrochemicznych możemy

,


133

wyróżnić biosensory typu amperometrycznego, potencjometrycznego lub

konduktometrycznego. Najczęściej badanymi w ciągu kilku ostatnich

dekad i często spotykanymi na rynku medycznym bioczujnikami

są enzymatyczne amperometryczne biosensory glukozy. Sensory

amperometryczne monitorują generowanie prądu w wyniku bezpośredniej

lub pośredniej wymiany elektronów między układem biologicznym,

a elektrodą [23].

Zasadniczo, pomiar glukozy opiera się na interakcji cukru z jednym

z 3 enzymów: heksokinazy, oksydazy glukozowej (GOx) oraz glukozo-1-

dehydrogenazy (GDH) [21]. Test z udziałem heksokinazy, praktykowany

w wielu laboratoriach klinicznych, służy do pomiaru glukozy przy użyciu

spektrofotometrii. Sensory do pomiaru samodzielnego dla pacjenta oparte

są na GOx i GDH. Enzymy te różnią się wartością potencjału redoks,

rodzajem kofaktorów oraz specyficznością wobec glukozy. Standardowym

enzymem stosowanym do budowy sensora jest oksydaza glukozowa.

Wykazuje ona większa specyficzność w stosunku do substratu, jest tania,

łatwo ją otrzymać. Ponadto może wytrzymać skrajne warunki

środowiskowe, a tym pH, siła jonowa i temperatura, co zdecydowanie

ułatwia proces produkcji czujników [24].

Podstawowa koncepcja sposobu działania biosensora opiera się na

fakcie, że unieruchomiony GOx katalizuje utlenianie β-D-glukozy przy

użyciu tlenu cząsteczkowego do kwasu glukonowego i nadtlenku wodoru.

Do osiągnięcia aktywności katalitycznej, oksydaza glukozowa wymaga

obecności kofaktora redoks – di nukleotydu flawinoadeninowego (FAD).

FAD pełni rolę początkowego akceptora elektronów i ulega redukcji do

FADH2. Następnie kofaktor ulega regeneracji podczas reakcji z tlenem,

co prowadzi do powstania nadtlenków wodoru. Nadtlenek wodoru utlenia

się na katalitycznej anodzie platynowej. Elektroda z łatwością rozpoznaje

liczbę przenoszonych elektronów, która jest proporcjonalna do liczby

cząsteczek glukozy obecnych we krwi.

Do elektrochemicznego wykrywania glukozy wykorzystuje się 3 główne

metody: pomiar zużycia tlenu, pomiar ilości nadtlenku wodoru

wytwarzanego w reakcji enzymatycznej lub przez rejestrację transferu

elektronu od GOx do elektrody przy użyciu im mobilizowanego enzymu.

Amperometryczne biosensory oparte na GDH obejmują dwa rodzaje:

jeden związany z ko faktorem NAD, a drugi z PQQ. Reakcja enzymatyczne

z udziałem GDH jest nie jest zależna od rozpuszczone tlenu. Jeśli GDH

rozpoznaje jako ko faktor PQQ reakcja przebiega według równania:

Glukoza + PQQ utl. -> Glukonolakton + PQQzred.

Mechanizm ten nie wymaga ani tlenu, ani NAD+. PQQ-NAD to bardzo

sprawny układ enzymatyczny, charakteryzujący się szybkim transferem

elektronów. Jego wadą jest wysoki koszt.


134

W roli kofaktora GDH występuje też NAD, który jest głównym

akceptorem elektronów podczas utleniania glukozy, w trakcie którego

pierścień NAD+ przyjmuje jon wodoru i 2 elektrony . W wyniku reakcji

powstaje glukonolakton oraz zredukowana forma NADH, która następnie

może ulec elektrochemicznemu utlenieniu [23].

Rys. 2. Schemat podstawowego mechanizmu działania biosensora glukozowego opartego na

OD [20]

4.2. Biosensory stosowane do pomiaru cholesterolu

Oznaczanie poziomu cholesterolu we krwi jest bardzo istotne z punktu

widzenia diagnostyki i leczenia hipercholesterolemii oraz zmian

patologicznych takich jak miażdżyca i choroby wieńcowej. Spośród

różnych metod dostępnych dla określenia poziomu cholesterolu,

m.in. Metody kolorymetrycznej, spektrofotometrii, chromatografii

cienkowarstwowej czy chromatografii gazowej, metody z użyciem

bioczujników są zdecydowanie prostsze, szybsze o wyższej czułości

i specyficzności. W biosensorach do oznaczania sterolu wykorzystuje się

esterazę cholesterolową, oksydazę cholesterolową, peroksydazę

unieruchomione na oktylowym żelu agarozowym, polimembranie

z mekrylanu 2-hydroksyetylu, nanorurkach węglowych, porowatym

silikonie, membranie celulozowej i wielu innych. Wszystkie te nośniki

enzymu, zarówno organiczne jak i nieorganiczne, posiadają liczne wady,

np.: wysoki koszt materiału nośnikowego i procedury immobilizacji, słaba

odporność na ataki drobnoustrojów, długi czas reakcji, zredukowana ilość

kompleksów enzym-substrat, interferencja metabolitów oraz niska

stabilność podczas przechowywania. Szansą w ulepszeniu biosensorów do

pomiaru cholesterolu jest zastosowanie jako membrany wysoce

usieciowionych żywic epoksydowych [26].

Najpopularniejszym sensorem do badania poziomu cholesterolu jest

bioczujników wykorzystujący oksydaze cholesterolową. Oksydaza

cholesterolowa zawiera di nukleotyd flawinoadeninowy (FAD), jako

centrum aktywne zachodzącej reakcji redoks. W czasie reakcji

,


135

enzymatycznej, tlen działa jako fizjologiczny mediator na powierzchni

elektrody, które podlega utlenianiu, co skutkuje wytworzeniem nadtlenku

wodoru oraz cholest-4-enonu. Wzrost stężenia nadtlenku wodoru lub

zmniejszenie tlenu może być wykorzystane do określenia ilości

cholesterolu. Taki mechanizm pomiarowy posiada jedną wadę.

Mianowicie, zmiany stężenia tlenu w próbce wpływają na zmiany

w odpowiedzi elektrody, co podczas ponownego utleniania nadtlenkiem

wodoru prowadzi do zwiększenia zakłóceń za strony metabolitów takich

jak kwas askorbinowy i kwas moczowy [27]. W celu uniknięcia tego

problemu, stosuje się mieszaninę dwóch lub więcej enzymów, których

połączenie zwiększa selektywność w stosunku do analitu (podstawowy

enzym jakim jest oksydaza cholesterolowa, działa na cholesterol,

wytwarzając nadtlenek wodoru, który wychwytywany jest przez drugi

enzym, np. peroksydazę).

Jednorazowe biosensory monitorujące poziom cholesterolu mierzą

całkowity poziom sterolu, który określany jest przy użyciu jednorazowych

pasków im mobilizowanych z Fe3O4, oksydazy cholesterolowej i esterazy

cholesterolowej. Kombinacja tych dwóch enzymów umożliwia wykrycie

zarówno zestryfikowanej, jak i wolnej formy cholesterolu [20].

5. Podsumowanie

Biosensory to urządzenia stosowane głównie w analityce medycznej do

wykrywania lub ilościowego oznaczania określonych substancji

w badanym materiale klinicznym, np. metabolitów w płynach ustrojowych.

Są to połączenia obiektów biologicznie aktywnych, do których zaliczyć

można m.in. enzymy, z czujnikiem przetwarzającym efekt towarzyszący

zachodzącej reakcji chemicznej na sygnał analityczny. Dzięki wysokiej

specyficzności i czułości, biosensory znajdują szerokie zastosowanie przy

monitorowaniu zmian fizykochemicznych w organizmie. Umożliwia to

wczesną diagnozę i leczenie wielu przewlekłych chorób. Jednymi

z najpopularniejszych chorób przewlekłych, których przebieg monitoruje

się za pomocą bioczujników są cukrzyca i choroby układu krążenia,

np. hipercholesterolemia. Wczesne wykrycie stanów patologicznych

niejednokrotnie zapobiega dalszemu rozwojowi choroby u pacjenta.

Łatwość w stosowaniu biosensorów, umożliwia chorym indywidualne

monitorowanie odpowiednich substancji (większość cukrzyków

samodzielnie kontroluje poziom glukozy we krwi) [20, 23, 28].


136

Literatura

1. Heineman W.R., Jensen W.B., Leland C., Clark 1918-2005, Biosens Bioelectron, 2006, s. 1403-1404

2. Weiner P.H., Parcher J.F. Improved urea electrode, Anal Chem, 1973, s.417-419 3. Docolomanský P., Gemeiner P., Mislovicová D., Stefuca V., Danielsson B.

Screening of concanavalin A-bead cellulose conjugates using an enzyme thermistor with immobilized invertase as the reporter catalyst, Biotechnol Bioeng, 1994, s.286-292

4. Timur S., Anik U., Odaci D., Gorton L. Development of a microbial biosensor based on carbon nanotube (CNT) modified electrodes, Electrochem commun, 2007, s.1810-1815

5. Turner A.P., Karube I., Wilson G.S., Oxford U.K. Oxford University Press, 1987, Biosensors: Fundamentals and applications, s. 770

6. Fetz V., Knauer S.K., Bier C., von Kries J.P., Stauber R.H. Translocation biosensors – cellular system integrators to dissect CRMI – dependant nuclear export by chemicogenomics, Sensors, 2009, s.5423-5445

7. Newman J.D., Setford S.J. Enzymatic biosensors, Mol. Biotechnol, 2006, s.249-268

8. Bohunicky B., Mousa S.A. Biosensors: The new wave in cancer diagnosis, Nanotechnol Sci Appl, 2011, s.1-10

9. Scheller F., Schubert F. Structure and function of transducer. Amsterdam: Elsevier Science Ltd, Biosensors, 1992, s.10-34

10. Thakur M.S., Ragavan K.V. Biosensors in food processing, J Food Sci Technol, 2013, s.625-641

11. Thévenot D.R., Toth K., Durst R.A., Wilson G.S. Electrochemical biosensors: Recommended definitions and classification, Biosens Bioelectro, 2001,s.121-131

12. North I. Immunosensors: antibody-based biosensor,. Trends Biotechnol, 1985, s.180-186

13. Fjota M. Electrochemical sensors for DNA interactions and damage, Electroanalysis, 2002, s.1449-1463

14. Pancrazio J.J., Whelan J.P., Borkholder D.A., Ma W., Stenger D.A. Development and application of cell-based biosensors, Ann Biomed Eng, 1999, s. 697-711

15. Aravamudhan S., Kumar A., Mohapatra S., Bhansali S. Sensitive estimation of total cholesterol in blood using Au nanowires based micro-fluidic platform, Biosens Bioelectron, 2007, s.2289-2294

16. Riechel T., Rechnitz G. Hybrid bacterial and enzyme membrane electrode with nicotinamide adenine dinucleotide response, J Memb Sci, 1978, s.243-250

17. Singh S., Solanki P.R., Pandey M.K., Malhotra B.D. Cholesterol biosensor based on cholesterol esterase, cholesterol oxidase and peroxidase immobilized onto conducting polyaniline films, Sens Actuators B Chem, 2006, s.534-541

18. Hikuma M., Obana H., Yasuda T., Karube I., Suzuki S. A potentiometric microbal sensor based on immobilized Escherichiacoli for glutamic acid, Anal Chim Acta, 1980, s.61-67

19. Sidwell J.S., Rechnitz G.A., Bananatrode S. An electrochemical biosensor for dopamine, Biotechnol Lett, 1985, s.419-422

20. Ngoepe M. i in., Integration of biosensors and drug delivery technologies for early detection and chronic management of illness, Sensors, 2013, s.7680-7713

,


137

21. Zhu Z., Garcia-Gancedo L., Flewitt A.J., Xie H., Moussy F., Milne W.I. A critical review of glucose biosensors based on carbon nanomaterials: Carbon nanotubes and grapheme, Sensors, 2012, s.5996-6022

22. Stout P., Racchini J.R., Hilgers M.E., Noujaim S.E, Continuous glucose monitoring: Key challenges to replacing episodic SMBG, Diabetes Res. Clin. Pract, 2006, s.97-100

23. Yoo E.H., Lee S.Y. Glucose biosensors: an overview of use in clinical practice, Sensors, 2010, s.4558-4576

24. Heller A., Feldman B. Electrochemical glucose sensors and their applications in diabetes management, Chem. Rev, 2008, s.2482-2505

25. Guilbault G.G., Lubrano G.J An enzyme electrode for the amperometric determination of glucose, Anal. Chim. Acta, 1973, s.439-455

26. Pundir C.S. i in. An amperometric cholesterol biosensor based on epoxy resin membrane bound cholesterol oxidase, Indian J Med Res, 2012, s.633-640

27. Ahn K.W., Sampson N.S. Cholesterol oxidase senses subtle changes in lipid bilayer structure, Biochemistry, 2004, s.827-836

28. Portalwiedzy.onet.pl


Streszczenie

Biosensory są urządzeniami szeroko wykorzystywanymi w branży medycznej, zarówno

w celach diagnostycznych jak i leczniczych. Ich historię zapoczątkował profesor Leland

Clark, opracowując pierwsze urządzenie oparte o oksydazę glukozową immobilizowaną na elektrodzie platynowej. Po tym przełomowym wynalazku wielu naukowców kontynuowało

i rozwijało tę dziedzinę, co zaowocowało powstaniem wielu typów biosensorów. Obecni

badacze dzielą bioczujniki na dwie zasadnicze grupy: ze względu na rodzaj posiadanego

elementu czułego oraz przetwornika. Współcześnie biosensory cieszą się największą popularnością w badaniach i terapii cukrzycy oraz chorób układu krążenia, zwłaszcza

hipercholesterolemii co sprawia, iż w tych dziedzinach rozwój bioczujników postępuje

najszybciej.

Słowa kluczowe: biosensor, cukrzyca, hipercholesterolemia, cholesterol, glukoza

Biosensors in service in public health

Abstract

Biosensors are widely utilized in medical business, both to diagnose and treat patients. Their

history began when professor Leland Clark created his first device, which was based on the glucose oxidase immobilized on the platinium electrode. After that crucial invention many

scientists continued and developed the field of biosensors, a lot of types of sensors appeared.

Current researchers divide biosensors into two major groups: on the basis of nature

of recognition or the type of transducer. Nowadays biosensors have the greatest popularity among the studies and therapy of diabetes and the circulatory system dideases, especially

hypercholesterolaemia - development of biosensors is the most dynamic in these branches

of medicine.

Keywords: biosensors, diabetes, hypercholesterolemia, cholesterol, glucose

138

Adrian Odrzywolski1

Aptamery jako nowe narzędzie terapeutyczne

1. Wstęp

Aptamery są w głównej mierze kwasami nukleinowymi (DNA, bądź

RNA), choć również występują w postaci peptydów. Dzięki specyficznej

strukturze przestrzennej potrafią wiązać się niekowalencyjnie z różnymi

cząsteczkami. Są relatywnie niewielkie, najczęściej ich długość waha

się między 15 a 40 nukleotydów, zaś najdłuższe nie przekraczają

100 nukleotydów.

Ich główne założenie i proces wytwarzania zostały przedstawione

w 1990 roku niezależnie przez dwie grupy naukowców: Szostaka i Golda.

Grupa Golda opracowała metodę selekcji takich cząsteczek RNA, który

wiązały się z polimerazą DNA faga T4 [1]. Metoda ta została nazwana

SELEX (ang. Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment).

Grupa Szostaka z kolei stworzyła cząsteczki RNA, które wiązały się

z różnymi barwnikami organicznymi [2]. Ponadto wprowadzili oni termin

aptamer (łac. apto znaczy pasować).

Ich odmienna struktura i właściwości fizykochemiczne w znaczący

sposób odbiegają od przeciwciał. Nie są wrażliwe na czynniki

denaturujące, w tym zmiany temperatury, są znacznie mniejsze, jak

również są w pełni produkowane in vitro, co pozwala na automatyzację ich

procesu wytwarzania. Przez to stanowią realne zastępstwo dla przeciwciał.

2. Wytwarzanie aptamerów

Jak wspomniano we wstępie, w celu wytworzenia aptameru, stosuje

się metodę SELEX. Podstawowa selekcja w tej metodzie przebiega

w 3 etapach [3]. Pierwszym z nich jest stworzenie na drodze syntezy

kombinatorycznej biblioteki DNA, składającej się z 1012

-1015

losowych

oligonukleotydów. Dobór długości aptameru zależy od empirycznych

badań danej grupy cząsteczek, niekiedy wspomaganej analizą in silico.

Każda taka cząsteczka zawiera stałe sekwencje dla odpowiednich starterów

na obu końcach do selekcji za pomocą reakcji PCR, które flankują

sekwencje losową.

1 [email protected], Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Wydział Nauk o Żywności

i Biotechnologii, Katedra Biotechnologii, Żywienia Człowieka i Towaroznawstwa Żywności,

http://www.up.lublin.pl/foodscience/;


,


139

Kolejnym krokiem po wygenerowaniu biblioteki oligonukleotydów jest

jej inkubacja z badaną substancją. Pod względem masy, bardzo wiele

cząsteczek może być brana pod uwagę – zarówno niskocząsteczkowe

związki organiczne jak np. ATP [4], nieorganiczne jony metali, np. rtęci

[5], czy też wielkocząsteczkowe jak białka bądź kwasy nukleinowe. Należy

jednak zwrócić uwagę na fakt, że nie do każdej cząsteczki da się stworzyć

aptamer. Przede wszystkim, badana cząsteczka powinna wykazywać

ogólny ładunek dodatni (co wynika z charakteru samych aptamerów, które

będąc kwasami nukleinowymi, mają ładunek ujemny), być hydrofilową,

oraz tworzyć wiązania wodorowe. Suma wszystkich tych cech daje

pewność, że uzyska się aptamer o dużym powinowactwie do analizowanej

cząsteczki [6]. Następnie po inkubacji biblioteki DNA z badaną substancją,

separuje się aptamery na takie które uległy związaniu z nią, oraz na takie

które pozostały niezwiązane. W tym celu używa się wielu różnych metod

takich jak: chromatografia powinowactwa, czy elektroforeza kapilarna [7].

Ostatnim krokiem jest powielenie aptamerów związanych z ligandem

za pomocą metody PCR i stworzeniem tym samym potomnej biblioteki.

Potomna biblioteka z kolei jest wykorzystywana ponownie do selekcji

aptamerów, na opisanej powyżej zasadzie. Zazwyczaj konieczne jest

przeprowadzenie 10-15 takich rund selekcyjnych, aż uzyska się niewielką

grupę aptamerów o najwyższym powinowactwie. Warto jednak zwrócić

uwagę, że stosując np. elektroforezę kapilarną, proces selekcji można

zminimalizować do 4 rund [7].

Poza klasyczną metodą SELEX, istnieje bardzo duża liczba modyfikacji

tej metody, które pokrywają zapotrzebowanie na oznaczenie badanej

substancji w niekiedy bardzo specyficznych materiałach [3]. Spośród nich,

warto zwrócić uwagę na komórkowy-SELEX. Został opisany pierwszy raz

w 2006 roku przez Shangguan i współ. [8] Ten sposób selekcji różni się od

standardowego protokołu tym, że zamiast użycia pojedynczych substancji

wobec których aptamery mają być swoiste, używa się całych komórek.

Zazwyczaj uzyskuje się szereg różnych aptamerów wiążących się

z różnymi elementami błony komórkowej. Jest to szczególnie istotne, do

tak skomplikowanych celów, jak badanie komórek nowotworowych.

Dodatkowo, stosując selekcję negatywną w postaci komórek zdrowych,

zyskuje się aptamery specyficzne dla danego typu nowotworu.

3. Porównanie wybranych cech aptamerów i przeciwciał

Chociaż przeciwciała i aptamery wykazują podobieństwa co do ich

działania, to sposób w jaki funkcjonują całkowicie się różni od siebie.

Porównując obie cząsteczki, nie trudno dostrzec jak dużą konkurencją dla

przeciwciała mogą być aptamery [3, 9].

Adrian Odrzywolski

140

Stabilność aptamerów. W porównaniu do przeciwciał aptamery

są wyjątkowo stabilne. Utrzymują swoją strukturę przy wyższych

temperaturach niż przeciwciała, są również niewrażliwe na zmiany pH czy

na zmiany warunków redoks. W przeciwieństwie do przeciwciał nie

posiadają hydrofobowego jądra, stanowiącego siłę napędową fałdowania

się białka i wpływających na procesy agregacji.

W przypadku utraty swojej struktury drugorzędowej w wyniku działania

czynników denaturujących, aptamery łatwo odzyskują swoją strukturę,

podczas gdy białka w takiej sytuacji w dużej mierze tracą swoje

właściwości na stałe. Praktycznym aspektem tego jest odporność aptamerów

na przechowywanie i powtarzanie cyklów rozmrażania/zamrażania, co jest

niedopuszczalne przy przeciwciałach.

Degradacja. Aptamery są pod tym względem bardzo delikatne.

Nukleazy są obecne w każdym środowisku i są bardzo odporne na różne

czynniki. Warunkuje to z jednej strony konieczność zadbania o sterylność

środowiska pracy, a z drugiej zastosowanie odpowiednich modyfikacji

w strukturze aptamerów, aby zmniejszyć ich podatność na działanie

nukleaz. Przeciwciała, choć są również podatne na degradację przez

proteazy, to proces przebiega wolniej i jest mniej dotkliwy, niżeli

w przypadku aptamerów.

Rozmiar. Przeciwciała są to bardzo duże cząsteczki. Zależnie od klasy,

ich masa cząsteczkowa waha się od 150 kDa (IgG – najczęściej używane

do badań) do 900 kDa (IgM). Z kolei aptamery to cząsteczki stosunkowo

niewielkie. Przykładowo natywny łańcuch cząsteczki RNA o długości

76 nukleotydów, ma masę około 23 kDa (waha się zazwyczaj między

5 kDa a 65 kDa). W znacznym stopniu ułatwia to na przykład przenikanie

ich przez różnego rodzaje bariery takie jak bariera krew-mózg, czy też

bariera kłębuszkowa w nerkach.

Powinowactwo. Aptamery bardzo często mają powinowactwo

na poziomie przeciwciał monoklonalnych i mieści się ono w przedziale

nano-, pikomolarnym.

Immunogenność. Do tej pory nie stwierdzono, aby aptamery

powodowały wykrywalną reakcję immunologiczną. W przypadku

przeciwciał jednak, sytuacja jest zupełnie odwrotna. Większość przeciwciał

może ją powodować.

Bazując na powyższych danych można stwierdzić, że aptamery

dorównują przeciwciałom, a niekiedy również je przewyższają. Głównym

problemem ograniczającym ich przydatność jest ich podatność na

degradację. W środowisku jest obecna ogromna ilość nukleaz, które

z łatwością przeprowadzają cięcie nici polimeru. Skutkuje to krótkim

okresem ich półtrwania. Konieczne zatem jest wprowadzenie szeregu

modyfikacji łańcucha polimeru, aby w jak największym stopniu przeszkodzić

,


141

w hydrolizowaniu wiązań fosfodiestrowych. Jedną z ważniejszych

stosowanych modyfikacji aptamerów są modyfikacje przy 2’-OH rybozy.

Dokonuje się tutaj zamiany grupy hydroksylowej na 2’-NH2, 2’-F, bądź też

2’-O-CH3. Ponadto stosuje się modyfikacje końców nici, chroniąc tym

samym aptamery przed działaniem egzonukleaz. W tym celu przeprowadza

się najczęściej dodanie do końca 3’ odwróconej tymidyny. Do końca 5’

z kolei można zastosować przyłączenie PEG, amin, reszt fosforanowych,

kwasów tłuszczowych, cholesterolu czy innych [11, 12, 13].

4. Zastosowanie aptamerów

Aptamery podobnie jak przeciwciała, mogą być wykorzystane do wielu

różnych celów. Poniżej zostały zestawione przykłady głównych sposobów

wykorzystania aptamerów.

4.1. Inhibicja

Jednym z pierwszych aptamerów wykazujących zdolność inhibicji,

był opisany w 1990 roku aptamer wiążący się do białka Tat wirusa HIV-1.

Został on uzyskany jednak nie dzięki zastosowaniu metody SELEX,

a poprzez nadekspresję w linii komórkowej CEM-SS. W wirusie HIV

występuje białko Tat, które pełni rolę aktywatora replikacji. W celu jego

aktywacji, konieczna jest odpowiedź trans-aktywacyjna (TAR). Zastosowany

apatmer był 60 nukleotydową cząsteczką RNA, która była podobna do TAR.

Łącząc się z białkiem Tat, blokował przekazywanie sygnału do replikacji

i tym samym przeciwdziałał namnażaniu się wirusa [13].

Pierwszym sukcesem w leczeniu chorób przy użyciu aptamerów był lek

o nazwie Macugen®. Stosuje się go w przypadku stwierdzenia mokrej

postaci zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Jest to

postępująca choroba oczu, która nieleczona skutkuje najpierw utratą

centralnego widzenia, a ostatecznie ślepotą. Dotyka ona najczęściej ludzi

powyżej 50 roku życia. Chociaż nie są znane przyczyny powstawania tej

choroby, to została ona powiązana z neowaskularyzacją w obrębie

naczyniówku, która jest stymulowana przez czynnik VEGF. Działanie

Macugenu® w tej chorobie polega na związaniu się z izoformą 164 VEGF,

co skutkuje zablokowaniem jego aktywności [14, 15]. Na podobnej

zasadzie działa szereg innych aptamerów, które wiążą się z: interferonem

γ [16], elastazą neutrofilową [17], czynnikiem krzepnięcia VIIa [18], czy

czynnikiem krzepnięcia krwi IXa [19].

W 2002 roku Ulrich H. i wsp. [20] zademonstrowali możliwość

wykorzystania aptamerów do walki z chorobą Chagasa. Jest to choroba

zwierząt i ludzi wywoływana przez świdrowca Trypanosoma cruzi,

przenoszona przez pluskwiaki z rodziny Reduviidae. W celu

Adrian Odrzywolski

142

przeprowadzenia selekcji, zostały wybrane receptory pasożyta wobec

czterech białek gospodarza, po czym uzyskano grupę aptamerów RNA

specyficznych do nich. Stwierdzono, że po zastosowaniu tychże

aptamerów, inwazja została obniżona o 50-70%.

4.2. Biosensory

Bardzo interesującym zagadnieniem jest zastosowanie aptamerów

w biosensorach. Biosensor to układ, który pozwala na detekcje określonej

substancji. Dobry biosensor powinien być selektywny, czuły, dawać

jednoznaczny sygnał z możliwie najmniejszym tłem.

Jest wiele różnych typów biosensorów, dlatego stworzono wiele różnych

ich klasyfikacji. Han i wsp.[9] zaproponował podział biosensorów na:

zmieniające strukturę pod wpływem badanej cząsteczki;

w układzie kanapkowym;

z odłączającym się aptamerem;

w układzie kompetencyjnym.

Biosensor zmieniający strukturę pod wpływem badanej cząsteczki

polega na tym, że aptamer występuje w postaci luźnego łańcucha, który

pod wpływem połączenia z badaną cząsteczką ulega zmianie

konformacyjnej. Zmiana ta pociąga za sobą z kolei jedną z trzech

możliwości: albo czynnik sygnałowy związany z aptamerem ulega

przemieszczeniu, albo ulega zmianie rozmiar całego kompleksu aptamer-

cząsteczka, albo aptamer zyskuje możliwość wiązania innych cząsteczek,

które powodują powstanie sygnału.

Mechanizm ten został z powodzeniem wykorzystany między innymi

do oznaczania kokainy [21]. W tym eksperymencie, aptamer rozpoznający

kokainę został połączony z kompleksem rutenu – Ru(bpy)2(dcbpy)NHS.

Następnie tak zmodyfikowany aptamer został połączony ze złotą elektrodą

za pomocą tiolo-Au. Po pojawieniu się kokainy na płytce, aptamer

z częściowo stabilnej struktury ulega zmianie do całkowicie stabilnej,

co z kolei powoduje przemieszczenie się kompleksu rutenu w kierunku

elektrody. Powoduje to pojawienie się sygnału dzięki reakcji

elektrochemiluminescencji między złotą elektrodą, a kompleksem rutenu.

Taki układ z powodzeniem można zastosować nie tylko do kokainy, ale

również do wielu innych związków takich jak alkaloid występujący

w ziarnach kakao – teofilina [22], czy też białkowy czynnik występujący

we krwi – PDGF [23].

Biosensor w układzie kanapkowym, znany również w oznaczaniu

za pomocą przeciwciał polega na ułożeniu warstwami kolejnych

odczynników. W przypadku aptamerów, stosuje się dwa rodzaje: aptamer-

białko-aptamer, bądź aptamer-białko-przeciwciało. Wymogiem tego trybu

,


143

jest to, aby białko posiadało dwa różne miejsca rozpoznawane przez aptamer

i przeciwciało. Jako przykład tej metody, może posłużyć metoda oznaczania

płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF) [24], czy trombiny [25].

Biosensor z odłączającym się aptamerem przedstawia odmienną

mechanikę w porównaniu do aptamerów wspomnianych powyżej. W tym

trybie aptamer nie ma bezpośredniego wpływu na sygnał. Jego celem jest

oddysocjowanie się od sprzęgniętej z nim komplementarnej nici i związać

się z badaną cząsteczką. Jednymi z pierwszych stosujących tę metodę byli

Han i wsp.[26] Celem badania było oznaczenie ilości ATP w roztworze.

W tym celu zastosowano złotą elektrodę w postaci płytki, do której były

dołączone nici komplementarne do aptameru. W podstawowej formie

płytki, aptamery z nićmi komplementarnymi są zhydrydyzowane.

Następnie po dodaniu ATP i podniesieniu temperatury do 60°C, aptamery

oddysocjowują i łączą się z ATP. Po przywróceniu standardowych

warunków i odpłukaniu aptamerów związanych z ATP, niektóre nici

komplementarne nie były zhydrydyzowane. Następnie dodając trzecią nić

związaną z ferrocenem, łączy się ona z wolnymi nićmi komplementarnymi.

Zbadanie różnicy w pomiarze napięcia pozwala na określenie ilości ATP.

System z odłączającym się aptamerem powodzeniem zastosowano również

do oznaczania: trombiny [27] czy też lizozymu [28].

Ostatni wymieniony typ biosensora, to biosensor w układzie

kompetycyjnym. Opiera się na rywalizowaniu o związanie się

z aptamerem, między dwoma typami badanej cząsteczki – oznaczonej

jakimś znacznikiem, oraz nieoznaczonej. Metoda ta posłużyła między

innymi do oznaczenia poziomu trombiny [29]. Po związaniu aptameru

do podłoża przygotowuje się w różnych proporcjach mieszaninę trombiny

nieznakowanej i znakowanej fluoresceiną, po czym bada się absorbancję.

Następnie przygotowuje się mieszaninę z nieznaną ilością nieznakowanej

trombiny i dokonuje pomiaru. Otrzymany wynik będzie proporcjonalny do

ilości badanej substancji.

4.3. Dostarczanie leków

Dostarczanie substancji aktywnych do konkretnych komórek jest bardzo

istotnym elementem każdej terapii. Im bardziej specyficzne jest dostarczenie

leku tym jest on skuteczniejszy i nie wywołuje niepożądanych efektów.

Ma to szczególne znaczenie w przypadku terapii przeciwnowotworowych.

Powyższa idea leży u podstaw prób stosowania aptamerów

w dostarczaniu substancji cytotoksycznych. Jako przykład, może służyć

dostarczanie deksorubicyny za pomocą aptameru. Deksorubicyna jest

antybiotykiem z grupy atracyklin uzyskany z Streptomyces peuceticus. Jego

działanie polega na interkalacji w strukturę DNA, przez co blokuje on jego

Adrian Odrzywolski

144

replikację. Ma to szczególne znaczenie w przypadku komórek

szybkodzielących się, jakimi są m.in. komórki nowotworowe. W badaniu

Hu i wsp. [30] został wykorzystany aptamer wiążący się z białkiem MUC1,

który często ulega dużej nadekspresji u gruczolakoraków. Zbadano stopień

cytotoksyczności dla MUC1-dodatnich linii komórkowych: ludzkiego raka

piersi (MCF-7), ludzkiego raka płuc (A549), oraz MUC1-negatywnych:

ludzkiego raka wątroby (HepG2), ludzkiego zwykłego raka wątroby (L02),

które zostały uzyskane przez wyciszenie danego genu. Wyniki wskazywały

na znaczne obniżenie wchłaniania deksorubicyny w próbach negatywnych,

w porównaniu do prób pozytywnych.

Innym, szeroko stosowanym sprzęgnięciem substancji aktywnej

z aptamerem, jest użycie cząsteczki siRNA czyli małego, interferującego

RNA, które pozwala na zablokowanie ekspresji danego genu. Ten

mechanizm został wykorzystany do zatrzymania ekspresji genów wirusa

HIV poprzez związanie z mRNA wirusa i aktywacje jego degradacji [31].

W tym celu stworzono hybrydę aptamer-siRNA i zarażono wirusem HIV

humanizowane myszy. Stwierdzono, że następuje znaczne obniżenie ilości

cząsteczek wirusa u mysz, u których zastosowano hybrydę, w porównaniu do

tych, które dostały tylko cząsteczkę siRNA. Takie połączenie aptamer-

siRNA wykorzystywane jest również przeciw: komórkom raka piersi [32],

czerniakowi [33], czy raka płuc [34].

5. Podsumowanie

Aptamery mają bardzo wiele możliwości zastosowań, chociaż znane

są od niedawna. Dzięki ich cechom fizykochemicznym możliwym stało się

stworzenie narzędzia, które w wielu sytuacjach wyręcza przeciwciała.

Dzięki ich właściwości wiązania się z wysoką specyficznością, bardzo

dobrze pełnią rolę dostarczania substancji aktywnych do wybranego celu,

wizualizacji za pomocą biosensorów, czy też pełnienia roli jako

samodzielnego środka do inhibicji określonych cząsteczek. Ich niewielki

rozmiar, relatywnie niskie koszty produkcji, wytrzymałość na zmienne

warunki środowiska, oraz brak problemów etycznych pozwala sądzić,

że zainteresowanie nimi będzie w najbliższych latach rosło. Warunkiem

na to, aby mogły całkowicie przejąć funkcję przeciwciał, jest znalezienie

dobrego sposobu na usunięcie ich podstawowej wady – degradacji przez

nukleazy, oraz łatwego wypłukiwania z organizmu.

,


145

Podziękowania

Autor pragnie podziękować dr Adamowi Waśko za cenne sugestie przy

pisaniu tego artykułu. Również dziękuje dr hab. n. med. Radosławowi Roli

za konstruktywne uwagi i przychylną recenzję pracy.

