Genetisch materiaal - DNA (desoxyribonuclenezuur) - Cellen (~1014) - Chromosomen (bij de mens 46) - Opgebouwd uit genen, die coderen voor eiwitten - Beinvloed het uitzicht en functioneren v/e cel

Structuur van DNA - Dubbele helix structuur - Grote purine-basen:

o Adenine o Guanine

- Kleine pyrimidine-basen o Cytosine o Thymine (urasil bij RNA)

- Complementariteit van de basen o Adenine-thymine o Guanine-cytosine

- Binding tussen een purine en een pyrimidine is een waterstofbinding - 3 fosfaatgroepen waarvan 2 verwijderd worden tijdens de opbouw van DNA - Suiker desoxyribose - Organische basen (adenine, cytosine, guanine, thymine) - DNA heeft op die manier de vorm van een wenteltrap met de basenparen als sporten - De complementaire strengen zijn antiparallel

o 3 -> 5 o 5 -> 3 = sense streng

- Lengte wordt uitgedrukt in basenparen (bp) of kilobasen (kb) (1 kb = 1000 bp)

- DNA is opgebouwd uit genen

o Intron: stukje DNA in een gen dat niet codeert voor een eiwit o Exon: stukje DNA in een gen dat codeert voor een eiwit o Codon: 3 opeenvolgende nucleotiden, codeert voor 1 AZ

- DNA aanwezig in: o Nucleus o Plasmiden, chloroplasten, mitochondrin

- DNA heeft 2 functies: o Eiwitsynthese (transcriptie van DNA) o (Zelf)replicatie

Replicatie van DNA Replicatie van DNA: vermeerdering van DNA (1e belangrijke functie van DNA)

- DNA bestaat uit 2 ketens nucleotiden - Deze ketens gaan verbroken worden (denaturatie) (enzym helicase) - DNA replicatie: vorming van een tweede streng complementair aan de eerste - Enzym DNA-polymerase vereist - Twee strengen aan elkaar door enzym ligase

Eiwitsynthese

DNA-transcriptie = DNA naar RNA

- RNA-polymerase: herkent startcodon v/h gen op de DNA streng - Deel helix (corresponderend met gen) wordt ontwonden - Ontdubbelen van de strengen - Enzym RNA-polymerase:

o Synthese mRNA corresponderend met template DNA o Herkent het startcodon of beginpunt v/e gen op DNA keten

- RNA transcriptie stopt wanneer een stopcodon is bereikt 'UAA', 'UAG', 'UGA' - Via splicing worden de introns verwijderd - mRNA komt los en migreert naar cytoplasma - Ligase: enzym dat de complementaire basen terug aan elkaar zet na de transcriptie, H-bruggen

tussen de basen gaan terug hersteld worden - Initiatie: promotor bestaande uit een TATA-box en een DNA regulatory sequentie van een bepaald

gen - Transcriptie factor wordt geactiveerd - activatie van co-activator eiwit complexen die de chromatine structuur openen - Terminatie: poly-A staart duidt op het einde van de RNA vorming

Verschil DNA en RNA: - Suiker desoxyribose - Thymine i.p.v. uracil - dubbele streng nucleotiden - Een DNA-molecuul bestaat uit duizenden nucleotiden - Langere levensduur

- Suiker desoxyribose - Thymine i.p.v. uracil - dubbele streng nucleotiden - Een DNA-molecuul bestaat uit duizenden nucleotiden - Langere levensduur

3 vormen van RNA:

- mRNA (messenger RNA): enkelstrengige keten die complementair is met het gen op het DNA - tRNA (transfer RNA): heel specifiek klaverblad-vormige molecule (75 tot 93 mononucleotiden) met

aan ene uiteinde een anticodon en aan het andere uiteinde een aanhechtingsplaats voor een AZ - rRNA (ribosomaal RNA): van belang bij het samenbrengen van mRNA en tRNA op de ribosomen

Translatie

- eiwitten worden in cytoplasma gesynthetiseerd door ribosomen - DNA bevindt zich in de celkern - mRNA verplaatst zich naar het cytoplasma

Ribosomen

- Ribosomen op het ruw endoplasmatisch reticulum - Ribosomen vrij in het cytoplasma - Bestaan uit 2 delen (groot en klein)

o Klein: binden van mRNA (zonder mRNA zin 2 onderdelen los v elkaar) o Groot: bestaat uit enzym dat peptidebanden tussen de AZ vormt

mRNA - is een kopie van een deel van het DNA (van een actief gen) - migreert via het cytoplasma naar het ribosoom en brengt de genetische code over

tRNA

- transport AZ -> ribosoom - triplet bepaald aan welk deel mRNA het wordt gebonden - ieder tRNA vervoert 1 welbepaald AZ

Verschillende stappen eiwitsynthese (translatie)

- mRNA door het ribosoom afgelezen - tRNA voert aminozuren aan - anticodon van tRNA koppelt aan een triplet (codon) van het mRNA - m.b.v. enzym (peptidyl-transferase) worden de aminozuren aan elkaar gekoppeld - de eiwitvorming start vanuit het triplet AUG (startcodon) en eindigt bij stopcodon (UAA, UAG en

UGA)

Expressie van genen - Alle cellen hebben zelfde genen - Andere expressie afhankelijk van:

o Plaats in het lichaam o Tijdstip

- Huishoudgenen: staan in vr basisfuncties v/e cel - Specifieke genen - Controlemechanisme dat de expressie van genen regelt

Korte definities - Gen= de basesequentie die 1 eiwit codeert - Locus= plaats van een gen in het genoom (en dus op de chromosomen) - Nucleotide= molecule die bestaat uit een suiker (ribose (RNA) of deoxyribose (DNA)), fosfaat en

een base (purine of pyrimidine) - Oligonucleotide= enkele nucleotiden aan elkaar - Polynucleotiden= heel veel nucleotiden na elkaar (vb. DNA en RNA) - Polymorfisme= fenomeen dat 1 gen verschillende expressies kan hebben (zo zijn er geen 2 dieren

aan elkaar gelijk) - Allel= de bepaalde vorm van een gen - Vermits een mens gepaarde chromosomen heeft kunnen de allelen gelijk of verschillend zijn - Exo- en endonucleasen: enzymen die het DNA verknippen respectievelijk aan de uiteinden en

binnen de DNA-streng - Restrictie-enzymen= endonucleasen die een bepaalde basensequentie in het DNA herkennen en

slechts dit DNA verknippen

Virussen Geschiedenis

- Virussen voor het eerst beschreven in 1892: o TMV kan andere planten infecteren o Kan niet verwijderd worden door te filteren over een bacteriefilter o Term virus door het infectieuze principe (vloeibaar levende smetstof), kleiner dan

bacterie - 1915: beschrijving van virussen die bacterin als gastheer hebben: bacteriofaag - 1935: TMV zuivering en kristallisatie - Virus is een nucleoprotene (nuclenezuur (RNA of DNA), en eiwit) - Virussen kunnen kleine filters niet passeren - Zichtbaar met elektronenmicroscoop - Levend of niet?

o Cel wordt als kleinste levende eenheid gezien, virussen zijn producten van cellen, door inbreng virusnuclenezuur, virussen zijn proto-organismen

Structuur en samenstelling - Grootte: 20-300 nm

Plantenvirussen:

- RNA: enkelstrengig (of dubbelstrengig) - Soms DNA: dubbelstrengig (of enkelstrengig)

Dierenvirussen:

- DNA: dubbelstrengig (of enkelstrengig) - RNA: enkelstrengig (of dubbelstrengig)

Bouw

- Virion= rijp infectieus virusdeeltje (virus) - Kern van 1 soort nuclenezuur (RNA of DNA) - Capside, eiwitmantel of eiwitkapsel: eiwitten op een geordende wijze het nuclenezuur

omkapselen (staafje, veelvlak of ingewikkeldere vorm) - Envelop: kapsel, huls of mantel rond capside, bevat eiwitten met een enzymatische functie - Nucleinezuur + eiwitkapsel = nucleocapside - Lipiden, glycoprotenen, polyaminen (structuren die niet steeds aanwezig zijn) - Bacteriofagen: kop, staart, staartfibrillen, heeft bacterie als gastheer

Functie envelop of capside:

