LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA VETERINARIJOS FAKULTETAS

UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDRA

Sigita Ramonait÷

BROILERIŲ SPARNELIŲ IR BLAUZDELIŲ UŽKRöSTUMAS KAMPILOBAKTERIJOMIS

Magistro darbas

Darbo vadovas: E. doc. p., dr. Alvydas Malakauskas

Kaunas, 2010 m.

2

Magistro darbas atliktas 2008 – 2010 metais bendradarbiaujant su Lietuvos veterinarijos

akademijos Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedros doktorant÷mis.

Magistro darbą paruoš÷: Sigita Ramonait÷ ..............................

(parašas) Magistro darbo vadovas: E. doc. p., dr. Alvydas Malakauskas ..............................

(LVA Užkrečiamųjų ligų katedra) (parašas) Recenzentas: ...............................

parašas)

3

TURINYS

SANTRAUKA ................................................................................................................................ 4

SUMMARY .................................................................................................................................... 5

SANTRUMPOS .............................................................................................................................. 6

ĮVADAS .......................................................................................................................................... 7

1. LITERATŪROS APŽVALGA ............................................................................................... 8

1.1 Kampilobakterijų įvairov÷ ................................................................................................ 8

1.2 Kampilobakterioz÷s epidemiologija ................................................................................. 9

1.2.1 Žmonių susirgimai..................................................................................................... 9

1.2.2 Infekcijos šaltiniai ................................................................................................... 12

1.2.3 Kampilobakterijų kontrol÷ ir profilaktika................................................................ 14

1.2.4 Kampilobakterijų patekimas į maistą ...................................................................... 16

1.3 Identifikavimo metodai................................................................................................... 18

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS .............................................................................. 21

2.1 M÷ginių rinkimas ir kampilobakterijų išskyrimas .......................................................... 21

2.2 DNR išskyrimas ir daugin÷ PGR .................................................................................... 22

2.3 Matematin÷ duomenų analiz÷ ......................................................................................... 23

3. TYRIMO REZULTATAI...................................................................................................... 24

3.1 Broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas kampilobakterijomis .............................. 24

3.2 Kampilobakterijų kiekis ant broilerių produktų paviršiaus ............................................ 27

3.3 Identifikuotos kampilobakterijų rūšys daugin÷s PGR metodu ....................................... 30

4. REZULTATŲ APTARIMAS ............................................................................................... 33

IŠVADOS...................................................................................................................................... 38

REKOMENDACIJOS................................................................................................................... 39

LITERATŪROS SĄRAŠAS......................................................................................................... 40

4

SANTRAUKA Sigita Ramonait÷

BROILERIŲ SPARNELIŲ IR BLAUZDELIŲ UŽKRöSTUMAS

KAMPILOBAKTERIJOMIS

Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovas: e. doc. p. dr. A. Malakauskas

Lietuvos veterinarijos akademija

Veterinarijos fakultetas

Užkrečiamųjų ligų katedra

Kaunas, 2010

Darbo apimtis: 46 puslapiai, 7 lentel÷s, 6 paveikslų.

Mūsų tyrimo tikslas - įvertinti atšaldytų broilerių produktų (sparnelių ir blauzdelių)

užkr÷stumą kampilobakterijomis. Tyrimo metu buvo pasirinkti trys paukštienos gamintojai

Lietuvoje, kurių gaminiai t.y. broilerių sparneliai bei blauzdel÷s, jų neįsp÷jant, buvo perkami

parduotuv÷se vieną kartą per savaitę, 2009 m. kovo - rugs÷jo m÷nesių laikotarpyje. Iš viso buvo

ištirti 174 paukštienos produktai, iš jų 87 broilerių sparneliai bei 87 blauzdel÷s. Kiekviename

m÷ginyje termofilinių kampilobakterijų aptikimas buvo atliekamas išskiriant jas tiesiogiai s÷jant

ant mCCDA agaro bei atlikus pagausinimą Bolton sultinyje. Kampilobakterijų padermių

identifikavimas iki rūšies atliktas daugin÷s polimeraz÷s grandinin÷s reakcijos metodu.

Atlikus tyrimą nustatyta, kad termofilin÷mis kampilobakterijomis buvo užkr÷sti 46,6 %

visų tirtų broilerių produktų. Identifikuojant išskirtas kampilobakterijų rūšis, C. jejuni buvo

nustatyta 69,12 %, C. coli - 13,23 %, o abi paderm÷s kartu 17,65 % užkr÷stų m÷ginių. Kiekybinio

broilerių produktų tyrimo rezultatai parod÷, kad vidutinis Campylobacter spp. skaičius tiriant

broilerių sparnelius bei blauzdeles buvo 1,56 log10 ksv/g ir 1,53 log10 ksv/g atitinkamai.

Šio tyrimo metu nustatytas sąlyginai didelis broilerių produktų užkr÷stumas termofilin÷mis

kampilobakterijomis rodo, kad Lietuvoje parduodami žali broilerių produktai gali sudaryti riziką

žmon÷ms užsikr÷sti kampilobakterioze. Tod÷l siekiant sumažinti vartotojų riziką užsikr÷sti

kampilobakterioze per broilerių produktus būtina siekti sumažinti kampilobakterijų paplitimą

broilerių pulkuose ir tokiu būdu skatinti neužkr÷stos paukštienos gamybą.

Raktažodžiai: Campylobacter spp., broileriai, prekyba, užkr÷stumas

5

SUMMARY Sigita Ramonait÷

CONTAMINATION OF BROILER CHICKEN WINGS AND DRUMSTICKS WITH

CAMPYLOBACTER SPP.

Master thesis

Work instructor: e. doc. p. dr. A. Malakauskas

Lithuanian Veterinary Academy

Faculty of Veterinary Medicine

Department of Infectious Diseases

Kaunas, 2010

The coverage of the work 46 pages, 7 tables and 6 pictures.

The present study was designed to investigate the occurrence and numbers of

Campylobacter spp. on broiler chicken wings and drumsticks at the retails level of the three main

poultry meat producers in Lithuania. Samples of chicken wings and drumsticks were collected of

each poultry meat producer by visiting randomly selected retail shops once a week from March

till October, in 2009. A total of 87 chicken wings and 87 drumsticks samples were collected and

tested for Campylobacter spp. contamination. Thermophilic Campylobacter spp. were isolated by

both direct inoculation on mCCDA selective medium and by selective enrichment in Bolton

enrichment broth. Multiplex-PCR method was used for detection and identification of

thermophilic Campylobacter species.

Our findings showed that overall 46.6 % (81 out of 174) of the collected samples were

contaminated with campylobacters. C. jejuni has been found in 69.12 % of the tested samples C.

coli in 13.23 % and both species together in 17.65 % respectively. The mean number of

Campylobacter bacteria detected on wings at the retail was 1.53 log10 CFU/g and on drumsticks

1.56 log10 CFU/g.

This study showed high occurrence of broiler meat contamination with Campylobacter spp.

at a retail level in Lithuania. Therefore the risk for consumers should be evaluated and an

improvement of control measures at poultry production and retail level should be considered to

reduce the risk for consumer’s infection with Campylobacter spp.

Key words: Campylobacter spp., broiler, retail, occurrence, contamination.

6

SANTRUMPOS

µl – mikrolitrai

µm – mikrometrai

ANOVA - dispersin÷ analiz÷

bp - bazių pora

DNR - deoksiribonukleorūgštis

EFSA – Europos maisto saugos tarnyba

ELISA – imunofermentinis metodas

ksv – kolonijas sudarantys vienetai

PGR - polimerazin÷ grandinin÷ reakcija

PSO – Pasaulio sveikatos organizacija

rRNR – ribosomin÷ ribonukleino rūgštis

RVASVT - rizikos veiksnių analiz÷ svarbiuose valdymo taškuose

7

ĮVADAS

Kaip ir pastaruosius ketverius metus, kampilobakterijos 2008 m. Europos Sąjungoje (ES) ir

toliau išlieka dažniausiai žarnyno uždegimą sukeliančios bakterijos. Tačiau, užregistruotų

kampilobaterioz÷s atvejų skaičių 2008 m. palyginus su 2007 m. sumaž÷jo 5 %. Dažniausiai

kampilobakterioz÷ buvo siejama su broilerių m÷sa arba kitais nepatikslintais m÷sos produktais.

ES bendras kampilobakterioz÷s atvejų skaičius 2008 m. buvo 40,7/100000 (susirgimai/gyventojų

skaičiui), tačiau skirtingose šalyse svyruoja nuo <0,1/100000 Rumunijoje iki 193,3/100000

Čekijos Respublikoje, o Lietuvoje buvo nustatyta 22,6/100000 (EFSA, 2010).

Žmon÷ms kampilobakteriozę sukelia termofilin÷s kampilobakterijos. Dažniausiai tai būna

Campylobacter jejuni, C. coli ir C. laris rūšys, tačiau yra ir kitų kampilobakterijų rūšių galinčių

sukelti infekcijas žmon÷ms (EFSA, 2009). Klinikinius virškinamojo trakto sutrikimus gali sukelti

ir labai nedideli kiekiai šių bakterijų iki 500 ksv/g, tačiau tai priklauso nuo amžiaus bendros

fizin÷s būkl÷s, vaikams ši doz÷ gali būti žymiai mažesn÷ (Kothary ir Buba, 2001). Pagrindinis

kampilobakterijų šaltinis žmon÷ms yra žalia ar nepakankamai gerai termiškai apdorota broilerių

m÷sa, arba jau po terminio apdorojimo bakterijomis užteršti maisto produktai (Cools ir kt., 2005).

Luber ir kt., 2005 metais tyrin÷jo šviežios paukštienos kulšeles ir pri÷jo išvados, kad

kampilobakterijos ant paukštienos produktų yra pasiskirsčiusios netolygiai. Daugiausia

kampilobakterijų yra ant produktų paviršiaus, tuo tarpu produkto gilesniuose audiniuose jų

pasitaiko rečiau. Kadangi Lietuvoje n÷ra pakankamai duomenų apie kampilobakterijų paplitimą

ant broilerių produktų mažmenin÷je prekyboje, mes tyrin÷jome atv÷sintus broilerių sparnelius ir

blauzdeles. Buvo siekiama kiekybiškai ir kokybiškai įvertinti kampilobakterijas esančias ant

tiriamųjų produktų paviršiaus.

Darbo tikslas: Įvertinti atšaldytų broilerių produktų (sparnelių ir blauzdelių) užkr÷stumą

kampilobakterijomis.

Darbo uždaviniai:

• Išskirti kampilobakterijas klasikiniu metodu nuo atv÷sintų sparnelių ir blauzdelių

• Nustatyti tiriamųjų produktų bendrą užkr÷stumą kampilobakterijomis

• Identifikuoti išskirtas kampilobakterijas molekuliniu metodu

8

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Kampilobakterijų įvairov÷

Kampilobakterijos yra mažos (0,2-0,9 µm pločio ir 0,2-5,0 µm ilgio), sporų

neformuojančios, spiral÷s, žuv÷dros ar S formos, Gram-neigiamos, termofilin÷s bakterijos. Šios

bakterijos yra judrios, juda greitai ir charakteringai sukdamosis spirale žiuželių pagalba.

Kampilobakterijomis gali užsikr÷sti ir žmon÷s, tod÷l jos laikomos zoonotiniais patogenais (Park,

2002). Campylobacteriaceae šeimai priklauso 18 rūšių, šeši porūšiai ir du biovariantai.

Dažniausiai žmon÷ms infekcijas sukelia Campylobacter jejuni (1 pav.) ir C. coli, o

besivystančiose šalyse svarbios yra ir C. upsaliensis (Dingle ir kt., 2002; Gurtler ir kt., 2005).

Žmon÷ms patogeniškų rūšių augimo temperatūros diapazonas gana siauras, nuo 30 °C iki 46 °C.

Campylobacter spp. palyginti l÷tai augančios, jautrios aplinkos veiksniams bakterijos, kurioms

reikalingos specifin÷s augimo sąlygos. Geriausiai jos auga mitybin÷je terp÷je praturtintoje 5-10%

krauju, prie mažo deguonies kiekio. Šios bakterijos labai skiriasi nuo kitų per maistą plintančių

bakterinių patogenų, nes jos yra mikroaerofilai, geriausiai auga atmosferoje, kur yra apie 10%

CO2 ir maždaug 5% O2 (Humphrey ir kt., 2007).

1 pav. C. jejuni (Humphrey ir kt., 2007)

Kampilobakterijos yra labai nestabilios, ypatingai greitai genetiškai kinta C. jejuni rūšis,

tod÷l greitai prisitaiko prie nepalankių sąlygų (Murphy ir kt., 2006). Tai lemia, kad

kampilobakterijos turi labai didelę genetinę įvairovę. Tyrimai atskleidžia daug didesnį

9

kampilobakterijų genetinį kintamumą, lyginant su kitomis žarnyno bakterijomis. Šie skirtumai

n÷ra tik labai dideli DNR pakitimai, daug dažniau pasitaiko maži pakitimai (Park, 2005).