Literatura

1. Tuerk C., Gold L., Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:

RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 1990 vol. 249,

s. 505-510

2. Ellington A. D., SzostakJ. W., In vitro selection of RNA molecules that bind

specific ligands, Nature, 1990 vol. 346, s. 818-822

3. Stoltenburg R., Reinemann C., Strehlitz B., SELEX—A (r)evolutionary method

to generate high-affinity nucleic acid ligands, Biomolecular Engineering, 2007

vol. 24, s. 381-403

4. Huizenga D. E., Szostak J. W., A DNA aptamer that binds adenosine and ATP,

Biochemistry, 1995 vol. 34, s. 656-665

5. Li D, Wieckowska A, Willner I., Optical analysis of Hg2+ ions by

oligonucleotide-gold-nanoparticle hybrids and DNA-based machines,

Angewandte Chemie International Edition in English, 2008 vol. 47, s.3927-3931

6. Wilson D. S.,Szostak J. W., In vitro selection of functional nucleic acids,

Annual Review of Biochemistry, 1999 vol. 68, s. 611-647

7. Mendonsa S. D., Bowser M. T., In vitro evolution of functional DNA using

capillary electrophoresis, Journal of the American Chemical Society, 2004

vol. 124, s.20-21

8. Shangguan D., Li Y., Tang Z., Cao Z. C., Chen H. W., Mallikaratchy P., Sefah

K., Yang C. J., Tan W., Aptamers evolved from live cells as effective

molecular probes for cancer study, Proceedings of the National Academy

of Sciences, 2006 vol. 103, s. 11838-11843

9. Han K., Liang Z., Zhou N., Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors,

Sensors, 2010 vol. 10, s. 4541-4557

10. Manoharan M., Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with

improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action,

Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002 vol. 12, s. 103-128;

11. Shea R. G., Marsters J. C., Bischofberger N., Synthesis, hybridization

properties and antiviral activity of lipid-oligodeoxynucleotide conjugates,

Nucleic Acids Research, 1990 vol. 18, s. 3777-3783

12. Ostendorf T., Kunter U., Grone H. J., Bahlmann F., Kawachi H., Shimizu F.,

Koch K. M., Janjic N., Floege J., Specific antagonism of PDGF prevents renal

scarring in experimental glomerulonephritis, Journal of the American Society

of Nephrology, 2001 vol. 12, s. 909-918

13. Sullenger B. A., Gallardo H. F., Ungers G. E., Gilboa E., Overexpression

of TAR sequences renders cells resistant to human immunodeficiency virus

replication, Cell, 1990 vol. 63, s. 601-608

14. Klussmann S., The Aptamer Handbook. Functional Oligonucleotides and

Their Applications, Weinheim, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2006

Adrian Odrzywolski

146

15. Centrum informacji o Leku [online], [dostęp: 6 luty 2014]. Dostępny w World

Wide Web: http://leki-informacje.pl/lek/epar/726,macugen.html

16. Kubik M. F., Bell C., Fitzwater T., Watson S. R., Tasset D. M., Isolation

and characterization of 2l-fluoro-, 2l-amino-, and 2l-fluoro-/amino-modified

RNA ligands to human IFN-gamma that inhibit receptor binding, The Journal

of Immunology, 1997 vol. 159, s. 259-267

17. Bless N. M., Smith D., Charlton J., Czermak B. J., Schmal H., Friedl H. P.,

Ward P. A., Protective effects of an aptamer inhibitor of neutrophil elastase

in lung inflammatory injury, Current Biology, 1997 vol. 7, s. 877-880

18. Rusconi C. P., Yeh A., Lyerly H. K., Lawson J. H., Sullenger B. A., Blocking

the initiation of coagulation by RNA aptamers to factor VIIa, Current Issue

of Thrombosis and Haemostasis, 2000 vol. 84, s. 841-848

19. Rusconi C. P., Scardino E., Layzer J., Pitoc G. A., Ortel T. L., Monroe D.,

Sullenger B. A., RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor

IXa, Nature, 2002 vol. 419, s. 90-94

20. Ulrich H., Magdesian M. H., Alves M. J. M., Colli W., In vitro selection

of RNA aptamers that bind to cell adhesion receptors of Trypanosoma cruzi

and inhibit cell invasion, The Journal of Biological Chemistry, 2002 vol. 277,

s. 20756-20762

21. Li Y., Qi H., Peng Y., Yang J., Zhang C., Electrogenerated

chemiluminescence aptamer-based biosensor for the determination of cocaine,

Electrochemistry Communications, 2007 vol. 9, s. 2571-2575

22. Ferapontova E. E., Olsen E. M., Gothelf K. V., An RNA aptamer-based

electrochemical biosensor for detection of theophylline in serum, Journal

of the American Chemical Society, 2008, vol. 130, s. 4256-4258

23. Lai R. Y., Plaxco K. W., Heeger A. J., Aptamer-based electrochemical

detection of picomolar platelet-derived growth factor directly in blood serum,

Analytical Chemistry, 2007 vol. 79, s. 229-233

24. Wang J., Meng W., Zheng X., Liu S., Li G., Combination of aptamer with

gold nanoparticles for electrochemical signal amplification: Application

to sensitive detection of platelet-derived growth factor, Biosensors and

Bioelectronics, 2009 vol. 24, s. 1598-1602

25. Fang L., Lu Z., Wei H., Wang E., A electrochemiluminescence aptasensor

for detection of thrombin incorporating the capture aptamer labeled with gold

nanoparticles immobilized onto the thio-silanized ITO electrode, Analytica

Chimica Acta, 2008 vol. 628, s. 80-86

26. Han K., Chen L., Lin Z., Li G., Target induced dissociation (TID) strategy

for the development of electrochemical aptamer-based biosensor,

Electrochemistry Communications, 2009 vol. 11, s. 157-160

27. Yoshizumi J., Kumamoto S., Nakamura M., Yamana K., Target-induced

strand release (TISR) from aptamer–DNA duplex: A general strategy for

electronic detection of biomolecules ranging from a small molecule to a large

protein, Analyst, 2008 vol 133, s. 323-325

28. Peng Y., Zhang D., Li Y., Qi H., Gao Q., Zhang, C., Label-free and sensitive

faradic impedance aptasensor for the determination of lysozyme based

http://leki-informacje.pl/lek/epar/726,macugen.html

,


147

on target-induced aptamer displacement, Biosensors and Bioelectronics, 2009

vol. 25, s. 94-99

29. Lee M., Walt D. R., A Fiber-Optic Microarray Biosensor Using Aptamers

as Receptors, Analytical Biochemistry, 2000 vol. 282, s. 142-146

30. Hu Y., Duan J., Zhan Q., Wang F., Lu X., Yang X., Novel MUC1 Aptamer

Selectively Delivers Cytotoxic Agent to Cancer Cells In Vitro, Public Library

of Science, 2012 vol. 7

31. Neff C. H., Zhou J., Remling L., Kuruvilla J., Zhang J., Li H., Smith D. D.,

Swiderski P., Rossi J. J., Akkina R., An Aptamer-siRNA Chimera Suppresses

HIV-1 Viral Loads and Protects from Helper CD4+ T Cell Decline in

Humanized Mice, Science translational medicine, 2011 vol. 3

32. Thiel K. W., Hernandez L. I., Dassie J. P., Thiel W. H., Liu X., Stockdale K.

R., Rothman A. M., Hernandez F. J., McNamara J. O. 2nd, Giangrande P. H.,

Delivery of chemo-sensitizing siRNAs to HER2+-breast cancer cells using

RNA aptamers, Nucleic Acids Research, 2012 vol. 40, s. 6319-6337

33. Li L., Hou J., Liu X., Guo Y., Wu Y., Zhang L., Yang Z., Nucleolin-targeting

liposomes guided by aptamer AS1411 for the delivery of siRNA for the

treatment of malignant melanomas, Biomaterials, 2014

34. Lai W. Y., Wang W. Y., Chang Y. C., Chang C. J., Yang P. C., Peck K.,

Synergistic inhibition of lung cancer cell invasion, tumor growth and

angiogenesis using aptamer-siRNA chimeras, Biomaterials, 2014 vol. 35,

s. 2905-2914

Adrian Odrzywolski

148


Streszczenie Aptamery zostały opisane po raz pierwszy w 1990. Są to zazwyczaj krótkie odcinki kwasów

nukleinowych, które mają określoną strukturę przestrzenną i wiążą się specyficznie z badaną

cząsteczką. Ich produkcja opiera się na stworzeniu puli losowych cząsteczek

oligonukleotydów, zsyntezowanych za pomocą chemii kombinatorycznej, oraz na szeregu rund selekcyjnych, nazywanych SELEX. Pozwala to na wyizolowanie tylko najlepiej

dopasowanych aptamerów do badanej cząsteczki. Dzięki swoim właściwościom wiązania

się specyficznie z badaną cząsteczką, są uważane za alternatywę dla przeciwciał.

W przeciwieństwie do nich, są odporne na działanie proteaz oraz na działanie czynników denaturujących. Również są relatywnie tanie i nie budzą wątpliwości natury etycznej.

Z drugiej strony, ich głównych problemem są nukleazy, które występują w każdym

środowisku. Aby przeciwdziałać ich aktywności należy stworzyć doskonalsze metody

modyfikacji aptamerów. Aptamery są doskonałym narzędziem do wielu typów badań:

dobrze sprawdzają się jako biosensory, czyli jako cząsteczki służące do wykrywania

różnych czynników, jak również do dostarczania leków docelowo do chorych komórek, czy

jako inhibitory szkodliwych cząsteczek.

Słowa kluczowe: aptamery, przeciwciała, SELEX

Aptamers as a new therapeutic tool

Abstract Aptamers were described for the first time in 1990. These are typically short stretches

of nucleic acids that have a specific spatial structure and bind specifically to the analyzed

molecule. Their production is based on creation of a pool of random oligonucleotides

molecules, synthesized using combinatorial chemistry, and the number of selection rounds, called SELEX. This allows to isolate only the best fitting aptamers to the analyzed molecule.

Due to their properties of binding specifically to the target, are considered as an alternative

to antibodies. In contrast to antibodies, are resistant to proteases and denaturing agents. Also

they are relatively cheap and do not raise any ethical concerns. On the other hand, their main problem are nucleases that are present in every environment. To counter their activity, there

is need to develop better methods of modification of aptamers. Aptamers are an excellent

tool for many types of studies: work well as biosensors, that is, as molecules for the

detection of various factors, as well as for delivery medicines to diseased cells, or as inhibitors of harmful agents.

Keywords: aptamers, antibodies, SELEX

149

Jan Sobstyl1, Paulina Sobstyl

2, Karol Terlecki, Paulina Chwil, Katarzyna

Schab, Magdalena Amarowicz, Marcin Urbańczuk, Dominika Mulawka,

Paulina Mulawka, Lidia Kotuła

Charakterystyka oraz możliwości terapeutyczne

wybranych przeciwciał monoklonalnych

1. Wstęp

Przeciwciała (immunoglobuliny) są glikoproteinami i należą do

najważniejszych cząsteczek układu odpornościowego. Posiadają niezwykłą

zdolność do swoistego łączenia się z antygenem i odgrywają zasadniczą

rolę w obronie organizmu przed bakteriami, wirusami i pasożytami

zewnątrzkomórkowymi oraz w mniejszym stopniu grzybami, a także

pasożytami i bakteriami wewnątrzkomórkowymi. Występują w płynach

ustrojowych wszystkich kręgowców. Na skutek wniknięcia antygenu do

organizmu, limfocyty B po kooperacji z limfocytami T ulegają aktywacji,

proliferacji i różnicowaniu w komórki intensywnie wytwarzające

i wydzielające przeciwciała. Komórki te mogą dalej się dzielić,

a końcowym etapem ich różnicowania są komórki plazmatyczne.

Przeciwciała mogą stanowić nawet 75-90% białek syntetyzowanych przez

te komórki. Wszystkie przeciwciała zbudowane są z czterech łańcuchów

polipeptydowych: dwóch lekkich L (light) i dwóch ciężkich H (heavy)

połączonych wiązaniami dwusiarczkowymi. U człowieka wyróżnia się pięć

klas przeciwciał: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Podział ten opiera się

na różnicach w budowie łańcuchów ciężkich, w których wyróżnia się

odpowiednio łańcuch α (alfa), δ (delta), ε (epsilon), γ (gamma), μ (mi).

Zarówno w łańcuchach lekkich jak i ciężkich można wyróżnić, leżące na

N-końcu, części zmienne V i na C-końcu części stałe C. Kolejność

aminokwasów części zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich definiuje

konfigurację przestrzenną, z której bezpośrednio wynika swoistość

przeciwciała do danego antygenu. W strukturze przeciwciała po trawieniu

papainą wyróżnia się dwa fragmenty Fab zawierające miejsca wiążące

określony antygen, oraz fragment krystalizujący Fc dla którego receptory

1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Genetyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny

w Lublinie, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Zakład Genetyki Klinicznej Uniwersytetu

Medycznego w Lublinie ul. Radziwiłłowska 11 20-080 Lublin 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Genetyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny

w Lublinie, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Zakład Genetyki Klinicznej Uniwersytetu

Medycznego w Lublinie ul. Radziwiłłowska 11 20-080 Lublin



Jan Sobstyl , Paulina Sobstyl , Karol Terlecki, Paulina Chwil, Katarzyna Schab, Magdalena

Amarowicz, Marcin Urbańczuk, Dominika Mulawka, Paulina Mulawka, Lidia Kotuła

150

znajdują się na wielu komórkach efektorowych i biorący udział między

innymi w aktywacji układu dopełniacza[1,2]. Swoistość wiązania się

immunoglobuliny z antygenem jest cechą, która dała nadzieje na leki nowej

generacji działające bezpośrednio na czynnik chorobotwórczy, niezależnie

od tego czy jest to patogen czy zmutowane komórki własnego organizmu.

W 1975 r. Georges Köhler i Cesar Milstein opracowali metodę produkcji

przeciwciał monoklonalnych (PM), za co 9 lat później otrzymali Nagrodę

Nobla [3]. Metoda ta pozwalała na produkcję przeciwciał wyłącznie

mysich, obecnie dzięki inżynierii genetycznej i zastosowaniu nowych

technik: „phage display” oraz techniki tworzenia zwierząt transgenicznych

możliwa jest produkcja przeciwciał ludzkich. Ponadto przeciwciała

monoklonalne stosuje się nie tylko jako swoiste leczenie, ale też

w diagnostyce chorób, oraz w badaniach naukowych [5].

2. Metody produkcji przeciwciał monoklonalnych

Metoda opracowana przez Milsteina i Kohlera tzw. „klasyczna”

polegała na fuzji limfocytów B wytwarzających swoiste przeciwciała

i komórek szpiczaka. Limfocyty B pobierane były od zimmunizowanej

odpowiednim antygenem myszy, a następnie izolowane ze śledziony.

Na skutek fuzji powstają linie komórkowe zwane hybrydoma. Limfocyt B

nadawał przeciwciałom swoistość względem antygenu, natomiast komórka

szpiczaka, jako komórka nowotworowa, nieśmiertelność oraz rybosomy

i dobrze rozwinięty aparat Golgiego.

W metodzie „phage display” (metoda ekspozycji bibliotek fagowych),

wbudowuje się geny dla części zmiennych zarówno łańcuchów lekkich jak

i ciężkich do genomu faga włókienkowego, na skutek czego dochodzi do

ekspresji kodowanych białek na powierzchni faga. Następnie izoluje się

fagi na kolumnach opłaszczonych antygenem swoistym do cząsteczek

na powierzchni faga.

W technice produkcji PM ludzkich z zastosowaniem zwierząt

transgenicznych wprowadza się osobno miniloci dla segmentów genowych

uczestniczących w syntezie przeciwciał (segmenty V, D, J, i w przypadku

łańcucha ciężkiego oraz V, J i części stałej łańcucha ) do

embrionalnych komórek macierzystych myszy z zablokowanymi genami

dla ich własnych immunoglobulin. Otrzymane transgeniczne myszy

immunizuje się i uzyskuje limfocyty B, zdolne do produkcji swoistych

w stosunku do danego antygenu przeciwciał [2,4]. Immunizacja

transgenicznych myszy Xenomouse (Abgenix) i HuMab Mouse (Medarex),

zawierających wymienione immunoglobulinowe łańcuchy ciężkie i kappa

na ludzkie odpowiedniki, pozwala na uzyskanie znaczących ilości ludzkich

przeciwciał, które nie wymagają dalszej obróbki biotechnologicznej [5].

,

Charakterystyka oraz możliwości terapeutyczne wybranych przeciwciał monoklonalnych

151

3. Nazewnictwo i podział przeciwciał monoklonalnych

W celu uporządkowania i ujednolicenia nazw PM wprowadzono

międzynarodowe zasady nazewnictwa, w zależności od pochodzenia

danego preparatu. Wszystkie PM zawierają końcówkę „-mab”. Jeśli

przeciwciało w całości pochodzi od myszy, wówczas przed wspólną

końcówkę dodaję się literę „o” (np. edrecolomab). Przeciwciała w których

części zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich pochodzą od myszy,

natomiast części stałe od człowieka, nazywa się chimerycznymi. Zawierają

one około 75% sekwencji ludzkich. W tym przypadku końcówka

poprzedzona jest wstawką „xi” (w nazewnictwie polskim „ksy”,

np. infilksymab). Przeciwciała w których tylko tzw. regiony hiperzmienne

części zmiennych są pochodzenia mysiego, a pozostałe sekwencje są od

człowieka, nazywa się humanizowanymi. Zawierają one około 95%

sekwencji ludzkich. W przypadku tych przeciwciał dodaję się wstawkę

„zu” (np. trastuzumab). Przeciwciała pochodzenia w całości ludzkiego

zawierają wstawkę „u” (np. adalimumab). Wyróżnia się jeszcze przeciwciała

pochodzące od szczura, wówczas dodaję się wstawkę „a” (-amab), oraz

od chomika ze wstawką „e” (-emab) [6].

4. Charakterystyka przeciwciał monoklonalnych

Stosowanie przeciwciał monoklonalnych pochodzenia mysiego wiąże

się z indukcją odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko

przeciwciałom, a także z ryzykiem wystąpienia reakcji anafilaktycznej.

W związku z powyższym zazwyczaj nie można podawać wielokrotnie temu

samemu pacjentowi mysich PM. Wraz ze zwiększaniem sekwencji

ludzkich w strukturze przeciwciał, ten problem tracił na znaczeniu.

Przeciwciała mysie w związku z dużą masą cząsteczkową słabo

penetrowały tkanki docelowe, co wiązało się z obniżeniem skuteczności ich

działania. Obecnie możliwa jest produkcja mniejszych cząsteczek

zachowujących swoistość. Są to bądź pochodne przeciwciał wielbłądów

i rekinów, bądź monowalentne fragmenty Fab, Fab’ lub ich części

warunkujące swoistość czyli fragmenty Fv. Wyróżnia się także

jednołańcuchowe białka scFv (single chain Fv), z których można ponadto

stworzyć tzw. miniciała składające się z 2 cząstek scFv przyłączonych do

minifragmentu Fc. Tak zmienione PM charakteryzują się reagowaniem

z ukrytymi epitopami antygenów, zwiększoną penetracją i akumulacją

w tkankach docelowych. Przeciwciała monoklonalne można łączyć

z innymi cząsteczkami takimi jak radioizotopy, toksyny, leki, cytokiny

czy enzymy [2, 5].



152

4.1. Radioimmunokoniugaty

Koniugaty PM z radioizotopami stosowane są głównie w onkologii,

zarówno w celach diagnostycznych (promieniowanie ) jak i w terapii

(promieniowanie ). Preparaty te znalazły zastosowanie w leczeniu

nowotworów układu chłonnego. Są to przeciwciała mysie anty-CD20

skoniugowane z izotopem itru (90

Y-ibritumomab tiuksetanu) oraz z jodem

131 (131

I-tositumomab). Obecnie terapię radioimmunokoniugatami

w chłoniakach agresywnych stosuje się w leczeniu konsolidującym po

chemioterapii indukcyjnej pierwszego rzutu lub w przypadkach nawro-

towych i opornych przed autologicznym przeszczepieniem macie-rzystych

komórek krwiotwórczych (auto-HSCT, autologous hematopoetic stem cell

transplantation). Do działań niepożądanych 90

Y-ibritumomabu tiuksetanu

należy głównie mielotoksyczność. Neutropenię obserwuje się u 30%

pacjentów, małopłytkowość u 10%, a niedokrwistość u 3% chorych.

W przypadku 131

I-tositumomabu toksyczność ograniczająca dawkę również

związana jest z mielotoksycznością. Podwyższony poziom TSH występuje

rzadko, a objawów hipotyreozy nie zaobserwowano [7, 8].

4.2. PM sprzężone z toksynami

Skoniugowanie przeciwciał monoklonalnych z toksynami niosło ze sobą

wiele nadziei, jak się jednak okazało takie połączenie skutkowało wysoką

immunogennością oraz toksycznym wpływem na wątrobę na skutek

niespecyficznego wychwytu. Do badań wykorzystuje się głównie

dyfterotoksynę, egzotoksynę A Pseudomonas oraz rycynę. Mechanizm

działania toksyny dyfterytu wytwarzanej przez Corynebacterium diphteriae

oraz egzotoksyny A wytwarzanej przez Pseudomonas aeruginosa jest,

mimo różnic w sekwencji, bardzo podobny. Obie toksyny katalizują

ADP-rybozylację dyftamidy, czynnika elongacyjnego EF-2 w cytozolu,

zahamowanie procesu translacji i w konsekwencji śmierć komórki.

Zastosowanie immunotoksyn pozwala niszczyć wybrane komórki, nie

powodując szkody pozostałym. W badaniach klinicznych intensywnie

badane są immunotoksyny wiążące się z komórkami nowotworów

hematologicznych. Taką immunotoksyną jest skoniugowane przeciwciało

anty-CD25 ze skróconą egzotoksyną A. Wykazano jej skuteczność wobec

przewlekłej białaczki limfocytowej B-komórkowej i neoplazji komórek T.

Dyfterotoksynę jak na razie skutecznie łączy się nie z PM a z IL-2.

Powstały w ten sposób lek o nazwie Ontak stosowany jest w leczeniu

chłoniaka skóry wywodzącego się z limfocytów T. Na komórkach tego

nowotworu zaobserwowano dużą koncentrację receptorów dla IL-2. W celu

zmniejszenia toksyczności wobec przypadkowych komórek, toksyny

zostają poddane mutacjom (zmiana w dyfterotoksynie Leu390 i Ser525

,


153

na Phe). Powoduje to znaczne obniżenie powinowactwa immunotoksyny

do komórek przypadkowych, nie wpływając tym samym na zdolność

przemieszczenia się toksyny do cytozolu komórki. Immunotoksyny poddaje

się również mutacjom mającym na celu zwiększenie powinowactwa do

receptora, dzięki czemu uzyskuje się większą cytotoksyczność [9, 10].

4.3. Przeciwciała monoklonalne sprzężone z lekami oraz terapia

ADEPT

W przeciwieństwie do immunotoksyn, koniugaty leków i PM nie

powodują tak nasilonej immunogenności. Wraz z PM sprzęgano tradycyjne

leki przeciwnowotworowe (np. doksorubicynę) jak i silne toksyny nie

podawane systemowo jak aurystatyna E, inhibitory polimerazy tubuliny

czy kalicheamycyna. Do leczenia zarejestrowano koniugat PM anty-CD30

i aurystatyny E, tzw. brentuksymab wedotyna, stosowany do leczenia wznowy

ziarnicy złośliwej i chłoniaka anaplastycznego wielkokomórkowego.

Najczęściej występujące objawy uboczne to zmęczenie, podwyższona

temperatura, nudności, neutropenia oraz obwodowa neuropatia [11,12].

Nieco innym połączeniem PM oraz leku jest terapia ADEPT (antibody-

directed enzyme prodrug therapy). W tej terapii PM swoiste to komórek

nowotworu nie jest połączone z lekiem, a z enzymem który przekształca

podany w drugiej kolejności prolek w postać aktywną leku. Prolek jest

formą nietoksyczną, a przejście w formę letalną dla komórek występuje

wyłącznie w miejscu w którym występuje podany wcześniej enzym

połączony z PM, a więc wyłącznie na komórkach nowotworu. Przed

podaniem proleku należy wcześniej oczyścić krew z enzymu. Taka terapia

pozwala na uniknięcie ogólnoustrojowego działania toksycznego leku, którego

stężenie skumulowane jest jedynie w obrębie tkanki nowotworowej [15].

4.4. PM sprzężone z cytokinami

Podejmuje się próby leczenia chorób nowotworowych z użyciem

immunocytokin, czyli przeciwciał monoklonalnych sprzężonych

z cytokinami. Cząsteczka taka działa poprzez wiązanie i niszczenie

komórki docelowej w mechanizmie ADCC (cytotoksyczność komórkowa

zależna od przeciwciał) bądź aktywację dopełniacza. Cytokiny z kolei

aktywują i stymulują proliferację komórek efektorowych.[2] Immuno-

cytokiny można podzielić na dwie kategorie: duże białka fuzyjne

z cytokinami sprzężonymi z łańcuchami ciężkimi całych przeciwciał

(IgG, >150kDa), lub małe białka fuzyjne, z cytokinami sprzężonymi

z fragmentami scFv przeciwciał (>28kDa). Pierwsze są preferowane, jeśli

wymagany jest długi okres półtrwania w krążeniu. Z kolei drugie, mniejsze

immunocytokiny, obecne są przez krótki okres w krążeniu i preferuje się je



154

w celu uniknięcia efektów ubocznych wynikających z długotrwałej

obecności w organizmie. Połączenie cytokiny z przeciwciałem wcale nie

gwarantuje dotarcia cytokiny do miejsca docelowego. Po pierwsze większość,

antygenów zlokalizowanych jest w strukturach okołonaczyniowych

i immunocytokiny muszą opuścić naczynie krwionośne, aby dotrzeć do

miejsca objętego chorobą. Po drugie wysokie wartości punktu

izoelektrycznego, glikozylacja, oraz duży rozmiar są molekularnymi

mechanizmami, które prowadzą do obniżenia stężenia cytokin w miejscu

docelowym i tym samym zmniejszonej skuteczności terapeutycznej.

Jednym z przykładów immunocytokiny jest IL-2 połączona z fragmentem

przeciwciała skierowanego przeciwko jednej z cząsteczek adhezyjnych

o nazwie EpCAM, obecnej na powierzchni komórek nowotworowych

pochodzenia nabłonkowego (rak okrężnicy, jajnika, płuc, gruczołu

krokowego). Do objawów ubocznych należą uogólniony zespół

przesiąkania włośniczek, hipotensję, gorączkę, złe samopoczucie oraz

nudności. Immunocytokinę sprzężoną z IL-12 stosuje się w badaniach

w leczeniu mięsaka Kaposiego, chłoniaka T komórkowego, oraz

chłoniaków nieziarniczych. Po stosowaniu zaobserwowano następujące

objawy uboczne: gorączka, dreszcze, zmęczenie, utrata wagi, nudności oraz

podwyższony poziom transaminaz. Koniugat z TNF- obecnie jest

sprawdzany w badaniach klinicznych pod względem skuteczności

w leczeniu czerniaka złośliwego. Do objawów ubocznych należą nudności

i wymioty oraz lekkie dreszcze [13, 14].

4.5. Przeciwciała bispecyficzne

Przeciwciała takie wytwarza się łącząc ze sobą dwie różne

immunoglobuliny, czego konsekwencją jest powstanie cząsteczki

o czterech fragmentach Fab. Jest możliwe również stworzenie przeciwciał

o czterech fragmentach Fab, z których każdy jest różny od siebie

(tzw. hybrydy hybryd, kwadroma), lub stworzenie koniugatów cząsteczek

scFv. Mechanizm działania bispecyficznego przeciwciała polega na tym,

że jedna para fragmentów Fab wiąże się swoiście z antygenem

nowotworowym (np. EpCAM, CEA, CD20, HER-2/neu, MUC-1),

natomiast druga para jest swoista w stosunku do komórek układu

odpornościowego (np. limfocyty T, komórki NK), działających zabójczo na

komórki nowotworowe [2]. Przykładem takiej cząsteczki jest

katumaksomab, trójfunkcyjne przeciwciało o dwóch miejscach wiążących

antygen i funkcjonalnej domenie Fc. Dwie domeny Fab wiążą się poprzez

EpCAM (epithelial cell-adhesion molecule) do komórek nowotworu,

pozostałe dwa fragmenty Fab do limfocytów T poprzez cząsteczkę CD3.

Następnie katumaksomab aktywuje komórki pomocnicze, łącząc się

,


155

domeną Fc z

immunologicznych komórek efektorowych w obszarze guza prowadzi do

polepszenia eliminacji komórek guza poprzez różnorodne immunologiczne

mechanizmy zabijania komórek. Ekspresja EpCAM występuje

w większości nowotworów nabłonkowych. Komórki nowotworowe obecne

w wysięku w jamie otrzewnej i spowodowanego tym wodobrzusza

w przebiegu raka piersi, jajnika, żołądka czy jelita grubego posiadają

w 70-100% ekspresję EpCAM. W zdrowych komórkach, również

obserwuje się ekspresję EpCAM, jednak co ciekawe ligand ten nie jest

dostępny dla przeciwciała, ponieważ chroniony jest on blaszką podstawną.

Co więcej jama otrzewnej wyścielona jest komórkami mezotelialnymi na

których nie występuje ekspresja EpCAM [16].

4.6. Inne modyfikacje PM

Zauważono, iż przeciwciała łączą się z antygenem w sposób bardzo

zbliżony do połączenia enzymu z substratem. Stworzono więc przeciwciała

o właściwościach enzymu: stabilizujące stan przejściowy, zmniejszające

energię aktywacji danej reakcji chemicznej, oraz przyspieszające ją

ok. miliona razy. W badaniach próbuje się wykorzystać te przeciwciała

np. w terapii uzależnień oraz detoksykacji po przedawkowaniu kokainy,

z użyciem abzymu przekształcającego kokainę do neutralnego metabolitu,

a także w leczeniu zakażenia HIV, z zastosowaniem abzymu inaktywującego

glikoproteinę gp120 uczestniczącą w procesie zakażenia limfocytów przez

wirus HIV [2].

5. Podsumowanie

Przeciwciała monoklonalne stosowane są w leczeniu już od ponad

30 lat. Postęp w technologii, a także rozwój diagnostyki molekularnej

i inżynierii genetycznej wpłynął na wprowadzenie do praktyki klinicznej

wielu przeciwciał monoklonalnych takich jak katumaksomab,

brentuksymab wedotyna, 90

Y-ibritumomab tiuksetanu, 131

I-tositumomab

oraz wielu innych. Wymagane są dalsze badania nad przeciwciałami

monoklonalnymi, w celu zwiększenia ich specyficzności oraz zmniejszenia

toksyczności ogólnoustrojowej. Niemniej jednaj leczenie PM w coraz

większym stopniu staje się ważnym elementem w farmakoterapii oraz

pozwala na mniej uciążliwe oraz bardziej selektywne leczenie.



156

Literatura

1. Sala K. Przeciwciała – budowa i podział, dostęp 5.02.2014, http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Przeciwciala-budowa-i-podzial/

2. Gołąb J., Jakóbsiak M., Lasek W., Stokłosa T. Immunologia, Wyd. 6, Warszawa, PWN, 2012, ISBN 978-83-01-17108-7

3. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984. Nobelprize.org. Nobel Media AB 2013. dostęp 6.02.2014 http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1984/

4. Powroźnik B., Kubowicz P., Pękala E. Przeciwciała monoklonalne w terapii celowanej, Postepy Hig Med Dosw. (online), 2012; 66: 663-673

5. Monoclonal Antibody Production, A Report of the Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies Institute for Laboratory Animal Research National Research Council, National Academy Press, Washington, DC 1999

6. Sosińska-Mielcarek K., Jassem J. Przeciwciała monoklonalne w leczeniu nowotworów litych, Onkologia w Praktye Klinicznej 2005, tom 1, nr 4, str. 225-232

7. Wróbel T. Przeciwciała monoklonalne anty-CD20 w terapii chłoniaków agresywnych, Hematologia 2010; 1, 4: 342-351

8. Kaminski et al., Radioimmunotherapy with iodine 131I tositumomab for relapsed or refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma: updated results and long-term follow-up of the University of Michigan experience, Blood, 15 August 2000, Volume 96, Number 4, 1259-1266

9. Maj J., Jankowska-Konsur A. Wybrane aspekty leczenia chłoniaków pierwotnie skórnych, Dermatologia Praktyczna 1/2011, 5-11

10. Łepeta K., Łasica A. M., Jagusztyn-Krynicka E. K. Zastosowanie produktów w terapiach antynowotworowych, Post. Mikrobiol., 2010, 49, 4, 255-268

11. Balwierz W., Dzikowska K., Szurgot M., Klekawka T., Moryl-Bujakowska A. Postępy w leczeniu chłoniaka Hodgkina u dzieci i młodzieży, Acta Haematologica Polonica 44, 2013, 182-187

12. Younes A., Bartlett N. L., Leonard J. P., Kennedy D. A., Lynch C. M., Sievers E. L., Forero-Torres A. Brentuximab Vedotin (SGN-35) for Relapsed CD30-Positive Lymphomas, N Engl J Med 2010; 363:1812-1821

13. Szyda A., Rossowska J., Pajtasz-Piasecka E., D. Duś Czy komórki dendrytyczne modyfikowane wektorami retrowirusowymi z genami cytokin staną się narzędziem terapeutycznym?, Postepy Hig Med Dosw. (online), 2006; 60: 552-562

14. List T., Neri D. Immunocytokines: a review of molecules in clinical development for cancer therapy, Clin Pharmacol. 2013; 5(Suppl 1): 29-45

15. Sharma S. K. ADEPT (Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy) & Translational Therapeutics, dostęp 11.02.2014, http://www.ucl.ac.uk/cancer/oncology/adept

16. Heiss M., Murawa M, Koralewski P., Kutarska E., Kolesnik O. O., Ivanchenko V. V., Dudnichenko A. S., Aleknaviciene B., Razbadauskas A., Gore M., Ganea-Motan E., Ciuleanu T., Wimberger P., Schmittel A., Schmalfeldt B., Burges A., Bokemeyer C., Lindhofer H., Lahr A., Parsons S. L. (2010), The trifunctional antibody catumaxomab for the treatment of malignant ascites due to epithelial cancer: Results of a prospective randomized phase II/III trial, Int. J. Cancer, 127: 2209-2221

http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Przeciwciala---budowa-i-podzial/

http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Przeciwciala---budowa-i-podzial/

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1984/

http://www.ucl.ac.uk/cancer/oncology/adept

,


157

Charakterystyka oraz możliwości terapeutyczne wybranych

przeciwciał monoklonalnych

Streszczenie

Przeciwciała (immunoglobuliny) są glikoproteinami i należą do najważniejszych cząsteczek układu odpornościowego. Posiadają niezwykłą zdolność do swoistego łączenia się

z antygenem i odgrywają zasadniczą rolę w obronie organizmu przed bakteriami, wirusami

i pasożytami zewnątrzkomórkowymi oraz w mniejszym stopniu grzybami, a także

pasożytami i bakteriami wewnątrzkomórkowymi. Swoistość wiązania się immunoglobuliny z antygenem jest cechą która dała nadzieje na leki nowej generacji, działające bezpośrednio

na czynnik chorobotwórczy, niezależnie od tego czy jest to patogen czy zmutowane

komórki własnego organizmu. W 1975 r. Georges Köhler i Cesar Milstein opracowali

metodę produkcji przeciwciał monoklonalnych (PM), za co 9 lat później otrzymali Nagrodę Nobla. Przeciwciała monoklonalne można łączyć z innymi cząsteczkami takimi jak

radioizotopy, toksyny, leki, cytokiny czy enzymy. Przeciwciała monoklonalne w tym

katumaksomab, brentuksymab wedotyna, 90Y-ibritumomab tiuksetanu, 131I-tositumomab

są obecnie wykorzystywane do leczenia wielu chorób.

Słowa kluczowe: przeciwciała monoklonalne, katumaksomab, brentuksymab wedotyna,

90Y-ibritumomab tiuksetanu, 131I-tositumomab

Characteristics and therapeutic abilities of the chosen monoclonal

antibodies

Abstract

Antibodies (immunoglobulins) are glycoproteins and one of the most important molecules

of the immune response system. Antibodies have an unique ability to bind specifically to the antigen and play an essential role in the organism defense against bacteria, viruses,

extracellular parasites and to a lesser extent fungus, intracellular parasites, and intracellular

bacteria. Specifically binding to the antigen made immunoglobulins a potential new

generation of medicine, which acts direct to the disease causative agent, whether this is a pathogen or a mutated body’s own cell. In the 1975 Georges Köhler and Cesar Milstein

discovered the principle for production of monoclonal antibodies (mAb), and were awarded

a Nobel Prize 9 years later. Monoclonal antibodies may be fused with other molecules such

as radioisotopes, toxins, medicines, cytokines and enzymes. Monoclonal antibodies such as catumaxomab, brentuximab vedotin, 90Y-ibritumomab tiuxetan, 131I-tositumomab are

increasingly used in the treatment of many diseases.

Keywords: monoclonal antibodies, catumaxomab, brentuximab vedotin, 90Y-ibritumomab tiuxetan, 131I-tositumomab

158

Katarzyna Szałapata1, Monika Osińska-Jaroszuk


1

Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia

stosowane w różnych dziedzinach życia

1. Wprowadzenie

Enzymy proteolityczne (określane również jako peptydazy lub proteazy)

stanowią dużą grupę białek enzymatycznych odpowiedzialnych za

hydrolizę wiązania peptydowego w różnych biocząsteczkach. Są one

szeroko rozpowszechnione w świecie organizmów żywych, występują

zarówno u zwierząt, roślin, jak i mikroorganizmów. U zwierząt, poza

trawieniem składników odżywczych dostarczanych z pobieranym

pokarmem, enzymy te są zaangażowane w kilka istotnych procesów takich

jak aktywacja proenzymów i prohormonów czy mechanizmy obronne

np. aktywacja układu dopełniacza lub kaskady krzepnięcia krwi [1, 2].

Mimo tego, że proteazy pełnią ważne funkcje regulacyjne, mogą

stanowić również zagrożenie dla homeostazy organizmu poprzez zaburzenie

prawidłowego funkcjonowania białek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych.

