BIOTECHVEG, LABORATORIOS DE ANÁLISIS … · hueco para la determinación de Ca y Mg en muestras de agua. ..... 18 Tabla 10. Longitud de onda emitida por la Lámpara de Cátodo

MÁSTER EN GESTIÓN SOSTENIBLE Y TECNOLOGÍA

DEL AGUA

BIOTECHVEG,

LABORATORIOS DE ANÁLISIS

AGROALIMENTARIOS Nombre: Alejandra Abellán Llobregat Tutor: Nuria Boluda

INDICE Pag.

1. Introducción. ............................................................................................................ 1

1.1. Laboratorios de análisis agroalimentario: BIOTECHVEG. .................................. 1

1.2. Fundamento del trabajo. ................................................................................... 1

1.3. Legislación vigente sobre aguas......................................................................... 1

2. Laboratorio de Aguas Físico-Químicos. ................................................................... 3

2.1. Introducción. ...................................................................................................... 3

2.2. Ensayos realizados. ............................................................................................ 3

2.2.1. Preparación de la muestra. ........................................................................ 3

2.2.2. Ensayos realizados con el Titrador. ............................................................ 3

2.2.2.1. pH, conductividad y bicarbonatos. ...................................................... 3

2.2.2.2. Cloruros. .............................................................................................. 5

2.2.3. Ensayos realizados con fotómetro. ............................................................ 7

2.2.3.1. Cloro libre y cloro total. ....................................................................... 7

2.2.4. Ensayos realizados con Espectrofotómetro de absorción

ultravioleta-visible. ................................................................................................... 8

2.2.4.1. Boro. .................................................................................................... 8

2.2.4.2. Nitratos. ............................................................................................... 9

2.2.4.3. Fosfatos. ............................................................................................ 11

2.2.4.4. Sulfatos. ............................................................................................. 13

2.2.4.5. Amonio. ............................................................................................. 14

2.2.5. Ensayos realizados con Espectrofotómetro de absorción atómica en llama (FAAS). ...................................................................... 15

2.2.5.1. Determinación de Fe, Mn, Zn, Cu, K.................................................. 15

2.2.5.2. Determinación de Ca y Mg. ............................................................... 17

2.2.5.3. Determinación de Na. ....................................................................... 18

2.2.6. Valores obtenidos mediante cálculos. ..................................................... 20

2.2.6.1. Índice de Langeliere (LSI). ................................................................. 20

2.2.6.2. Indice S.A.R. (Relación de Absorción de sodio). ................................ 20

2.2.6.3. Norma Riverside (C) y (S)................................................................... 21

2.2.6.4. Norma Green. .................................................................................... 23

2.2.6.5. Norma Wilcox. ................................................................................... 23

3. Laboratorio de Microbiología. ............................................................................... 25

3.1. Introducción. .................................................................................................... 25

3.2. Condiciones de trabajo. ................................................................................... 25

3.3. Preparación de medios. ................................................................................... 26

3.4. Análisis de muestras de agua. .......................................................................... 26

3.4.1. Introducción. ............................................................................................ 26

3.4.2. Análisis de muestras de agua que se pueden filtrar. ............................... 27

3.4.2.1. Material. ............................................................................................ 27

3.4.2.2. Reactivos. .......................................................................................... 27

3.4.2.3. Preparación de la muestra. ............................................................... 27

3.4.2.4. Determinación de aerobios. .............................................................. 29

3.4.2.5. Determinación de Eschericia Colli. .................................................... 29

3.4.2.6. Determinación de Salmonella. .......................................................... 29

3.4.2.7. Determinación de Listeria. ................................................................ 30

3.4.3. Muestras de agua que no se pueden filtrar. ............................................ 30

3.4.3.1. Material. ............................................................................................ 30

3.4.3.2. Reactivos. .......................................................................................... 31

3.4.3.3. Preparación de la muestra. ............................................................... 31

3.4.3.4. Determinación de aerobios. .............................................................. 31

3.4.3.5. Determinación de coliformes. ........................................................... 32

3.4.3.6. Determinación de Eschericia Colli. .................................................... 32

3.4.3.7. Determinación de Salmonella. .......................................................... 32

3.4.3.8. Determinación de Listeria. ................................................................ 33

3.5. Análisis de muestra de alimentos. ................................................................... 33

3.5.1. Introducción. ............................................................................................ 33

3.5.2. Material. ................................................................................................... 33

3.5.3. Reactivos. .................................................................................................. 33

3.5.4. Preparación de la muestra. ...................................................................... 34

3.5.5. Determinación de aerobios. ..................................................................... 34

3.5.5.1. Aerobios Mesófilos. ........................................................................... 34

3.5.5.2. Eschericia Colli. .................................................................................. 35

3.5.6. Determinación de Salmonella. ................................................................. 35

3.5.7. Determinación de Listeria. ....................................................................... 36

3.5.8. Determinación de coliformes totales. ...................................................... 36

3.5.9. Determinación de Mohos y Levaduras. .................................................... 37

4. Laboratorio de Orgánica. ....................................................................................... 37

4.1. Introducción. .................................................................................................... 37

4.2. Multirresiduos. ................................................................................................. 37

4.2.1. Fundamento. ............................................................................................ 37

4.2.2. Alcance...................................................................................................... 38

4.2.3. Material. ................................................................................................... 38

4.2.4. Reactivos. .................................................................................................. 38

4.2.5. Procedimiento experimental. ................................................................... 39

4.3. Multiliquídos. ................................................................................................... 41

4.3.1. Fundamento. ............................................................................................ 41

4.3.2. Alcance...................................................................................................... 42

4.3.3. Material. ................................................................................................... 42

4.3.4. Reactivos. .................................................................................................. 42

4.3.5. Procedimiento experimental. ................................................................... 43

5. Laboratorio de Agrícola. ........................................................................................ 45

5.1. Introducción. .................................................................................................... 45

5.2. Análisis de suelos. ............................................................................................ 45


5.2.2. pH. ............................................................................................................. 45

5.2.3. Conductividad. .......................................................................................... 47

5.2.4. Nitrógeno Kjeldhal. ................................................................................... 48

5.2.4.1. Fundamento. ..................................................................................... 48

5.2.4.2. Material. ............................................................................................ 49

5.2.4.3. Reactivos. .......................................................................................... 49

5.2.4.4. Procedimiento experimental. ........................................................... 50

5.2.5. Carbonatos. .............................................................................................. 51

5.2.5.1. Fundamento. ..................................................................................... 51

5.2.5.2. Material. ............................................................................................ 51

5.2.5.3. Reactivos. .......................................................................................... 51


5.2.6. Caliza activa. ............................................................................................. 53

5.2.6.1. Fundamento. ..................................................................................... 53

5.2.6.2. Material. ............................................................................................ 53

5.2.6.3. Reactivos. .......................................................................................... 53


5.2.7. Materia orgánica. ..................................................................................... 54

5.2.7.1. Fundamento. ..................................................................................... 54

5.2.7.2. Material. ............................................................................................ 55

5.2.7.3. Reactivos. .......................................................................................... 55


5.2.8. Boro. ......................................................................................................... 56

5.2.8.1. Fundamento. ..................................................................................... 56

5.2.8.2. Material. ............................................................................................ 57

5.2.8.3. Reactivos. .......................................................................................... 57


5.2.9. Fósforo Olsen. ........................................................................................... 57

5.2.9.1. Fundamento. ..................................................................................... 57

5.2.9.2. Material. ............................................................................................ 58

5.2.9.3. Reactivos. .......................................................................................... 58


5.2.10. Micronutrientes (Fe, Mn, Cu, Zn). ........................................................ 59

5.2.10.1. Fundamento. ..................................................................................... 59

5.2.10.2. Material. ............................................................................................ 59

5.2.10.3. Reactivos. .......................................................................................... 59


5.2.11. Macronutrientes (Na, K, Ca, Mg). ......................................................... 60

5.2.11.1. Fundamento. ..................................................................................... 60

5.2.11.2. Material. ............................................................................................ 60

5.2.11.3. Reactivos. .......................................................................................... 60


5.3. Análisis de foliares. .......................................................................................... 61


5.3.2. Nitrógeno Kjeldhal. ................................................................................... 61

5.3.2.1. Fundamento. ..................................................................................... 61

5.3.2.2. Material. ............................................................................................ 61

5.3.2.3. Reactivos. .......................................................................................... 61


5.3.3. Otros ensayos: Mineralización de la muestra. ......................................... 62

5.3.3.1. Fundamento. ..................................................................................... 62

5.3.3.2. Material. ............................................................................................ 62

5.3.3.3. Reactivos. .......................................................................................... 62


6. Caso práctico. ......................................................................................................... 63

6.1. Procedimiento experimental. .......................................................................... 63

6.2. Análisis de la exactitud de los métodos de análisis. ........................................ 64

7. Valoración personal. .............................................................................................. 66

8. Bibliografía. ............................................................................................................ 67

ANEXO I .......................................................................................................................... 68

ANEXO II ......................................................................................................................... 70

INDICE DE TABLAS Pag.

Tabla 1. Valores indicativos de calidad de agua para riego. ............................................ 2

Tabla 2. Valores indicativos de elementos químicos en agua de riego. .......................... 2

Tabla 3. Modo de preparación del blanco, patrón y muestra para la determinación de boro en muestras de aguas. ............................................................ 9

Tabla 4. Modo de preparación del blanco, patrón y muestra para la preparación de nitratos en muestras de agua. .......................................................... 10

Tabla 5. Modo de preparación del blanco, patrón y muestra para

determinación de fosfatos en muestras de agua............................................................. 12

Tabla 6. Modo de preparación del blanco, patrón y muestra para la determinación de sulfatos en muestras de agua (dilución 1:15). .................................. 14

Tabla 7. Modo de preparación del blanco, patrón y muestra para muestras de agua (dilución 1:5). .................................................................................... 15

Tabla 8. Longitudes de onda emitidas por las Lámparas de Cátodo hueco para la determinación de Mn, Fe, Zn, Cu y K, en muestras de agua. .................. 17

Tabla 9. Longitudes de onda emitidas por las Lámparas de Cátodo hueco para la determinación de Ca y Mg en muestras de agua. ................................... 18

Tabla 10. Longitud de onda emitida por la Lámpara de Cátodo hueco para la determinación de Na en muestras de agua. ........................................... 19

Tabla 11. pH óptimo para el crecimiento de los cultivos según la textura del suelo .... 47

Tabla 12. Clasificación de la salinidad del suelo en función de la conductividad eléctrica (CE). .......................................................................................... 48

Tabla 13. Nivel de carbonatos en suelos. ....................................................................... 52

Tabla 14. Nivel de caliza activa en suelos. ..................................................................... 54

Tabla 15. Nivel deseable de materia orgánica en suelo. ............................................... 56

Tabla 17. Interpretación de los resultados de acuerdo al contenido en fósforo. ......... 59

Tabla 18. Comparación de resultados obtenidos para una muestra de agua mineral “Manantial Fuente del Arca” con los valores teóricos. ............................ 65

Tabla 19. Aplicación del test estadístico “t de Student”. ............................................... 66

Tabla 20. Alcance del método multirresiduos empleado en Biotechveg. ..................... 68

Tabla 21. Alcance del método multilíquidos empleado en Biotechveg. ........................ 69

Tabla 22. Valores tabulados de la t de Student según el intervalo de confianza. ......... 70

INDICE DE FOTOGRAFÍAS Pag.

Fotografía 1. Filtración de varias muestras de agua de sustrato. .................................... 3

Fotografía 2. Titrador. ...................................................................................................... 5

Fotografía 3. Sensor de temperatura, pH-metro y conductímetro dispuestos en el auto-sampler. ............................................................................................................................ 5

Fotografía 4. Blanco, patrón y diversas muestras preparadas para la determinación de boro. ................................................................................................................................. 9

Fotografía 5. Espectrofotómetro de absorción UV-VIS llevando a cabo la determinación de la concentración de nitratos en diversas muestras de agua. .................................... 11

Fotografía 6. Diversas muestras de agua en el momento previo a la medida de fosfatos mediante espectrofotometría de absorción UV-VIS. ..................................................... 12

Fotografía 7. Equipo de absorción atómica en llama. ................................................... 16

Fotografía 8. Medida de la concentración de Mn, Fe, Zn, Cu, K mediante FAAS. ......... 17

Fotografía 9. Orden de trabajo para una muestra de agua a la salida de una desaladora. ..................................................................................................................... 24

Fotografía 10. Autoclave. ............................................................................................... 25

Fotografía 11. Campana extractora dotada de radiación ultravioleta. ......................... 26

Fotografía 12. Montaje para la filtración en rampa....................................................... 28

Fotografía 13. Recipiente conteniendo una muestra de agua. ..................................... 28

Fotografía 14. Aspecto de un filtro tras una filtración en rampa. ................................. 29

Fotografía 15. Presencia de E.Colli en una muestra de agua......................................... 29

Fotografía 16. Medios de cultivo MK y RVS para la determinación de Salmonella. ...... 30

Fotografía 17. Placa con colonias de aerobios. .............................................................. 32

Fotografía 18. Muestra de coco de producción; dilución madre. ................................. 34

Fotografía 19. (a) Placa XLD negativa en Salmonella. (b) Placa BGA negativa en Salmonella. .................................................................................................. 35

Fotografía 20. (a) Placa XLD positiva en Salmonella. (b) Placa BGA positiva en Salmonella. ................................................................................................... 35

Fotografía 21. (a) Placa ALOA negativa en Listeria. (b) Placa ALOA positiva en Listeria. ......................................................................................................... 36

Fotografía 22. (a) Placa con coliformes totales. ............................................................ 36

Fotografía 23. Placa con mohos. .................................................................................... 37

Fotografía 24. Triturador de muestras. .......................................................................... 39

Fotografía 25. Rotavapor. .............................................................................................. 40

Fotografía 26. Equipo GC-MS. ........................................................................................ 41

Fotografía 27. Equipo GC-ECD y GC-NPD. ...................................................................... 41

Fotografía 28. Equipo HPLC-QQQ. ................................................................................. 45

Fotografía 29. Agitador de muestras. ............................................................................ 46

Fotografía 30. Digestor Buchi. ........................................................................................ 50

Fotografía 31. Destilador Kjeldahl. ................................................................................. 50

Fotografía 32. Etiqueta del envase de la muestra de agua mineral analizada. ............. 65

INDICE DE FIGURAS

Pag.

