BIOTECNOLOGIA DE CÉLULAS ANIMAIS - w3.ualg.ptw3.ualg.pt/~jbelo/documentos/BCA/Conteúdos BCA2006-07.pdf · Tecnicas assépticas. Normas de segurança e perigos biológicos. Biotecnologia

PROGRAMA E CONTEÚDO TEÓRICO E PRÁTICO DAS MATÉRIAS DA DISCIPLINA DE

BIOTECNOLOGIA DE CÉLULAS ANIMAIS

José António Henriques de Conde Belo

Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais

Faro, Setembro de 2006

Biotecnologia de Células Animais 2006/07

1

BIOTECNOLOGIA DE CÉLULAS ANIMAIS Engenharia Biotecnológica – FERN/UALG

2005/2006

DOCENTE: Prof. Doutor José António Belo

Gabinete 3.10; Telefone: #7040

EMAIL: [email protected] ;

1. AVALIAÇÃO DE CONHECIMENTOS

A avaliação dos conhecimentos da disciplina de Biotecnologia de Células Animais poderá ser feita por exame final ou por frequência. O exame ou testes contabilizam 70% da nota final, sendo os restantes 30% o resultado da avaliação do relatório final das aulas práticas (20%) e da avaliação do seminário (10%).

2. PROGRAMA TEÓRICO

CAPÍTULO 1) O desenvolvimento da tecnologia de células animais.

Vantagens da Cultura de Células Desvantagens. Principais diferenças in vitro.

Definição de tipos de cultura de tecidos.

Biologia da célula em cultura.

CAPÍTULO 2) Desenho e distribuição do laboratório.

Equipamento necessário.

Tecnicas assépticas.

Normas de segurança e perigos biológicos.


2

CAPÍTULO 3) O ambiente de cultura: Substrato, Fase de Gás, Meio e Temperatura.

CAPÍTULO 4) Preparação e esterilização.

Desagregação do tecido e cultura primária.

Manutenção da cultura: linhas celulares.

Clonagem e selecção de linhas celulares específicas.

CAPÍTULO 5) Caracterização de linhas celulares.

Disponibilidade e obtenção de linhas celulares.

Estabelecimento de linhas celulares: imortalização por transfecção.

CAPÍTULO 6) Contaminação.

Quantificação e desenho experimental.

CAPÍTULO 7) Hibridação celular e Hibridomas.

Produção de anticorpos monoclonais.

Tissue Engineering (Culturas tridimensionais).

CAPÍTULO 8) Embryonic Stem (ES) Cell Technology – alteração dirigida e estável do património genetico do ratinho.

Isolamento de Células Estaminais Embrionárias de ratinho.

Inactivação dirigida de genes usando estas células.

CAPÍTULO 9) Isolamento de Células Estaminais Embrionárias humanas.

Utilização em engenharia de tecidos humanos.

Considerações científicas, biomédicas e éticas.


3

3. PROGRAMA PRÁTICO PROTOCOLO 1. Apresentação do curso prático Duração: 1 aula (três horas) Considerações gerais sobre o laboratório de cultura de tecidos e procedimentos gerais de laboratório. PROTOCOLO 2. Técnicas básicas para o manuseamento e cultura de células de mamífero (ratinho). Duração: 5 aulas (15 horas) Aprendizagem de técnicas básicas em cultura de células de mamífero com o intuito do crescimento e manutenção em cultura deste tipo de células e comparação de diferentes métodos de contagem utilizados nestas células. PROTOCOLO 3. Isolomento e manutenção de uma cultura primária de fibroblastos de ratinho. Duração: 2 aulas (seis horas) Aprendizagem de técnicas básicas utilizadas no estabelecimento de culturas primárias.


4

4. BIBLIOGRAFIA

4.1. Livros gerais para apoio às aulas teóricas

General Techniques of Cell Culture (Handbooks in Practical Animal Cell Biology), November 1997.

Maureen A. Harrison, Ian F. Rae, Ann Harris (Preface)

Cambridge Univ Pr (Pap Txt); ISBN: 052157496X

Engenharia genética – Princípios e aplicações, 2001

Arnaldo Videira (ed.)

Lidel. Lisboa; ISBN: 972-757-163-8

Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol 57), June 1998.