Uniknięcie negatywnych skutków niekontrolowanej proteolizy osiągane

jest m.in. dzięki regulacji ekspresji, sekrecji i aktywacji proenzymów oraz

degradacji enzymu. Jedno z ważniejszych miejsc wśród procesów

kontrolnych zajmuje regulacja poprzez naturalną inhibicję, a proces

równowagi pomiędzy miejscowo występującymi proteazami oraz

skierowanymi przeciwko nim inhibitorami decyduje o równowadze

funkcjonowania komórki, tkanki, a nawet całego organizmu [3, 4].

Celem niniejszej pracy jest przybliżenie tematyki związanej

z klasyfikacją inhibitorów proteaz i mechanizmem ich działania oraz

przedstawienie praktycznych zastosowań tych cząsteczek w różnych

dziedzinach życia.

1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział

Biologii i Biotechnologii, Zakład Biochemii http://www.fungi.umcs.lublin.pl/

[email protected]%20

http://www.fungi.umcs.lublin.pl/

,

Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia stosowane w różnych dziedzinach życia

159

2. Klasyfikacja inhibitorów proteaz

Pod względem budowy chemicznej cząsteczki inhibitorów proteaz

w znacznej większości są białkami lub peptydami. Możemy jednak spotkać się

również z inhibitorami, które są polisacharydami, polifenolami, glikolipidami,

triterpenami lub niebiałkowymi związkami niskocząsteczkowymi [5, 6].

Podstawowe kryterium podziału inhibitorów proteaz jako cząsteczek

regulujących katalityczną aktywność enzymów proteolitycznych opiera się

na klasyfikacji według trzech różnych zasad: typu inhibowanej proteazy,

mechanizmu reakcji wiązania do proteazy oraz sekwencji aminokwasowej

inhibitora [4].

2.1. Klasyfikacja według typu inhibowanej proteazy

Biorąc pod uwagę typy hamowanej proteazy inhibitory można podzielić

na dwie duże grupy, pierwsza z nich to inhibitory niespecyficzne, natomiast

druga obejmuje inhibitory klasowo specyficzne [4].

Inhibitory niespecyficzne są odpowiedzialne za regulację enzymów

proteolitycznych z różnych klas. W niektórych przypadkach może

dochodzić do sytuacji, w której jeden inhibitor kontroluje wszystkie klasy

proteaz. Do grupy tej zaliczamy α2-makroglobulinę, która jest dużym

białkiem o niskiej specyficzności względem rodzaju hamowanego enzymu.

Posiadając tak szerokie spektrum działania, α2-makroglobulina odgrywa

ważną rolę w wielu fizjologicznych procesach organizmów zwierzęcych [7].

W odróżnieniu od inhibitorów niespecyficznych, inhibitory klasowo

specyficzne hamują aktywność proteolityczną proteaz pochodzących

wyłącznie z odpowiadających im klas katalitycznych. W ten sposób zostały

wyróżnione m.in.:

inhibitory proteaz serynowych (wśród których najbardziej znane

są tzw. Kuniny, inhibitory Kazala, inhibitory z rodziny Bowmana-

Birka, serpiny i hirudyny);

inhibitory proteaz cysteinowych (takie jak cystatyny, stefiny,

kininogeny czy tyropiny);

inhibitory metaloproteaz (np. rodzina TIMP);

inhibitory proteaz asparaginowych [3, 4, 8].

Godnym podkreślenia jest fakt, że ten rodzaj klasyfikacji inhibitorów

powstał jako pierwszy. Był on powszechnie stosowany przez długi czas,

a obecnie również cieszy się popularnością ze względu na swoją prostotę.

Jednak biorąc pod uwagę, że nie odnosi się on do tak ważnych cech

inhibitorów jak mechanizm wiązania cząsteczki inhibitora do cząsteczki

enzymu czy opis sekwencji aminokwasowej inhibitorów, utworzone

zostały inne metody klasyfikacji tych cząsteczek.


160

2.2. Klasyfikacja według mechanizmu reakcji wiązania do

proteazy

Zdecydowana większość inhibitorów proteaz pracuje według schematu,

w którym podstawową zasadą jest zablokowanie miejsca aktywnego

enzymu. Zatem klasyfikacja według mechanizmu reakcji wiązania

inhibitora do proteazy opiera się na różnych typach interakcji pomiędzy

inhibitorem a hamowanym enzymem. Wyróżniamy tutaj między innymi

podział inhibitorów na działające według mechanizmu pułapkowania,

inhibitory kanoniczne lub inhibitory działające według mechanizmu

„samobójczego” [4]. Szerszy opis tych reakcji zamieszczony został

w Podrozdziale 2.

2.3. Klasyfikacja według sekwencji aminokwasowej inhibitora

W roku 2004 Rawlings i wsp. [9] podjęli próbę klasyfikacji inhibitorów

proteaz na podstawie homologii ich sekwencji aminokwasowych.

Wynikiem tej pracy było wydzielenie 48 rodzin inhibitorów [4, 10].

Obecnie z klasyfikacją i nomenklaturą wszystkich inhibitorów

enzymów proteolitycznych, dla których są znane sekwencje

aminokwasowe, można się zapoznać dzięki wirtualnej, systematycznie

aktualizowanej bazie MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/inhibitors/).

Dotychczas inhibitory wprowadzone do bazy zostały zaklasyfikowane do

76 rodzin oraz 39 klanów [4, 11].

http://merops.sanger.ac.uk/inhibitors/

,


161

Rys. 1 Przykładowy ekran systemu MEROPS przedstawiający informacje dotyczące

wybranej rodziny inhibitorów [11]


162

System MEROPS dostarcza informacji w dziedzinie mechanizmu

inhibicji danej rodziny inhibitorów, jej homologów, rozpowszechnienia

występowania wśród organizmów żywych oraz struktury cząsteczki.

Dodatkowo dzięki bazie danych można szukać powiązań i interakcji

pomiędzy inhibitorami a wybranymi enzymami proteolitycznymi (Rys. 1).

3. Mechanizm reakcji inhibicji

Wśród reakcji inhibicji enzymów proteolitycznych możemy wyróżnić

ich dwa główne mechanizmy. Pierwszy z nich opisuje reakcje

nieodwracalnego pułapkowania - ang. „trapping” reactions (Rys. 2A).

Reakcje te zachodzą wyłącznie z udziałem endopeptydaz i są wynikiem

konformacyjnych zmian w strukturze inhibitora wywołanych przez

rozszczepienie wewnętrznego wiązania peptydowego przez proteazę

gospodarza. Obecnie zidentyfikowano trzy rodziny inhibitorów, które

są zaangażowane w te reakcje: rodzina I4 (serpiny), rodzina I39

(α2-makroglobulina) oraz rodzina I50 (wirusowe inhibitory kaspaz) [8‚10].

Mechanizm pułapkowania jest najbardziej charakterystyczny dla

α2-makroglobuliny. W przypadku wszystkich klas enzymów proteolitycznych

dochodzi do ich związania w tym samym miejscu cząsteczki makroglobuliny.

Związanie to prowadzi do zmian konformacyjnych w strukturze inhibitora

i zablokowania możliwości interakcji innych białek z przechwyconym

przez inhibitor białkiem enzymatycznym. Nowo powstały kompleks

makroglobulina - proteaza jest bardzo szybko wychwytywany w procesie

endocytozy. Następnie kompleksy te mogą ulegać degradacji w systemie

endosomalnym lub lizosomalnym. Jedna cząsteczka α2-makroglobuliny

może wiązać i przenosić maksymalnie dwie cząsteczki proteazy [4, 7].

Pojęcie mechanizmu „samobójczego” zostało wprowadzone ze względu

na znaczne zmiany zachodzące w strukturze inhibitora, do których

dochodzi po jego połączeniu się z odpowiadającą mu proteazą.

Rozszczepienie wewnętrznego wiązania peptydowego inhibitora prowadzi

do jego zniszczenia, które skutkuje uszkodzeniem miejsca aktywnego

inhibitora. W wyniku tych zmian inhibitor nieodwracalnie wiąże się

z enzymem i powoduje jego inaktywację [4].

Do nieodwracalnej inhibicji może dochodzić również w sytuacji, gdy

reaktywna elektrofilowa grupa inhibitora tworzy wiązanie kowalencyjne

z resztą aminokwasową w miejscu aktywnym enzymu [8‚10].

,


163

Rys. 2 Schemat mechanizmów reakcji inhibicji enzymów proteolitycznych: (A)

nieodwracalne pułapkowanie („trapping” reactions) (B) i (C) odwracalne mocne związanie

(tight-binding reactions) [8]. Cząsteczki proteazy zostały oznaczone kolorem jasnoszarym, miejsce aktywne enzymu kolorem czarnym, a cząsteczki inhibitora ciemnoszarym.

Drugim typem reakcji inhibicji są reakcje odwracalnego mocnego

związania (Rys. 2B i C) – ang. tight-binding reactions, które są znacznie

bardziej rozpowszechnione niż opisane powyżej reakcje nieodwracalne.

Zaliczamy tutaj inhibitory działające według standardowego kanonicznego

mechanizmu (mechanizmu Laskowskiego). Inhibitor jest tu powoli

uwalniany ze względu na stabilność konformacyjną pętli, która może

naśladować naturalny substrat. Taki mechanizm reakcji można wykazać

jedynie w przypadku inhibicji proteaz serynowych. W pozostałych

przypadkach mamy do czynienia z inhibitorami, które fizycznie blokują

miejsce aktywne proteazy dzięki wysokiemu powinowactwu wiązania się

w pozycji po obu stronach miejsca aktywnego [8].

4. Wybrane zastosowania inhibitorów proteaz

Enzymy proteolityczne pełnią niezwykle istotną rolę w procesach

metabolicznych we wszystkich organizmach. Ponieważ reakcja hydrolizy

wiązania peptydowego jest reakcją nieodwracalną, wszystkie związane

z nią anomalie prowadzą do powstawania patologicznych zjawisk takich

jak procesy nowotworowe i zapalne lub zwiększenie podatności na infekcje

wirusowe, bakteryjne czy pasożytnicze. Dlatego też istnienie efektywnego

systemu regulacji aktywności aparatu proteolitycznego jest warunkiem

koniecznym do utrzymania homeostazy organizmu.

Inhibitory enzymów proteolitycznych, jako jeden z elementów składowych

układu kontrolowanej proteolizy, znalazły zastosowanie nie tylko w przemyśle

medycznym i farmaceutycznym, ale także zaczęły cieszyć się popularnością

w obszarach tematyki ekologicznej ochrony upraw rolnych. Coraz częściej

używa się ich również w metodach chromatografii powinowactwa

wykorzystywanej do oczyszczania preparatów proteaz. Niniejszy podrozdział


164

ma na celu nakreślenie obecnego statusu zastosowań tych związków

oraz przedstawienie przyszłych perspektyw dla ich wykorzystania.

4.1. Przemysł medyczny i farmaceutyczny

4.1.1 Leczenie choroby Alzheimera

Choroba Alzheimera jest zespołem zaburzeń neurodegeneracyjnych

mózgu, które prowadzą do demencji. Według statystyk schorzeniem tym

obarczona jest co dziewiąta osoba po 80. roku życia [12].

Chorobie tej towarzyszą patologiczne zmiany w mózgu, w wyniku

których powstają sploty neurofibrylarne oraz płytki starcze. Płytki starcze

określane są również mianem blaszek lub złogów amyloidowych. W swojej

strukturze posiadają rdzeń, który stanowi β-amyloid, dystroficzne neuryty

oraz komórki astro- i mikrogleju. Molekularnym podłożem choroby

Alzheimera jest mutacja w trzech różnych genach. Pierwszym z nich jest

gen APP (ang. Amyloid Precursor Protein), kodujący białko prekursorowe

amyloidu. Kolejny gen ryzyka to gen kodujący enzym rozkładający

insulinę oraz inne małe peptydy (ang. insulin-degrading enzyme – IDE).

Z nielicznymi przypadkami tej choroby związany jest również polimorfizm

apolipoproteiny E (ApoE) [13].

W patogenezie choroby decydującą rolę odgrywa białko prekursorowe

amyloidu, podlegające przemianom, w które zaangażowane są β- oraz

γ-sekretaza. Na początku lat dziewięćdziesiątych została sformułowana

hipoteza kaskady amyloidowej, według której złogi amyloidowe powstają

w wyniku odkładania się hydrofobowego peptydu Aβ42, co jest

skorelowane z najwcześniejszymi krytycznymi zmianami istotnymi

w rozwoju choroby [12, 13].

Jednym z proponowanych rodzajów terapii jest obniżenie aktywności

β-sekretazy poprzez zastosowanie inhibitorów hamujących działanie

enzymu. Poszukiwania prowadzone są wśród peptydowych analogów

substratu tzw. peptydomimetyków. Ograniczeniem tej terapii jest jednak fakt,

że dotychczas wytworzone niskocząsteczkowe inhibitory hamują poza

samym enzymem docelowym również aktywność innych proteaz

asparaginianowych (np. katepsyny D). Nie spełniają też podstawowego

wymagania, jakie jest stawiane lekom, ponieważ nie przekraczają bariery

krew-mózg. Dlatego też leczenie choroby Alzheimera z wykorzystaniem

inhibitorów proteaz pozostaje nadal tematem otwartym [12, 14].

,


165

4.1.2 Leczenie chorób nowotworowych

Jednym z ważniejszych mechanizmów mających miejsce w procesach

nowotworzenia jest zdolność komórek nowotworowych do przekroczenia

barier pozakomórkowych oraz przerzutowania do odległych miejsc

w obrębie organizmu. Białkami odpowiedzialnymi za te zjawiska są

wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe enzymy proteolityczne, które remodelują

komórki tkanki łącznej i błony podstawnej. Do najważniejszych z nich

należą metaloproteazy macierzowe (MMP), proteinazy serynowe

(urokinaza), proteinazy asparaginianowe (katepsyna D) oraz proteinazy

cysteinowe (katepsyny B, H, S oraz L) [8].

W powszechnym mniemaniu istnieje przekonanie, że powstawanie

guzów nowotworowych związane jest z tym, iż aktywność proteolityczna

istotnych enzymów przestaje podlegać kontroli inhibitorów. W związku

z tym egzogenne inhibitory proteaz mogą być czynnikami, które zahamują

postępy choroby. Jednak w rzeczywistości problem ten jest o wiele bardziej

złożony, ponieważ leczenie wymaga użycia specjalistycznych narzędzi,

które skierowane byłyby wyłącznie przeciwko enzymom powiązanym

z onkogenezą, a nie z ważnymi fizjologicznymi funkcjami pełnionymi

w organizmie [8, 15].

Badania prowadzone na modelach zwierzęcych z wykorzystaniem

CA-074 – inhibitora katepsyny B potwierdziły skuteczność specyficznej

i ukierunkowanej terapii. Naukowcy zaobserwowali zmniejszenie wzrostu

guzów oraz zahamowanie angiogenezy wielu typów nowotworów (badano

m.in. komórki raka trzustki, czerniaka oraz raka piersi) [16].

Innymi celami, przeciwko którym można by było skierować tego

rodzaju terapię, ze względu na mnogość ról pełnionych w procesie

nowotworzenia, są metaloproteazy. Jednak różnorodność tej klasy

enzymów oraz szeroki wachlarz pełnionych przez nie funkcji fizjolo-

gicznych uniemożliwia zastosowanie całej puli przeznaczonych dla nich

inhibitorów [17].

Obiecującymi metodami leczenia są metody skojarzone, w których

wykorzystywane są inhibitory kompleksów proteasomów w połączeniu

z tradycyjną chemioterapią. Zablokowanie aktywności tych

multikatalitycznych kompleksów w procesach onkogenezy pozwala na

zaindukowanie obumierania komórek nowotworowych. Zakłócanie przez

inhibitory proteasomów szlaku ubikwityna-proteasom, prowadzi do

akumulacji białek zaangażowanych w progresję cyklu komórkowego.

Finalnym efektem tej terapii jest zahamowanie procesu podziałów

komórkowych w obrębie guza i wymuszenie indukcji apoptozy komórek

nowotworowych [17].


166

4.2. Zastosowanie inhibitorów proteaz w ochronie upraw rolnych

Endogenne roślinne inhibitory proteaz stanowią jedną ze strategii

obronnych przeciw czynnikom chorobotwórczym, pasożytom i organizmom

roślinożernym. Głównym celem ich działania są proteolityczne czynniki

wirulencji bakterii fitopatogennych, grzybów, różnego rodzaju pasożytów

oraz wirusów poprzez utrudnianie poboru substancji odżywczych, a także

uniemożliwianie uchylania się przed mechanizmami obronnymi organizmu

gospodarza. Dodatkowo hamują one również działanie proteaz układu tra-

wiennego, uniemożliwiając pobór azotu organicznego pochodzącego z żyw-

ności, który pełni kluczową rolę w procesach wzrostu i rozwoju [8, 18, 19].

Biorąc pod uwagę silne hamujące działanie naturalnych roślinnych

inhibitorów proteaz względem czynników wirulencji, uzasadnione jest

poszukiwanie nowych cząsteczek, które wykazywałaby potencjalne

właściwości ochronne, a zarazem idealnie wpisywałyby się w przyjazne dla

środowiska metody zwalczania szkodników.

Największe zainteresowanie wzbudziło zastosowanie inhibitorów

proteaz jako środków ochrony przeciwko insektom, gdyż to właśnie owady

powodują co roku najpoważniejsze straty gospodarcze. Za działające

w najbardziej destrukcyjny sposób uważane są larwy motyli i ciem

(Lepidoptera). Owady w zdecydowanej większości powodują bezpośrednie

straty rolne w wyniku żywienia się plonami, ale także straty pośrednie

poprzez przenoszenie licznych cząsteczek wirusowych lub wtórnych

zakażeń bakteryjnych [8].

Dodatkową zaletą stosowania inhibitorów proteaz w ochronie roślin przed

roślinożernymi pasożytami jest to, że powodują one również skumulowaną

ochronę przed nicieniami, bakteriami, grzybami oraz wirusami.

Takie skumulowane działanie można zaobserwować w przypadku

patogennego nicienia – mątwika burakowego (Heterodera schachtii),

u którego w układzie pokarmowym w przeważającej większości występują

enzymy proteolityczne z klasy proteaz cysteinowych. W tym przypadku

z powodzeniem stosowano pochodzący z heterologicznej ekspresji roślinny

inhibitor proteaz cysteinowych fitocystatynę (rodzina I25) [8].

4.3. Zastosowanie inhibitorów proteaz w biotechnologii

4.3.1. Metody zapobiegające niekontrolowanej proteolizie

Jednym z bardzo częstych problemów spotykanych w praktyce

laboratoryjnej jest trudność w uzyskaniu preparatów białkowych. Sytuacja

ta związana jest z obecnością natywnych enzymów proteolitycznych

w badanym materiale biologicznym. W celu uniknięcia niepożądanej

proteolizy wykorzystuje są preparaty niskocząsteczkowych inhibitorów

,


167

proteaz o szerokim spektrum działania hamującym aktywność proteaz

z wielu różnych klas katalitycznych. Wśród składników najczęściej

wykorzystywanych koktajli znajdują się: pepstatyna A (proteazy

asparaginianowe), E-64 (proteazy cysteinowe), chymostatyna (proteazy

serynowe), antypaina (proteazy cysteinowe i serynowe) oraz leupeptyna

(proteazy cysteinowe, serynowe i treoninowe). W przypadku zahamowania

aktywności metaloproteaz stosowane są środki chelatujące takie jak EDTA

czy 1,10-fenantrolina [4].

Często do niepożądanej proteolizy dochodzi również w przypadku

heterologicznej ekspresji białek w różnego rodzaju układach

ekspresyjnych. W takich sytuacjach można wykorzystać szczepy

bakteryjne i grzybowe naturalne lub uzyskane w wyniku działania metod

inżynierii genetycznej, dla których profil enzymów proteolitycznych jest

stosunkowo ubogi. Jednak szczepy te mimo wielu zalet mogą nie

wykazywać pożądanych cech na wystarczająco wysokim poziomie, aby

móc je swobodnie stosować w bioprocesach. W takich sytuacjach dąży się

do zmodyfikowania warunków hodowli w taki sposób, aby obniżyć ryzyko

uszkodzenia lub całkowitego zniszczenia rekombinowanego białka. Aby

uchronić cenny produkt procesu biotechnologicznego, stosowane są dodatki

niskocząsteczkowych inhibitorów proteaz serynowych i asparaginowych

w podłożach hodowlanych [4].

4.3.2. Oczyszczanie proteaz metodami chromatografii

powinowactwa

Innym ważnym z biotechnologicznego punktu widzenia aspektem jest

zastosowanie inhibitorów proteaz w procesie oczyszczania białek na drodze

chromatografii powinowactwa. Ten rodzaj chromatografii jest dość

prostym jednostopniowym procesem oczyszczania cząsteczek z układu

złożonej mieszaniny poprzez wysoce specyficzne wiązanie ich z ligandem

znajdującym się na unieruchomionym złożu. W zależności od rodzaju

oczyszczanej proteazy docelowej można tutaj wykorzystywać inhibitory

o wąskiej specyficzności lub odwrotnie - o szerokim spektrum działania

jako cząsteczki ligandu. Jednak należy zwrócić szczególną uwagę na to, jak

silny rodzaj wiązania powstanie pomiędzy oczyszczanym enzymem

a ligandem, gdyż proces ten nie zajdzie efektywnie, jeśli powstałe wiązanie

będzie za słabe. W sytuacji odwrotnej, gdy powstałe wiązanie będzie zbyt

silne, niemożliwa stanie się prawidłowa elucja preparatu [20].

Wręcz idealnymi narzędziami do tworzenia ligandów w chromatografii

powinowactwa są inhibitory proteaz pochodzenia bakteryjnego i grzybowego.

Zawdzięczają to swojej wysokiej tolerancji na drastyczne zmiany wartości

pH, temperatury i siły jonowej, dzięki czemu mogą z powodzeniem


168

wytrzymywać niekorzystne warunki unieruchamiania na matrycy oraz

kilkukrotne cykle elucji.

Ciekawym przykładem oczyszczania preparatów enzymatycznych jest

oczyszczanie dwuetapowe, w którym wykorzystywane są różnice

w specyficzności działania wybranych inhibitorów. W pierwszym etapie, gdy

oczyszczamy surowy preparat zawierający białka, możemy zastosować

inhibitory proteaz o szerokim spektrum działania. Natomiast w etapie

drugim, gdy chcemy uzyskać już homogenny preparat proteazy,

wykorzystujemy jako ligand inhibitor o wysokiej specyficzności względem

oczyszczanego enzymu [4, 20, 21].

5. Podsumowanie

Przedstawiony w artykule szeroki wachlarz zastosowań inhibitorów

enzymów proteolitycznych w wielu dziedzinach przemysłu i nauki pozwala

na stwierdzenie, że są one grupą związków, które z pełnym sukcesem

wkroczyły na rynek biotechnologiczny. Ponadto badania prowadzone nad

nowymi metodami ich wykorzystania są prężnie rozwijane w wielu

placówkach naukowych. Warty podkreślenia jest jednak fakt, że aby badać

kolejne obiecujące cząsteczki inhibitorów, należy rozszerzyć badania

z wykorzystaniem nowych organizmów modelowych i dokładnie poznać

ich degradom. Praca nad tym ważnym aspektem badań z pewnością

przyczyni się do odkrycia nowych, niezwykle cennych biotechnologicznie

substancji.

Literatura

1. Garcia-Carreno F. L. Protease inhibition in theory and practice,

Biotechnology Education, 1992 vol. 3, no. 4, s. 145-150

2. Chapman H. A., Riese R. J., Shi G. Emerging roles for cysteine proteases

in human biology, Annual Review of Physiology, 1997 vol. 59, s. 63-88;

3. Grzywnowicz K., Inhibitory proteaz z grzybów jako potencjalne farmaceutyki,

Biotechnologia, 2004 vol. 3(66), s. 69-77

4. Dunaevsky Y. E., Popova V. V., Semenova T. A., Beliakova G. A.,

Belozersky M. A. Fungal inhibitors of proteolytic enzymes: Classification,

properties, possible biological roles, and perspectives for practical use,

Biochimie, 2013, s. 1-11

5. Doljak B., Cateni F., Anderluch M., Procida G., Zilic J., Zacchigna M.

Glycolipids as selective thrombin inhibitors from the fungus Stereum hirsutum,

Drug Development and Industrial Pharmacy, 2006 vol. 32, s. 635-644

6. Cateni F., Zilic J., Zacchinga, Procida G. Cerebrosides with antiproliferative

activity from Euphorbia peplis L., Fitoterapia, 2010 vol. 81, s. 97-103

7. Hibbets K., Hines B., Williams D. An overview of proteinase inhibitors,

Journal of Veterinary Internal Medicine, 1999 vol. 13, s. 302-308

,


169

8. Sabotic J., Kos J. Microbial and fungal protease inhibitors – current and

potential applications, Applied Microbiology and Biotechnology, 2012 vol.

93, s. 1351-1375

9. Rawlings N. D., Tolle D. P., Barrett A. J. Evolutionary families of peptidase

inhibitors, Biochemical Journal, 2004 vol. 378, s. 705-716

10. Rawlings N. D., Peptidase inhibitors in the MEROPS database, Biochimie,

2010 vol. 92, s. 1463-1483

11. http://merops.sanger.ac.uk/inhibitors/ (stan na dzień 8.02.2014 r.);

12. Nawrot B. Proteazy aspartylowe w chorobie Alzheimera, Szkoła Wiosenna

2005: Genetyczne podstawy chorób neurodegeneracyjnych, 2005, s. 9-17

13. Selkoe D. J., The molecular pathology of Alzheimer’s disease, Neuron, 1991

vol. 6, s. 487-498

14. Fear G., Komarnytsky S., Raskina I. Protease inhibitors and their

peptidomimetic derivatives as potential drugs, Pharmacology & Therapeutics,

2007 vol. 113, s. 354-368

15. Turk B. Targeting proteases: successes, failures and future prospects, Nature

Reviews Drug Discovery, 2006 vol. 5(9), s. 785-799

16. Farlan R., Gobec S. Inhibitors of cathepsin B, Current Medicinal Chemistry,

2006 vol. 13(19), s. 2309-2327

17. Rastogi N., Mishra D. P. Therapeutic targeting of cancer cell cycle using

proteasome inhibitors, Cell Division, 2012 vol. 7(26), s. 1-17

18. Markiewicz M., Barnyk A., Białka aktywne biologicznie obecne w soku

pokrochmalnianym, Ziemniak Polski, 2010 vol. 2, s. 1-5

19. Haq S. K., Atif S. M., Khan R. H. Protein proteinase inhibitor genes in combat

against insects, pests, and pathogens: natural and engineered phytoprotection,

Archives of Biochemistry and Biophysics, 2004 vol. 431(1), s. 145-159

20. Sabotic J., Koruza K., Gabor B., Peterka M., Barut M., Kos J., Brzin J. The

value of fungal pro tease inhibitors in affinity chromatography, Affinity

Chromatography, 2012 Chapter 15, s. 307-332

21. Gamboa A. G., Batista K. A., Lopes F. M., Fernandes K. F. The use of papain

inhibitor immobilized onto polyaniline for bioaffinity chromatography

of cysteine proteases, Separation and Purification Technology, 2013 vol. 120,

s. 467-472

http://merops.sanger.ac.uk/inhibitors/


170

Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia stosowane

w różnych dziedzinach życia

Streszczenie

Enzymy proteolityczne, pełniąc istotne funkcje metaboliczne oraz regulatorowe w organizmach żywych, wymagają odpowiedniego systemu regulacji. Jest on częściowo zapewniany dzięki

działaniu naturalnych inhibitorów proteaz. Poza pełnieniem czysto biologicznych funkcji

regulatorowych cząsteczki inhibitorów są również ciekawymi narzędziami biotechnologicznymi.

Dzięki swojej wielofunkcyjnej naturze możliwe stało się ich wykorzystanie w przemyśle medycznym i farmaceutycznym w leczeniu wielu schorzeń, zastosowanie w metodach

oczyszczania enzymów proteolitycznych oraz nawet jako środków ochrony upraw.

Kontynuując poszukiwania nowych organizmów wytwarzających cząsteczki inhibitorów

proteaz, możemy spodziewać się, że staną się one bogatym źródłem cennych biotechnologicznie substancji.

Słowa Kluczowe: inhibitory proteaz, proteazy, zastosowanie inhibitorów proteaz

Protease inhibitors as multifunctional tools used in different fields of life

Abstract

Proteases perform important metabolic and regulatory functions in living organisms and require appropriate regulatory system, which is partially ensured by natural protease

inhibitors. Protease inhibitor molecules in addition to their biological function are also

interesting biotechnological tools. Thanks to their multifunctional nature they are used

in medical and pharmaceutical industries in treating various disorders. Furthermore they are used in purification of proteolytic enzymes and during crop protection. Continuing the

search for new organisms which produce protease inhibitor molecules we can expect that

they will become a rich source of valuable biotechnological substances.

Keywords: protease inhibitors, protease, applications of protease inhibitors

171

Marta Głogowska1

Zawartość sodu i potasu

w tkankach ludzkiego przełyku

1. Wstęp

Czynność przełyku polega na transporcie pokarmu z gardła do żołądka.

Ściana przełyku nie ma zdolności wchłaniania pokarmu ani trawienia

i składa się z błony śluzowej z nabłonkiem wielowarstwowym płaskim,

utkania podśluzowego, błony mięśniowej i błony zewnętrznej. Mięśnie

w górnej 1/3 części są poprzecznie prążkowane, w dolnej występują

mięśnie gładkie. Wyściółka przełyku jest wilgotna w celu ułatwienia

przesuwania przełykanego pokarmu, a powierzchnia komórek utrzymujących

wydzielany śluz, pokryta jest fałdami [1].

Metale biogenne koncentrują się różnie w zależności od stanu zdrowia

pacjentów, co wskazuje na fakt, że mogą one odgrywać istotną rolę

w kancerogenezie. Sód jest kationem płynu pozakomórkowego, bez

którego nie byłaby możliwa prawidłowa praca błon komórkowych.

Sprawne i właściwe funkcjonowanie organizmu, zależne jest od pracy

i kondycji pojedynczych komórek, a sód jest niezastąpiony w utrzymaniu

prawidłowej gospodarki wodnej oraz gospodarki kwasowo-zasadowej

w organizmie człowieka. Pobudza on pracę wielu enzymów i ma wpływ na

przewodzenie impulsów przez neurony, stąd jego bezpośrednie działanie

na stopień, kurczliwości mięśniowej (wspomaga prawidłową pracę nerwów

i mięśni). Sód jest także jednym z istotnych składników kości i stawów,

a spożycie sodu jest ważnym elementem zdrowia publicznego, ponieważ

jego ograniczenie pozwala na zmniejszenie średniego ciśnienia tętniczego

dla całej populacji [2]. Sód odnajdziemy prawie we wszystkich produktach

spożywczych. Oprócz najprostszej postaci soli kuchennej, sód znajdziemy

głównie w gotowych i przetworzonych daniach. Stosowany, jako naturalny

środek konserwujący w największych ilościach znajduje się w żywności

wysoko przetworzonej. Produkty z wysoką zawartością sodu to, pieczywo,

sery żółte, warzywa konserwowe, przekąski (paluszki, chipsy, orzeszki

ziemne solone), gotowe przyprawy, wędliny i wyroby mięsne [2]. Potas

natomiast jest naturalnym składnikiem większości produktów

spożywczych. Jego najważniejszymi źródłami są warzywa i owoce.

1 [email protected], Uniwersytet Pedagogiczny w Krakowie, Wydział Geograficzno-Biologiczny, Zakład

Zoologii Kręgowców i Biologii Człowieka, www.wsp.krakow.pl;

http://pl.wikipedia.org/wiki/Pokarm

http://pl.wikipedia.org/wiki/Wch%C5%82anianie_pokarmu

http://pl.wikipedia.org/wiki/Trawienie

http://pl.wikipedia.org/wiki/B%C5%82ona_%C5%9Bluzowa

http://pl.wikipedia.org/wiki/Mi%C4%99sie%C5%84_poprzecznie_pr%C4%85%C5%BCkowany

http://pl.wikipedia.org/wiki/Tkanka_mi%C4%99%C5%9Bniowa_g%C5%82adka


http://www.wsp.krakow.pl/

Marta Głogowska

172

W organizmie znajduje się przede wszystkim wewnątrz komórek. Spełnia

wiele funkcji fizjologicznych i bierze udział w podobnych procesach jak

sód, spełniając funkcję dopełniającą. Zatem równowaga pomiędzy sodem

i potasem w organizmie jest kluczowa dla jego prawidłowego funkcjo-

nowania [3].

W regulacji ciśnienia tętniczego krwi podstawowe znaczenie odgrywa

zdolność nerek do wydalania lub zatrzymywania sodu [3]. Większość

badań pokazuje, że ograniczenie spożycia sodu wiąże się z obniżeniem

wartości ciśnienia tętniczego a ten efekt jest największy u osób z wysokim

ciśnieniem tętniczym, otyłych i w starszym wieku, jednak odpowiedź

organizmu na ograniczenie spożycia sodu jest zmienna osobniczo i może

nie prowadzić do istotnego obniżenia ciśnienia u osób z prawidłowym

ciśnieniem tętniczym. Z kolei wysokie spożycie potasu wpływa na

obniżenie ciśnienia tętniczego, co może być spowodowane zdolnością

potasu do zwiększenia wydalania sodu przez nerki oraz bezpośrednim

wpływem naczyniorozkurczowym potasu. Okazuje się, że otyłość, niska

aktywność fizyczna oraz niskie spożycie potasu ma większy wpływ na

wartości ciśnienia tętniczego niż wysokie spożycie sodu. Duże stężenie

sodu w organizmie zakłóca pracę nerek i w efekcie końcowym powoduje

ich uszkodzenie. Negatywnie wpływa na osoby cierpiące na cukrzycę.

Wywołuje ponadto dolegliwości ze strony wątroby, uczucie znużenia,

zmęczenia i ospałości [4‚10].

2. Cel Pracy

Badania przeprowadzono w celu stwierdzenia wzajemnego stosunku

metali biogennych (sodu i potasu) w tkankach ludzkiego przełyku. Coraz

częściej stwierdza się podwyższony poziom tych pierwiastków u człowieka,

co niesie za sobą konsekwencje zdrowotne. Nie do końca określone jest

jednak stężenie kationów Na+ i K

+ w przełyku, co może być istotną

informacją, wskazującą na prawidłowość działania pomp sodowo

– potasowych w tym narządzie.

3. Materiał i metody

Badaniom poddano próbki ludzkich tkanek pochodzących z przełyku

(n= 24 próbki). Niezmienione patologicznie, zdrowe tkanki przełyku

pobierano w trakcie sekcji zwłok od kobiet i mężczyzn w wieku (20-90 lat),

a średnia waga każdego wycinka wynosiła 0,5-2 g. Materiał pozyskiwany

był przez wyspecjalizowanego w tym zakresie patomorfologa, który

bezpośrednio po pobraniu niezmienionej morfologicznie tkanki, umieszczał

ją w sterylnej, polietylenowej probówce o pojemności 11 cm3, a następnie

wkładał do zamrażarki o ustalonej temperaturze -20C. Materiał do badań

,

Zawartość sodu i potasu w tkankach ludzkiego przełyku

173

pochodził od osób z Krakowa i okolic i był bezpośrednio odbierany

z Zakładu Patomorfologii 5 Wojskowego Szpitala Klinicznego z Polikliniką

w Krakowie. Na badania uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy

Okręgowej Izbie Lekarskiej w Krakowie (opinia nr 46/KBL/OIL/2012).

W celu określenia w badanym materiale zawartości sodu i potasu,

zastosowano metodę mineralizacji na mokro z użyciem stężonego kwasu

azotowego (V) 65%, który jest silnym kwasem utleniającym,

umożliwiającym całkowity rozkład substancji do prostych, stałych związków

nieorganicznych. Technika przeprowadzona zastała w mineralizatorze

VELP Scientifica DK20. Wysuszony materiał był przenoszony do

szklanych żaroodpornych kolb i zalewany 2 ml stężonego kwasu

azotowego (V). Mineralizacja odbywała się w temperaturze 100C i trwała

ok. 6 godzin. Otrzymane mineralizaty zlewano do polietylenowych

probówek o pojemności 5 cm3, uzupełniano wodą destylowaną i szczelnie

zamykano korkiem.

Uzyskane po mineralizacji roztwory posłużyły do analizy zawartości

wybranych pierwiastków metodą płomieniowej spektrofotometrii

absorpcyjnej (FAAS) przy użyciu spektrofotometru BUCK 200A firmy

Cole-Parmer (Fot. 1), z użyciem płomienia acetylenowo-powietrznego

i odpowiednich lamp z katodą wnękową (HCL).