Figura 1. Clasificación de un agua de riego de acuerdo la Norma Riverside. ................ 22

Figura 2. Clasificación de un agua de riego en función del contenido en sales y el % de sodio (Norma Green). ........................................................................ 23

Figura 3. Clasificación de un agua de riego en función de la conductividad el % de sodio (Norma Wilcox). ....................................................................................... 23

Figura 4. Calcímetro de Bernard. ................................................................................... 52

Figura 5. Esquema del procedimiento experimental para análisis de muestras de agua. ..................................................................................................... 64

1

BIOTECHVEG, LABORATORIOS DE ANÁLISIS AGROALIMENTARIO

1. Introducción.

1.1. Laboratorios de análisis agroalimentario: BIOTECHVEG.

BIOTECHVEG S.A. es una empresa española que desde 1998 ofrece al sector agroalimentario servicios analíticos, asesoramiento técnico e investigación y desarrollo. Estas necesidades requieren un profundo conocimiento de los productos, de sus características y potencialidades, que sólo se obtiene mediante las técnicas científicas y tecnológicas más avanzadas y complejas. Todas las empresas e instituciones del sector necesitan cada día infinidad de datos e información técnica sobre sus productos agroalimentarios, de los que se requieren controles analíticos cada vez más exhaustivos. Laboratorios BIOTECHVEG están al frente de la innovación analítica y biotecnológica, empleando los medios más eficaces para cumplir este cometido. La empresa consta de cuatro departamentos (laboratorio de Aguas Físico-Químico, laboratorio de Microbiología, laboratorio de Orgánica, y laboratorio de Agrícola) cada uno de ellos dedicados a unos determinados tipos de ensayos y muestras.

1.2. Fundamento del trabajo.

Este trabajo consta, en primer lugar, de una presentación de los parámetros permitidos por la legislación para aguas de riego. Se ha escogido este tipo de muestra, debido a que la gran mayoría de muestras recibidas en el laboratorio de Aguas Físico-Químico son aguas destinadas al riego. A continuación, se presentan los ensayos realizados en cada uno de los laboratorios de Biotechveg y finalmente, se presenta una comparación de los resultados obtenidos experimentalmente para una muestra de agua natural, con los indicados por el fabricante.

1.3. Legislación vigente sobre aguas.

Existe mucha legislación en lo referente tanto a gestión como planificación y

usos del agua. Como norma más importante a nivel europeo se sitúa la Directiva MARCO del Agua, Directiva 2000/60/CE y su transposición a la legislación estatal a través de la Ley de Aguas. Estas leyes imponen requisitos de vertidos de aguas de origen agrario con el fin de preservar la calidad del medio receptor, ya sea un acuífero, una masa de agua superficial o el propio suelo de la zona. Sin embargo, los parámetros de control para el agua de riego son recomendaciones de la OMS (Organización Mundial de la Salud) y la FAO. A continuación se detalla alguno de los parámetros y metales controlados.

2

Tabla 1. Valores indicativos de calidad de agua para riego.

Problemas potenciales en el riego

Grado de restricción en el uso

Unidad Ninguno

Ligero a

moderado Estricto

Salinidad, afecta a

la disponibilidad

de agua para los

cultivos.

CEw < 0,7 0,7-3,0 > 3,0 dS/m

SDT < 450 450-2000 > 2000 mg/l

Permeabilidad,

afecta a la

velocidad de

infiltración

del agua en el

suelo. Se evalúa

utilizando

ECw y RAS juntos.

SAR =

0-3 CEw: ≥ 0,7 0,7-0,2 < 0,2 dS/m

SAR =

3-6 CEw: ≥ 1,2 1,2-0,3 < 0,3 dS/m

SAR =

6-12 CEw: ≥ 1,9 1,9-0,5 < 0,5 dS/m

SAR =

12-20 CEw: ≥ 2,9 2,9-1,9 < 1,9 dS/m

SAR =

20-40 CEw: ≥ 5,0 5,0-2,9 < 2,9 dS/m

Toxicidad de iones

específicos, afecta

a los cultivos

sensibles.

Sodio

(riego superficial) < 3 3-9 > 9 RAS

Cloro

(riego superficial) < 140 140-350 > 350 mg/l

Boro < 0,7 0,7-3 > 0,3 mg/l

Otros efectos,

afectarían a

cultivos sensibles.

Nitrógeno (N

total) < 5 5-30 > 30 mg/l

Bicarbonato

(aspersores

elevados)

< 90 90-500 > 500 mg/l

Cloro residual

(aspersores

elevados)

< 1,0 1,0-5,0 > 5,0 mg/l

pH 4,5 - 9

Tabla 2. Valores indicativos de elementos químicos en agua de riego.

Elemento

Concentración

máxima

recomendada

(mg/l)

Elemento

Concentración

máxima

recomendada

(mg/l)

Al 5,0 Mn 0,20

As 0,10 Mo 0,01

Be 0,10 Ni 0,20

Cd 0,01 Pb 5,0

Co 0,05 Se 0,02

Cr 0,10 Sn -

Cu 0,20 Ti -

F 1,0 V 0,10

Fe 5,0 Zn 2,0

http://www.miliarium.com/Paginas/Prontu/Tablas/Aguas/CalidadAguaRiego.htm#CEw

http://www.miliarium.com/Paginas/Prontu/Tablas/Aguas/CalidadAguaRiego.htm#SDT

http://www.miliarium.com/Paginas/Prontu/Tablas/Aguas/CalidadAguaRiego.htm#RAS

3

2. Laboratorio de Aguas Físico-Químicos.

2.1. Introducción.

Las técnicas empleadas en esta sección de Biotechveg son la espectrofotometría de absorción atómica y la espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible. Se reciben semanalmente muestras de aguas de embalses (riego), goteros y sustratos, desaladoras y descalcificadoras (entrada y salida), y ocasionalmente, muestras de agua de piscina.

2.2. Ensayos realizados.

2.2.1. Preparación de la muestra.

En primer lugar, cuando se recibe y recepciona una muestra de agua, y si no va a ser analizada en el momento, se conserva a 2 ºC. Si la muestra contiene sólidos en suspensión, es necesaria una filtración previa a cualquier análisis que se haya de realizar.

Fotografía 1. Filtración de varias muestras de agua de sustrato.

2.2.2. Ensayos realizados con el Titrador.

2.2.2.1. pH, conductividad y bicarbonatos.

a) Fundamento.

La determinación de pH y conductividad de una muestra de agua se basa en el uso de un pH-metro y conductímetro (método electrométrico con electrodo de vidrio), respectivamente.

4

La determinación de bicarbonatos en muestras de agua se basa en la valoración de la muestra con una disolución de HCl, y posterior cálculo de la concentración de carbonatos y bicarbonatos a partir del volumen de valorante gastado. Se trata de una valoración ácido-base, que puede escribirse como sigue:

3

2

3 HCOHCO

323 COHHHCO

A partir del volumen de HCl gastado en la valoración y conocida la concentración de dicha disolución, se calcula fácilmente la concentración de carbonatos y bicarbonatos en la muestra de agua.

b) Material. Material de laboratorio.

- Vasos de plástico. - Probeta (V = 25 ml).

Equipo.

- Titrador.

c) Reactivos. - HCl (0,05 M). - Soluciones patrón de pH 4 y 7. - Soluciones patrón de conductividad. - Agua destilada.

d) Procedimiento experimental. La medida se lleva a cabo mediante un dispositivo denominado Titrador. Se trata de un sistema con auto-sampler que permite la medida de hasta 12 muestras por serie. El equipo se muestra en la fotografía 2.

5

Fotografía 2. Titrador.

Para determinar el pH y la conductividad se llena un vaso de plástico con unos 20 ml de muestra. Para llevar a cabo la medida se introduce el pH-metro, el conductímetro y el sensor de temperatura, en los orificios dispuestos para ello, tal y como se muestra en la fotografía 3.

Fotografía 3. Sensor de temperatura, pH-metro y conductímetro dispuestos en el auto-sampler.

La determinación de bicarbonatos y carbonatos la realiza el equipo mediante una valoración con ácido clorhídrico (HCl 0,05 M) y tras la medida indica el valor de la concentración de carbonatos y de bicarbonatos expresada en ppm.

2.2.2.2. Cloruros.

a) Fundamento.

La determinación de cloruros en muestras de agua se basa en la valoración de la muestra con una disolución de AgNO3, y posterior cálculo de la concentración de cloruros a partir del volumen de valorante gastado. Se trata de una valoración redox, que puede escribirse como sigue:

6

CÁTODO: AgeAg 222

ÁNODO: eClCl 22 2

2222 ClAgClAg

La reacción global se puede escribir como sigue:

323 2222 NaNOClAgNaClAgNO

A partir del volumen de AgNO3 gastado en la valoración y conocida la concentración de dicha disolución, se calcula fácilmente la concentración de cloruros en la muestra de agua.

b) Material.

Material de laboratorio.

- Vasos de plástico. - Pipeta automática (V = 25 ml).

Equipo.

- Titrador.

c) Reactivos. - Nitrato de plata (AgNO3 0,1 M). - Agua destilada. - Polivinil alcohol (para limpiar el electrodo entre muestra y muestra). d) Procedimiento experimental.

Se disponen 20 ml de la muestra de agua en un vaso de plástico y se llevan al Titrador, donde el equipo llevará a cabo de manera automatizada, la valoración de la muestra con AgNO3. Para ello, se introduce la sonda de medida en la muestra y se ejecuta el programa correspondiente a la medida de cloruros. El programa informático incorporado, expresa el resultado en ppm de cloruros.

7

2.2.3. Ensayos realizados con fotómetro.

2.2.3.1. Cloro libre y cloro total.

a) Fundamento.

El cloro libre reacciona en solución débilmente ácida con dipropil-p-fenilendiamina (DPD) dando un complejo color violeta rojizo, que se determina fotométricamente. El cloro combinado también puede determinarse en esta reacción en presencia de yoduro potásico (KI).

b) Material. Material de laboratorio.

- Vasos de plástico. - Pipeta (V = 5 ml).

Equipos.

- Fotómetro. - Agitador Vortex.

c) Reactivos.

- Kit comercial para la determinación de cloro libre y cloro total. - Agua destilada.

d) Procedimiento experimental. En primer lugar, la preparación de la muestra debe ser inmediatamente después de la toma de muestras. Para la determinación de cloro libre, se pipetean 5 ml de la muestra en una cubeta redonda, donde se adiciona una microcucharada azul rasa (con la tapa del frasco) del reactivo Cl2-1. Se agita vigorosamente la cubeta hasta que el reactivo se haya disuelto. Se deja en reposo durante 1 minuto y finalmente se mide la absorbancia en un fotómetro.

rojizovioletaComplejoDPDCl 2

8

Para la determinación de cloro total, se pipetean 5 ml de la muestra en una cubeta redonda, donde se adiciona una microcucharada azul rasa (con la tapa del frasco) del reactivo Cl2-1. Se agita vigorosamente la cubeta hasta que el reactivo se haya disuelto. Se añaden dos gotas del reactivo Cl2-2 a la preparación y se agita de nuevo en el Vortex para que quede bien mezclado. Se deja en reposo durante 1 minuto y finalmente se mide la absorbancia en un fotómetro.

2.2.4. Ensayos realizados con Espectrofotómetro de absorción ultravioleta-visible.

2.2.4.1. Boro.

a) Fundamento.

El método se basa en la reacción del boro con azometina-H, formándose un complejo de color amarillo, medible a 410 nm mediante espectrofotometría ultravioleta-visible. La azometina-H es un azocompuesto que tiene la ventaja de ser soluble en agua y tener una alta sensibilidad. Los elementos Cu, Fe, y Al interfieren en la reacción, evitándose mediante la adición de EDTA a la disolución tampón empleada.

b) Material necesario. Material de laboratorio:

- Pipeta automática (1-5 ml). - Tubos de plástico de 10 ml.

Equipos:

- Espectrofotómetro ultravioleta-visible. c) Reactivos.

- Agua ultrapura. - Disolución de tampón enmascarante. - Disolución de azometina. - Disolución de patrón de boro (H3BO3 1000 ppm). d) Realización del ensayo.

Para que el equipo pueda llevar a cabo la medida es necesaria la preparación de un blanco y un patrón. Para la preparación de la disolución patrón, se parte de una disolución de 1000 ppm de ácido bórico (H3BO3) La preparación del blanco, del patrón y las muestras se lleva a cabo como se indica a continuación.

9

Tabla 3. Modo de preparación del blanco, patrón y muestra para la determinación de boro en muestras de aguas.

Disolución Vt.e.

(ml)

Vazometina

(ml)

Va.u

(ml)

Vpatrón

(ml)

Vmuestra

(ml)

Blanco 4 2 5 0 0

Patrón 4 2 4,8 0,2 0

Muestra (sin color) 4 2 0 0 5

Muestra (con color) 4 2 4 0 1

t.e.: Tampón enmascarante. a.u.: Agua Ultrapura.

En primer lugar, para la preparación de la muestra, se añade en el tubo de plástico correspondiente, el volumen de muestra de agua necesario; a continuación, y en el caso de que la muestra tenga color, se le añade el agua ultrapura. Finalmente, se añade el volumen de tampón enmascarante y de azometina, y se deja en reposo durante 1,5 horas.

Fotografía 4. Blanco, patrón y diversas muestras preparadas para la determinación de boro.

Transcurrido este tiempo se mide la absorbancia en el espectrofotómetro de ultravioleta-visible a 410 nm.

2.2.4.2. Nitratos.

a) Fundamento.

