Técnicas electroforéticas

Electroforesis de ácidos nucleicos (secuenciación)

Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimación de su concentración y grado de entereza. Podemos además extraer del gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones.

La electroforesis en geles de agarosa es el método estándar para separar y purificar fragmentos de ADN cuando no requerimos un alto poder de resolución. Por su parte, la electroforesis en geles de poliacrilamida, aunque tiene una mayor limitación en cuanto al tamaño de los fragmentos que podemos separar (5-600 pb), posee un poder de resolución mucho mayor.

-gel de agarosa: para moléculas grandes (100 pb a 60000 pb, que en realidad es hasta 30000 pb). Se hace horizontal.

-gel de poliacrilamida: moléculas pequeñas(6 a 2000 pb). Se hace vertical. Permite ver cada 1 base.

Pulse fiel : “Electroforesis de campo cruzado” Para separar DNA cromosómico (millones pares de bases). Como hay mucha masa se deforman los fragmentos puestos en el gel siendo inútil su visualización. Entonces se utiliza esta técnica, donde el campo tiene 24 electrodos (no dos como la electroforesis básica) y un microprocesador que va cambiando la dirección de carga entre los electrodos.

Gel shift: “retraso en gel” el ensayo de cambio en la corrida electroforética o EMSA por sus iniciales en inglés (electrophoretic mobility shift assay) es una técnica utilizada para investigar interacciones entre proteínas y ADN o ARN. La técnica se basa en una corrida electroforética entre fragmentos de DNA o RNA marcados y la presencia de extractos celulares. El ensayo básico para el ADN consiste en un carril solo con el fragmento de ADN de interés marcado, un segundo carril con el mismo ADN más proteínas que, en las condiciones dadas, no interaccionan con el mismo, y el tercer carril conteniendo el mismo fragmento de ADN más las proteínas con supuesta interacción con esa secuencia. Dependiendo del resultado del tercer carril se puede determinar si existió o no interacción. Un fragmento de ADN interaccionando con proteínas tiende a recorrer menos distancia a través del gel en el mismo tiempo que en los carriles 1 o 2, y por lo tanto se debería ver retrasado.

Hibridación de ácidos nucleicos:

La hibridación es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de dos monocatenarios usando la complementariedad de bases.Cuando una solución de DNA que ha sido calentada se enfría lentamente se produce la rehibridación dando lugar a la estructura inicial. Tal reasociación ocurre sólo si las secuencias de bases son complementarias. Por lo tanto, la hibridación permite la formación de complejos bicatenarios no naturales de DNA:DNA y ADN:ARN. Este es un método muy versátil que permite estudiar el grado de relación genética entre dos ácidos nucleicos. También permite la detección de fragmentos de DNA que son complementarios a fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas). Por ejemplo, se puede utilizar una sonda radioactiva para saber si en una mezcla desconocida existe algún fragmento complementario a la sonda. Para ello se usan membranas de nitrato de celulosa o de nilón.

Sondas de hibridación

Con los conocimientos que existen de los genomas de los organismos, cada vez es más sencillo generar pequeños fragmentos de DNA (oligonucleótidos) que sean complementarios de regiones que nos interesan, por ejemplo de genes específicos de una especie bacteriana. De esta forma, si en una muestra problema se produce la hibridación entre el

oligonucleótido y el DNA presente en la muestra, se puede concluir que la bacteria de interés estaba presente en esa muestra. A estos fragmentos de DNA se les denomina sondas.

Marcaje de los ácidos nucleicos. (sondas)

La radioactividad se usa en la investigación de ácidos nucleicos porque puede ser detectada en cantidades muy pequeñas. Los ácidos nucleicos radioactivos pueden detectarse directamente en un contador de radioactividad o bien indirectamente sobre una placa fotográfica (autoradiografía).

Un ácido nucleico puede hacerse radioactivo simplemente por la adición de fosfato radioactivo (fósforo 32) durante su síntesis. Así, si se añade fosfato radioactivo al medio de cultivo cuando está teniendo lugar la síntesis de DNA, el nuevo DNA será radioactivo.

32P3 -------> 32P-nucleótido -------> 32P-ácido nucleico

Alternativamente, se puede marcar radioactivamente el extremo 5' de una cadena de DNA usando ATP radioactivo marcado en el tercer fosfato.

El enzima polinucleótido quinasa quita específicamente el tercer fosfato del ATP y lo une al grupo hidroxilo 5' del ADN (El fosfato 5 ' es quitado por un fosfatasa).