Campylobacter gentis, kartu su Arcobacter ir Sulfurospirillum priklauso

Campylobacteriaceae šeimai (Vandamme, 2000 ). Sistematin÷ klasifikacija:

Karalyst÷: Bacteria

Tipas: Proteobacteria

Klas÷: Epsilonproteobacteria

Būrys: Campylobacterales

Šeima: Campylobacteraceae

Gentis: Campylobacter

C. concisus C. curvus C. hominis, C. sputorum, C. rectus, C. showae ir C. gracilis yra

glaudžiai susiję filogenetiškai. Dauguma šių rūšių rasta žmogaus burnos ertm÷je, C. hominis

išskirta tik iš žmogaus žarnyno, o C. sputorum, kuri turi du porūšius buvo rasta žarnyne ir

lytiniuose takuose tokių gyvūnų kaip avys ir galvijai (On ir kt., 1998). Filogenetin÷s analiz÷s

būdu nustatyta, kad C. hyointestinalis subsp. lawsonii C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis C.

laninae C. fetus subsp. veneralis ir C. fetus subsp. fetus taip pat yra glaudžiai susiję. C. fetus

subsp. veneralis dažniausiai randama galvijų dauginimosi organuose ir yra susijusi su galvijų

genitalijų kampilobakterioze (galvijų nevaisingumu). Pagrindinis C. fetus subsp. fetus

šeimininkas yra avys ir galvijai, šis porūšis sukelia savaiminį galvijų ir avių persileidimą. C.

jejuni turi du porūšius, C. jejuni subsp. jejuni, kuri yra dažniausia ūmaus enterito priežastis

žmon÷ms, ir C. jejuni subsp. doylei, kuri daugiausia susijusi su vaikų viduriavimu

besivystančiose šalyse (Fernandez ir kt., 1997).

1.2 Kampilobakterioz÷s epidemiologija

1.2.1 Žmonių susirgimai

Kampilobakterijos yra viena iš pagrindinių žmonių bakterin÷s kilm÷s diar÷jos priežasčių

pasaulyje. Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) apskaičiavo, kad kampilobakterijomis kasmet

užsikrečia ~ 1% Vakarų Europos gyventojų (Humphrey ir kt., 2007).

10

Pasaulyje žmonių bakterinę diar÷ją dažniausiai sukelia C. jejuni subsp. jejuni. Šios

bakterijos paprastai randamos įvairių gyvūnų žarnyne, bet pagrindinis šaltinis yra naminiai

paukščiai (Broman ir kt., 2000). Kampilobakteriozei būdingas sezoniškumas (2 pav.).

2 pav. Patvirtintų kampilobakterioz÷s atvejų skaičius 100000 gyventojų, per m÷nesį

2008 m. EFSA duomenimis (EFSA, 2010)

Campylobacter spp. gali būti perduodamos žmon÷ms tiesiogiai po sąlyčio su gyvūnais ar

vartojant bei tvarkant užterštus maisto produktus. Apie kai kurių šalių broilerių fermų, produktų

užkr÷stumą kampilobaterijomis, taip pat kampilobakterioz÷s atvejus pateikti duomenys 1

lentel÷je. Išsivysčiusiose šalyse, visų amžiaus grupių žmon÷s yra vienodai imlūs

kampilobakterijoms, tačiau besivystančiose šalyse kampilobakterioz÷ yra tokia dažna vaikyst÷je,

kad vaikams susidaro imunitetas, tod÷l retai serga vyresni vaikai ir suaugę žmon÷s (Skirrow,

1994).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

M÷nesiai

1000

00 g

yven

tojų

11

1 lentel÷ Broilerių fermų, skerdenų užkr÷stumas kampilobakterijomis ir

kampilobakterioz÷s atvejų skaičius 100000 gyventojų 2008 metais (EFSA, 2010)

Šalis Broilerių

fermų užkr÷timas %

Broilerių skerdenų mažmenin÷je prekyboje

užkr÷stumas %

Kampilobakterioz÷s atvejai 100000

gyventojų Austrija 60,0* 8,0 51,4 Danija 25,9 36,6 63,4

Vokietija 32,2 36,4 78,7 Latvija 37,0* 9,8 0,0

Liuksemburgas - 49,2 90,7 Olandija - 14,1 39,2 Slov÷nija 75,3* 74,6 4,3 Ispanija 46,1* 13,3 11,4 Lietuva 42,0 - 22,6

* pažym÷ti 2007 metų duomenys; - duomenų n÷ra.

Kampilobakterioz÷s inkubacinis periodas gali trukti 1-10 dienų, tačiau daugeliui žmonių

klinikiniai simptomai pasireiškia per 4 dienas. Ligos patogenezę nulemia didelis kampilobakterijų

adhezinis ir invazinis aktyvumas. Jų prisitvirtinimą prie gleivin÷s lemia paviršiniai saviti

adhezijai ir žiuželiai. Jos lengvai prasiskverbia pro gleives, epitelinių ląstelių membranas ir

greitai kolonizuoja plonąją žarną, sukeldamos gleivin÷s pokyčius ir paburkimą, pasireiškiantį

enterokolitu. Patogeniškumui svarbūs ir gaminami termolabilūs bei termostabilūs enterotoksinai.

Termolabilaus enterotoksino veikimas panašus į viduriavimą sukeliančius ešerichijų ir choleros

viriono toksinus. Termostabilus enterotoksinas (endotoksinas) išsilaisvina žuvus

kampilobakterijoms ir turi gramneigiamų bakterijų endotoksinų savybes. Sergantiems

kampilobakterioze būdingas gausus, dažnai su krauju viduriavimas, ūmūs pilvo skausmai ir

karščiavimas. Daugumą sergančių gali pykinti (Adak ir kt., 2002).

Kampilobakterioz÷ dažniausiai per savaitę praeina savaime, tačiau maždaug 20% pacientų

simptomai gali tęstis nuo 1 iki 3 savaičių (Allos ir Blaser, 1995). Komplikacijos pasitaiko retai.

Kai kuriems žmon÷ms kampilobakterioz÷ gali komplikuotis artritais (sąnarių uždegimais),

kitiems išsivysto reta liga Miller Fisher sindromas ar Guillain-Barre sindromas, kuris prasideda

pra÷jus keletui savaičių po viduriavimo, ir veikia nervų sistemą. Šis sindromas išsivysto tuomet,

kai ligonio imunin÷ sistema ima atakuoti savo paties nervus, d÷l to jie kelioms savait÷ms

paralyžiuojami. Tuomet ligonį reikia intensyviai gydyti. Guillain-Barre ir Miller Fisher

12

sindromus dažniausiai lemia C. jejuni bakterijos. Tačiau ne visos C. jejuni paderm÷s gali sukelti

šias komplikacijas (Takahashi ir kt., 2005).

1.2.2 Infekcijos šaltiniai

Kampilobakterijų šaltiniais gali būti visi gyvūnai naudojami maistui, o taip pat ir naminiai

gyvūn÷liai (2 lentel÷). Natūralioje aplinkoje, pavyzdžiui, gruntiniame vandenyje, taip pat dažnai

yra šios ligos suk÷l÷jų (Schaffner ir kt., 2004).

2 lentel÷ Kampilobakterijų rūšių šaltiniai (Humphrey ir kt., 2007)

Nr. Rūšis Šaltiniai

1. C. coli Kiaul÷s, naminiai paukščiai, galvijai, avys, laukiniai paukščiai

2. C. concisus Žmon÷s 3. C. curvus Žmon÷s 4. C. fetus subsp. fetus Galvijai, avys 5. C. fetus subsp. venerealis Galvijai 6. C. gracilis Žmon÷s 7. C. helveticus Kat÷s, šunys

8. C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis

Kiaul÷s, galvijai, žiurk÷nai, elniai

9. C. hyointestinalis subsp. lawsonii Kiaul÷s 10. C. hyoilei Kiaul÷s 11. C. jejuni subsp. doylei Žmon÷s

12. C. jejuni subsp. jejuni Naminiai ir laukiniai paukščiai, kiaul÷s, galvijai, avys, šunys, kat÷s, vanduo, pienas, triušiai, vabzdžiai

13. C. lari Laukiniai ir naminiai paukščiai, vanduo, šunys, kat÷s, beždžion÷s, arkliai, ruoniai

14. C. mucosalis Kiaul÷s 15. C. rectus Žmon÷s 16. C. showae Žmon÷s 17. C. sputorum bv. Sputorum Žmon÷s, galvijai, kiaul÷s 18. C. sputorum bv. Faecalis Avys, jaučiai 19. C. upsaliensis Šunys, kat÷s 20. C. insulaenigrae Ruoniai, delfinai 21. C. lanienae Galvijai, kiaul÷s, žmon÷s 22. C. hominis Žmon÷s

13

Naminiai paukščiai yra pagrindinis termofilinių kampilobakterijų šaltinis (Jørgensen ir kt.,

2002). Tikriausiai tai įtakoja aukšta paukščių kūno temperatūra, kuri ypač palanki šioms

bakterijoms. Broileriams užsikr÷tusiems kampilobakterijomis n÷ra ligos simptomų, jie dideliais

kiekiais išskiria šias bakterijas su išmatomis, paprastai 108 ksv grame išmatų. Paukščių pulke

bakterijos gali plisti nuo viščiuko viščiukui koprofagijos būdu, taip pat per orą, užterštą pašarą ar

vandenį (Stern ir kt., 1995).

Tiriant Kanadines žąsis, migruojančias antis ir kopines gerves, visose šiose rūšyse rastas

didelis kiekis C. jejuni (Pacha ir kt. 1998), tod÷l manoma, kad laukiniai paukščiai turi svarbų

vaidmenį platinant bakterijas aplinkoje. Tačiau Broman ir kt. (2004) teigia, kad laukinių paukščių

štamai labai skiriasi nuo patogeniškų žmon÷ms.

Evans (1993) teigia, kad sezoninei žmonių kampilobakteriozei gali tur÷ti įtakos šuniukų

gimimas ir tai, kad jie auginami kambaryje. Jeigu šuniukai užsikr÷tę kampilobakterijomis, jos

išplatinamos žmonių gyvenamojoje aplinkoje.

Galvijai, avys ir kiaul÷s paprastai būna užsikr÷tę C. jejuni ir C. coli. Manoma, kad šie

gyvūnai kampilobakterijomis užsikrečia iš užkr÷stos aplinkos (Humphrey ir kt., 2007).

Humphrey ir Beckett (1987) atskleid÷ ryšį tarp vandens iš gamtinių šaltinių vartojimo ir

melžiamų karvių užsikr÷timo kampilobakterijomis. Didžioji bandos dalis būna užsikr÷tusi šiomis

bakterijomis. Tačiau skirtingų gyvūnų organizmuose būna skirtingas kampilobakterijų kiekis, tai

priklauso nuo individualių savybių, kai kurie bandos gyvūnai būna iš viso neužsikr÷tę. Bendras

bandos individų užsikr÷timas atspindi aplinkos užkr÷stumą.

Jeigu pieninių galvijų žarnyne yra kampilobakterijų, dažnai melžimo metu šiomis

bakterijomis užteršiamas pienas. Tinkama higiena melžimo metu gali sumažinti užsikr÷timo lygį,

tačiau tai n÷ra visiškai veiksminga kontrol÷s priemon÷. Vienintelis būdas užtikrinti, kad žmon÷s

būtų apsaugoti nuo užsikr÷timo kampilobakterijomis per pieną yra pieno pasterizacija. Yra buvę

protrūkių, kuriuos suk÷l÷ pasterizuotas pienas, tačiau tai yra susiję su pieno užteršimu po

pasterizacijos arba nesilaikant technologinių reikalavimų pasterizacijos metu (Humphrey ir kt.,

2007).

14

1.2.3 Kampilobakterijų kontrol÷ ir profilaktika

Gyvūnai, kurie yra auginami ganyklose, dažniau užsikrečia kampilobakterijomis, negu tie,

kurie auginami uždarose patalpose (Heuer ir kt., 2001). Kampilobakterijos paprastai randamos

natūralioje aplinkoje, tod÷l dažniau užsikrečia gyvūnai, kurie turi tiesioginį kontaktą su jomis

(Humphrey ir kt., 2007).

Ūkyje turi būti kontroliuojamas horizontalus kampilobakterijų perdavimas.

