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BIOQUIMICA DE PROTEINAS
DETERMINACIÓN DE ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
PROF. LUCIA CHEMES
CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X
CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X
CONSTITUYE LA TECNICA DE MAYOR RESOLUCION CONOCIDA PARA ANALIZAR LA ESTRUCTURA DE BIOMOLECULAS
NOS DA UNA IMAGEN ESTATICA DE LA PROTEINA
LAS PROTEINAS DEBEN ENCONTRARSE EN UNA FORMA CRISTALINA, ALTAMENTE ORDENADA
HOY, MUCHAS PARTES DEL PROCESO ESTÁN AUTOMATIZADAS!!!
MUCHAS MOLÉCULAS ORIENTADAS IGUAL
UNA FUENTE DE RAYOS XSU LONGITUD DE ONDA (1.54 Å) ES DEL ORDEN DE LA DISTANCIA DE UN ENLACE, POR LO QUE DIFRACTA A TRAVÉS DE LA PROTEÍNA
UN DETECTOR
BASES DE LA TECNICA
1- OBTENER UN CRISTAL DE PROTEÍNA
2- DIFRACCIÓN DE RAYOS X
(SINCROTRÓN)
3- ANÁLISIS PARA OBTENER UN MAPA
DE DENSIDAD
4- AJUSTE DEL MAPA A UN MODELO TRIDIMENSIONAL
5- REFINAMIEMTO DEL MODELO
1- OBTENER UN CRISTAL DE PROTEÍNA
LA PROTEÍNA DEBE ESTAR MUY PURANO TODAS LAS PROTEÍNAS SON FÁCILES DE CRISTALIZAR. POR QUÉ??
SE MEZCLA LA PROTEÍNA CON SOLUCIONES QUE LA HACEN PRECIPITARPERO LENTAMENTE (“SALTING OUT”)
TIPICAMENTE SE USA:PEG (POLIETILENGLICOL)SALES (SULFATO DE AMONIO, CLORURO DE SODIO)ALCOHOLES (ISOPROPANOL, ETC)ALTA CC DE PROTEINA ~10MG/ML
SE UTILIZAN KITS QUE PERMITEN ENSAYAR HASTA 500 CONDICIONES A LA VEZ, Y ROBOTS QUE AUTOMATIZAN
EL PROCESO
PARA FORMAR CRISTALES, LAS PROTEÍNAS SON SOMETIDAS A CONDICIONES EN LAS QUE PRECIPITAN ORDENADAMENTE
“METODO DE LA GOTA COLGANTE”
SE HACE EN MULTIPLACAS
10µl proteína
Precipitante
cristales: 50µm a 500µm
arreglo de muchas “celdas unidad” que contienen proteína cristalina
SE OBTIENEN MUCHOS TIPOS DIFERENTES DE CRISTALES
MUCHAS MOLÉCULAS ORIENTADAS IGUAL MEJORAN LA INTENSIDAD DE LA SEÑAL
ES DIFÍCIL CRISTALIZAR PROTEÍNAS PORQUE MÁS DEL 50% DE LOS CRISTALES ESTÁ OCUPADO POR EL SOLVENTE (DESORDENADO)
PROTEÍNA
SOLVENTE
BAJO EMPACAMIENTO
LA FORMA DEL CRISTAL NO TIENE NADA QUE VER CON LA ESTRUCTURA DE LA PROTEÍNA!!
LA MISMA PROTEÍNA PUEDE “ORDENARSE” O “CRISTALIZAR” EN DIFERENTES ARREGLOS CRISTALINOS
PROTEÍNA = PATO!