32P -P-P-adenosina + HO-desoxiribosa-DNA -------> ADP + 32P -O-desoxiribosa-DNA

Actualmente existen diversas alternativas no radiactivas para marcar las sondas, como puede ser el uso de enzimas (peroxidasa o fosfatasa, que llevan a cabo una reacción detectable), marcadores de afinidad (biotina o digoxigenina, que se van a unir posteriormente a otra molécula) o moléculas quimioluminiscentes (que producen luz y puede excitar una película fotográfica).

La molécula marcadora se puede incorporar a la sonda mediante distintas técnicas:

-Unión al azar ("random priming"). Consiste en copiar un fragmento de DNA utilizando una DNA polimerasa y añadiendo a la reacción algunos nucleótidos marcados; se incorpora un nucleótido marcado cada 20-25 bases.

-Marcado por relleno ("nick translation"). Se realizan cortes enzimáticos ("nicks") en el DNA y después se reparan con una DNA polimerasa utilizando nucleótidos marcados.

-Marcado en 3'. Se añade un único nucleótido marcado en el extremo 3' empleando una transferasa terminal.

-Marcado extendido en 3' ("3' tailing"). Similar a la técnica anterior, pero se añade una cadena sencilla de 10-50 bases en el extremo 3'.

-Marcado en 5'. Se pueden marcar las sondas en el extremo 5' durante su síntesis química.

-Marcado de RNA. Se usan una RNA polimerasa y nucleótidos marcados para que se transcriba un fragmento de DNA, dando lugar a un RNA marcado.

-Marcado por PCR. Se lleva a cabo una PCR (ver más adelante) empleando nucleótidos marcados para amplificar un fragmento de DNA.

-Marcado por fotoactivación. Se une un marcador covalentemente al DNA mediante exposición a la luz UV.

Concepto de Tm y cot

La temperatura de fusión: TmCuando la temperatura alcanza el punto de fusión del ADN, la agitación térmica es capaz de separar las dos hebras y producir una desnaturalización. Este es un proceso reversible, ya que al bajar la temperatura se puede producir una renaturalización. En éste proceso se rompen los puentes de hidrógeno que unen las cadenas y se produce la separación de las mismas, pero no se rompen los enlaces fosfodiéster covalentes que forman la secuencia de la cadena.

Las moléculas bicatenarias absorben menos que las monocatenarias en el ultravioleta. Por tanto, si se va observando la absorción a medida que se calienta un ADN bicatenario, el incremento en absorbancia cuando el ADN bicatenario se convierte en monocatenario nos indicará la temperatura de fusión (Tm; del inglés melting temperature). Tm, está en función del contenido en GC del ADN en cuestión, ya que los pares de bases GC se unen por 3 puentes de hidrógeno, mientras que AT sólo por dos. Cuanto mayor sea el contenido en GC mayor será la temperatura de fusión. Si el ADN calentado se enfría lentamente, la doble cadena vuelve a formarse (el ADN se renaturaliza). Esto permite realizar hibridaciones con cadenas de DNA procedentes de fuentes distintas.

Curvas Cot: sirven para estimar la complejidad de los genomas. Se entiende por complejidad a la composición, con respecto a la frecuencia de secuencias de ADN repetitivas. La técnica se basa en el calentamiento y post enfriado de la hebras de adn. Durante este proceso la doble hélice se separa al alcanzar una determinada Tm. Al enfriarse se vuelven a unir. La velocidad con la que esto ocurra, se relaciona con la mayor o menor complejidad de la secuencia.

TRANSFERENCIA (BLOTTING)

La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:

Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda. “Es una técnica empleada para detectar secuencias específicas de ADN. Para llevar a cabo hibridaciones de este tipo, se aísla el ADN de un tejido o línea celular, luego se purifica, y se digiere con enzimas de restricción específicas. Los fragmentos generados se separan mediante electroforesis y después son transferidos a la membrana que sirve de soporte (gel de agarosa). Este proceso se lleva a cabo colocando el gel de agarosa sobre papel filtro previamente remojado en una solución llamada de transferencia (solución salina concentrada). A continuación se sitúa la membrana sobre el gel y encima de esta una pila de papel filtro seca, y por capilaridad la solución de transferencia es atraída a la pila de papel filtro, arrastrando consigo al ADN hacia la membrana, donde queda inmovilizado conservando la misma posición relativa que ocupaba en el gel. Luego, el ADN puede ser hibridado en la membrana con una sonda.”

Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda

Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar.