David Barnes (Editor), Jennie P. Mather (Editor)

Academic Pr; ISBN: 0124800408

Culture of Animal Cells – A Manual of Basic Technique, 1994

R. Ian Freshney

Third Edition

Wiley-Liss, Inc.

Animal Cell Culture (A Practical Approach), 2000.

John R. W. Masters (Editor)

Third Edition

Oxford University Press

Gene Targeting (A Practical Approach), 2000

Alexandra L. Joyner (Editor)

Second Edition



5

4.2. Livros gerais para apoio às Aulas Práticas Cells – A Laboratory Manual, 1998

Vol.1: Culture and Biochemical Analysis of Cells. David L. Spector, Robert D. Goldman and Leslie A. Leinwand Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Essential Developmental Biology (A Practical Approach), 1993.

Claudio D. Stern and Peter W. H. Holland (Editors)


Mammalian Cell Biotechnology (A Practical Approach), 1991.

M. Butler (Editor) Oxford University Press

4.3. Endereços de Internet de revistas internacionais com interesse para a disciplina Motor de busca bibliográfica PubMed OnLine - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed American Journal of Human Genetics - http://genetics.faseb.org/genetics/ashg/ashgmenu.htm Annual Review of Cell and Developmental Biology - http://www.annualreviews.org/catalog/2005/cb21.asp Annual Review of Biomedical Engineering - http://www.annualreviews.org/catalog/2005/be07.asp BioEssays - http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/34201 Biotechnology Advances - http://www.sciencedirect.com/science/journal/07349750 Biotechnology and Bioengineering – http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/71002188 Cell - http://www.cell.com/ Current Opinion Cell Biology - http://www.sciencedirect.com/science/journal/09550674 EMBO Journal - http://embojournal.npgjournals.com/ Experimental Cell Research - http://www.sciencedirect.com/science/journal/00144827 Journal of Biotechnology - http://www.sciencedirect.com/science/journal/01681656 Journal of Cell Biology - http://www.jcb.org/


6

Journal of Cell Science - http://jcs.biologists.org/current.shtml Molecular Biology of the Cell - http://www.molbiolcell.org/current.shtml Nature - http://www.nature.com/ Reviews in Molecular Biotechnology - http://www.sciencedirect.com/science/journal/13890352 Science - http://www.sciencemag.org/ Tissue and Cell - http://www.sciencedirect.com/science/journal/00408166 Transgenic Research - http://www.kluweronline.com/issn/0962-8819 Trends in Biotechnology - http://www.sciencedirect.com/science/journal/01677799 Trends in Cell Biology - http://www.sciencedirect.com/science/journal/09628924

4.4. Hiper-ligações para páginas Internet dedicadas à Biotecnologia Células Animais American Society for Bone and Mineral Research - http://www.asbmr.org/

American Society for Cell Biology - http://www.ascb.org/

American Society for Microbiology - http://www.asmusa.org/

BioEngineering Research Group, IST, Lisboa - http://193.136.165.110/cebq/berg/ Biotech terms http://biotechterms.org/sourcebook/index_kc.phtml Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) - http://www.bbsrc.ac.uk/ Biotechnology Research Institute - http://www.bri.nrc.gc.ca British Medical Research Council (MRC) Stem Cell Bank - http://www.nibsc.ac.uk/divisions/cbi/stemcell.html

Departamento de Engenharia Biológica, UMinho - http://www.deb.uminho.pt/

European Federation of Biotechnology - http://www.efbweb.org/efb.htm

European Molecular Biology Laboratory - http://www.embl.de/

Harvard Stem Cell Institute - http://stemcell.harvard.edu/

Human Stem Cell Training Courses - http://www.isscr.org/science/courses.htm

Instituto Biologia Experimental e Tecnológica - http://www.ibet.pt/rnd.htm

Instituto Tecnologia Quimica e Biológica - http://www.itqb.unl.pt/Research/Technology/Animal_Cell_Technology/

International Society for Stem Cell Research - http://www.isscr.org/index.htm

Medical Research Council (UK) - http://www.mrc.ac.uk/

National Center for Biotechnology Information - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Riken Center for Development Biology - http://www.cdb.riken.jp/en/


7

Sigma-Aldrich - http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_interest/Life_Science/Cell_Culture Society for Developmental Biology - http://www.sdbonline.org Stem Cell Research Foundation - http://www.stemcellresearchfoundation.org/ The Jackson Laboratory - http://www.jax.org/index.html Tissue Engineering Society International - http://www.tesinternational.org/ Wellcome Trust - http://www.wellcome.ac.uk/

