Biyolojik Örneklerde İlaç

AnaliziECZ 3441. ders/07.03.2014

2. ders/14.03.2014

PROF. DR. DİLEK AK

ECZACILIK FAKÜLTESİ

ANALİTİK KİMYA ANABİLİM DALI

1

İçerik

Biyolojik sıvılar,

Biyolojik örneklerin saklanması koşulları,

Ekstraksiyon işlemleri,

Kurutma işlemleri,

Bulaşma kaynakları ve hatalar,

Miktar tayini yöntemleri,

Yöntem seçimi,

Sonuçların değerlendirilmesi.

2

Öğrenme Çıktıları

Biyolojik sıvılarda ilaç analizinin önemini

değerlendirebilecektir.

İlaç analizinin hangi alanlarda önemli olduğunu açıklar.

İlaç analizi yapılan biyolojik sıvıları tanımlar.

İlaçların kimyasal yapıları, ilaç metabolitleri ve

degredasyon ile ilgili problemleri açıklar.

3

Öğrenme Çıktıları

Biyolojik örneklerle ilgili işlemlerde karşılaşılan

problemleri tartışabilecektir.

Analiz yapılacak biyolojik örneklerin saklanmasını

açıklar.

Ekstraksiyon işlemlerini açıklar.

Bulaşma ve diğer hata kaynaklarını tartışır.

4

Öğrenme Çıktıları

İlaç analizinde kullanılan yöntemleri tartışabilecektir.

Spektroskopik yöntemleri açıklar.

Kromatografik yöntemleri açıklar.

Diğer Yöntemleri açıklar.

Yöntem seçimi ve ölçüm sonuçlarının

değerlendirilmesini tartışır.

5

İlaç Analizi

Yılda 5000 makale üretilir.

Analizcilerin klinisyenler, farmakokinetikçiler, biyokimyacılar ve toksikologlar için ürettiği kaba analizverileri sunulur.

Bir çok makale ve kitap analizler sırasında karşılaşılanproblemleri ele alır.

Tarihsel derlemeler belirli bir tekniğin ilk olarak kimtarafından ve ne zaman uygulandığını bildirir.

Bazı yazarlar seçicilik ve duyarlık bakımından biryöntemin diğerinden ne kadar üstün olduğunu detaylıbir şekilde açıklarlar, ancak bu üstünlüğün niçin gerekliolduğunu açıklamayı dikkate almazlar.

6

İlacın KeşfiYeni bir kimyasalın sentezi

Farmakolojik Testler

Geliştirme

Akut Toksisite Hayvan Farmakokinetikleri

Kronik Toksisite Hayvan Metabolizması

İnsanda Faz I çalışmaları

Insandaki farmakokinetikler

İnsan Metabolizması

Klinik

İnsanda Faz II çalışmaları

Compliance (uyunç) testleri

Farmakodinamikler

İlaç Pazarlama

Formülasyon geliştirme

Aşırı Doz

İlaç İzleme

Adli (Forensic) Toksikoloji

7Bir ilaç ürününün araştırma, geliştirme ve

uygulamasında analitik veri girişi gerektiren basamaklar

İlaç Kullanımı

Adli Toksikoloji

Doz aşımı

İlaç suistimali

Sporda ilaç kullanımı

Terapötik ilaç izleme

Farmakogenetik

8

Araştırma – Geliştirme Alanı

Farmakoloji

Toksikoloji

Faz-I klinik testler

Metabolizma

Farmakokinetikler

Formülasyon geliştirme

Faz-II klinik testler

Farmakodinamikler

9

Adli Toksikoloji

Bir suç işlenmişse soruşturmayı yürüten kurumun

mağdurun ölüm sonrası zehirlenmenin kanıtı olan ilgili

örneklerinin incelenmesiyle varılan sonuçları bilmek

istemesi

yabancı bir maddenin varlığı ve kimliği (ne olduğu)

ile ilgili kanıtlar

Tarama testleri (ITK)

Doğrulayıcı testler (Kromatografi + Kütle

spektrometri, IR)

10

Doz Aşımı

Toksik etki gösteren madde teşhis edildiğinde uyguntedavi başlatılabilir.