Dot blot y slot blot: Son procederes similares al Northern con la diferencia de que el ARN no es sometido a electroforesis sino que se sitúa directamente sobre la membrana. Este tipo de análisis requiere de un molde asociado a succión con vacío para colocar el ARN que puede producir círculos o puntos (dot blot) o hendiduras (slot blot). Este tipo de prueba es muy útil cuando se quieren estudiar gran número de muestras, pero tienen la limitante de no ofrecer información sobre el tamaño de las bandas del ARN hibridado

MÉTODOS CLÁSICOS DE SECUENCIACIÓN

Los dos protocolos clásicos de secuenciación (método químico y enzimático) comparten etapas comunes.

Pasos: marcaje, tratamiento (secuenciar, fragmentos que se cortan dependiendo de las bases), ruptura, separación, visualización y análisis.

Marcado: Es necesario marcar las moléculas a secuenciar radiactiva o fluorescentemente

Separación: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN marcadas cuyos tamaños se diferencian en una única base. Estas cadenas de distintas longitudes pueden separarse por electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen como una escalera de bandas cuya longitud varía en un único nucleótido.

Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:

Método químico de Maxam y Gilbert

Esta técnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas radiactivamente con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, por electroforésis, en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radiactivas obtenidas. Solo se usa con ADN simple cadena. No se puede secuenciar con RNA.

Método enzimático de Sanger

Este método de secuenciación de ADN fue diseñado por Sanger, Nicklen y Coulson también en 1977 y se conoce como método de los terminadores de cadena o didesoxi.

Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador (se puede marcar o no) o "primer" complementario de una región del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN. Se necesitan 4 tubos con A C G T y el deoxinucleotido trifosfato marcado con florocromo.

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMÁTICO

Es una alternativa al método de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador o los terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reacción de secuencia. Los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforésis al pasar por delante de un láser que al excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia emitida.

Secuenciación empleando cebadores fluorescentes

Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se añade el oligonucleótido o cebador marcado con una sonda fluorescente distinta y un ddNTP diferente en cada una de ellas. Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un único tubo.

Secuenciación empleando terminadores fluorescentes

Se realiza una única reacción de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta.

Hibridacion de moléculas y sus variantes

Marcadores moleculares. (RFLP, MAAPs, AFLP)

RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción). Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la detección de fragmentos de DNA de distinto peso molecular (por digestión con la misma enzima de restricción) en diferentes organismos. Los fragmentos más fáciles de analizar son los pequeños derivados de la digestión del genoma de las mitocondrias o los cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o mutaciones pueden alterar significativamente el patrón de bandas identificable por electroforesis en geles de agarosa, donde migran de acuerdo con su peso molecular. En cambio, para moléculas de DNA de mayor tamaño, como el DNA cromosómico, el patrón de bandas es tan complejo que es necesario utilizar sondas específicas para visualizar sólo ciertos fragmentos mediante la técnica de Southern Blot. Las sondas de DNA para esta técnica suelen corresponder a genes previamente conocidos, aunque a veces se usan DNA preparados a partir de amplificaciones inespecíficas. Aunque la RFLP evalúa sólo un tipo de polimorfismo en cada ensayo, el resultado es muy preciso. Los primeros mapas genómicos basados en la distribución física de los genes en vez de la frecuencia de entrecruzamiento se hicieron utilizando esta técnica. Cuando se emplea la PCR en lugar de sondas radiactivas para visualizar los polimorfismos, se le denomina PCR-RFLP

MAAP ( Múltiples perfiles arbitrarios de amplificación ) Término genérico acuñado en 1994 con el que se designan las técnicas que emplean oligonucleótidos arbitrarios para generar huellas dactilares complejas. Entre estas técnicas caben destacar:

AFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados): Combinacion dde RFLP Y PCR.Esta técnica se desarrolló en 1995 y combina el uso de enzimas de restricción y oligonucleótidos para PCR, de manera que se obtienen marcadores moleculares muy específicos sin necesidad de conocer la secuencia con anterioridad. El DNA se corta con dos enzimas de restricción, una de corte muy frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los fragmentos se les ligan oligonucleótidos de extremos compatibles con las enzimas usadas.y se amplifica por PCR. Jugando con la complementariedad del oligonucleótido con el sitio de restricción se puede disminuir o aumentar el número de bandas amplificadas. Una ventaja especial de esta técnica es que es capaz de generar muchos marcadores moleculares en una sola reacción. Por eso el resultado debe resolverse en un gel de poliacrilamida de alta resolución, puesto que no se resolverían en agarosa. Esta técnica ya se ha usado con éxito en patatas y cebada.

RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar) 13 a 15 nucleotidos, DAF 5 a 8 nucleot., AP-PCR 25 a 30 nucleot.