El método se basa en la medida de la absorbancia de las muestras mediante un espectrofotómetro de absorción ultravioleta-visible, y la determinación de la concentración de nitratos mediante la comparación con una muestra patrón de nitrato de sodio, cuya concentración es conocida.

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b) Material necesario. Material de laboratorio.

- Pipeta automática (1-5 ml). - Pipeta automática (100-1000 μl) - Tubos de plástico de 10 ml.

Equipos.

- Espectrofotómetro ultravioleta-visible.

c) Reactivos.

- Ácido clorhídrico (HCl 1N) - Agua Ultrapura. - Patrón de nitrato de sodio (NaNO3 1000 ppm).

d) Realización del ensayo. Es necesaria la preparación de un blanco y un patrón. Para la preparación de la disolución patrón, se parte de una disolución de 1000 ppm de NaNO3. La preparación del blanco, del patrón y las muestras se lleva a cabo como se indica en las siguientes tablas, dependiendo del tipo de agua del que se trate.

Tabla 4. Modo de preparación del blanco, patrón y muestra para la preparación de nitratos en muestras de agua.

Disolución VHCl

(ml)

Vpatrón

(ml)

Va.u

(ml)

Vmuestra

(ml)

Blanco 0,4 0 20 0

Patrón 0,4 0,4 19,6 0

Muestra (sin dilución) 0,4 0 0 20

Muestra (riego, dil. 1:15) 0,4 0 4 16

Muestra (gotero, drenaje; 1:50) 0,4 0 0,4 19,6

a.u.: Agua Ultrapura. HCl 1M.

Para llevar a cabo el ensayo, se prepara en primer lugar, el blanco, la disolución patrón y la muestra. Finalmente, se añade el volumen de ácido clorhídrico (HCl 1M) necesario y se mide de inmediato mediante un espectrofotómetro de absorción ultravioleta-visible a una longitud de onda de 220 nm.

11

Fotografía 5. Espectrofotómetro de absorción UV-VIS llevando a cabo la determinación de la

concentración de nitratos en diversas muestras de agua.

2.2.4.3. Fosfatos.

a) Fundamento. El método se basa en la reacción de una solución diluida de ortofosfato con el molibdato amónico, para formar el ácido molibdofosfórico. Este, en presencia de vanadio, forma ácido vanadomolibdofosfórico, de color amarillo. La intensidad del color es proporcional a la concentración de fosfato y se mide mediante espectrofotometría ultravioleta-visible.



Equipos.

- Espectrofotómetro ultravioleta-visible. - Agitador Vortex.

c) Reactivos.

- Reactivo Vanidato-Molibdato (Formado por dos soluciones: solución A, con

molibdato amónico en agua destilada, y solución B, que contiene metavanadato de amonio y ácido clorhídrico en agua destilada).

12

- Patrón de dihidrogenofosfato sódico (KH2PO4 1000 ppm) - Agua Ultrapura.

d) Realización del ensayo. Es necesaria la preparación de un blanco y un patrón. Para la preparación de la disolución patrón, se parte de una disolución de 1000 ppm de KH2PO4.La preparación del blanco, del patrón y las muestras se lleva a cabo como se indica en las siguientes tablas, dependiendo del tipo de agua del que se trate.

Tabla 5. Modo de preparación del blanco, patrón y muestra para determinación de fosfatos en muestras

de agua.

Disolución VV-Mb

(ml)

Vpatrón

(ml)

Va.u

(ml)

Vmuestra

(ml)

Blanco 2 0 8 0

Patrón 2 1 7 0

Muestra (riego; 1:2) 2 0 3 5

Muestra (gotero, drenaje; 1:10) 2 0 7 1

a.u.: Agua Ultrapura. V-Mb: Vanidato-Molibdato.

Para llevar a cabo el ensayo, se prepara en primer lugar, el blanco, la disolución patrón y la muestra, con los volúmenes indicados en las tablas. A continuación, se adiciona el volumen de disolución de vanidato-molibdato necesario, se agita mediante un agitador Vortex y se deja en reposo un mínimo de 20 minutos.

Fotografía 6. Diversas muestras de agua en el momento previo a la medida de fosfatos mediante

espectrofotometría de absorción UV-VIS.

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Finalmente se lleva a cabo la medida de la absorbancia mediante un espectrofotómetro de absorción ultravioleta-visible a una longitud de onda de 420 nm.

2.2.4.4. Sulfatos.

a) Fundamento. El método se basa en que el ión sulfato (SO4

2-) precipita en medio ácido al añadir Cloruro de Bario (BaCl2) formando cristales de Sulfato de Bario (BaSO4), y generándose una turbidez en la muestra. La absorbancia de la suspensión se mide en el espectrofotómetro ultravioleta-visible a 420 nm y se determina la concentración de sulfatos por comparación de la lectura con una curva patrón.

b) Material necesario. Material de laboratorio:


Equipos:


c) Reactivos.

- Solución de Dicloruro de Bario (BaCl2). - Patrón de sulfato sódico (Na2SO4 1000 ppm). - Agua Ultrapura.

d) Realización del ensayo. Es necesaria la preparación de un blanco y un patrón. Para la preparación de la disolución patrón, se parte de una disolución Na2SO4. La preparación del blanco, del patrón y las muestras se lleva a cabo como se indica en las siguientes tablas.

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Tabla 6. Modo de preparación del blanco, patrón y muestra para la determinación de sulfatos en muestras de agua (dilución 1:15).

Disolución VBaCl2

(ml)

Vpatrón

(ml)

Va.u

(ml)

Vmuestra

(ml)

Blanco 5 0 10 0

Patrón 5 0,5 9,5 0

Muestra 5 0 9 1

a.u.: Agua Ultrapura. Para llevar a cabo el ensayo, se prepara en primer lugar, el blanco, la disolución patrón y la muestra, con los volúmenes indicados en las tablas. A continuación, se adiciona el volumen de disolución de BaCl2 necesario, se agita mediante un agitador Vortex y se lleva a cabo la medida de la absorbancia mediante un espectrofotómetro de absorción ultravioleta-visible a una longitud de onda de 420 nm.

2.2.4.5. Amonio.

a) Fundamento.

El método se basa en la medida de la absorbancia de las muestras mediante un espectrofotómetro de absorción ultravioleta-visible, y la determinación de la concentración de amonio mediante la comparación con una muestra patrón de amonio cuya concentración es conocida.



Equipos.


c) Reactivos.

- Kit de amonio con diversos reactivos. - Patrón de cloruro amónico (NH4Cl). - Agua Ultrapura.

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d) Realización del ensayo.

Es necesaria la preparación de un blanco y un patrón. Para la preparación de la disolución patrón, se parte de una disolución de 1000 ppm de NH4Cl. La preparación del blanco, del patrón y las muestras se lleva a cabo como se indica en las siguientes tablas.

Tabla 7. Modo de preparación del blanco, patrón y muestra para muestras de agua (dilución 1:5).

Disolución Vpatrón

(ml)

Va.u

(ml)

Vmuestra

(ml)

Blanco 0 5 0

Patrón 1 4 0

Muestra 0 4 1

a.u.: Agua Ultrapura. Para llevar a cabo el ensayo, se prepara en primer lugar, el blanco, la disolución patrón y la muestra, con los volúmenes indicados en las tablas. A continuación, se adicionan los reactivos contenidos en el kit de amonio en el orden y respetando los tiempos indicados por el fabricante. Finalmente se mide la absorbancia mediante un espectrofotómetro de absorción ultravioleta-visible a una longitud de onda de 690 nm.

2.2.5. Ensayos realizados con Espectrofotómetro de absorción atómica en llama (FAAS).

2.2.5.1. Determinación de Fe, Mn, Zn, Cu, K.

a) Fundamento. La determinación de Fe, Mn, Zn, Cu y K se basa en el método de absorción atómica en llama. Es un método instrumental que esta basado en la atomización del analito en matriz líquida y que utiliza comúnmente un nebulizador pre-quemador (o cámara de nebulización) para crear una niebla de la muestra y un quemador con forma de ranura que da una llama con una longitud de trayecto más larga. La niebla atómica es desolvatada y expuesta a una energía a una determinada longitud de onda emitida por una Lámpara de Cátodo hueco construida con el mismo analito a determinar. La siguiente fotografía muestra el equipo FAAS del que disponen en la empresa Biotechveg.

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Fotografía 7. Equipo de absorción atómica en llama.

Para determinar la concentración del analito se mide la intensidad de la luz que llega a un detector, lo que permite determinar, por diferencia, la cantidad de luz que ha absorbido la muestra, y mediante la recta de calibrado, la concentración del analito. b) Material. Material de laboratorio.

- Tubos de ensayo (V = 25 ml). - Pipeta automática (V = 5 ml).

Equipo.

- Agitador magnético. - Espectrofotómetro de absorción atómica en llama (FAAS).

c) Reactivos.

- Disolución patrón mezcla de los elementos que se desean determinar. - Agua destilada.

d) Procedimiento experimental. Para llevar a cabo la determinación de Fe, Mn, Zn, Cu, y K se procede del siguiente modo. En primer lugar, se dispone un volumen aproximado de 20 ml de la muestra de agua en un tubo de ensayo. Se prepara también un blanco y una única disolución patrón, ya que le equipo realiza las diluciones necesarias para la obtención de la curva de calibrado. Una vez se han preparado las muestras, se colocan en el equipo (FAAS), y se lleva a cabo el análisis como se muestra en la siguiente fotografía.

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Fotografía 8. Medida de la concentración de Mn, Fe, Zn, Cu, K mediante FAAS.

Las longitudes de onda que emiten las diferentes lámparas se muestran en la siguiente tabla. Tabla 8. Longitudes de onda emitidas por las Lámparas de Cátodo hueco para la determinación de Mn,

Fe, Zn, Cu y K, en muestras de agua.

Mn Fe Zn Cu K

λ (nm) 279,4 248,3 213,9 404,5 324,8

2.2.5.2. Determinación de Ca y Mg.

a) Fundamento. La determinación de Ca y Mg se basa en el método de absorción atómica en llama. Es un método instrumental que esta basado en la atomización del analito en matriz líquida y que utiliza comúnmente un nebulizador pre-quemador (o cámara de nebulización) para crear una niebla de la muestra y un quemador con forma de ranura que da una llama con una longitud de trayecto más larga. La niebla atómica es desolvatada y expuesta a una energía a una determinada longitud de onda emitida por una Lámpara de Cátodo hueco construida con el mismo analito a determinar. Para determinar la concentración del analito se mide la intensidad de la luz que llega a un detector, lo que permite determinar, por diferencia, la cantidad de luz que ha absorbido la muestra, y mediante la recta de calibrado, la concentración del analito. b) Material. Material de laboratorio.

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Equipos.


c) Reactivos.

- Disolución patrón mezcla de los elementos que se desean determinar. - Modificador de estroncio. - Agua destilada.

d) Procedimiento experimental. Para llevar a cabo la determinación de Ca y Mg se procede del siguiente modo. En primer lugar, la muestra de agua se prepara con dilución 1:10, es decir se dispone un volumen de 2 ml de la muestra de agua en un tubo de ensayo y se le adicionan 18 ml de agua destilada. Se prepara también un blanco y una única disolución patrón, ya que el equipo realiza las diluciones necesarias para la obtención de la curva de calibrado. Una vez se han preparado las muestras, se colocan en el equipo (FAAS), y se lleva a cabo el análisis.

Las longitudes de onda que emiten las diferentes lámparas se muestran en la siguiente tabla. Tabla 9. Longitudes de onda emitidas por las Lámparas de Cátodo hueco para la determinación de Ca y

Mg en muestras de agua.

Mg Ca

λ (nm) 202,6 422,7

2.2.5.3. Determinación de Na.

a) Fundamento. La determinación de Na se basa en el método de absorción atómica en llama. Es un método instrumental que está basado en la atomización del analito en matriz líquida y que utiliza comúnmente un nebulizador pre-quemador (o cámara de nebulización) para crear una niebla de la muestra y un quemador con forma de ranura

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que da una llama con una longitud de trayecto más larga. La niebla atómica es desolvatada y expuesta a una energía a una determinada longitud de onda emitida por una Lámpara de Cátodo hueco construida con el mismo analito a determinar. Para determinar la concentración del analito se mide la intensidad de la luz que llega a un detector, lo que permite determinar, por diferencia, la cantidad de luz que ha absorbido la muestra, y mediante la recta de calibrado, la concentración del analito. b) Material. Material de laboratorio.


Equipos.


c) Reactivos.

- Disolución patrón mezcla de los elementos que se desean determinar. - Modificador de KCl. - Agua destilada.

d) Procedimiento experimental. Para llevar a cabo la determinación de Na se procede del siguiente modo. En primer lugar, la muestra de agua se prepara con dilución 1:10, es decir se dispone un volumen de 2 ml de la muestra de agua en un tubo de ensayo y se le adicionan 18 ml de agua destilada. Se prepara también un blanco y una única disolución patrón, ya que el equipo realiza las diluciones necesarias para la obtención de la curva de calibrado. Una vez se han preparado las muestras, se colocan en el equipo (FAAS), y se lleva a cabo el análisis. Las longitudes de onda que emiten las diferentes lámparas se muestran en la siguiente tabla.

Tabla 10. Longitud de onda emitida por la Lámpara de Cátodo hueco para la determinación de Na en muestras de agua.

Na

λ (nm) 330,3

20

2.2.6. Valores obtenidos mediante cálculos.

2.2.6.1. Índice de Langeliere (LSI).

