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Biotecnologie
Screening delle genoteche con le sonde geniche
Giancarlo Dessì
http://www.giand.it
Licenza Creative Commons BY-NC-SA
(BY: attribuzione, NC: uso non commerciale, SA: condividi allo stesso modo)
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La tecnica si basa sui seguenti presupposti:
• si conosce almeno in parte la sequenza nucleotidica di uno deifilamenti del frammento cercato (DNA bersaglio)
• si dispone di una sequenza complementare costruitaartificialmente impiegando nucleotidi marcati con isotopiradioattivi (sonda genica)
• un frammento di DNA può essere linearizzato e separato neisuoi due filamenti singoli con tecniche di denaturazione
• la sonda genica si “appaia” spontaneamente al filamentocomplementare del frammento ricercato (ibridazione).
Scopo di questa tecnica è l’estrazione oisolamento di un gene o di una specificasequenza di DNA da una genoteca.
Le genoteche
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Esistono due tipi di genoteche rappresentative:1) Genoteca genomica. Contiene l’intero genoma di un organismo, perciò comprende sia il DNA intronico sia quello esonico.2) Genoteca di DNA complementare (cDNA). Contiene solo i geni di espressione del tessuto a cui si riferisce e, quindi, solo DNA esonico. Da tessuti diversi dello stesso organismo si ottengono genoteche di cDNA differenti.
Genoteca genomica
Si estrae il DNA da un campione di celluledell’organismo e si frammenta con uno opiù enzimi di restrizione.
Con gli stessi enzimi di restrizione, siincorporano i frammenti in vettori diclonazione (es. plasmidi ).
Questi vengono amplificati sfruttando lacapacità delle cellule procariote diassumere materiale genetico dall’esterno(es. per trasformazione batterica) e direplicarli più volte al loro interno.
Dalla moltiplicazione di ciascuna cellula siottiene un clone , ovvero un insieme dicellule che contengono lo stessoframmento di DNA clonato.
L’estrazione dei vettori di clonazione, dopol’amplificazione, permette la raccolta in unasola provetta di tutti i frammenti di DNA,ciascuno contenuto all’interno di unvettore.
La provetta contenente l’intero DNAdistribuito alla rinfusa nei plasmidi clonatirappresenta la genoteca genomica .
Figura 1
Genoteca di cDNA
Si estrae il RNA messaggero (mRNA ) daun campione di cellule di un tessutodell’organismo.
Con l’impiego dell’enzima trascrittasiinversa si costruisce un filamento di DNAcomplementare al mRNA. Il filamento diRNA viene poi distrutto e sostituito da unfilamento di DNA complementare a quelloottenuto con la trascrittasi inversa.
Il materiale ottenuto, detto cDNA , contienesolo il DNA dei geni codificanti funzionaliper il tessuto specifico. Non contienepertanto DNA intronico e i geni “disattivati”.
Usando gli enzimi di restrizione, iframmenti di cDNA vengono incorporati invettori di clonazione (es. molecole di DNAfagico ).
Questi vengono introdotti nelle particellevirali e amplificati sfruttando la capacità deibatteriofagi di moltiplicarsi attraverso lecellule di Escherichia coli .
Dalla infezione fagica di ciascuna cellula siottiene un clone, ovvero un insieme diparticelle virali che contengono lo stessoframmento di DNA clonato.
La raccolta dei vettori di clonazione, dopol’amplificazione, contenente l’intero cDNAdistribuito alla rinfusa nei fagi clonatirappresenta la genoteca di cDNA di unospecifico tessuto.
Una genoteca è una raccolta di geni o frammenti di DNA contenuti allarinfusa in un insieme di vettori di clonazione (plasmidi, cosmidi, fagi, ecc.).
Essa è rappresentativa quando contiene almeno una copia di tutte lepossibili sequenze.
Figura 1 . Costituzione di una biblioteca genomica.1: prelievo di un campione di cellule. 2: estrazione del DNA. 3: trattamento con enzimi di restrizione e inclusione in plasmidi usati come vettori di clonazione. 4: inclusione dei plasmidiricombinati in cellule batteriche. 5: amplificazione del DNA ricombinato per moltiplicazione delle cellule. 6: estrazione dei plasmidi e costituzione della genoteca.
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La scelta del vettore di clonazione e del metodo di amplificazionedipende dalle dimensioni dei frammenti di DNA genomico ocomplementare.
I plasmidi sono infatti usati per frammenti di piccole dimensioni e sono perciò poco adatti per costituire genoteche di organismi superiori.
Le sonde geniche
Figura 2 . Appaiamento spontaneo dei frammenti incorrispondenza di sequenze complementari.