Analizin temel amacı derişimi yerine ilacın teşhisedilmesi olmasına karşın, miktar tayini belli düzeydegerekebilir.

Örneğin, ilacın düzeyi ve insandaki eliminasyonkarakteristikleri, ilacın uzaklaştırılıpuzaklaştıralamayacağı, veya vücudun eliminasyonişlemini kendi mekanizmaları ile tamamlamasını sağlayan yolların çalıştırılmasına izin verilmesi hakkındadoktorun karar vermesine olanak sağlar.

Alternatif olarak , tedavi sürerken tekrar analiz için dahafazla kan örneğinin alınması ile ilerlemeyi izlemek yararlıolabilir.

11

İlaç Suistimali

İlaç suistimalcileri (uyuşturucu müptelaları) büyük bir

olasılıkla ilaç alışkanlığı yüzünden hastalıklar

nedeniyle çalışamama, daha fazla sağlık hizmeti

kapsamı, iş yerinde daha az verim veya daha fazla

tehlike oluşturma olayları yaşarlar.

ilaç testleri aday seçimi işlemlerinin rutin uygulanan

bir parçasıdır.

En fazla test edilen madde marihuanadır.

İdrar en yaygın kullanılan test örneğidir.

12

Sporda İlaç Kullanımı

At yarışlarında doping, 1666 da Worksop daki

yarışlarda uyarıcı maddelerin yasaklanması kaydına

kadar eski zamanlara uzanır.

At ve köpek yarışlarında hayvanların tamamen

ilaçsız olması gerekir.

İnsanlarla ilgili yarışmalarda doping listeleri ilgili etik

kurullar tarafından oluşturulmuştur.

Yasaklı ilaçların kullanımı idrar numunelerinde

araştırılır.

13

Terapötik İlaç İzleme

Toksik etkilerin meydana geldiği dozlara göre daha düşükdozlarda etkili olan yeni bileşiklerin geliştirilmesi ile zararlıetkilerden yararlı etkilerin ayrılması istenir.

Terapötik oranı (toksik düzeylerin terapötik düzeylere oranı) düşük olan, dar terapötik pencereli ilaçlar kullanılırken aşırı özengösterilerek dozlama yapılması zorunludur.

Doğru ilaç dozu uygulansa bile etki yerindeki ilaç derişimi de önemlidir.

İlaç tayinleri istenen terapötik plazma düzeyleri toksik plazmadüzeylerine yakın kişilerde ilaç dozunun titre edilmesinde çokyararlıdır, örn digoksin kan düzeyi izlenerek yüksek terapötik ve düşük toksik etki elde edilir.

Genellikle HPLC, GC gibi yöntemlerin yanı sıra radyoimmunolojik tayin (RIA) yöntemleri de sıklıkla kullanılır.

14

Farmakogenetik

Dar terapötik pencereli ilaçların doz ve kan düzeyleri arasında bireyler arası bir ilişki olmaması farklılıkların genetik temelde incelenmesine yol açmıştır.

Desipraminin farklı hastalarda ulaşılan plazma düzeylerinin 36 misli farklı olduğu ve buetkinin ilacı hidroksilleyen enzimlerin farklı aktivitelerinden kaynaklanabileceğibelirlenmiştir.

Debrisoquin ile rutin klinik farmakolojik çalışmalar sürerken gönüllülerden bazılarında ağırhipotansif yanıtlar 4-hidroksidebrisoquin’e metabolize etmekteki yetersizliğine bağlı bulunmuştur.

Enzim ile metabolit üretmedeki yetersizlik zayıf metabolizer için bir tanım üretilmesine neden olmuştur.

Hastaya test ilacı (debrisoquin, spartein, dextrometorfan) uygulanır ve belirli bir zamansonra idrarda değişmeyen ilaç ve major metaboliti ölçülür. Bu iki değerin oranı mebolizmakapasitesidir. Zayıf metabolizerlerin belirlenmesinde önemlidir.