- Bepaalt de vorm van het virion - Beschermt nuclenezuur tegen ongunstige milieu-invloeden - Functie bij het binnendringen van het virus in de cel - Ook eiwitten met een enzymatische functie, bv. voor oplossen celwand, reverse transcriptase bij

retro-virussen,

Dissociatie en associatie Virussen kunnen experimenteel gesplitst worden

- Nuclenezuur, eiwit individuele capsomeren - Naakte nuclenezuren: kunnen in een gevoelige cel opnieuw volledige virionen vormen erfelijke

informatie zit vervat in nuclenezuur - Zelf-assemblage: buiten de cel uit de gedissocieerde componenten weer complete virionen

opbouwen, omdat de informatie nodig voor de vorm van de capside in de structuur van de individuele bouwstenen besloten ligt

Virusinfectie - Vermeerdering van virusdeeltje: enkel in levende cellen - Enzymen en celstructuren nodig voor de aanmaak van virus DNA en viruseiwit worden van de

gastheercel geleend Stadia: - Aanhechting

o Op bepaalde, specifieke plaatsen van de celmembraan o Sommige virussen hebben herkenbare aanhechtingsstructuren (staartfibrillen bij

bacteriofagen, penton fibers bij adenovirussen, ) o Aanhechting van 1 virusdeeltje voldoende om het infectieproces in de cel op gang te

zetten o Geen aanhechting -> geen infectie o Enkel cellen met juiste aanhechtingsplaats zij gevoelig voor infectie v dat virus

- Penetratie o Na aanhechting aan de celmembraan dringt het virion de cel binnen o 2 verschillende mechanismen in dierlijke cel

Endocytose: virus maakt gebruik van de bestaande celactiviteit, nodig om macromoleculen op te nemen. Door afsnoering van de membraan wordt een coated vesicle gevormd. Virusenvelop wordt aangetast en nucleocapside komt vrij in cytoplasma

Penetratie door fusie: fusie tussen membraan en virusenvelop: nucleocapside komt direct in cytoplasma

o Welk mechanisme meest effectief: niet duidelijk o Meeste virionen die binnendringen, brengen geen vermenigvuldiging teweeg o Penetratie in plant en bacterie is moeilijker door de aanwezigheid van een celwand o Plantenvirussen in plantencel via insecten o Bacteriofagen injecteren nuclenezuren direct in de bacteriecel, staart is injectienaald

- Vermenigvuldiging o Synthese van de viruscomponenten zeer strikt o Processen die in gang worden gezet: afhankelijk van het soort virus/nuclenezuur o Replicatiestrategie afhankelijk van:

Type nuclenezuur (enkelstrenig of dubbelstrengig DNA, enkelstrenig of dubbelstrenig RNA)

Polariteit van het nuclenezuur o Virale genetische component DNA (vb. adenovirus)

DNA dient als matrijs voor vermeerdering DNA (DNA replicatie) DNA ook via transcriptie RNA mRNA wordt door de cellulaire ribosomen vertaald (translatie) naar virus-

specifieke enzymen en structurele eiwitten o enkelstrenig DNA (parvovirussen) (klein genoom)

ssDNA wordt omgevormd naar dsDNA dsDNA dient opnieuw voor de zelfreplicatie van DNA Het dsDNA wordt via transcriptie omgezet naar mRNA, dat dan via translatie de

nodige virale enzymes en bouwstenen manteleiwitten levert o Genetische component van het virion ssRNA

Positief enkelstrengs RNA-virussen (vb. picornavirussen): viraal RNA heeft dezelfde polariteit als het mRNA

Virus RNA zal vertaald worden in enzymen die de productie van viraal RNA verzorgen

RNA dient tevens als mRNA en de synthese van virusspecifieke eiwitten op volgende wijze

o mRNA wordt vertaald op discontinue wijze, zodat een aantal afzonderlijke eiwitten wordt gevormd, 1 eiwit voor ieder gen

o mRNA wordt vertaald in 1 grote polypeptideketen, die dan verdeeld wordt in een aantal eiwitten met verschillende functies (o.a. virus replicatie)

Negatief enkelstrengs RNA-virussen (vb. paramyxovirussen, rhabdovirussen, arenavirussen): polariteit van het virus RNA is tegengesteld aan het viraal mRNA, virus RNA kan niet zomaar dienst doen als mRNA

Deze groep virussen bevat een enzym dat zorgt voor de synthese van de complementaire RNA-streng, die als mRNA fungeert

Daarna zelfde als bij de positieve enkelstrengs RNA-virussen o Dubbelstrengs RNA virussen: vb. reovirussen: viraal enzym om enkelstrengs RNA te

vormen, daarna opnieuw replicatie dsRNA o eigenschappen van RNA- als DNA-virussen: genoom bestaat uit ssRNA

RNA via reversed transcriptase naar DNA DNA in cellulair genoom gastheer Verandert de normale gastcel in een tumorcel

- Assemblage o Bij voldoende virus-nuclenezuur en virusspecifieke bouwstenen in de cel: spontaan

assemblage van de virusdeeltjes - Rijping

o Wanneer er voldoende virusdeeltjes in de cel zijn: zullen zij de cel verlaten om nieuwe infectiecyclus te starten

Door afbraak eigen celcomponent krijgen we lyse van de genfecteerde cel virusdeeltjes in omgeving

Virus treedt naar buiten via tubulaire structuren Virusdeeltjes rijpen aan het plasmamembraan en worden via een uitstulping van

de membraan (budding) aan de omgeving vrijgegeven o Bij bacterin: lysogene infectie door gematigde fagen:

Replicatie van de virus onderdrukt, DNA gaat deel uitmaken van het genoom van de bacterie

Gebeurt ook soms bij bepaalde virussen bij dieren Provirus Dit kan leiden tot een transformatie van de cel, waarbij deze een ongeremde

delingsactiviteit gaat vertonen

Genetisch materiaal bij prokaryoten - Vrij centraal in cytoplasma - Nucleode: 1 enkel cirkelvormige DNA, molecule, geen eiwit - Plasmide: klein circulair DNA, enkele genen, onafhankelijke replicatie, vaak resistentie-genen

(weerstand tegen antibiotica). Kan gemakkelijk aangepast worden

DNA bij eukaryoten Algemeen

- Chromatine-materiaal: DNA gekoppeld aan arsenaal v eiwitten - Chromosomen: dragers van genen - Zichtbaar maken bij delende cellen via Giemsa kleuring - Tijdens metafase: steeds 2 chromatiden - Karyogram: rangschikking van de chromosomen naar grootte en vorm

o wordt in genetisch onderzoek frequent gebruikt: Pre-nataal onderzoek: trisomie 21, turner-syndroom, andere geslachtsafwijkingen,

trisomien, Kankeronderzoek: opsporen afwijkingen karakteristiek voor een bepaalde soort

kanker - Heterochromatine: sterk gekleurde delen - Euchromatine: licht gekleurde delen - Meeste eukaryoten: 2 exemplaren van chromosomen (diplod) (2n) - Eencelligen, schimmels (haplod) (n) - Menselijk genoom: 46 chromosomen, 3,2.109 baseparen, 25 000 30 000 genen

Celcyclus:

- G1-fase: cel neemt 20% in omvang toe, defecten in DNA repareren, enzymen voor DNA replicatie aanmaken (8 u)

- S-fase: DNA duplicatie (8 u) - G2-fase: enzymen voor mitose aanmaken, organellen bijmaken, cel groeit (3 u) - G1, S, G2-fase: interfase: controle van de processen door enzymen, met eventuele afdoding van de

cel als er fouten optreden - M-fase: kerndeling (1 u)

o Profase: DNA moleculen spiriliseren, chromosomen worden zichtbaar o Metafase: chromosomen verplaatsen naar middenvlak o Anafase: chromatiden uit elkaar getrokken o Telofase: chromatiden naar polen o Cytokinese: nieuw kernmembraan