El Indice de Langeliere (LSI) se establece para una temperatura determinada y

mide el estado de equilibrio del agua en relación con su carácter incrustante o corrosivo. Se define teóricamente como:

spKpHLSI

Siendo pH, el pH al que se encuentra la muestra de agua y pHs el valor de pH al

que comenzaría a precipitar carbonato cálcico (CaCO3). Debido a ello, cuando LSI tenga un valor negativo se tratará de un agua con tendencia corrosiva, tendencia tanto mayor cuanto menor sea el LSI. En cambio, para valores positivos de LSI el agua tendrá una tendencia incrustante provocando la deposición del carbonato cálcico. El valor de LSI se calcula experimentalmente en el laboratorio, sin embargo puede hacerse una aproximación bastante buen aplicando la siguiente fórmula:

DCBApH s 3,9

Donde A, B, C y D vienen dados por las siguientes expresiones:

1log10

1 TDSA

55,34273ºlog12,13 CTB

4,0log THC

TACD log

Siendo TDS los mg/l de sólidos disueltos; T, la temperatura en ºC; TH la dureza

expresada en mg/l de CaCO3 y TAC, la alcalinidad en mg/l de CaCO3.

2.2.6.2. Indice S.A.R. (Relación de Absorción de sodio).

El índice S.A.R. hace referencia a la proporción relativa en que se encuentra el ion sodio y los iones calcio y magnesio, calculándose mediante la siguiente expresión:

21

2

..22

MgCa

Na

CC

CRAS

en la que la concentración de los cationes se expresa en meq/l. Para valores del índice S.A.R> 10, se puede afirmar que el agua es alcalinizante, siendo mayor este riesgo cuanto mayor sea aquel valor.

2.2.6.3. Norma Riverside (C) y (S).

Esta clasificación se presenta en forma de diagrama semilogarítmico en el cual se establece dieciséis categorías de aguas, las cuales resultan de combinar cuatro intervalos distintos de conductividad (que establece el riesgo de salinización) y cuatro intervalos de Relación de Adsorción de Sodio (S.A.R., que establece el riesgo de sodificación). La valoración de las Normas Riverside es la siguiente: C1: Aguas de baja salinidad. Pueden ser usadas para el riego de la mayoría de las cosechas y en la práctica totalidad de los suelos, con poco riesgo de salinización. C2: Aguas de salinidad media. Pueden ser usadas en condiciones de lavado moderado de los suelos. Las plantas con una moderada tolerancia a las sales pueden regarse, en la mayor parte de los casos, sin medidas especiales para el control de la salinidad. C3: Aguas de salinidad alta. No pueden ser usadas en suelo con drenaje deficiente, y aún en caso de tratarse de suelos con un adecuado drenaje, deberán controlarse los posibles riegos de salinización de los mismos. Deben emplearse solo para el riego de plantas con buena tolerancia a la salinidad. C4: Aguas de salinidad muy alta. Solo deben usarse bajo circunstancias especiales, en caso de suelos permeables con buen drenaje. El riego debe ser abundante para favorecer la lixiviación y evitar la acumulación de sales. Solo deben emplearse para el riego de plantas muy tolerantes a la salinidad. S1: Aguas de sodicidad baja. Pueden ser usadas en casi todos los suelos con poco, o ningún riesgo de alcanzar niveles perjudiciales de sodio adsorbido o cambiable. S2: Aguas de sodicidad media. Presentan un cierto peligro de sodicidad en suelos de textura fina, que tienen una alta capacidad de intercambio catiónico, especialmente en condiciones de lavado insuficiente, excepto cuando el suelo contenga yeso. S3: Aguas de sodicidad alta. Pueden producir niveles perjudiciales de yeso adsorbido en la mayor parte de los suelos. Deben usarse en suelos con buen drenaje. Los suelos

22

yesosos pueden no desarrollar niveles perjudiciales de sodio. La incorporación de una adecuada fertilización orgánica puede disminuir el riesgo de sodicidad que comporta el uso de este tipo de aguas. S4: Aguas de sodicidad muy alta. En general, no son aptas para el riego salvo que la salinidad sea muy baja, en cuyo caso se establecerían equilibrios entre el sodio del agua y el conjunto de cationes adsorbidos en el suelo, produciéndose, en conjunto, una disminución de la concentración de sodio en la disolución del suelo.

La siguiente figura muestra las diferentes clasificaciones de un agua de acuerdo a esta norma.

Figura 1. Clasificación de un agua de riego de acuerdo la Norma Riverside.

23

2.2.6.4. Norma Green.

Toma como base la concentración total de sales expresada en meq/l con relación al porcentaje de sodio (este porcentaje se calcula respecto al contenido total de cationes expresado en meq/l).

Figura 2. Clasificación de un agua de riego en función del contenido en sales y el % de sodio (Norma

Green).

2.2.6.5. Norma Wilcox.

Considera como índices para la calificación de las aguas el porcentaje de sodio respecto al total de cationes y la conductividad eléctrica.

Figura 3. Clasificación de un agua de riego en función de la conductividad el % de sodio (Norma Wilcox).

24

Fotografía 9. Orden de trabajo para una muestra de agua a la salida de una desaladora.

25

3. Laboratorio de Microbiología.

3.1. Introducción.

El laboratorio de Microbiología de Biotechveg lleva a cabo una importante labor en cuanto a cantidad y calidad de análisis de muestras. En esta sección de la empresa se llevan a cabo análisis microbiológicos de muestras de agua y alimentos, análisis microbiológicos ambientales (superficie, aire y manipuladores) así como estudios y diagnósticos de enfermedades infecciosas de las plantas (fitopatología). Además cuentan con equipos de gran calidad, como la PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa).

3.2. Condiciones de trabajo.

Debido a la sensibilidad de los análisis llevados a cabo en esta sección del laboratorio, las instalaciones, los recursos energéticos, la iluminación, la climatización, el nivel de ruido, los sistemas auxiliares, y la ventilación deberán ser tales que faciliten la adecuada realización de los ensayos y en ningún caso afectarán negativamente en los resultados de los mismos.

Para evitar posibles contaminaciones, los tubos y botellas que contienen los medios para la posterior realización de los ensayos, se introducen en el autoclave a 105 ºC durante un periodo de 20 minutos.

Fotografía 10. Autoclave.

Además, la manipulación de la muestra siempre ha de llevarse a cabo en campana (con luz UV) o bajo llama, los utensilios empleados han de ser flambeados antes de ser empleados y los envases de las muestras desinfectados con alcohol.

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Fotografía 11. Campana extractora dotada de radiación ultravioleta.

3.3. Preparación de medios.

Los medios con los que habitualmente se trabaja en la sección de microbiología de la empresa Biotechveg son:

- Agua de Peptona Tamponada (APT): Se emplea como enriquecimiento para todos los microorganismos

- PCA: Se emplea para favorecer el crecimiento de los microorganismos aerobios. - TBX: Se emplea para favorecer el crecimiento de la E. Colli. - MK y RVS: Se trata de medios semi-selectivos que favorecen el crecimiento de

Salmonella y a su vez dificultan el crecimiento de los coliformes y otras bacterias

- BGA y XLD: Son medios selectivos para la identificación de Salmonella. - Aloa: Se trata de un medio selectivo para el crecimiento de Listeria. - Rosa de Bengala: Medio selectivo para el crecimiento de mohos y levaduras.

Los medios se preparan como sigue: se pesa una masa de medio sólido, de acuerdo a las instrucciones del fabricante, se añade agua destilada, y se agita en un agitador magnético con aporte de calor. Una vez se ha disuelto el medio, éste se autoclava. En algunos medios, es necesaria la adición de un suplemento vitamínico, que se adiciona una vez se ha llevado al autoclave, ya que suelen ser termolábiles y se volatilizarían durante el proceso de esterilización. La adición debe llevarse a cabo, por tanto, en campana con luz UV o bajo llama.

3.4. Análisis de muestras de agua.

3.4.1. Introducción.

Se reciben aguas empleadas para riego, de embalses en caso de los cultivos.

Biotechveg analiza habitualmente el agua con la que lavan la frutas, instalaciones, etc. de la empresa Frutibón.

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3.4.2. Análisis de muestras de agua que se pueden filtrar.

3.4.2.1. Material.


- Montaje para filtración en rampa. - Filtros (tamaño de poro: 0,45 μm). - Asa de siembra. - Placas Petri. - Tubos de ensayo. - Pinzas. - Mechero.

Equipos.

- Estufa. - Campana con luz UV. - Contador de colonias.

3.4.2.2. Reactivos.

- Medios de cultivo (Agua de Peptona, PCA, TBX, RVS, MK, BGA, XLD, Aloa). - Agua destilada.

3.4.2.3. Preparación de la muestra.

La muestra de agua se recibe en una botella de plástico estéril y que contiene un inhibidor de cloro. En primer lugar es necesario recoger las bacterias en ausencia de agua. Para ello, se lleva a cabo una filtración en rampa. En la fotografía 12 se muestra una imagen del montaje necesario para llevar a cabo la filtración.

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Fotografía 12. Montaje para la filtración en rampa.

Para realizar la filtración de la muestra se procede como sigue. En primer lugar se colocan los filtros sobre las superficies metálicas y a continuación los recipientes sobre los que será vertida la muestra. Cuando ya se dispone del montaje, se llenan los recipientes con la muestra y se acciona el vacío.

Fotografía 13. Recipiente conteniendo una muestra de agua.

El volumen de muestra filtrado depende del microorganismo que se desea determinar. Para la determinación de E.Colli se filtran 100 ml de muestra, mientras que para Salmonella y Listeria el volumen de muestra filtrado son 250 ml. Una vez terminada la filtración, las bacterias han quedado retenidas en el filtro, por lo que este se retira del montaje y se analiza.

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Fotografía 14. Aspecto de un filtro tras una filtración en rampa.

3.4.2.4. Determinación de aerobios.

Para la determinación de aerobios en una muestra de agua, se filtra un volumen de muestra de 100 ml. El filtro se introduce en una placa que contiene el medio PCA y se incuba durante 72 horas a 22 ºC. Transcurrido este tiempo se determina el número de colonias.

3.4.2.5. Determinación de Eschericia Colli.

Para la determinación de E.Colli en una muestra de agua, se filtra un volumen de muestra de 100 ml. El filtro se introduce en una placa que contiene el medio TBX, a una temperatura de 44 ºC durante 24 horas. Finalmente, se determina el número de colonias que han aparecido.

Fotografía 15. Presencia de E.Colli en una muestra de agua.

3.4.2.6. Determinación de Salmonella.

Para la determinación de Salmonella en una muestra de agua, se filtra un volumen de muestra de 250 ml. El filtro se introduce en una botella que contiene Agua

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de Peptona Tamponada (V = 225 ml APT), y se mantiene a 37 ºC durante 24 h. Transcurrido este período se retira la botella de la estufa y se pasa un volumen determinado de la disolución a dos tubos que contienen medios selectivos: MK (V = 1 ml) y RVS (V = 0,1 ml), como muestra la siguiente fotografía.

Fotografía 16. Medios de cultivo MK y RVS para la determinación de Salmonella.

Estos tubos se incuban a 37 ºC (MK) y a 41 ºC (RVS) durante 24 h. A continuación se realiza el sembrado en placas. De cada uno de los tubos (MK o RVS) se siembra un volumen determinado en dos placas que contienen los medios XLD y BGA. Estas placas se incuban a 37 ºC durante 24 h y finalmente se lleva a cabo la identificación de colonias negras con halo rosa (XLD) y colonias rosas transparentes (BGA).

3.4.2.7. Determinación de Listeria.

Para la determinación de Listeria en una muestra de agua, se filtra un volumen de muestra de 250 ml. El filtro se introduce en una botella que contiene APT, y se mantiene a temperatura ambiente durante 24 horas. A continuación, se siembra un volumen determinado (V = 1 ml) en una placa que contiene el medio ALOA. Esta placa se incuba a 37 ºC durante 48 horas. Se comprueba la aparición de colonias azules con halo de precipitación traslúcido.

3.4.3. Muestras de agua que no se pueden filtrar.

3.4.3.1. Material.


- Bolsa Stomacher®. - Asa de siembra. - Asa drigalsky.

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- Vaso de precipitados de plástico (V = 500 ml). - Mechero. - Placas Petri. - Tubos de ensayo. - Mechero.

Equipos.

- Balanza. - Homogeneizador de muestras. - Estufa. - Campana con luz UV. - Contador de colonias.

3.4.3.2. Reactivos.

- Medios de cultivo (Agua de Peptona, PCA, TBX, RVS, MK, BGA, XLD, Aloa,

Chromocult). - Alcohol (para flambear).

3.4.3.3. Preparación de la muestra.

La muestra de agua se recibe en una botella de plástico estéril y que contiene un inhibidor de cloro. Determinadas muestras de agua, debido al contenido en sólidos en suspensión, no pueden ser filtradas mediante rampa de filtración, ya que se produce la saturación del filtro empleado.

Cuando el agua esta muy sucia y tapona los poros del filtro, impide que se pueda filtrar, por lo que la muestra se prepara con una dilución 1/10. Para ello, se procede del siguiente modo. En primer lugar se pesa una masa de 25 g de muestra en una bolsa de Stomacher® y se le añaden 225 ml de Agua de Peptona Tamponada (APT) o preferiblemente 100 g de agua en lo correspondiente a APT. Finalmente se introduce en el homogeneizador.

3.4.3.4. Determinación de aerobios.

Para la determinación de aerobios se lleva a cabo un banco de diluciones y para ello, en primer lugar, se siembra un volumen de 1 ml de la dilución madre en una placa y se añade el medio PCA que se encuentra en estado líquido en un baño (T = 47 ºC), y un volumen de 10 ml de la dilución madre en otra placa (diámetro = 140 mm) al que también se adiciona el medio PCA. También se toman 2 ml de la dilución madre y se vierte en un tubo que contiene un volumen de 18 ml de Agua de Peptona. De este modo, se consigue la dilución -2. A partir de esta dilución, se preparan la placa de

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dilución -2, del mismo modo que se preparó la placa de dilución -1. De igual modo, operando como hasta el momento, se preparan el resto de diluciones de la muestra. Para la determinación de aerobio en muestras de agua, se preparan las diluciones -1, -2, -3, y -4. Finalmente las placas se incuban a 30ºC durante un período de 72 horas. Transcurrido este tiempo se cuenta el número de colonias blancas aparecidas en la placa.

Fotografía 17. Placa con colonias de aerobios.