Kampilobakterijos patekusios į naminių paukščių pulką labai greitai išplinta ir tuo metu jų

neįmanoma kontroliuoti. Kampilobakterijos į paukštyną patenka iš išorin÷s aplinkos, tod÷l

svarbiausia kontrol÷s priemon÷ yra neleisti ar apriboti kontaktą su išorine aplinka. Taigi, tinkama

biosauga uždarame paukščių ūkyje yra pagrindin÷ prevencijos priemon÷. Ūkininkai ir veterinarai

lankosi broilerių pulkuose per visą jų auginimo ciklą. Kiekvienas vizitas padidina infekcijos

riziką, tod÷l apsilankymai broilerių pulkuose tur÷tų būti ribojami. Labai svarbu laikytis higienos

reikalavimų. Tinkamas kojų dezinfekavimas dezinfekavimo skystyje gali apsaugoti pulką nuo

infekcijos, dar geresn÷ apsaugos priemon÷ yra higieniniai barjerai atskiriantys naminius

paukščius nuo kitų paukščių. Išoriniai rūbai ir avalyn÷ turi būti išversti į vidinę pusę ir naudojami

kiekvieną kartą einant į paukščių pulką. Skandinavijos šalys abejoja ilgalaikiu šio metodo

veiksmingumu, tačiau tyrimais Jungtin÷je Karalyst÷je nustatyta, kad Norvegijoje taikant panašias

priemones infekcija sumaž÷jo 67%. Kampilobakterijų infekcija buvo sumažinta 50% kai dažnai

buvo keičiamas batų dezinfekavimo skystis (Anonymous, 2005). Ūkių higieną galima pagerinti

daugiau naudojant betonuotus ar kitus gerai valomus paviršius, nes juos lengviau išlaikyti švarius

ir sausus nei žolę ar dirvožemį. Taip pat labai svarbu bendroji ūkio higiena, tyrimai įvairiose

šalyse parod÷, kad ūkiuose su nepakankamai gera higiena daugiau infekuotų pulkų. Tai gal÷tų

būti susiję su dideliu kampilobakterijų kiekiu aplinkoje (Humphrey ir kt., 2007). Egzistuoja daug

papildomų kontrol÷s priemonių galinčių kontroliuoti kampilobakterijas broilerių pulkuose:

• Konkurencinis pašalinimas: Sveika, subalansuota žarnyno mikroflora yra gyvybiškai svarbi

visų gyvūnų imunin÷s sistemos vystymuisi, o imunin÷ sistema ir žarnyno komensalai

apsaugo gyvūnus nuo žarnyno ligų suk÷l÷jų. Komerciniai viščiukai paprastai auginami

sąlygose, kur jų žarnyno mikroflora negali vystytis natūraliu būdu. Siekiant viščiukuose

15

kontroliuoti salmoneles, gali būti naudojamas mišinys su nepatogeniškomis žarnyno

bakterijomis, kurios atlieka konkurencinį salmonelių pašalinimą. Šis metodas iki šiol

nebuvo s÷kminga kontrol÷s priemon÷ kampilobakterijoms. Komensalinę žarnyno

mikroflorą galima valdyti keičiant gyvūnų mitybą, kai kurių mokslininkų tyrimai parod÷,

kad viščiukai gavę tam tikrą pašarą yra labiau atsparūs kampilobakterijoms.

• Skiepai ir motininių antikūnių vaidmuo: Įvairiose šalyse atliekami tyrimai, kurių metu

siekiama nustatyti, kurie kampilobakterijų genai yra svarbūs kolonijų susidarymui paukščių

žarnyne. Šie tyrimai gal÷tų duoti pradžią vakcinai, prieš tam tikrus kampilobakterijų

ląstelių taikinius. Viščiukai gali iššaukti antikūnių padaug÷jimą, kai yra užsikr÷tę

kampilobakterijomis. Be to, didel÷ antikūnių koncentracija buvo rasta per÷jimo pulke ir jų

kiaušinių trynyje (Sahin ir kt., 2001). Viščiukai iš tokių pulkų taip pat gali būti su

teigiamais antikūniais. Tačiau duomenys apie antikūnių atsaką į kampilobakterijų infekciją

yra neaiškūs ir reikia daugiau tyrimų, kad būtų taikoma tokia kontrol÷s priemon÷. Taip pat

yra svarbu užtikrinti prieinamą vakcinos kainą.

• Gydymas bakteriofagais: Vištų žarnyne natūraliai yra virusų žinomų kaip bakteriofagai,

kurie gali atakuoti kampilobakterijas (Anonymous, 2005). Tai gali būti kontrol÷s priemon÷.

Naudojant bakteriofagų preparatus galima sunaikinti daugelį kampilobakterijų ląstelių

esančių viščiukų žarnyne. Galima gydyti kampilobakterijomis užkr÷stus pulkus likus

keletui dienų iki skerdimo siekiant sumažinti bakterijų platinimą. Tačiau šios kontrol÷s

priemon÷s trūkumas yra tas, kad gali atsirasti bakteriofagams atsparių kampilobakterijų

štamų (Humphrey ir kt., 2007).

Kaip kontrol÷s priemon÷ buvo pasiūlyta vakcinacija ir vaistų terapija, nors antibiotikų

vartojimas lemia, kad visame pasaulyje atsiranda antibiotikams atsparios kampilobakterijos

(Allos, 2001).

Paukštiena kampilobakterijomis gali būti užkr÷sta skerdenų tvarkymo metu, nuo kitų

infekuotų paukščių. Tod÷l perdirbimo įmon÷se siekiant sumažinti produktų užterštumą, būtina

taikyti RVASVT principų (Humphrey ir kt., 2007).

16

1.2.4 Kampilobakterijų patekimas į maistą

Saugius maisto produktus galima pagaminti termiškai apdorojant ir/arba slopinant patogenų

dauginimąsi, kad jų kiekis nepasiektų kenksmingo lygio. Kampilobakterijos yra jautrios aukštai

temperatūrai taikomai terminio apdorojimo metu, tačiau šios bakterijos labai kintančios, tod÷l į

tai reikia atsižvelgti taikant kontrol÷s priemones (Humphrey ir kt., 2007).

Kärenlampi ir Hänninen (2004) įrod÷, kad C. jejuni šviežiuose maisto produktuose

laikomuose žemoje temperatūroje gali išgyventi pakankamai ilgai ir sukelti pavojų vartotojui. Šių

patogenų išgyvenimo laikas priklauso nuo sąlygų kuriose maistas laikomas. Tačiau duomenys

rodo, kad kampilobakterijų skaičius užšaldytoje paukštienos skerdenoje gali likti iš esm÷s

nepakitęs net 7 dienas (Jørgensen ir kt., 2002). Nepaisant ilgo išgyvenimo laiko, beveik visais

žmonių užsikr÷timo kampilobakterijomis atvejais maistas nebuvo apdorotas pakankamai aukštoje

ir/arba žemoje temperatūroje prieš vartojant. Nepaisant to, kad kampilobakterijos yra pavojingi

patogenai žmon÷ms, mažai yra žinoma kaip kampilobakterijos reaguoja į nepalankias sąlygas

perdavimo grandin÷je nuo gyvūnų žmon÷ms ir kaip šios bakterijos išgyvena maiste ar ne maisto

aplinkoje. Taip pat yra mažai informacijos apie molekulinius mechanizmus, kurie padeda

kampilobakterijoms išgyventi stresin÷je aplinkoje susijusioje su maisto gamyba.

Kampilobakterijos yra daug jautresn÷s šilumai ir rūgštims, negu salmonel÷s arba E. coli.

Kampilobakterijos gali reaguoti į pH, temperatūros ir prieinamo deguonies pokyčius, tačiau vis

dar tiriama, ar tai gal÷tų būti tinkama kontrol÷s priemon÷, kad maistas taptų saugus. Svarbu

atminti, kad kampilobakterijos neišgyvena po pasterizacijos ir tinkamai išvirus maistą.

Kampilobakterijų tyrimai atskleid÷ jų jautrumą oksidacijos stresui. Oksidacinis stresas svarbų

vaidmenį vaidina nužudant kampilobakterijas užšaldymo-atšildymo metu. Kampilobakterijos yra

ypač jautrios osmosiniui šokui ir džiovinimui. Tai gali būti d÷l to, kad jos neturi sintez÷s ir

transporto sistemų (Gaynor ir kt., 2005).

Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) yra nustačiusi penkis punktus, kad maistas būtų

saugesnis. Tai yra:

• Laikytis švaros;

• Atskirti žaliavas ir pagamintą maistą;

17

• Kruopščiai virti;

• Maistą laikyti saugioje temperatūroje;

• Naudoti saugų vandenį ir žaliavas.

Maisto žaliavos, tokios kaip paukštiena gali sukelti riziką užsikr÷sti kampilobakterijomis

jeigu nebus pakankamai gerai apdorota termiškai arba jeigu užkr÷sta paukštiena liesis su

paruoštais vartojimui maisto produktais. Taip pat reik÷tų prisiminti, kad raudona m÷sa atsitiktinai

gali užsikr÷sti kampilobakterijomis nuo išorin÷s paukštienos pakuot÷s (Burgess ir kt., 2005;

Harrison ir kt., 2001). Maždaug apie 30 % kampilobakterioz÷s atvejų pasitaiko d÷l kryžminio

užterštumo. Svarbiausia kryžminio užterštumo priežastis yra maisto žaliavų kontaktas su

paruoštais maisto produktais. Tyrimai parod÷, kad ruošiant maistą iš labai kampilobakterijomis

užterštų žaliavų pvz. paukštienos, kampilobakterijos gali būti plačiai paskleistos maisto ruošimo

aplinkoje (Cogan ir kt., 1999). Taigi, darbo paviršius, durys ir spintelių rankenos, pjaustymo

lentel÷s, pašluost÷s ir t. t. po gaminimo iš užkr÷stų žaliavų, kartais net po valymo gali būti

užkr÷sti šiais patogenais. Labai svarbu, kad virtuv÷ po maisto gaminimo būtų išvaloma. Virtuv÷je

gaminant maistą labai svarbu laikytis tinkamos higienos, nes užteršti darbo paviršiai arba

pašluost÷s gali kelti riziką. Tiek viešojo maitinimo virtuv÷se, tiek namų virtuv÷se labai svarbu,

kad kampilobakterijomis užterštos žaliavos būtų tinkamai apdorotos termiškai. Po terminio

apdorojimo maistas turi būti saugomas, kad neužsikr÷stų pakartotinai. Yra daug būdų, kuriais

išvirti maisto produktai gali būti iš naujo užkr÷sti kampilobakterijomis. Kaip min÷ta anksčiau,

kampilobakterijos virtuv÷je plinta maisto ruošimo metu. Išnagrin÷jus vartotojų įpročius tvarkant

maistą paaišk÷jo, kad 50% vartotojų nenusiplauna rankų po žalios paukštienos ar kitos m÷sos

apdorojimo. Atsižvelgiant į aukštą paukštienos užkr÷stumą kampilobakterijomis lygį, natūralu,

kad vartotojai ir maisto tiek÷jai tur÷tų plauti skerdenas. Maistas gali būti nesaugus, jeigu verdant

maistą nepasiekiama pakankamai aukšta temperatūra. Kaip ir kitų zoonozinių patogenų, taip ir

kampilobakterijų užterštumo lygį ant virtuv÷s paviršių veiksmingai galima sumažinti valant su

valikliais, karštu vandeniu ir dezinfekavimo priemon÷mis. Tačiau vartotojai ne visada valo

teisingai, kad pašalintų kampilobakterijas nuo virtuv÷s paviršių. Tinkamas rankų plovimas

diar÷jos riziką gali sumažinti 50 % (Cogan ir kt., 1999).

18

1.3 Identifikavimo metodai

Boltonas ir kt. (1997), paskelb÷ daug metodų ir įrod÷, kad naudojant mikroaerobinę aplinką

sudarančias sistemas, galima išskirti kampilobakterijas iš klinikinių m÷ginių. Identifikavimui

paprastai reikalingas bakterijų pagausinimas. Kampilobakterijų patvirtinimas iš maisto ir aplinkos

m÷ginių gali užtrukti 5 dienas, tai sukelia sunkumų protrūkių metu. Naudojant įvairius reikmenis

galima sutrumpinti išskyrimo ir patvirtinimo laika.

Imunologiniai metodai:

Kampilobakterijos sukelia užkr÷stų šeimininkų antikūnių atsaką ir šitie baltymai gali būti

naudojami greitam patogenų išaiškinimui ir/arba patvirtinimui maiste. Grup÷ Airijoje (Grennan ir

kt., 2001) apibūdino PGR – ELISA metodą, kampilobakterijų aptikimui ir išskyr÷ C. jejuni ir C.

coli iš paukštienos m÷ginių. PGR tyrimų taikinys yra kampilobakterijų DNR oligonukleotidų

zondų 16S/23S rRNR tarpgenin÷s sritys. Jų tyrimai parod÷, kad PGR – ELISA metodo pagalba

galima aptikti kampilobakterijas ir iki galo identifikuoti C. jejuni ir C. coli pagausintuose

paukštienos m÷sos m÷giniuose.