- G0-fase: rustfase

DNA en histonen - DNA-moleculen eukaryoten > DNA-moleculen prokaryoten - Lineair (behalve plasmiden circulair) - Geassocieerd met eiwitten (histonen en niet-histonen) en fracties RNA - Cel bevat uitgerold 2 meter lang DNA-molecule - Geheel van DNA en nucleosomen: chromatine - Chromatine: opgebouwd uit nucleosomen - 1 nucleosoom: opgebouwd uit 8 histonen (octameer) - Core-DNA: binnenste DNA: DNA rond dit histoncomplex in een 1 winding, die gemiddeld 140 bp

bevat - linker-DNA: verbinden de nucleosomen, ongeveer 60bp - Per nucleosoom= ongeveer 200 bp - Condensatie in heterochromatine sterker dan in euchromatine - Dankzij nucleosomen kan de DNA-molecule in een cel passen - Door die compacte verstrenging: DNA zit effectief op slot en kan niet gelezen worden - openen en sluiten van DNA gebeurt door chemische sleutels, waaronder methyl en acetyl (DNA

komt zo minder strak rond eiwitbolletjes) - Om de chemische sleutels in en uit slot te krijgen: enzymen nodig - Nucleosomen bestaan uit vier verschillende eiwitten, histonen genaamd, met meerdere

bindingsplaatsen voor chemische groepen

(1. Enkelvoudig DNA, 2. Chromatine (DNA met nucleosoom), 3. Nucleosoom) Histonen

- Hoog gehalte basische aminozuren (20 tot 30%) - Spelen een belangrijke rol in de structuur van chromatine - Interactie tussen de positief geladen histonen en de negatief geladen fosfaatgroep van DNA - In kop spermacellen histonen vervangen door protaminen waardoor een nog compactere

structuur mogelijk - Histon H1 (n type): bevindt zich aan de buitenzijde van het nucleosoom bij het linker-DNA,

betrokken bij het handhaven van de nucleosoomstructuur - Histonen vormen als het ware 'klosjes' waar het lange DNA-molecule omheen is gewonden - Ze spelen een belangrijke rol bij het samentrekken (condenseren) van het DNA, zodat een

chromosoom kan ontstaan - Histoneiwitten per lengte-eenheid constant - Hoeveelheid niet-histoneiwitten ~ activiteit van het DNA

Verschil pro- en eukaryoten op vlak van DNA? Prokaryoot Eukaryoot Centraal in cytoplasma Gekoppeld aan eiwitten= chromatine plasmiden Diplod en haplod Hoe is chromatine, nucleosoom opgebouwd? Chromatine: opgebouwd uit nucleosomen 1 nucleosoom: opgebouwd uit 8 histonen (octameer) Wat is een karyogram? Rangschikking van de chromosomen naar grootte en vorm

Enzymen en nuclenezuren - In elke cel zijn enzymen aanwezig die nuclenezuurmoleculen als substraat hebben - Enzymen kunnen die nuclenezuren veranderen, vb. methyleren van DNA, aan elkaar koppelen van

DNA-fragmenten, repliceren van DNA, synthetiseren van RNA - In labo: enzymen aanwenden om DNA en RNA te veranderen of synthetiseren

Groepen goed kennen! Vijf groepen:

- Toposomerasen - Ligasen - Modificerende enzymen - Nucleasen - Polymerasen

Toposomerasen - Kunnen het aantal windingen van een DNA-molecule veranderen door het aanbrengen van een

knip in n of in beide strengen van de DNA-molecule - Knipplaatsen kunnen dus voorkomen in zowel lineair als circulair DNA - Komen voor in pro- als eukaryoten - Relaxed DNA super-coiled DNA - Mate van supercoiling: bepaald door de antagonistische werking van de beide enzymes - Overgang van superhelix-vorm naar meer relaxed vorm: energie komt vrij - Aanbrengen van torsie: kost energie - Twee types:

o Toposomerase I: werkt alleen in op DNA met negatieve supercoiling, draait deze rechts om de andere streng heen en lijmt vervolgens de breuk, aantal negatieve windingen neemt toe of af met 1

o Toposomerase II: knipt in beide strengen, het aantal negatieve windingen neemt toe (af) met 2

Ligasen = lijm-enzymen, kunnen fragmenten van nuclenezuren aan elkaar koppelen

- Herstel van breuken van DNA - Aanbrengen van fosfodisterbinding tussen 2 opeenvolgende nucleotiden - Energierijke verbindingen vereist: ATP - Belangrijk bij recombinant technologie

Modificerende enzymen - Enzymes die geringe veranderingen bij nuclenezuren kunnen aanbrengen door verwijdering of

toevoeging v/e methylgroep - Methylasen: brengen methylgroepen aan op bepaalde basen, blokkeren zo de werking van

bepaalde restrictie-enzymes - Alkalische fosfatase (AP): verwijdering van de fosfaatgroep aan het 5-einde van een DNA-

molecule o AP gaat in vitro een 5 fosfaatgroep verwijderen die dan bv. door een radioactief gelabelde

fosfaatgroep kan vervangen worden o AP dient ook om herstel van een aangebrachte knip in het DNA-molecule te voorkomen

- Polynucleotide-kinase (PNK): additie van een fosfaatgroep aan het 5-uiteinde, in vitro meestal een

gelabelde fosfaatgroep - Terminaal-transferase: enzym zorgt voor additie van 1 of meer desoxyribonucleotiden aan 3

uiteinde DNA molecule

Nucleasen - Enzymen die nuclenezuren afbreken door het verbreken van de fosfodisterbindingen - ! Exonucleasen: knippen vanaf het uiteinde steeds 1 nucleotide af, kunnen circulair DNA niet

knippen - ! Endonucleasen: splitsen fosfodisterbindingen binnen de nucleotidenketen - ! Restrictie-enzymes: herkennen specifieke sequentie - ! DNasen - ! RNasen: hittebestendig, zijn pas onwerkzaam na 4u bij 250C

Polymerasen - Enzymes die nucleotiden kunnen polymeriseren tot polynucleotiden - DNA-polymerasen:

o bezitten ook exonuclease-activiteit i.v.m. de te verrichte DNA-reparatie o Betrokken bij repliceren en repareren

- RNA-polymerasen: o Kunnen niet tijdens synthese gemaakte fouten repareren

- RNA-moleculen hebben kortere levensduur de eventuele fouten hebben minder grote gevolgen - RNA-virussen geven fouten wel door op nageslacht: mutatiefrequentie is groter dan bij DNA-

virussen - DNA-polymerasen polymeriseren in de richting 5 3, exonuclease activiteit in beide richtingen - Reverse transcriptase (RT)

o Heeft RNA als matrijs en wordt aangetroffen bij retro-virussen o In vivo: zet RNA-virus om in DNA-fragment, zodat dit in de gastheer kan worden

ingebouwd o In vitro: mRNA om te zetten in complementair DNA (cDNA)

Werking antibiotica - Eiwitsynthese van prokaryoten stoppen zonder deze van eukaryoten aan te tasten - Peptidyl-transferase uit de ribosomen van prokaryoten meer gevoelig voor het antibioticum

chlooramfenicol dan analoge enzym bij eukaryoten - Remming peptidyl-transferase: aaneenschakeling van AZ voorkomen - Streptomycine: verhindert een correcte start eiwitsynthese prokaryoten - tRNA kan niet binden waardoor een misreading van mRNA gebeurt - Puromycine: voortijdige stop eiwitsynthese bij zowel pro- als eukaryoten, tRNA kan geen AZ meer

inbouwen

Veranderingen in het genetisch materiaal - DNA-diagnostiek = verschillende toepassingsgebieden waarin een diagnose wordt gesteld op basis

van DNA-onderzoek - Vele aandoeningen hebben genetische oorsprong - Mutaties

o Ioniserende straling, bepaalde chemische stoffen, - Variaties tussen mensen

o SNPs (single nucleotide polymorphisms): subtiele verschillen op DNA-niveau tussen individuen

Liggen verspreid over de 46 chromosomen Gemiddeld genomen ~ 10 miljoen bp verschillend tussen 2 individuen Variatie van 1/300

o CNVs: copy number variations: repeterende stukken DNA die voor variaties zorgen

Veranderingen in de genen - Veranderingen in de genen: mutatie - Deletie: verwijdering van 1 of meerdere nucleotiden. Vb. mucoviscidoseMutatie: veranderingen in

de genen - Additie of insertie: toename van nucleotiden in de keten. Vb. ziekte van Huntington - Puntmutatie: vervanging van een nucleotide door een ander - Gevolg van mutatie:

o Silent mutation: mutatie verandert de DNA-code, maar verandert niets aan het eiwit dat wordt gesynthetiseerd -> gn probleem

o Missense mutation: mutatie resulteert in een wijziging v/e aminozuur v/h eiwit o Nonsense mutation: mutatie resulteert in een voortijdig stopcodon die de eiwitsynthese

voortijdig doet stoppen o Frameshift mutation: gevolg v/e deletie of additie v/e basenparen met een getal

verschillend v/e veelvoud v 3, zodat totaal andere combinaties v codons ontstaan die resulteren in een totaal andere combinatie v AZ