UNA FUENTE DE RAYOS X: LOS ACELERADORES DE PARTÍCULAS O SINCROTRONES
SINCROTRÓN DE GRENOBLE
LA MUESTRA (CONGELADA) SE MONTA SOBRE UNA PLATAFORMA DONDE ES IRRADIADA CON LOS RAYOS X
LA BAJA TEMPERATURA REDUCE EL DAÑO POR RADIACIÓN A LA MUESTRA
FACTORES QUE AFECTAN LA DIFRACCIÓN
• LA INTENSIDAD DE DIFRACCIÓN DEPENDE DE LA CANTIDAD DE ELECTRONES DE CADA NÚCLEO (CARBONO GENERA MAYOR SEÑAL QUE HIDRÓGENO)
• ALGUNOS HACES DIFRACTADOS SE SUMAN POR INTERFERENCIA CONSTRUCTIVA, MIENTRAS OTROS SE ANULAN POR INTERFERENCIA DESTRUCTIVA
• EL PATRON DE DIFRACCIÓN REFLEJA LA ESTRUCTURA ATÓMICA
LOS ELECTRONES SON LOS QUE DIFRACTAN LOS RAYOS X
POSICIÓN
INTENSIDAD
UN PATRON DE DIFRACCIÓN
CUANTA MAYOR ES LA RESOLUCIÓN, MAS REFLEXIONES TENGO LEJOS DEL CENTRO
EL PATRÓN DE DIFRACCIÓN ES UN PATRÓN DE INTERFERENCIA
Perfectamente en fase: Int constructiva
Perfectamente fuera de fase: Int destructiva
Diferencia de fase
Orden
Amplificado
Anulado
Bragg proveyó una aproximación simple e intuitiva a la difracción en cristales
• Pensar el cristal como planos de átomos separados por una distancia “d”• Asumir que estos planos reflejan los rayos X
ENTONCES: los picos en la radiación difractada ocurrirán cuando estos rayos interfieran constructivamente
LAS REGLAS DE DIFRACCIÓN EN CRISTALES SON DETERMINADAS POR LA LEY DE BRAGG
CONDICIÓN PARA INTERFERENCIA CONSTRUCTIVASólo observaremos un pico cuando la interferencia es constructiva
Cuando los rayos estén EN FASE, es decir se desfasen por un número entero de longitudes de onda
Las “reflexiones” especulares ocurren sólo en estos ángulos
A partir de los ángulos, puedo calcular “d”, la distancia entre los planos del cristal
INTERFERENCIA CONSTRUCTIVA Y DESTRUCTIVA: GENERA EL PATRÓN DE PUNTOS
INTERFERENCIA CONSTRUCTIVA
INTERFERENCIA DESTRUCTIVA
BRAGG (HIJO) TENÍA 22 AÑOS CUANDO DESCUBRIÓ ESTO….!!ERA ESTUDIANTE EN CAMBRIDGE
FUE EN 1913
El patrón de difracción generado por un cristal de proteína, puede ser interpretado como reflexiones del planos del cristal. La distancia “d” es la distancia entre unidades
repetitivas del cristal
LE PARECIÓ “MUY SIMPLE” DESCUBRIRLO….
En 1915, William Lawrence Bragg (hijo) y Sir William Henry Bragg (padre) reciben el premio Nobel en Física por “Su servicios en el análisis de la
estructura cristalina mediante el uso de los Rayos X”
Este descubrimiento, lleva, en los años que siguen (1920s-1930s) a la determinación de las estructuras de cloruro de sodio cristalino, y de varios cristales minerales lo
cual es realizado por Bragg & Bragg!
BRAGG (HIJO) FUE UNO DE LOS PRINCIPALES IMPULSORES DE LA CRISTALOGRAFÍA DE PROTEÍNAS…
NO DE CASUALIDAD…ES EN CAMBRIDGE A FINES DE 1950QUE PERUTZ Y KENDREW DETERMINAN LA PRIMERAESTRUCTURA CRISTALOGRÁFICA DE UNA PROTEÍNA
CÓMO SE RECONSTRUYE EL MAPA DE DENSIDAD ELECTRÓNICA A PARTIR DEL PATRÓN DE DIFRACCIÓN??
EN LA ÓPTICA TRADICIONAL LOS RAYOS REFRACTADOS SON ENFOCADOS POR LENTES
PERO NO EXISTEN LENTES PARA ENFOCAR RAYOS X !!!
EN CAMBIO, SE UTILIZA UNA TRANSFORMACIÓN MATEMÁTICA PARA RECONSTRUIR EL MAPA
F(X)
TRANSFORMADADE FOURIER
MAPA DE DENSIDAD ELECTRÓNICA(OBJETIVO, UNICO)
PATRÓN DE DIFRACCIÓN( AMPLITUDES Y FASES DE CADA REFLEXIÓN)
CÓMO SE RECONSTRUYE EL MAPA DE DENSIDAD ELECTRÓNICA A PARTIR DEL PATRÓN DE DIFRACCIÓN??
