BIOTECNOLOGIA DE LOSMICROORGANISMOS

Aplicaciones de las enzimas ligninolíticas

Dra. Isabel E. Cinto

isa.cinto@gmail.com

El interés en los hongos causantes de pudrición blanca se incrementó ellos últimos 20-30 años asociados a sus numerosas aplicacionesbiotecnológicas

La mayoría de las aplicaciones ligadas a aplicaciones biotecnológicas de hongos de pudrición blanca:

Especies del Hemisferio NorteEspecies del Hemisferio Norte

Gran diversidad de hongos ligninolíticos descriptos en el Hemisferio Sur

Escasos estudios acerca de los sistemas enzimáticos implicados

Utilización de hongos para biorremediación requiere clarificar:Mecanismos enzimáticos empleados para detoxificar contaminantesFactores ambientales que incrementen la capacidad de biodegradación

Aplicaciones ligninasas

Degradación de xenobióticosDegradación efluentes industrialesBiorremediaciónDegradación de colorantes industrialesDecoloración de Demin

Industria de papelBiopulpado de la madera (X,L)Bioblanqueado de la pulpa de madera (X,L)

Investigación y desarrolloBiosensores

Degradaciónde

xenobióticos

Hidrocarburos AromáticosPolicíclicos (PAHs)

Aromáticos clorados

PentaclorofenolInsecticida, herbicida, preservante madera

Dioxinastetraclorodibenzodioxina

triclorofenol

2,4,5-triclorofenoxiacéticoherbicida

Pesticidas

DDTDicloro difeniltricloroacético

Persistente, liposolubleCorto plazo: sistema nervios e hígadoLargo plazo: carcinógeno

LindanoHexaclorohexano

Bifenilos policlorados-PCBs

Usos:Fluidos electricos en transformadores y capacitoresDiluyentes de pesticidad, adhesivos y aceitesRetardantes de llamaLubricantes hidráulicos

Aplicación en industria textilBiodesteñido de demin con lacasa

Dos estrategias para degradación de xenobióticos:

1)Biotransformación del compuesto por cultivos enteros2) Uso de enzimas (utilizadas mas frecuentemente lacasa y MnP)

Costos compatibles a escala industrial:

1)Producción de los hongos o sus enzimas a sustratos baratos (Ej: residuos agroindustriales)2)Utilización de enzimas no purificadas (pueden estar presente otros factores que favorecen la estabilidad de las enzimas o que actúan como mediadores, mejorando su rendimiento)

Hongos de pudrición blanca, cepas Argentinas

Coriolus versicolor Trametes elegansTrametes trogiiCoriolus versicolor

Fomes spp Trametes villosa Pycnoporus sanguineus

Trametes elegansTrametes trogii

Degradación de colorantes

Azure B PolyR-478 Rojo Congo

Xilidina RBBR Azul de antraquinona

Colorantes

Antraquinónico

AzoAzo

Trifenilmetano

Coriolus antarcticus Decoloración con cultivos en medio líquido

Coriolus antarcticus Efecto de mediadores de lacasa en la decoloración

Trametes trogii

Produce Lacasa y MnP

La lacasa es la enzima mayoritaria:

Medio líquido con 1 mM Cu++ , 20 días : 100 U/ml Óptimo de actividad: pH 3.5, 50 ºC

Estabilidad: a pH 4.5, 30 ºC, más de 5 días, 100%

2 isoenzimas, PM 38 y 60 KD

Degrada: colorantes, PAHs, PCBs.

Altas concentraciones de nitrógeno estimulas su crecimiento yproducción de ligninasas excelente candidato paraproducción de ligninasas a gran escala

Degradación de PCBs (200 ppm de aroclor 1150)

Degradación de PAHs(160 ppm de efluente de industria petroquímica con 10% de PAHs)

Trametes trogii

Cromatogramas (gas-líquido) de: (A) Controles, cultivo inactivado por calor; (B) Cultivo, 7 d

Degradación de antraceno Degradación de nitrobenceno

Trametes trogii

Control abiótico Control abiótico

Cultivo, 250 ppm antraceno

GC/masa de los compuestos extraídos.Agregados: al 4º d de crecimiento y extraídos al d.12

Control abiótico Control abiótico

Cultivo, 500 ppm nitrobenceno

Trametesvillosa

Inmovilización de enzimas- Permite el reuso o un uso continuado

Adhesión – uniones iónicas

Material soporte: inorgánicoorgánico naturalsintético

Adhesión – uniones iónicasdiferencia de cargasuniones covalentes

Atrapado – en una matriz porosapolímeros fibrososmicrocápsulas semipermeables

Tener en cuenta:actividadactividadestabilidad

Aplicación:tanquescolumnas

Stereum hirsutumStereum hirsutumen esponja vegetalen esponja vegetal

1,4dimetoxifenol; guayacol; ácido gálico

y 2,4 diclorofenol

Raphanus sativus(rabanito)

Agua destilada

Fenol 10mM

90

10090

100

Los porcentajes de germinación :