CYP2D6 enziminin zayıf metabolizerlerin karaciğerinde olmadığı belirlenmiştir.

Metabolik kapasitenin belirlenmesi için ilaç ve metabolitinin ölçülmesi hayati önem taşır.

15

Araştırma – Geliştirme Alanı

Farmakoloji

Toksikoloji

Faz-I klinik testler

Metabolizma

Farmakokinetikler

Formülasyon geliştirme

Faz-II klinik testler

Farmakodinamikler

16

Farmakoloji

Aynı etkiyi gösteren yeni ilacın daha düşük dozunun bu etkiyi sağlaması ile ilgili araştırmalar sırasındaki ölçümler önem taşır. Aktifliği belirlemek için derişimle veya bilinen standartlarla ilişkiliolan in vitro ve in vivo farmakolojik testler yapılır. Genellikle radyoimmun testler ve reseptör bağlanma deneyleri uygulanır.

“Doz-plazma derişimi-etki” çalışmalarının sonuçları kullanılarak ilacın ilgili aktivitesi hakkında daha açık bir fikir oluşur.

İlave olarak ilacın dağılımını etkileyen faktörlerle ilgili doğru vekapsamlı bir fikir oluşur.

Araştırmacılar o zaman, vücudun tamamındaki farmakolojikgözlemlerine dayanarak ilaç adayını kabul ya da red etmekyerine, optimal in vivo etkileri elde etmek için hangi koşullarındeğiştirilebileceğine karar verebilirler.

Zayıf absorbe olan ilaçların belirlenmesinde analitik ölçüm sonuçları ilaç geliştirmede nihai kararı belirler.

17

Toksikoloji

Akut toksisite testlerinde artan ilaç dozları hayvanlara verilerek LD50 belirlenir, bu sırada plazma düzeylerinin ölçülmesi çok önemli değildir. İlaç uzman kişiler tarafından genellikle çözelti halinde tek doz ile tek hayvana uygulanır.

Kronik toksisite (KT) fazında ilaç dozları LD50 nin altında ve uzun süreli uygulanır. Bu aşamada çok sayıda deney hayvanına yem veya su ile karıştırılmış halde ilaç verilir.

KT de ilaç veya metabolitinin plazma düzeylerinin ölçülerek toksisite ile ilişkilendirilmesi gerekir.

Küçük ve büyük deney hayvanlarındaki plazma düzeylerini belirleme çalışmaları kolay bir konu değildir, sorun ve zorluklar taşır.

Toksikokinetik son yıllarda toksikologların ilgilendiği, toksikolojikbakış açısı ile ilacın absorpsiyon hızı, doku dağılımı, enzimatik ve non-enzimatik biyotransformasyonu ve atılımının incelendiği yeni bir alandır.

18

Faz Çalışmaları

İnsan denekler üstünde klinik araştırma, “faz çalışması” denilen ve dört basamakta cereyan eden bir etkinlikler dizisidir. Bu çalışmalar sonucunda yeni bir kimyasal antite ya ilaç olma özelliğini kazanır ve klinik uygulamaya sunulmak üzere ruhsat alır; ya da ruhsatlı bir ilacın pazar sonrası takibiyle sonucunda ruhsat değişikliğine gidilebilir. Yönetmelikte yer aldığı üzere ilaç klinik araştırmalarının bu “fazik safhaları” madde 15 de düzenlenmiştir ve şöyledir:

MADDE 15 – (1) İlaç klinik araştırmalarının safhaları sunlardır:

a) Faz I: Araştırma ürününün farmakokinetik özelliklerinin, toksisitesinin ve vücut fonksiyonlarına etkisinin tespit edilebilmesi için, araştırmanın niteliğine ve mahiyetine göre seçilmiş yeterli sayıda sağlıklı gönüllüye veya sağlıklı gönüllülerde çalışılmasına imkân olmayan durumlarda hasta gönüllülere uygulanmak suretiyle denendiği klinik araştırma safhasıdır.