Transformada de Fourier: a partir de una onda, extrae la frecuencia fundamental
Transformada inversa de Fourier: a partir de las frecuencias, me permite deducir la forma original de la densidad electrónica (en este caso, en el caso genérico
reconstruir la función inicial
OBTENER LA DENSIDAD ELECTRÓNICA A PARTIR DEL PATRÓN DE DIFRACCIÓN NO ES TRIVIAL…
LA MAYOR INDETERMINACIÓN ES EN LAS FASES
LA AMPLITUD SE CONOCE A PARTIR DE LA INTENSIDAD DE CADA PUNTO
LA FRECUENCIA PROVIENE DE LA FUENTE (RAYOS X)
TÉCNICAS PARA AVERIGUAR LAS FASES:REEMPLAZO MOLECULAR Y REEMPLAZO ISOMORFO
Consiste en agregar átomos pesados (mercurio,, que contribuyen fuertemente al patrón de difracción, que pueden ser localizados y permiten deducir la faseSu agregado no debe inducir cambios en la estructura de la proteína
A PARTIR DEL MAPA DE DENSIDAD ELECTRÓNICA (OBJETIVO), SE CONSTRUYE UN MODELO (SUBJETIVO, INTERPRETACIÓN) DE LA
ESTRUCTURA DE LA PROTEÍNA
ESTO IMPLICA IR “ENHEBRANDO” LA SECUENCIA PRIMARIA A LOLARGO DE LA DENSIDAD ELECTRONICA…
Y LUEGO AJUSTANDO LA ESTRUCTURA TEÓRICA DE LA CADENA PRINCIPAL Y LATERAL A LA DENSIDAD OBSERVADA
(GRUPOS CARBONILO, GRUPOS FENILO)
LA CALIDAD DE LA DIFRACCIÓN DEPENDE EN GRAN MEDIDA DE LA CALIDAD DEL CRISTAL (ES DECIR SU REGULARIDAD) Y DETERMINA
LA RESOLUCIÓN DEL PATRÓN DE DENSIDAD ELECTRÓNICA
PORQUÉ ES ESTO IMPORTANTE??
PROTEÍNAS~1.5 Å Se distinguen cadenas laterales~3.0 Å Se puede seguir el esqueleto carbonado~5.0 Å Sólo se distingue el contorno de la hélice
CUAN BIEN SE PUEDEN DEFINIR LAS ESTRUCTURAS A DIFERENTES RESOLUCIONES??
AJUSTE DE CADENAS AMINOACIDICAS A LA DENSIDAD ELECTRONICA
REFINAMIENTO Y VALIDACIÓN DE ESTRUCTURASMUY IMPORTANTE, ALGUNAS ESTRUCTURAS PUBLICADAS ESTABAN MAL!!
LOS MODELOS SE REFINAN, PARA MEJORAR SU PRECISIÓN (SE CALCULA LA DIFERENCIA ENTRE LA DENSIDAD OBSERVADA Y LA TEÓRICA QUE CORRESPONDE AL MODELO: FACTORES RR=0.0 ( ACUERDO TOTAL), R=0.59 (DESACUERDO TOTAL)UN “BUEN R” ES R~0.15-0.20
SE CHEQUEA QUE EL MODELO SEA “REALISTA”, POR EJEMPLO QUE LOS ANGULOS PHI-PSI (ESTR SECUNDARIA) SEAN COMPATIBLES CON RAMACHANDRAN
SE CHEQUEAN LOS ÁNGULOS OMEGA (DEL ENLACE PEPTÍDICO) QUE EN GENERAL ES TRANS (OMEGA=180)
180 TRANS 0 CIS
RESUMIENDO…
REQUERIMIENTOS
INFORMACIÓN OBTENIDA
• Debemos contar con una fuente de proteína pura (en general expresión recombinante)• Debe poder ser concentrada a ~10mg/ml sin agregar• Debe ser posible encontrar condiciones para que se formen cristales de alto orden
• Detalles de la topología de la cadena (conectividad de elementos de estructura secundaria)
• Detalles de la ubicaciónde cadenas laterales
• Uniones puente H (a resmayores a 2A)
• Estructura de sitios activos en una enzima
• Sitio de unión de inhibidos
SE PUDO CRISTALIZAREL RIBOSOMA UNIDO AVARIOS ANTIBIÓTICOS,LOS CUALES SE ASOCIANAL CENTRO PEPTIDILTRANSFERASA
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
ES UNA TÉCNICA MÁS RECIENTE QUE LA CRISTALOGRAFÍA QUE PERMITE CONOCER LA ESTRUCTURA 3D DE PROTEÍNAS
LA PRIMERA ESTRUCTURA POR RMN FUE RESUELTA EN 1986
SOLO SE PUEDEN RESOLVER ESTRUCTURAS DE PROTEÍNAS DE PESO MOLECULAR < ~30KDA
REQUIERE DE PROTEÍNA PURA Y CONCENTRADA, MARCADACON ISÓTOPOS (15N, 13C)
MUY ÚTIL PARA ESTUDIAR LA DINÁMICA DE LAS PROTEÍNAS, Y SUS INTERACCIONES: ESTÁN EN SOLUCIÓN!