96% en agua destilada,

0% en fenol 10mM

91 % en el fenol tratado con S. hirsutum

Productos de degradación

Fig 2: Remoción de fenol 10mM en S. hirsutum inmovilizado en esponja vegetal y en crecimiento libre a lo largo de dos ciclos de 13 días (10 mM = 1000 ppm)

010

2030

4050

6070

8090

13 15 18 20 23 26

Micelio Libre

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2 5 7 10 13Días

Rem

oció

n de

Fen

ol (%

)

Micelio Inmovil izado

Segundo ciclo: reagregado de fenol 10mM

Aplicaciones a la Industria Papelera

Madera

Chips

Pulpa de papel

Biopulpado(xilinasas, ligninasas)

Pulpado mecánico+NaHO + Na2S

Efluentes tóxicos (licor negro)Pulpa de papel(marrón)

Pulpa de papel(blanca)

Refinado, laminado

Papel

Bioblanqueado(xilinasas, ligninasas)

Blanqueado(productos clorados y peróxido)

Efluentes tóxicos

Biorremediaciónligninasas

Empleo de hongos ligninolíticos y sus enzimas en el proceso de fabricación de papel

Bipulpado (previo al pulpado mecánico-químico:<energía, < tiempos decocción, químicos entran más facilmente porque la madera adquiere unaestructura más abierta, mas porosa)

El organismo elegido debe ser capaz de atacar selectivamente a la ligninadejando casi intactos a los carbohidratos, en un período de tiemporazonable (acorde con los niveles de producción de las plantas) y ser kisuficientemente robusto para desarrollarse en condiciones que varíanconsiderablemente dentro del sistema de biopulpado.

Empleo de hongos ligninolíticos y sus enzimas en el proceso de fabricación de papel

Bioblanqueado El uso de hemicelulasas (xilanasas) libera la ligninareduciendo el uso de compuestos clorados. El preblanqueo xon xilanasases utilizado actualmente en varias plantas productoras de papel.Recientemente se ha comenzado a probar el sistema lacasa-mediador enRecientemente se ha comenzado a probar el sistema lacasa-mediador enbioblanqueo.

Se reduce el uso de químicos.

Biorremediación

¿Qué es?

Biorremediación

•Debe encararse de modo multifacético•El medioambiente es heterogéneo•Prenta gran complejidad•Actividad interdisciplanaria: microbiologíaIngenieríaIngenieríaGeologíaQuímica

•Tiene múltiples aplicaciones, aguas subterráneas, sedimentos, lodos, suelos, en tratamientos líquidos, gases y sólidos•Puede ser aplicada a grandes extensiones

Biorremediación

Condiciones para la biorremediación

Biorremediación

Biorremediación

Antes de tomar una desición debemos preguntarnos:

¿el contaminante es biodegradable?

¿la biodegradación ocurre en el lugar naturalmente?

¿las condiciones ambientales son apropiadas para la biodegradación?

Si el contaminante no es totalmente degradado ¿Qué haremos después?

Factores que limitan la biorremediación:

Factores ambientales: pH, temperatura, oxígeno, humedad, fuente de carbono y energía, etc

Microorganismos: concentración de biomasa, diersidad de población, actividad enzimatica, etc

Sustrato: características físico-químicas, estructura molecular y

Biorremediación

Sustrato: características físico-químicas, estructura molecular y concentración

Biodisponibilidad del contaminante, puede limitar la remediación de 3 formas:•La cantidad del contaminante es baja e insuficiente para generar laenergía que induzca a la biodegradación•La biodegradaciónse produce pero no es suficiente para un aumento demasa microbiana importante•Contaminante induce la degradación y la tasa de crecimiento delmicroorganismo y la biorremediación es exitosa

Laboratorio

Selección del organismo

Estudio de su fisiología

Industria

Necesidad de tratamiento

Efluentes(toxicidad, color,

metales, mat. org.)Estudio de su fisiología(crecimiento, producción de

enzimas, capacidad de decoloración,absorción de metales pesados, etc.)

Medioambiente

metales, mat. org.)

Evaluación del métodoDesarrollo

EscaladoPiloto

Conclusiones

Los tratamientos de biorremediación en la actualidad utilizanmayoritariamente bacterias.

Para aplicar hongos en dichos tratamientos aún se debe reducir el costo dela producción enzimática, para hacerlos competitivos frente a las tecnologíastradicionales. Esto puede lograrse:•Optimizando la producción enzimática en medios baratos•Optimizando la producción enzimática en medios baratos•Obteniendo enzimas recombinantes, expresadas en levaduras o bacterias.

Aunque se ha comprobado la capacidad de los hongos ligninolíticos paradegradar distintos contaminantes ambientales, falta establecer el rol precisode las enzimas involucradas en esos procesos y los factores que regulan suproducción y actividad.

Objetivos: Aportar conocimiento que contribuyan al desarrollo detecnologías de biorremediación utilizando hongos ligninolíticos o susenzimas