Biotecnología e Ingeniería Genéticacronos.unq.edu.ar/ibcm/clases/2008a/clase2_inggenetica.pdf · Mejoramiento vegetal por cruzamiento y selección “Genética Clásica” Cdk

Biotecnología e Ingeniería Genética

Universidad Nacional de Quilmes

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“BIOTECNOLOGÍA”

Definición: Biotecnología es la utilización de los seres vivos y/o sus derivados para la generación

de productos o servicios.

Para ello se requieren los conocimientos de todas las grandes áreas científicas: Microbiología, Biología General y Molecular, Ing. Química, Química Orgánica, Bioquímica, Fisicoquímica, Matemática, Física, Informática, etc.



¿Seres vivos?

Bacterias

Levaduras

Animales

Hongos

Vegetales

Organismos unicelulares

Organismos multicelulares

Virus



Biotecnología clásica

Biotecnología moderna

Utiliza a los seres vivos tales como se los encuentra en la naturaleza... Solo incluye mejoras de organismos por genética clásica.

A partir de las técnicas de Ingeniería

Genética podemos modificar a los

organismos y sus partes para sacarles

mayor provecho.



Mejoramiento vegetal por cruzamiento y selección“Genética Clásica”

Cdk Cdk sdnr hmsdsdnr hmsd ` k ` k l ` Áyl ` ÁyLycopersiconesculentum

Lycopersiconperuvianum

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Biotecnología clásica

Productos de Fermentación en alimentos:- Etanol: cerveza, vino, sidra, ron, etc.- Ácido Láctico: yogurt, ricota, leche cultivada.- CO2: panificación.- Ácido acético: vinagre.

Otros productos más recientes en la historia:- Aminoácidos- Ácido cítrico- Gas metano

Servicios:- Depuración de residuos cloacales.- Biorremediación- Biolixibiación.- Biofiltros



Biorreactores“El caldo de cultivo”

IngredientesMicroorganismo

Temperatura Nutrientes

OxígenoAgua

Mezclar y esperar!



Biotecnología moderna

tRNA

mRNA

rRNA

DNA



Procariotas vs eucariotas

Genoma de E. Coli 1,2 Mb

Genoma de un mamífero 3 Gb



Hibridación del DNA



Temperatura de melting



sondas

Oligonucleótido de simple cadena, marcado y secuenciado



Electroforesis: ADN y ARN

Geles de:

- Agarosa

- Poliacrilamida

Permite separar las moléculas de DNA y RNA por tamaño



Electroforesis: ADN y ARN



Transferencia Southern



Transferencia Southern



Transferencia Northern



Southern blot y el análisis de

identidad



Hibridación in situ

Sonda radiactiva anti mRNA del gen ftz



Microarray



Método químico: “Maxam y Gilbert”

Secuenciación de DNA






Método enzimático: “Sanger”

2’-3’ dd NTPs













Ciclos:

-Desnaturalización92-95 ºC

- Hibridación35 – 60 ºC

- Polimerización72 ºC

Ingredientes:Ingredientes:- Buffer específico - DNA molde- Primers- dNTPs- TAQ - Mg++

Objetivo. Obtener múltiples copias de una determinada secuencia de DNA a partir de unas pocas

“PCR” Reacción en cadena de la polimerasa







PCR en medicina forense

VNTR: variable number of

tandem repeat

...GTGTGT...



Enzimas en la tecnología del DNA



“ER” Endonucleasas de Restricción

Ext. Romos

Ext. Cohesivo 3’ protruyente

Ext. Cohesivo 5’ protruyente

En general reconocen secuencias palindrómicas



“ER” Endonucleasas de Restricción



DNA ligasa



RFLP: Polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción.



Mapa de restricción



Vectores de Clonado

Componentes mínimos:- Origen de replicación.- Gen marcador de selección.- Sitios de restricción: “polylinker”http://image.llnl.gov/image/html/vectors.shtml#pcDNA3.1


http://image.llnl.gov/image/html/vectors.shtml#pcDNA3.1


Plásmidos: 3 y 10 kb; aceptan insertos de hasta 10 kb.



Agregar mas vectores





Fagos: 50 kb; aceptan 15 kb



- Cósmidos: híbrido plásmido-fago L; 35-40 kb- Fásmidos: híbrido plásmido- fago M13.- Cromosomas artificiales “BACs”, “PACs” y “YACs”100 a 500 kb

OTROS TIPOS DE VECTORES:



VECTORES DE EXPRESIÓN:

Vector de expresión en eucariotas Vector de expresión en procariotas



Transfección de DNA a una célula huésped

TransformaciónDNA desnudo

Inyección de DNAElectroporaciónCañón génicoCalor – Cl2CaLipofectamina

policationes - PEI

Transducciónfagos lambda

Conjugaciónplásmidos \ célula-célula

bacteria-bacteriaagrobacterium









Paso a paso...



Genotecas

Biblioteca Genómica

Biblioteca de cDNA





Transcriptasa Reversa “RT”



screening

PCR

Hibridación

RFLP

Actividad EZ

Anticuerpos



OGMs o Transgénicos

Modificación del genoma de un organismo

- Recombinación homóloga.- Transposones.- Inserción al azar.

Knock-in y knock- out



RNA antisentido o RNAi Knock-in y knock- out



Biotecnología Vegetal



Tabaco transgénico: GFP



Biotecnología Animal en Argentina

BIOSIDUS y Pampita

PROYECTO TAMBO FARMACEUTICO

2002 Nacen Pampa, primera ternera clonada de Latinoamérica y Pampa Mansa, portadora del gen de hormona de crecimiento.

2004 Nacen Pampa Mansa II y III primeros clones de transgénicos.

2004 Nace Pampero, primer transgénicovacuno macho, perpetuador del Tambo Farmacéutico.

http://www.sidus.com.ar/web/biosidusweb.nsf/?Open


http://www.sidus.com.ar/web/biosidusweb.nsf/?Open


http://www.argenbio.org/h/biotecnologia/11.php

Biotecnología vegetal en Argentina


http://www.argenbio.org/h/biotecnologia/11.php


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Proceso de autorización y puesta en el mercado de materiales que hayan pasado por las manos de la ingeniería genética.

1. CONABIA(Comisión Nacional de Biotecnología Agropecuaria)Analiza los potenciales impactos de los organismos genéticamente modificados sobre el medio ambiente.

2. SENASA(Servicio Nacional de sanidad y calidad agroalimentaria)Evalúa la inocuidad alimentaria para consumo humano y animal.

3. Dirección Nacional de Mercados AgroalimentariosEvalúa el potencial impacto sobre los mercados de exportación.

Proceso de Bioseguridad Nacional



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Trabajo práctico 1 y 2

Extracción de DNA plasmídico a partir de bacterias.Miniprep - hidrólisis alcalina

Cuantificación y análisis de pureza del DNA

Chequeo del extracto por electroforesis en gel de agarosa




Extracción de DNA plasmídico a partir de bacteria.Miniprep - hidrólisis alcalina

Soluciones necesarias:Solución 1: Tris 10 mM, EDTA 25 mM, pH 7,5.Solución 2: glucosa 40 mM, EDTA 10 mM (pH 8,0), Tris HCl25 mM (pH 8,0).Solución 3: NaOH 0,2 N, SDS 1% (w/v). Preparar en el momento de usar.Solución 4: Kac 3M + Hac, pH 4,8. Mantener a 4 ºC.




Cuantificación y análisis de pureza del DNA



Chequeo del extracto por electroforesis en gel de agarosa




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