ESPECIALMENTE ÚTIL PARA PROTEÍNAS FLEXIBLES
RMN: PRINCIPIOS DE LA TÉCNICASe basa en la propiedad de MAGNETIZACION de ciertos núcleosEstos núcleos tienen spin, el cual genera un momento magnético y puede tomardos valores cuando el núcleo es sometido a un campo magnético
ALGUNOS NUCLEOS SOMETIDOS A UN CAMPO MAGNETICO TIENEN DOS ESTADOS DE SPIN
MEDIANTE UN PULSO DE RADIOFRECUENCIA (PULSO RF), PUEDO INDUCIR LA TRANSICION DEL ESTADO ALFA AL BETA (MAYOR ENERGIA) OBTENIENDO UNA RESONANCIA
LA FRECUENCIA REQUERIDA PARA OBSERVAR LA RESONANCIA DEPENDE DE LA DIFERENCIA DE ENERGIA ENTRE LOS ESTADOS, LA CUAL ES MAYOR CUANTO MAYOR ES EL CAMPO MAGNETICO QUE SE APLICA
ESPECTRO DE RESONANCIA 1H DE UN COMPUESTO
ETANOLPICOS RESUELTOS
PODEMOS OBTENER UN ESPECTRO DE RESONANCIA:
1- VARIANDO EL CAMPO MAGNETICO A UNA FRECUENCIA CONSTANTE DE RADIACION ELECTROMAGNETICA
2- MANTENIENDO EL CAMPO MAGNETICO CONSTANTE Y VARIANDO LA FRECUENCIA DE LA RADIACION ELECTROMAGNETICA
EL ESPECTRO NOS PERMITE INVESTIGAR EL ENTORNO QUIMICO DE LOS PROTONES. CADA TIPO DE 1H PRESENTA RESONANCIA A UNA FRECUENCIA (DESPLAZAMIENTO QUIMICO) DIFERENTE (DADOS POR CAMPOS MAGNETICOS LOCALES INDUCIDOS EN CADA NUCLEO)
Mido el desplazamiento químicoen partes por millón (ppm) con respecto a un compuesto de referencia
PROTON ALIFATICO 1ppmPROTON AROMATICO 7ppm
ESPECTROS MONODIMENSIONALES DE 1H
ETANOL
PROTEINA
EL DESPLAZAMIENTO QUIMICO DE CADA 1H DEPENDE DE SU ENTORNO QUIMICO
PICOS RESUELTOS
MAYOR COMPLEJIDADPICOS SUPERPUESTOS
PARA “ASIGNAR” COMPLETAMENTE UNA PROTEINA ES NECESARIO REALIZAR EXPERIMENTOS DE TRIPLE RESONANCIA
(1H, 15N, 13C)
PARA ELLO, LA PROTEINA DEBE SER PRODUCIDAEN FORMA RECOMBINANTE CON MARCACION ISOTOPICA
COMO SE HACE??