Veranderingen in de chromosomen Structurele veranderingen

- Deletie: verwijdering van een deel of een volledig chromosoom. Vb: Angelman syndroom/Prader-Willi

- Duplicatie: chromosoom wordt langer door een deel chromosoom dat zich verdubbeld - Translocatie: uitwisseling van chromosomaal materiaal tussen 2 chromosomen - Inversie: het uitknippen van een deel van de dubbele helix, waarna dit deel wordt teruggeplaatst

op dezelfde plaats maar met de andere orintatie

Veranderingen in aantal - Polyplodie: het aantal van alle chromosomen is veranderd

o Niet leefbaar in dieren o Komt wel voor bij planten

- Polysomie: het aantal van 1 of enkele chromosomen is veranderd - Trisomie: 3 i.p.v. 2 chromosomen - Monosomie: 1 i.p.v. 2 chromosomen. Vb: Turner syndroom

Verschil in genetische en chromosomale aandoeningen +vb.

Erfelijke aandoeningen - Microscopisch waarneembare chromosoomafwijkingen: karyogram of FISH - Multigene aandoeningen: meerdere genen betrokken: sommige kankers, alzheimer, hart- en

vaatziekten - Monogene aandoeningen: 1 gen betrokken

o 5000 beschreven o Meest onderzocht

Biotechnologische technieken - PCR (polymerase chain reaction) - DNA-sequentie opsporen - DNA-diagnostiek - Fingerprinting - Genetische modificatie - Klonen bij dieren - Transgene dieren - Cel- en weefseltherapie

PCR (polymerase chain reaction) - 1980 ontwikkeld door Carry Mullis - Exponentieel vermenigvuldigen van een DNA-fragment - Polymerase ketting reactie: cyclisch proces - 2 primers nodig:

o oligonucleotiden van ongeveer een 20 tal basenparen met gekende sequentie die passen op de uiteinden van de te vermeerderen DNA-sequentie

- Gebruik PCR techniek bevorderd dankzij ontdekking van thermostabiele DNA-polymerase uit de bacterie Thermus aquaticus

- Deze bacterie leeft in omgeving van heetwaterbronnen en kan temperaturen van iets meer dan 90C doorstaan

- enzyme van deze bacterie (Taq-DNA-polymerase of Taq-polymerase) blijft stabiel na denaturatie - 2 primers: aan elke kant van target-DNA - na hybridisatie vanaf elke primer polymerisatie in de richting 3' 5' - Opstellen primers:

o nucleotidensequenties van target-DNA kennen o complementaire sequenties moeten zeer specifiek zijn (alleen voor vermeerdering target-

DNA) o Primers zijn niet gelijk, nieuwe strengen worden in tegengestelde zin gesynthetiseerd

Cyclische verandering:

- Denaturatie (> 90C): hoge temperatuur doet de complementaire strengen uit elkaar wijken - Annealing (~55C): (primebinding) primers hechten zich aan de complementaire sequentie - Primer extension (~72C): optimale temperatuur om door enzyme polymerase dNTPs vanaf de

primers in te bouwen - Deze 3 stappen worden gedurende verscheidene cycli herhaald (n cycli geeft 2n fragmenten)

Bestanddelen: - DNA-polymerase (uit thermofiele bacterie) - DNA-template (enkele ng genoeg) - 2 primers - dNTPs - Buffer - Mg2+-ionen (vaak reeds aanwezig in buffer) - Minerale olie: vormt laagje op reactiemengsel en voorkomt verdamping en condensatie - In nieuwe toestellen is geen minerale olie meer nodig, vermits deksel verwarmd wordt om

verdamping tegen te gaan Voordelen:

- Weinig DNA nodig (reeds voldoende met enkele ng) - DNA mag gedeeltelijk gedegradeerd zijn - Zeer snel en zeer makkelijk - Via RT-PCR (reversed transcriptase PCR) kan mRNA omgezet worden in DNA en dit dan gebruikt

worden in PCR (introns zijn niet meer aanwezig in RNA en maakt het soms makkelijker om genherschikkingen op te sporen)

Nadelen:

- Mispriming (primers die op verkeerde plaatsen binden) bij lage temperatuur: o Kan verholpen worden met een hot start o Primers met voldoende GC (hogere annealing)

- Contaminatie van een negatief staal o Pre- en post-PCR scheiden o PCR ruimtes DNA en RNA vrijmaken door UV-bestraling (UV maakt alles kapot) o Nieuwe technieken waarbij PCR producten gevalueerd worden zonder openen epjes

Evaluatie v/d PCR producten

- Agarose of polyacrylamide gel elektroforese (polysaccharide opgekookt en opgesteven) - Scheidt de DNA fragmenten volgens grootte - Elektrische stroom zorgt voor migratie van de fragmenten door de agarose of polyacrylamide gel:

DNA is negatief en migreert naar positieve pool van een stroombron - Kleinste fragmenten migreren sneller - DNA ladder

Amplificeren van RNA RNA vermeerderen gaat ook, mr dan is er 1 stap extra in de cyclus: eerst RNA omzetten naar DNA en dan PCR-cyclus. = RT-PCR Toepassingen:

- Opsporen genherschikkingen waarbij de breuken in de intronen tss de exonen aanwezig zijn

- Productie chymosine vertrekkende van mRNA uit cellen kalvermagen

Aanvullende technieken Kwantitieve real-time PCR (Q-PCR):

- PCR waarbij op ieder moment de toename van het aantal kopien gedetecteerd wordt - Oorspronkelijke DNA concentratie - in vaststellen - viral load (aantal virusdeeltjes bij bv. AIDS patinten, aangetaste gewassen) - minimal residual disease (het vaststellen van het aantal kopien van het gemuteerde DNA bij het

opvolgen van leukemie patinten) - Bepaling hoeveelheid ggos, allergenen in voedingsmiddelen - Kleurstof dat bindt met ds DNA - Intensiteit van de kleurstof ~ gevormd PCR product - Werkwijze:

o DNA-probe complementair aan target DNA, niet verlengt met DNA polymerase o Bevat quencher en reporter o Verloop fluorescentie vergelijken met een gekende standaardreeks o 2 primers + DNA-probe

- Voordelen: o Kwantificatie o Geen gel-electroforese nodig o Minder kans op contaminatie o Enkel kwantificatie van juiste PCR product (door gebruik probe)

- Verschilpunten met Taqman probe: o Zelfde voordelen als Taqman maar minder specifiek (alle PCR product wordt gemeten) o Goedkoper (geen dure probe nodig)

- Probe hybridiseren met het gevormde DNA tijdens annealing - Intensiteit van de kleurstof probe ~ gevormd PCR product

Andere veel gebruikte PCR technieken Inverse PCR

Asymmetrische PCR Sterk verschillende concentratie van de 2 primers, daardoor ontstaat uiteindelijk veel ssDNA

Aanhangsels aan het 5-einde van de primers (vb. een restrictieplaats, promotor plaats, stopcodon)

Gelokaliseerde mutagenese Doelbewust aangebrachte veranderingen in primer die dan een lagere annealingstemp. op het DNA zal binden en teruggevonden wordt in het geamplificeerde DNA. Toepassingen PCR

- DNA-diagnostiek - Screening op virussen, zoals IBR (bovine herpesvirus), BVD (bovine viraal diarree) en bacterin

zoals TBC, brucellose, - Screening op defecte genen zoals deleties of translocaties - Identificaties in de gerechtelijke geneeskunde of om sanitaire redenen

DNA-sequentie analyse - = Bepaling precieze opeenvolging van nucleotiden in DNA-monster - Dideoxyketenterminatie methode van Sanger - DNA synthese 4 soorten dNTPs: ATP, GTP, CTP en TTP - Dideoxymethode nucleotiden toegevoegen die 3OH groep niet hebben - Dideoxynucleotide DNA elongatie stopt - chain termination method