b) Faz II: Araştırma ürününün; terapötik doz sınırlarının, klinik etkililiğinin ve emniyetinin araştırılması amacıyla, araştırmanın niteliğine ve mahiyetine göre seçilmiş yeterli sayıda gönüllü hastaya uygulanmak suretiyle denendiği klinik araştırma safhasıdır.

c) Faz III: Araştırma ürününün; araştırmanın niteliğine ve mahiyetine göre seçilmiş, yeterli sayıda gönüllü hastaya uygulanarak; etkinliği, emniyeti, yeni bir endikasyon araştırması, farklı dozları, yeni veriliş yolları ve yöntemleri, yeni bir hasta popülâsyonu ve yeni farmasötik şekiller yönünden denendiği klinik araştırma safhasıdır.

ç) Faz IV: Türkiye’de ruhsat almış ürünlerin onaylanmış endikasyonları, izinli ürünlerin ise önerilen kullanımlarına yönelik emniyetinin ve etkililiğinin daha fazla incelenmesi veya yerleşik diğer tedavi, ürün ve yöntemlerle karşılaştırılması için fazla sayıda hasta üzerinde gerçekleştirilen klinik araştırma safhasıdır.

19

Faz-I Klinik Testler

Çok düşük bir doz yakından takip edilen sağlıklı gönüllülerin küçük bir grubuna

öncelikle verilir.

Bu doz umulan terapötik dozun epeyce altında olacaktır ve gönüllüler

istenmeyen yan etkilerin herhangi bir işareti için gözlenirler.

Sonra bu doz önerilen terapötik dozun üzerinde bir sınıra yükseltilir ve bu serideki

en yüksek doz hatta hiçbir zaman uygulanmayacak ilaç dozu bile olabilir.

Beklenen bir etki görülmezse veya öngörülmeyen yüksek dozlara kadar

görülmezse bunun ilacın zayıf aktivitesinden mi veya test edilen gönüllülerdeki

zayıf absorpsiyondan mı veya farmakolojik test hayvanları ile karşılaştırıldığında

artan metabolizmadan mı olup olmadığını belirlemek önemlidir.

Plazma düzeylerinin ölçümü bu noktada çok yararlıdır. Düzeyler yüksekse insanda

ilacın inaktif olduğu kabul edilebilir ve analitik yöntem ilaç geliştirmenin

sonlandırılmasında hayati öneme sahip olacaktır.

20

Metabolizma

Hayvan metabolizma çalışmalarının başlaması insandaki toleransçalışmalarıyla aynı zamanda yapılır.

Metabolizma çalışmaların en populer nedenlerinden biri toksisite testleri içinseçilen türdeki (kobay, sıçan köpek vb) metabolizma yolaklarının insandakiile aynı olup olmadığını belirlemektir.

Eğer metabolizma yolakları 2 türde farklıysa o zaman hayvanda toksik olanbir metabolitin insanda oluşmama olasılığı mevcuttur. Bundan dolayıinsandaki toksik bir etki ile ilgili olarak yanlış bir yoruma neden olur. Tersiolarak insanda toksik, hayvanda olmayan bir metabolit oluşursa toksikpotansiyel hayvan çalışmalarından tahmin edilemez ve klinik çalışmalarsırasında beklenmeyen sonuçlar görülür.

İnsandaki ile aynı kimyasal maruziyete yol açan deney hayvanının testedilen bir türü veya test türleri kombinasyonu bulunamazsa insanda oluşanmetabolitleri sentezlemek ve toksik etkileri için bunları ayrıca test etmekgerekebilir. İlaç metabolizması çalışmaları bu yüzden kullanılan toksisitetürünün (deney hayvanının) geçerliliğini gösteren bir bilim olarak gösterilir.

21

Farmakokinetik çalışmalar

Organizmanın ilaca ne yaptığı ile ilgilenir. (Emilim, dağılım, metabolizma ve itrah)

İnsana ilaç uygulamalarının erken basamaklarında farmokokinetik verileri belirleyici kılmak içinkalitesi kanıtlanmış analitik yöntemler uygulanır.