Rys. 1. Spektrofotometr BUCK 200A [opracowanie własne]

Zasada działania ASA polega na wprowadzeniu rozpylonej próbki

do płomienia, a następnie, w wyniku przemian fizyko – chemicznych,

doprowadzeniu analitu do postaci wolnych atomów, na które kierowane

jest promieniowanie elektromagnetyczne generowane przez lampę z katodą

wnękową, które jest absorbowane przez wolne atomy analitu zgodnie

z regułami Kirchhoffa - Bunsena. W ten sposób zmierzono absorbancję dla

sodu i potasu. Wartości absorbancji przeliczono na zawartość metali

Marta Głogowska

174

w roztworach otrzymanych po mineralizacji, na podstawie krzywej

kalibracyjnej wyznaczonej dla roztworów wzorcowych z wykorzystaniem

specjalnego oprogramowania. Otrzymane wyniki przeliczono, podając

zawartość analitów w mikrogramach danego metalu na gram suchej masy

tkanki (µg•g-1

s.m.).

4. Analiza wyników badań

Średnia zawartość sodu w tkankach przełyku osiągnęła wartość

2276,806±320,618 µg•g-1

s.m., natomiast średnia zawartość potasu

w tkankach przełyku jest dużo niższa i wynosi 1143,237±39,545 µg•g-1

s.m.

Omówione wyniki przedstawiono na wykresie 1. Ponadto analiza korelacji

Pearsona nie wykazała istnienia zależności pomiędzy omawianymi

pierwiastkami w tkankach przełyku.

Wykres 1. Średnia zawartość sodu w przełyku kobiet i mężczyzn

Tkanki pozyskane z przełyku kobiet i mężczyzn, przyporządkowano

dodatkowo do dwóch grup wiekowych: 20-50 lat (pacjenci młodsi) oraz

51-90 lat (pacjenci starsi). Średnia zawartość sodu w przełyku kobiet

mających 20-50 lat wyniosła 3009,876±9,815 µg•g-1

s.m. U kobiet

mających 51-90 lat średnia zawartość sodu była niższa i wyniosła

2141,273±604,866 µg•g-1

s.m. Średnia zawartość sodu u mężczyzn

mających 20-50 lat wyniosła 1611,952±14,030 µg•g-1

s.m. U mężczyzn

mających 51-90 lat średnia zawartość sodu była nieco wyższa i wyniosła

2363,492±616,991 µg•g-1s.m. Omówione wyniki zilustrowano na wykresie 2.

PRZEŁYK

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

śód potas

g

•g-1

s.m

.

,


175

Wykres 2. Średnia zawartość sodu w przełyku kobiet i mężczyzn

Średnia zawartość potasu u kobiet mających 20-50 lat wyniosła

713,530±14,393 µg•g-1

s.m. U kobiet mających 51-90 lat średnia zawartość

potasu była znacznie wyższa i wyniosła 2172,465±1223,357 µg•g-1

s.m.

U mężczyzn mających 20-50 lat, średnia zawartość potasu była niska

i wyniosła 573,812±25,129 µg•g-1

s.m., z kolei u mężczyzn mających 51-90

lat poziom potasu wyniósł 1128,540±545,596 µg•g-1

s.m. Omówione wyniki

zilustrowano na wykresie 3.

Wykres 3. Średnia zawartość potasu w przełyku kobiet i mężczyzn

ZAWARTOŚĆ SODU W TKANKACH PRZEŁYKU

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

kobiety 20-50 kobiety 51-90 mężczyźni 20-50 mężczyźni 51-90

g

•g-1

s.m

.

ZAWARTOŚĆ POTASU W TKANKACH PRZEŁYKU

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

kobiety 20-50 kobiety 51-90 mężczyźni 20-50 mężczyźni 51-90

g

•g-1

s.m

.

Marta Głogowska

176

5. Wnioski

Przełyk jest narządem nie zaangażowanym w czynną absorpcję

elektrolitów [11], jednak otrzymane wyniki (2276,806 µg•g-1

s.m.)

wskazują, na wysoką zawartość sodu w jego śluzówce. Niższą wartość

(1700,158 µg•g-1

s.m. sodu) otrzymano w badaniach z 2012 roku [12].

Średnia zawartość potasu w przełyku (1143,237 µg•g-1

s.m.) jest dużo

niższa, niż zawartość sodu. Podobną wartość (1308,872 µg•g-1

s.m.)

otrzymano w innej pracy [12]. Jony Na+ i cząsteczka ATP przyłączają się

do pompy sodowo-potasowej, a hydroliza ATP powoduje zmianę struktury

białka i transport jonów Na+ na drugą stronę błony, po której przyłączane

są jony K+. Następuje uwolnienie jonów Na

+ i przetransportowanie jonów

K+ na drugą stronę. W ten sposób pompa sodowo-potasowa wytwarza

gradient jonowy, który pełni w komórce bardzo ważną rolę, gdyż

kontroluje jej objętość [13]. Z przeprowadzonych badań wynika, że

w tkankach przełyku więcej jest sodu niż potasu, z kolei zgodnie z zasadą

działania pompy sodowo – potasowej sytuacja powinna być odwrotna.

Wyniki sugerują, że wzrost średniej koncentracji jonów Na+ wewnątrz

komórek może być związany z nadmiernym spożyciem sodu i zaburzeniem

homeostazy wewnątrzustrojowej.

Literatura

1. Bochenek A., Reicher M. Anatomia człowieka, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2010, s.150-151

2. Pohl H.R., Wheeler J.S., Murray H.E. Sodium and potassium in health and disease, 2013; (13), s.29-47

3. Geleijnse J.M., Kok F.J., Grobbee D.E. Blood pressure response to changes in sodium and potassium intake: a metaregression analysis of randomised trials, Journal of Human Hypertension, 2003; (17), s. 471-480

4. Geleijnse J.M., Kok F.J., Grobbee D.E. Impact of dietary and lifestyle factors on the prevalence of hypertension in Western populations, European Journal of Public Health, 2004; (14), s. 235-239

5. Dietary reference intakes for water, potassium, sodium, chloride, and sulfate, 2004 6. Sacks F.M., i in. Effects on blood pressure of reduced dietary sodium

and the dietary approaches to stop hypertension (DASH) diet, New England Journal of Medicine, 2001; (344), s. 3-10

7. U.S. Department of Health and Human Services, 7th Report of the US Joint National Committee on prevention, Detection Evaluation, Treatment of Hypertension, JNC 7 Express, 2003; s. 8

8. Bertino M., Beauchamp G.K., Engelman K., Long-term reduction in dietary sodium alters the taste of salt, American Journal of Clinical Nutrition, 1982; (36), s.1134-1144

9. Blais, C.A., et al., Effect of dietary sodium restriction on taste responses to sodium chloride: a longitudinal study, American Journal of Clinical Nutrition, 1986; (44), s. 232-243

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pohl%20HR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24470088

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wheeler%20JS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24470088

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Murray%20HE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24470088

,


177

10. Geleijnse J.M., Grobbee D.E., Kok, F.J. Impact of dietary and lifestyle factors on the prevalence of hypertension in Western populations, Journal of Human Hypertension, 2005; (19), s. 1-4

11. Lachowicz L. Czynność układu trawiennego. Fizjologia-podstawy fizjologii lekarskiej, Warszawa. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1994; s. 565-578

12. Głogowska M. Zawartość sodu i potasu w komórkach ludzkiego przełyku, żołądka, jelita cienkiego i jelita grubego u pacjentów krakowskich szpitali, Badania w dydaktykach nauk przyrodniczych, 2012; s. 32-35

13. Stryer L. Biochemia, Warszawa, Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003


Streszczenie Przełyk transportuje pokarm do żołądka, jednak nie zachodzi w nim wchłanianie. Sód jest kationem płynu pozakomórkowego, bez którego nie byłaby możliwa prawidłowa praca błon komórkowych. Potas w organizmie znajduje się przede wszystkim wewnątrz komórek. Spełnia wiele funkcji fizjologicznych i bierze udział w podobnych procesach jak sód, spełniając funkcję dopełniającą, zatem równowaga pomiędzy sodem i potasem w organizmie jest kluczowa dla jego prawidłowego funkcjonowania. Badania przeprowadzono w celu stwierdzenia wzajemnego stosunku metali biogennych (sodu i potasu) w tkankach ludzkiego przełyku. Coraz częściej stwierdza się podwyższony poziom tych pierwiastków u człowieka, co niesie za sobą konsekwencje zdrowotne. Badaniom poddano próbki ludzkich tkanek pochodzących z przełyku (n=24 próbki), które pobierano w trakcie sekcji zwłok od kobiet i mężczyzn w wieku 20-90 lat. Zawartość badanych pierwiastków określono za pomocą metody spektrofotometrycznej płomieniowej (ASA). Średnia zawartość sodu w tkankach przełyku wynosi 2276,806 µg•g-1s.m., natomiast średnia zawartość potasu jest dużo niższa i wynosi 1143,237 µg•g-1s.m. Badania wskazują na brak równowagi kationów Na+ i K+ w tkankach przełyku, a wzrost średniej koncentracji jonów Na+ wewnątrz komórek może być związany z nadmiernym spożyciem sodu i zaburzeniem homeostazy wewnątrzustrojowej. Słowa kluczowe: sód, potas, przełyk, ASA

The content of sodium and potassium in human esophagus tissues

Abstract Esophagus translocates food to the stomach but does not occur in the absorption. Sodium is a cation of the extracellular fluid, without which it would be not possible properly work of the cell membranes. Potassium in the body is found primarily intracellularly and performs many physiological functions and is involved in similar processes as sodium, functioning as complementary, so the balance between sodium and potassium in the body is essential for its proper functioning. The study were performed to determine the relationship between biogenic metals (sodium and potassium) in the tissues of human esophagus. Increasingly found elevated levels of these elements in man, which have health consequences. The study involved a samples from human esophagus tissues (n=24 samples), which were taken during the autopsy from women and men (20-90 years). The average content of the analyzed elements was determined by Atomic Absorption Spectrometry method (ASA). The average content of sodium in esophagus tissues is 2276.806 µg•g-1d.m., while the average content of potassium is much lower (1,143.237 µg•g-1d.m.). Studies indicate to imbalance between cations Na+ and K+ in the tissues of the esophagus, and the increase of the average concentration of Na+ inside cells may be associated with excessive intake of sodium and disorder of intrasystemic homeostasis. Keywords: sodium, potassium, esophagus, ASA

http://www.mendeley.com/research/zawarto%C5%9B%C4%87-sodu-i-potasu-w-kom%C3%B3rkach-ludzkiego-prze%C5%82yku-%C5%BCo%C5%82%C4%85dka-jelita-cienkiego-i-jelita-grubego-u-p-3/

http://www.mendeley.com/research/zawarto%C5%9B%C4%87-sodu-i-potasu-w-kom%C3%B3rkach-ludzkiego-prze%C5%82yku-%C5%BCo%C5%82%C4%85dka-jelita-cienkiego-i-jelita-grubego-u-p-3/

178

Kamila Wlizło1, Jolanta Polak


1

Lakaza – niebieski enzym

dla kolorowej biotechnologii

1. Wprowadzenie

Metody biotechnologiczne są stosowane w codziennym życiu od tysięcy

lat. Współczesna biotechnologia znalazła zastosowanie w wielu obszarach

przemysłowych a jej zakres jest tak szeroki, że podzielono ją na

odpowiednie grupy skupiające określone dziedziny nauki i przemysłu.

Biotechnologia czerwona, obejmuje procesy związane z produkcją

nowych biofarmaceutyków, rozwojem diagnostyki genetycznej, genoterapii

i ksenotransplantologii; biotechnologia zielona, odnosi się do inżynierii

genetycznej stosowanej w celu doskonalenia produkcji roślinnej

i zwierzęcej; najszerszą grupę stanowi biotechnologia biała określana też

mianem biotechnologii przemysłowej. Procesy białej biotechnologii są

stosowane w wielu gałęziach przemysłu i są oparte na zastosowaniu

bioprocesów i biokatalizy [1]. Przykładem biokatalizatorów, które mogą

zainteresować wiele dziedzin przemysłu są lakazy [EC 1.10.3.2], enzymy

zaliczane do klasy oksydoreduktaz. Lakazy są znane ze swojej bardzo

niskiej specyficzności substratowej i przez to mogą stanowić alternatywę

dla stosowanych obecnie procesów syntezy, obniżając koszty produkcji

i zmniejszając szkodliwe oddziaływanie przemysłu, przede wszystkim

chemicznego, na środowisko naturalne [2].

2. Występowanie i funkcje lakaz w przyrodzie

2.1. Lakazy roślinne

Pierwszym gatunkiem roślin wyższych, gdzie stwierdzono obecność

lakazy było drzewo lakowe Rhus vernicifera a pierwsza praca na ten temat

została opublikowana w 1883 [3]. Oprócz tego, istnieją doniesienia

o gatunkach roślin, w których nie tylko wykazano obecność lakaz, ale

również stwierdzono jej występowanie w postaci kilku izoform. Przykła-

dami takich roślin są między innymi sosna taeda (Pinus taeda), gdzie

stwierdzono obecność aż ośmiu izoform lakazy, oraz topola (Populus

1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie- Skłodowskiej, Wydział Biologii

i Biotechnologii, Zakład Biochemii, http://fungi.umcs.lublin.pl/w_pl/;


http://fungi.umcs.lublin.pl/w_pl/

,

Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii

179

trichocarpa), w której ksylemie wykazano ekspresję pięciu form tego

enzymu [4]. Dodatkowo, dane literaturowe wskazują na występowanie

w przyrodzie gatunków roślin, wytwarzających oksydazy miedziowe, które

są bardzo podobne do lakaz. Do najbardziej znanych tego typu gatunków

roślin należą tytoń szlachetny (Nicotiana tabacum), klon jawor (Acer

pseudoplatanus) oraz kukurydza zwyczajna (Zea mays) [5].

Funkcją wszystkich lakaz roślinnych, bez względu na gatunek, jest jej

udział w wieloenzymatycznym układzie, związanym z syntezą ligniny

w komórkach drewna. W procesie tym, lakazy wspólnie z innymi enzymami

oksydoredukcyjnymi - peroksydazami, zaangażowane są w łączenie

monomerów tzw. monolignoli, którymi są alkohole: p-kumarylowy,

koniferylowy i synapinowy, w dimery homomolekularne, zawierające

wiązania węgiel - węgiel lub węgiel - tlen, które w dalszych etapach mogą

być sprzęgane do oligomerów i polimerów ligninowych [4,6]. Nie jest to

jedyny proces, w którym uczestniczą lakazy, ponieważ biorą one także

udział w procesach związanych z naprawą uszkodzonych fragmentów

tkanek roślinnych [7].

Lakazy roślinne są glikoproteidami zewnątrzkomórkowymi, wydzielanymi

do apoplastu, co możliwe jest dzięki obecności w ich strukturze fragmentu

węglowodanowego. Stanowi on od 22% do 45% cząsteczki enzymu

i najczęściej zbudowany jest z mannozy, N-acetyloglukozaminy i galaktozy,

natomiast jego główną funkcją jest utrzymywanie aktywności enzymu

poprzez ochronę cząsteczki przed enzymami proteolitycznymi a także

utrzymywanie jego stabilności termicznej [8].

2.2. Lakazy grzybowe

Pierwsza praca dotycząca lakaz grzybowych została opublikowana

w 1896 roku [9]. Większość opublikowanych prac, opisujących lakazy

grzybowe, dotyczy gatunków ligninolitycznych, wywołujących białą

zgniliznę drewna. Przede wszystkim są to szczepy należące do typu

podstawczaków (Basidiomycota), między innymi Trametes versicolor,

Trametes gallica, Trametes villosa, Lentinula edeodes, Pleurotus ostreatus

[5,9], Trametes hirsute [10] czy Cerrena unicolor [11]. Istnieją również dane

literaturowe na temat występowania lakaz u gatunków należących do typu

workowców (Ascomycota), jak na przykład Myceliophotra thermofila czy

Chaetomium termophilum [12,13].

W przeciwieństwie do roślin, główną funkcją lakaz grzybowych jest

degradacja kompleksu ligninowego drewna zarówno drogą enzymatyczną,

jak i nieenzymatyczną, dostarczając tym samym niezbędnych grzybom

makroelementów [7]. Lakazy grzybowe, podobnie jak lakazy roślinne,

są glikoproteidami zewnątrzkomórkowymi, zawierającymi w swojej

Kamila Wlizło, Jolanta Polak, Anna Jarosz- Wilkołazka

180

strukturze komponent cukrowy. Stanowi on od 10% do 25% cząsteczki

enzymu i chroni ją przed działaniem proteaz, co ważne jest ze względu na

udział lakaz grzybowych w procesie patogenezy roślin. Ponadto w cyklu

rozwojowym grzybów enzym ten jest zaangażowany w proces

morfogenezy, pigmentacji oraz tworzenia zarodników [14,15].

2.3. Lakazy bakteryjne

Szerokie występowanie lakaz w przyrodzie obejmuje również

organizmy prokariotyczne. Podobnie jak u grzybów, lakazy wytwarzane

przez bakterie mogą mieć formę monomeru lub oligomeru [13]. Pierwszą

bakterią, u której stwierdzono obecność lakazy jest szczep Azospirillum

lipoferum, gdzie enzym zaangażowany jest w proces melanizacji [16, 17].

Z kolei w przypadku szczepu Bacillus subtilis i Anabaena azollae,

wytwarzane lakazy związane są z procesami pigmentacji endospor i tym

samym biorą udział w ich ochronie przed promieniami UV [5].

Lakazy wytwarzane przez organizmy prokariotyczne są enzymami

wewnątrzkomórkowymi, dlatego też nie posiadają w swojej strukturze

komponentu węglowodanowego, ale w przeciwieństwie do lakaz

grzybowych, enzymy bakteryjne wykazują większą stabilność w wysokich

wartościach temperatury czy pH [5].

3. Charakterystyka lakaz grzybowych

3.1. Budowa molekularna

Lakazy grzybowe są glikoproteidami mogącymi występować

jako monomery, dimery lub oligomery, a ich masa cząsteczkowa może

wahać się od 60 kDa do 100 kDa [15]. O ile masa cząsteczkowa czy

elementy struktury jak komponent węglowodanowy, są różne w zależności

od źródła określonej lakazy, tak cecha charakterystyczna lakaz jaką jest ich

centrum aktywne, wydaje się być strukturą dość konserwatywną [4].

W skład centrum aktywnego lakazy grzybowej wchodzą cztery atomy

miedzi (II) (Rys. 1.), należące do trzech typów - typ 1 (T1), typ 2 (T2) oraz

dwa atomy miedzi typu 3 (T3), różniące się między innymi cechami

spektroskopowymi [18].

W formie utlenionej, atom T1, wykazuje maksimum absorbancji

przy długości fali 610 nm, przez co nadaje lakazom charakterystyczną,

niebieską barwę. Jest ona wynikiem kowalencyjnego wiązania pomiędzy

atomem miedzi a resztą cysteiny znajdującej się w centrum aktywnym

enzymu [19]. Atom miedzi T1 wiąże się także za pomocą wiązań

koordynacyjnych z dwoma resztami histydyny i jedną resztą metioniny [5],

a także charakteryzuje się wysokim potencjałem oksydoredukcyjnym

,


181

(+790 mV) w wyniku, czego stanowi on miejsce utleniania substratu [20].

Dodatkowo analiza spektroskopowa elektronowego rezonansu magnetycznego

(EPR) wykazała aktywności paramagnetyczne atomu miedzi T1 [19].

Rys. 1. Cząsteczka lakazy z Coriolus zonatus oraz jej centrum aktywne [18]

Podobne wyniki otrzymano w przypadku atomu miedzi T2, który

wykazuje aktywności paramagnetyczne, nie wykazując natomiast

absorbancji w świetle widzialnym. Atom ten zlokalizowany jest blisko

atomu miedzi T3, który z kolei w utlenionej formie wykazuje maksimum

absorbancji przy długości fali 330 nm, jednakże obecność mostka

hydroksylowego pomiędzy dwoma atomami miedzi T3 skutkuje brakiem

sygnału EPR [13].

Zarówno atom miedzi T2 jak i dwa atomy miedzi T3 pełnią ważną rolę

w aktywności katalitycznej lakaz, tworząc tzw. trójatomowy klaster T2/T3, który

jest miejscem wiązania i redukcji tlenu cząsteczkowego do wody [19, 21].

3.2. Mechanizmy reakcji katalizowanych przez lakazy

Ogólny mechanizm reakcji katalizowanych przez lakazy, zakłada

wytwarzanie produktu poprzez utlenienie czterech cząsteczek substratu

do rodników i zredukowania jednej cząsteczki tlenu do dwóch cząsteczek

wody [8]. Proces ten może odbywać się trzema drogami: w bezpośrednim

utlenianiu substratu (2.2.1.), w pośrednim utlenianiu substratu z udziałem

mediatora (2.2.2.) i poprzez reakcję sprzęgania (2.2.3.).


182

3.2.1. Bezpośrednie utlenianie substratu

Reakcje bezpośredniego utlenienia substratu są najprostsze spośród

trzech wyróżnianych typów i przebiegają zgodnie z ogólnym opisem

mechanizmu reakcji katalizowanej przez lakazę. Zredukowany substrat jest

utleniany przy udziale miedzi T1 z centrum aktywnego enzymu a powstałe

elektrony są przekazywane następnie z atomu miedzi T1 do klastra T2/T3,

gdzie dochodzi do redukcji tlenu cząsteczkowego do wody [5] (Rys. 2).

Rys. 2. Schemat bezpośredniego utlenienia substratu przez lakazę; na podstawie [20]

Transformacjom w wyniku bezpośredniego utlenienia substratu ulegają

proste związki organiczne takie jak fenole, oraz ich pochodne zawierające

grupy aminowe, metoksylowe, karboksylowe czy sulfonowe [20].

3.2.2. Utlenianie substratu z udziałem mediatora

Drugi typ katalizowanych reakcji (tzw. LSM – ang. Laccase-Mediator-

System) przebiega z udziałem mediatora i dotyczy substratów, które mają

zbyt duży potencjał oksydoredukcyjny w porównaniu do potencjału lakazy,

lub są za duże, aby dopasować się do jej centrum aktywnego. W takich

sytuacjach stosuje się tzw. mediatory czyli niskocząsteczkowe związki,

pośredniczące pomiędzy enzymem a utlenianym substratem. Mediatory

posiadają specyficzne grupy funkcyjne (-NO, -NOH) a do najbardziej

znanych mediatorów zalicza się sól diamonową 2,2’-azyno-bis

[3-etylbenzotiazoliny-6-kwasu sulfonowego] (ABTS) i hydroksy-

benzotriazol (HBT) [3, 18].

Tego typu reakcja odbywa się dwuetapowo. Początkowo, związkiem

utlenianym przez enzym jest mediator, który w kolejnym etapie utlenia

substrat a równocześnie ulega redukcji [20].

Rys. 3. Schemat utlenienia substratu z udziałem mediatora; na podstawie [20]

Stosowanie mediatorów znacznie poszerza zakres potencjalnych substratów

utlenianych przez lakazy. Dzięki tym związkom istnieje szansa na

,


183

zastosowanie mechanizmu LMS w takich dziedzinach przemysłu, jak

delignifikacja i wybielanie pulpy drzewnej, usuwanie ksenobiotyków ze

środowiska, w tym policyklicznych węglowodorów aromatycznych (PAH)

i innych zanieczyszczeń trudnych do usunięcia tradycyjnymi metodami, jak

również w syntezie organicznej [8, 18].

3.2.3. Reakcja sprzęgania

Ostatni typ reakcji katalizowanych przez lakazę stanowią reakcje

sprzęgania. Mechanizm tych reakcji jest bardzo podobny do

bezpośredniego utleniania substratów, z tą różnicą, że powstające w reakcji

rodniki są niestabilne i ulegają spontanicznym reakcjom

nieenzymatycznego sprzęgania tworząc dimery, oligomery jak również

polimery, które stanowią produkty reakcji w postaci nowych struktur

fenolowych [20].

Rys. 4. Schemat utlenienia substratu z wytworzeniem wysoko reaktywnych

intermediatów w czasie reakcji sprzęgania; na podstawie [20]

Powstające struktury łączą się przez wytworzenie wiązań węgiel - węgiel,

węgiel - tlen, węgiel - azot lub azot - azot, przy czym reakcje te zachodzą

w łagodnych warunkach. Sprawia to, że reakcje sprzęgania są obiektem

zainteresowań ze strony przemysłu, jako potencjalna alternatywa pozwalająca

na obniżenie kosztów prowadzonych procesów z zachowaniem wydajności

i przy jednoczesnym zmniejszeniu szkodliwych oddziaływań na środowisko

naturalne [2].

4. Możliwość zastosowania reakcji katalizowanych przez lakazy

w przemyśle

Lakazy mogą prowadzić utlenianie szerokiej gamy substratów od

związków fenolowych, w tym naturalnie występujących flawonoidów

[10,22], przez niskocząsteczkowe pochodne benzenowe i poliaminy, po

związki niefenolowe, wymagające obecności mediatora w czasie ich

utleniania [18,23]. Tak niska specyficzność substratowa lakaz, wpływa na

wysokie zainteresowanie tymi enzymami przez wiele gałęzi przemysłu,

zaczynając od przemysłu papierniczego, poprzez spożywczy i tekstylny,

kończąc na przemyśle farmaceutycznym i związanym z biosensorami [24].

W dalszej części pracy przedstawionych zostanie kilka najważniejszych


184

dziedzin przemysłu, gdzie zastosowanie lakaz jest intensywnie badane lub

nawet wdrożone w ramach wprowadzania metod biotechnologicznych.

4.1. Przemysł papierniczy

Popularyzacja zachowań pro-ekologicznych zakłada wykorzystywanie

surowców wtórnych, co dotyczy również przemysłu papierniczego

i produkcji papieru makulaturowego, co przyczynić ma się do zwiększenia

ochrony środowiska naturalnego. Niemniej jednak, produkcja wysokiej

jakości papieru, wymaga pozyskania podstawowego do tego celu surowca,

jakim jest celuloza pochodząca z drewna. Główną przeszkodą w procesie

pozyskiwania celulozy jest zawarta w ścianie komórkowej roślin i trudna

do rozłożenia, lignina [25]. Tradycyjnie stosowane metody, mające na celu

usunięcie ligniny, wykorzystują agresywne substancje jak między innymi

ług warzelny, czy związki chloru będące źródłem zanieczyszczeń

środowiska naturalnego [3,26]. Mniejsza emisja zanieczyszczeń

towarzyszy mechanicznej delignifikacji drewna, co więcej, ilość masy

otrzymanej w tym procesie jest niemal dwukrotnie większa od tej

otrzymanej w metodach chemicznych. Niemniej jednak jest to proces

kosztowny, wymagający dużego nakładu energii, a papier otrzymany w

jego wyniku posiada gorsze właściwości mechaniczne, w porównaniu do

papieru otrzymanego w chemicznej delignifikacji [5].

Istnieje wiele danych literaturowych podających, że lakazy mogą

z powodzeniem przeprowadzać zarówno proces delignifikacji jak

i wybielania otrzymanej pulpy drzewnej w warunkach przyjaznych dla

środowiska [4,6,27,28]. Pozwala na to aktywność ligninolityczna, którą

w naturze obserwuje się w przypadku wady drewna, jaką jest biała zgnilizna.

Wada ta powstaje na skutek rozkładu ligniny, celulozy i hemicelulozy przez

grzyby ligninolityczne. W końcowej fazie rozkładu, w komórkach drewna

pozostaje więcej białej celulozy niż brązowej ligniny (Rys. 5.).

Rys. 5. Drewno rozkładane w procesie białej zgnilizny drewna [29]

,


185

Co więcej niektóre badania donoszą, że stosowanie lakaz poprawia

właściwości mechaniczne otrzymywanego papieru. Cały proces odbywa się

z udziałem mediatorów jak na przykład kwasy fenolowe [13] czy kwas

3-hydroksyantranilowy, jak w przypadku lakazy ze szczepu Pycnoporus

cinnabarinus [27].

Dodatkowo, w niektórych pracach pojawiają się informacje o powstających

dwóch obszarach badań dotyczących produktów przemysłu drzewnego.

Pierwszy dotyczy projektowania materiałów ligninocelulozowych zawiera-

jących komponenty fenolowe, tzw. funkcjonalizacja włókien celulozy

i wykazujących nowe właściwości związane z odpornością i stabilnością

oraz wykorzystania lakaz do poprawy stopnia zwartości drewnianych

elementów przez sprzęganie enzymatyczne ligniny in situ, bez

wykorzystania toksycznych klejów zawierających formaldehyd [18].

4.2. Synteza barwnych produktów

Część reakcji katalizowanych przez lakazy związana jest z wytworzeniem

niestabilnych intermediatów, które na drodze nieenzymatycznej tworzą

barwne produkty [20]. Znaczna część tych produktów może zostać

wykorzystywana przez przemysł tekstylny do barwienia włókien

naturalnych jak celuloza, włókna lniane czy wełna, ale także sztucznych

materiałów jak poliamid czy poliester. Barwienie tego typu materiałów

barwnikami syntetyzowanymi przy udziale lakazy, zostało opatentowane

przez duńską firmę Novo Nordisk, która dodatkowo opatentowała

barwienie włókien keratynowych, w tym włosów. Novo Nordisk nie jest

jedyną firmą na rynku, posiadającą tego rodzaju patent. Patenty przyznano

również takim znanym koncernom jak L’Oreal, Wella czy Henkel [7].

Niemniej jednak prace nad poszukiwaniem nowych prekursorów

i tworzeniem nowych barwników nie ustają, czego dowodem są ciągle

ukazujące się prace na ten temat.

Synteza barwników z udziałem lakazy stanowi realną alternatywę dla

stosowanych obecnie sztucznych barwników. Synteza z zastosowaniem

biokatalizatora odbywa się w łagodnych warunkach w środowisku

wodnym, bez stosowania toksycznych substancji, jest przy tym ekono-

miczna, a otrzymane produkty są przyjazne dla środowiska naturalnego [11].

Z pomocą lakaz otrzymywane są barwniki, wśród których możemy

wyróżnić barwniki azowe, zawierające w swojej strukturze podwójne

wiązanie pomiędzy dwoma atomami azotu oraz barwniki fenoksazynowe,

charakteryzujące się obecnością szkieletu fenoksazynowego. Innego

rodzaju barwniki określa się ogólnie, jako barwniki fenolowe lub

niefenolowe i są one syntetyzowane z prostych fenolowych bądź


186

niefenolowych prekursorów, głównie pochodnych o-, m-, p-hydroksylowych,

metoksylowych, aminowych oraz sulfonowych [7].

Część barwnych polimerów z powodzeniem syntetyzowana jest w homo-

lub heteromolekularnych transformacjach z naturalnie występujących fenoli

jak kwas galusowy, syryngowy, ferulowy, a także katechina czy katechol [21,

30]. Uzyskano w ten sposób barwniki głównie w odcieniach brązu i czerwieni

(Rys. 7.) [30].

Rys. 6. Barwniki uzyskane w procesie heterotransformacji kwasu galusowego i

syryngowego (d), katechiny i katecholu (e), kwasu ferulowego i syryngowego (f).

Płytki a-c stanowią odpowiednie kontrole prekursorów bez dodatku lakazy [30]

Dużą zaletą uzyskanych barwników oprócz koloru, jest ich zdolność

do barwienia włókien keratynowych (Rys. 8.) co jest cechą pożądaną

w przypadku produkcji farb do włosów [30].

Rys. 7. Włókna keratynowe niebarwione (a) oraz barwione produktami

heterotransformacji kwasu gallusowego i syryngowego (b), katechiny i katecholu

(c) oraz kwasu ferulowego i syryngowego (d) [30]

,


187

Innymi badanymi naturalnymi prekursorami są również takie flawonoidy

jak kwercetyna i moryna [10] oraz rutyna [22]. Jednakże powstające

w homomolekularnych transformacjach ciemne barwniki koloru brązowego

mogą być wykorzystane głównie przez przemysł tekstylny [10, 22,30].

Barwne produkty otrzymane przy udziale lakazy wykazują dobre

właściwości barwiące w stosunku do materiałów tekstylnych pochodzenia

naturalnego takich jak len [10] czy wełna (Rys. 8.) [20].

Rys. 8. Porównanie barwników syntetyzowanych w hodowlach płytkowych i ich

kolorów po zabarwieniu próbek wełnianych [opracowanie własne]

Wzmocnienie efektu barwiącego oraz skrócenie procesu barwienia

i syntezy barwnika, można uzyskać poprzez syntezę barwników in situ.

Proces ten polega na dodaniu do włókien celulozowych lakazy jako

biokatalizatora oraz określonego prekursora stosowanego do syntezy

konkretnego barwnika, na przykład 2,5-DABS [31] czy katechol [32].

Takie wykorzystanie enzymatycznej syntezy barwnika bezpośrednio na

włóknie wymaga zużycia mniejszej ilości wody i prekursorów barwników

co czyni ten proces bardziej ekonomicznym. Dodatkowo przebiega on

w niższej temperaturze i jest bardziej przyjazny środowisku.

Niemniej jednak, otrzymanie lakazy i jej oczyszczenie na skalę

przemysłową jest w dalszym ciągu zbyt kosztowne, co utrudnia

komercjalizację produkcji barwników drogą biokatalizy. Interesującym

rozwiązaniem, może okazać się synteza barwników przy udziale biomasy

grzybowej. W takich układach, immobilizowana grzybnia wydziela lakazę


188

do płynnego podłoża hodowlanego, zawierającego roztwór odpowiedniego

prekursora a cały proces syntezy barwników odbywa się w łagodnych

warunkach, w środowisku o określonych parametrach pH i temperatury [11].

4.3. Degradacja barwników i bioremediacja

Tematyka związana z barwnikami, dotyczy nie tylko syntezy barwnych

produktów przy udziale lakazy jako biokatalizatora. W przypadku

przemysłu tekstylnego enzymy te mogą działać dwukierunkowo,

w syntezie lub degradacji barwników. Jednakże pojęcie degradacji dotyczy

w głównej mierze barwników syntetycznych wykorzystywanych

w koloryzacji różnego rodzaju materiałów tekstylnych. Bardzo często

związki te zawierają w swojej strukturze aromatyczne pochodne oraz

chlorki metali co jest szkodliwe dla środowiska naturalnego. Dodatkowym

problemem jest ich wysoka rozpuszczalność, co stanowi przeszkodę

w usuwaniu tych związków ze zbiorników wodnych. Stosowane obecnie

metody oczyszczania środowiska z barwników syntetycznych są mało

efektywne, a przy tym często nieekonomiczne [33].

Stąd też zastosowanie lakaz w procesie dekoloryzacji i degradacji

barwników spotkało się z dużym zainteresowaniem badaczy i stanowi

alternatywną drogę usuwania barwników ze środowiska naturalnego [6].

Na tym jednak, udział lakazy się nie kończy. Innym sposobem na

wykorzystanie tych biokatalizatorów w oczyszczaniu środowiska

z barwników syntetycznych jest przeprowadzenie reakcji sprzęgania.

Podczas tego procesu barwniki ulegają polimeryzacji do nierozpuszczalnych

agregatów. Tworzą one z kolei osady, które z pomocą filtracji stają się

łatwe do usunięcia ze zbiorników wodnych [24].

Istnieje cały szereg szczegółowych danych dotyczących degradacji

konkretnych sztucznych barwników przez organizmy grzybowe,

z dokładnym procentowym określeniem procesu dekoloryzacji.

Jednymi z najczęściej badanych rodzajów grzybów stosowanych

w procesach odbarwiających jest rodzaj Trametes oraz Pleurotus. Trametes

versicolor wykazał zdolność do dekoloryzacji 90% barwnika Poly R-478

w obecności alkoholu weratrylowego [4]. T. trogii badano z kolei pod

kątem zdolności do dekoloryzacji i detoksyfikacji ścieków przemysłowych

z udziałem i bez udziału mediatora. Stosowanie lakazy tego szczepu bez

udziału mediatora przyniosło jedynie 10% degradację zanieczyszczeń,

podczas gdy zastosowanie mediatora w postaci HBT znacznie zwiększyło

intensywność reakcji [6]. Natomiast lakaza ze szczepu T. villosa oprócz

degradacji oranżu metylowego, z powodzeniem przeprowadzała reakcję

sprzęgania pomiędzy aminami aromatycznymi a katecholem powodując

wytrącenie zanieczyszczeń w formie osadów [34]. Dobre parametry

,


189

dekoloryzacji wykazał w badaniach szczep Pleurotus chrysosporium

powodując degradację barwników Cibanon Blue (87%), Cibanon Golden-

Yellow (74.8%) Cibanon Red (71%) oraz Indanthrene Direct Black (51%)

[6]. W badaniach nad szczepem P. sajor- caju otrzymano degradację

barwników azowych takich jak Acid Red 18 (90%), Acid Black 1 (87%)

i Direct Blue 71 (72%) [35]. Pojawiają się również prace dotyczące

dekoloryzacji barwników z udziałem lakaz unieruchomionych, jak na

przykład lakaza ze szczepu Paraconiothyrium variabile unieruchomiona na

nośniku alginianowo- żelatynowym. Zastosowanie tego typu układu

pozwoliło na dekoloryzację barwnika Amido Black 10D w 80% [36].