3.4.3.5. Determinación de coliformes.

Para la determinación de coliformes en una muestra de agua, se lleva a cabo el mismo procedimiento que para la determinación de aerobios (apartado 3.4.3.4.), empleando placas que contienen el medio chromocult.

3.4.3.6. Determinación de Eschericia Colli.

Para la determinación de Eschericia Colli solo se requiere la dilución -1. Para ello, se siembra un volumen de 1 ml de la dilución madre en placa con el medio TBX, y un volumen de 10 ml en otra placa con el mismo medio. Las placas se incuban a 44ºC durante un período de 24 horas. Transcurrido este tiempo se cuenta el número de colonias azules aparecidas en la placa.

3.4.3.7. Determinación de Salmonella.

La muestra preparada en la bolsa de Stomacher®, se preenriquece a 37ºC para revivificar las bacterias que pudieran estar dañadas y no crecerían en placa. Transcurridas 24 horas se transfiere 1 ml de la bolsa al tubo de ensayo que contiene el medio MK y 0,1 ml al tubo que contiene RVS. El tubo MK se incuba a 37ºC y el tubo RVS a 41,5 ºC, ambos durante un periodo de 24 horas. Finalmente se siembra por estrías en placas BGA y XLD.

33

3.4.3.8. Determinación de Listeria.

Para la investigación de Listeria monocytogenes, la muestra preparada en la bolsa de Stomacher®, se preenriquece a 37ºC para revivificar las bacterias que pudieran estar dañadas y no crecerían en placa durante 24 ºC. A continuación se siembra en dos placas de Aloa, que se incuban a 37ºC durante un periodo de 48 horas.

3.5. Análisis de muestra de alimentos.

3.5.1. Introducción.

Se reciben diariamente diversas muestras de alimentos de producción (recogidos del día anterior) y de caducidad (caducados el día anterior) de la empresa Bonyssa (tomate, piña y granada). Además, también se reciben muestras de alimentos de empresas externas.

3.5.2. Material.


- Bolsa Stomacher®. - Vaso de precipitados de plástico (V = 500 ml). - Mechero. - Asa de siembra. - Asa Drigalsky. - Placas Petri. - Pipeta automática (V = 1 ml) y micropipeta automática (V = 100 μl). - Tubos de ensayo. - Mechero.

Equipos.

- Balanza. - Homogeneizador de muestras. - Estufa. - Campana con luz UV. - Contador de colonias.

3.5.3. Reactivos.

- Medios de cultivo (Agua de Peptona, PCA, TBX, RVS, MK, XLD, BGA, Aloa). - Alcohol (para flambear).

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Para la preparación de muestras de alimentos se procede del siguiente modo. En primer lugar se pesa una masa de 25 g de muestra en una bolsa de Stomacher® y se le añaden 225 ml de Agua de Peptona (enriquecimiento). Finalmente se introduce en el homogeneizador. La disolución obtenida es la dilución madre (dilución -1, 1:10). A partir de esta disolución es posible la determinación de una gran variedad de microorganismos.

Fotografía 18. Muestra de coco de producción; dilución madre.

3.5.5. Determinación de aerobios.

A partir de la dilución madre, se prepara un banco de diluciones, cuyo número de diluciones depende de la concentración de microorganismos en la muestra.

3.5.5.1. Aerobios Mesófilos.

Para la determinación de aerobios mesófilos se prepara un banco de diluciones. Para ello, en primer lugar, siembra un volumen de 1 ml de la dilución madre en una placa con el medio PCA. También se toma 1 ml de la dilución madre y se vierte en un tubo que contiene un volumen de 9 ml de Agua de Peptona. De este modo, se consigue la dilución -2. A partir de esta dilución, se prepara la placa de dilución -2, del mismo modo que se preparó la placa de dilución -1. De igual modo, operando como hasta el momento, se preparan el resto de diluciones de la muestra. Finalmente las placas se incuban a 30 ºC durante un período de 72 horas. Transcurrido este tiempo se cuenta el número de colonias blancas aparecidas en la placa.

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3.5.5.2. Eschericia Colli.

Para la determinación de Eschericia Colli solo se requiere la dilución -1. Para ellos, se siembra un volumen de 1 ml de la dilución madre en placa con el medio TBX. La placa se incuba a 44ºC durante un período de 24 horas. Transcurrido este tiempo se cuenta el número de colonias azules aparecidas en la placa.

3.5.6. Determinación de Salmonella.

Para la determinación de Salmonella en muestras de alimentos se procede de la siguiente manera. En primer lugar, se incuba la dilución madre contenida en la bolsa de Stomacher® preparada anteriormente a 37 ºC durante 24 h. Transcurrido este período se retira la bolsa de la estufa y se pasa un volumen determinado de la disolución a dos tubos que contienen medios selectivos: MK (V = 1 ml) y RVS (V = 0,1 ml). Estos tubos se incuban a 37 ºC (MK) y a 41 ºC (RVS) durante 24 h. A continuación se realiza el sembrado en placas. De cada uno de los tubos (MK o RVS) se siembra un volumen determinado en dos placas que contienen los medios XLD y BGA. Estas placas se incuban a 37 ºC durante 24 h y finalmente se lleva a cabo la identificación de colonias negras con halo rosa (XLD) y colonias rosas transparentes (BGA).

(a) (b)

Fotografía 19. (a) Placa XLD negativa en Salmonella. (b) Placa BGA negativa en Salmonella.

(a) (b)

Fotografía 20. (a) Placa XLD positiva en Salmonella. (b) Placa BGA positiva en Salmonella.

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3.5.7. Determinación de Listeria.

Para la determinación de Listeria la bolsa de Stomacher® se incuba a una temperatura de 22ºC durante un periodo de 1 hora. A continuación se siembra un volumen determinado (V = 1 ml) en una placa que contiene el medio ALOA. Esta placa se incuba a 37 ºC durante 48 horas. Se comprueba la aparición de colonias azules con halo de precipitación traslúcido.

(a) (b)

Fotografía 21. (a) Placa ALOA negativa en Listeria. (b) Placa ALOA positiva en Listeria.

3.5.8. Determinación de coliformes totales.

Para la determinación de coliformes totales se hace en primer lugar, una siembra en masa (V = 1 ml) o en superficie (V = 0,1 ml) a partir de la dilución madre. Seguidamente se incuba a una temperatura de 37 ºC durante un período de 24-48 horas. Finalmente se cuentan el número de colonias rosadas y azules.

Fotografía 22. (a) Placa con coliformes totales.

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3.5.9. Determinación de Mohos y Levaduras.

Para la identificación de mohos y levaduras en muestras de alimentos, se lleva a cabo el siguiente ensayo. En primer lugar, se deja reposar la bolsa Stomacher® que contiene la dilución madre durante 1-2 horas y a temperatura ambiente. A continuación se realiza una siembra en superficie (V = 0,1 ml) con un asa Drigalski y sobre una placa que contiene el medio Rosa de Bengala, y se incuba a una temperatura de 26 ºC durante un periodo de 5 días. Al medio Rosa de Bengala se le ha adicionado un antibiótico para impedir e crecimiento de las bacterias. Transcurridos los 5 días, se identifican colonias rosadas (levaduras) y el aspecto característico de los hongos.

Fotografía 23. Placa con mohos.

4. Laboratorio de Orgánica.

4.1. Introducción.

El Laboratorio de Orgánica desempeña una importante labor en la empresa, dedicado a la búsqueda de plaguicidas en alimentos.

4.2. Multirresiduos.

4.2.1. Fundamento.

El método se emplea para la determinación de la concentración de diversos plaguicidas en alimentos. Se basa en la extracción de los plaguicidas mediante extracción líquido-líquido y posterior identificación y cuantificación mediante Cromatografía de Gases con detectores EDC y NPD. Además, se lleva a cabo una confirmación de los resultados mediante Cromatografía de Gases acoplado a Espectrometría de Masas.

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4.2.2. Alcance.

El método puede ser aplicado a muestras de alimentos. Los plaguicidas identificados y cuantificados mediante el mismo se muestran en la tabla contenida en el Anexo I (pag. 66).

4.2.3. Material.


- Vaso de precipitados (V = 500 ml). - Matraz Kitasatos (V = 500 ml). - Matraz erlenmeyer (V = 500 ml). - Matraz de fondo redondo (V = 500 ml) - Probeta (V = 500 ml). - Pipeta (V = 10 ml). - Micro-pipeta. - Embudos cónicos. - Papel de filtro. - Embudo de decantación. - Matraces aforados (V = 5 ml). - Cuentagotas. - Jeringa Hamilton. - Viales de cromatografía (V = 1,5 ml).

Equipos. - Batidora. - Trituradora. - Rotavapor. - Agitador Vortex. - Cromatógrafo de Gases acoplado a Espectrómetro de Masas. - Cromatógrafo de Gases con detector ECD y NPD.

4.2.4. Reactivos.

- Agua Ultrapura. - Acetona. - Diclorometano. - NaCl. - Celite. - Na2SO4. - Lana de vidrio. - Mix QQQ.

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4.2.5. Procedimiento experimental.

a) Preparación de la muestra. En primer lugar, la muestra recibida (habitualmente frutas y hortalizas) se tritura y se conserva en nevera a T = 2 ºC.

Fotografía 24. Triturador de muestras.

Para comenzar el ensayo, se pesa la muestra (m = 50 gr) en un vaso de precipitados. Paralelamente a la muestra, es necesario preparar un control y llevarle a cabo los mismos procesos que a la muestra. El control se prepara con la misma muestra (m = 50 g), y desde el momento de su pesada se le adiciona un volumen determinado de una disolución mezcla de los plaguicidas en estudio cuya concentración es conocida (MIX QQQ). A partir de ese instante, el control se trata como una muestra más. A continuación, se añade el volumen de agua ultrapura necesario, de acuerdo a las indicaciones de la PNT basadas en el contenido en agua en la muestra. Seguidamente, se añade Celite (m = 10 gr), y a continuación, la acetona (V = 80 ml). La mezcla resultante se bate mediante una batidora convencional durante 1-2 minutos. Es importante no batir más tiempo del necesario, por la posible evaporación de los plaguicidas. Para continuar, la mezcla se filtra al matraz Kitasatos mediante un embudo con papel de filtro, lavando el filtro que contiene la muestra con acetona (V = 20 ml). Se mide mediante probeta el volumen de filtrado recogido, ya que se tendrá en cuenta en los cálculos realizados para la determinación de la concentración de los diferentes plaguicidas.

b) Extracción de los plaguicidas. Para extraer los plaguicidas en una fase orgánica, en primer lugar, el filtrado obtenido es transferido a un embudo de decantación que contiene NaCl (m = 10 g), y a continuación, se agita. Se lleva a cabo una primera extracción con CH2Cl2 (V = 50 ml), reservando la fase orgánica obtenida en un matraz erlenmeyer que contiene Na2SO4. La fase acuosa

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obtenida se somete a una segunda extracción con CH2Cl2 (V = 50 ml), añadiendo la nueva fase orgánica obtenida al matraz erlenmeyer. A continuación, el líquido obtenido se filtra a un matraz de fondo redondo mediante un embudo con vidrio de lana y Na2SO4.

c) Concentración y re-disolución de los plaguicidas. Se continua disponiendo el matraz de fondo redondo en el Rotavapor y llevando a cabo una destilación hasta haber eliminado todo el volumen de la disolución.

Fotografía 25. Rotavapor.

Una vez terminado, se procede a la re-disolución. Para ello, se añaden pequeños volúmenes de acetona al matraz de fondo y se agita mediante el agitador Vortex. A continuación, mediante un cuentagotas se traspasa dicho volumen de acetona (junto con los plaguicidas redisueltos) a un matraz aforado (V = 5 ml). Se repite esta operación hasta enrasar el matraz. Seguidamente, el volumen de disolución obtenido se filtra mediante una jeringa Hamilton. Finalmente, se dispone la disolución obtenida en tres viales de cromatografía (V = 1,5 ml), preparados para ser analizados mediante GC-ECD, GC-NPD y GC-MS.

d) Análisis. Cromatógrafo de Gases 1. El cromatógrafo se encuentra provisto de un inyector automático de muestras en modo PTV (inyección por vaporización a temperatura programada), un horno con una rampa de temperatura programada, un Detector de Masas de impacto electrónico con cuadrupolo, una columna cromatográfica capilar tipo HP-5MS (30 m de longitud, 0.25 mm de diámetro interno, 25 μm de película fenil-metilpolisiloxano y con un rango de temperatura de trabajo de -60 ºC a +325/350 ºC), una estación de trabajo con software específico y el Software de Librerías de Espectros de Masas de Plaguicidas.

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Fotografía 26. Equipo GC-MS.

Cromatógrafo de Gases 2. Provisto de dos inyectores automáticos de muestras trabajando en modo splitless, un horno con una rampa de temperatura programada , detectores específico s de captura electrónica (ECD) a 300 ºC y Nitrógeno-Fósforo (NPD) a 325 ºC, dos columnas cromatográficas capilares tipo HP-5MS (30 m de longitud, 0.25 mm de diámetro interno, 25 μm de película fenil-metilpolisiloxano y con un rango de temperatura de trabajo de -60 ºC a +325/350 ºC) y una estación de trabajo con software específico.

Fotografía 27. Equipo GC-ECD y GC-NPD.

4.3. Multiliquídos.

4.3.1. Fundamento.

El método se emplea para la determinación de la concentración de diversos plaguicidas en alimentos. Se basa en la extracción de los plaguicidas mediante extracción líquido-líquido y posterior identificación y cuantificación mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución acoplada a un Espectrómetro de Masas de Triple Cuadrupolo.

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4.3.2. Alcance.

El método puede ser aplicado a muestras de alimentos. Los plaguicidas identificados y cuantificados mediante el mismo se muestran en la tabla contenida en el Anexo I (Tabla pag. 67).