Fenotipinis metodas:

Dažniausiai kampilobakterijos nustatomos remiantis klasikin÷mis fenotipin÷mis savyb÷mis,

įskaitant kolonijų morfologiją, judrumą, katalaz÷s, oksidaz÷s, hipurato hidroliz÷s testais, H2S

gamyba, jautrumas antibiotikams cefalotinui ir nalidikso rūgščiai (Nachamkin, 2003). Klasikinio

fenotipinio identifikavimo metodo trūkumas yra tas, kad rūšių išskyrimas dažnai remiasi viena ar

dviem skirtingomis charakteristikomis pavyzdžiui, hidrolaz÷s ir ureaz÷s aktyvumu. Hipurato

hidroliz÷s aktyvumo testas atskiria daugelį C. jejuni padermių nuo kitų kampilobakterijų rūšių.

Tačiau pasteb÷ta, kad 5 – 8 % C. jejuni nepasireiškia hipurato aktyvumas ir yra klaidingai

neigiamas hipurato hidroliz÷s testas. Be to, daugelyje šalių padid÷jo C. jejuni ir C. coli

atsparumas chinolonams (Engberg ir kt., 2005). Tai sukelia problemų identifikuojant rūšis, kai

išimtinai taikomas tik fenotipinis tyrimas, tačiau šis metodas dažniausiai naudojamas išskirti

Campylobacter spp. įprastose laboratorijose. Nor÷dami tiksliai nustatyti netipišką C. jejuni ir

kitas kampilobakterijas reikia atlikti papildomus biocheminius testus ir/arba molekulinius

metodus jeigu yra reikalinga (On, 1996). N÷ra nustatyta, kad kampilobakterijų identifikavimui

naudojamos komercin÷s sistemos yra tikslesn÷s negu tradiciniai metodai. Pavyzdžiui,

19

kampilobakterijų identifikavimo komercinis rinkinys API Campy (API Biomériux Ltd., Marcy

l’Etoile, France) klaidingai identifikuoja kai kurias rūšis, jo d÷ka negalime atskirti C. concisus

nuo C. mucosalis, taip pat reikia būti labai atidiems identifikuojant tam tikras C. coli ir C. lari

padermes (Reina ir kt., 1995; On, 1996).

Molekuliniai metodai:

DNR paremti aptikimo metodai, tokie kaip PGR yra naudojami kampilobakterijoms

identifikuoti. Priešingai nei klasikiniais metodais, kai nustatomos tik gyvos bakterijos galinčios

augti, genomu paremti metodai aptinka DNR tiek iš gyvų, tiek mirusių bakterijų. Tai nesudaro

problemų, kada m÷giniai yra šviežių išmatų arba iš aklosios žarnos su dideliu skaičiumi

gyvybingų kampilobakterijų, tačiau yra rimtų sunkumų, kada tiriami aplinkos ar maisto m÷giniai,

kuriuose yra ir gyvų ir mirusių bakterijų. Pavyzdžiui, virtoje paukštienoje bus didelis skaičius

žuvusių kampilobakterijų. Šis molekulinių metodų trūkumas yra susijęs ne tik su

kampilobakterijomis, bet ir su kitais mikroorganizmais. Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija (PGR)

tai nebrangus ir greitas specifinių DNR atkarpų pagausinimo (amplifikacijos) metodas, galintis

per keliolika minučių pagaminti tūkstančius specifinių DNR fragmentų iš nedidelio kiekio DNR.

PGR ciklas susideda iš 3 etapų:

• DNR išvyniojimas: aukštoje temperatūroje dviguba DNR grandin÷ išsivynioja ir tampa

prieinama jungčiai su vienos DNR grandin÷s specialiai tam pagamintais 2 pradmenimis;

• Pradmenų prijungimas: sumažinus temperatūrą, DNR pradai prisijungia prie bandomos

DNR molekul÷s atkarpose, kurių sekos sutampa su prado sekomis;

• DNR sintez÷: pak÷lus temperatūrą, pradedant nuo pradmens, sintetinama nauja DNR

grandin÷ DNR polimeraz÷s enzimo pagalba pagal bandomos DNR nukleotidų sekas.

Ciklas kartojamas kelis kartus, kuo daugiau ciklų tuo daugiau pagaminama DNR

fragmentų. Pagausinti fragmentai matomai elektroforez÷s gelyje.

Siekiant aptikti kampilobakterijų genties bakterijas naudojamas 16S rRNR regionas, jis yra

PGR taikinys, tuo tarpu mažiau specifiniai lokusai yra skirti nustatyti konkrečias rūšis. Vienas iš

pavyzdžių yra hipO genas pas C. jejuni (Bang ir kt., 2002). Tradicinis PGR aptikimas gali

reikalauti daug pastangų d÷l techninių darbuotojų patirties, kurios reikia siekiant išvengti

kryžmin÷s amplifikuotos DNR taršos. D÷l šios ir kitų priežasčių buvo sukurta tikro laiko PGR

(Yang ir kt., 2005). Šis metodas reikalauja mažiau pastangų iš techninio personalo, tod÷l jį gali

20

atlikti žmon÷s turintys mažiau patirties. Be to, šis metodas papildo kiekybinius aptikimo

aspektus, kai ciklų skaičius pasiekia ribinę vertę, tai ši reikšm÷ yra tiesiogiai susijusi su pradiniu

kampilobakterijų skaičiumi m÷ginyje, jeigu m÷ginys n÷ra iš anksto pagausintas. PGR metodų

trūkumas, tačiau šis trūkumas bendras ir kitiems metodams, yra tas, kad daugelis laboratorijų yra

susikūrę protokolus pagal kuriuos dirba, tačiau rezultatų negalima palyginti su kitomis

laboratorijomis, nes jos naudoja skirtingus protokolus (Wang, 2002).

21

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS

2.1 M÷ginių rinkimas ir kampilobakterijų išskyrimas

Tyrimams buvo pasirinkti trys didžiausi paukštienos produktų gamintojai Lietuvoje, kurių

gaminiai buvo perkami jų neįsp÷jant. Iš įvairių Lietuvos prekybos centrų nuo 2009 metų kovo

m÷nesio iki 2009 metų spalio m÷nesio, kas savaitę buvo perkami įmonių A, B ir C (kodinis

žym÷jimas) atv÷sinti broilerių sparneliai ir blauzdel÷s. Iš viso buvo ištirti 174 m÷giniai, iš jų 87

broilerių sparneliai ir 87 blauzdel÷s.

Kiekvieną savaitę paimti m÷giniai buvo tiriami kampilobakterijų atžvilgiu. Iš kiekvieno

m÷ginio bakterijos buvo išskiriamos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir atlikus pagausinimą

Bolton sultinyje. Kampilobakterijų kiekybin÷je analiz÷je naudojami tik tie m÷giniai, kur

bakterijos buvo išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro.

Kampilobakterijos buvo tiriamos nuo produktų paviršiaus, tod÷l m÷ginys buvo skalaujamas

buferiniame peptono vandenyje ir daromi dešimtkarčiai praskiedimai. Kiekvienas produktas buvo

įdedamas į sterilų vienkartinį maišelį ir užpilamas 100ml buferiniu peptono vandeniu (BPW;

Oxoid Ltd., Basingstoke, UK), taip paruoštas m÷ginys rankiniu būdu buvo maišomas 1min. Po

to, buvo atlikti 5 dešimtkarčiai praskiedimai su buferiniu peptono vandeniu. Į sterilias

vienkartines l÷kšteles paruoštas su selektyvia mCCDA terpe buvo pas÷ta po 0,1 ml m÷ginio iš

atitinkamų praskiedimų. Pas÷tos l÷kštel÷s su mCCDA terpe buvo inkubuojamos 37 °C

temperatūroje, 48 val., mikroaerofilin÷mis sąlygomis (85% azoto, 10% anglies dioksido ir 5%

deguonies, Campygen CN25; Oxoid Ltd, Anglija). Po inkubacijos l÷kštel÷se su mCCDA buvo

skaičiuojamos kampilobakterijoms būdingos kolonijos, kurios v÷liau buvo patikrinamos fazinio

kontrasto mikroskopu, vertinant jų morfologiją ir judrumą. Po to, iš kiekvienos l÷kšteles buvo

atrenkama iki 5 kolonijų ir kiekviena kolonija pas÷jama į l÷kšteles su kraujo agaru (Blood Agar

Base No. 2 (Liolfilchem, Italy)), praturtintu 7 % arklių krauju ir inkubuojama 37 °C, 48 val. Po

inkubavimo gryna kultūra buvo saugoma – 70 °C, BHI sultinyje (BHI; Oxoid Ltd., Basingstoke,

UK) turinčiame 20 % glicerolio (glycerol; "Stanlab" Poland).

22

Kiekvienas m÷ginys atitinkamai buvo pagausinamas Bolton sultinyje. Ir tuo atveju jeigu

kampilobakterijos nebuvo išskiriamos iš tiesioginio s÷jimo ant mCCDA agaro, buvo atliekami

s÷jimai iš pagausinimo. Į m÷gintuv÷lį su selektyviu Bolton pagausinimo sultiniu (CM0983;

Oxoid Ltd., England), selektyviu Bolton sultinio priedu (SR0183E; Oxoid Ltd., England) ir 5 %

arklio krauju (SR0048; OxoidLtd., England) buvo s÷jama 0,1ml pradinio skiedimo m÷ginio.

Pagausinimo m÷gintuv÷liai buvo inkubuojami mikroaerofilin÷mis sąlygomis, 42 °C, 24h. Po

inkubacijos 10 µl sultinio buvo s÷jama į l÷kšteles su mCCDA agaru. Kampilobakterijų

nustatymas ir išgryninimas atliekamas taip pat kaip buvo aprašyta anksčiau.

2.2 DNR išskyrimas ir daugin÷ PGR

DNR išskyrimas: Nuo l÷kštel÷s su kraujo agaru surenkama pilna kilpel÷ grynos

kampilobakterijų kultūros ir perkeliama į m÷gintuv÷lį su 500 µl distiliuoto vandens. Taip

paruoštas tirpalas yra kaitinamas termomikseryje 100 °C, 10 min., po to 5min. centrifuguojama

14 000 aps/min. Supernantas perkeliamas į naują m÷gintuv÷lį, o išskirta DNR iškarto naudojama

PGR, arba užšaldoma -20 °C iki tyrimo.

Kampilobakterijų aptikimas ir atskyrimas naudojant daugine PGR: Kampilobakterijos

buvo identifikuojamas iki rūšies naudojant šiek tiek pakeistą Wang ir kt. (2002) aprašytą metodą

ir pradmenis. Naudojant pradmenis 23SF ir 23SR susidar÷ 650 bp fragmentai, kurie pasireiškia

visose kampilobakterijose. C. jejuni amplifikuoto fragmento ilgis 323 bp, o C. coli – 126 bp,

tyrimams buvo naudojamas pradmenų oligonukleotidų mišinys hibridizuojantis su C. jejuni hipO

genu (pradmenys CJF ir CJR) ir su C. coli glyA genu (pradmenys CCF ir CCR).

Bendras PGR reakcijos mišinio kiekis vienam m÷giniui buvo 25 µl. Kiekvienas PGR

mišinys buvo ruošiamas iš 2 µl 2 mM deoksinukleozido trifosfato mišinio, 2,5 µl 10X reakcijos

buferio, 2,5 µl 25 mM MgCl2, 0.25 µl HotStart Taq DNR polimeraz÷s (MBI, Fermentas), 0,75 µl

100 µM pradmenų mišinio, kuris sudarytas iš 23S rRNR C. jejuni ir C. coli pradmenų, 2,5 µl

chromosomų DNR ir distiliuoto H2O iki 25 µl. PGR produktai buvo analizuojami elektroforez÷s

gelyje. Po 11 µl kiekvieno PGR produkto buvo pakraunama į 1,3 % TopVision™ LM GQ

agaroz÷s gelį (MBI, Fermentas), kuriam buvo 0,05 µl/ml etidžio bromido tirpalo. PGR rezultatai

23

atlikus elektroforezę buvo vertinami padarius nuotraukas UV spindulių šviesoje. Buvo naudojami

GeneRulerTM100 bp DNA Ladder (MBI, Fermentas) molekuliniai žymenys.

2.3 Matematin÷ duomenų analiz÷

Matematiškai duomenys apdorojami statistiniais, Microsoft Office Excel 2007, SPSS 16.0

programiniais paketais.