Z kolei lakaza z P. ostreatus wykazała zdolność do degradacji

antrachinowego barwnika SN4R (66%), a przy zastosowaniu ABTS jako

mediatora wydajność degradacji osiągnęła 90% [37].

Warto zaznaczyć, że oprócz szeroko zakrojonych badań laboratoryjnych,

stosowanie lakaz grzybowych do degradacji i dekoloryzacji barwników

syntetycznych jest wdrożone już od niemal dwudziestu lat. W 1996 roku

firma Novo Nordisk opatentowała preparat lakazy dostępny pod handlową

nazwą DeniLite®. Gen dla tego enzymu oryginalnie pochodzący ze

szczepu grzybowego Myceliophtora termophila, przeniesiono do szczepu

Aspergillus oryze, gdzie ulega on ekspresji [38]. Był to pierwszy

komercyjny preparat lakazy stosowany z udziałem mediatora, służący do

wybielania tekstyliów takich jeans. Dodatkowo w 2001 roku indyjska firma

Zytex, opracowała formułę opartą na katalizie według mechanizmu LMS,

służącą do enzymatycznej degradacji błękitu indygowego. Nazwa

handlowa produktu to Zylite [33].

Oprócz usuwania ze środowiska naturalnego syntetycznych barwników,

lakaza może również posłużyć, jako narzędzie w degradacji trudnych

do utylizacji ksenobiotyków, jak na przykład policykliczne węglowodory

aromatyczne (PAH), chlorofenole czy herbicydy.

Podobnie jak w przypadku dekoloryzacji barwników, również do badań

nad rozkładem ksenobiotyków wykorzystano rodzaj Trametes.

Wymieniony wcześniej szczep T. versicolor wytwarza lakazę zdolną do

rozkładu takich herbicydów jak diketonitryl, w obecności, ABTS jako

mediatora [4]. Z kolei bisfenol A, organiczny związek z grupy fenoli,

z powodzeniem rozkładany jest przez lakazę pochodzącą ze szczepu

T. villosa, ulegającą ekspresji po przeniesieniu do szczepu Aspergillus sp.

Oprócz tego, bisfenol A jest rozkładany in vivio jak również in vitro przez

lakazę ze szczepu P. ostreatus [39]. Dodatkowo lakaza szczepu T. villosa

ma zdolność prowadzenia reakcji sprzęgania 2,4,6-nitrotoluenu (TNT)

z katecholem lub z kwasem syryngowym, prowadząc do remediacji gleby

skażonej trotylem [24]. Sprzęganiu z substancjami humusowymi gleby,

mogą ulegać również takie ksenobiotyki jak 3,4-dichloroanilina czy


190

chlorofenole, które w postaci związanej są mniej dostępne dla organizmów

glebowych, stając się tym samym mniej toksyczne [9].

Duży problem wśród zanieczyszczeń glebowych stanowią

zanieczyszczenia węglowodorami aromatycznymi. Są to wysoce toksyczne,

karcynogenne i mutagenne związki, powstające między innymi w trakcie

zużywania paliw kopalnych [5,33]. Niemniej jednak również i tego typu

związki mogą zostać rozłożone z wykorzystaniem lakaz grzybowych jak na

przykład żółta lakaza z P. ostreatus, w przypadku której obserwuje się

zdolność do degradacji antracenu (95% w dwa dni) [9].

4.4. Przemysł spożywczy

Dzięki swoim właściwościom katalitycznym, lakaza znalazła

zastosowanie również w przemyśle spożywczym a najbardziej znanym jest

zastosowanie lakazy w procesie stabilizacji i klarowania win. Obecne

w winie antocyjany, katechiny i inne polifenole mogą być utleniane

z udziałem jonów żelaza czy miedzi i/lub enzymów co powoduje obniżenie

jakości wina poprzez zmianę jego klarowności, smaku i koloru [6,24].

Cechy organoleptyczne wina jak również jego trwałość w trakcie

przechowywania, poprawia się przez usuwanie polifenoli na przykład

z użyciem dwutlenku siarki. Jednakże usuwanie tych związków powinno

się odbywać w sposób selektywny, ponieważ usunięcie wszystkich

polifenoli również prowadzi do pogorszenia jakości wina. W celu pozbycia

się polifenoli powinny one zostać utlenione, następnie przejść etap

polimeryzacji oraz wytrącania [40].

Rozwiązaniem okazało się zastosowanie lakazy. W 1986 roku Cantarelli

i wsp. przedstawili dowody na skuteczne usuwanie polifenoli z czerwonego

wina [40]. Zastosowana w badaniach lakaza pochodziła ze szczepu

Polyporus versicolor i pozwoliła na usunięcie katechin (70%) oraz

antocyjanidyn (90%) w ciągu trzech godzin. Metoda ta okazała się również

skuteczna przy oczyszczaniu soku winogronowego, z którego usunięto 50%

polifenoli [40]. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że

usuwanie polifenoli z udziałem lakazy jest znacznie skuteczniejsze niż

działanie takimi enzymami jak tanaza, fenolaza i antocyjanidaza [24].

Jedyną wadą wykorzystania lakazy jest konieczność filtracji wina w celu

usunięcia strąconego osadu oraz samego enzymu, ponieważ lakaza nie jest

dodatkiem do żywności dopuszczonym w przemyśle spożywczym (JECFA,

FAO/WHO Food Additives Systems Dates) [24]. Niemniej jednak, lakaza

wykorzystywana jest, jako produkt handlowy pod nazwą Suberaza®

w produkcji korków winiarskich. Dzięki niej usuwa się związki fenolowe

zawarte w korkach naturalnych, odpowiadające za gorycz, zapach,

cierpkość i niekorzystnie wpływających na organoleptyczne cechy win

,


191

[20]. Podobne metody zastosowano również przy usuwaniu polifenoli

naturalnie występujących w sokach owocowych [12,21].

Działem przemysłu spożywczego, w którym stwierdzono pozytywne

działanie lakazy jest również piekarnictwo. Wykazuje ona bowiem

działanie oksydacyjne prowadzące do wzmocnienia struktury glutenu

zawartego w cieście. Zwiększa również objętość, delikatność i zwartość

uzyskanego pieczywa [6,12].

5. Podsumowanie

Otrzymywane drogą biokatalizy produkty oraz prowadzone procesy nie

ustępują jakością i wydajnością produkcji w stosunku do tradycyjnych,

chemicznych metod, a niekiedy okazują się być nawet lepsze. Lakaza jest

enzymem, który w przyszłości znajdzie szereg zastosowań w wielu

gałęziach przemysłu, eliminując przy tym kosztowne i szkodliwe dla

środowiska procesy. W chwili obecnej otrzymanie lakazy na skalę

przemysłową w dalszym ciągu jest procesem kosztownym stąd też

konieczność prowadzenia dalszych badań, dotyczących udoskonalania

procesu wytwarzania tego enzymu jak również zastosowania bioukładów

opierających się na organizmach, mogących przeprowadzić proces

biokatalizy z udziałem lakazy.

Podziękowania

Praca współfinansowana ze środków Narodowego Centrum Nauki

(NN 302 633040).


192

Literatura

1. http://www.nauka.gov.pl/strategiczne-obszary-

badawcze/biotechnologia_24019,archiwum,1.html (6.02.2014 r.)

2. Mikolasch A., & Schauer F. Fungal laccases as tools for the synthesis of new

hybrid molecules and biomaterials, Applied Microbiology And

Biotechnology, 2009 vol. 82, s. 605-624

3. Riva S. Laccases : blue enzymes for green chemistry, Trends in


4. Mayer A. M., & Staples R. C. Laccase : new functions for an old enzyme,

Phytochemistry, 2002 vol. 60, s. 551-565

5. Dwivedi U. N., Singh P., Pandey V. P., & Kumar A. Structure–function

relationship among bacterial, fungal and plant laccases, Journal of Molecular

Catalysis B: Enzymatic, 2011 vol. 68, s. 117-128

6. Imran M., Asad M.J., Hadri S.H., Maehmood S. Production and industrial

application of laccase enzyme, Journal of Cell and Molecular Biology, 2012 vol.

10, s. 1-11

7. Polak J., & Jarosz-Wilkołazka A. Fungal laccases as green catalysts for dye

synthesis, Process Biochemistry, 2012 vol. 47, s. 1295-1307

8. Kunamneni A., Camarero S., García-Burgos C., Plou F. J., Ballesteros A.,

& Alcalde M. Engineering and applications of fungal laccases for organic

synthesis, Microbial Cell Factories, 2008 vol. 7, s. 32

9. Baldrian P. Fungal laccases - occurrence and properties, FEMS Microbiology

Reviews, 2006 vol. 30, s. 215-242

10. Kim S., López C., Güebitz G., & Cavaco‐Paulo A. Biological coloration

of flax fabrics with flavonoids using laccase from Trametes hirsuta,

Engineering in Life Sciences, 2008 vol. 8, s. 324-330

11. Polak J., & Jarosz-Wilkołazka A. Whole-cell fungal transformation

of precursors into dyes, Microbial Cell Factories, 2010 vol. 9, s. 1-12

12. Brijwani K., Rigdon A., & Vadlani P. V. Fungal laccases: production,

function, and applications in food processing. Enzyme Research, 2010 vol.

2010, s. 1-10

13. Morozova O. V, Shumakovich G. P., Gorbacheva M. A., Shleev S. V, &

Yaropolov A. I. Blue laccases, Biochemistry (Moscow) 2007 vol. 72, s. 1136-1150p

14. Robert V., Mekmouche Y., Pailley P. R., & Tron T. Engineering laccases:

in search for novel catalysts, Current Genomics, 2011 vol. 12, s. 123-129;

15. Thurston C. F., The structure and function of fungal laccases, Microbiology,

1994 vol.140, s. 19-26

16. Claus, H, & Filip, Z. The evidence of a laccase-like enzyme activity in a

Bacillus sphaericus strain, Microbiological Research 1997 vol. 152, s. 209-216

17. Diamantidis G., Aline E., & Potier P. Purification and characterization of the

first bacterial laccase in the rhizospheric bacterium Azospirillum lipoferum,

Soil Biology and Biochemistry, 2000 vol. 32, s. 919-927

18. Rivera-Hoyos C. M., Morales-Álvarez E. D., Poutou-Piñales R. A., Pedroza-

Rodríguez A. M., RodrÍguez-Vázquez R., & Delgado-Boada J. M. Fungal

laccases, Fungal Biology Reviews, 2013 vol. 27, s. 67-82

http://www.nauka.gov.pl/strategiczne-obszary-badawcze/biotechnologia_24019,archiwum,1.html

http://www.nauka.gov.pl/strategiczne-obszary-badawcze/biotechnologia_24019,archiwum,1.html

,


193

19. Claus H. Laccases : structure, reactions, distribution, Micron, 2004 vol. 35, s. 93-96

20. Polak J., & Jarosz-Wilkołazka, A. Reakcje katalizowane przez lakazę– mechanizm

i zastosowanie w biotechnologii, Biotechnologia, 2007 vol. 4, s. 82-94

21. Arora D. S., & Sharma R. K. Ligninolytic fungal laccases and their

biotechnological applications, Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010

vol 160, s. 1760-1788

22. Uzan E., Portet B., Lubrano C., Milesi S., Favel A., Lesage- Messen L.,

& Lomascolo A. Pycnoporus laccase- mediated bioconversion of rutin

to oligomers suitable for biotechnology applications, Applied Microbiology

And Biotechnology, 2011 vol. 90, s. 97-105

23. Witayakran S., & Ragauskas A. J. Synthetic applications of laccase in green

chemistry, Advanced Synthesis & Catalysis, 2009 vol. 351, s. 1187-1209

24. Kudanga T., Nyanhongo G. S., Guebitz G. M., & Burton S. Potential

applications of laccase-mediated coupling and grafting reactions: a review,

Enzyme and Microbial Technology, 2011 vol. 48, s. 195-208

25. Leonowicz A., Matuszewska A., Luterek J., Ziegenhagen D., Cho N.,

Hofrichter M., & Rogalski J. Biodegradation of lignin by white rot fungi,

Fungal Genetics and Biology,1999 vol. 185, s. 175-185

26. http://ippc.mos.gov.pl/ippc/custom/48%20-%20rozdzial_3.pdf (6.02.2014 r.);

27. Camarero S., Ibarra D., Mart T., Romero J., Guti A., & del Rio C. Paper pulp

delignification using laccase and natural mediators, Enzyme and Microbial

Technology, 2007 vol. 40, s. 1264-1271

28. Jeon J.-R., & Chang Y.-S. Laccase-mediated oxidation of small organics:

bifunctional roles for versatile applications, Trends in Biotechnology, 2013 vol.

31, s. 335-341

29. http://botit.botany.wisc.edu/Resources/Toms%20Fungi/Basidiomycota/Hymeno

mycetes/General_--Wood_rotters/White_rot_Stromatoscypha_tjv.jpg.html

(6.02.2014 r.)

30. Jeon J-R., Kim E-J, Murugesan K., Park H-K, Kim Y-M, Kwon J-H, Kim W-G.,

Lee J-Y., Chang Y-S. Laccase-catalysed polymeric dye synthesis from plant-

derived phenols for potential application in hair dyeing : Enzymatic

colourations driven by homo- or hetero-polymer synthesis, Microbial


31. Blanco C. D., González M. D., María J., Monmany D., & Tzanov T. Dyeing

properties, synthesis,isolation and characterization of an in situ generated phenolic

pigment, covalently bound to cotton, Enzyme and Microbial Technology, 2009 vol.

44, s. 380-385

32. Kim S. Y., Zille A., Murkovic M., & Cavaco-Paulo A. Enzymatic

polymerization on the surface of functionalized cellulose fibers, Enzyme

and Microbial Technology, 2007 vol. 40, s. 1782-1787

33. Couto S. R., Luis J., & Herrera T. Industrial and biotechnological applications

of laccases : A review, Biotechnology Advances, 2006 vol. 24, s. 500-513

34. Zille A., Munteanu F., Georg M. G., & Cavaco-Paulo A. Laccase kinetics

of degradation and coupling reactions, Journal of Molecular Catalysis B:

Enzymatic, 2005 vol. 33, s. 23-28

http://ippc.mos.gov.pl/ippc/custom/48%20-%20rozdzial_3.pdf

http://botit.botany.wisc.edu/Resources/Toms%20Fungi/Basidiomycota/Hymenomycetes/General_--Wood_rotters/White_rot_Stromatoscypha_tjv.jpg.html

http://botit.botany.wisc.edu/Resources/Toms%20Fungi/Basidiomycota/Hymenomycetes/General_--Wood_rotters/White_rot_Stromatoscypha_tjv.jpg.html


194

35. Murugesan K., Arulmani M., Nam I.-H., Kim Y.-M., Chang Y.-S., &

Kalaichelvan P. T. Purification and characterization of laccase produced

by a white rot fungus Pleurotus sajor-caju under submerged culture condition

and its potential in decolorization of azo dyes, Applied Microbiology And


36. Mogharabi M., Nassiri-Koopaei N., Bozorgi-Koushalshahi M., Nafissi-

Varcheh N., Bagherzadeh G., & Faramarzi M. A. Immobilization of laccase

in alginate-gelatin mixed gel and decolorization of synthetic dyes,

Bioinorganic Chemistry And Applications, 2012, vol. 13, s. 205-2016

37. Hou H., Zhou J., Wang J., Du C., & Yan B. Enhancement of laccase

production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization

of antraquinone dye, Process Biochemistry, 2004 vol. 39, s. 1415-1419

38. Piscitelli A., Pezzella C., Giardina P., Faraco V., & Giovanni S. Heterologous

laccase production and its role in industrial applications, Bioengineered

Bugs, 2010 vol. 1, s. 252-262

39. Fukuda T., Uchida H., Takashima Y., & Uwajima T. Degradation

of Bisphenol A by purified laccase from Trametes villosa, Biochemical

and Biophysical Research Communications, 2001 vol. 706, s. 704-706

40. Minussi R. C., Pastore M., & Dura, N. Potential applications of laccase in the

food industry, Trends in Food Science and Technology, 2002 vol. 13, s. 205-216


Streszczenie W dobie popularyzacji ochrony środowiska, tradycyjne procesy chemiczne stosowane

w przemyśle są wypierane lub modyfikowane przez stosowanie rozwiązań

biotechnologicznych. Dziedziną biotechnologii związaną z przemysłem jest biała

biotechnologia. Obejmuje ona bioprocesy i biokatalizy związane z przetwarzaniem surowców do pożądanych produktów, redukując przy tym ilość zanieczyszczeń uwalnianych

do środowiska naturalnego. Podstawowym narzędziem białej biotechnologii są enzymy

służące jako biokatalizatory. Przykładem takiego enzymu jest lakaza, będąca powszechnie

występującą w przyrodzie oksydoreduktazą, utleniającą różnorodne substraty z jednoczesną redukcją tlenu cząsteczkowego do wody. Obecność lakaz stwierdzono w roślinach

wyższych, bakteriach, ale głównym źródłem tych enzymów są grzyby ligninolityczne.

W środowisku naturalnym lakazy biorą udział w wielu procesach, przede wszystkim

w syntezie ligniny u roślin lub jej degradacji przez grzyby, gdzie dodatkowo zaangażowane są w procesy patogenezy, morfogenezy oraz detoksyfikacji. Cechą charakterystyczną lakaz

ich jej niska specyficzność substratowa, co przyczyniło się do dużego zainteresowania tymi

enzymami przez wiele gałęzi przemysłu. Szeroko zakrojone badania dotyczą zastosowania

lakaz w przemyśle papierniczym, gdzie stosowane są do usuwania ligniny i wybielania pulpy drzewnej, w przemyśle tekstylnym, gdzie mogą być stosowane do syntezy

niskotoksycznych barwników oraz rozkładzie barwników syntetycznych, bioremediacji

gleby i ochronie środowiska. Znany jest również przykład zastosowania lakazy w przemyśle

spożywczym, w procesie klarowania i stabilizacji win. Niemniej jednak otrzymywanie lakaz na skalę przemysłową jest wysoce kosztowne, dlatego też konieczne są dalsze badania

w celu obniżenia kosztów oraz intensyfikacji produkcji.

Słowa kluczowe: lakazy, biała biotechnologia, przemysł tekstylny

,


195

Laccase – a blue enzyme of colourful biotechnology

Abstract In these days of eco-friendly behaviour, the traditional, chemical industry processes are

replaced or modified by biotechnological solutions. Field of biotechnology, strictly

connected to the industry is white biotechnology. It includes bioprocesses and biocatalysis

in processing of many materials to certain products with reduced environmental pollutants. Basic elements of white biotechnology are enzymatic biocatalysts, for example, laccases.

Those enzymes are oxidoreductases, widely distributed in environment and catalyse

oxidation of substrates with the contaminant reduction of oxygen to water in four-electron

transfer process. Laccases are present in higher plants, bacteria but their main sources are ligninolytic fungi. The enzymes are involved in lignin polymerization in plants and in its

depolymeryzation by fungi in which are involved also in the pathogenesis, morphogenesis

and detoxification. Because of their low- substrate specificity, laccases are interesting

enzymes in industrial application. According to many research, this enzymes are potentially

useful in paper industry in delignification and paper pulp bleaching processes, in textile

industry, in dyes synthesis and degradation of synthetic dyes, as well as in the

bioremediation of soil and in environmental protection. Laccases are also known enzymes

used in wine stabilization in food industry. Nevertheless, production of laccases in industry scale is too expensive, thus for intensification and reducing costs, more research need to be done.

Key words: laccases, white biotechnology, textile industry

196

Ewelina Zielińska1, Monika Michalak-Majewska

2, Damian Zieliński

Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów

wybranych gatunków pestkowców tropikalnych

1. Wstęp

Tłuszcze są złożonymi substancjami organicznymi rozpowszechnionymi

zarówno w świecie roślinnym, jaki i zwierzęcym, głównie jako substancje

odżywcze i zapasowe. W roślinach znajdują się one przede wszystkim

w owocach i nasionach, natomiast w organizmach zwierzęcych występują

w prawie wszystkich tkankach.

Ważną grupę lipidów stanowią tak zwane biooleje, czyli naturalne oleje

roślinne pozyskiwane metodą tłoczenia na zimno (oleje dziewicze) lub

metodą rafinacji. Biooleje charakteryzują się wysoką zawartością

niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych (NNKT), do których

zalicza się między innymi: kwas linolowy, kwas linolenowy i kwas

arachidonowy. Ponadto zawierają one substancje biologicznie czynne takie

jak: witaminy, fosfolipidy i fitosterole [1].

Biooleje, a wśród nich liczna grupa egzotycznych olejów roślinnych,

cieszą się, szczególnie w ostatnich latach, dużą popularnością. Głównie ze

względu na możliwe działanie biologiczne oraz na szeroką gamę

zastosowań praktycznych w różnych gałęziach przemysłu. Innym

powodem tak dużej popularności egzotycznych olejów roślinnych są

względy marketingowe. Producenci, aby przyciągnąć uwagę klientów

zamieszczają na etykietach swoich produktów egzotycznie brzmiące nazwy.

Najpowszechniejszym zastosowaniem większości naturalnych lipidów

roślinnych jest wykorzystanie ich do celów spożywczych. Oleje ze względu

na swoje wysokie walory smakowe znajdują zastosowanie zarówno do

smażenia, jak i jako dodatki do sałatek.

Tłuszcze stosuje się w farmacji i kosmetyce jako nośniki lub podłoża

do substancji czynnych, przy produkcji leków, maści, zastrzyków, kremów.

W medycynie wykorzystywane są ze względu na zawarte w nich substancje

czynne [1].


i Biotechnologii, SKN Technologii Żywności, www.skntz.up.lublin.pl; 2 [email protected], Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Wydział Nauk o Żywności

i Biotechnologii, Katedra Technologii Owoców, Warzyw i Grzybów, www.up.lublin.pl;


http://www.skntz.up.lublin.pl/


http://www.up.lublin.pl/

,



197

Ze względu na rosnące zainteresowanie egzotycznymi olejami poszukuje

się wciąż nowych możliwości ich zastosowania. Niniejsza praca przedstawia

obecne, jak również nowe kierunki wykorzystania lipidów zawartych

w wybranych gatunkach pestkowców egzotycznych (awokado właściwym,

kawie arabskiej, oliwce europejskiej, migdale zwyczajnym i orzechu

kokosowym).

2. Omówienie podstawowych pojęć

Lipidy (tłuszczowce) to grupa substancji o zróżnicowanej budowie.

Wspólną cechą lipidów jest ich nierozpuszczalność w wodzie,

a rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych, np. eterze czy

chloroformie. Większość lipidów spełnia funkcję materiału zapasowego,

rolę ochronną lub strukturalną. Podstawowym kryterium przynależności do

tej grupy związków jest zawartość długołańcuchowych kwasów

tłuszczowych oraz obecność co najmniej jednego wiązania estrowego.

Tłuszcze dzielone są na poszczególne grupy na podstawie różnych

kryteriów: ze względu na budowę (proste, złożone), pochodzenie

(zwierzęce, roślinne), właściwości fizyczne i chemiczne (stałe, półstałe,

ciekłe) oraz przeznaczenie (spożywcze, techniczne) [2].

Owoce tropikalne zwane inaczej owocami egzotycznymi lub owocami

południowymi – to grupa różnorodnych owoców importowanych z krajów

o ciepłym klimacie – ze strefy klimatu tropikalnego i subtropikalnego.

Owoce egzotyczne ze względu na budowę dzielone są na:

owoce jagodowe (owoce cytrusowe, banan, kiwi, granat daktyl, kaki,

karambola, papaja);

owoce ziarnkowe (figa);

owoce pestkowe (awokado, mango, orzech kokosowy, pistacja,

migdał, pekan);

orzechy (makadamia, kasztan, orzech nadnerczy);

strąki (orzech ziemny);

torebki (orzech brazylijski) [3].

Pestkowce są to owoce zamknięte, niepękające, które powstały

z jednego lub większej ilości owocolistków. Wewnętrzną częścią owocu

pestkowców jest endokarp tworzący z reguły twardą, zwykle zdrewniałą

warstwę otaczającą jedno, rzadziej dwa lub trzy nasiona, czyli pestkę.

Łupiny nasienne występują zazwyczaj w postaci cienkich, błoniastych

okryw. Mezokarp, czyli otaczająca pestkę środkowa warstwa owocni

zazwyczaj tworzy gruby, soczysto – mięsisty lub kleisto – włóknisty

miąższ, który otoczony jest egzokarpem, czyli błoniastą lub skórzastą

okrywą. Jadalnymi częściami większości pestkowców jest mezokarp

(np. awokado, mango) lub nasiona (np. kokos) [4].

Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska , Damian Zieliński

198

3. Charakterystyka wybranych gatunków pestkowców

tropikalnych

3.1. Awokado właściwe (Persea american Mill.)

Awokado należy do rodziny wawrzynowate (Lauraceae). Jest

zimozielonym, rozłożystym i nisko rozgałęziającym się drzewem

wysokości 10-20m.

Owoce awokado mają zazwyczaj kształt gruszkowaty, czasami prawie

okrągły. Osiągają ponad 30cm długości i do 15cm szerokości. Mają cienko

– skórzastą jędrną okrywę, która może być gładka, pomarszczona lub

szorstka o rożnej barwie – zielonej, fioletowej, czarniawej. Miąższ jest

jasnozielony, białawy lub żółtawy o konsystencji masła. Jest bezwonny

o łagodnym orzechowym smaku. Łatwo odchodzi od okrywy oraz od

jajowatej lub okrągławej, twardej, jasnej pestki o średnicy 5-7cm [5].

Obecnie znanych jest wiele odmian, które różnią się wielkością,

kształtem i składem chemicznym owoców oraz porą kwitnienia

i dojrzewania. Ojczyzną awokado są tropikalne lasy Meksyku i Ameryki

Środkowej. Obecnie głównymi rejonami uprawy są: USA, Meksyk,

Brazylia, Izrael, Indonezja, Wyspy Karaibskie, Nowa Zelandia, Republika

Południowej Afryki.

Owoc awokado charakteryzuje się szczególnie wysoką zawartością

tłuszczu (od 5 aż do 32%), zawartość cukrów jest niższa i wynosi

od 1.2 do 10%. Poza tym w owocach występuje białko, związki mineralne

i witaminy [5].

3.2. Kawa arabska (Coffea arabica L.)

Należy do rodziny marzanowate (Rubiaceae). Jest zimozielonym krzewem

lub małym, nisko i silnie rozgałęzionym drzewem o wysokości do 8m.

Owoce kawy są krótkoszypułkowe i gruboszypułkowe. W stanie

dojrzałym przybierają barwę pomarańczowoczerwoną, czerwonobrązową

do czerwonawoczarnej. Rosną gęsto upakowane i ściśnięte. Są owalne

z dyskowatym wgłębieniem na końcu. Zewnętrzna okrywa owocu kawy jest

jędrna, słabo błyszcząca. Pod spodem znajduje się soczysty, czerwony

miąższ oraz miękka, cienka, szklisto-żółta jego wewnętrzna warstwa, która

otacza dwa leżące obok siebie nasiona. Nasiona są owalne, na zewnątrz

wybrzuszone, a od środka płaskie z podłużną bruzdą. Dodatkowo osłonięte

są błoniastą okrywą.

Rodzaj kawa obejmuje około 60 gatunków, ale dwoma głównymi

botanicznymi gatunkami kawy są: arabika (Coffea arabica) i robusta

(Coffea canephora). Różnią się one budową krzewu, wymaganiami

klimatycznymi oraz kształtem, wielkością i składem chemicznym ziaren.

,



199

Kawa arabska wywodzi się prawdopodobnie z Etiopii. Obecnie kawa

rośnie w pasie 25º na północ i 25º na południe od równika, a jej głównymi

producentami są Brazylia, Kolumbia i Wietnam [6].

Palone ziarno kawy zawiera: 1-3% wody, 21-26% błonnika, 12-14%

tłuszczu, 0.5-2% kofeiny, 1-1.5% substancji garbnikowych [5].

3.3. Migdałowiec zwyczajny (Amygdalus communis)

Należy do rodziny różowatych (Rosaceae). Jest długowiecznym

drzewem lub krzewem o wysokości do 10m, mającym szarą, łuskowatą

korę, kulistą koronę oraz lancetowate, naprzemianległe, piłkowane

i błyszczące liście.

Zewnętrzna i środkowa część owocni pozostaje cienka, skórzasta, lekko

omszona i niejadalna. Jadalną częścią owocu migdała jest duże, jajowate,

spłaszczone nasienie, które ma brązowo-rdzawą skórkę i biały miąższ. Jego

smak w zależności od odmiany uprawnej jest słodki lub gorzki. Długość

nasienia wynosi 2-4cm, a szerokość 1-2cm.

Znane są liczne odmiany migdała, które uprawiane w różnych krajach

można podzielić na trzy typy: o miękkich, półtwardych i twardych

pestkach. Ojczyzną migdałowca zwyczajnego prawdopodobnie jest

centralna Azja, Chiny i Japonia. Obecnie uprawiany jest w krajach

śródziemnomorskich w Europie, Azji i Afryce Południowej, w USA

(głównie Kalifornii), południowej Afryce i Australii.

W skład migdałów wchodzi 11-12% wody, 45-60% tłuszczu, 16% białka.

Ważniejszymi składnikami mineralnymi są wapń, fosfor i magnez. W składzie

migdałów ważnym elementem są również witaminy B1, B2 i PP [7].

3.4. Oliwka europejska (Olea europaea)

Należy do rodziny oliwkowatych (Oleaceae). Oliwka jest wolno

rosnącym drzewem, wiecznie zielonym, które osiąga dojrzałość w wieku

25-30 lat, natomiast może żyć wiele lat, nawet do 1000. Dorasta do 8-12m

wysokości. Korona jest nieregularnie rozgałęziona o stosunkowo wiotkich

i nieco zwisających gałęziach.

Owoce oliwki mają mięsisty miąższ i twardą pestkę. Barwa owoców

w czasie dojrzewania zmienia się z zielonej na czarną. Średnia masa owocu

wynosi od 2 do 12g. Oliwki mają kształt podłużnie owalny lub kulisty.

Stosunek miąższu do pestki waha się od 4:1 do 8:1 [8].

Na świecie uprawia się około 1275 odmian drzew oliwnych, ale tylko

kilkadziesiąt z nich ma znaczenie ekonomiczne. Najpopularniejszymi

odmianami w europie są: Arbequina, Picudo, Picual, Koroneki, Tsounati,

Coratina, Cima di Bitonto. Ojczyzną oliwki jest rejon śródziemnomorski.

Aktualnie uprawiana jest w Hiszpanii, Włoszech, Grecji, Turcji, Syrii, Izraelu,


200

Libanie, Tunezji, Algierii, Maroku Libanie, Egipcie, USA i Australii.

Zawartość oleju w oliwce waha się od 10 do 30%, a wody 40-60% [9].

3.5. Kokos właściwy (Cocos nucifera L.)

Należy do rodziny arekowate (Arecaceae). Palmę kokosową najczęściej

uprawia się w formie wysokiej, której pień osiąga 20-30 m, a na jego

szczycie rozwija się pióropusz z 25-30 liści. Istnieje także forma niska,

której wysokość sięga 8-10 m.

Młode owoce początkowo są zielone, ale po dojrzeniu przyjmują barwę

żółtą, pomarańczową, czerwoną lub brązową. Dojrzałe owoce mają długość

20-30cm i wagę do 2.5kg. Owoc składa się z trójwarstwowej owocni:

gładkiej i cienkiej warstwy zewnętrznej, która zwana jest epikarpem,

włóknistego mezokarpu i endokarpu – twardej skorupy, która otacza

nasiono powszechnie zwane orzechem kokosowym. Pod skorupą znajduje

się cienka, brązowa okrywa nasienna, która wyścielona jest od wewnątrz

białym bielmem. W środku nasiono ma pustą przestrzeń, którą w stadium

dojrzałości wypełnia płynne bielmo, czyli mleko kokosowe [3].

Znanych jest wiele odmian, ale w ciągu ostatnich lat sadzi się odmiany

niskopienne (np. ‘Golden Dwarf’), ponieważ z nich łatwiej zbierać owoce.

Kokos właściwy pochodzi prawdopodobnie z Azji Południowo-Wschodniej

lub Polinezji. Aktualnie występuje i jest uprawiany w tropikach na całym

świecie, a głównymi producentami są Filipiny, Indonezja, Indie i Malezja [4].

Dojrzałe jądro orzecha kokosowego zawiera około 50% wody, 25-35%

tłuszczu, 8% cukrów i 4% białka. Natomiast kopra zawiera 7% wody,

60-70% tłuszczu, 14% cukrów i 7% białka [5].

4. Charakterystyka i obecne kierunki wykorzystania lipidów


4.1. Awokado i olej z awokado

Jedną z możliwości wykorzystania awokado jest sporządzanie masła,

czyli mieszanki przetartego owocu z sokiem z cytryny i ziołami, które

można wykorzystywać do każdego rodzaju pieczywa, naleśników, grzanek

i jako komponent potraw słodkich [3].

Z owoców awokado pozyskuje się olej awokadowy, który jest żółto-

zielony lub brązowo-zielony i ma delikatny, przyjemny zapach. Olej

wydobywa się z wysuszonego miąższu przez tłoczenie na zimno lub przez

macerację świeżej miazgi wodą i odwirowanie. W składzie kwasów

tłuszczowych (tabela 1) przeważa kwas oleinowy, a pozostałe to: kwas

linolowy, kwas palmitynowy, kwas stearynowy, kwas linolenowy.

,



201

Ponadto w składzie oleju z awokado występuje fosfatydocholina

(lecytyna), która należy do fosfolipidów. Lecytyna jest niezbędna

w funkcjonowaniu tkanki nerwowej ludzi i zwierząt. Bierze udział

w gospodarce cholesterolem, pełni funkcje ochronne wobec wątroby,

posiada również właściwości emulgujące. Olej z awokado zawiera ponadto

fitosterole, skwalen, białko, sole mineralne oraz witaminy: A, B, C, D, E,

K, PP. Tłuszcz znajdujący się w owocu awokado zalicza się do olejów

nieschnących. Ze względu na swoją wysoką jakość olej z owoców awokado

wykorzystywany jest w medycynie, przemyśle kosmetycznym oraz

w przemyśle spożywczym [10].

W przemyśle spożywczym olej z awokado wykorzystywany jest ze

względu na swoje właściwości emulgujące w produkcji mas czekoladowych,

sosów i kremów. Olej z awokado jest pożywny i lekkostrawny. Może być

stosowany do obróbki termicznej potraw, ze względu na swoją odporność

termiczną [10].

W przemyśle kosmetycznym olej z awokado należy do szczególnie

cenionych olejów o wielokierunkowym wykorzystaniu, między innymi

do ochrony, odżywiania, regeneracji i regulacji gospodarki wodno-

lipidowej skóry. Olej z awokado w kosmetyce używany jest jako czysty

olej lub jako dodatek do kosmetyków przeznaczonych dla skóry suchej,

wrażliwej, dojrzałej. Olej ten jest źródłem nienasyconych kwasów

tłuszczowych takich jak kwas linolowy i kwas oleinowy oraz ich estrów.

Kwasy te będąc składnikiem błon biologicznych chronią naturalny czynnik

nawilżający (NMF – ang. natural moisturising factor), a ponadto tworzą

na powierzchni skóry film ochronny, który zapobiega utracie wody

w procesie fizjologicznego parowania – transepidermalnej utraty wody

(TEWL – ang. transepidermal water loss). Zawarte w oleju kwasy

tłuszczowe wolne lub zestryfikowane, wypełniają obszary, gdzie naturalna

bariera lipidowa ulega zniszczeniu. Ma to szczególne znaczenie

w przypadku nienasyconych kwasów tłuszczowych, których deficyt

powodowany jest wolnorodnikowymi procesami utleniania. Procesy te są

przyczyną zakłóceń w funkcjonowaniu błon biologicznych jako barier

chroniących komórkę np. przed nadmierną utratą wody. Sucha skóra

charakteryzuje się wzrostem zawartości nasyconych kwasów tłuszczowych

oraz jednoczesną redukcją kwasu linolowego. Aby zachować prawidłowe

proporcje kwasów oraz poprawić stan naskórka należy stosować na skórę

kosmetyki bogate w nienasycone kwasy tłuszczowe. Kwas linolowy

charakteryzuje się dodatkowo posiadaniem właściwości głębokiego

nawilżania. Natomiast zawarte w oleju witamina E i karoten przyczyniają

się do wzmocnienia bariery tłuszczowej skóry oraz do zmniejszenia TEWL

przez ochronny wpływ na lipidy i lipoproteiny błon biologicznych [11].