4.5. Bibliografia para apoio à elaboração do seminário Os artigos para apresentação em seminário são préviamente escolhidos pelo pelo professor. Grupos de dois alunos debruçam-se sobre cada um artigo específico, recente, de acordo com o respectivo interesse, sob orientação e aconselhamento do professor. Este artigo será depois apresentado em formato PowerPoint perante os restantes colegas


8

5. PROTOCOLOS DAS AULAS PRÁTICAS

AULA TEÓRICO-PRÁTICA 2

ARTIGOS PARA APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO

Jun Cheng, Amalia Dutra, Aya Takesono, Lisa Garrett-Beal and Pamela L. Schwartzberg (2004). Improved Generation of C57BL/6J Mouse Embryonic Stem Cells in a Defined Serum-Free Media. genesis 39:100–104

H.J. RIPPON, N.N. ALI, J.M. POLAK, and A.E. BISHOP (2004). Initial Observations on the Effect of Medium Composition on the Differentiation of Murine Embryonic Stem Cells to Alveolar Type II Cells. Cloning and Stem Cells 6 (2): 49-56.

A. VON DRYGALSKI, G. ALESPEITI, L. REN and J.W. ADAMSON (2004). Murine Bone Marrow Cells Cultured Ex Vivo in the Presence of Multiple Cytokine Combinations Lose Radioprotective and Long-Term Engraftment Potential. STEM CELLS AND DEVELOPMENT 13:101–111.

Jason S. Meyera, Martin L. Katzb, Joel A. Maruniaka, Mark D. Kirk (2004). Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in vitro and after transplantation into eyes of mutant mice with rapid retinal degeneration. Brain Research 1014: 131– 144.


9

AULA TEÓRICO-PRÁTICA 3.

ARTIGOS PARA APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO

Anton Novak, Caiying Guo, Wenyi Yang, Andras Nagy and Corrinne G. Lobe (2000).

Z/EG, a Double Reporter Mouse Line That Expresses Enhanced Green Fluorescent Protein Upon Cre-Mediated Excision. genesis 28:147–155.

Petra Pennekamp,1 Christina Karcher,Anja Fischer, Axel Schweickert, Boris Skryabin, Jurgen Horst,Martin Blum and Bernd Dworniczak (2002). The Ion Channel Polycystin-2 Is Required for Left-Right Axis Determination in Mice. Current Biology, Vol. 12, 938–943, June 4

Tel/Etv6 is an essential and selective regulator of adult hematopoietic stem cell survival (2004). Hanno Hock, Eliza Meade, Sarah Medeiros, Jeffrey W. Schindler, Peter J.M. Valk, Yuko Fujiwara and Stuart H. Orkin. GENES & DEVELOPMENT 18:000–000.

Christopher B. Brown, Jennifer M. Wenning, Min Min Lu, Douglas J. Epstein, Erik N. Meyers, and Jonathan A. Epstein (2004). Cre-mediated excision of Fgf8 in the Tbx1 expression domain reveals a critical role for Fgf8 in cardiovascular development in the mouse. Developmental Biology 267: 190–202.


10

PROTOCOLO 2. Técnicas básicas para o manuseamento e cultura de células de mamífero (Humanas). Duração: 5 aulas (15 horas)

Aprendizagem de técnicas básicas em cultura de células de mamífero e comparação de

diferentes métodos de contagem utilizados nestas células.

Prática 1+2

Objectivo: Esta aula prática tem como objectivo a aprendizagem de técnicas básicas de manuseamento de culturas de células animais dependentes de ligação para o crescimento e a comparação de diferentes métodos de contagem utilizados com este tipo de células. Material, células e meios:

Lista de reagentes

Glutamina Gibco/BRL# 043-05030 D

Penicilin/Streptomycin (10,000 U cada) Gibco/BRL# 15140-114

Trypsin/EDTA (10X) Gibco/BRL# 35400-027

PBS (sem cálcio e magnésio) Gibco/BRL# 14190-094

Calf Serum (Heat Inactivated) Gibco/BRL# 26170-043

DMEM Gibco/BRL# 41965-039

Material Hemocitómetros para células animais Banho de água a 37ºC Tubos Eppendorf esterilizados Pipetas de vidro esterilizadas com algodão (1, 5 e 10 ml) Pipetas de Pasteur esterilizadas com algodão Pontas para micropipetas de 1000 µl e 200 µl esterilizadas