4.3.3. Material.


- Tubos de centrífuga (V = 50 ml). - Probeta (V = 500 ml). - Pipeta (10 ml). - Matraces aforados (V = 5 ml, V = 1 ml). - Micropipeta. - Jeringa Hamilton. - Cuentagotas. - Viales de cromatografía (V = 1,5 ml).

Equipos. - Trituradora. - Centrífuga. - Cromatógrafo de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) acoplado a Espectrómetro

de Masas de Triple Cuadrupolo.

4.3.4. Reactivos.

- Agua Ultrapura. - Acetonitrilo. - Acetonitrilo + patrón interno (50 ppb). - NaCl. - Na2SO4. - MgSO4. - Na2Cytrate. - Na3Cytrate. - Bondesyl-PSA. - Mix QQQ.

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4.3.5. Procedimiento experimental.

a) Preparación de la muestra. En primer lugar, la muestra recibida (habitualmente frutas y hortalizas) se tritura y se conserva en nevera a T = 2 ºC. Paralelamente a la muestra, es necesario preparar un control y llevarle a cabo los mismos procesos que a la muestra. El control se prepara con la muestra (m = 50 g), y desde el momento de su pesada se le adiciona un volumen determinado de una disolución mezcla de los plaguicidas en estudio cuya concentración es conocida. A partir de ese instante, el control se trata como una muestra más, es decir, que se somete a las mismas condiciones que la muestra. De este modo, es posible controlar la recuperación de los plaguicidas con el ensayo realizado.

b) Extracción de los plaguicidas. A continuación, se añade el volumen de agua ultrapura necesario, de acuerdo a las indicaciones de la PNT basadas en el contenido en agua contenido en la muestra. Seguidamente se adiciona una disolución de acetonitrilo mezclada con patrón interno (V = 10 ml) y se agita manualmente durante 1 minuto. Se añade: MgSO4 (m = 4 g), NaCl (m = 1 g), Na3Cytrate dyhidrate (m = 1 g) y Na2HCytrate sesquihydrate (m = 0,5 g). Estos reactivos proporcionan un tampón de pH óptimo para la extracción (pH = 5-5,5). La mezcla resultante se agita manualmente durante 1 minuto y seguidamente se centrifuga durante 5 minutos a 5000 rpm. Transcurrido el tiempo necesario, se toman 5 ml de la parte superior de la disolución y se transfieren a otro tubo de centrífuga. A continuación, se adiciona una mezcla de MgSO4 + PSA (750 mg MgSO4 + 125 mg PSA), se agita manualmente durante 30 segundos y se centrifuga durante 5 minutos a 5000 rpm. El Bondesil-PSA retiene gran parte de las moléculas interferentes que no interesan, pero no retiene nada los plaguicidas que se desea determinar. El MgSO4 se emplea para eliminar el agua residual.

c) Concentración de los plaguicidas. Una vez terminado el programa de la centrífuga, se obtiene una disolución de dos fases, cuya fase superior se filtra mediante una jeringa Hamilton a un matraz aforado de 10 ml. Mediante ayuda de un cuentagotas se prepara 1 ml de la disolución obtenida, conteniendo ácido fórmico al 5% (V = 10 μl). Finalmente, la disolución obtenida se transfiere a un vial de cromatografía, preparada para su análisis mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución acoplada con Espectrómetro de Masas de Triple Cuadrupolo (HPLC-QQQ).

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d) Análisis. El cromatógrafo de líquidos de alta resolución consta de las siguientes características: Desgasificador de vacio.

- Capacidad para cuatro canales. - Máximo flujo: 10 ml/min por canal. - Nº Canales: 4. - Volumen interno: 12 ml por canal.

Bomba cuaternaria.

- Bomba cuaternaria en gradiente. - Precisión de flujo de 0,15%-0,3% de RSD. - Presión de pulsación < 1% a 1 ml/min. - Rango de pH recomendado: 1-12,5. - Sistema de dos pistones en serie servocontrolados. - Flujo entre 1 μl a 10 ml/min, en pasos de 1 μl/min. - Presión: 0-5880 psi

Termostato de columna.

- Rango de temperatura: 10-80 ºC. - Estabilidad de temperatura: ±0,15 ºC. - Exactitud de temperatura: ±0,8 ºC.

Columna y pre-columna.

- Columna ZORBAX ECLIPSE XDB-C8 150 mm x 4,6 mm. - Precolumna ZORBAX ECLIPSE XDB-C8 4,6 mm x 12,5 mm.

Fases móviles.

- Fase móvil B: Metanol/Agua (9:1)(5 mM Ácido Fórmico). - Fase móvil C: Metanol/Agua (2:8)(5 mM Ácido Fórmico). - Fase móvil D: Metanol.

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Fotografía 28. Equipo HPLC-QQQ.

5. Laboratorio de Agrícola.

5.1. Introducción.

La empresa analiza y estudia en profundidad todos los aspectos relacionados con la planta. Este apartado se centra en los ensayos más solicitados por los clientes durante el periodo de las prácticas en empresa realizadas: análisis de suelos y análisis de foliares.

5.2. Análisis de suelos.


Cuando la muestra se recibe en el laboratorio se conserva a 3ºC hasta el momento de su análisis. Para llevar a cabo los análisis la muestra de suelo requiere el siguiente tratamiento. En primer lugar, se retiran las piedras y demás objetos de volumen considerable que pueda contener la muestra. Seguidamente, la muestra de suelo se mantiene durante 24 h a 40 ºC en estufa. Transcurrido este período de tiempo, la muestra se deja enfriar y se hace pasar por un tamiz con tamaño de malla de 2 mm. La muestra se encuentra preparada para los posteriores análisis.

5.2.2. pH.

5.2.2.1. Fundamento. La determinación del pH de una muestra de suelo se determina mediante un pH-metro.

46

5.2.2.2. Material. Material de laboratorio.

- Vasos de plástico.

Equipos.

- Balanza. - Titrador. - Agitador.

5.2.2.3. Reactivos. - Soluciones patrón de pH 4 y 7. - Agua destilada.

5.2.2.4. Procedimiento experimental.

Para determinar el pH de una muestra de suelo, se pesa una masa de muestra (m = 10 g) y se adiciona un volumen de agua destilada (V = 25 ml). A continuación, se agita durante un periodo de 10 minutos en el agitador que se muestra en la siguiente fotografía.

Fotografía 29. Agitador de muestras.

Transcurridos los 10 minutos, la muestra se retira del agitador y se deja en reposo durante aproximadamente 5 minutos. Finalmente, se determina el pH de la muestra en el Titrador. En la siguiente tabla se muestra la clasificación de la muestra de suelo de acuerdo al pH:

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Tabla 11. pH óptimo para el crecimiento de los cultivos según la textura del suelo

5.2.3. Conductividad.

5.2.3.1. Fundamento. La determinación de la conductividad de una muestra de agua se basa en el uso del conductímetro, es decir, en el método electrométrico con electrodo de vidrio.

5.2.3.2. Material.

- Vasos de plástico. - Embudo. - Papel de filtro. - Balanza. - Titrador. - Agitador.

5.2.3.3. Reactivos. - Soluciones patrón de conductividad. - Agua destilada.


Para determinar la conductividad de una muestra de suelo, se pesa una masa de muestra (m = 20 g) y se adiciona un volumen de agua destilada (V = 100 ml). A continuación, se agita durante un periodo de 30 minutos en el agitador.

Transcurrido el tiempo, la muestra se retira del agitador y se filtra mediante un embudo y papel de filtro. Finalmente, se determina la conductividad de la muestra en el Titrador. En la siguiente tabla se muestra la clasificación de la muestra de suelo de acuerdo al pH:

Tipo de suelo pHKCL óptimo

Suelos orgánicos 4-5 Suelos minerales arenosos 5-6

Suelos minerales arceillosos 7-7.5

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Tabla 12. Clasificación de la salinidad del suelo en función de la conductividad eléctrica (CE).

CE1:5 (dS/m) CEps (dS/m) Tipo de suelo

< 0.35 <2 No salino 0.35 - 0.65 2 – 4 Ligeramente salino 0.65 – 1.15 4 – 8 Salino

>1.15 8 - 18 Muy salino

5.2.4. Nitrógeno Kjeldhal.

5.2.4.1. Fundamento.

El procedimiento Kjeldhal es el más utilizado en la determinación del nitrógeno en suelo. El método consta de dos pasos bien definidos: a) Digestión de la muestra y b) Cuantificación del amonio. Este procedimiento permite la determinación del nitrógeno que está en el suelo en forma orgánica y amónica, pero no el que se encuentra como nitrato o nitrito. Los procesos que tienen lugar se indican a continuación:

1. Digestión de la muestra. La reacción que tiene lugar en el digestor Kjeldhal es:

442242 HSONHOHCON

rCatalizadoCalorSOH

organico

El método consiste en tratar el suelo con H2SO4 concentrado y una mezcla catalizadora constituida por K2SO4, CuSO4·5H2O y Se metal.

2. Cuantificación del amonio. La destilación es el procedimiento más empleado en la determinación del amonio presente en el mineralizado Kjeldhal. El NH3 liberado en la destilación con NaOH se recoge sobre un volumen de H3BO3, valorando posteriormente el exceso de NH3 sobre HCl estandarizado. En la destilación del NH3 se producen las reacciones que a continuación se indican. Se debe tener en cuenta que en el mineralizado existe NH4HSO4 y exceso de H2SO4 que tienen que ser neutralizados, por tanto:

OHSONaOHNHNaOHHSONH

OHSONaNaOHSOH

242444

24242

2

22

Al calentar la muestra se desprende amoniaco y vapor de agua:

49

)(234 v

Q OHNHOHNH

Que al enfriarse conjuntamente, condensan dando:

OHNHOHNH v 4)(23

Este NH4OH al destilar sobre H3BO3 reacciona como sigue:

)(2324334 vOHBOHNHBOHOHNH

Mediante una valoración con ácido se regenera el H3BO3 que reaccionó con el NH4

+:

33

tan

32 BOHHBOH darizadoesacido

A partir de la cantidad de ácido gastado en la valoración, se calcula la cantidad de amonio destilada y por tanto, la presente en la muestra original.

5.2.4.2. Material.


- Tubos de digestión Kjeldhal. - Vasos del destilador. - Pipeta.

Equipos.

- Balanza. - Digestor Buchi. - Destilador Kjeldahl. - Titrador.

5.2.4.3. Reactivos.

- Ácido sulfúrico (H2SO4 96%). - Catalizador Kjeldahl. - Disolución de Hidróxido Sódico (NaOH 30%). - Disolución de Ácido Bórico (H3BO3 2%). - Agua destilada.

50


Para determinar el contenido en nitrógeno se pesan dos masas de muestra (m1

= 0,5 g y m2= 1 g) en los tubos del digestor Kjeldhal perfectamente secos y se añade un volumen de H2SO4 (V = 10 ml), además de unas bolitas para favorecer la ebullición y una cucharada del catalizador Kjeldahl. Se lleva a cabo la digestión mediante el programa del equipo.

Fotografía 30. Digestor Buchi.

Una vez ha concluido el programa del digestor, los tubos se llevan a un destilador Kjeldhal como el que se muestra en la siguiente fotografía.

Fotografía 31. Destilador Kjeldahl.

Cuando termina la destilación, se retira el vaso de vidrio y se determina el nitrógeno haciendo uso del Titrador (valoración con HCl 0,05 M).

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5.2.5. Carbonatos.


El método de determinación de carbonatos totales en suelos, se basa en el hecho de que al atacar con ácido clorhídrico un suelo que contenga carbonatos se desprende CO2 según la reacción:

OHCaClCOHClCaCO 2223 2

El método empleado en Biotechveg se basa en el ataque de los carbonatos por un ácido y en la cuantificación del CO2 desprendido.

5.2.5.2. Material.

- Calcímetro con cierres herméticos. - Matraz Erlenmeyer. - Balanza.

5.2.5.3. Reactivos.

- Ácido clorhídrico (HCl 6 N aproximadamente). - Disolución saturada de NaCl y CO2: Disolver 100 g de NaCl y 1 g de NaHCO3 en

300 ml de agua; a ésta disolución agregar unas gotas de rojo de metilo y lentamente ácido sulfúrico diluido, hasta reacción ácida, agitando para eliminar el exceso de CO2. Esta disolución coloreada en rojo por el indicador se utiliza para llenar el calcímetro.

- Carbonato cálcico finamente pulverizado.


Se pesan 0,5 g de muestra de suelo y se colocan en un erlenmeyer, se humedecen la muestra con un poco de agua y se conecta el erlenmeyer al calcímetro, en el que previamente se habrán colocado unos mililitros de ácido clorhídrico usando el dispositivo al respecto. La siguiente figura muestra la imagen de un cálcímetro.

52

Figura 4. Calcímetro de Bernard.

Con la llave del calcímetro abierta para mantener en el interior del sistema la presión atmosférica, ajustar la altura del depósito del calcímetro hasta enrasar la bureta del mismo con el cero. Cerrar la llave, e inclinando el erlenmeyer verter el ácido sobre la muestra, agitando suavemente para favorecer el ataque. Al mismo tiempo se va descendiendo la rama móvil del calcímetro procurando mantener al mismo nivel el líquido en las dos ramas. Cuando el nivel del líquido del calcímetro permanezca estacionario, dejar de agitar y tomar la lectura alcanzada por el mismo una vez enrasadas las dos ramas. El volumen leído corresponde al del CO2 desprendido por la muestra. Se repiten las mismas operaciones tomando en vez de muestra, 0,2 g de CaCO3 y con las lecturas obtenidas, efectuar los cálculos.

p

p

L

Lcaliza

100%

Donde: L : Lectura observada en el calcímetro para la muestra. L´: Lectura observada en el calcímetro para el CaCO3. p: peso seco de la muestra de suelo en g. p´: peso seco del CaCO3 en g. En la siguiente tabla se muestra la clasificación de la muestra de suelo de acuerdo al contenido en carbonatos:

Tabla 13. Nivel de carbonatos en suelos.