Procedure:

- DNA denaturatie (dubbelstrengig -> enkelstrengig) - mengsel van 4 normale dNTPs en een kleine hoeveelheid van ddNTPs met een verschillend

fluorescent gelabeled kleur - + DNA polymerase - Elongatie (verlenging) gebeurt tot bij toeval een ddNTP wordt toegevoegd i.p.v. een normale dNTP - Correcte verhouding dNTPs en ddNTPs: fragmenten van 1 basenpaar tot enkele honderden

basenparen - Fragmenten scheiden volgens lengte - Toestel detecteert verschillende fluorescente stoffen

Eerste generatie sequentie analyse: - 3 miljard bp - 3 miljard dollar - 13 jaar - Humaan genoom project

o Gestart in 1990 met als doelstelling het volledige menselijk genoom te sequencing

o Gecordineerd door US department of Energy and the National Institute of Health, in samenwerking met 9000 wetenschappers in 36 landen

o Doelstellingen: Identificatie van de ongeveer 25 000 genen in humaan DNA Het in kaart brengen van de 3 miljard bp Deze informatie stockeren in databases Deze gegevens gebruiken voor een betere data analyse

o Nu volledige menselijk genoom in kaart is gebracht, nieuwe perspectieven: o Onderzoek naar de identificatie van de genen die betrokken zijn bij erfelijke ziekten,

kankers, schrizofenie, o Inzicht verkrijgen in het ziekteproces o Algemeen streven naar een verbetering van de menselijke gezondheid en de bestrijding

van ziektes o Onderzoek naar mogelijkheden gentherapie

Tweede generatie:

- Verbetering technologie o Pyrosequencing: reacties in gaatjes van enkele picometer breed 1,6 miljoen

sequentiereacties op 1 plaatje (genoomchip) o Identificatie tijdens polymerisatie

Derde generatie:

- DNA sequencen met de nanoporiemethode o Gaatje van enkele nm DNA erdoor trekken o Direct aflezen van elektrische stroom

Toepassingen: - Mutaties opsporen en identificeren - Humaan genoom project (zonder sequencing onmogelijk)

Gentherapie: - Gentherapie: opties om erfelijke ziekte te genezen - Methode:

o cellen uit het lichaam van de patint nemen o in labo in die cellen correcte versie van slecht functionerende gen inbrengen o cellen weer terugbrengen in het menselijk lichaam

- Hoop voor erfelijke ziektes - Maar: bij vele ziekten meerdere genen betrokken

Genetisch profiel, DNA-polymorfisme Afkortingen & wat!

- Vingerafdrukken zijn uniek - Genetisch profiel = DNA fingerprint is uniek (uitzondering neiige tweelingen) - Gevoeliger, universeler, betrouwbaarder - Belang:

o Ouderschapsonderzoek o Opsporen daders o Verwantschap

- Methode: DNA-technieken gebaseerd op DNA-polymorfismen - Slechts 2% DNA mens codeert voor eiwitten - Andere delen: introns - Introns bestaan hoofdzakelijk uit enkele basenparen,vaak of minder vaak herhaald - Repeterende sequenties, microsatellieten, of repeats - CNVs (copy number variations): aantal repeats genoom verschilt per individu - VNTR's (variable number of tandem repeats) (9-80 bp) - STRs (short tandem repeats) (2 8 bp) - Mutaties

o Willekeurig o Grotere kans in een intron o In introns geen effect op functie o Makkelijk overerfbaar o Geen invloed op selectie

- DNA-polymorfisme uniek - Familiale gelijkenissen - Specifieke mutaties binnen families - Variaties om 200 300 basenparen bij niet-verwante individuen - DNA fingerprint: techniek om genetische vingerafdruk te maken (DNA profiel)

RIFLIPS, RFLP fingerprinting = random fragment length polymorphism

- DNA behandelen met EcoRI restrictie-enzym: geeft ongeveer 1 000 000 fragmenten

- Polymorfisme: variatie in knipplaatsen en fragmentlengte - Minder variatie meer verwant - Fragmenten met verschillende groottes scheiden op een agarose gel - 1 000 000 is teveel om te evalueren (geeft een smeer) - Afdruk van de gel op membraan maken (blotten) - Met radioactieve merker (probe) deel van de VNTRs zichtbaar maken - Probe: kort stuk ssDNA dat aan een complementair DNA sequentie kan binden

(hybridiseren) - Jeffrey: probe 16 bp herkent repeats binnen intron gen myoglobine en ~ 30

andere minisatelliet sequenties - DNA: 1- 4 fg (druppel bloed en sperma) - Het streepjespatroon is uniek voor elke persoon - Homozygoot - hererozygoot - Ideaal voor vaderschapstest of aanwijzen dader bij een crimineel feit

RAPD (random amplified polymorphic DNA) - Vereenvoudigde PCR met slechts 1 primer - Ontworpen of random gekozen (13 bp) - Verwantschappen vergelijkbaar patroon op een agarosegel - Amplificatie DNA:

o primers met juiste orintatie o geschikte onderlinge afstand

- primers 2 en 5, 3 en 6 geven PCR product - ander individu: primer 2 bindt niet meer

- Gelelektroforese nodig

AFLP (ampiflied fragment lenght polymorfism) Procedure:

- Genomisch DNA verknippen zoals RFLP

- Ontwikkeling adaptor moleculen specifiek voor de restrictieplaatsen - DNA fragmenten lijmen aan de adaptor moleculen (ligase)

- pre-selectieve PCR amplificatie: met primers complementair aan adaptor sequenties + 1 gekozen

basepaar (reductie tot 1/16 van het oorspronkelijke aantal fragmenten)

- tweede selectieve PCR met eerste PCR producten als template, primers eerste PCR + 2 additionele

basenparen (na de twee reacties subfractie van 1/4096 oorspronkelijk complex mengsel)

- Gelelectroforese maakt evaluatie mogelijk

Voordelen: - Reproduceerbaar, hoge resolutie en efficintie - Gevoeligheid voor detectie polymorfismen op vlak van het volledig genoom -

Microsatellieten - STR: korte DNA-fragmenten met repetitief motief (2 tot 8 bp). Vb: TA, CA, GTG, - VNTR: iets grotere fragmenten - Variatie in het aantal herhalingen van het basismotief - Passende primers om specifieke microsatellieten te isoleren en amplificeren

Recombinant DNA-technologie - Begin jaren 70 - recombinant DNA technologie of genetic engineering en gen cloning - Benodigdheden: restrictie-enzymen, ligasen en polymerasen. - recombinant-DNA: DNA van verschillende herkomst aan elkaar koppelen

Procedure:

- Isolatie v DNA: DNA uit cellen - Bewerking DNA: Knippen DNA

o Gen afzonderen: knippen met restrictie-enzymes (herkenningssequentie 4,6,8 bp)

- Selectie vector

o De gepaste vector zoeken met merkergenen o Plasmide (circulair DNA aanwezig in bacterin en gisten), YAC o Virussen (bloemkoolmozaekvirus)

- Bewerking v/d vector: Knippen vector

- Inbrengen DNA in vector: Stukjes DNA aan elkaar lijmen (ligase): DNA-fragmenten + vector,

vectoren samen, fragmenten samen - DNA-fragment + cloning vector = recombinant DNA molecule

- recombinant DNA molecule introduceren in een gast cel (meestal de bacterie E. coli) via transformatie of gistcellen (posttranslationele veranderingen) specifieke tertiaire structuur v/d eiwitten

- Selectie gewenste kloon: Bacterie of gist uitplaten: kloon = kolonie van cellen met elk recombinant

DNA molecule

- Gepaste gastheer selecteren voor de vermeerdering (bacterin, gisten)

o Bacterin: gram+ kunnen makkelijk DNA opnemen, gram- eerst competent maken (transformatie)

o Eukaryote cellen (voordeel: eiwitten modificeren en gepaste tertiaire structuren geven): gisten, planten, dierlijke cellen, menselijke cellen

Toepassing:

- Sequentie van gekloneerd DNA-fragment - Genen eukaryoten tot expressie brengen in bacterin of in gistcellen (vb menselijk groeihormoon,

stollingsfactoren) - Eiwitten ontwerpen voor speciale doeleinden (protein engineering) en basis voor gentherapie.