11

Células T-flasks pequenos com monocamada confluente de células HELA, células humanas epiteliais provenientes de uma linha celular imortalizada, no final da fase exponencial de crescimento Meios de Cultura, aditivos, tampões, enzimas e corantes Meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Solução de Glutamina 200 mM Soro Solução de Tripsina Solução salina (NaCl 9g/l) Azul de triptano Violeta de cristal ATENÇÃO: todos os meios, aditivos e soluções estão esterilizadas. Todo o trabalho com células e soluções que vão estar em contacto com células deve ser feito na câmara de fluxo laminar em condições de assépsia. Deve-se passar à chama e deixar arrefecer todo o material de vidro que vai estar em contacto com células e soluções. As colorações e contagens podem ser feitas fora do fluxo laminar. Preparação de meios Fazer as adições necessárias de modo a obter um volume final de 20 ml de meio DMEM com 10% (V/V) de soro, 4 mM de glutamina. Se o meio já estiver preparado apresentar no relatórios os cálculos dos volumes de meio base, soro e do stock de glutamina que tinham que adicionar para obtenção do meio de cultura pretendido. Todos os meios e soluções que vão estar em contacto com as células devem estar a 37ºC.

“Passagem” ou “manutenção” de uma linha celular dependente de ligação para o crescimento

1. Abrir o T-flask na câmara de fluxo. Colocar o T-flask em pé;

2. Retirar o meio de cultura que cobre as células com uma pipeta e deitar fora;

3. “Lavar” as células com 4 ml de PBS em alternativa adicionando o tampão muito suavemente na parede do T-flask oposta á monocamada de células. Lavar a monocamada e retirar o tampão. Repetir esta operação mais uma vez;

4. Adicionar 1 ml da solução de Tripsina. Fechar o T-flask e esperar de 3 a 5 minutos se possível na cmara de incubação a 37ºC. Agitar suavemente e verificar se as células se estão a soltar.

5. Quando as células se soltarem da superfície adicionar 9 ml de meio DMEM com aditivos e homogeneizar utilizando uma pipeta de 5 ml;

6. “Passar” para 2X T-flask pequenos 1 ml da suspensão celular e adicionar a cada um deles 4 ml de meio. Colocar na incubadora a 37ºC após saturar a atmosfera do T-


12

flask com uma mistura de 5% CO2 em ar utilizando uma pipeta de Pasteur com algodão.

7. Identificar 2 tubos eppendorf com A e V. Retirar para cada um dos tubos 500 µl da suspensão celular.

8. Observar o T-flask durante 5-7 dias em nicroscópio invertido. Contagens Celulares: • Número de núcleos (células totais) Centrifugar o tubo V a 200 x g durante 10 minutos. Desprezar o sobrenadante e resuspender o pellet em 200 µl de Nacl. Adicionar 200 µl de violeta de cristal e agitar. Incubar a 37ºC durante 1 h - 2 h. Encher as células do hemocitometro e contar os núcleos.

• Número de células viáveis Retirar 100 µl do tubo A para outro eppendorf e adicionar 100 µl de azul de triptano. Esperar 5 minutos e contar as células viáveis (transparentes) e não viáveis (azuis) no hemocitometro utilizando microscopia de contraste de fase.


13

Prática 3

OBJECTIVOS: Expansão em cultura de células HeLa, células humanas epiteliais

provenientes de um alinha celular imortalizada.

1- Observar as Células HeLa em cultura desde a aula anterior. Anotar características das

células, grau de confluência, cor do meio, etc.

2- Preparar 4 frascos TC 6cm.

3- Tratar com 2 mL tripsina/EDTA os dois frascos com as culturas da aula anterior.

Incubar 10 min.

4- Pegar nas placas TC 6cm no qual células HeLa tenham estado em, abrir a tampa e

aspirar por vacuo o meio de cultura (evitando tocar na superfície de crescimento).

5- Adicionar a cada frasco 5 mL de PBS. Lavar cuidadosamento por oscilação a

superfície onde as células estao aderentes.

6- Aspirar o PBS. Adicionar a cada frasco 2 mL de 1X tripsina/EDTA.