Ryšiui tarp kintamųjų įvertinti buvo skaičiuojami Pirsono ir Spirmeno koreliacijos

koeficientai. Siekiant išsiaiškinti veiksnių įtaką priklausomam kintamajam buvo taikoma

daugiafaktorin÷ dispersin÷ analiz÷ (ANOVA). Vertinant skirtumus tarp nepriklausomų,

neparametrinius duomenis turinčių imčių buvo skaičiuojamas chi-kvadratas. Skirtumai tarp imčių

besiskiriančių pagal vieną požymį buvo vertinami skaičiuojant vienfaktorinę ANOVA.

24

3. TYRIMO REZULTATAI

3.1 Broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas kampilobakterijomis

Užkr÷stumo tyrimai parod÷, kad 46,6 % visų tirtų broilerių produktų buvo užkr÷sti

termofilin÷mis kampilobakterijomis, o iš jų 16,7 % bakterijos buvo išskirtos tik po pagausinimo

Bolton sultinyje (3 lentel÷).

Broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis tarp įmonių A, B ir C buvo

reikšmingai skirtingas (χ2=15,52; df=2; p=0,001). Daugiausia kampilobakterijomis užkr÷stų

broilerių produktų buvo įmon÷je A, - 67,2 %, iš jų 50,0 % išskirta tiesiogiai s÷jant ant mCCDA

agaro ir 17,2 % po pagausinimo Bolton sultinyje. Įmon÷je C buvo užkr÷sta 39,7 % broilerių

produktų, 13,8 % išskirta tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro, ir 25,9 % po pagausinimo.

Mažiausia kampilobakterijomis užkr÷stų broilerių produktų buvo įmon÷je B, 32,8 %, iš jų 25,9 %

išskirta tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir tik 6,9 % po pagausinimo. Gamintojo A broilerių

produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis yra reikšmingai didesnis negu gamintojo B

(χ2=13,79; df=1; p=0,00) ir C (χ2=8,87; df=1; p=0,00). Broilerių produktų užk÷stumas

kampilobakterijomis tarp gamintojų B ir C reikšmingai nesiskyr÷ (χ2=0,6; df=2; p=0,44).

3 lentel÷ Įmonių A, B ir C broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis

Gamintojai M÷ginių

sk.

Teigiamų m÷ginių sk.

išskirtų tiesiogiai %

Teigiamų m÷ginių sk. po pagausinimo

% Viso

teigiamų m÷ginių sk.

%

A 58 29 50,0 10 17,2 39 67,2

B 58 15 25,9 4 6,9 19 32,8

C 58 8 13,8 15 25,9 23 39,7

Viso: 174 52 29,9 29 16,7 81 46,6

Kampilobakterijomis buvo užkr÷sta 44,9 % blauzdelių, iš jų 31,0 % kampilobakterijų

išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro, o 13,9 % po pagausinimo Bolton sultinyje (4

lentel÷). Sparnelių užkr÷stumas buvo panašus kaip ir blauzdelių, kampilobakterijomis užkr÷sta

48,1 % sparnelių, iš jų 28,7 % kampilobakterijų išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir

25

19,4 % po pagausinimo Bolton sultinyje. Reikšmingo skirtumo tarp užkr÷stų sparnelių ir

blauzdelių n÷ra (χ2=0,21; df=1; p=0,65). Visi sparneliai ir blauzdel÷s vienodai užkr÷sti

kampilobakterijomis.

Paskaičiavus neparametrinį rangų koreliacijos koeficientą, buvo nustatyta, kad yra vidutinio

stiprumo teigiamas ryšys tarp kampilobakterijomis užk÷stų ir neužkr÷stų sparnelių ir blauzdelių

(r=0,56, p=0,0000).

Nustatytas reikšmingas skirtumas tarp gamintojų A, B ir C blauzdelių užkr÷stumo

kampilobakterijomis (χ2=12,43; df=2; p=0,002). Daugiausia kampilobakterijomis užkr÷stų

blauzdelių buvo įmon÷je A 69,0 %, iš jų 51,7 % išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro, ir

17,3 % po pagausinimo Bolton sultinyje. Įmon÷je C buvo 37,9 % užkr÷stų broilerių blauzdelių iš

jų 17,2 % išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir 20,7 % po pagausinimo. Mažiausia

užkr÷stų blauzdelių buvo įmon÷je B 24,1 %, visos kampilobakterijos išskirtos tiesiogiai s÷jant ant

mCCDA agaro, po pagausinimo nebuvo nei vieno teigiamo m÷ginio. Reikšmingas skirtumas

buvo tarp gamintojų A ir B (χ2=11,71; df=1; p=0,000) bei A ir C (χ2=5,61; df=1; p=0,02)

blauzdelių užkr÷stumo. Reikšmingo skirtumo nebuvo tarp gamintojų B ir C blauzdelių (χ2=1,29;

df=1; p=0,26).

Daugiausia kampilobakterijomis užkr÷stų sparnelių buvo įmon÷je A 62,2 %, iš jų 48,3 %

išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro, ir 13,9 % po pagausinimo Bolton sultinyje, tačiau

skirtumas tarp skirtingų gamintojų sparnelių užkr÷stumo kampilobakterijomis nebuvo

reikšmingas (χ2=3,31; df=2; p=0,19). Įmon÷se B ir C buvo vienodas užkr÷stų sparnelių skaičius

po 41,4 %. Tačiau įmon÷je C 10,3 % kampilobakterijų išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA

agaro ir 31,1 % po pagausinimo, o įmon÷je B 27,6 % kampilobakterijų išskirtos tiesiogiai s÷jant

ant mCCDA agaro ir 13,8 % po pagausinimo Bolton sultinyje.

26

4 lentel÷ Įmonių A, B ir C broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas

kampilobakterijomis

Gamintojai Broilerių produktai

M÷ginių sk.

Teigiamų m÷ginių sk.

išskirtų tiesiogiai

% Teigiamų

m÷ginių sk. po pagausinimo

% Viso

teigiamų m÷ginių sk.

%

Sparneliai 29 14 48,3 4 13,9 18 62,2 A

Blauzdel÷s 29 15 51,7 5 17,3 20 69,0

Sparneliai 29 8 27,6 4 13,8 12 41,4 B

Blauzdel÷s 29 7 24,1 0 0 7 24,1

Sparneliai 29 3 10,3 9 31,1 12 41,4 C

Blauzdel÷s 29 5 17,2 6 20,7 11 37,9

Sparneliai 87 25 28,7 17 19,4 42 48,1 Viso:

Blauzdel÷s 87 27 31,0 12 13,9 39 44,9

Broilerių produktų užkr÷stumo kampilobakterijomis dinamika priklausomai nuo m÷nesio

pateikta 3 pav. Tyrimo duomenimis, mažiausiai kampilobakterijomis užkr÷stų broilerių produktų

buvo kovo m÷nesį, o daugiausiai - buvo liepos m÷nesį. Nustatytas reikšmingas skirtumas tarp

skirtingų m÷nesių broilerių produktų užkr÷stumo kampilobakterijomis (χ2=24,65; df=6; p=0,000).

Reikšmingas skirtumas buvo tarp kovo ir geguž÷s, kovo ir birželio, kovo ir liepos, kovo ir

rugpjūčio, kovo ir rugs÷jo, balandžio ir liepos, balandžio ir rugs÷jo, geguž÷s ir liepos, geguž÷s ir

rugs÷jo, birželio ir liepos bei birželio ir rugs÷jo broilerių produktų užkr÷stumo (p<0,05).

27

3 pav. Paukštienos produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis kovo - rugs÷jo

m÷nesiais (N – bendras tirtas m÷ginių skaičius)

3.2 Kampilobakterijų kiekis ant broilerių produktų paviršiaus

Tyrimo metu buvo ne tik išskiriamos kampilobakterijos, bet taip pat buvo skaičiuojami

kolonijas sudarantys vienetai (ksv) ir išreiškiami dešimtainiu logaritmu. Didžiausias

kampilobakterijų skaičius buvo nustatytas įmon÷je A, 1,76 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis

±0,67 (5 lentel÷). Įmon÷se B ir C kampilobakterijų skaičius atitinkamai buvo, 1,39 log10 ksv/g,

standartinis nuokrypis ± 0,44 ir 1,49 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis ± 0,56, tačiau skirtumas

kampilobakterijų kiekio tarp visų įmonių n÷ra reikšmingas (p˃0,05).

Siekiant išsiaiškinti, kurie veiksniai turi įtakos kampilobakterijų kiekiui ant broilerių

produktų buvo atliekama daugiafaktorin÷ dispersin÷ analiz÷. Išskirti tokie faktoriai: broilerių

produktai (sparnelis, blauzdel÷), gamintojai (A, B ir C) ir m÷ginių rinkimo laikas (kovas,

balandis, geguž÷, birželis, liepa, rugpjūtis ir rugs÷jis). Nustatyta, kad kampilobakterijų skaičiui

ant broilerių produktų statistiškai reikšmingos įtakos turi m÷ginių rinkimo laikas (F=3,7; df=6;

p=0,0048). Gamintojai (F=0,96; df=2; p=0,39) ir broilerių produktai (F=0,59; df=1; p=0,45)

reikšmingos įtakos kampilobakterijų kiekiui ant paukštienos paviršiaus neturi.

28

5 lentel÷ Įmonių A, B ir C broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas

kampilobakterijomis ir kolonijas sudarančių vienetų skaičius g

Produktų vidurkis log10 ksv/g Gamintojas

Vidurkis log10 ksv/g Sparneliai Blauzdel÷s

A 1,76 1,62 1,90 B 1,39 1,31 1,47 C 1,49 1,74 1,23

Viso: 1,55 1,56 1,53

Buvo paskaičiuotas koreliacijos koeficientas (r=0,06; p=0,58) ir nustatyta, kad n÷ra

patikimo ryšio tarp kampilobakterijų kiekio ant sparnelių ir blauzdelių.

Tyrimo duomenimis, didžiausias kampilobakterijų skaičius buvo nustatytas ant įmon÷s A

blauzdelių 1,90 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis ±0,78. Mažiausias kampilobakterijų skaičius

buvo ant įmon÷s C blauzdelių 1,23 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis ±0,33. Ant įmon÷s B

blauzdelių buvo nustatytas 1,47 log10 ksv/g kampilobakterijų skaičius, standartinis nuokrypis

±0,46. Tačiau skirtumas tarp atskirų gamintojų blauzdelių kampilobakterijų kiekio n÷ra

reikšmingas p˃0,05.

Įmonių A ir C kampilobakterijų skaičius ant sparnelių buvo panašus, atitinkamai 1,62 log10

ksv/g, standartinis nuokrypis ±0,56 ir 1,74 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis ±0,80. Mažiausias

kampilobakterijų skaičius buvo ant įmon÷s B sparnelių 1,31 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis

±0,45. Skirtumas tarp atskirų gamintojų sparnelių kampilobakterijų kiekio n÷ra reikšmingas

p˃0,05.

29

4 pav. Kampilobakterijų kolonijas sudarančių vienetų skaičiaus vidurkis log10 ksv/g

skirtingais tyrimo m÷nesiais (N – bendras tirtas m÷ginių skaičius)

Atlikus tyrimą nustatyta, kad didžiausias kampilobakterijų kiekis ant broilerių produktų

buvo geguž÷s m÷nesį - 2,44 log10 ksv/g (4 pav.). Mažiausias kampilobakterijų kiekis buvo liepos

ir rugs÷jo m÷nesiais, 1,45 log10 ksv/g ir 1,43 log10 ksv/g. Kovo m÷nesį kampilobakterijos buvo

išskirtos tik iš dviejų m÷ginių, tačiau tik vieno m÷ginio duomenys įtraukti į kiekybinę duomenų

analizę, nes iš antro m÷ginio kampilobakterijos buvo išskirtos tik po pagausinimo. Nustatyta, kad

kovo m÷nesio teigiamas m÷ginys buvo užkr÷stas kampilobakterijomis 2,4 log10 ksv/g, kadangi

sunku lyginti šio m÷nesio duomenis su kitų m÷nesių kiekybiniais kampilobakterijų užkr÷stumo

vidurkio duomenimis, 4 pav. n÷ra įtraukta šio m÷nesio duomenų. Reikšmingas kampilobakterijų

kiekio skirtumas yra tarp balandžio ir geguž÷s, geguž÷s ir birželio, geguž÷s ir liepos, geguž÷s ir

rugpjūčio bei geguž÷s ir rugs÷jo m÷nesių (p<0,05).

30

3.3 Identifikuotos kampilobakterijų rūšys daugin÷s PGR metodu

Naudojant dauginį PGR metodą, kampilobakterijos buvo identifikuojamos iki rūšies. PGR

rezultatai atlikus elektroforezę buvo vertinami padarius nuotraukas UV spindulių šviesoje (5

pav.).