Figura 3 . Ripiegamento del frammento per appaiamento di sequenzecomplementari.
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Le sonde geniche sono a filamento singolo .
Per evitare l’accoppiamento spontaneo dei filamenti o illoro ripiegamento, la sequenza di basi non deve perciòcontenere tratti reciprocamente complementari.
Una sonda genica è un filamento singolo di DNA, costruitoartificialmente sulla base di una sequenza predefinita dibasi.
Per gli scopi che si propone l’utilizzo delle sonde geniche,il filamento è costruito con nucleotidi marcati con l’isotoporadioattivo 32P o con altri metodi di marcatura.
_____________________________________________________|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||AATCCTGGCCCATCAATCCGTGAGTTAAATTGATGGGCTTAAGGGGGTATTCC
Questo frammento, ad esempio, non può essere impiegato come sonda genicaperché le due sequenze evidenziate in blu sono reciprocamente complementari.Queste sequenze provocherebbero l’accoppiamento spontaneo di due frammentidistinti (Figura 2 ) oppure il ripiegamento del filamento per l’accoppiamentospontaneo dei due tratti complementari (Figura 3 ).
Le sonde geniche hanno lunghezze dapoche decine a qualche migliaio di paiadi basi (bp).
Denaturazione e ibridazione
Figura 4 . Molecola eteroduplex ottenuta per ibridazione.
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Fattori destabilizzanti .
- alta temperatura (>90°C)
- pH elevato (>pH 11)
Fattori stabilizzanti .
- lunghezza del doppio filamento
- frequenza degli accoppiamenti guanina-citosina
- concentrazione salina
Denaturazione o melting
Consiste nella destabilizzazione della struttura: la doppia elica si svolge e i legami aidrogeno si rompono causando la separazione dei due singoli filamenti.
Il fenomeno è indotto artificialmente sottoponendo il DNA a riscaldamento, a temperaturegeneralmente superiori a 90°C.
Ogni molecola di DNA ha una sua specifica temperatura di melting , in relazione agli altrifattori stabilizzanti e destabilizzanti.
La struttura del DNA a doppio filamento avvolta aspirale è resa possibile dai legami a idrogeno che siinstaurano tra le basi azotate.
Sulla stabilità di questa struttura influiscono diversifattori.
La denaturazione è una trasformazione reversibile .
L’abbassamento di temperatura fino a valori di 45-65°Cpermette l’appaiamento spontaneo dei filamenti singoli eil riavvolgimento della doppia elica.
Ibridazione
Fenomeno per cui, in opportune condizioni di temperatura e concentrazione salina, unfilamento singolo di DNA (DNA bersaglio ) è appaiato spontaneamente da un altroframmento di DNA a singolo filamento in un tratto di sequenza complementare ( Figura 4 ).Le molecole di DNA a doppia elica ottenute dall’ibridazione sono dette eteroduplex .
Il fenomeno è sfruttato per individuare una specifica sequenza di basi con l’uso dellesonde geniche.
Screening di una genoteca (metodo del colony blot )
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Dopo l’incubazione, da ogni cellula si sviluppa una colonia.
Tutte le cellule di una colonia contengono lo stessoframmento di DNA clonato .
Nella foto, colonie di Escherichia coli, incubate in unacapsula Petri.
(Fonte: Wikimedia Commons, autore: Madeleine PriceBall, licenza Creative Commons BY-SA 3.0)
I batteri contenenti i geni clonati vengono inoculati in una capsulaPetri su un apposito terreno di coltura. Ogni cellula contiene unframmento della genoteca, tuttavia non si conosce la posizione dellecellule contenenti il gene da isolare.
Si stende sulle colonie un filtro dinitrocellulosa o di nylon
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Le cellule assorbite dal filtro vengono distrutte (lisi)e il DNA liberato sottoposto a denaturazione.
Il filtro viene bagnato conuna soluzione contenentela sonda genica specifica,marcata con 32P.
Dopo il lavaggio, sul filtro restanosolo le sonde geniche che si sonoappaiate al DNA bersaglio delframmento cercato (ibridazione ).
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Si sovrappone al filtro una pellicola sensibile ai raggi X.
La pellicola sarà impressionata in corrispondenza delle areein cui si sono concentrate le sonde geniche marcate conl’isotopo radioattivo (autoradiografia ).
Il confronto tra le aree della pellicola impressionate e lapiastra Petri di origine permette di localizzare le coloniecontenenti il frammento di DNA bersaglio.
A questo punto si prelevano le cellule dalle colonieindividuate e si procede alla loro moltiplicazione alloscopo di amplificare il frammento di DNA bersaglio.