7- Fechar os frascos TC 6cm e colocar-los em posição de incubação permitindo a

distribuição uniforme da tripsina por toda a área de crescimento das HeLa.

8- Incubar 10 min a temperatura ambiente

9- Adicionar 2 mL de meio DMEM a cada frasco TC. Lavar cuidadosamente a

superfície de crescimento por pipetamento e recolher a totalidade do liquido+Células

para um tubo esteril de 50 mL.

10- Adicionar meio DMEM ate perfazer um total de 20 mL.

11 Adicionar 5 mL a cada uma dos frascos cultura 6cm préviamente identificados.

12- Tapar os frascos e colocar a incubar na estufa a 37º C, 5% CO2


14

Prática 4

OBJECTIVOS: Teste do efeito de utilização de diversas drogas no crescimento e

viabilidade das Células Hela em cultura.

Nota: Geneticina (G418) e Mitomicina C sao substancias tóxicas por contacto e por isso

a utilização de luvas e obrigatória bem como extremo cuidado no manuseamento

durante todo o procedimento.

1- Observar as Células HeLA em cultura desde a aula anterior. Anotar características

das células, grau de confluência, cor do meio, etc.

2- Marcar os 4 frascos de A a D.

3- Mudar o meio dos frascos A e B com novo DMEM. Suplementar o meio no frasco B

com Geneticina (G418). Incubar na estufa a 25º C.

4- Ás placas C e D suplementar o meio de cultura com 25% e 100% de Mitomicina C

respectivamente. Incubar por 2 horas.

5- Aspirar o meio dos frascos C e D. Lavar 2X com PBS. Adicionar a cada placa 5 mL

de DMEM. Incubar na estufa a 37º C, 5% CO2.


15

Prática 5

OBJECTIVOS: Observação do efeito de utilização de diversas drogas no crescimento e

viabilidade das Células HeLa em cultura.

Nota: Geneticina (G418) e Mitomicina C são substancias tóxicas por contacto e por isso

a utilização de luvas e obrigatória bem como extremo cuidado no manuseamento

durante todo o procedimento.

1- Observar as Células HeLa em cultura desde a aula anterior. Anotar

características das células, grau de confluência, cor do meio, etc.

2- Tratar com 2 mL tripsina/EDTA os 4 frascos com as culturas da aula anterior.

Incubar 10 min.

3- Adicionar 1 mL de meio DMEM a cada um dos frascos TC. Lavar

cuidadosamente a superfície de crescimento por pipetamento e recolher a

totalidade do liquido+Células de cada frasco TC para um tubo estéril de 15 mL.

4- Contar o numero de células por tubo utilizando um Hematocitometro.

5- Comparar as diversas contagens relacionando com o efeito esperado das drogas

utilizadas no crescimento e viabilidade celular.

CONTAGENS

1. Abrir o T-flask na câmara de fluxo. Colocar o T-flask em pé;


3. “Lavar” as células com 4 ml de PBS em alternativa adicionando o tampão muito suavemente na parede do T-flask oposta á monocamada de células. Lavar a monocamada e retirar o tampão. Repetir esta operação mais uma vez;

4. Adicionar 1 ml da solução de Tripsina. Fechar o T-flask e esperar de 3 a 5 minutos se possível na cmara de incubação a 37ºC. Agitar suavemente e verificar se as células se estão a soltar.

5. Quando as células se soltarem da superfície adicionar 9 ml de meio DMEM com aditivos e homogeneizar utilizando uma pipeta de 5 ml;


16

6. “Passar” para um T-flask pequeno 1 ml da suspensão celular e adicionar 9 ml de meio. Colocar na incubadora a 37ºC após saturar a atmosfera do T-flask com uma mistura de 5% CO2 em ar utilizando uma pipeta de Pasteur com algodão.

7. Identificar 2 tubos eppendorf com A e V. Retirar para um dos tubos 500 µl da suspensão celular.

8. Contar de novo o numero de núcleos e o número de células viáveis utilizando as técnicas de violeta de cristal e de azul de triptano respectivamente, como indicado no protocolo da aula anterior.

Apresentação de Resultados: Comparar os diferentes métodos de contagem celular. Cálculos: CALCULAR QUANTAS CÉLULAS VIÁVEIS FORAM INOCULADAS NO T-FLASK.