Estas usan primers al azar y PCR. Se diferencian por el largo de los oligonucleótidos.

PCR

COMPONENTES DE LA PCR

-Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs). Es una mezcla de deoxi nucleótidos que sirve de sustrato para la síntesis de nuevo ADN.

-Iniciadores (primers). Dos oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre 10-30 nucleótidos, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Deben estar enfrentados (uno en cada hebra del ADN), para delimitar el fragmento a amplificar).

-ADN polimerasa. El descubrimiento en 1976 de la Taq polimerasa, una ADN polimerasa extraída de la bacteria termófila Thermus aquaticus que habita medios de muy alta temperatura (50-80 °C), eliminó los grandes inconvenientes del método de la PCR. Esta ADN polimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendo activa hasta después de la desnaturalización del ADN

-ADN molde. Molécula que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

ETAPAS DE LA PCR

La PCR consiste en una serie de cambios repetidos de temperatura llamados ciclos. Por lo general el número de ciclos es de 20 a 30, cada ciclo consiste en tres cambios de temperatura. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo, dependen de algunos parámetros en los que se incluye, la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y dNTPs en la reacción así como la temperatura de unión de los iniciadores

DESNATURALIZACIÓN DEL ADN: En la primera etapa, la reacción es llevada a una temperatura de 94-96ºC y se mantiene entre 30 segundos y un minuto. A estas temperaturas el ADN se desnaturaliza (se separan las dos hebras que lo constituyen). La temperatura a la cual se decide llevar a cabo esta etapa va a depender de la proporción de Guanina-Citocina (G-C) que tenga la hebra, así como también del largo de la misma.

ALINEAMIENTO/UNIÓN DEL INICIADOR A LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA: En la segunda etapa también conocida como hibridación, los iniciadores se unen a las regiones 3`complementarias que flanquean el fragmento que se quiere amplificar. Para ello, es necesario bajar la temperatura a 50-65ºC durante 20-40 segundos, permitiendo así el alineamiento. La polimerasa se une entonces al hibrido formado por la cadena molde y el iniciador y empieza la síntesis del ADN. Los iniciadores actúan como límite de la región de la molécula que va a ser amplificada.

EXTENSIÓN/ELONGACIÓN DE LA CADENA: En la tercera etapa, la polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementario a la hebra molde, añadiendo los dNTPs complementarios en dirección 5`• 3` uniendo el grupo 5`-fosfato de los dNTPs con el grupo 3`-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente. La temperatura en esta etapa depende de la ADN polimerasa que se utilice. Para la Taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad está entre 74-80ºC, aunque por lo general se usa 74ºC. El tiempo de elongación va a depender del tipo de polimerasa empleado, así como también del tamaño del fragmento de ADN que se requiere amplificar.

ELONGACIÓN FINAL: En la cuarta etapa, la temperatura es regulada de 70-74ºC durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR, con el objeto de asegurar que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente amplificado.

Por último, el producto amplificado es mantenido a una temperatura de 4ºC por un periodo indefinido lo cual permite conservar el producto de la reacciónPara comprobar que la PCR ha generado el fragmento de ADN esperado, se emplean técnicas como la electroforesis, que permite separar los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su tamaño. Por lo general se emplea la electroforesis en gel de agarosa para fragmentos grandes, en acrilamida para fragmentos más pequeños y asociada a marcaje fluorescente así como la electroforesis capilar3, 4

La detección del producto de la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza normalmente mediante una corrida electroforética. Dependiendo del tamaño del producto de la amplificación y la resolución que se desea, se utilizan diferentes matrices de separación (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio con una lámpara de luz UV, tinción de plata, fluorescencia o radioactividad.

De igual forma, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridación (unión complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases esté contenida en el fragmento de interés.

Los tamaños de los productos de PCR se determinan comparando los mismos, con marcadores que contienen fragmentos de ADN de tamaño conocido los cuales se corren en el gel junto a los productos de PCR.

VARIANTES:

PCR TIEMPO REAL: Es una reacción de PRC cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original(ES CUANTITATIVA). Se puede dividir en:

a-Técnica basada en fluorocromos no específicos.

b-Técnica basada en sondas específicas.

En las técnicas basadas en fluorocromos no específicos, el ADN se une al fluorocromo (por lo general SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por un termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción, pero tiene la ventaja de utilizar iniciadores normales para su realización. Es mucho más económica que la PCR que utiliza sondas específicas.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el iniciador directo (forward) y el inverso (reverse). Cuando la sonda esta intacta, presentan una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha fluorescencia no se produce cuando la sonda esta dañada y los dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5`3`exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio de patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.