Hybridisatie - Temperatuur verhogen: beide strengen dsDNA laten los (denatureren) - Afkoelen: DNA-strengen herenigen dsDNA: 'reannealing' - ssDNA + complementair ssDNA afkomstig van ander organisme dsDNA-molecule (hybride-DNA) - Hybridiseren: mate van hybridisatie is maat voor verwantschap van het DNA - Hybridisatie van ssDNA met RNA ook mogelijk (DNA/RNA-hybriden) (sterker) - Hybridisatie uitgevoerd met een onbekend, aan te tonen DNA, het z.g. target-DNA - Probe: kortere, bekende DNA is gelabeld - De hybridisatie kan in verschillende situaties voorkomen, zoals op een membraan, in de cel

(intracellulair) of in een oplossing (in vitro). - Stringentie: percentage mismatching dat bij hybridisatie wordt toegestaan - Vraagstelling van het onderzoek bepaalt de mate van stringentie - Bijvoorbeeld virus classificeren: hoog percentage mismatching toestaan (lage stringentie) - Verschil tussen proto-oncogen en een oncogen met 1 nucleotide: hybridiseren hoge mate

stringentie - Fluorescentie in situ hybridisatie (of FISH technologie): hybridisatie met fluorescente probe - Frequent gebruikt in prenataal en kankeronderzoek

- meerdere fluorescente labels, waardoor evaluatie van meerdere genen of chromosoomfragmenten per hybridisatie

- M-FISH: alle 23 chromosoomparen tegelijkertijd te visualiseren

- Radioactieve hybridisatie: blotting - Blotten: overbrengen DNA, RNA, of eiwit van een gel op een membraan - Southern blotting: DNA als target - Northern blotting: RNA als target - Western blotting: eiwit als target

Toepassingen:

- Ziektediagnosis (probe complementair aan stuk micro-organisme) - Onderzoek aan- of afwezigheid van een eigenschap (DNA complementair aan een deel van het

gen): selectie - Erkenning rassen,

Microarrays:

- nieuwe techniek om genexpressies te meten - 1 experiment om de expressie van 1000den genen tegelijkertijd te meten - Genen worden via transcriptie omgezet in mRNA en deze gaat via translatie naar eiwit - Hoeveelheid mRNA is een maat voor de expressie van het respectievelijke gen - array: glazen plaatje van 2x6 cm waarop probes specifiek voor een gen zijn aangebracht - mRNA wordt uit het staal gextraheerd - Via RT-PCR omgezet in cDNA - cDNA wordt fluorescent gemerkt en kan binden met probe op array - mRNA eerste staal omzetten naar cDNA en fluorescent merken met rode kleur - mRNA tweede staal omzetten naar cDNA en fluorescent merken met een groene kleur - Beide stalen op een array brengen - Met een toestel groene en rode kleur meten en via de computer elk stipje op de array vergelijken

Antisense technologie - Genen mRNA (transcriptie) - mRNA eiwitten (translatie) - Door in te grijpen op de hoeveelheid mRNA, wordt ook ingegrepen op hoeveelheid eiwit - Complementair RNA of antisense-RNA: RNA fragment dat bindt met mRNA: dubbelstrengig mRNA - Target RNA kan niet meer vertaald worden naar eiwit

Toepassing:

- Bestrijding kanker, virale ziekten en infectieziekten - Manipulatie expressie bloemkleur

Genetische modificatie v planten - Eeuwenlange veredeling: kruisingen en selectie van de nakomelingen - Inbreng genen: Agrobacterium of electroporatie - Planten groeien vanaf gewijzigde cellen - GGO: enkel gewenste genen in genoom brengen (ook van andere soorten)

o Opbrengstverhogend, resistenties, kwaliteit verhogend, aanslag op milieu verminderen o Insecticide-planten: Bacillus thuringiensis bacterie (biologisch bestrijdingsmiddel)

produceert kristallen die darmwand rupsen en kevers aantast (niet stabiel)/Via recombinant technologie kristallen door plant laten maken

o Herbicide-planten: BASTA o Mannelijk steriele planten: om zelfbestuiving te vermijden: meeldraden verwijderen

(mechanisch, chemisch, genetisch) o Verhogen van de voedingswaarde: aardappelen met verhoogd zetmeelgehalte, rijst met

bta-caroteen o Resistentie tegen milieu invloeden o Vbn GGOs

Blauwe katoen Aardappelen met meer zetmeel en minder water Koolzaad met meer onverzadigde vetzuren Mas met gen voor kouderesistentie Rijst met beta-caroteen Appelen en peren met resistentie tegen Erwinia amylovora

- Planten GGOs makkelijk te vormen? o Planten zijn totipotent (dedifferentiren) o Plantencellen kunnen uitgroeien tot volledig nieuwe plant(delen) (in vitro-teelt)

Genetische modificatie v dieren Normale ontwikkeling v dieren

- Dierlijke cellen: alleen stamcellen zijn flexibel - Genoom bepaald bij bevruchting - Eicel en zaadcel genetisch materiaal - Mutaties in geslachtscellen doorgegeven aan nakomelingen - Genetische variabiliteit gestuurd door selectie en evolutie

Klonen bij dieren - Klonen= individuen met eenzelfde genoom - Natuurlijke klonen: eeneiige tweelingen - In landbouw: liefst klonen

o Op die manier planten en dieren met de beste eigenschappen o Geen variatie meer

- Klonen zijn fenotypisch niet 100% gelijk - Fenotype = genotype + omgevingsfactoren - Waarom klonen ?

o allen dezelfde positieve eigenschappen - Meer nadelen dan voordelen

o klonen geen topdieren o zeer duur o Zelfde dieren, zelfde ziekten, o Zeer negatieve publieke opinie

- Kunstmatig klonen: embryo in een vroeg stadium splitsen (embryo-splicing)

- Fenotype moeilijk behouden bij seksuele voortplanting - Beperkt aantal klonen

Homozygote, diplode of eenouderlijke dieren = Klonen van de moeder

- Normaal: F1 is een mengsel genotype vader en moeder - Methode: na bevruchting, eicel nemen voor de versmelting eicel en zaadcel - En van de prekernen verwijderen door microchirurgie - Cytochalasine B toevoegen bij eerste celdeling: zorgt voor verdubbeling genoom zonder

cytoplasmatische deling - Op die wijze krijgen we een diplod genoom in 1 enkele cel - Het diplod genoom is wel afkomstig van 1 van de ouders - De bevruchte eicel in een draagmoeder laten ontwikkelen - Enkel XX is leefbaar, YY bestaat niet

Androgenese = Voortplanting zonder inbreng van genetisch materiaal van het vrouwelijk dier

- Methode: 2 zaadcellen in 1 eicel = dispermie triplod embryo dat niet leefbaar is - Microchirurgie: prekern eicel verwijderen - Kruising vader met zichzelf of kruising twee mannen - Embryo's zijn nooit tot volledige ontwikkeling gekomen

Gynogenese = Voortplanting zonder inbreng genetisch materiaal van mannelijk dier

- eicel bevruchten met andere eicel i.p.v. door een zaadcel - Eicellen samensmelten met een fusiemiddel - Embryo's zijn nooit tot volledige ontwikkeling gekomen

Overplanting v/d kern (klonen)

- Overplanten van de kern, na verwijderen prekernen - Celkern kiezen uit bestaand individu (topdier) - Cellen van een volwassen dier al gedifferentieerd - Cellen van een embryo: totipotent, moeten nog differentiren tot een bepaald type - Om van cellen van een volwassen dier (gedifferentieerd) een nieuw organisme te bevorderen

ontwikkelingscapaciteit van de gedifferentieerde kernen herstructureren of "dedifferentiren" - Moeilijk, voor het eerst gelukt in Schotland in 1997 (schaap Dolly) - Spermatogonie is de stamcel waaruit spermatozoden ontstaan - Deze cel is gemakkelijk bereikbaar door een eenvoudige biopsie van de testes - Totipotent; diplod en geschikt om talrijke mitotische delingen - Hoopvol - Maar: te hoge kosten en geringe slagingskans - Commercieel belangrijke eigenschappen moeten op moleculair niveau gedentificeerd worden

Schaap Dolly:

- Schotland, 1997 - Methode:

o Cel isoleren uit uier topschaap o Cel inactief maken door uit te hongeren en kweken: op die

manier weer totipotent o Eicel van een andere of zelfde schaap nemen o Daaruit kernmateriaal verwijderen o Eicel activeren met een stroomstoot

- Geactiveerde eicel en andere totipotente cel samenbrengen - Cellen smelten samen in een elektrisch veld - Geen 100 % identieke kloon als er een andere eicelmoeder,

mitochondriaal DNA is anders - 100% identieke kloon, eicelmoeder gelijk aan de moeder geselecteerde

cel - Ook reeds op andere diersoorten toegepast

Therapeutisch klonen bij de mens - Lichaamseigen productie van donororganen - Geen afstotingsverschijnselen - Kern uit volwassen huidcel van een patint - Herprogrammeren tot een totipotente celkern - Laten uitgroeien tot gewenst lichaamsdeel (specifieke groei- en differentiatiefactoren)

Transgene dieren - Reeds toegepast (stier Herman) - Genen (DNA) introduceren in dierlijke cellen - Nieuwe genen toevoegen of genen uitschakelen - Doorgeven aan volgende generaties - Doel: ontwikkeling dieren met betere productiekenmerken of als producent farmaceutische

eiwitten - Intranucleaire geninjectie: groot aantal bevruchte eicellen worden genjecteerd met gewenste gen

+ aantal controle-elementen - Enkele genomen gaan nieuwe DNA opnemen (1% of minder bij rund en varken) - Transgene dieren kruisen met niet-transgene dieren eigenschap doorgeven aan volgende

generaties - Intranucleaire geninjectie gecombineerd met kerntransplantatie: Transgene embryos in vitro

kweken en selecteren vooraleer ze in te planten bij draagmoeders Groter succes - Gen introduceren in stamcellen: stamcellen kweken tot vroeg embryonaal stadium genen

inbrengen - Cellen selecteren met gen op de juiste plaats in hun genetische informatie - Kerntransplantatie toepassen: kern uit deze transgene stamcel in een lege eicel brengen

uitgroeien tot een individu - Nog veel onderzoek nodig - Meeste experimenten met micro-injectie van embryos - Misschien in de toekomst meer potentie - Ontwikkeling sneller groeiende dieren (overexpressie groeihormonen) - Goedkope productie farmaceutische eiwitten (via de melk) - DNA gewenste gen koppelen aan expressiesignaal dat enkel tot expressie komt in de uier van het

dier - Konijnen die in melk eiwit bevatten dat geneesmiddel is voor ziekte van Pompe - Transgene stier Herman nakomelingen geven melk met lactoferrine

Toepassingen v/d biotechnologie in de dierlijke productie Hybridoma-technologie en monoclonale antilichamen

- Antistoffen aanmaken tegen antigenen van ziektekiem - Capside van virussen bevatten verschillende eiwitten

verschillende antistoffen - Hybridoma: technologie om 1 antilichaam aan te maken

(MA): monoclonaal antilichaam - Via recombinant technologie: B-lymfocyt en kankercel

versmelten en zo productie van monoklonale antilichamen - Toepassing:

o Immuunserum virulente ziekten o Aantonen infecties met grote zekerheid

Kruisresistentie

- Virussen opgebouwd uit verschillende antigenen tegen elk antigeen worden in de gastheer door lymfocyten, antistoffen aangemaakt

- Bij grote gelijkenis tussen 2 kiemen is de immuniteitsopbouw snel verlopen voor de 2e gedeeltelijke immuniteit = kruisresistentie

JoyceCross-Out

JoyceCross-Out

Quantitative trait loci (QTL) - Uiterlijke kenmerken worden bepaald door verschillende genen - Kenmerken vlees- en melkproductie: polygenen - Quantitative trait loci: plaatsen op het genoom met deze polygenen - Op deze genen selecteren in fokprogrammas - Merkergenen plaatsen op locus interessant gen - MAS: marker assisted selection om superieure dieren te selecteren

Biotechnologie en toepassingen in planten: stand v zaken Herbicidetolerante gewassen

- Waarom kiezen boeren voor herbicideresistente gewassen? o Lagere productiekosten o Gemak voorbereiding en opvolging teelten

- Milieu-impact o In 2006 6% minder herbiciden o Gebruikte herbiciden hadden 25% minder impact op milieu

- Niet de perfecte oplossing voor duurzame en milieuvriendelijke landbouw o Blijven afhankelijk van herbiciden o Eenzijdig gebruik van herbiciden resistentie

Insectresistente gewassen - Mas, katoen, koolzaad - Bt toxines (Bacillus thuringiensis) in plant via genetische modificatie - - Australi, Argentini: 80% Bt-katoen - China, India, Zuid-Afrika, Mexico: 50% Bt-katoen

Genetische modificatie v/d aardappel Aardappelziekte

- meest bedreigend in regios gematigd klimaat - Verlies ~ 55 miljoen euro - Conventioneel resistente rassen: Bionica, Toluca, Sarpo Mira (beperkt gebruik biologische teelt) - Veroorzaakt door schimmelachtig organisme: Omyceet Phytophtora infestans - Plant en knol aangetast

Phytophthora resistente aardappel - Vooral consumptieaardappel - Bintje (40-50%): zeer vatbaar aardappelziekte - 10 tot 15 x spuiten/jaar nodig - Bestrijding moeilijker - Aggresievere isolaten Phytophthora infestans - Grotere diversiteit door recombinatie mating types

Conventionele resistentieveredeling Rassen Bionica en Toluca

- Eerste kruising 1959 2005 bruikbare rassen - Enkelvoudig resistentiegen: Rpi-bib-2 uit Solanum bulbocastanum - Ingewikkeld kruisingsschema

Sarpo mira:

- > 40 jaar - grote genenpool zoveel mogelijk kruisingen - Planten in vroeg stadium besmetten met mix P. infestans - 95% afgestorven overige behandelen en laten uitgroeien knollen verder kruisen

Het introduceren v resistentie tegen Phytophthora infestans m.b.v. GGOs - Stap 1: identificatie resistentiegenen

o DNA resistente planten vgl met niet resistente planten o Gebieden in DNA opsporen waarop resistentie gelegen is o Genoom aardappel gekend zoektocht resistentiegenen vergemakkelijkt o 20 tal genen gekend o Cisgenen (gesoleerde genen afkomstig uit kruisbare soorten)

- Stap 2: modificeren van aardappellijnen o Gen in plasmide A. tumefaciens o Resistentiegenen in DNA plant

Resistentiegen koppelen aan ander gen Geen selectiemarker aan het over te dragen DNA toegevoegd

o Transgenen (planten waarin via genetische modificatie soortvreemde genen zijn binnengebracht)

o Nieuw plantje uit weefsel o Selectie juiste plantjes

Antibiotica/herbicide tolerantie Geen selectiemerker: controle DNA via PCR (meer tijdrovend en hogere kost)

- Stap 3: testen planten in serre o Plantenkweekkamer serre o Zijn gewenste eigenschappen aanwezig ? Controle ras-eigenschappen o Duurzame resistentie = rassen met meervoudige resistentiegenen in ruimte en tijd

afwisselen - Raseigenschappen kunnen verloren gaan als gevolg v 3 fenomenen:

o Insertiemutagenese: fout als gevolg v extra stuk DNA midden in een bestaand gen verstoort werking v dat gen

o Pleiotropie: onverwachts en ongewenste effecten kunnen optreden a.g.v./h feit dat het extra stuk DNA op een niet bekende plaats in het DNA v/d plant landt

o Somaklonale variatie: ontstaan v fenotypische (waarneembare) afwijkingen t.o.v./d aardappel waarv hij is afgeleid. A.g.v./h door in vitro brengen en opnieuw regenerenen v/d aardappel. Kan bij elke in vitro techniek voorkomen

Fortuna-aardappel v BASF

- 2 resistentiegenen: Rpi-blb-1 en Rpi-blb-2 - Selectiemerker: gemuteerde AHAS-gen (tolerantie tegen sulfonyl-ureum gebaseerd herbicide) - Goede verwerking tot friet

Cisgenese project DuRPh - Nederland start 2006 (10 jarig project) - Doelstelling

o Resistentiegenen identificeren en karakteriseren o Ggo aardappellijnen maken en testen o Communiceren met breed doelpubliek o Duurzaamheidsbenadering !