202

Tłuszcz z awokado używany jest w leczeniu chorób skórnych,

zwłaszcza w egzemach i liszajach. We Francji na bazie tłuszczu z awokado

wyprodukowano preparat do leczenia twardzin skóry (sklerodermii), egzem

oraz schorzeń tkanki okołozębowej i chorób zwyrodnieniowych stawów [5].

4.2. Olej z kawy

Z palonych ziaren kawy, na bazie naturalnego, zimnotłoczonego oleju

słonecznikowego, nowoczesną metodą S-CO2 (ang. supercritical carbon

dioxide) otrzymywany jest ekstrakt w postaci oleju o ciemnożółtym kolorze

i charakterystycznym zapachu dla palonych ziaren kawy. Ekstrakt zawiera

w swoim składzie kwas palmitynowy, kwas stearynowy, kwas oleinowy,

kwas linolowy oraz kwas α-linolenowy (tabela 1). Bogaty jest także

w fitosterole, witaminę E, znaczne ilości kofeiny i związki aromatyczne,

które odpowiedzialne są za charakterystyczny zapach palonej kawy.

Olejek kawowy, dzięki zawartym w nim składnikom, wzmacnia barierę

ochronną skóry, wykazuje działanie nawilżające, gojące, antybakteryjne,

antyoksydacyjne, regenerujące, ujędrniające, ponadto pobudza krążenie

i wykazuje właściwości aromatyczne. Olejek polecany jest do stosowania

zarówno do cery tłustej, jak i suchej, delikatnej, łuszczącej się

i podrażnionej. Stosowany jest do pielęgnacji twarzy i ciała oraz do

pobudzającego masażu. Obecnie wykorzystywany jest także w kosmetykach

redukujących grubość tkanki tłuszczowej i celulitis [12].

Tabela 1. Procentowy skład tłuszczów w wybranych gatunkach pestkowców

egzotycznych

Awokado

właściwe

Kawa

arabska

Migdałowiec

zwyczajny

Oliwka

europejska

Kokos

właściwy

Kwas oleinowy 60-80 8-10 58-81 55-83 (72) -

Kwas linolowy 10-20 40-50 - 3.5-21 (14) -

Kwas palmitynowy 4-12 30-45 6-9 7.5-20 (14) 11

Kwas stearynowy 2 5-9 0.5-1.5 - 6

Kwas linolenowy 2 0.1-3 12-33 - -

Kwas mirystynowy - - - - 18

Kwas laurynowy - - - - 44

Źródło: Opracowanie własne [10,12]

,



203

4.3. Migdały i olej z migdała

Z uwagi na dużą zawartość tłuszczu migdały dobrze łączą się

z pokarmami mącznymi, dlatego też stosuje się je w wyrobach

cukierniczych oraz mieszankach złożonych z suchych owoców (muesli)

i płatków zbożowych. Z roztartych i zalanych wodą nasion migdała

otrzymuje się mleczko migdałowe, tzw. orszadę, która jest odżywczą

emulsją, bogatą w tłuszcze, sole mineralne i związki zapachowe. Specjalnie

przygotowane mleczka migdałowe podawane są niemowlętom uczulonym

na białko mleka krowiego [5, 7].

Z nasion drzewa migdałowego otrzymuje się poprzez wyciskanie na

zimno olej migdałowy. Do najważniejszych kwasów tłuszczowych

występujących w oleju z nasion migdała należą: kwas oleinowy, kwas

linolenowy, kwas palmitynowy, kwas stearynowy (tabela 1). Ponadto olej

ten zawiera cenne fitosterole i tokoferole w ilości od 0.3 do 1%. Olej

z migdałów wykorzystywany jest w ciastkarstwie i cukiernictwie jako

dodatek do różnych mas, kremów cukierniczych, nadzień oraz ciasteczek.

W przemyśle kosmetycznym jest cennym składnikiem kremów do rąk

i mydeł ze względu na swoje nawilżające i zmiękczające działanie, a ze

względu na kojące właściwości polecany jest do pielęgnacji skóry dzieci [10].

Olej migdałowy ponadto wykorzystuje się do iniekcji podskórnych jako

rozpuszczalnik leków lipoidalnych (kamfory, hormonów, witamin

lipoidalnych), maści ocznych, zawiesin. Zawarte w oleju nienasycone

kwasy tłuszczowe wpływają łagodząco i zmiękczająco na skórę i błony

śluzowe oraz są czynnikiem wspomagającym leczenie w stanach zapalnych

przewodu pokarmowego, dróg oddechowych i moczowych. Olej migdałowy

jest łagodnym środkiem przeczyszczającym, leczy rany, w połączeniu

z fosforem był stosowany do leczenia zaćmy [7].

4.4. Oliwa z oliwek

Dziewiczą oliwę z oczyszczonych, umytych, dokładnie roztartych,

zmielonych oliwek pozyskuje się mechanicznie trzema metodami:

przez tradycyjne tłoczenie w prasach hydraulicznych, przez wirowanie

lub w wyniku selektywnej filtracji. W skład oliwy z oliwek wchodzą

triacyloglicerole (skład kwasów tłuszczowych przedstawiono w tabeli 1),

które stanowią ok. 97–99%, natomiast 1–2% stanowią substancje

niezmydlające (SNZ), w skład których wchodzi ok. 230 związków

chemicznych, np. alifatyczne i triterpenowe alkohole, węglowodory

(np. skwalen), sterole (β- fitosterol), polifenole, aromatyczne związki lotne.

Liczną grupę stanowią związki o właściwościach antyoksydacyjnych

(np. polifenole, kwasy fenolowe, flawonoidy, pochodne oleuropeiny), które


204

ponadto nadają oliwie charakterystyczne cechy organoleptyczne oraz mają

pozytywny wpływ na organizm człowieka [9].

Oliwa z oliwek charakteryzuje się atrakcyjnym smakiem. Używana jest

do sałatek, sosu vinegrette oraz do smażenia w umiarkowanej temperaturze.

W niefiltrowanej oliwie z pierwszego tłoczenia zawarte są naturalne

przeciwutleniacze, które zwalczają wolne rodniki, zmniejszają ryzyko

chorób serca oraz opóźniają procesy starzenia komórek [11].

Zawarty w oliwie w dużych ilościach kwas oleinowy wpływa korzystnie

na ograniczenie zachorowań na astmę i alergiczne zapalenie błony śluzowej

nosa, co obserwowane jest wśród mieszkańców basenu Morza

Śródziemnego, gdzie oliwa jest podstawowym składnikiem diety. Ponadto

oliwa z oliwek, dzięki zawartym w niej składnikom zalecana jest do

stosowania przy miażdżycy, nieżycie i owrzodzeniu żołądka, kamicy

żółciowej, zaparciach oraz zapobiega tworzeniu się wolnych rodników.

Reguluje procesy trawienia, spowalnia procesy starzenia, wpływa na

wzrost kości u dzieci. Przeciwdziała zakrzepom. Asymiluje cukry

i wyrównuje ich poziom we krwi, dzięki czemu polecana jest osobom

chorym na cukrzycę [9, 11].

Oliwa z oliwek poza swoim kulinarnym znaczeniem ma również

szerokie zastosowanie w lecznictwie i kosmetyce. Stosowanie oliwy

z oliwek jako kosmetyku daje pożądane rezultaty. Smarowanie skóry

surową oliwą nadaje jej zdrowy, promienny wygląd oraz przynosi ukojenie

skórze narażonej na działanie niekorzystnych czynników atmosferycznych

i stresu. Zawarte w oliwie witaminy i składniki wnikają w głąb skóry,

powodując wygładzenie zmarszczek, odświeżenie, natłuszczenie. Oliwa

jest naturalnym, ale słabym filtrem UV. Zawarta w oliwie witamina F jest

jednym ze składników chroniących skórę przed utratą wilgoci. Przywraca

ona naturalną barierę i odbudowuje płaszcz lipidowy naskórka, likwidując

szorstkość skóry. Oliwa z oliwek stosowana jest do kąpieli, maseczek,

peelingów, jako substytut kremu oraz do masażu pobudzającego krążenie

krwi, dzięki któremu skóra staje się lepiej odżywiona i gładsza [11].

4.5. Tłuszcz kokosowy

Wysuszone bielmo orzecha kokosowego, zwane koprą, zawiera znaczne

ilości tłuszczu od 60 do 70%. Z kopry poprzez tłoczenie i rozgrzanie jej,

otrzymywany jest olej kokosowy, który w temperaturze pokojowej ma

postać stałą. Olej ten bezpośrednio po tłoczeniu lub ekstrakcji ma ciemną

barwę oraz nieprzyjemny smak i zapach. Po procesie rafinacji uzyskuje on

białą barwę oraz pozbawiony zostaje nieprzyjemnego smaku i zapachu.

Wyróżnia się on wysoką zawartością kwasów nasyconych, w tym kwasu

laurynowego, kwasu mirystynowego, kwasu palmitynowego oraz kwasu

,



205

stearynowego (tabela 1). Dzięki takiemu składowi tłuszcz kokosowy jest

odporny na utlenianie. Tłuszcz ten znajduje szerokie zastosowanie

w ciastkarstwie i cukiernictwie, gdzie używany jest do wyrobu ciast,

smażenia, powlekania krakersów, produkcji lodów i wyrobów

czekoladopodobnych. Jest również cennym komponentem przy produkcji

ciasta francuskiego i kruchego ze względu na zawartość kwasu

laurunowego [3, 10].

W przemyśle kosmetycznym stosuje się go jako czysty olej do ciała

lub masażu, dzięki temu, iż posiada działanie uspokajające i chłodzące.

Ponadto stosowany jest w preparatach do pielęgnacji zniszczonych

i suchych włosów oraz jako dodatek do kosmetyków przeznaczonych do

skóry suchej i pękającej oraz do skóry dojrzałej i uszkodzonej przez słońce.

Ma on również zastosowanie przy produkcji mydeł pieniących się

w morskiej wodzie. Stosowany jest również do wyrobu luksusowych

środków piorących oraz płynów kąpielowych i balsamów pod prysznic ze

względu na zawartość kwasu laurynowego [10].

Tłuszcz kokosowy znalazł także zastosowanie w przemyśle chemicznym,

gdzie używany jest w produkcji świec i aparatury włókienniczej. Z tłuszczu

kokosowego otrzymuje się także alkohole i kwasy tłuszczowe.

5. Nowe możliwości wykorzystania lipidów zawartych

w wybranych gatunkach pestkowców tropikalnych

Jednym z możliwych kierunków wykorzystania niektórych ze

wspomnianych wcześniej olejów, szczególnie oleju z migdałów, oleju

z awokado i oliwy z oliwek, jest produkcja tych olejów jako żywności

funkcjonalnej wzbogacanej dodatkowo np. w fitosterole i witaminę E.

Fortyfikowane oleje z owoców egzotycznych spełniałyby wymagania

stawiane żywności funkcjonalnej:

nie są w postaci proszku, kapsułki ani tabletki;

są produktem spożywczym pochodzącym z naturalnie występujących

składników;

są elementem codziennej diety;

ich konsumpcja sprzyjałaby wzmocnieniu mechanizmów obronnych

organizmu, zapobiegałaby chorobom serca [13].

Można przypuszczać, że olej z kawy stosowany obecnie w kosmetyce

znalazłby również zastosowanie w przemyśle spożywczym jako olej

konsumpcyjny. Byłby to szczególny produkt, przeznaczony dla wąskiej

grupy konsumentów. Głównym powodem wąskiego grona odbiorców

byłyby walory organoleptyczne, czyli: ciemniejsza barwa, charaktery-

tyczny smak i zapach palonych ziaren kawy oraz cena. Olej powinien być

pozyskiwany z najlepszych ziaren kawy, które byłyby poddane starannemu


206

paleniu, aby zachować specyficzny aromat. Ze względu na skład kwasów

tłuszczowych (wysoka zawartość kwasu linolowego, obecność kwasu

linolenowego i oleinowego) olej z kawy może być składnikiem sosów do

sałatek. Obecność nienasyconych kwasów tłuszczowych powoduje, że olej

ten nie powinien być stosowany do obróbki termicznej w wysokiej

temperaturze.

Olej migdałowy i tłuszcz kokosowy mogłyby znaleźć zastosowanie jako

oleje techniczne. Istnieje możliwość stosowania ich jako komponent do

różnego rodzaju środków smarowych, zarówno smarów nietoksycznych,

jak i podatnych na rozkład biologiczny. Takie smary mogłyby znaleźć

zastosowanie w różnego rodzaju maszynach i urządzeniach precyzyjnych.

Egzotyczne oleje roślinne mogą zostać wykorzystane jako paliwo

do silników Diesla zastępując tym samym olej napędowy. Oleje te mogą

być stosowane jako samodzielne paliwo silnikowe, jako domieszki do

paliwa oraz jako surowiec do produkcji biodiesla. Biodiesel to

przetworzony chemicznie na drodze transesteryfikacji olej roślinny. Paliwo

to przeznaczone jest do stosowania w silnikach Diesla, bez przeróbek

wymaganych do zastosowania surowego oleju roślinnego. Wynika to ze

zbliżonej lepkości biodiesla i oleju napędowego oraz krzepnięcia w niższej

temperaturze niż olej roślinny. Na rynku obserwuje się wzrost

wykorzystania olejów roślinnych jako paliw. Jest to spowodowane

rosnącymi cenami ropy naftowej. Zastosowanie olejów egzotycznych jako

paliwa byłoby uzasadnione ekonomicznie jedynie w krajach ich

pozyskiwania [14].

6. Podsumowanie

Owoce egzotyczne stanowią bogate źródło cennych składników,

które znajdują zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu. Obecnie na

rynku konsument ma dostęp do licznej grupy owoców tropikalnych oraz

produktów z nich otrzymywanych. Istotne jest przekazanie odbiorcom

informacji dotyczących możliwości wykorzystania nowego asortymentu.

Świadomy konsument może sam podjąć decyzję o tym czy chce korzystać

z różnorodności i bogactwa jakie niosą produkty otrzymywane z roślin

egzotycznych. Niektóre z zastosowań praktycznych mogą być dostępne

jedynie w miejscu naturalnego występowania lub uprawy omawianych

gatunków. Spowodowane jest to względami ekonomicznymi lub nietrwa-

łością niektórych produktów.

Najpowszechniejszymi kierunkami praktycznego zastosowania lipidów

zawartych w awokado właściwym, kawie arabskiej, migdałowcu

zwyczajnym, oliwce europejskiej oraz kokosie właściwym jest przemysł

spożywczy, przemysł kosmetyczny, przemysł farmaceutyczny i medycyna.

,



207

Oleje pozyskane z wymienionych gatunków pestkowców egzotycznych

wyróżniają się wysokimi walorami smakowymi i zapachowymi,

charakterystycznymi dla surowców, z których zostały otrzymane. Stanowią

one źródło cennych składników odżywczych: witamin, nienasyconych

kwasów tłuszczowych, soli mineralnych, fitosteroli, lecytyny i innych.

Ze względu na bogactwo jakie niosą za sobą egzotyczne owoce, a wśród nich

liczna grupa pestkowców, stale powinny być poszukiwane nowe kierunki

wykorzystania zawartych w nich składników biologicznie aktywnych, w tym

lipidów.

Literatura

1. Naturalne lipidy – skuteczna bariera ochronna, Laboratoria.net, Innowacje,

Nauka, Technologie [online], [dostęp 24 stycznia 2014]. Dostępny w World

Wide Web: http://www.laboratoria.net/pl/technologie/3230.html

2. Kopcewicz J., Lewak S. Fizjologia roślin, Warszawa, PWN, 2007, s. 336-345,

413-415

3. Świetlikowska K., Kazimierczak R., Wasiak-Zys G. Surowce spożywcze

pochodzenia roślinnego, Warszawa, SGGW, 2008, s. 321, 336-340

4. Nowak B., Schulz B. Atlas owoców egzotycznych, Warszawa, Horyzont, 2002,

s. 17, 43-44, 73-75, 164-166

5. Lamer – Zarawska E. Owoce egzotyczne, Wrocław, Wydawnictwo Astrum,

2004, s. 62-669, 235-238, 275-283, 364-372

6. Wasilewski D. U źródeł kawy, Przegląd Piekarski i Cukierniczy, 2003, vol. 5,

s. 56-57

7. Hojden B. Zalety użytkowe i lecznicze migdałowca zwyczajnego, Wiadomości

Zielarskie, 2001, vol. 5, s. 13

8. Procyk A. Oliwka europejska, Wiadomości Zielarskie, 2001, vol. 5, s. 7

9. Wroniak M. Oliwa z oliwek znaczenie, technologia, klasyfikacja, Przemysł

Spożywczy, 2008, vol. 6, s. 26-31

10. Rutkowska J. Oleje niepospolite, Przegląd Piekarski i Cukierniczy, 2007,

vol. 1, s. 10-13

11. Portal Dbam o Zdrowie [online], [dostęp 16 stycznia 2014]. Dostępny

w World Wide Web: http://www.doz.pl

12. Lamer – Zarawska E. Tłuszcze z roślin egzotycznych stosowane

w kosmetykach, Wiadomości Zielarskie, 2001, vol. 5, s. 14-15

13. Jeznach M. Stan i perspektywy rozwoju rynku żywności funkcjonalnej,

Warszawa, Wydawnictwo SGGW, 2003, s. 11

14. Biodiesel – charakterystyka fizykochemiczna [online], [dostęp 27stycznia

2014]. Dostępny w World Wide Web: http://www.biodiesel.biz.pl

http://www.laboratoria.net/pl/technologie/3230.html

http://www.doz.pl/

http://www.biodiesel.biz.pl/


208

Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów wybranych gatunków

pestkowców tropikalnych

Streszczenie Owoce tropikalne, zwane inaczej owocami egzotycznymi lub owocami południowymi, to grupa różnorodnych owoców importowanych z krajów strefy klimatu tropikalnego i subtropikalnego. Ze względu na budowę owoców wyróżnia się m.in. owoce pestkowe, których przedstawicielami są awokado, mango, orzech kokosowy, pistacja, migdał, pekan. Powszechnie konsumowanymi częściami większości pestkowców jest mezokarp, czyli środkowa warstwa owocni zazwyczaj tworząca gruby, soczysto-mięsisty miąższ (np. awokado, mango) lub nasiona (np. kokos). W ostatnich latach coraz większą uwagę zwraca się na inne wykorzystanie owoców egzotycznych, a mianowicie jako potencjalne źródło lipidów. Dużą popularnością, szczególnie w ostatnich latach, cieszą się biooleje, czyli naturalne oleje roślinne pozyskiwane metodą tłoczenia na zimno lub metodą rafinacji. Wśród nich znajduje się liczna grupa egzotycznych olejów roślinnych, wykorzystywanych ze względu na możliwe działanie biologiczne, a także ze względów marketingowych. Producenci, aby przyciągnąć uwagę klientów, zamieszczają na etykietach swoich produktów egzotycznie brzmiące nazwy. Najpowszechniejszym zastosowaniem większości naturalnych lipidów roślinnych jest wykorzystanie ich do celów spożywczych, ale także w farmacji i kosmetyce jako nośniki lub podłoża dla substancji czynnych, przy produkcji leków, maści, zastrzyków, kremów. Niniejsza praca ma na celu przedstawienie obecnych, ale i wskazanie nowych kierunków wykorzystania lipidów zawartych w wybranych gatunkach pestkowców egzotycznych (awokado właściwym, kawie arabskiej, oliwce europejskiej, migdale zwyczajnym i orzechu kokosowym).

Słowa kluczowe: lipidy, owoce tropikalne, pestkowce

The possibility of the practical use of lipids contained in the selected

species of tropical drupes

Abstract Tropical fruit, otherwise known as exotic fruit or southern fruit, a group of a variety of fruits imported from tropical and subtropical climate zone. Due to the fruit construction, among others, include drupes, which are representatives of avocado, mango, coconut, pistachio, almond, pecan. Commonly consumed part of the most drupes is mesocarp, which is the middle layer of the pericarp usually forming a thick, fleshy and juicy flesh (e.g. avocado, mango) or seeds (such as coconut). In recent years, more attention is paid to the other use of exotic fruit, namely as a potential source of lipids. Very popular, especially in recent years, are the bio-oils, that are natural plant oils obtained by cold pressing or by refining. Among them is a large group of exotic oils, used due to possible biological effects, as well as for marketing reasons. Producers to attract the attention of customers, put on the labels of their products exotic-sounding name. The most common use of most natural plant lipids is to use them for food, but also in pharmacy and cosmetics as carriers or base for the active substances in the production of medicines, ointments, injectables, creams. This paper aims to provide current, but also to identify new directions of use of lipids contained in the selected species of exotic drupes (avocado, Arabic coffee, European olive, almond and coconut). Keywords: lipids, tropical fruit, drupes

209

Magdalena Bartosiak1, Anna Cieślak

2

Zastosowanie enzymów amylolitycznych

i proteolitycznych w przemyśle spożywczym

1. Wstęp

Enzymy są wyspecjalizowanymi białkami obecnymi w organizmach

żywych. Umożliwiają przeprowadzenie wielu reakcji chemicznych oraz są

niezbędne dla prawidłowego metabolizmu wszystkich organizmów. Mogą

być również wykorzystane poza organizmami dla przyspieszenia

wybranych reakcji chemicznych. Są stosowane od tysięcy lat (początkowo

w sposób nieświadomy), co jest związane ze znaczeniem mikro-

organizmów w wytwarzaniu wielu produktów spożywczych. Ich

skuteczność, specyficzność oraz łatwość stosowania spowodowały, że są

często używane w przetwórstwie żywności. Postępy biotechnologii

w ostatnich latach pozwoliły na dalsze udoskonalenie zastosowania

enzymów w przemyśle spożywczym. Znaleziono rozwiązania dla wielu

problemów technologicznych i wytyczono drogę dla wielu nowych

ekscytujących możliwości. Najbardziej znanym przykładem korzyści

odniesionych dzięki nowoczesnej technologii z zastosowaniem enzymów

jest rozkład skrobi do cukrów prostych. Zastosowanie procesu

enzymatycznego nie wymaga specjalnych warunków, oszczędza energię

i zapobiega powstawaniu zanieczyszczeń [17, 20]. Amylazy są

odpowiedzialne za enzymatyczny rozkład cukrów, do osiągnięcia

aktywności wymagają obecności jonów wapnia, które poprawiają

stabilność enzymu i biorą udział w reakcji katalitycznej. Poznane zostały

różne rodzaje amylaz i różne możliwości ich klasyfikacji. Szerokie

zastosowanie w przemyśle spożywczym znalazły również enzymy

proteolityczne. Ich zdolność do hydrolizy białek jest wykorzystywana

głównie w serowarstwie, przy produkcji produktów mlecznych i ogólniej

modyfikacji składników żywności.

1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii

i Biotechnologii, Zakład Biochemii, Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron” 2 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii i Biotechnologii,

Zakład Biochemii, Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron”




210

2. Enzymy amylolityczne

2.1. Ogólna charakterystyka enzymów amylolitycznych

Enzymy amylolityczne (amylazy) zaliczane są do podklasy hydrolaz

(EC. 3.2), czyli grupy enzymów, których zasada działania opiera się na

przerywaniu wiązania glikozydowego w procesie hydrolizy [1]. Hydrolazy

w roztworach wodnych katalizują przede wszystkim hydrolizę wiązań

glikozydowych, ale w przypadku obecności dużych stężeniach cukru mogą

katalizować reakcje kondensacji, a w szczególnych przypadkach również

reakcje transglikozylacji. Amylazy, odpowiedzialne za enzymatyczny

rozkład cukrów, do osiągnięcia aktywności wymagają obecności jonów

wapnia, które poprawiają stabilność enzymu i biorą udział w reakcji

katalitycznej. Aktywacja enzymów odbywa się przy udziale jonów

chlorkowych lub innych anionów. Ponadto różnią się między sobą

wartością optymalnej temperatury i pH, przy których wykazują

maksymalną aktywność[4].

Poznane zostały różne rodzaje amylaz i różne możliwości ich klasyfikacji.

Z punktu widzenia możliwości hydrolizy różnych wiązań glikozydowych

można je podzielić na hydrolizujące wiązania α-1,4-glikozydowe

(α-amylazy, β-amylazy), hydrolizujące wiązania α-1,6-glikozydowe

(izoamylazy i pululanazy) oraz hydrolizujące wiązania α-1,4-glikozydowe

i α-1,6-glikozydowe (glukoamylazy i niektóre pullanazy). Ze względu na

miejsce cięcia wiązania glikozydowego w cząsteczce skrobi amylazy

można sklasyfikować do endoamylaz (α-amylazy, amylazy znoszące

rozgałęzienia) oraz egzoamylaz (glukoamylazy i β-amylazy). Biorąc pod

uwagę rodzaj zachodzących procesów możemy je podzielić na enzymy

upłynniające (α-amylazy, izoamylazy, pululanazy) i scukrzające (β-amylazy,

glukoamylazy i niektóre α-amylazy). Podział enzymów amylolitycznych

może nastąpić również ze względu na źródło ich pochodzenia i konfigurację

centrum anomerycznego uwalnianych produktów hydrolizy [3].

W przemyśle największe znaczenia ma katalizowana przez enzymy

amylolityczne reakcja hydrolizy skrobi do cukrów prostych [2].

W zależności od stopnia hydrolizy [4] i sposobu rozrywania wiązania

glikozydowego [5] istnieje możliwość otrzymania wielu różnych

Enzym Rodzaj hydrolizowanego wiązania

α-amylaza α 1,4- glikozydowe wewnątrz łańcucha skrobi

β-amylaza α-1,4-glikozydowe między drugą a trzecią jednostka

glukozową, licząc od nieredukującego końca łańcucha

γ-amylaza α-1,4-glikozydowego

pullanaza 1,6 glikozydowe jedynie w przypadku kiedy łączy ono

łańcuchy połączone wiązaniem α-1,4

,

Zastosowanie enzymów amylolitycznych i proteolitycznych w przemyśle spożywczym

211

produktów, np.: glukoza, fruktoza, maltoza, dekstryny [4]. W procesie

hydrolizy skrobi najważniejszą rolę odgrywają α amylazy, βamylazy,

glukoamylazy oraz enzymy usuwające rozgałęzenia, głównie pullanazy [2].

2.2. α-amylaza: charakterystyka i zastosowanie

α-amylaza (EC 3.2.1.1,4-glukanohydrolaza α,1→4-glukanu) [5]

to endoenzym mający największe znaczenie w procesie upłynniania skrobi.

Posiada ona zdolność zrywania wiązania α 1,4- glikozydowego wewnątrz

łańcucha skrobi, powodując tym samym spadek lepkości obrabianego

kleiku skrobiowego [2]. Pierwszy etap procesu hydrolizy skrobi

z zastosowaniem α-amylazy polega na upłynnieniu skrobi przy użyciu

enzymu przez podgrzanie do temperatury 105°C na czas 2-5 minut oraz

przetrzymanie w temperaturze 90-100 °C przez 1 – 2 godziny. Stosowanie

tak wysokiej temperatury wymaga odpowiednio dużej termostabilności

enzymu. Ulepszenie tej cechy można otrzymać dzięki technologii

rekombinacji genetycznej [6].

Rys.1 Model upłynniania cząsteczki amylopektyny przy udziale alfa-amylazy

Pod względem biochemicznym α-amylazy to metylohydrolazy. Domena

katalityczna enzymu to domena typu α,β-1,8- beczułki zbudowanej

z naprzemiennie ułożonych ośmiu helis i ośmiu odcinków β fałdowych.

Szósta helisa ma charakter nieciągły i złożona jest z 2 krótkich odcinków

helikalnych połączonych odcinkiem łańcucha polipeptydowego. Po

rozciągnięciu naprzemiennie ułożone są odcinki beta-fałdowe i alfa-helisy

połączone pętlami. Najistotniejszą funkcję pełni pętla trzecia, łącząca

trzecią helisę i trzeci odcinek β-fałdowy. Jest ona stosunkowo długa

i zawiera reszty aminokwasów katalitycznych: jedną resztę kwasu

glutaminowego i dwie reszty kwasu asparaginowego. Miejsce, które łączy

substrat w tej domenie w centrum katalitycznym ma również

skomplikowaną strukturę. W miejscu wiążącym występuje 10 podmiejsc


212

ponumerowanych od 0 do 9 i w których wiążą się kolejne reszty

glukopiranozy. Wiązany jest tu oligosacharyd zbudowany z 10 reszt

glukopiranozy bądź to być część łańcucha amylozy czy amylopektyny.

Następnie następuje przecięcie wiązania między resztami, które są wiązane

w podmiejscach 6 i 7. Taka struktura miejsca wiążącego w centrum

aktywnym tłumaczy fakt, że α-amylaza hydrolizuje układ większych

substratów oraz hydrolizuje oligodekstryny o minimalnej długości 10 reszt.

W tym ostatnim przypadku hydroliza zachodzi dużo wolniej [7,8,9].

Najlepiej została poznana produkcja α-amylazy przez bakterie Bacillus

subtilis, jednak do zastosowań komercyjnych stosuje się α-amylazę

otrzymywaną ze szczepu bakterii Bacillus licheniformis, ponieważ enzym

ten wykazuje stabilność i aktywność w temperaturach przekraczających

90°C. Ponadto aktywność enzymu w małym stopniu zależna jest od pH

roztworu i stężenia jonów wapnia. Wyróżnić jeszcze możemy α-amylazę

pochodzenia grzybowego, która jest bardziej odporna na zmiany pH

środowiska reakcji, jednak wykazuje większa termo labilność [6].

2.3. β- amylaza: charakterystyka i zastosowanie

β- amylaza (EC 3.2.1.2,maltohydrolaza α-1→4-glukanu) [5] to główna

egzoamylaza stosowana w hydrolizie skrobi [2]. Hydrolizując wiązanie

α-1,4-glikozydowe [5] między drugą a trzecią jednostka glukozową, licząc

od nieredukującego końca łańcucha [2], zmieniają konfigurację α przy C1

glukozy w konfigurację β (stąd nazwa β-amylazy)[5]. Enzym ten najlepiej

działa w środowisku o temperaturze 55-56°C i pH około 5 [10].

Amylopektynę i glikogen rozkładają tylko w około 50%, ponieważ

wiązania α,l→6-glikozydowe przeszkadzają im w działaniu. Niestrawiona

reszta wykazuje wysoki stopień polimeryzacji i jest nazwana dekstryną

graniczną β-amylazy [5]. W wyniku działania na skrobię β-amylazą jako

produkt otrzymuje się maltozę oraz wspomniane wyżej dekstryny

graniczne[2]. Cząsteczka enzymu może hydrolizować około 252 000 wiązań

na minutę. Dla prawidłowego funkcjonowania enzymu są istotne grupy

sulfhydrylowe obecne e centrum aktywnym [5]. W odróżnieniu od innych

enzymów hydrolitycznych nie zawiera w centrum aktywnym jonów metali.

Pod względem biochemicznym to oligomeryczne białko najczęściej

zbudowane z identycznych podjednostek. Każda podjednostka zawiera

centralnie położoną domenę katalityczną o charakterze αβ-1,8-beczułki.

Zbudowana jest ona z ośmiu helis i ośmiu odcinków β-fałdowych. Helisy

stanowią otulinę zewnętrzną, natomiast odcinki β-fałdowe wyściółkę

domeny. Ponadto wyróżnić można kieszeń katalityczna złożoną z dwóch

reszt kwasu glutaminowego bądź reszty kwasy glutaminowego i reszty

kwasy asparaginowego oraz reszty tyrozyny

,


213

Rys.2 Model upłynniania cząsteczki amylopektyny przy udziale β-amylazy

2.4. γ- amylaza

γ-amylaza (EC 3.2.1.3 4-glukanoglukohydrolaza-α-1,4-glukanu,

glukoamylaza) to enzym umożliwiający wysoce specyficzną hydrolizę

wiązania α-1,4-glikozydowego. Pozyskiwany jest z transgenicznych

szczepów Aspergillus niger oraz Aspergillus awamori . Końcowym

produktem reakcji jest glukoza: enzym rozszczepia po jednej cząsteczce

glukoza aż do miejsca rozgałęzienia. γ-amylaza zdolna jest również do

hydrolizy wiązań α-1,6-glikozydowych. Jednak reakcja ta zachodzi z małą

wydajnością [2]. Enzym wykazuje największą aktywność w środowisku

o temperaturze 40-65°C. Ponadto charakteryzuje się dużą odpornością na

zmiany pH (1,8-8,8 dla A. niger i 1,8-10,5 dla A. awamori). Warto

zaznaczyć, że w przeciwieństwie do α-amylazy obecność jonów wapnia

działa inhibicyjnie na proces hydrolizy skrobi z udziałem β-amylazy [10]

Atak enzymu rozpoczyna się na nieredukującym końcu łańcucha

polimerowego, a powstała glukoza ma konformację β. W przypadku, gdy

stężenie glukozy bądź enzymu w środowisku reakcji jest wysokie możliwe

jest zajście reakcji odwrotnych, tj. repolimeryzacji glukozy do maltozy

i izomaltozy.

2.5. Pullanaza

Pullanaza (EC 3.2.1.41, pullulan-6-glukanohydrolaza) to enzym usuwający

rozgałęzienia zarówno w amylozie jak i amylopektynie. Przy użyciu tego

enzymu możliwa jest hydroliza wiązania 1,6 glikozydowego jedynie

w przypadku kiedy łączy ono łańcuchy połączone wiązaniem α-1,4 (np. w pul

lulanie, stąd nazwa enzymu). Poza tym, na skalę przemysłową produkowane

są również preparaty pullanaz mogące hydrolizować wiązanie

1,4-glikozydowe. Produktem końcowym reakcji z udziałem enzymu są oligo-


214

i polisacharydy, a optymalna temperatura do działania tego enzymu to 60°C.

Izolowany jest on głównie z bakterii mezofilnych lub termofilnych,

np.: Geobacillus stearothermophilus, Bacillus stearothermophilus [2, 11].

2.6. Zastosowanie enzymów amylolitycznych w przemyśle

Ze względu na specyficzność substratową enzymów, która zapobiega

powstawaniu niepożądanych produktów ubocznych, możliwości

prowadzenia reakcji enzymatycznych przy względnie niskich wartościach

temperatury, pH i ciśnienia w porównaniu do procesów chemicznych,

możliwości immobilizacji enzymów na stałych nośnikach, która usprawnia

wydajność procesu i zapobiega przedostawaniu się enzymów do gotowego

produktu [2, 12] preparaty enzymatyczne wciąż umacniają swoja pozycję

na rynku przemysłowym. Jednym z nich są preparaty enzymów

amylolitycznych, które opanowały niemal cały, szeroko pojęty, przemysł

spożywczy. Dzięki możliwości katalizowania procesu hydrolizy skrobi,

który może przebiegać w różnym stopniu, znajdują one zastosowanie

głównie przy produkcji syropów maltodekstrynowych (powstają po

procesie upłynnienia skrobi), glukozowych i maltozowych (dwa ostatnie

powstają po procesie scukrzania upłynnionej już wcześniej skrobi).

Poszczególne syropy charakteryzuje tzw. ekwiwalent dekstrozowy DE

(ang. Dextrose equivalent), wyrażony w procentowej zawartości cukrów

redukujących (zwykle rownoważnikow glukozy) na jednostkę suchej masy

produktu. Dla niezhydrolizowanej skrobi DE wynosi w przybliżeniu zero,

natomiast po zhydrolizowaniu jej do glukozy DE wzrasta do 100 [14].

Syropy glukozowe znajdują głównie zastosowanie w przemyśle

browarniczym, gorzelniczym oraz piekarniczym. Otrzymuje się z nich

syropy fruktozowe dodawane do konfitur, syropów i popularnych napojów

gazowanych typu Coca Cola [3, 15]. Z glukozy otrzymuje się też tzw.

polidekstrozę niskiej kaloryczności oraz sorbitol. Syropy maltodekstrynowe

stosowane są jako zagęszczacze, inhibitory krystalizacji, regulatory

wilgotności przetworów spożywczych [3, 13, 14]. Mogą być wykorzystywane

do ochrony związków małocząsteczkowych (np. aromatów żywności) przed

utlenianiem, ponieważ wykazują skłonność do kapsułkowania aromatów.