HOT START: la reacción incia cuando se alcanza una determinada temperatura. Suele estar mediada por la interaccion de un anticuerpo sobre la polimerasa.

L PCR: long pcr se agrega enzima con actividad correctora.

PCR ANIDADA: se realiza una segunda reacción de PCR con primers que hibriden dentro del fragmento ya amplificado por el primer par.

PCR INVERSA: en lugar de amplificar la región interna, se amplifica la región externa a los primers no conocidos, primero se corta el DNA con extremos cohesivos, luego de la circularizacion se liga y se procede a la PCR normal.

PCR con ADAPTADORES: para amplificar secuencias desconocidas se corta un fragmento de ADN con extremos pegajosos, se agregan los adaptadores, se ligan y luego se añaden primers que se unen a los extremos 3´de los adaptadores.

PCR ASIMETRICA: se generan copias de una de las hebras, se añaden cantidades diferentes de ambos primers. En el tiempo uno de ellos se agota, asi solo una de las hebras sigue amplificándose.

Mutagénesis de sitio dirigido

La mutagénesis de sitio dirigido, también llamada mutagénesis dirigida, es una técnica de biología molecular utilizada para crear mutaciones puntuales en una cadena deADN.

La técnica fue desarrollada por primera vez en 1978 por el científico Michael Smith, al cual le concedieron el Premio Nobel de Química en octubre de 1993 junto a Kary B. Mullis, el creador de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, acrónimo del inglés polimerase chain reaction). Un requisito indispensable para el uso de esta técnica es que se debe conocer la secuencia de ADN que se quiere mutar.

El proceso, en primer lugar, requiere sintetizar un fragmento corto de ADN, el cebador, que contenga la mutación. El cebador debe hibridar con la molécula simple (unicatenatenaria) de ADN que contiene el gen de interés. Utilizando una ADN polimerasa, se elonga la cadena (el fragmento unicatenario más el cebador) incorporando la mutación al ADN y formando una molécula de ADN completa bicatenaria. Dicha doble cadena de ADN puede ser introducida en una célula hospedadora y clonada. Tras esto, se escogen los mutantes.

Esta técnica no solo hace posible crear mutaciones puntuales en una molécula de ADN, sino que también se pueden producir deleciones e inserciones. Se consigue controlar el tipo de mutación que se pretende realizar en el ADN modificando el cebador. Para las deleciones se utilizan cebadores que contengan la deleción pero que tengan la capacidad de hibridación en la cadena de ADN en el sitio correcto; por el contrario, para una inserción el cebador deberá llevar el fragmento extra de ADN además de hibridar correctamente con la cadena molde.

Métodos del Mutagénesis de sitio dirigido

Mutagénesis de sitio dirigido por PCR

Para realizar mutagénesis de sitio dirigido, también se puede utilizar la PCR obteniendo el mismo resultado. Generalmente, se suelen utilizar 4 cebadores: dos de ellos presentan la mutación; y los otros dos únicamente se utilizan para amplificar la cadena. Puesto que con la PCR obtendremos una amplificación exponencial, el fragmento mutado se amplificará de tal manera que superará mayoritariamente al número de cadenas silvestres sin la mutación. Tras la PCR, podemos despreciar el número de cadenas de ADN silvestre en comparación con las que han sido mutadas.

Mutagénesis de sitio dirigido por PCR inversa en un plásmido

La PCR inversa utiliza cebadores orientados al revés (el forward hacia la izquierda y el reverse hacia la derecha, saliendo del mismo punto para que amplifican el plasmido entero) para amplificar el plásmido con un inserción, deleción o sustitución. El tipo de mutación depende en el diseño de los cebadores. En el caso de inserción los cebadores están ubicados a ambos lados del sitio de mutación y uno de los cebadores contiene el pedazo de secuencia para insertar. Se realiza sustituciones por el uso de un cebador con la sustitución en el medio. Los cebadores para los delaciones están ubicados en ambos lados del sitio de deleción en tal manera que tal region no está incluido en el amplicón.

Los cebadores vienen fosforilado en los extremos 5´para facilitar la ligacion del amplicón.

Mutagenesis dirigida por oligonucleótidos.

Método Smith at all Método kunkel Método Lewis at all. (mas importante) utiliza plasmido 1

Ventajas: se puede planificar el lugar y tipo de mutacion

Desventajas: se requiere conocimiento previo de propiedades de la proteína, purificación de la enzima mutada y determinación de propiedades.