- cisgenese o Resistentiegenen zijn enkel afkomstig uit Solanaceae o Resistentiegenen worden niet aangepast, natuurlijke regulatiesignalen o In finale lijnen geen selectiemerkers o Kan in principe ook natuurlijk

Amflora aardappel

- Zetmeel onder 2 vormen o 20% Amylose: onvertakte vorm o 80% Amylopectine: vertakte vorm (industrieel nuttig)

- Amylose verwijderen o Arbeidsintensief o Milieubelastend o Chemisch o Ggo alternatief ?

Amflora-aardappel

- BASF ggo - Biosynthese zetmeel benvloeden - Extra gbss-gen inbrengen - Extra kopie zorgt voor onderdrukking van expressie natuurlijk gbss-gen - Co-suppressie - Mechanisme tegen indringers

Natuurlijke situatie:

- Tetraploid: 4 gbss genen

- Extra kopie gbss gen zet mechanisme in gang dat RNA kopien afbreekt - Extra gbss-gen in genoom in vorm kop-staart dubbelkopie

- 2x overgedragen (2 extra gbss-genen)

Amflora-aardappel bevat het npt-II antibioticum

- Selectiemerker: npt-II antibioticaresistentiegen - Kanamycine en neomycine resistentie - risico!?

o Highly important antimicrobials for human use o Overdracht transgene plant bacterie niet aangetoond o Npt-II gen verschillend van npt-II bacterin o Reeds aanwezig in natuur

2e genetisch gewijzigde zetmeelaardappel - Modena (geen npt-II gen)

o ABEVE (Ndl) o Marktaanvraag eind 2009 begonnen

- Eliana: traditionele amylose-vrije aardappel o Via mutagenese (straling): puntmutaties gbss-gen o Valt niet onder ggo-wetgeving

- Fraunhover IME o TILLING: combinatie chemische mutatie en gerichte genetische screening naar

puntmutatie o Amylose-vrije aardappel o testfase

Aandeel transgene gewassen

Transgene gewassen in de toekomst - Genoom planten ontrafelen - Functie genen ontrafelen in relatie tot andere genen - Inzicht in hoe verschillende genen, eiwitten en biologische processen elkaar benvloeden - Complexe eigenschappen zoals voedingskwaliteit ontrafelen

Planten zelf opgewassen tegen ziekten Nematoderesistentie bij aardappelen en rijst Minder stressgevoelig Genen identificeren met sleutelrol in stresstolerantie Meer biomassa

- meer opbrengst - Kennis ontwikkeling bladeren en wortels - Identificatie 100den genen die rol spelen in ontwikkeling zijwortels - Gewassen die beter verankeren in bodem, beter water en mineralen opnemen

Verfijning v/d technologie 1. Eigenschappen zelfde soort overbrengen

o Eigenschappen van soortgenoten gebruiken, o Aardappel ontwikkeld resistent aan bepaalde schimmel: genen uit wilde variant aardappel

2. Bestaande eigenschappen bijsturen o Eigenschappen uitschakelen of versterken o Stoffen die allergie opwekken elimineren o Ontwikkelen rijst en mas met hogere opbrengst

3. Nieuwe technieken o RNAinterferentie: RNAi o Kleine stukjes DNA inbouwen RNA past op uit te schakelen gen o Koffieplanten zonder caffene o Ajuin zonder traanverwekkende stof

Veiligheid v GGOs Verschillen en gelijkenissen met de klassieke veredeling Verschillen:

- Mengeling gewenste en ongewenste eigenschappen bij conventionele kruising - Enkel gebruik van eigenschappen uit verwante planten

Gelijkenissen:

- Planten met nieuwe eigenschappen - DNA plant verstoren

De weg van labo naar markt GGOs in voeding Etikettering verplicht Gevaar toxische stoffen?

- Ook natuurlijke voeding kan gifstoffen bevatten - Strenge testen

Testen:

- Gedetailleerde moleculaire beschrijving - Toxicologische testen op korte en lange termijn - Analyse mogelijke allergeniciteit - Vergelijking samenstelling klassiek vs. ggo - Analyse gedrag plant in veld

Toxicologische tests

- Met gekende giftige stoffen - Proefdieren

Toekomstige wijzigingen Gevaar voor allergie?

- Alle nieuwe voedingsproducten kunnen nieuwe allergien doen ontstaan - Allergeen kan in plant terecht komen via DNA - Vb. interessant eiwit uit paranoot in soja bleek paranoot allergeen te zijn - Onmiddellijke stopzetting - Maar ggo biedt ook de mogelijkheid allergenen en gifstoffen te verwijderen - Transgene soja zonder allergeen dat 50% van alle allergien veroorzaakt - Verplichte testen allergeniciteit binnen Europa

Is genen eten gevaarlijk ? - Alle voedsel bevat DNA (verteerbaar) - Lichaamscellen nemen geen intacte genen op

Veilig in de winkel

- Etiket genetisch gewijzigd - Sporen kunnen steeds voorkomen (< 0,9%) - Detectiemethoden zijn gevoelig - Vrijheid consument om te kiezen in EU !!!

GGO ketenbeheer

- Verplichte traceerbaarheid - Mogelijkheid in te grijpen mochten er toch problemen opduiken - Middel om etikettering te controleren (ggo afgeleide producten kunnen niet altijd onderscheiden

worden van de conventionele) GGOs in de natuur

- Natuur door menselijke activiteiten zwaar onder druk - Biodiversiteit zwaar onder druk

Effect transgene planten op andere organismen Kan zowel positief als negatief zijn Verspreiding via zaden

- Veel gewassen zodanig veredeld dat ze niet meer in de natuur overleven (mas) - Grassen en koolzaad wel makkelijk te verspreiden

Verspreiding via stuifmeel

- Genetische eigenschappen uitwisselen met planten uit vrije natuur via stuifmeel - In omgeving verwante soorten nodig! - Specialisten nodig om dit risico in kaart te brengen - Voldoende afstand met andere telers nodig ! - Beoordeling milieuveiligheid

Milieuveiligheid!

Genetisch materiaalStructuur van DNAReplicatie van DNAEiwitsyntheseDNA-transcriptieTranslatieRibosomenmRNAtRNAVerschillende stappen eiwitsynthese (translatie)

Expressie van genenKorte definities

VirussenGeschiedenisStructuur en samenstellingBouw

Dissociatie en associatieVirusinfectie

Genetisch materiaal bij prokaryotenDNA bij eukaryotenAlgemeenDNA en histonen

Enzymen en nuclenezurenToposomerasenLigasenModificerende enzymenNucleasenPolymerasenWerking antibiotica

Veranderingen in het genetisch materiaalVeranderingen in de genenVeranderingen in de chromosomenStructurele veranderingenVeranderingen in aantal

Erfelijke aandoeningen

Biotechnologische techniekenPCR (polymerase chain reaction)Amplificeren van RNAAanvullende techniekenAndere veel gebruikte PCR techniekenToepassingen PCR

DNA-sequentie analyseGenetisch profiel, DNA-polymorfismeRIFLIPS, RFLP fingerprintingRAPD (random amplified polymorphic DNA)AFLP (ampiflied fragment lenght polymorfism)Microsatellieten

Recombinant DNA-technologieHybridisatieAntisense technologie

Genetische modificatie v plantenGenetische modificatie v dierenNormale ontwikkeling v dierenKlonen bij dierenHomozygote, diplode of eenouderlijke dierenAndrogeneseGynogeneseOverplanting v/d kern (klonen)

Therapeutisch klonen bij de mensTransgene dierenToepassingen v/d biotechnologie in de dierlijke productieHybridoma-technologie en monoclonale antilichamenKruisresistentieQuantitative trait loci (QTL)

Biotechnologie en toepassingen in planten: stand v zakenHerbicidetolerante gewassenInsectresistente gewassenGenetische modificatie v/d aardappelPhytophthora resistente aardappelAmflora aardappel

Aandeel transgene gewassenTransgene gewassen in de toekomstPlanten zelf opgewassen tegen ziektenMinder stressgevoeligMeer biomassaVerfijning v/d technologie

Veiligheid v GGOsVerschillen en gelijkenissen met de klassieke veredelingDe weg van labo naar marktGGOs in voedingGGOs in de natuur