Nivel % de CaCO3

Muy Bajo 0 – 5 Bajo 5 – 10

Normal 10 – 20 Alto 20 - 40

Muy Alto >40

53

5.2.6. Caliza activa.


La caliza activa se define como la fracción de carbonato de tamaño inferior a 50 μm. Si bien este dato es más bien orientativo, pues el tamaño a partir del cual los carbonatos empiezan a poseer una actividad importante varía de unos suelos a otros. Otros autores, sin embargo, prefieren definir la caliza activa, atendiendo a criterios químicos como la fracción de caliza total que reacciona con una disolución de oxalato amónico 0,2 N después de dos horas de agitación. El método clásico de determinación de caliza activa en suelos se basa en que la caliza de tamaño fino reacciona con una disolución de oxalato amónico, precipitando el calcio en forma de oxalato cálcico, según la reacción:

excesoOCNHOCaCCONHOCNHCaCO 42244232442243 )()()(

Mediante el calcímetro se valora el carbonato amónico formado, de acuerdo a la siguiente reacción:

OHClNHCOHClCONH 242324 22)(

5.2.6.2. Material.


- Calcímetro. - Matraz erlenmeyer. - Probetas (V = 250 ml). - Botellas de agitador (V = 25 ml).

Equipos.

- Agitador mecánico. - Balanza.

5.2.6.3. Reactivos.

- Disolución de oxalato amónico (aproximadamente 0,2 N). - Ácido clorhídrico (HCl 6 N). - Carbonato cálcico puro pulverizado.

54


Para la determinación de la caliza activa se procede como sigue. Se pesa 1 g de la muestra de suelo y se introduce en una botella de 25 ml; seguidamente se añaden 25 ml de la disolución de oxalato amónico y se agita mecánicamente durante dos horas. Transcurrido este tiempo, se filtra la disolución, desechando los primeros filtrados turbios. Se toman 10 ml del filtrado y se procede con el ácido clorhídrico como en el caso de la determinación de carbonatos totales en suelos (pag. ), anotando el volumen de anhídrido carbónico desprendido. El contenido en caliza activa viene dado por la siguiente ecuación:

10

25100%

p

V

V

pactivacaliza

Donde: V : Volumen de CO2 desprendido por la muestra. V´: Volumen de CO2 desprendido por CaCO3 puro. p: peso de la muestra de suelo en g. p´: peso del CaCO3 en g.

Tabla 14. Nivel de caliza activa en suelos.

% Caliza activa Interpretación

0 – 6 Bajo: No suelen aparecer clorosis 6 – 9 Medio: Se ven afectadas plantas sensibles

>9 Alto: Problemas de clorosis graves

5.2.7. Materia orgánica.


El contenido de materia orgánica de un suelo se realiza por medio de la determinación del carbono orgánico. Los métodos de análisis del carbono orgánico se basan en la oxidación de éste, que puede realizarse de dos formas: via seca y via húmeda. La determinación de la materia orgánica en Biotechveg se lleva a cabo por via húmeda. Se basa en la oxidación de la MO con un agente oxidante, generalmente dicromato, en presencia de un ácido fuerte. La oxidación se lleva a cabo sin aporte de calor, por lo que solo se oxida una parte de la materia orgánica del suelo. Las reacciones que tienen lugar en la oxidación de la materia orgánica con dicromato, son las siguientes:

55

- Reducción del Cr6+:

OHCreHOCr 2

32

72 72614

- Oxidación de la materia orgánica:

OHCOOOHC 2226126 666

- Valoración del exceso de oxidante con una sal ferrosa.

eFeFe 132

5.2.7.2. Material.

- Matraz erlenmeyer (V = 500 ml). - Barras agitadoras. - Buretas. - Agitador magnético. - Balanza.

5.2.7.3. Reactivos.

- Dicromato potásico 1N. - Ácido sulfúrico concentrado conteniendo 25 g de Ag2SO4 por litro. - Ácido fosfórico concentrado. - Sulfato ferroso amónico (Sal de Mohr) 0,5 N.


En primer lugar, se pesa 1 g de suelo tamizado y se introduce en un erlenmeyer. A continuación se añade mediante dosificador 10 ml de dicromato potásico 1N imprimiendo un movimiento de giro al matraz para asegurar una mezcla íntima con el suelo. Seguidamente se adiciona, lentamente y agitando, 20 ml de ácido sulfúrico concentrado, dejando la mezcla en reposo durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo, se añade 200 ml de agua, se deja enfriar y se agregan 10 ml de ácido fosfórico concentrado, introduciéndose también en el matraz una barra agitadora. Se le adiciona a la mezcla, 4 o 5 gotas del indicador difenilamina y se valora con sal de Mohr mediante bureta y utilizando agitador magnético hasta cambio de color. La coloración vira de rojo burdeos a verde brillante, pasando por tonos azules violáceos. Es necesario realizar un blanco siguiendo el mismo procedimiento anterior, pero sin incluir la muestra de suelo.

56

Finalmente, para el cálculo del porcentaje de materia orgánica oxidable, se emplea la siguiente fórmula:

10077,0

724,11

4000

12

2

1%

pVVMO MB

Donde: VB: Volumen de sal ferrosa gastado en el ensayo del blanco. VM: Volumen de sal ferrosa gastado en el ensayo de la muestra. p: Peso en gramos, de la muestra referido a peso de suelo seco. 1/2 : Factor considerado al ser la sal de Mohr 0,5 N. 12/4000 : Peso equivalente del carbono. 0,77 : Factor de recuperación. 100/58 (1,724): Factor de conversión de C en MO. De acuerdo al contenido en materia orgánica del suelo, se puede establecer la siguiente clasificación.

Tabla 15. Nivel deseable de materia orgánica en suelo.

Nivel Arenoso (<10% arcilla)

Franco (10-30% arcilla)

Arcilloso (>30% arcilla)

Muy Bajo 0 – 1,75 0 – 1,5 0 – 2 Bajo 1,76 – 2,50 1,5 – 2 2 – 3

Normal 2,51 – 3,50 2 – 3 3 – 4 Alto 3,51 – 4,25 3 – 3,75 4 – 5

Muy Alto >4,25 >3,75 > 5

5.2.8. Boro.


El método se basa en la reacción del boro con azometina-H, formándose un complejo de color amarillo, medible a 410 nm mediante espectrofotometría ultravioleta-visible. La azometina-H es un azocompuesto que tiene la ventaja de ser soluble en agua y tener una alta sensibilidad. Los elementos Cu, Fe, y Al interfieren en la reacción, evitándose mediante la adición de EDTA a la disolución tampón empleada.

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5.2.8.2. Material.

Material de laboratorio. - Manta calefactora. - Refrigerante. - Matraz de fondo redondo (V = 100 ml). Equipos. - Espectrofotómetro de absorción UV-VIS. - Balanza.

5.2.8.3. Reactivos.

- Dicloruro de bario (BaCl2 0,1% en agua) - Agua ultrapura. - Disolución de tampón enmascarante. - Disolución de azometina. - Disolución de patrón de boro.


Para la determinación de boro en muestras de suelo se procede del siguiente modo. Se pesa una masa de muestra (mmuestra= 2,5 g) en un matraz de fondo redondo y se adiciona un volumen de BaCl2 (V = 20 ml). A continuación, se acopla un refrigerante al matraz y la mezcla se calienta a reflujo mediante una manta calefactora. Se deja el tiempo necesario para que la mezcla hierva y tras 5 minutos más, se retira el calor y se deja enfriar. La mezcla se filtra mediante papel de filtro y la disolución obtenida se trata como una muestra de agua (2.2.4.1. pag. 8).

5.2.9. Fósforo Olsen.


El método Olsen propone extraer la fracción de fósforo disponible del suelo mediante agitación con una solución de bicarbonato sódico a pH 8,5 y carbono activo. La posterior reacción del fósforo extraído con molibdato amónico da lugar a ácido molibdofosfórico, cuya absorbancia se determina espectrofotométricamente. El método tiene la desventaja de disolver la materia orgánica, produciendo extractos coloreados, que perturban la colorimetría, lo que se corrige adicionando carbón activo.

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5.2.9.2. Material.


- Vasos de plástico. - Embudo. - Papel de filtro.

Equipos.

- Balanza. - Titrador.

5.2.9.3. Reactivos.

- Carbono activo. - Molibdato amónico.


Se prepara la disolución A: 12 g de molibdato de amonio en agua + 0,2908 g de tartrato potásico y antimonio en agua+ 148 ml de H2SO4 concentrado en 1000 ml de agua. Se mezcla todo y se enrasa hasta 2000 ml en agua. Se prepara la disolución B: 1 g de ácido ascórbico en 200 ml de disolución A.

- Extracción de Fósforo de la muestra de suelo.

Para la preparación de la muestra se pesa una masa de 2,5 g de suelo, se adicionan 0,2 g de carbón activo y seguidamente 50 ml de NaHCO3. A continuación se agita durante 30 minutos y transcurrido este tiempo se filtra con doble papel de filtro.

- Determinación de Fósforo en la muestra.

Se toma un volumen de 0,5 ml del filtrado, al que se adicionan 4,5 ml de agua y 5 ml de la disolución B. Finalmente se determina la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 700 nm. Es necesaria la preparación de un blanco, para poder corregir la absorbancia.

De acuerdo al método empleado se puede hacer la siguiente clasificación:

59

Tabla 16. Interpretación de los resultados de acuerdo al contenido en fósforo.

5.2.10. Micronutrientes (Fe, Mn, Cu, Zn).


Se basa en la extracción de los analitos con DTPA y posterior medición de la

absorbancia de los micronutrientes mediante Espectroscopía de Absorción Atómica en

Llama (FAAS).

5.2.10.2. Material.


- Vasos de plástico. - Probeta (V = 50 ml) - Tubos para FAAS. - Gradilla.

Equipos.

- Balanza. - Agitador. - Espectrofotómetro de Absorción Atómica en Llama (FAAS).

5.2.10.3. Reactivos.

- Ácido Dietilenotriaminopentaacético (DTPA). - Patrones de los elementos que se desean determinar.

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Para la determinación de micronutrientes en una muestra de suelo, en primer

lugar, ha de llevarse a cabo la extracción de estos elementos de la muestra. Para ello, se

pesa una masa de muestra (m = 20 g) y se le adiciona un volumen de DTPA (V = 40

ml). La mezcla resultante se agita durante dos horas y transcurrido este tiempo, se filtra.

Con este extracto se hacen las diluciones necesarias y se miden los micronutrientes

mediante la técnica FAAS.

5.2.11. Macronutrientes (Na, K, Ca, Mg).


Se basa en la extracción de los analitos con acetato amónico y posterior

medición de la absorbancia de los macronutrientes mediante Espectroscopía de

Absorción Atómica en Llama (FAAS).

5.2.11.2. Material.


- Vasos de plástico. - Probeta (V = 50 ml). - Tubos para FAAS. - Gradilla.

Equipos.

- Balanza. - Agitador. - Espectrofotómetro de Absorción Atómica.

5.2.11.3. Reactivos.

- Acetato amónico. - Patrones de los analitos que se desea determinar.


Para la determinación de macronutrientes en una muestra de suelo, en primer

lugar, ha de llevarse a cabo la extracción de estos elementos de la muestra. Para ello, se

pesa una masa de muestra (m = 5 g) y se le adiciona un volumen de acetato amónico (V

= 50 ml). La mezcla resultante se agita durante 30 minutos y transcurrido este tiempo,

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se filtra. Con este extracto se hacen las diluciones necesarias y se miden los

macronutrientes mediante la técnica FAAS.

5.3. Análisis de foliares.


La muestra foliar se lava con jabón sin fosfatos y se seca en estufa a 80ºC durante 24 horas. Transcurrido este periodo de tiempo, la muestra ya seca, se tritura con un molinillo convencional.

5.3.2. Nitrógeno Kjeldhal.


El procedimiento Kjeldhal es el más utilizado en la determinación del nitrógeno en suelo. El método consta de dos pasos bien definidos: a) Digestión de la muestra y b) Cuantificación del amonio. Para más información, ver la página 47, en la que se explica el método aplicado a muestras de suelo.

5.3.2.2. Material.


- Tubos de digestor. - Vasos del destilador. - Pipeta.

Equipos.

- Balanza. - Digestor Buchi. - Destilador Kjeldahl. - Titrador.

5.3.2.3. Reactivos.

- Ácido sulfúrico (H2SO4 96%). - Catalizador Kjeldahl. - Disolución de Hidróxido Sódico (NaOH 30%).

62

- Disolución de Ácido Bórico (H3BO4 2%). - Agua destilada.


Para determinar el contenido en nitrógeno se pesa una masa de muestra (m = 0,15 gr) en los tubos del digestor y se añade un volumen de H2SO4 (V = 5 ml), además de unas bolitas para favorecer la ebullición y una cucharada del catalizador Kjeldahl. Se lleva a cabo la digestión en un programa determinado del equipo Buchi.

Una vez ha concluido el programa del digestor, se lleva a cabo la destilación de la muestra mediante un destilador Kjeldhal y una vez concluida la destilación, se retira el vaso de vidrio y se determina el nitrógeno mediante el Titrador.

5.3.3. Otros ensayos: Mineralización de la muestra.


La mineralización de la muestra se basa en la obtención de las cenizas de las foliares mediante calcinación seguida de la extracción de los diferentes analitos mediante la adición de un ácido.

5.3.3.2. Material.


- Crisol de cerámica. - Vaso de plástico. - Baño de arena. - Micro-pipeta (V = 1 ml). - Matraz aforado (V = 100 ml). - Papel de filtro.

Equipos.

- Balanza. - Mufla.

5.3.3.3. Reactivos.

- Ácido clorhídrico (HCl 37 %). - Ácido nítrico (HNO3 65%).

63

- Agua destilada.