5 pav. Polimerazin÷s grandinin÷s reakcijos rezultatų atlikus elektroforezę nuotrauka:

11 - DNR ilgio standartas nuo 100 bp iki 1000 bp (MBI, Fermentas); 1, 4, 5, 7, 16 ir 18 - C.

jejuni; 2, 3, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21 ir 22 - C. coli.

Nuo 2009 m. kovo m÷n. iki 2009 m. spalio m÷n. buvo užšaldyti 263 grynųjų

kampilobakterijų kultūrų m÷giniai. Iš įmon÷s A buvo užšaldyti 146 grynųjų kultūrų m÷giniai, B –

57 m÷giniai, o C – 60. Remiantis tyrimo duomenimis nustatyta, kad 69,12 % broilerių sparnelių

ir blauzdelių buvo užkr÷sti C. jejuni, 13,23 % produktų užkr÷sti C. coli ir 17,65 % broilerių

produktų užkr÷sti abiem kampilobakterijų rūšimis (C. jejuni ir C. coli) (6 lentel÷).

Daugiausia C. jejuni buvo identifikuota įmon÷s B m÷giniuose – 78,57 %, o mažiausia

įmon÷s C m÷giniuose – 50 %. Daugiausia C. coli bakterijų buvo identifikuota įmon÷s C

m÷giniuose – 30 %, o mažiausia įmon÷s A m÷giniuose – 2,94 %. Skirtingas kampilobakterijų

rūšių santykis yra reikšmingas tarp gamintojų A ir C (χ2=8,44; df=2; p=0,01). Tarp kitų

gamintojų kampilobakterijų rūšių santykio reikšmingo skirtumo n÷ra (p˃0,05).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

650 bp 323 bp 126 bp

31

6 lentel÷ Įmonių A, B ir C broilerių produktų užkr÷stumas C. jejuni ir C. coli rūšimis

Gamintojai M÷ginių

sk. C. jejuni % C. coli % C. jejuni

ir C. coli % A 34 26 76,47 1 2,94 7 20,59 B 14 11 78,57 2 14,29 1 7,14 C 20 10 50 6 30 4 20

Viso: 68 47 69,12 9 13,23 12 17,65

Atlikus tyrimą daugin÷s PGR metodu buvo identifikuotos termofilin÷s kampilobakterijų

rūšys. Nustatyta, kad broilerių blauzdel÷s ir sparneliai buvo panašiai užkr÷sti C. jejuni

kampilobakterijomis, atitinkamai 68,75 % ir 69,44 %. Taip pat panašiai blauzdel÷s ir sparneliai

buvo užkr÷sti C. coli kampilobakterijomis, atitinkamai 12,5 % ir 13,89 % (7 lentel÷).

Kampilobakterijų rūšių pasiskirstymas ant visų gamintojų sparnelių ir blauzdelių n÷ra

reikšmingas (χ2=13,5; df=10; p=0,2).

C. jejuni kampilobakterijomis dažniausiai buvo užkr÷stos įmonių A ir B blauzdel÷s,

atitinkamai 70,59 % ir 80 %. Rečiausiai, C. jejuni kampilobakterijos buvo identifikuotos nuo

įmon÷s C sparnelių paviršiaus 40 %. Dažniausiai C. coli bakterijos buvo identifikuota nuo įmon÷s

C broilerių sparnelių ir blauzdelių paviršiaus po 30 %. O nuo įmon÷s A broilerių sparnelių ir B

broilerių blauzdelių paviršiaus iš viso nebuvo identifikuota vien C. coli. Reikšmingas skirtumas

nerastas tarp kampilobakterijų rūšių pasiskirstymo ant atskirų gamintojų sparnelių ir blauzdelių

(p˃0,05). Visų gamintojų broilerių sparneliai ir blauzdel÷s buvo daugiau užkr÷sti C. jejuni

kampilobakterijomis, negu C. coli.

7 lentel÷ Įmonių A, B ir C broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas C. jejuni ir C.

coli rūšimis

Gamintojai Broilerių produktai

M÷ginių sk. C. jejuni % C. coli %

C. jejuni

ir C. coli % Sparneliai 17 14 82,35 0 0 3 17,65

A Blauzdel÷s 17 12 70,59 1 5,88 4 23,53 Sparneliai 9 7 77,78 2 22,22 0 0

B Blauzdel÷s 5 4 80 0 0 1 20 Sparneliai 10 4 40 3 30 3 30

C Blauzdel÷s 10 6 60 3 30 1 10 Sparneliai 36 25 69,44 5 13,89 6 16,67

Viso: Blauzdel÷s 32 22 68,75 4 12,5 6 18,75

32

Identifikavus broilerių produktų kampilobakterijas nustatyta, kad daugiausia C. jejuni

kampilobakterijų buvo kovo m÷nesį 100 % (6 pav.). Tačiau kovo m÷n. buvo tik 2 teigiami

m÷giniai, tod÷l šio m÷nesio rezultatus sunku lyginti su kitais m÷nesiais. Mažiausiai m÷ginių

užkr÷stų C. jejuni buvo identifikuota geguž÷s 33,34 % ir birželio 50 % m÷nesiais. Tyrimo

duomenimis, kovo ir rugpjūčio m÷nesiais iš viso nebuvo užkr÷stų produktų vien C. coli

bakterijomis. Mažiausias C. coli kampilobakterijų santykis buvo liepos m÷nesį – 5,88 %.

Geguž÷s m÷nesį C. coli buvo identifikuota daugiausia - 44,44 %. Skirtingi kampilobakterijų rūšių

santykių pasiskirstymai lyginant visus m÷nesius n÷ra reikšmingi (χ2=16,83; df=10; p=0,08).

Reikšmingas skirtumas buvo tik tarp geguž÷s ir liepos (χ2=5,97; df=2; p=0,05) bei geguž÷s ir

rugs÷jo (χ2=6,75; df=2; p=0,03).

6 pav. C. jejuni ir C. coli rūšių pasiskirstymas broilerių produktuose skirtingais

m÷nesiais

33

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Šio tyrimo metu buvo ištirtas trijų Lietuvos paukštienos gamintojų broilerių produktų

(sparnelių ir blauzdelių) mažmenin÷je prekyboje užkr÷stumas kampilobakterijomis nustatytas

kampilobakterijų kiekis ant produktų ir identifikuotos kampilobakterijų rūšys. Tokių tyrimų

rezultatai Lietuvoje dar nebuvo iki šiol paskelbti ir tai yra pirmas kartas. Tyrimo rezultatai

parod÷, kad beveik pus÷ (46,6 %) pagrindinių broilerių produktų gamintojų į rinką tiekiamų

sparnelių ir blauzdelių yra užkr÷sti termofilin÷mis kampilobakterijomis. Mažmenin÷je rinkoje

parduodamų paukštienos produktų tyrimai buvo atlikti ir kitose šalyse, ir gauti panašūs rezultatai:

Ispanijoje Campylobacter spp. užkr÷sti 49,5 % m÷ginių (Dominguez ir kt., 2002), Vokietijoje

45,9 % (Atanassova ir Ring, 1999) ir Belgijoje 49,4 % (2002 m.) bei 44,9 % (2003 m.) (Ghafir ir

kt., 2007). Skirtingai nei Lietuvoje, kai kuriose šalyse broilerių produktai mažmenin÷je prekyboje

kampilobakterijomis užkr÷sti daug dažniau: Jungtin÷je Karalyst÷je atliktų tyrimų metu nustatyta,

kad paukštiena kampilobakterijomis užkr÷sta nuo 68 % iki 87 % (Harrison ir kt., 2001; Kramer ir

kt., 2000; Meldrum ir kt., 2004), Šiaur÷s Airijoje - 94 % (Moore ir kt., 2002), Kroatijoje - 66,6 %

(Granić ir kt., 2009). Taip pat didelis paukštienos produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis

mažmenin÷je prekyboje nustatytas Italijoje – 81,3 % ir Prancūzijoje – 75,7 % (Denis ir kt., 2001;

Pezzotti ir kt., 2003).

EFSA duomenimis 2008 metais Lietuvoje sergamumo kampilobakterioze indeksas buvo

22,6/100000 ir tai nebuvo labai aukštas kampilobakterioz÷s susirgimų rodiklis lyginat su kitomis

šalimis (1 lentel÷) (EFSA, 2010). Mūsų atlikto tyrimo duomenys patvirtina tai, kad

kampilobakterioz÷ glaudžiai susijusi su broilerių produktų užkr÷stumu ir kampilobakterijų kiekiu

ant produktų. Lietuvos mažmenin÷je rinkoje parduodami broilerių produktai n÷ra užkr÷sti dideliu

kiekiu kampilobakterijų, tai gali tur÷ti įtakos, sąlyginai neaukštam patvirtintų kampilobakterioz÷s

atvejų skaičiui Lietuvoje. Be to, neaukštas kampilobakterioz÷s indeksas gali būti susijęs su tuo,

kad sergantys nesikreikia į gydymo įstaigas, o jeigu kreipiasi, tai dažniausiai suk÷l÷jo

patvirtinimo tyrimas neatliekamas ir tik esant sunkiems susirgimams, su būdingais

kampilobakteriozei simptomais nustatomas suk÷l÷jas. Kitose šalyse, kur nustatytas labai aukštas

broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis arba produktai užkr÷sti dideliu bakterijų

34

kiekiu, d÷l nepakankamai gero terminio apdorojimo ar higienos taisyklių nesilaikymo, padid÷ja

kryžminio užkr÷stumo rizika, kas gali įtakoti didesnį užregistruojamų patvirtintų

kampilobakterioz÷s atvejų skaičių.

Pagal maisto saugos reikalavimus žmonių maistui skirtų produktų kokyb÷ ir sauga tur÷tų

būti užtikrinama „nuo lauko iki stalo“. Teis÷s aktai, kaip pavyzdžiui reglamentai 852/2004 „D÷l

maisto produktų higienos“, 853/2004 „Nustatantis konkrečius gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktų

higienos reikalavimus“, direktyva 207/43/EB nustatanti būtiniausias broilerių apsaugos taisykles,

higienos normos ir kt. turi užtikrinti, kad žmon÷ms tiekiamas maistas būtų saugus ir nekeltų

rizikos jų sveikatai. Higienos normos 15:2005 „Maisto higiena“ laikymasis turi užtikrinti, kad

būtų vykdoma griežta maisto produktų skirtų žmonių maistui kontrol÷ kiekviename gamybos,

perdirbimo, transportavimo bei pardavimo etape. Mūsų tyrimo metu buvo nustatyta, kad broilerių

produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis tarp įmonių A, B ir C skiriasi reikšmingai.

Kampilobakterijų paplitimui ūkiuose labai svarbu bendroji higiena ir taikomos biosaugos

priemon÷s. Tyrimai įvairiose šalyse parod÷, kad ūkiuose kur nesilaikoma higienos bei biosaugos

reikalavimų yra daugiau kampilobakterijomis užsikr÷tusių broilerių pulkų. Tai gal÷tų būti susiję

su dideliu kampilobakterijų kiekiu aplinkoje (Humphrey ir kt., 2007). Atsižvelgiant, į tai, kad

daugiausia kampilobakterijomis užkr÷stų broilerių produktų buvo įmon÷je A, galime manyti, kad

šis gamintojas prasčiau laikosi higienos reikalavimų, nei B ir C. Visos šios įmon÷s yra

sertifikuotos pagal maisto produktų saugos standartą (BRC Food), tačiau gamintojai B ir C

papildomai yra sertifikuoti pagal Maisto saugos vadybos sistemą (ISO 22000:2005). Tod÷l

sugriežtinta kokyb÷s kontrol÷ gal÷jo įtakoti, kad gamintojų B ir C broilerių produktai rečiau

užkr÷sti kampilobakterijomis palyginus su A.

Broilerių skerdena labiausiai kampilobakterijomis užteršiama skerdimo proceso metu

(Berndtson ir kt., 1992; Norman ir kt., 2008). Belgijoje atlikto tyrimo metu nustatyta, kad

broilerių sparneliai yra dažniau užkr÷sti kampilobakterijomis negu kulšel÷s, atitinkamai 75 % ir

59,71 % (Habib ir kt., 2008). Mūsų tyrimų metu nebuvo reikšmingo skirtumo tarp sparnelių ir

blauzdelių užkr÷stumo kampilobakterijomis. Nustat÷me, kad jeigu yra užkr÷sti sparneliai, taip pat

būna užkr÷stos ir blauzdel÷s. Galime manyti, kad skirtingos broilerių skerdenų dalys bakterijomis

užteršiamos kryžminiu būdu vienos nuo kitų, nes buvo nustatyta, kad n÷ra ryšio tarp

kampilobakterijų kiekio ant sparnelių ir blauzdelių, tod÷l galime teigti, kad jeigu sparneliai

35

užkr÷sti dideliu kampilobakterijų kiekiu tos pačios partijos blauzdel÷s nebūtinai bus užkr÷stos

dideliu bakterijų kiekiu ir atvirkščiai.