17

PROTOCOLO 3. Isolomento e manutenção de uma cultura primária de fibroblastos de ratinho. Duração: 2 aulas (seis horas) Aprendizagem de técnicas básicas utilizadas no estabelecimento de culturas primárias.

Prática 6

Este protocolo pode ser utilizado com embriões de ratinho, rato, hamster e galinha.

Neste caso específico a espécie utilizada será o ratinho. È recomendável obter embriões

entre 11-13 dias de gestação, pois a este estadio os embriões contém um número óptimo

de células indiferenciadas de mesenquima, de onde as células com características de

fibroblastos são derivadas.

1. Sacrificar a ratinha grávida utilizando métodos apropriados.

2. Imediatamente esfregar o animal com 70% etanol numa camara estéril.

3. Utilizando tesouras e pinças estéreis, abrir o abdomen e remover o útero

contendo os embriões. Transferir para uma placa de petri esterilizada.

4. Remover as membranas, a cabeça e as visceras. Lavar os embriões em PBS,

mudando o líquido até a solução se apresentar límpida.

5. Transferir 6-8 embriões para uma nova placa e cortar em pedaços bastante

pequenos. Lavar com PBS.

6. Transferir os pedaços de embrião para um frasco de 500 mL com uma barra de

agitação. Adicionar 200 ml de 0.25% tripsina em HBSS GIBCO/BRL). Agitar

num incubador a 37ºC durante 15 minutos.

7. Parar a agitação e permitir que os blocos maiores de tecido assentem no fundo

do frasco por gravidade. Remover a solução contendo as células em suspensão

para um tubo estéril de centrifuga contendo 1 mL de soro de vitelo por cada 1o

mL de suspensão (para inactivar a tripsina).

8. Centrifugar durante 5 minutos a 1200 rpm, e remover o sobrenadante.


18

9. Ressuspender o pellet em PBS e centrifugar de novo como em 8.

10. Ressuspender o pellet em 10 mL de DMEM contendo 10% de soro de vitelo e

antibióticos, a´te um volume final de 100 mL.

11. Para determinar a concentração de células presentes, adicionar 0.2 mL da

suspensão a 1.8 mL de 1% ácido acético (para lisar eventuais glóbulos

vermelhos presentes) e contar no hematócitometro.

12. Plaquear as células a uma densidade de 1-4X107 por placa de 100mm contendo

10 mL de meio de cultura. Incubar a 37ºC em 5% de CO2.

Prática 7

1. Abrir a placa na câmara de fluxo.


3. “Lavar” as células com 4 ml de NaCl 9g/l (pode ser PBS em alternativa) adicionando o tampão muito suavemente na parede da placa. Lavar a monocamada e retirar o tampão. Repetir esta operação mais uma vez;

4. Adicionar 1 ml da solução de Tripsina. Fechar a placa e esperar de 3 a 5 minutos se possível na cmara de incubação a 37ºC. Agitar suavemente e verificar se as células se estão a soltar.

5. Quando as células se soltarem da superfície adicionar 9 ml de meio DMEM com aditivos e homogeneizar utilizando uma pipeta de 5 ml.

6. Identificar 2 tubos eppendorf com A e V. Retirar para um dos tubos 500 µl da suspensão celular.

Contagens Celulares: • Número de núcleos (células totais) Centrifugar o tubo V a 200 x g durante 10 minutos. Desprezar o sobrenadante e resuspender o pellet em 200 µl de Nacl. Adicionar 200 µl de violeta de cristal e agitar. Incubar a 37ºC durante 1 h - 2 h. Encher as células do hemocitometro e contar os núcleos.


19

• Número de células viáveis Retirar 100 µl do tubo A para outro eppendorf e adicionar 100 µl de azul de triptano. Esperar 5 minutos e contar as células viáveis (transparentes) e não viáveis (azuis) no hemocitometro utilizando microscopia de contraste de fase.

Apresentação de Resultados: Comparar os diferentes métodos de contagem celular. Cálculos: CALCULAR QUANTAS CÉLULAS VIÁVEIS FORAM INOCULADAS EM CADA PLACA DE 100 MM.

Documents

BIOTECNOLOGIA DE CÉLULAS ANIMAIS - w3.ualg.ptw3.ualg.pt/~jbelo/documentos/BCA/Conteúdos BCA2006-07.pdf · Tecnicas assépticas. Normas de segurança e perigos biológicos. Biotecnologia