En primer lugar, se pesa una masa de muestra triturada (m = 2 g) en un crisol de cerámica y se introduce en la mufla durante 6 horas a una temperatura de 60 ºC, obteniéndose cenizas. A continuación, los crisoles se colocan en un baño de arena (T = ; t = 20 min) y se les adiciona un volumen de ácido clorhídrico (HCl 37 %; V = 6 ml). Durante el tiempo que los crisoles se encuentran en el baño de arena, es importante controlar que la muestra no se quede seca, y para ello se van adicionando pequeños volúmenes de agua destilada. Transcurrido este tiempo, los crisoles se dejan enfriar durante 2 horas. Seguidamente, a la muestra obtenida se le adiciona un volumen de ácido nítrico (HNO3 65%; V = 1 ml) y se enrasa hasta un volumen de 100 ml con agua destilada. Finalmente la muestra se filtra, empleando para ello un doble filtro de papel, y se guarda la muestra de agua obtenida. Esta muestra se trata a partir de este momento del mismo modo que cualquier muestra de agua. Los ensayos que pueden determinarse son:

- Macronutrientes: Azufre (turbidimetría), Calcio (FAAS), Fósforo (Absorción UV-VIS), Magnesio (FAAS), Potasio (FAAS), Sodio (FAAS).

- Micronutrientes: Boro, Cobre, Hierro, Manganeso, Zinc (todos determinados mediante FAAS).

6. Caso práctico.

6.1. Procedimiento experimental.

En la siguiente figura se muestra el esquema general de los pasos que sigue una muestra de agua una vez se recibe y recepciona en Biotechveg. Se trata de un esquema general, en el que se mencionan los ensayos presentados anteriormente.

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MUESTRA AGUA

1º. Conservación a

2ºC

2º. Análisis

Microbiología

3º. Análisis Físico-

químico

Filtración en rampa

Análisis

- Aerobios.

- E.Colli.

- Coliformes totales.

- Salmonella

- Listeria

Filtración

Análisis

- pH, Conductividad y Bicarbonatos

- Cloruros.

- Cloro libre y cloro total.

- Boro, nitratos, sulfatos, fosfatos,

amonio,

- Ca, Mg, Na, Fe, Mn, Zn, Cu, y K

.

Figura 5. Esquema del procedimiento experimental para análisis de muestras de agua.

6.2. Análisis de la exactitud de los métodos de análisis.

Una de las propiedades más importantes de un método analítico es que se encuentre libre de errores sistemáticos, es decir, el valor dado para la cantidad de analito debería ser el valor “verdadero”. Esta propiedad se puede comprobar al aplicar el método a una muestra estándar que contenga una cantidad conocida de analito. Sin embargo, los errores aleatorios no permiten que la cantidad medida sea exactamente igual a la cantidad conocida incluso aunque no hubiera error sistemático. Para decidir si la cantidad medida y la cantidad conocida se puede justificar por estos errores

65

aleatorios, puede aplicarse una prueba estadística que se denomina prueba de significación. Como su nombre indica, esta aproximación prueba si son significativas las diferencias entre los dos resultados, o si se pueden justificar solo por variaciones aleatoria.

Con el fin de comprobar la exactitud de los resultados obtenidos en los ensayos realizados en la empresa Biotechveg, se lleva a cabo la determinación de la concentración de diversos analitos en una muestra de agua mineral “Manantial Fuente del Arca”, y posterior comparación de los resultados obtenidos con los indicados por el fabricante. La siguiente fotografía muestra la etiqueta del envase con algunos de los parámetros estudiados. El resto de parámetros estudiados se han encontrado en la página web de la empresa que dispone del agua.

Fotografía 32. Etiqueta del envase de la muestra de agua mineral analizada.

En la siguiente tabla se muestran los resultados obtenidos en el laboratorio para diversos analitos (resultados experimentales), así como los consultados en la etiqueta de la botella (resultados teóricos).

Tabla 17. Comparación de resultados obtenidos para una muestra de agua mineral “Manantial Fuente del Arca” con los valores teóricos.

Análisis Resultados teóricos Resultados experimentales

pH 7,61 7,47 ± 0,06

Conductividad (μS/cm) 277 274 ± 15

Bicarbonatos (ppm) 302,0 292 ± 7

Cloruros (ppm) 1,4 1,50 ± 0,09

Nitratos (ppm) 1,4 1,35 ± 0,12

Sulfatos (ppm) 5,0 4,8 ± 0,7

Calcio (ppm) 66,0 68 ± 3

Magnesio (ppm) 19,6 20,0 ± 0,3

Sodio (ppm) 1,0 1,1 ± 0,4

Para decidir si la diferencia entre μ (valor teórico) y xmedia (valor experimental) es significativa se calcula la “t de Student” de acuerdo a la siguiente ecuación:

s

nx

Donde: μ: Valor teórico. x : Valor determinado experimentalmente.

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n: Número de muestras. s: Desviación estándar.

Si t es mayor que un cierto valor crítico, entonces se rechaza la hipótesis nula.

El valor crítico de t para un nivel de significación concreto se encuentra en la tabla 21

(Anexo II).

Mediante la realización del contraste estadístico t se comprueba si bajo una cierta probabilidad existe una diferencia estadísticamente significativa entre ambas variables. La hipótesis nula planteada es H0: No existe diferencia estadísticamente significativa entre ambos valores (95 % de probabilidad), es decir, no hay errores sistemáticos. En la siguiente tabla se muestran los resultados obtenidos en el contraste estadístico para los diferentes parámetros estudiados (ttab (n: 3, 95%): 4,30).

Tabla 18. Aplicación del test estadístico “t de Student”.

Análisis t calculada Resultado Error Sistemático

pH 1,49 tcalc < ttab No

Conductividad (μS/cm) 1,88 tcalc < ttab No

Bicarbonatos (ppm) 10,21 tcalc > ttab Si

Cloruros (ppm) 0,89 tcalc < ttab No

Nitratos (ppm) 0,39 tcalc < ttab No

Sulfatos (ppm) 0,63 tcalc < ttab No

Calcio (ppm) 4,16 tcalc < ttab No

Magnesio (ppm) 2,20 tcalc < ttab No

Sodio (ppm) 0,42 tcalc < ttab No

Como se muestra en la tabla, la aplicación de contraste de significación indica

que bajo una probabilidad del 95 %, existe una diferencia estadísticamente significativa

entre los dos valores comparados. Esto se debe a errores sistemáticos ocurridos durante

la realización del ensayo, bien por parte del operador, equipo o demás factores que

puedan intervenir. Debido a la limitación de tiempo, el ensayo no pudo repetirse.

Para el resto de métodos estudiados, puede afirmarse que la exactitud de los

mismos es correcta.

7. Valoración personal.

A lo largo de este mes y medio de prácticas en la empresa Biotechveg he realizado análisis de muchas muestras y de muy diversas matrices. Como se ha podido ver a lo largo del trabajo, he analizado parámetros físicos, químicos y microbiológicos de distintas muestras de aguas de riego, de suelos y de alimentos. Todas tienen una característica especial al tratarse de matrices muy distintas, por lo que en este aspecto, el trabajo a pesar de ser repetitivo me ha resultado ameno. He podido conocer los

67

distintos departamentos de la empresa lo que me ha permitido profundizar en el aprendizaje de las distintas técnicas analíticas. Además, todos los laboratorios constaban de tecnología muy novedosa que hacía más llevadero el trabajo rutinario. El ver cómo se trabaja en un laboratorio analítico fuera de la universidad aumenta mi satisfacción de orientar mi carrera a este ámbito de la química, a la vez que me doy a conocer en este tipo de empresas. Por último, comentar que me hubiera agradado (y creo que hubiera aprendido aun mas) poder participar en algún proyecto de investigación durante el periodo de prácticas. No obstante, la empresa Biotechveg no trabaja en investigación, limitándose a realizar análisis de rutina diarios, lo que ha provocado que las prácticas no me resultaran del todo interesantes. Para acabar, dar las gracias a la empresa Biotechveg, en especial a los miembros del laboratorio que han compartido conmigo este periodo y me han ayudado cuanto han podido; a la Universidad de Alicante que ha llevado a cabo la gestión del convenio de prácticas y a mi tutora Nuria Boluda, por la ayuda prestada.

8. Bibliografía.

- Marín García, M.A. y otros; Análisis químico de suelos y agua: Manual de

laboratorio; editorial Universidad Politécnica de Valencia.

- Juárez Sanz, M. y otros; Diagnóstico del potencial nutritivo del suelo; Publicaciones Universidad de Alicante.

- Diversas PNT (Procedimientos Normalizados de Trabajo).

- http://www.utadeo.edu.co/comunidades/estudiantes/ciencias_basicas/analitic

a_instrumental/guia_3_1.pdf.

- http://www.aguadebeteta.es/agua-beteta.htm.

- Miller J.C. ; Estadística para Química Analítica; 2ª edición; Adisson-Wesley Iberoamericana.

- Apuntes Máster Universitario en Gestión Sostenible y Tecnologías del Agua;

Módulo 2: Calidad de las Aguas; Profesor: Pedro Varó.

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ANEXO I

Tabla 19. Alcance del método multirresiduos empleado en Biotechveg.

Acefato Aclonifen Acrinatrina

Alacloro Atrazina Benalaxil

Benfluralina Bifentrina Bromacilo

Bromopropilato Bupirimato Buprofecina

Cadusafos Carbofentión Ciflutrin

Cipermetrina Ciproconazol Ciprodinilo

Clofentezina Clorfenvinfós (suma de isómeros) Clorpirifos

Clorpirifós-metilo Clorprofam Clortal Dimetil

Clorotalonil Clozolinato DDT

Deltametrín Diazinon Diclofuanida

Dicloran Diclorvos Dicofol(suma isómeros)

Dieldrín (+ Aldrín) Dietofencarb Difenoconazol

Dimetoato (+ Ometoato) Dimetomorf (suma de isómeros) Diuron (+ Linuron)

Endosulfan (α+β+Sulfato) Endrin (+ D-cetoendrín) Etalfluralina

Etión Etofenprox Etoprofos

Etridiazol Famoxadona Fanamifos

Fenarimol Fenazaquina Fenhexamida

Fenitrotion Fenpropatrin Fention

Fentoato Fluazifop-P-butil Fludioxonil

Folpet (Folpet+Captan) Fosalon Fosmet

HCH (Alfa+Beta+Delta) Heptacloro (+ epóxido) Hexaconazol

Imazalil Iprodiona Kresoxim- Metilo

Lambda-Cihalotrina Lindano Malation

Mecarbam Matanipirima Metalaxilo

Metamidofós Metazacloro Matidation

Metoxicloro Metribucina Miclobutanil

Molinato Napropamida Norflurazon

Nuarimol Ofurace Ortofenilfenol

Oxadixilo Oxifluorfen Paration-Metilo

Penconazol Pendimetalina Permetrin (+ isomeros)

Pirazofós Piridaben Piridafention

Pirifenox Pirimetanil Pirimicarb

Pirimifós-metil Piriproxifen Procimidona

Procloraz Prometrina Propargita

Propizamida Quinalfos Quinometionato

Simacina Tau-Fluvalinato Tebuconazol

Tebufenocida Tebufenpirad Terbacilo

Terbumetona Terbutilacina Terbutrina

Tetraconazol Tetradifón Tetrametrin

Tolilfluanida Tralometrina Triadimefon

Triadimenol Triazofos Triclorfon

Triflumizol Trifluralina Vinclozolina

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Tabla 20. Alcance del método multilíquidos empleado en Biotechveg.

Abamectina Acetamiprid Aldicarb (+sulfóxido+sulfota)

Aldicarb sulfota

(+Aldicarb+sulfóxido)

Aldicarb sulfóxido (+sulfona+aldicarb)

Ametrina

Amitraz Azadiractina Azinfos Metil

Azoxistrobina Benalaxil Bitertanol

Boscalida Bromacilo Butocarboxim(+butoxicarboxim)

Butóxido de Piperonilo Carbaril Carbendazima

Carbofurano Carbofurano 3-ceto Carbofurano 3-OH

Carfentrazona-etilo Ciazofamida Cicloxidim

Cimoxanilo Ciproconazol Ciprodinil

Cietodim Clofentezina Clorantranilipol

Demeton S-metil Sulfóxido Desmedifan Diclorvos

Dietofencarb Difenoconazol Diflufenical

Dimetoato (+ Ometoato) Dimetomorf (+ isómeros) Diuron (+ Linuron)

Emamectina Benzoato Epoxiconazol Espirodiclofeno

Espiromesifeno Etiofencarb Etofenprox

Etoprofos Etoxazol Famoxadona

Fenamifos Fenazaquina Fenbuconazol

Fenhexamida Fenmedifam Fenoxicarb

Fenpiroximato Fenpropidina Flonicamid

Fluazifop-P-butil Flubendiamida Fludioxonil

Flufenoxuron Flutriafol Hexitiazox

Hidrametilnon Imazalil Imidacloprid

Indoxacarb Isoxaben Linuron

Lufenuron Macarbam Mapanipirina

Metaflumizona Metalaxilo-M Metamidofos

Metiocarb Metomilo Metoxifenocida

Metoxuron Miclobutanil Omeoato

Oxadiazon Oxadixilo Oxamil

Paclobutrazol Pencicuron Pimetrozina

Piraclostrobina Pirimetanil Pirimicarb

Procloraz Propamocarb Propargita

Propiconazol Propoxur Quizalofop-P-etil

Rotenona Simazina Spinosad (A+D)

Spiroxamina Tebuconazol Tebufenocida

Tebufenpirad Teflubenzuron Terbufos

Tiabendazol Tiacloprid Tiametoxan

Tiodicarb Tiofanox (+sulfona+sulfóxido) Tiofanox sulfona

(+tiofanox+sulfóxido)

Tifanox sulfóxido (+tiofanox+sulfona)

Triadimefon Triadimenol

Tridemorfo Trifloxistrobina

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ANEXO II

Tabla 21. Valores tabulados de la t de Student según el intervalo de confianza.

Documents

BIOTECHVEG, LABORATORIOS DE ANÁLISIS … · hueco para la determinación de Ca y Mg en muestras de agua. ..... 18 Tabla 10. Longitud de onda emitida por la Lámpara de Cátodo