Šio tyrimo metu buvo pasteb÷ta sezonin÷ kampilobakterijų dinamika. Didžiausias

kampilobakterijomis užkr÷stų produktų skaičius buvo nuo liepos iki rugs÷jo, o mažiausias - kovo

m÷nesį. Tokie sezoniniai skirtumai gali būti susiję su žema temperatūra spalio – kovo laikotarpiu,

nes kampilobakterijos yra jautrios žemai temperatūrai. Kampilobakterioz÷s sezoniškumo

dinamikai įtakos gali tur÷ti fermose įvairių mechanizmų įdiegimas vasaros metu. Naujausi

duomenys rodo, kad šiltuoju metų laiku mus÷s yra svarbios kampilobakterijų platintojos paukščių

pulkuose. Vabzdžiai šiltuoju metų laiku į fermas gali patekti per ventiliacijos angas su oro srautu

(Hald ir kt., 2004, Nichols, 2005, Ekdahl ir kt., 2005). Manoma, kad išorin÷ aplinka yra

pagrindinis kampilobakterijų šaltinis. Įrodyta, kad tie patys šių bakterijų tipai identifikuoti tiek iš

naminių, tiek iš laukinių paukščių. Kadangi broilerių pulkai dažniausia užsikrečia nuo gamtoje

paplitusių kampilobakterijų padermių, tokiu būdu šaltuoju metų laiku broilerių pulkai yra rečiau

užkr÷sti kampilobakterijomis ir skerdimo metu skerden÷l÷s lieka neužkr÷stos. Kampilobakterijų

paplitimas ir kiekis ant skerdenų gali būti paremtas sezoniniais pokyčiais broilerių gyvenamojoje

aplinkoje (Stern ir Robach, 2003). Sezoninius kampilobakterijų pokyčius pasteb÷jo ir kiti

autoriai, Willis ir Murray (1997) praneš÷, kad didžiausias broilerių produktų užkr÷stumas

kampilobakterijomis yra nuo geguž÷s iki spalio, o mažiausias gruodžio ir sausio m÷nesiais.

Panašūs rezultatai buvo ir Olandijoje atlikto tyrimo metu, kur didžiausias izoliatų kiekis buvo nuo

birželio iki rugs÷jo, o mažiausias kovo m÷nesį (Jacobs-Reitsma ir Mulder, 1994). Sezonin÷

kampilobakterijų dinamika ant broilerių produktų sutampa su kampilobakterioz÷s atvejų

svyravimais žmonių populiacijoje. EFSA duomenimis (EFSA, 2010), pastebimas patvirtintų

kampilobakterioz÷s atvejų pikas nuo birželio iki rugs÷jo (2 pav.). Reikšmingas C. jejuni, C. coli ir

mišrus abejų kampilobakterijų kartu santykių pasiskirstymas buvo tik tarp geguž÷s ir liepos bei

geguž÷s ir rugs÷jo m÷nesių (p<0,05).

Stern ir Robach (2003) nustat÷, kad kampilobakterijų kiekis randamas ant skerdenos yra

svarbus rodiklis, kuris gali padidinti riziką vartotojams užsikr÷sti kampilobakterioze. D÷l

skirtingų naudojamų metodikų kampilobakterijų skaičiavimui nuo broilerių m÷sos paviršiaus

sud÷tinga palyginti skirtingų tyrimų rezultatus. Habib ir kt. (2008), atliko paukštienos produktų

užkr÷stumo kampilobakterijomis analizę Belgijoje ir nustat÷, kad visi tirti produktai vidutiniškai

36

1,68 log10 ksv/g buvo užkr÷sti kampilobakterijomis. Mūsų atlikto tyrimo metu nustatyta, kad

vidutinis kampilobakterijų kiekis ant užkr÷stų sparnelių ir blauzdelių buvo 1,55 log10 ksv/g.

Reikšmingo kampilobakterijų kiekio skirtumo nebuvo tarp skirtingų broilerių produktų

gamintojų. Luber ir kt. (2004) atliko tyrimą, kai buvo skaičiuojamos kampilobakterijos ant

vištienos kulšelių, tačiau šio tyrimo metu buvo nustatytas didesnis kampilobakterijų skaičius -

4,01 log10 ksv/g, ir tai yra 2,48 log10 ksv/g didesnis užkr÷stumas nei nustatytas mūsų atlikto

tyrimo metu. Belgijoje atlikti tyrimai parod÷, kad broilerių sparneliai kampilobakterijomis

vidutiniškai užkr÷sti 2,21 log10 ksv/g (Habib ir kt., 2008). Tuo tarpu mes nustat÷me, kad tirtų

broilerių sparnelių m÷giniai kampilobakterijomis vidutiniškai užkr÷sti 1,56 log10 ksv/g. Mūsų

tyrimo metu nustatyta, kad kampilobakterijų kiekiui ant produktų paviršiaus įtakos neturi

produkto rūšis (sparnelis, blauzdel÷), gamintojas (A, B ir C), tačiau kampilobakterijų kiekiui

reikšmingos įtakos turi m÷ginių rinkimo laikas. Didžiausias kampilobakterijų kiekis buvo

nustatytas geguž÷s m÷nesį 2,44 log10 ksv/g, o mažiausias liepos rugs÷jo m÷nesiais nuo 1,4 iki 1,6

log10 ksv/g.

C. coli ir C. jejuni yra glaudžiai susijusios kampilobakterijų rūšys, kurios sukelia daug

klinikinių gastroenterito atvejų visame pasaulyje (Dingle ir kt., 2002). Identifikavus

kampilobakterijų rūšis buvo nustatyka, kad 69,12 % teigiamų m÷ginių yra užkr÷sti C. jejuni ,

13,23 % produktų užkr÷sti C. coli ir 17,65 % broilerių produktų užkr÷sti abiem kampilobakterijų

rūšimis (C. jejuni ir C. coli). C. jejuni buvo identifikuota dažniau negu C. coli. Suzuki ir

Yamamoto (2009) atliko įvairių pasaulio šalių literatūros analizę, kur išanalizavo paukštienos

produktų užkr÷stumą kampilobakterijomis. Jie nustat÷, kad C. jejuni dažniausiai būdavo

dominuojanti rūšis, tačiau įvairiose šalyse C. jejuni ir C.coli santykis yra skirtingas. Tailande

(Padungtod ir Kaneene, 2005) ir Pietų Afrikoje (Van Nierop ir kt., 2005) mažmenin÷s prekybos

broilerių produktų dominuojanti kampilobakterijų rūšis yra C. coli. Panašus kampilobakterijų C.

jejuni ir C.coli santykis kaip ir mūsų atlikto tyrimo metu buvo gautas ir kitose šalyse, tokiose kaip

Vokietijoje (71 % ir 18,6 %), Jungtin÷je Karalyst÷je (73,8 % ir 26,2 %) bei Ispanijoje (72,5 % ir

27,5 %) (Alter ir kt., 2004; Bolton ir kt., 2002; Mateo ir kt., 2005).

Mūsų žiniomis, tai yra pirmas tyrimas Lietuvoje nustatant mažmenin÷je prekyboje esančių

broilerių produktų užkr÷stumą kampilobakterijomis. Atlikti tyrimai parod÷, kad svarbu

kontroliuoti paukštynus ir skerdyklas, o mažmenin÷je prekyboje turi būti griežtai laikomasi

37

higienos reikalavimų siekiant sumažinti riziką vartotojams užsikr÷sti kampilobakterioze. Taip

pat, vartotojų švietimas, kaip tinkamai apdoroti ir virti paukštienos produktus, gali pad÷ti

sumažinti užsikr÷timo kampilobakterijomis riziką.

38

IŠVADOS

• Lietuvos mažmenin÷je prekyboje esantys pagrindinių gamintojų broilerių sparneliai ir

blauzdel÷s yra dažnai (46,6 %) užkr÷sti termofilin÷mis kampilobakterijomis ir gali būti

svarbus žmonių užsikr÷timo šaltinis, ypač nesilaikant terminio apdorojimo reikalavimų

bei higienos taisyklių.

• Gamintojo A broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis yra reikšmingai

didesnis negu gamintojo B ir C (p<0,05). Broilerių produktų užkr÷stumas

kampilobakterijomis tarp gamintojų B ir C reikšmingai nesiskyr÷ (p˃0,05).

• Broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas kampilobakterijomis did÷ja prasidedant

šiltajam metų laikui (liepa-rugs÷jis), bet maž÷ja atšalus orams.

• Mūsų tyrimo metu nustatyta, kad kampilobakterijų kiekiui ant produktų paviršiaus įtakos

neturi produkto rūšis (sparnelis, blauzdel÷) (p˃0,05).

• Kampilobakterijų kiekis ant broilerių produktų pagamintų skirtingų gamintojų

reikšmingai nesiskiria (nuo 1,39 log10 ksv/g iki 1,76 log10 ksv/g).

• Dažniausiai broilerių produktai užkr÷sti C. jejuni 69,12 %, rečiau C. coli 13,23 %, tačiau

pasitaiko ir mišrus užkr÷timas abejomis rūšimis 17,65 %.

39

REKOMENDACIJOS

• Tolimesniems tyrimams: panagrin÷ti rizikos veiksnius įtakojančius broilerių produktų

skirtingą užkr÷stumą.

• Kadangi šie ir kiti tyrimai parod÷, kad broilerių produktai dažnai užkr÷sti Campylobacter

spp. naudojant šiuos produktus reikia ypatingą d÷mesį skirti terminiam apdorojimui bei

higienos laikymuisi.

40

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Adak, G.K., Long, S.M., O'Brien, S.J., Trends in indigenous foodborne disease and deaths,

England and Wales: 1992 to 2000. 2002. Gut 51, 832–841.

2. Allos, B.M. & Blaser, M.J. Campylobacter jejuni and the expanding spectrum of related

infections. 1995. Clinical Infectious Diseases 20, 1092-1101.

3. Allos, B.M., Campylobacter jejuni infections: update on emerging issues and trends. 2001.

Clinical Infectious Diseases 32, 1201–1206.

4. Alter, T., Gürtler, M., Gaull, F., Johne, A. and Fehlhaber, K. Comparative analysis of the

prevalence of Campylobacter spp. in retail turkey and chicken meat. 2004. Arch.

Lebensmittelhyg. 55: 60–63.

5. Anonymous., Advisory Committee on the Microbiological Safety of Food. Second Report on

Campylobacter. 2005. HMSO, London.

6. Atanassova, V., C. Ring., Prevalence of Campylobacter spp. in poultry and poultry meat in

Germany. 1999. Int. J. Food Microbiol. 51, 187-190.

7. Bang, D.D.,Wedderkop, A., Pedersen, K., Madsen, M., Rapid PCR using nested primers of

the 16S Rrna and the hippuricase (hip O) genes to detect Campylobacter jejuni and

Campylobacter coli in environmental samples. 2002. Molecular and Cellular Probes 16, 359–

369.

8. Berndtson, E., Tivemo, M., and Engvall, A., Distribution and numbers of Campylobacter in

newly slaughtered broiler chickens and hens. 1992. Int. J. Food Microbiol 15: 45- 50.

9. Bolton, F. J., Sails, A. D., Fox, A. J., Wareing, D. R. and Greenway, D.L. Detection of

Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in foods by enrichment culture and polymerase

chain reaction enzyme-linked immunosorbent assay. 2002. J. Food Prot. 65: 760–767.

10. Bolton, F.J.,Wareing,D.R., Sails,A.D., Comparison of a novelmicroaerobic system with three

other gas-generating systems for the recovery of Campylobacter species from human faecal

samples. 1997. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 16, 839–

842.

41

11. Broman T, Bergström S, On SL, Palmgren H, McCafferty DJ, Sellin M, Olsen B. Isolation

and characterization of Campylobacter jejuni subsp. jejuni from macaroni penguins (Eudyptes

chrysolophus) in the subantarctic region. Appl Environ Microbiol. 2000 Jan;66(1):449-52.

12. Broman, T., Waldenstrom, J., Dahlgren, D., Carlsson, I., Eliasson, I., Olsen, B., Diversities

and similarities in PFGE profiles of Campylobacter jejuni isolated from migrating birds and

humans. 2004. Journal of Applied Microbiology 96, 834–843.

13. Burgess, F., Little, CL., Allen, G., Williamson, K., Mitchell, R.T., Prevalence of

Campylobacter, Salmonella, and Escherichia coli on the external packaging of raw meat.