Obecnie biorą również udział w produkcji środków spożywczych dla

niemowląt i odżywek dla sportowców. Z kolei syropy maltozowe ogrywają

największa rolę w przemyśle cukierniczym. Służą do zapobiegania

krystalizacji sacharozy [13, 14]. Ich dodatek do żywności ułatwia kontrolę

wodochłonności. Syropy te stosuje się także jako wypełniacze i stabili-

zatory żywności przetworzonej[o]. Dzięki możliwości zapobiegania

tworzenia się kryształków lodu, syropy o dużej zawartości maltozy stosuje

się do produkcji lodów i mrożonej żywności. Ponadto wykorzystywane

,


215

są w procesie produkcyjnym napojów bezalkoholowych oraz żywności

dla diabetyków. Syropy ze skrobi stosuje się również jako substytuty

tłuszczów w żywności fat free [3, 13, 14]. Poza otrzymywaniem syropów

enzymy amylolityczne biorące udział w enzymatycznej hydrolizie skrobi

wykorzystywane są przy produkcji kwasów organicznych takich jak kwas

glukonowy, który znajduje zastosowanie w przemyśle spożywczym,

np.: glukoniany wapnia, żelaza i magnezu służą jako dodatki wzbogacające

produkty spożywcze w odpowiednie sole mineralne. Dodatkowo, enzymy

te usuwają zanieczyszczenia skrobiowe z różnego rodzaju produktów

spożywczych, np. służą do klarowania soków i win. Główną rolę w tym

procesie odgrywają α-amylazy o optimum pH 3-4. Bez amylaz upadłoby

gorzelnictwo i browarnictwo. Preparaty enzymatyczne używane są do

hydrolizy skrobi głównie pochodzenia roślinnego (kukurydza, maniok,

pszenica, ziemniaki). Natomiast przy produkcji piwa uczestniczą

w zacieraniu słodu i procesie klarowania, zwiększając wydajność warzelni

i obniżając koszty związane z budową i eksploatacją słodowni [3, 14].

Dzięki zdolności amylaz do zwiększania zawartości cukrów, a tym

samym możliwości wzmożenia fermentacji, wykorzystuje je także

piekarstwo. Zintensyfikowana przez enzymy fermentacja spulchnia ciasta,

zwiększa porowatość oraz poprawia zarówno kolor skórki jak i smak

i zapach pieczywa. Ponadto stosowane są przy produkcji pasz, gdzie

doskonalą ich przyswajalność [14].

3. Enzymy proteolityczne

3.1. Ogólna charakterystyka enzymów proteolitycznych

Enzymy proteolityczne stanowią najważniejszą grupę enzymów.

Katalizują hydrolizę wiązań peptydowych w białkach i peptydach. Należą

do klasy 3 – hydrolaz. Enzymy proteolityczne możemy podzielić na trzy

grupy w zależności od funkcji, mechanizmu działania i struktury białka:

Mechanizm katalizy. W tej grupie proteaz wyróżniamy proteazy:

serynowe, cysteinowe, treoninowe, asparaginowe, glutaminianowe,

aspartylowe oraz metaloproteazy;

Rodzaj katalizowanej reakcji. Wszystkie proteazy katalizują tą samą

reakcję – hydrolizy wiązania peptydowego. Natomiast nie wszystkie

proteazy katalizują hydrolizę tego samego rodzaju wiązań

peptydowych. Jedną z cech na podstawie której dokonujemy podziału

proteaz jest położenie wiązania peptydowego, które ma ulec hydrolizie.

W tej grupie wyróżniamy: endopeptydazy, omegapeptydazy, egzo-

peptydazy, aminopeptydazy, karboksypeptydazy, dipeptydylo-

peptydazy, tripeptydylopeptydazy, peptydylodipeptydazy i dipeptydazy;


216

Struktury molekularnej i homologii – jest to najnowsza z grup

podziału. Zależy od znajomości sekwencji aminokwasowej

i struktury przestrzennej peptydu ulegającego hydrolizie.

Proteazy serynowe zawierają w centrum aktywnym serynę oraz

histydynę, jako dawcę ładunku dodatniego; hamowane przez

diizopropylofluorofosforan (DIFP) np. trypsyna, chymotrypsyna, elastaza,

trombina. Proteazy cysteinowe zawierają w centrum aktywnym grupę

tiolową cysteiny w bezpośrednim sąsiedztwie pierścienia imidazolowego His

np. katepsyna II, enzymy roślinne: papaina bromelaina, ficyna [7]. Proteazy

aspartylowe zawierają w centrum aktywnym 2 grupy karboksylowe, zarówno

w charakterze grupy nukleofilowej, jak i dawcy protonu, działają one

z reguły w środowisku o małym pH np. pepsyna, podpuszczka, katepsyna

IV, niektóre enzymy wenątrzkomórkowe zwierzęce oraz grzybowe.

Aktywność metaloproteaz zależna jest od obecności określonych jonów

metali (cynku, wapnia czy manganu) np. karboksypeptydaza A i B,

bakteryjna termolizyna czy kolagenaza [13].

Peptydazy nie wykazują najczęściej ścisłej specyficzności w stosunku

do rozkładanego substratu, natomiast charakteryzują się wybiórczością

w stosunku do położenia rozkładanego wiązania wewnątrz łańcucha

polipeptydowego (endopeptydazy) i na jego skraju (egzopeptydazy).

Endopeptydazy to enzymy, które hydrolizują wiązania peptydowe

znajdujące się wewnątrz cząsteczki białka czy peptydu rozkładając go na

mniejsze fragmenty. Należą do nich pepsyna, trypsyna i chymotrypsyna.

Do endopeptydaz roślinnych zaliczane są: papaina, bromelanina,

aktynidyna i ficyna. Egzopeptydazy są enzymami, które hydrolizują

wiązania peptydowe znajdujące się na C- lub N- końcu białka, odczepiające

pojedyncze aminokwasy. Karboksypeptydazy to enzymy odczepiającymi

aminokwas na C końcu peptydu (wykazują specyficzność w stosunku do

sąsiedniego wolnego ładunku ujemnego grupy karboksylowej), natomiast

aminopeptydazy to enzymy odczepiającymi aminokwas na N końcu

peptydu (wykazują specyficzność w stosunku do sąsiedniego wolnego

ładunku dodatniego grupy aminowej) [7].

3.2. Zastosowanie enzymów proteolitycznych w przemyśle

3.2.1. Peptydazy pochodzenia mikrobiologicznego

W przemyśle spożywczym szerokie zastosowanie znalazły proteazy

asparaginowe, produkowane przez pleśnie z gatunków Mucor. Ich optimum

pH wynosi 4-4,5. Najważniejszym enzymem z tej grupy jest podpuszczka.

Jest stosowana w przemyśle serowarskim do koagulacji białek mleka.

Początkowo enzym ten był otrzymywany z żołądków cieląt. Kwaśne

,


217

proteazy pleśniowe nie hydrolizują kazeiny, tylko powodują jej ścinanie na

drodze koagulacji. Od preparatów kwaśnych proteaz wymagana jest

wysoka czystość. Zanieczyszczenia innymi protezami i lipazami, mogą

prowadzić do rozkładu kazeiny oraz powstania gorzkiego smaku. Kwaśne

proteazy są wytwarzane przez grzyby z rodzaju Mucor . Stosuje się

głównie do wyrobu serów typu cheddar. Proteaz pleśniowych używa się

również w piekarnictwie do poprawiania tekstury ciasta. Te enzymy są

również dodawane do piwa w celu zwiększenia jego klarowności

i ulepszenia warunków filtracji. W przemyśle mleczarskim proteazy

pleśniowe wykorzystywane są do stabilizacji zagęszczanego mleka

i produkcji hydrolizatów białkowych. Innym enzymem proteolitycznym

pochodzenia zwierzęcego, który ma zastosowanie przemysłowe jest

pepsyna, pozyskiwana z błony śluzowej żołądków kurcząt rzeźnych [2, 16].

Do hydrolizy białek soi używa się pepsynopodobne proteinazy kwaśne.

Proteazy wykorzystuje się dodatkowo do hydrolizy żelatyny. Żelatyna ma

małą wartość odżywczą, dlatego hydrolizaty dodaje się do napojów jako

niskokaloryczne wypychacze żołądka. Proteazy stosuje się również, aby

uzyskać produkty dietetyczne poprzez zmniejszanie wydzielania

natywnych enzymów. Stosowane są także do produkcji substytutu mleka

i kontroli gorzkiego smaku w hydrolizach białka. Dodatkowo, stosuje się je

w przetwórstwie rybnym, na rozdrobione resztki po rybie takie jak ości,

skóra czy płetwy działa się roztworem wodnym z proteazą. Za pomocą

pasteryzacji, denaturacji, odwirowania oddziela się substancje tłuszczowe

i produkt staje się rozpuszczalny [18]. Opracowano wiele procesów

polegających na sterowanej proteolizie białek żywnościowych w celu

polepszenia ich właściwości funkcjonalnych i smakowych. Do produkcji

autolizatów drożdżowych, wykorzystuje się własny kompleks enzymów

proteolitycznych komórek drożdżowych (tzw. endotrypsyny). Na drodze

enzymatycznej hydrolizy kwasów rybonukleinowych w drożdżach,

uzyskuje się z nukleotydów sól dwusodową kwasu 5’-inozynowego oraz

analogiczną sól kwasu 5’-guanilowego, które pod nazwą rybotydów lub

w skrócie IMP i GMP znajdują coraz szersze zastosowanie w przemyśle

spożywczym jako środki poprawiające smak [19, 13]. Lista zastosowań

enzymów proteolitycznych w technologii ciągle się powiększa.

3.2.2. Peptydazy pochodzenia zwierzęcego

W latach dziewięćdziesiątych skonstruowano rekombinowane

genetycznie drożdże i bakterie syntetyzujących proteazy podpuszczkowe

znane pod nazwą chymozyny. W serowarstwie wykorzystywana jest

kazeolityczna właściwość chymozyny (renniny), mającej zdolność ścinania

mleka na słodko w wyniku bardzo szybko przebiegających hydrolitycznych


218

zmian w jednej z frakcji kazeinowych. Następnie podpuszczka hydrolizuje

frakcje kazeinowe w czasie dojrzewania sera, powodując ich częściowe

doprowadzenie do stadium peptydów. Dalsza hydroliza peptydów do

aminokwasów i ich ewentualna dezaminacja lub dekarboksylacja jest

przypisywana działalności enzymów bakteryjnych. Wobec stale

zwiększającego się zapotrzebowania na podpuszczkę cielęcą zastępuje się

ją częściowo lub całkowicie innymi enzymami proteolitycznymi

o zbliżonym działaniu, jak pepsyną wołową lub wieprzową [17]. Enzymy

proteolityczne znalazły zastosowanie także w piwowarstwie. Używa się ich

do rozpuszczenia białek i zapobieżeniu zmętnieniom piwa przy jego

chłodzeniu [16].

3.2.3. Peptydazy pochodzenia roślinnego

Peptydazy pochodzenia roślinnego, mają duże znaczenie w przetwórstwie

żywności i innych gałęziach przemysłu. Najważniejszymi peptydazami

pochodzenia roślinnego, stosowanymi w przemyśle są: papaina, ficyna

i bromelaina. Enzymy roślinne stosowane są do zwiększania kruchości

mięsa. Enzymy roślinne atakują przede wszystkim białka tkanki łącznej

(kolagen i elastynę), a tylko w nieznacznym stopniu działają na włókna

mięśniowe, wpływając na tkankę łączną tylko w określonych warunkach.

Papaina wykorzystywana jest także w browarnictwie do klarowania piwa.

W przemyśle piekarskim dodatek tych enzymów bywa konieczny przy

stosowaniu pszenicy stepowej w celu rozluźnienia zbyt mocnego białka

glutenowego [20].

4. Podsumowanie

Enzymy to biokatalizatory powszechnie stosowane w przetwórstwie

żywności[2]. W praktyce stosowanie preparatów enzymatycznych

obejmuje prawie wszystkie gałęzie przemysłu spożywczego [13]. Używane

są one w początkowych etapach produkcji i często, w wyniku inaktywacji

w procesie np. gotowania, nie występują w gotowym produkcie.

Wyróżniamy różne grupy enzymów, które przyczyniają się do wytwarzania

i ulepszania produktów żywnościowych. Jednak to enzymy amylolityczne

i proteolityczne są najbardziej powszechne [2]. Największe korzyści

płynące z zastosowania takich biokatalizatorów to m.in.: podniesienie

jakości i wydłużenie trwałości produktów spożywczych, przyspieszenie

procesów technologicznych i zwiększenie wydajności tradycyjnie

stosowanych surowców oraz zmniejszenie kosztów produkcji [13, 14].

Wykorzystywane przez przemysł spożywczy enzymy sprzedawane

są w postaci preparatów wzbogaconych szeregiem substancji dodatkowych

takich jak stabilizatory, konserwanty, rozcieńczalniki, a produkowane

,


219

w większości przez mikroorganizmy (bakterie, grzyby), które coraz

częściej otrzymywane są metodami inżynierii genetycznej [2].

Literatura

1. Hill R., Needham J. The Chemistry of Life: Eight Lectures on the History of Biochemistry, London, England: Cambridge University Press, 1970

2. Kobus K. Transgeniczne mikroorganizmy w produkcji enzymów stosowanych w technologii żywności, Poznań, 2009

3. Kołodziejczyk A. Naturalne związki organiczne, Warszawa, Wyd. Naukowe PWN,, 2004

4. Grec M., Pastuch-Gawołek G. Enzymatyczna hydroliza skrobi do produktów małocząsteczkowych. Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu Chemia Bioorganiczna i Bionieorganiczna Dla studentów kierunku Chemia, specjalność Chemia Bioorganiczna, Materiały wykonane w ramach realizowane na Politechnice Śląskiej projektu nr UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01

5. Praca zbiorowa pod red. L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z biochemii, Warszawa, Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003

6. Olempska-Beer Z., Merker R. I., Ditto M. D., DiNovi M. J. Food-processing enzymes from recombinant microorganisms—a review, Regulatory Toxicology and Pharmacology 45, 2006

7. Stryer L., Tymoczko J. L., Berg J. M. Biochemia, PWN, 2007 8. Voet D., Voet J.G. Biochemistry, John Wiley&SONS, INC., 2011 9. Biotechnologia.pl 10. Pandey A., Nigam P., Soccol C.R., Soccol V.T., Singh D., Mohan R., Advances

in microbial amylases. Biotechnology and Applied Biochemistry 31, 2000 11. Domań-Pytka M., Bardowski J. Pullulan degrading enzymes of bacterial

origin. Critical Reviews in Microbiology, 30(2), 2004 12. MacCabe A.P., Orejas M., Tamayo E.N., Villanueva A., Ramo´n D.,

Improving extracellular production of food-use enzymes from Aspergillus nidulans. Journal of Biotechnology 96, 2005

13. Kączkowski J. Podstawy biochemii, WNT, Warszawa, 1993 14. http://www.cyfronet.krakow.pl/~rrlukasi/acro/przemysl/hydroliza_enzymatycz

na.pdf 15. Samborska K. Suszenie rozpyłowe enzymów – przyczyny inaktywacji oraz

metody i mechanizmy ich stabilizacj, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 6 (73): 7-17, 2010

16. Bednarski W.., Reps A. Biotechnologia żywności, Warszawa, Wydawnictwa Naukowo – Techniczne., 2003: 29-315

17. Nowak D. Enzymy jako nowoczesne narzędzie technologiczne. Agro Przemysł 2/2008

18. Sumantha A., Larroche Ch., Pandey A. Microbiology and Industrial Biotechnology of Food – Grade Proteases: A Perspective. Food Technol, 2006

19. Przemysl spoz̊ywczy; Miesięcznik naukowotechniczny: Food industries; monthly devoted to the technical problems of food industries

20. Pijanowski E., Dłużewski M.., Dłużewska A., Jarczyk A. Ogólna technologia żywności, Warszawa, Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, 2004


220

Zastosowanie enzymów amylolitycznych i proteolitycznych

w przemyśle spożywczym

Streszczenie

Enzymy są wyspecjalizowanymi białkami obecnymi w organizmach żywych, które umożliwiają przeprowadzenie wielu reakcji chemicznych i coraz częściej odgrywają ogromną rolę

w przetwórstwie żywności. W praktyce stosowanie preparatów enzymatycznych obejmuje

prawie wszystkie gałęzie przemysłu spożywczego. Największe korzyści płynące z zastosowania

biokatalizatorów to m.in.: podniesienie jakości i wydłużenie trwałości produktów spożywczych, przyspieszenie procesów technologicznych. Wyróżniamy różne grupy enzymów, które

przyczyniają się do wytwarzania i ulepszania produktów żywnościowych. Jednak to enzymy

amylolityczne i proteolityczne są najbardziej powszechne. Amylazy zaliczane do podklasy

hydrolaz, katalizują hydrolizę wiązania glikozydowego. Poznane zostały różne rodzaje amylaz i ich możliwości klasyfikacji, m.in. podzielić je można ze względu możliwości hydrolizy różnych

wiązań glikozydowych, miejsce cięcia wiązania glikozydowego w cząsteczce skrobi.

W przemyśle największe znaczenia ma katalizowana przez enzymy amylolityczne reakcja

hydrolizy skrobi do cukrów prostych. Natomiast enzymy proteolityczne katalizują hydrolizę wiązań peptydowych w białkach i peptydach. Proteazy dzielimy na trzy grupy w zależności od

ich mechanizmu katalizy, rodzaju katalizowanej reakcji i struktury białka ulegającego katalizie.

Enzymy amylolityczne i proteolityczne znajdują szerokie zastosowanie w przemyśle

spożywczym.

Słowa kluczowe: amylazy, proteazy, przemysł spożywczy

Aplication of amylolytic and proteolytic enzymes in the food industry

Abstract

Enzymes are specialized proteins occuring in living organisms that allow to carry out many

chemical reactions and play a huge role in food processing. In practice, the application of enzymes include almost all branches of the food industry. The greatest benefits of using

biocatalysts include: improving the quality and extend the durability of food products

or acceleration of technological processes. There are a few different groups of enzymes that

contribute to the production and improvement of food products. However, amylolytic and

proteolytic enzymes are the most common ones. Amylases are included in the subclass

of hydrolases, catalyze the hydrolysis of the glycoside bond. At present we know a few

different types of amylases and their classification capabilities. They can be divided by the

ability of hydrolysis the glycosidic bonds or by various cleavage sites of glycoside bond in the starch molecule. In industry, the greatest importance is catalyzed by amylolytic

enzymes reaction of hydrolysis starch to sugars. In contrast, proteolytic enzymes catalyze

the hydrolysis of peptide bonds in proteins and peptides. Proteases can be divided into three

groups depending on their mechanism of catalysis, the type of catalyzed reaction catalyzed and structure of catalyzed protein. Proteolytic and amylolytic enzymes are widely used

in the food industry.

Key words: amylases, proteases, food industry

221

Maciej Gierada1, Rafał Rachwalik

2

Rola reakcji ubocznych

w procesie izomeryzacji α-pinenu

1. Wstęp

Jednym z monoterpenów bicyklicznych jest α-pinen. W naturze związek

ten występuje bardzo powszechnie. Jest głównym składnikiem olejków

eterycznych pozyskiwanych z praktycznie każdego drzewa iglastego. Przez

przemysł chemiczny związek ten pozyskiwany jest głównie z terpentyny

siarczanowej, będącej produktem ubocznym, otrzymywanym podczas

przeróbki drewna w procesie produkcji papieru. Terpentyna ta zawiera

około 60-70% α-pinenu oraz około 20% β-pinenu [1]. Ze względu na

obecność w cząsteczce α-pinenu wiązania podwójnego oraz czteroczło-

nowego pierścienia, związek ten ulega szeregu przemianom. Zalicza się

do nich m.in. proces izomeryzacji [2].

Prowadząc izomeryzację α-pinenu na stałych katalizatorach o charakterze

kwasowym otrzymuje się jako główny produkt kamfen [3]. Substancja ta

może być surowcem w procesie syntezy: kamfory, izoborneolu, borneolu

oraz octanu izobornylu. Wszystkie te związki znalazły zastosowanie

zarówno w przemyśle perfumeryjnym jak również i w przemyśle

farmaceutycznym [4]. Podstawową technologią otrzymywania kamfenu jest

poddanie izomeryzacji α-pinenu na uwodnionym TiO2 modyfikowanym

H2SO4 w temperaturze około 160°C [5]. Taki katalizator charakteryzuje się

relatywnie małą aktywnością, reakcje przebiegają stosunkowo wolno,

a poza tym przysparza wielu problemów, m.in. powoduje korozję

aparatury. Aby zoptymalizować proces produkcji kamfenu poszukuje się

innych, bardziej efektywnych katalizatorów [6].

Stwierdzono, że w procesie izomeryzacji α-pinenu uczestniczą kwasowe

centra aktywne, stąd badania nad optymalizacją procesu izomeryzacji tego

związku były prowadzone na różnego rodzaju katalizatorach posiadających

właściwości kwasowe. Jako katalizatory rozważano m.in. takie związki jak:

tlenki metali modyfikowane kwasem (np. ZrO2) [7] lub mieszaniny

tlenków metali [8], modyfikowane zeolity [9], porowate fosforany [10],

1 [email protected], Politechnika Krakowska, Wydział Inżynierii i Technologii Chemicznej,

Instytut Chemii i Technologii Organicznej http://www.chemia.pk.edu.pl/wiitch/index.php 2 Politechnika Krakowska, Wydział Inżynierii i Technologii Chemicznej, Instytut Chemii i Technologii

Organicznej http://www.chemia.pk.edu.pl/wiitch/index.php


http://www.chemia.pk.edu.pl/wiitch/index.php

http://www.chemia.pk.edu.pl/wiitch/index.php


222

heteropolikwasy [11] oraz aktywowane i modyfikowane materiały

warstwowe [12]. Jako produkty za każdym razem otrzymano mieszaninę

monoterpenów o składzie zmieniającym się wraz z upływem czasu trwania

procesu izomeryzacji. Skład ten zależał również od szeregu innych

czynników, takich jak: temperatura procesu, czy specyficzne właściwości

poszczególnych katalizatorów. Każdy z wyżej wymienionych układów

katalitycznych prowadził do otrzymania jako produktu głównego kamfenu

z selektywnością sięgającą około 30-50% [13].

Produkty izomeryzacji α-pinenu można podzielić na dwie grupy. Do

jednej z nich należą monoterpeny bicykliczne oraz tricykliczne takie jak:

kamfen, β-pinen, bornylen oraz tricyklen. Zatem są to związki utworzone

poprzez ekspansje pierścienia i jego wzrost. Podczas procesu izomeryzacji

α-pinenu powstają również związki o budowie monocyklicznej, do których

zalicza się: limonen, terpinolen, α- i β-terpinen, p-cymen i p-menten. Jak

widać, skład mieszany poreakcyjnej jest złożony. Bardzo trudno

wyeliminować powstawanie któregoś ze związków, gdyż poszczególne

izomery są produktami przejściowymi pomiędzy innymi, bardziej

stabilnymi termodynamicznie substancjami chemicznymi [14].

Zostało udowodnione, że centra aktywne typu Lewisa preferują

powstawanie produktów bi- oraz tri-cyklicznych, podczas gdy centra

aktywne typu Brønsteda zwiększają selektywność otrzymywania

produktów monocyklicznych. Gdy stosunek centrów aktywnych typu

Lewisa do Brønsteda jest wystarczająco wysoki, selektywność

otrzymywania kamfenu rośnie znacznie [15]. Przy mocnych centrach

kwasowych katalizatora i wysokich temperaturach prowadzenia procesu

w mieszaninie po izomeryzacji α-pinenu dominują produkty

monocykliczne, podczas gdy w obecności słabych centrów i w niskich

temperaturach dominującymi produktami będą monoterpeny bicykliczne

i tricykliczne, a wśród nich zdecydowanie najwięcej będzie kamfenu [16].

2. Cel i zakres pracy

Celem pracy jest określenie, czy podczas prowadzenia procesu

izomeryzacji α-pinenu w fazie ciekłej w obecności heteropolikwasów

reakcje uboczne pomiędzy produktami głównej reakcji zachodzą, a jeżeli

tak, to jaka jest ich rola i wpływ ten proces.

3. Metodyka badań

W reaktorze szklanym zaopatrzonym w płaszcz grzewczy oraz

mieszadło magnetyczne procesowi izomeryzacji poddano 20 cm3 α-pinenu.

Reakcję prowadzono w temperaturze 80°C z zastosowaniem układu

katalitycznego na bazie kwasu dodekawolframokrzemowego SiW12/SiO2

,

Rola reakcji ubocznych w procesie izomeryzacji α-pinenu

223

(Aldrich)30 (zwany dalej dla uproszczenia zapisu SiW12/SiO2) oraz, dla

porównania, z zastosowaniem katalizatora na bazie kwasu

dodekawolframofosforowego PW12/SiO2(Aldrich)30 (zwany dalej

PW12/SiO2). Oba wyżej wymienione układy katalityczne zostały

sporządzone stosując metodę pierwszej wilgotności. Proces izomeryzacji

przeprowadzono dla różnych mas katalizatora, odpowiednio: 100 mg,

200 mg, 300 mg i 400 mg w takich samych warunkach temperaturowych.

Ponadto, transformacji poddano również produkty izomeryzacji α-pinenu,

a mianowicie limonen, terpinolen oraz α-terpinen. W określonych

odstępach czasowych, odpowiednio, 2 minuty od rozpoczęcia procesu

izomeryzacji, 5, 15, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 300, oraz 360 minut

pobierano z mieszaniny reakcyjnej kolejne próbki. Próbki te następnie

poddano analizie na chromatografie gazowym BRUKER 430-GC

z detektorem FID. Warunki analizy: temperatura dozownika 270°C,

temperatura detektora 300°C, temperatura pieca 70°C, analiza z programem

temperaturowym 5 minut w temperaturze 70°C, następnie 5 minut

z narostem temperatury z szybkością 5°C/min do 95°C. Objętość

analizowanych próbek wynosiła 1µl. Czas analizy pojedynczej próbki

wynosił 10 minut.

4. Wyniki

Analizując dane zebrane podczas prowadzenia procesu izomeryzacji

α-pinenu, stwierdzono, że zachodzi proces izomeryzacji, a jego efektem jest

obecność w mieszaninie reakcyjnej szeregu związków monoterpenowych.

Na Rys. 1 przedstawiono zmianę konwersji α-pinenu w funkcji czasu

trwania procesu, w zależności od rodzaju i masy zastosowanego

katalizatora.

Zaobserwowano, że ilość katalizatora wpływa w znacznym stopniu

na konwersję α-pinenu. W przypadku jego niewielkich ilości reakcja

izomeryzacji α-pinenu zachodzi bardzo wolno, a konwersja zwiększa się

powoli i nieznacznie. Jednak wraz ze zwiększeniem zawartości katalizatora

w mieszaninie konwersja α-pinenu również zwiększa się. Przy

zastosowaniu 400 mg układu katalitycznego od samego początku

konwersja α-pinenu jest bardzo wysoka. Oznacza to, że przy tej zawartości

katalizatora obserwuje się praktycznie całkowite przereagowanie α-pinenu

już w początkowej fazie procesu. Ponadto, katalizator na bazie PW12/SiO2

jest aktywniejszy w rozważanym procesie, w porównaniu do SiW12/SiO2.

Zgodnie z literaturą, kamfen powinien być głównym produktem

izomeryzacji α-pinenu. Faktycznie tak jest, a świadczy o tym wykres

przedstawiający zmianę selektywności otrzymywania kamfenu w funkcji

czasu trwania procesu (Rys. 2).


224

Rys. 3 Porównanie zmiany konwersji α-pinenu w zależności od zastosowanego

katalizatora i jego ilości w funkcji czasu trwania procesu [opracowanie własne]

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 100 200 300 400

Ko

nw

ersj

a [%

]

Czas prowadzenia procesu [min]

kat. SiW12/SiO2

100 mg

200 mg

300 mg

400 mg

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 100 200 300 400

Ko

nw

ersj

a [%

]


kat. PW12/SiO2

100 mg

200 mg

300 mg

400 mg

,


225

Rys. 4 Porównanie selektywności otrzymywania kamfenu na drodze izomeryzacji

α-pinenu w zależności od zastosowanego katalizatora i jego ilości w funkcji czasu

trwania procesu [opracowanie własne]

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

0 100 200 300 400

Sele

ktyw

no

ść [

%]


kat. SiW12/SiO2

100 mg

200 mg

300 mg

400 mg

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

0 100 200 300 400

Sele

ktyw

no

ść [

%]


kat. PW12/SiO2

100 mg200 mg300 mg


226

Selektywności otrzymywania tego związku, w odniesieniu do innych

monoterpenów, są prawie zawsze największe w przypadku każdego

z przeprowadzonych procesów izomeryzacji α-pinenu. Kamfen powstaje na

samym początku procesu izomeryzacji, a wraz z upływem czasu trwania

reakcji jego ilości, choć nieznacznie rosną, to utrzymują się na podobnym

poziomie. Początkowy wzrost selektywności otrzymywania kamfenu

związany jest z procesem stopniowej dezaktywacji katalizatora.

W momencie gdy powierzchnia katalizatora zostanie odpowiednio

zmodyfikowana poprzez osadzające się produkty reakcji (mogą to być

również produkty będące oligomerami monoterpenów) selektywność

otrzymywania kamfenu już nie zmienia się znacząco. Ponadto, na

selektywność otrzymywania kamfenu nie mają znaczącego wpływu

ewentualne reakcje uboczne, gdyż, co wynika z Rys. 2, selektywność

ta zależy jedynie od stosunku masowego α-pinen : katalizator.

Zaobserwowano, że zwiększenie ilości katalizatora wpływa na zmniejszenie

selektywności otrzymywania kamfenu. Podobne konkluzje zostały zawarte

w publikacji [13].

Oprócz kamfenu produktem końcowym izomeryzacji α-pinenu jest

p-cymen i p-menten (Rys. 3). Obecność w mieszaninie reakcyjnej obu tych

związków można tłumaczyć zachodzącymi procesami dysproporcjonowania,

ewentualnie odwodornienia. W początkowej fazie reakcji powstają znaczne

ilości limonenu, jednakże już po około 90 minutach od rozpoczęcia procesu

jego zawartość w mieszaninie jest znikoma. Świadczy to prawdopodobnie

o możliwości przegrupowania limonenu, czego efektem może być

otrzymanie innych związków. Analiza procesu izomeryzacji limonenu

wskazuje, że głównymi produktami tej reakcji w początkowej jej fazie jest

α-terpinen, natomiast pod koniec p-cymen oraz p-menten. Ciekawą

zależność zaobserwowano również dla α-terpinenu i terpinolenu.

W początkowej fazie procesu selektywności otrzymywania tych związków

rosną, jednakże już po 30 minutach reakcji selektywności maleją

stopniowo, aż do praktycznego ich zaniku pod koniec procesu. Świadczy to

o tym, że oba te związki mogą, podobnie jak limonen, ulegać reakcjom

następczym. Analiza produktów izomeryzacji terpinolenu wskazuje, że

głównym produktem tej reakcji jest α-terpinen, natomiast po

przeprowadzeniu izomeryzacji α-terpinenu w mieszaninie reakcyjnej

dominuje p-cymen i p-menten.

Przy zastosowaniu katalizatora PW12/SiO2 obserwacje izomeryzacji

α-pinenu niestety są utrudnione, gdyż wszystkie ewentualne reakcje

uboczne przebiegają bardzo szybko.

,


227

Rys. 5 Porównanie selektywności otrzymywania poszczególnych związków

monoterpenowych w procesie izomeryzacji α-pinenu w funkcji czasu trwania

procesu w obecności 400 mg katalizatora [opracowanie własne]

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

0 100 200 300 400

Sele

ktyw

no

ść [

%]


kat. SiW12/SiO2

p-menten

alfa-terpinen

p-cymen

m-cymen

limonen

gamma-terpinen

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

0 100 200 300 400

Sele

ktyw

no

ść [

%]


kat. PW12/SiO2

p-menten

alfa-terpinen

p-cymen

m-cymen

limonen

gamma-terpinen

izo-terpinolen

terpinolen


228

5. Wnioski

Analiza otrzymanych wyników dała odpowiedź na pytanie o rolę reakcji

ubocznych w procesie izomeryzacji α-pinenu:

Stwierdzono, że proces izomeryzacji α-pinenu to złożony proces,

podczas którego dochodzi do dynamicznej zmiany składu

mieszaniny reakcyjnej.

Reakcje uboczne w procesie izomeryzacji α-pinenu zachodzą

dopiero, gdy konwersja jest odpowiednio wysoka.

Poszczególne produkty reakcji następczych mogą być surowcami do

kolejnych reakcji.

Początkowo w procesie izomeryzacji α-pinenu reakcji ulega tylko

surowiec, w następnej kolejności reaguje limonen, terpinolen

i α-terpinen. Kolejność zachodzących reakcji ma istotne znaczenie,

gdyż każda z przemian zachodzi przy określonych zawartościach

monoterpenów w mieszaninie.

Stwierdzono również, że w procesie izomeryzacji α-pinenu

w obecności heteropolikwasów, oprócz zachodzenia procesu

izomeryzacji, obserwuje się również zachodzenie procesu

dysproporcjonowania i odwodornienia otrzymanych monoterpenów

jednopierścieniowych.

Na selektywność otrzymywania kamfenu nie mają znaczącego

wpływu obserwowane reakcje uboczne. Selektywność ta zależy

jedynie od stosunku masowego α-pinen : katalizator.

Literatura

1. Breitmaier E. Terpenes: Importance, general structure, and biosynthesis.

Terpenes: Flavors, Fragrances, Pharmaca, Pheromones, 2006: s. 1-9

2. Bazhenov Y.P., Kas' yanova L., Bokin A., Kutepov B., Khazipova A., Travkin

E., Shchadneva N., Khusnutdinov R., Dzhemilev U. Hydrogenation and

skeleton rearrangements of α-pinene on heterogeneous catalysts. Russian

journal of applied chemistry, 2003. 76(2): s. 234-237

3. Comelli N.A., PonziI E.N., Pinzi M.I. Effect of Lewis Sites in the

isomerization of α-pinene to camphene. 2nd Mercosur Congress on Chemical

Engineering, 4th Mercosur Congress on Process Systems Engineering,

Enpromer

4. Wang J., Hua W., Yue Y., Gao Z. MSU-S mesoporous materials: An efficient

catalyst for isomerization of α-pinene. Bioresource technology, 2010. 101(19):

s. 7224-7230

5. Gscheidmeier M., Haberlein H., Haberlein H.H., Haberlein J.T., Haberlein

M.C. Process for the preparation of camphene by the rearrangement

of a-pinene. 1998, U.S. Patent No. 5,826,202

,


229

6. Bes̨ün N., Özkan F., Gündüz G. Alpha-pinene isomerization on acid-treated

clays. Applied Catalysis A: General, 2002. 224(1): s. 285-297

7. Comelli N.A., Ponzi E.N., Ponzi M.I. α-Pinene isomerization to camphene:

Effect of thermal treatment on sulfated zirconia. Chemical Engineering

Journal, 2006. 117(2): s. 93-99

8. Sidhpuria K.B., Tyagi B., Jasra R.V. ZrO2–SiO2 Mixed Oxides Xerogel and

Aerogel as Solid Acid Catalysts for Solvent Free Isomerization of α-Pinene

and Dehydration of 4-Methyl-2-Pentanol. Catalysis letters, 2011. 141(8):

s. 1164-1170

9. Rachwalik R., Olejniczak Z., Jiao J., Huang J., Hunger M., Sulikowski B.

Isomerization of α-pinene over dealuminated ferrierite-type zeolites. Journal

of Catalysis, 2007. 252(2): s. 161-170

10. Li Y., Wang C., Chen H., Hua W., Yue Y., Gao Z. Isomerization of α-Pinene

Over Porous Phosphate Heterostructure Materials: Effects of Porosity and

Acidity. Catalysis letters, 2009. 131(3-4): s. 560-565

11. Rocha K.A., Robles-Dutenhefner P.A., Kozhevnikov I.V., Gusevskaya E.V.

Phosphotungstic heteropoly acid as efficient heterogeneous catalyst for

solvent-free isomerization of α-pinene and longifolene. Applied Catalysis A:

General, 2009. 352(1): s. 188-192

12. Volzone, Masini O., Comelli N.A., Grzona L.M., Ponzi E.N., Ponzi M.I.

Production of camphene and limonene from pinene over acid di-and trioctahedral

smectite clays. Applied Catalysis A: General, 2001. 214(2): s. 213-218

13. Szücs-Balázs J.Z., Coroş M., Woiczechowski-Pop A., Blăniƫă G., Vlassa M.

Supported H4SiW12O40 catalysts for α-pinene isomerization. Central European

Journal of Chemistry, 2012. 10(4): s. 1208-1217

14. López C.M., Machado F.J., Rodríguez K., Arias D., Méndez B., Hasegawa M.

Gas‐versus liquid‐phase α-pinene transformation over faujasite‐like zeolites

and an amorphous silicoaluminate. Catalysis letters, 1999. 62(2-4): s. 221-226

15. Severino A., Esculcas A., Rocha J., Vital J., Lobo L. Effect of extra-lattice

aluminium species on the activity, selectivity and stability of acid zeolites

in the liquid phase isomerisation of α-pinene. Applied Catalysis A: General,

1996. 142(2): s. 255-278

16. Ferragina C., Cafarelli P., Perez G. Selective isomerization of α-pinene.

Reaction Kinetics and Catalysis Letters, 2002. 77(1): s. 173-179


230


Streszczenie Obiektem badań w tej pracy jest proces izomeryzacji α-pinenu, ze szczególnym

uwzględnieniem zachodzących ewentualnych reakcji następczych. Cały szereg czynności

wykonanych w ramach tej pracy miał za zadanie dostarczenie informacji niezbędnych do

odpowiedzi na pytanie: Czy podczas prowadzenia procesu izomeryzacji α-pinenu reakcje uboczne pomiędzy produktami zachodzą, a jeżeli tak, to w jaki sposób wpływają one na sam

proces izomeryzacji? W tym celu przeprowadzono serię doświadczeń, w których zbadano

wpływ dwóch typów heteropolikwasów naniesionych na nośnik krzemionkowy

tj. SiW12/SiO2(Aldrich)30 i PW12/SiO2(Aldrich)30 na proces izomeryzacji α-pinenu, przy różnych zawartościach katalizatora. Wszystkie procesy prowadzone były w 80°C

w reaktorze szklanym zaopatrzonym w płaszcz grzewczy i mieszadło magnetyczne. Analiza

próbek odbywała się przy zastosowaniu chromatografu gazowego BRUKER 430-GC

z detektorem FID. Zaobserwowano, że w pewnych warunkach prowadzenia izomeryzacji

α-pinenu selektywności otrzymywania poszczególnych związków monoterpenowych

zaczynają zmieniać się, co sugeruje o zachodzących reakcjach następczych. W celu

dogłębnego poznania zachodzących zjawisk, procesowi izomeryzacji, oprócz α-pinenu,

poddano limonen, terpinolen oraz α-terpinen, czyli monoterpeny powstające jako produkty izomeryzacji α-pinenu. Okazuje się, że reakcje następcze mają znaczący wpływ na skład

mieszaniny reakcyjnej. Ponadto dowiedziono, że początkowo izomeryzacji ulega tylko

surowiec, w następnej kolejności reaguje limonen, terpinolen i α-terpinen. Kolejność

zachodzących reakcji ma istotne znaczenie, gdyż każda z przemian zachodzi przy określonych zawartościach monoterpenów w mieszaninie. Na selektywność otrzymywania

kamfenu nie mają wpływu obserwowane reakcje uboczne.