Eğer i.v. deney yapılmışsa ilacın gerçek eliminasyon yarı ömrü ve dağılım hacmibelirlenmelidir. O zaman çeşitli doz değerleri için plazma ya da doku derişimleri yoluyla kinetikparametrelerin tahmin edilmesi için kullanılabilir.

Sonra uygun deneylerle (uygun numune alma ve tayin yoluyla) bu tahminleri test etmekgerekir. Bu yüzden insandaki erken faz testlerinde analitik yöntem kritiktir ve yaygın olarakkullanılabilir.

Önemli kararlar bu deneylere dayanarak alınır ve verilerin yüksek kalitede olması çokönemlidir. İnsanlardaki deneylerin tipik serilerinde doğrusal kinetikleri belirlemek (yani artandozda, doz sonrası eşdeğer zamanlarda plazma derişimlerinin orantılı artışını verir),biyoyararlanım (oral ve intravenöz uygulanan ilacın AUC lerinin karşılaştırılması) ve çoklu

dozları takiben birikmenin kapsamını belirlenmesinin gerekli olduğu düşünülür.

İlaç testlerinin bu fazı, modern ilaç araştırma ve geliştirmenin ciddi harcamaları içerisindeönemli bir harcama oluşturan 10000 plazma ve idrar analiziyle ilgili olabilir.

22

Formülasyon Geliştirme

İlacın temel farmokokinetiklerinin belirlenmesinden sonra

analitik yöntem ticari dozaj formunun performansını izlemek

için kullanılır. Başlangıçtaki dozaj formu oral biyoyararlanım

için formule edilir.

Böyle çalışmalar oral çözeltilerin ve geliştirilmiş formulasyonun

crossover -çapraz- dizayn biçiminde gönüllülere uygulanması

ve eğri altındaki alan, pik derişimi, pik zamanı gibi plazma

profili ile ilgili ölçütlerin karşılaştırılmasını kapsar ve aynı profile

sahip olması beklenir. (Şekil 1.11).

23

24

Şekil 1.11 Üç farklı formülasyon uygulanan hastaların tolbutamit ölçümü

ile biyoeşdeğerlik çalışmasında zaman-plazma derişimi profillerinin

karşılaştırılması

Daha ileri geliştirmeler için pik plazma düzeyleri incelenir (yani formülasyondaki

değişikliklerle absorpsiyonun yavaşlaması). Bu sırada vücudun ilacın aynı miktarına

maruz kalması sağlanır. Absorpsiyon yavaşladığında pik zamanı gecikir. Pik derişiminin

gerçek değeri azalır. Ancak eğri altındaki alan (AUC) ideal durumda değişmemelidir.

Uzun etkili (sustained release) formulasyonlar için AUC pratikte en iyi biyoyararlanım

formundan daima daha az olacaktır. Çünkü uzun etkili formulasyon absorpsiyon

yerinde sonsuza kadar kalamaz ve gerçek bir eksponansiyel eğri formulasyonun

absorpsiyon yerini terk ettiği noktada kırılacaktır, bu noktada gözlenen eğri plazmadan

ilacın atılması için normal bozunma eğrisine dönecektir (Şekil 1.12).

Formulasyon geliştirme sırasında analitik yöntem için gerekli şartlar temel

farmokokinetik beklentilerin belirlenmesi için olanlarla aynıdır. Eğer metabolizma 1.

derece hız prosesi ile yürüyorsa, metabolitlerle karşılaştırıldığında değişmeyen ilaç için

yöntemin spesifik olması gerekli bir kriter değildir.

25

26

Şekil 1.12 Uzatılmış salım formundaki ilacın absorpsiyon yerinden

uzaklaşmasının zaman-plazma derişimi profili üzerine etkisi. İlaç

absorpsiyon yerinden ayrılana kadar sistemik dolaşımda ilaç uzatılmış

plazma derişimi sergiler ve sonrasında plazma düzeyi ilacın yarı ömrüne

göre azalır.