2005. Journal of Food Protection 68, 469–475.

14. Cogan, T.A., Bloomfield, S.F.,Humphrey, T.J., The effectiveness of hygiene procedures for

prevention of cross-contamination fromchicken carcasses in the domestic kitchen. 1999.

Letters in Applied Microbiology 29, 354–358.

15. Cools, I., M. Uyttendaele, J. Cerpentier, E. D’Haese, H. J. Nelis, and J. Debevere.,

Persistence of Campylobacter jejuni on surfaces in a processing environment and on cutting

boards. 2005. Lett. Appl. Microbiol. 40:418–423.

16. Denis, M., Refregier- Petton, J., Laisney, M.- J., Ermel, G. and Salvat, G. Campylobacter

contamination in French chicken production from farm to consumers. Use of a PCR assay for

detection and identification of Campylobacter jejuni and C. coli. 2001. J Appl Microbiol 91:

255- 267.

17. Dingle, K.E., Colles, F.M., Ure, R.,Wagenaar, J.A., Duim, B., Bolton, F.J., Fox, A.J.,

Wareing, D.R., Maiden, M.C., Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a

basis for epidemiologic investigation. 2002. Emerging Infectious Diseases 8, 949–955.

18. Dominguez, C., I. Gomez, J. Zumalacarreui., Prevalence of Salmonella and Campylobacter in

retail chicken meat in Spain. 2002. Int. J. Food Microbiol. 72, 165-168.

19. Ekdahl, K., Normann, B., Andersson, Y., Could flies explain the elusive epidemiology of

campylobacteriosis? 2005. BMC Infectious Diseases 5, 11.

20. Engberg J, Bang DD, Aabenhus R, Aarestrup FM, Fussing V, Gerner-Smidt P.

Campylobacter concisus: an evaluation of certain phenotypic and genotypic characteristics.

2005. Clin Microbiol Infect;11:288-95.

42

21. Evans, S.J., The seasonality of canine births and human campylobacteriosis: a hypothesis.

1993. Epidemiology and Infection 110, 267–272.

22. Fernandez, H., Fagundes Neto, U. & Ogatha, S. Acute diarrhea associated with

Campylobacter jejuni subsp. doylei in Sao Paulo, Brazil. 1997. Pediatric Infectious Disease

Journal 16, 1098-1099.

23. Gaynor, E.C., Wells, D.H., MacKichan, J.K., Falkow, S., The Campylobacter jejuni stringent

response controls specific stress survival and virulence-associated phenotypes. 2005.

Molecular Microbiology 56, 8–27.

24. Ghafir, Y., China, B., Dierick, K., De Zutter, L. and Daube, G., A seven-year survey of

Campylobacter contamination in meat at different production stages in Belgium. 2007. Int J

Food Microbiol 116: 111- 120.

25. Granić, K., D. Krčar, S. Uhitil, S. Jakšić: Determination of Campylobacter spp. in poultry

slaughterhouses and poultry meat. 2009. Vet. arhiv 79, 491-497.

26. Grennan B.,O'SullivanN.A., Fallon R., Carroll, C., Smith, T.,Glennon,M., PCR–ELISAs for

the detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in poultry samples. 2001.

Biotechniques 30, 602–606, 608–610.

27. Gurtler, M., T. Alter, S. Kasimir, and K. Fehlhaber, The importance of Campylobacter coli in

human campylobacteriosis: prevalence and genetic characterization. 2005. Epidemiol. Infect.

133, 1081–1087.

28. Habib, I., I. Sampers, M. Uyttendaele, D. Berkvens, and L. De Zutter. Baseline data from a

Belgium-wide survey of Campylobacter species contamination in chicken meat preparations

and 438 considerations for a reliable monitoring program. 2008. Appl. Environ. Microbiol.

74: 5483-9.

29. Hald, B., Skovgaard, H., Bang, D.D., Pedersen, K., Dybdahl, J., Jespersen, J.B., Madsen, M.,

Flies and Campylobacter infection of broiler flocks. 2004. Emerging Infectious Diseases 10,

1490–1492.

30. Harrison, W.A., Griffith, C.J., Tennant, D. and Peters, A.C. Incidence of Campylobacter and

Salmonella isolated from retail chicken and associated packaging in South Wales. 2001. Lett

Appl Microbiol 33: 450- 454.

43

31. Heuer, O.E., Pedersen, K., Andersen, J.S., Madsen, M., Prevalence and antimicrobial

susceptibility of thermophilic Campylobacter in organic and conventional broiler flocks.

2001. Letters in Applied Microbiology 33, 269–274.

32. Humphrey T, O'Brien S, Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food

production perspective. 2007. Int J Food Microbiol:117(3):237-57.

33. Humphrey, T.J., Beckett, P., Campylobacter jejuni in dairy cows and raw milk. 1987.

Epidemiology and Infection 98, 263–269.

34. Yang, C., Jiang, Y., Huang, K., Zhu, C., Yin, Y., Gong, J.H., Yu, H., A real-time PCR assay

for the detection and quantitation of Campylobacter jejuni using SYBR Green I and the

LightCycler. 2005. Yale Journal of Biology and Medicine 77, 125–132.

35. Jacobs-Reitsma, W. F., N. M. Bolder, and R. W. Mulder. Cecal carriage of Campylobacter

and Salmonella in Dutch broiler flocks at slaughter: a one-year study. 1994. Poult. Sci.

73:1260–1266.

36. Jørgensen, F., Bailey, R., Williams, S., Henderson, P., Wareing, D.R., Bolton, F.J., Frost,

J.A., Ward, L., Humphrey, T.J., Prevalence and numbers of Salmonella and Campylobacter

spp. on raw, whole chickens in relation to sampling methods. 2002. International Journal of

Food Microbiology 76, 151–164.

37. Kärenlampi, R., Hänninen, M.L., Survival of Campylobacter jejuni on various fresh produce.

2004. International Journal of Food Microbiology 97, 187–195.

38. Kothary, M. H., U. S. Buba., Infective dose of foodborne pathogens in volunteers: A review.

2001. J. Food Safety. 21, 49-73.

39. Kramer, J.M., Frost, J.A., Bolton F.J. and Wareing, D.R., Campylobacter contamination of

raw meat and poultry at retail sale: identification of multiple types and comparison with

isolates from human infection. 2000. J Food Prot 63: 1654- 1659.

40. Luber, P., Scherer, K. and Bartelt, E., Contamination of retail chicken legs with

Campylobacter spp. 2005. Fleischwirtschaft 85, 93–96.

41. Luber, P., Vogt, P., Scherer, K. and Bartelt, E., Quantification of Campylobacter in fresh

retail chicken parts. 2004. Proceedings EU- Rain Conference on Epidemiology of Zoonoses,

3- 4 December, Padua, Italy, 149 pp.

44

42. Mateo, E., Cárcamo, J., Urquijo, M., Perales, I. and Fernández- Astorga, A., Evaluation of a

PCR assay for the detection and identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter

coli in retail poultry products. 2005. Res. Microbiol. 156: 568–574.

43. Meldrum, R. J., Tucker, D. and C. Edwards., Baseline rates of Campylobacter and

Salmonella in raw chicken in Wales, United Kingdom, in 2002. 2004. J Food Prot 67: 1226-

1228.

44. Moore, J. E., T. S. Wilson, D. R. Wareing, T. J. Humphrey, P. G. Murphy., Prevalence of

thermophilic Campylobacter spp. in ready-to-eat foods and raw poultry in Northern Ireland.

2002. J. Food Prot. 65, 1326-1328.

45. Murphy C, Carroll C, Jordan K.N., Environmental survival mechanisms of the foodborne

pathogen Campylobacter jejuni. 2006. J Appl Microbiol 100: 623–632.

46. Nachamkin I. Campylobacter and Arcobacter. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH,

Pfaller MA, Yolken RH, Manual of Clinical Microbiology. 2003. Washington, D.C., ASM

Press.

47. Nichols, G.L., Fly transmission of Campylobacter. 2005. Emerging Infectious Diseases 11,

361–364.

48. Norman J. Stern; Boris V. Eruslanov; Victor D. Pokhilenko; Yuri N. Kovalev; Larisa L.

Volodina; Vladimir V. Perelygin; Evgenii V. Mitsevich; Irina P. Mitsevich; Valery N.

Borzenkov; Vladimir P. Levchuk; Olga E. Svetoch; Yuri G. Stepanshin; Edward A. Svetoch

Bacteriocins reduce Campylobacter jejuni colonization while bacteria producing bacteriocins

are ineffective. 2008. Microbial Ecology in Health and Disease, 20, p:74 – 79.

49. On SLW. Identification methods for campylobacters, helicobacters, and related organisms.

1996. Clin Microbiol Rev 9:405-22.

50. On, S.L., Nielsen, E.M., Engberg, J. & Madsen, M. Validity of SmaI-defined genotypes of

Campylobacter jejuni examined by SalI, KpnI, and BamHI polymorphisms: evidence of

identical clones infecting humans, poultry, and cattle. 1998. Epidemiology and Infection 120,

231-237.

51. Pacha, R.E., Clark, G.W., Williams, E.A., Carter, A.M., Migratory birds of central

Washington as reservoirs of Campylobacter jejuni. 1998. Canadian Journal of Microbiology

34, 80–82.

45

52. Padungtod, P. and Kaneene, J. B. Campylobacter in food animals and humans in northern

Thailand. 2005. J. Food Prot. 68: 2519–2526.

53. Park, S., Campylobacter: stress response and resistance. In: Griffiths, M. (Ed.),

Understanding Pathogen Behaviour, Virulence, Stress Response and Resistance. 2005.

Woodhead Publishing, Cambridge, p. 279–299.

54. Park, S.F., The physiology of Campylobacter species and its relevance to their role as

foodborne pathogens. 2002. Int J Food Microbiol 74: 177–188.

55. Pezzotti, G., Serafin, A., Luzzi, I., Mioni, R., Milan, M. and Perin, R., Occurrence and

resistance to antibiotics of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in animals and meat

in northeastern Italy. 2003. Int J Food Microbiol 82: 281- 287.

56. Reina J, Ros MJ, Serra A. Evaluation of the API-campy system in the biochemical

identification of hippurate negative Campylobacter strains isolated from faeces. 1995. J Clin

Pathol 48:683-5.

57. Sahin, O., Zhang, Q., Meitzler, J.C., Harr, B.S., Morishita, T.Y., Mohan, R., Prevalence,

antigenic specificity, and bactericidal activity of poultry anti-Campylobacter maternal

antibodies. 2001. Applied and Environmental Microbiology 67, 3951–3957.

58. Schaffner, N., Zumstein, J., Parriaux, A., Factors influencing the bacteriological water quality

in mountainous surface and groundwaters. 2004. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica 32,

225–234.

59. Skirrow, M.B. Diseases due to Campylobacter, Helicobacter and related bacteria. 1994.

Journal of Comparative Pathology 111, 113-149.

60. Stern, N.J., and M. C. Robach. Enumeration of Campylobacter in broiler feces and in

corresponding processed carcasses. 2003. J. Food Prot. 66:1557–1563.

61. Stern, N.J., Clavero, M.R., Bailey, J.S., Cox, N.A. & Robach, M.C. Campylobacter spp. in

broilers on the farm and after transport. 1995. Poultry Science 74, 937-941.

62. Suzuki H, Yamamoto S. Campylobacter contamination in retail poultry meats and by-

products in the world: a literature survey. 2009. J Vet Med Sci. 71(3):255-61.

63. Takahashi, M., Koga, M., Yokoyama, K., Yuki, N., Epidemiology of Campylobacter jejuni

isolated from patients with Guillain–Barre and Fisher syndromes in Japan. 2005. Journal of

Clinical Microbiology 43, 335–339.

46

64. The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses and Zoonotic Agents

in the European Union in 2007, The EFSA Journal 2009, 223

65. The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and

food-borne outbreaks in the European Union in 2008, The EFSA Journal 2010, 1496.

66. Van Nierop, W., Dusé, A. G., Marais, E., Aithma, N., Thothobolo, N., Kassel, M., Stewart,

R., Potgieter, A., Fernandes, B., Galpin, J. S. and Bloomfield, S. F. Contamination of chicken

carcasses in Gauteng, South Africa, by Salmonella, Listeria monocytogenes and

Campylobacter. 2005. Int. J. Food Microbiol. 99: 1–6.

67. Vandamme, P. Taxonomy of the family Campylobacteriaceae. In Campylobacter 2nd

edition. 2000. Ed I. Nachamkin & M.J. Blaser. ASM Press, Washington. pp 3-26.

68. Wang, H., Rapid methods for detection and enumeration of Campylobacter spp. in foods.

2002. Journal of AOAC International 85, 996–999.

69. Willis, W. L., and C. Murray. Campylobacter jejuni seasonal recovery observations of retail

market broilers. 1997. Poult. Sci. 76:314–317.