Słowa kluczowe: α-pinen, heteropolikwas, izomeryzacja

Role of side-reactions in isomerization of α-pinene

Abstract This work presents study of α-pinene isomerization. The main attention was focused

on occurring side reactions. The goal of this work was to answer the question: How the side

reactions influence on the isomerization of α-pinene? All the processes were performed over

catalysts based on silica supported silicotungstic heteropoly acid (SiW12/SiO2(Aldrich)30) and phosphotungstic heteropoly acid (PW12/SiO2(Aldrich)30) in liquid phase in batch

reactor at 80°C. Analysis of samples were carried by gas chromatography using BRUKER

430-GC with the FID detector. The obtained data allowed to draw up graphs which

interpretation led to gain knowledge of process and side reactions. It has been found that under certain special conditions selectivity of obtaining particular monoterpenes varied

significantly. To deeply understand mechanisms of occurring side-reactions except

of α-pinene some other monoterpenes isomerized. It has been found that side reactions have

significant influence on distribution of the products. In addition, it has been demonstrated that initially only α-pinene is isomerized. Later, when conversion of α-pinene is high,

isomerisation of limonene occurs spontaneously. Next side-reaction is the isomerisation

of terpinolene. Finally, at the end of process α-terpinene is isomerised. The order

of proceeding reactions is important. Each of the reactions occurs at the specific contents of monoterpenes in a mixture. Moreover, occurring side-reactions do not influence

on selectivity toward camphene.

Keywords: α-pinene, heteropoly acid, isomerisation

231

Ewelina Zielińska1, Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński

Suszenie sublimacyjne

– aspekty technologiczne i wyzwania

1. Wstęp

Problematyka utrwalania żywności stanowi jedno z największych

wyzwań przemysłu spożywczego. Celem przedłużania trwałości żywności

jest utrzymywanie jej w stanie możliwie nie zmienionym pod względem

cech fizycznych (zapachu, smaku, struktury), wartości odżywczej oraz

wartości higienicznej (brak zanieczyszczeń). W ostatnich latach wzrasta

zainteresowanie żywnością przetworzoną, wygodną i szybką do

przygotowania. Prowadzi to do dynamicznego rozwoju badań związanych

z poszukiwaniem jak najlepszych technologii, które zapewnią w jak

największym stopniu zachowanie cennych właściwości surowca.

Współczesnych konsumentów cechuje coraz większa świadomość

żywieniowa. Oczekują nie tylko produktów o przedłużonej trwałości, ale

także o wysokiej jakości. Producenci chcąc pozostać na rynku, starają się

zaoferować żywność coraz bardziej atrakcyjną dla wymagającego

konsumenta. Musi być ona pełnowartościowa, o właściwym smaku,

barwie, zapachu czy konsystencji.

Jednym ze sposobów utrwalania żywności, który zwiększa atrakcyjność

tego rodzaju produktów jest liofilizacja. Słowo to pochodzi z języka

greckiego i oznacza łatwo rozpuszczalny produkt. Liofilizacja to inaczej

suszenie sublimacyjne, które pozwala uzyskać susze o dobrych walorach

sensorycznych i wysokiej wartości odżywczej. Żywność liofilizowana

posiada wszystkie właściwości cenione przez konsumentów, a przede

wszystkim jest łatwo odtwarzalna do stanu wyjściowego. Ponadto dzięki

niewielkiej zawartości wody produkty te można długotrwale

przechowywać.

Historia suszenia sublimacyjnego sięga czasów starożytnych Inków,

którzy wykorzystywali tę metodę do wytwarzania potrawy zwanej obecnie

chudo, co oznacza zamrożone ziemniaki. Wysoko w Andach (2090-2400 m

n.p.m.) ziemniaki były rozkładane na ziemi i nocą zimne, górskie powietrze

powodowało ich zamrożenie. Rano zamrożone ziemniaki rozgniatano

i otrzymaną pulpę w ciągu dnia suszono na słońcu. Te czynności powtarzano


i Biotechnologii, SKN Technologii Żywności, www.skntz.up.lublin.pl


http://www.skntz.up.lublin.pl/

Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński

232

przez kilkanaście dni i w efekcie otrzymywano produkt o wysokiej

zawartości węglowodanów, którego trwałość wynosiła nawet kilka lat [1].

Po raz pierwszy liofilizacja do produkcji żywności została zastosowana

w 1938 roku przez firmę Nestlé, a otrzymanym produktem była kawa

Nescafé [1].

Niniejsza praca ma na celu przedstawienie przebiegu procesu, a także

zwrócenie uwagi na jego wady i zalety.

2. Charakterystyka procesu

2.1. Definicja

Liofilizacja jest jedną z metod suszenia produktu, która polega na

usunięciu wody z zamrożonego materiału przez sublimację lodu,

z pominięciem fazy ciekłej. Proces ten może przebiegać tylko w warunkach

ujemnej temperatury oraz przy znacznie obniżonym ciśnieniu (poniżej

200 Pa). Warunki te minimalizują aktywność drobnoustrojów oraz

możliwość wystąpienia reakcji niepożądanych takich jak utlenianie lub

inne zmiany chemiczne i enzymatyczne, straty aromatu, degradację

witamin [2].

Liofilizacji poddać można każdy produkt spożywczy – warzywa,

owoce, zioła, grzyby, mięsa, ryby, sery, jogurty. Liofilizaty są podstawą

zup instant, wyrobów piekarniczych, a nawet niektórych produktów

cukierniczych. Główne zastosowanie tego procesu dotyczy produktów

termolabilnych – nie tylko żywności ale i preparatów farmaceutycznych,

suszenia kultur bakterii mleczarskich [3].

2.2. Przebieg procesu

Proces liofilizacji przebiega w trzech etapach:

Zamrażanie;

suszenie I;

suszenie II.

Przed suszeniem surowiec musi być odpowiednio przygotowany oraz

poprawnie dobrany np. właściwy stopień dojrzałości. Tak przygotowane

produkty należy ujednolicić, doprowadzić do odpowiedniego kształtu

i rozmiarów, aby następnie umieścić je w komorze liofilizatora [4].

Podstawową operacją w procesie liofilizacji jest sublimacja wody

z suszonego materiału. Aby to zjawisko mogło zajść, konieczne jest

zapewnienie odpowiednich warunków, które wynikają z wykresu fazowego

wody (rys. 1).

,

Suszenie sublimacyjne – aspekty technologiczne i wyzwania

233

Rys. 1. Wykres fazowy wody [4]

Powyższy wykres przedstawia obszary istnienia poszczególnych faz

wody, wpływ ciśnienia i temperatury na przemiany fazowe oraz warunki

jakie muszą zostać spełnione dla zachowania równowagi faz. Z diagramu

wynika, że sublimacja może nastąpić tylko wtedy, gdy temperatura

i ciśnienie będą niższe niż w punkcie potrójnym czyli stanie, w jakim dana

substancja może istnieć w trzech fazach termodynamicznych równocześnie

w równowadze termodynamicznej. Punkt ten określony jest przez

temperaturę i ciśnienie punktu potrójnego. Niezbędne jest więc zamrożenie

produktu (w praktyce zamrożenie wstępne do – 40°C pod ciśnieniem

atmosferycznym). Dopiero następnym krokiem jest wytworzenie

w komorze liofilizatora znaczenie niższego ciśnienia, co skutkuje

rozpoczęciem procesu sublimacji. W pewnym momencie trwania procesu

powstaje stan równowagi pomiędzy lodem a parą wodną. Dostarczenie

ciepła, zwykle przez przewodzenie lub promieniowanie powoduje

zachwianie tej równowagi, efektem czego możliwe jest dalsze suszenie

sublimacyjne [4].

2.2.1. Zamrażanie

Istotny wpływ na jakość końcowego produktu ma proces zamrażania,

który jest pierwszym etapem procesu liofilizacji. W jego trakcie zamrożone

zostaje około 65-90% wody znajdującej się w materiale. Istnieją dwie

metody zamrażania: zamrożenie wstępne oraz tzw. samozamrożenie.


234

Zamrożenie wstępne polega na obniżeniu temperatury w warunkach

ciśnienia atmosferycznego. Ma ono zastosowanie przy liofilizacji owoców

czy warzyw. Szybkość zamrażania wpływa na kształt i rozmiary

powstających kryształków lodu, a co za tym idzie na porowatość suszonego

materiału oraz na szybkość wymiany ciepła i masy. Podczas powolnego

zamrażania cząsteczki lodu będą większe niż w przypadku szybkiego

zamrażania, co korzystnie wpływa na dynamikę ruchu pary wodnej w ich

obrębie czyli możliwość szybszego suszenia produktu [5]. Zbyt duże

kryształy w materiale o budowie tkankowej mogą jednak powodować

uszkodzenia mechaniczne komórek [1].

Samozamrażanie polega na odparowywaniu wilgoci z powierzchni

niezamrożonego surowca umieszczonego w komorze liofilizatora pod

wpływem wytwarzania próżni (nawet do 14% wody). Suszony materiał

ochładza się wskutek oddawania ciepła potrzebnego do parowania.

Rezultatem jest zamrożenie wolnej wody. Niekiedy stosuje się dodatkowo

rozpylanie ciekłego azotu lub kontakt z ochładzaną powierzchnią.

Na zachowanie pierwotnych właściwości materiału wpływa dodatnio

szybkie wytwarzanie próżni w komorze. Samozamrażaniu najczęściej

poddawane są surowce o konsystencji pasty. Może ono jednak powodować

znaczne zmiany właściwości produktu więc nie poleca się go do soków

owocowych, surowego mięsa oraz ryb [4].

W przypadku substancji ciekłych (soki owocowe, mleko, przeciery)

stosuje się metodę kombinowaną. Krystalizacji ulega woda tylko

w zewnętrznych warstwach substancji, a po umieszczeniu jej

w liofilizatorze ulega samozamrożeniu wskutek obniżania ciśnienia [2].

2.2.2. Pierwszy etap suszenia

Po etapie zamrażania w komorze urządzenia obniża się ciśnienie, które

umożliwia sublimację lodu. Proces ten zakończy się w momencie

osiągnięcia równowagi faz lód – para wodna. Dalszą sublimację umożliwia

dostarczenie utajonego ciepła sublimacji (2840 kJ/kg lodu) najczęściej

na drodze przewodzenia od ogrzewanej powierzchni, na której znajduje się

materiał lub na drodze promieniowania cieplnego [5]. Podwyższenie

efektywności dostarczania ciepła jest możliwe przez ogrzewanie produktu

z dwóch stron lub użycie kratownic zwiększających powierzchnię suszenia.

Udowodniono, że wpływa to na drugi etap suszenie skracając go

o 1,5 godziny w stosunku do użycia płyt grzejnych [6]. Konieczne jest

uzyskanie temperatury optymalnej, gdyż zbyt wysoka powoduje, że

sublimacja zostaje częściowo zastąpiona parowaniem, co wiąże się ze

znacznym pogorszeniem jakości produktu i wydłużeniem czasu suszenia [7].

,


235

W początkowym etapie suszenia woda usuwana jest z wierzchnich

warstw materiału, a następnie coraz głębszych. Wysublimowane kryształki

lodu tworzą kanaliki, przez które para wodna wydostaje się na zewnątrz

produktu do komory suszenia. Jej usunięcie możliwe jest dzięki

wymrożeniu na powierzchni kondensatora, umieszczonego między komorą

suszenia a pompą próżniową. Koniec pierwszego etapu suszenia następuje,

gdy na powierzchni kondensatora nie gromadzi się już lód [4].

2.2.3. Drugi etap suszenia

Drugi etap suszenia zwany jest suszeniem desorpcyjnym. Usuwana jest

wtedy woda silnie związana np. chemicznie. Stanowi ona 10-35%

całkowitej zawartości wody, dlatego też wpływ tego stadium na czas

i szybkość suszenia jest bardzo istotny [5]. Etap ten przebiega w warunkach

obniżonego ciśnienia z jednoczesnym podgrzewaniem materiału do wartości

granicznej. Dla produktów wrażliwych termicznie wynosi ona 10-35ºC, a dla

bardziej odpornych termicznie – nawet do 80ºC. Szybkość suszenia w tej

fazie znacznie spada więc może ona trwać dłużej niż właściwe suszenie

sublimacyjne. Suszenie desorpcyjne kończy się gdy materiał osiągnie

oczekiwaną wilgotność, na ogół około 2% [8].

3. Suszarki sublimacyjne stosowane w przemyśle spożywczym

Proces liofilizacji prowadzony jest w suszarkach sublimacyjnych.

Składają się one z podstawowych elementów uzasadnionych przebiegiem

procesu jakimi są: komora suszenia, kondensator pary, układ ogrzewania,

chłodzenia i wymrażania oraz układ próżniowy.

Suszony produkt znajdujący się na tacy jest ogrzewany przez płyty

grzejne, znajdujące się poniżej i powyżej tacy. Para wodna z produktu

przepływa między tacami a płytami grzejnymi i odpływa do komory, gdzie

ulega kondensacji w postaci lodu na chłodzonych przewodach. Komory

pracujące naprzemiennie są połączone ze zbiornikiem wody o temperaturze

około 20ºC, dzięki czemu następuje roztopienie lodu znajdującego się na

przewodach. Nadmiar wody, powstały ze skroplenia pary wodnej

i stopionego lodu, jest usuwany na zewnątrz [1].

Najbardziej podstawową częścią instalacji jest komora suszarnicza. Jej

budowa uzależniona jest od rodzaju suszonego materiału. Produkty stałe

umieszczane są na półkach lub tacach znajdujących się wewnątrz komory.

Liofilizacja cieczy może odbywać się przez napełnianie nią butelek lub

pojemników umieszczanych na półkach komory suszarniczej [8]. Innym

rozwiązaniem są urządzenia, w których ciecz jest rozpylana w cylindrycznej

wieży, gdzie na skutek „zamrażania wyparnego” (samo zamrażania

z jednoczesnym odparowaniem około 15% zawartej w nim wody)


236

następuje jego zestalenie. Częściowo wysuszony proszek opada i jest

suszony do odpowiedniej wilgotności [5].

Kondensator najczęściej znajduje się w osobnej komorze instalacji do

suszenia sublimacyjnego. Istotnym problemem jest pokrywanie się jego

powierzchni lodem, który należy stale usuwać. Innym sposobem usuwania

wilgoci jest jej adsorpcja w ciekłych roztworach higroskopijnych [8].

Kolejnym ważnym elementem jest źródło ciepła. Ciepło może być

doprowadzane przez ogrzewanie kontaktowe, za pomocą promienników

podczerwieni lub za pomocą mikrofal.

Najczęstszym sposobem jest umieszczanie surowca na półkach

ogrzewanych czynnikiem grzejnym. Jednak ogrzewanie za pomocą

promieniowania i mikrofal intensyfikuje proces suszenia [8].

Suszarki sublimacyjne mogą działać w trybie okresowym, półciągłym

i ciągłym. Najbardziej rozpowszechnionymi przemysłowymi liofilizatorami

są urządzenia okresowe. Dzielą się w zależności od typu stosowanego

kondensatora lodu:

znajdującego się w tej samej komorze co tace z produktem,;

znajdującego się w oddzielnej komorze połączonej ze strefą

sublimacji [5].

Suszarki sublimacyjne o działaniu półciągłym są urządzeniami

tunelowymi. Posiadają one śluzę wejściową i wyjściową, po zamknięciu

których uzyskuje się odpowiednie ciśnienie. Surowiec wprowadzany jest

okresowo do tunelu na wózkach. Najnowocześniejsze rozwiązania opierają

się na ciągłym przemieszczaniu się materiału na taśmach, jednak ciągłość

pracy można również osiągnąć poprzez zorganizowanie pracy kilku

samodzielnych suszarek okresowych według specjalnego przemiennego

schematu [5].

4. Koszty i wydajność procesu

Suszenie sublimacyjne posiada szereg zalet, jednak nie należą do nich

niewątpliwie aspekty ekonomiczne procesu. Liofilizacja jest kosztownym

i czasochłonnym sposobem suszenia. Powoduje to ograniczenie jej

powszechnego zastosowania. Koszty liofilizacji cztero-pięciokrotnie

przewyższają koszty suszenia rozpyłowego i ośmio-dziesięciokrotnie

jednoetapowego odparowania [9]. Sam koszt inwestycyjny urządzeń jest

około trzykrotnie większy niż innych typów suszarek. Metoda ta jest

również energochłonna. Koszt energii jest dwu-, trzykrotnie wyższy

w porównaniu z innymi metodami [5]. Istotny wpływ na opłacalność

procesu ma także czas jego trwania, który wynosi 12-24 godzin [4].

W celu zwiększenia wydajności, a zarazem obniżenia kosztów suszenia

sublimacyjnego poszukuje się rozwiązań intensyfikujących proces.

,


237

Zastosowanie promieniowania mikrofalowego jako źródła energii pozwala

przyspieszyć proces suszenia i przez co nawet kilkukrotnie skrócić czas jego

trwania. Innym rozwiązaniem jest połączenie ogrzewania za pomocą

promieniowania i mikrofal. Skraca to czas suszenia i zmniejsza zużycie

energii [5].

Obniżone ciśnienie utrzymywane podczas liofilizacji pochłania około

25% całkowitych kosztów procesu. Aby je zmniejszyć można płytko

zamrożony produkt suszyć pod ciśnieniem atmosferycznym z zastosowaniem

pompy ciepła, jednak istnieje większe ryzyko załamania struktury produktu

podczas suszenia [1].

Wraz ze spadkiem zawartości wody w suszu wydłuża się czas suszenia

i zwiększa zapotrzebowanie na energię. Dowiedziono, że susz jabłkowy

o wilgotności 16% po czterech miesiącach próżniowego przechowywania

nie odbiegał cechami jakościowymi od świeżego [10]. Wynika z tego, że

nie zawsze konieczne jest odwadnianie surowca do wilgotności 2-3% co

wiąże się z mniejszym nakładem kosztów. Inne badania dowodzą, że

oddzielenie cząstek lodu przed suszeniem sublimacyjnym wpłynęło by

pozytywnie na ograniczenie czasu i kosztów procesu liofilizacji [4].

Kwestia kosztów i wydajności liofilizacji jest wciąż tematem wielu

badań i powodem poszukiwania nowych rozwiązań. Zagadnieniom tym

poświęca się więcej czasu, aby udoskonalić suszenie sublimacyjne pod

każdym względem.

5. Właściwości suszonej sublimacyjnie żywności

Surowce poddane suszeniu sublimacyjnemu charakteryzują się wysoką

jakością. Zawdzięczają to znacznie zmniejszonej możliwości wpływu

szkodliwych zjawisk związanych z aktywnością biochemiczną

drobnoustrojów oraz degradacją termiczną na liofilizowany produkt. Dzięki

temu suszony materiał ma skład chemiczny w wysokim stopniu zbliżony

do naturalnego [4].

Na jakość produktu liofilizowanego ma wpływ wiele czynników między

innymi szybkość i charakter reakcji zachodzących w poszczególnych

etapach utrwalania tj. podczas procesu mrożenia, suszenia sublimacyjnego

i przechowywania [11]. Znaczący jest odpowiedni dobór surowca, jego

skład chemiczny, stopień dojrzałości, a także zastosowanie właściwej

obróbki wstępnej. Jednym ze sposobów jest blanszowanie, które powoduje

między innymi unieczynnienie poszczególnych enzymów i rozluźnienie

tkanki przed dalszymi procesami. Badania wykazały, że może ono

spowodować skrócenie czasu liofilizacji [12]. Ważny jest także dobór

metody zamrożenia produktu oraz szybkość przeprowadzenia tego etapu.

Dobór temperatury w fazie końcowego usuwania wilgoci może zaważyć na


238

ostatecznej wartości suszonego materiału. Badania wskazują, że warunkiem

koniecznym do uzyskania produktów o wysokiej jakości jest usunięcie 75-95%

wody. Aby jakość suszu sublimacyjnego była możliwie wysoka, należy

ustalić odpowiednie parametry suszenia [4].

Badania jakości suszu warzyw dowodzą, że w większości przypadków

wyróżniki jakościowe liofilizatu przewyższały dwukrotnie analogiczne

wyróżniki jakości suszu konwekcyjnego [13]. Suszenie sublimacyjne

umożliwia również otrzymanie proszków owocowych o wysokiej jakości

sensorycznej i strukturalnej, lepszej rozpuszczalności i dłuższym okresie

przydatności do spożycia [14]. Produkty liofilizowane, w porównaniu

z konwencjonalnym suszeniem charakteryzują się:

lepszym zachowaniem barwy i aromatu;

lepszym stopniem rehydratacji;

dobrze zachowaną strukturą komórkową.

6. Wady i zalet liofilizacji

Suszenie sublimacyjne to metoda utrwalania żywności, która posiada

szereg zalet. Żywność liofilizowaną cechuje wysoka jakość, przez co

zaliczana jest do grupy produktów spożywczych o najlepszych walorach

organoleptycznych oraz odżywczych. Jednak, jak każdy proces

przetwórczy, posiada również wady, a o ostatecznej ocenie procesu

decyduje końcowy bilans tych cech.

Na liczne zalety suszenia sublimacyjnego wskazują wyniki wielu prac

naukowych [1, 4, 5, 8, 9, 11]:

liofilizacja jest metodą usuwania wody gwarantującą otrzymanie

produktu o lepszej jakości w porównaniu z produktami suszonymi

innymi sposobami;

proces ten pozbawia produkty zawartej w nich wody niemal w 100%

lub pozostawia jej niewielką ilość, dzięki czemu otrzymuje się

produkt o delikatnej strukturze;

minimalna zawartość wody, na poziomie kilku procent, sprzyja

długotrwałemu przechowywaniu żywności pod warunkiem

właściwego jej zapakowania, uniemożliwiającego dostęp wilgoci

z atmosfery;

umożliwione jest wyeliminowanie łańcucha chłodniczego w obrocie

towarowym;

znaczne zmniejszenie masy produktu ułatwia transport i obrót

handlowy;

możliwe jest otrzymanie sterylnego, suchego produktu w handlowych

opakowaniach jednostkowych;

,


239

stosując metodę suszenia sublimacyjnego uzyskuje się susze

o znacznym zachowaniu właściwości fizycznych, chemicznych

i biologicznych surowca, a także o niezmienionej w stosunku do

niego wartości odżywczej;

liofilizacja umożliwia zachowanie związków zapachowych oraz

barwy, które są stabilne w trakcie właściwego przechowywania;

suszenie sublimacyjne nie powoduje degradacji witamin i nie niszczy

aktywności biologicznej produktu;

możliwe jest suszenie produktów zawierających substancje

termolabilne, przy zachowaniu ich wysokiej zawartości np. witaminy

C, -tokoferolu, karotenoidów;

wyeliminowana zostaje możliwość negatywnego wpływu

drobnoustrojów;

minimalizowane są procesy enzymatycznego i nieenzymatycznego

brunatnienia;

obecność wody w stanie stałym podczas suszenia sublimacyjnego

chroni pierwotną strukturę materiału, co prowadzi do zachowania

jego kształtu i wyglądu, z nieznacznym zmniejszeniem objętości;

do żywności suszonej sublimacyjnie nie dodaje się chemicznych

środków konserwujących, co ma istotne znaczenie przy produkcji

tzw. zdrowej żywności;

produkty liofilizowane posiadają dużą szybkość ponownego

uwadniania, co wynika z dużej porowatości produktu;

liofilizaty odznaczają się bardzo dobrą rozpuszczalnością i są silnie

higroskopijne;

żywność liofilizowana, odpowiednio zapakowana, nadaje się do

spożycia w każdych warunkach wilgotności, w wysokich i w niskich

temperaturach (używana przez alpinistów, astronautów), zachowując

wartości bioenergetyczne oraz walory smakowe.

W licznych pracach [1 ,4, 5, 9] wspomina się także o wadach suszenia

sublimacyjnego takich jak:

wysokie koszty procesu ograniczają w znacznym stopniu stosowanie

tej metody suszenia na skalę przemysłową. Koszty liofilizacji cztero-

pięciokrotnie przewyższają koszty suszenia rozpyłowego i ośmio-

dziesięciokrotnie jednoetapowego odparowania;

sam koszt inwestycyjny jest około trzykrotnie większy niż koszt

innych suszarek;

proces liofilizacji jest bardzo energochłonny, co za tym idzie duży

koszt stanowi eksploatacja urządzeń – dwu-trzykrotnie wyższy

w porównaniuz innymi metodami;

suszenie sublimacyjne trwa stosunkowo długo – od 12 do 24 godzin;


240

krucha i otwarta struktura liofilizowanych owoców sprzyja

przemianom chemicznym oraz uszkadzaniu produktu w czasie

wytwarzania, pakowania, transportu i przechowywania.

Podsumowując, suszenie sublimacyjne ma znacznie więcej zalet niż

wad. W zasadzie podstawową wadą jest wysoki koszt procesu, co często

może być największym ograniczeniem do zastosowania tej metody.

By udoskonalić proces liofilizacji rozpoczęto badania nad modyfikacjami,

które pozwoliłyby obniżyć koszt, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej

jakości produktu końcowego. Pomyślne wprowadzenie nowych rozwiązań

byłoby zbawienne dla wprowadzenia tej metody na skalę przemysłową.

7. Podsumowanie

Stały wzrost zapotrzebowania na żywność wysokoprzetworzoną

prowadzi do intensyfikacji badań nad poprawą metod utrwalania żywności,

dzięki czemu będzie można nie tylko przedłużyć jej trwałość, ale także

zaoferować nowe produkty, o wysokiej jakości i atrakcyjności dla

konsumenta.

Taką szansę stwarza wykorzystanie metody suszenia sublimacyjnego,

będącą połączeniem osiągnięć chemii, biologii, fizyki oraz biochemii.

Proces liofilizacji łączy w sobie dwie metody utrwalania: zamrażanie

i suszenie pod obniżonym ciśnieniem. Jest procesem długotrwałym,

a w związku z tym kosztownym, co w znacznym stopniu ogranicza jego

stosowanie na skalę przemysłową. Mimo to suszenie sublimacyjne jest

cenioną metodą utrwalania żywności, dlatego też celem kolejnych badań

naukowych będzie zapewne próba obniżenia kosztów procesu przy

niezmienionej wysokiej jakości produktu. Umożliwiłoby to poprawę

jakości oferowanych na rynku produktów, a w konsekwencji ich korzystny

wpływ na organizm społeczeństw.

Literatura

1. Rząca M., Witrowa-Rajchert D., Suszenie żywności w niskiej temperaturze, Przemysł Spożywczy, 2007, vol. 4, s. 30-35

2. Muzzio C., Dini N., Simulation of freezing step in vial lyophilization using finite element method, Computers and Chemical Engineering, 2011, vol. 35, s. 2274-2283

3. Ivancevic S., Mitrovic D., Tosic D., Lyophilisation – new treatment of preserving food, Tractors and power machines, 2003, vol. 8(4), s. 198-202

4. Kondratowicz J., Burczyk E., Technologiczne aspekty procesu liofilizacji, Chłodnictwo, 2010, vol. 4, s. 54-59

5. Witrowa-Rajchert D., Suszarki sublimacyjne do żywności, Przemysł Spożywczy, 2008, vol. 4, s. 14-20

,


241

6. Dziugan P., Zastosowanie tac z kratownicą w procesie liofilizacji biopreparatu zawierającego bakterie Lactobacillus plantarum, Zeszyty Naukowe Politechniki Łódzkiej, 2006, s. 37-42

7. Gawlik P., Liofilizacja żywności w aspekcie przemian fazowych roztworów amorficznych [W:] Pierwszy Portal Rolny [online], 2011, [dostęp luty 2014]. Dostępny w World Wide Web: http://www.ppr.pl/artykul-liofilizacja-zywnosci-w-aspekcie-przemian-fazowych-2901.php

8. Kawala Z., Kapłon J., Kramkowski R., Ważniejsze aspekty suszenia sublimacyjnego, Przemysł Spożywczy, 1993, vol. 3, s. 64-67

9. Ciurzyńska A., Lenart A., Liofilizacja – innowacyjne produkty, Bezpieczeństwo i Higiena Żywności, 2010, vol. 4/81, s. 68-70

10. Lis T., Lis H., Kłoczek E., Zależność cech jakościowych liofilizatu, czasu suszenia i zużycia energii od jego wilgotności, Acta Agrophysica, 2004, vol. 4(3), s. 747-752

11. Irzyniec Z., Klimczak J., Suszenie sublimacyjne, [W:] Michałowski S. (red.): Technologia chłodnictwa żywności. Procesy i ich kontrola, Wyd. Politechniki Łódzkiej, Łódź, 1994, s. 117-123

12. Lentas K., Witrowa-Rajchert D., Hankus M., Wpływ parametrów blanszowania oraz metody suszenia na właściwości mechaniczne suszonych pieczarek, Acta Agrophysica, 2011, vol. 17(2), s. 359-368

13. Gawałek J., Wpływ warunków konwekcyjnego i sublimacyjnego suszenia korzeni marchwi na jakość suszu, Inżynieria Rolnicza, 2005, vol. 11, s. 119-127

14. Jakubczyk E., Gondek E., Głód K., Charakterystyka właściwości fizycznych proszku jabłkowego otrzymanego metodą suszenia pianowo-sublimacyjnego, Acta Agrophysica, 2010, vol. 15(2), s. 281-291


Streszczenie

Problematyka utrwalania żywności stanowi jedno z największych wyzwań przemysłu

spożywczego. W ostatnich latach wzrasta zainteresowanie żywnością przetworzoną,

wygodną i szybką do przygotowania. Prowadzi to do dynamicznego rozwoju badań

związanych z poszukiwaniem jak najlepszych technologii, które zapewnią w jak

największym stopniu zachowanie cennych właściwości surowca. Liofilizacja jest jedną

z metod suszenia produktu, której głównym założeniem jest usunięcie wody z zamrożonego materiału wskutek procesu sublimacji lodu, z pominięciem fazy ciekłej. Suszenie

sublimacyjne jest połączeniem osiągnięć chemii, biologii, fizyki oraz biochemii. Najbardziej

rozpowszechnionymi suszarkami sublimacyjnymi są okresowe urządzenia, do których

ciepło jest dostarczane na drodze przewodzenia lub promieniowania. Wysokie koszty inwestycyjne i eksploatacyjne procesu ograniczają w znacznym stopniu stosowanie tej

metody suszenia na skalę przemysłową. Kosztowny jest także długi czas trwania suszenia,

co stało się przyczyną poszukiwania sposobów jego intensyfikacji (m.in. doprowadzanie

energii w postaci promieniowania mikrofalowego). Niewątpliwie wielkim wyzwaniem będzie próba obniżenia kosztów procesu przy niezmienionej wysokiej jakości produktu, co

uzależnione jest od prowadzonych badań naukowych oraz kreatywności w projektowaniu

urządzeń.

Słowa kluczowe: liofilizacja, suszenie sublimacyjne, utrwalanie żywności

http://www.ppr.pl/artykul-liofilizacja-zywnosci-w-aspekcie-przemian-fazowych-2901.php

http://www.ppr.pl/artykul-liofilizacja-zywnosci-w-aspekcie-przemian-fazowych-2901.php


242

Freeze drying - the technological aspects and challenges

Abstract The issue of food preservation is one of the biggest challenges of the contemporary food

industry. In recent years, consumers are interested in processed food, comfortable, limiting

the time required to prepare a meal. This leads to the dynamic development of research

related to the search for the best technology to ensure as much as possible to preserve valuable properties of the material. Lyophilization is one of the methods of drying the

product, whose main aim is to remove the water from the frozen material as a result of the

process of ice sublimation, excluding the liquid phase. Freeze drying is a combination of the

achievements of chemistry, biology, physics and biochemistry. Plant materials, meat and dairy products are the most often lyophilized products. The most common dryers

sublimation are periodic devices, to which heat is supplied by conduction or radiation. The

high investment and operating costs of the process are limited to a large extent the use of the

drying method on an industrial scale. At higher costs also affects long drying time, which

led to the search for ways to intensify (e.g. energy supply in the form of microwave

radiation). Undoubtedly, the big challenge will be to attempt to reduce the cost of the

process with unchanged high-quality product, which is dependent on scientific research and

creativity in the design of devices.

Keywords: lyophilization, freeze drying, food preservation

243

Indeks autorów:

Amarowicz M. ...................... 149

Bartosiak M. ............ 41, 127, 209

Chwil P. ................................ 149

Cieślak A. ........................ 41, 209

Czemierska M. ........................ 53

Dobrzańska A. ....................... 127

Gierada M. ............................ 221

Głogowska M. ....................... 171

Jarosz-Wilkołazka A.53, 158, 178

Kordowska-Wiater M. ............. 30

Kotuła L. ............................... 149

Lach J. ..................................... 67

Marczak M. ............................. 19

Matysiak P. ............................. 19

Michalak-Majewska M.. 196, 231

Mulawka D. ........................... 149

Mulawka P. ........................... 149

Niścior M. ....................... 89, 110

Odrzywolski A. ..................... 138

Osińska-Jaroszuk M. .............. 158

Podgórska I. ............................ 30

Polak J................................... 178

Rachwalik R. ......................... 221

Schab K................................. 149

Sęczkowska M. ....................... 78

Sęczyk Ł. ................................ 30

Skorupska A. ........................... 19

Sobstyl J. ............................... 149

Sobstyl P. .............................. 149

Szałapata K............................ 158

Szcześ A. ................................ 53

Szewczuk-Karpisz K. .............. 78

Terlecki K. ............................ 149

Urbańczuk M. ....................... 149

Waleczek K. .............................. 7

Wiśniewska M. ....................... 78

Wlizło K. .............................. 178

Zielińska E. ....................196, 231

Zieliński D. ....................196, 231

Documents

Biotechnologia w analizie, ochronie środowiska, medycynie i