“MEDIO MINIMO”13C GLUCOSA 15NH4CL
PURIFICACION
EXPERIMENTO DE RMN PARA MEDIR UN ESPECTRO HSQC
PARA TENER UNA MAYOR RESOLUCIÓN, SE MIDEN ESPECTROS BIDIMENSIONALES 1H, 15N
PROTEINA CADA PICO CORRESPONDE AL PROTONASOCIADO AL N AMIDA DE UN AA
ESPECTRO HSQCHETERONUCLEAR SINGLE QUANTUM CORRELATION
ASIGNAR NO SIEMPRE ES FÁCIL O POSIBLE: LOS PICOS DEBEN TENER LA SUFICIENTE DISPERSIÓN
PARA RESOLVERSE
DOS EJEMPLOS DE ESPECTROS “MALOS”
ESTO ES NECESARIO PORQUE MIENTRAS TENGO ALTA ABUNDANCIA DE 1H, HAY BAJA ABUNDANCIA NATURAL DE 15N Y 13C
**
**
**
12C
ESQUEMA SIMPLIFICADO DE UN EXPERIMENTO NOESY
NOE = NUCLEAR OVERHAUSER EFFECT
PICOS FUERA DE LA DIAGONAL: INTERACCIONES ENTRE PROTONES QUE ESTAN CERCA EN EL ESPACIO (DIST MENOR A 5A)
EN ESTE EJEMPLO DE LOS AMINOACIDOS 2 Y 5
Se analiza como el spin de un protón afecta a los vecinosse induce una magnetización transiente que es transferida entre protones cercanos
EXPERIMENTO NOESY DE UNA PROTEINA REAL
SE OBSERVAN MULTIPLES PICOS FUERA DE LA DIAGONAL: INTERACCIONES TERCIARIAS
DETERMINACION DE ESTRUCTURA DE PROTEINASPOR RMN
NOESY
PROVEE RESTRICCIONESESTRUCTURALES
CONECTIVIDAD: CONTACTOS
FAMILIADE
ESTRUCTURAS
TIPOS DE DINAMICA QUE ES POSIBLE MEDIR POR RMN
EJEMPLO: ESTUDIO DE FLEXIBILIDAD MEDIANTE ANÁLISIS DE ESPECTROS HSQC
LA “DISPERSION” EN LA DIMENSION PROTON ME DA IDEADEL GRADO DE PLEGAMIENTO DE UNA PROTEINA…
PROTEINA GLOBULAR PROTEINA DESORDENADA
△ppm = 3ppm △ppm = 1-1,5ppm
PUEDO DETERMINAR SI UNA PROTEINA ES GLOBULAR O DESORDENADA POR LA DISPERSION EN LA EL EJE 1H DEL HSQC
EJEMPLO: ESTUDIO DE INTERACCIONES MEDIANTE ANÁLISIS DE ESPECTROS HSQC
E1A Proteina viral desordenada (violeta) que se une a
una proteína globular: Rb (gris)
EN REALIDAD…ES ASÍ
EJEMPLO: ESTUDIO DE INTERACCIONES MEDIANTE ANÁLISIS DE ESPECTROS HSQC
NEGRO: E1A
ROJO: E1A EN COMPLEJO CON RB
LOS PICOS DE ALGUNOS AMINOACIDOS“DESAPARECEN” AL PONER RB
MARCA REGIONES DE INTERACCION
EJEMPLO: ESTUDIO DE INTERACCIONES MEDIANTE ANÁLISIS DE ESPECTROS HSQC
IUNIDO/ILIBRE
LAS REGIONES DONDE LA INTENSIDAD
“DESAPARECE” CORRESPONDEN A
SITIOS DE INTERACCION
HACIENDO UNA “TITULACION” PUEDO INCLUSO MEDIR CONSTANTES DE AFINIDAD…
curva de titulación de las intensidades
PUEDO TENER DIFERENTE COMPORTAMIENTO DEPENDIENDO DE LA AFINIDAD…
“INTERCAMBIO LENTO”
“INTERCAMBIO RAPIDO”
BAJA AFINIDAD ALTA AFINIDAD
EJEMPLO: ESTUDIO DE CONTENIDO DE ESTRUCTURA SECUNDARIA MEDIANTE
DESPLAZAMIENTOS QUÍMICOS SECUNDARIOS
EL SIGNO DEL DESVÍO EN CADA NUCLEOME INDICA SI HAY ESTRUCTURA
ALFA O BETA
La región con desvío positivo en Calfa, corresponde a la hélice roja de p53
OTRO EJEMPLO MIRANDO CALFA Y HALFA
>0 HELICE
<0 HELICE
<0 BETA
>0 BETA
INTERPRETANDO EL EFECTO DE MUTACIONES(CON LO QUE YA SABEMOS!)
P53 NTAD. FLEXIBLERegión roja: forma hélice cuando se
une a Mdm2.
PERO…forma una hélice antes de unirse ???
INTERPRETANDO EL EFECTO DE MUTACIONES(CON LO QUE YA SABEMOS!)
SECUENCIA HÉLICE: 20-SDLWKLLPENN-30
WILD TYPE
P27A
RMN DE P53 SOLA (SIN MDM2)
AQUI NO HAY MUCHA HELICE PREEXISTENTE AL COMPLEJO. LA MUTACION DE LA PROLINA AUMENTA SU ESTABILIDAD Y AHORA SE PUEBLA
OTRO EJEMPLO SIMILAR (C-MYB UNIDO A KIX)
CMYB FLEXIBLE
Región AZUL: forma hélice cuando se une a KIX.
PERO…forma una hélice antes de unirse ???
OTRO EJEMPLO SIMILAR (C-MYB UNIDO A KIX)
WT
L300G
SECUENCIA: 292-EKRIKELELLLMSTRNRLKGQQ-313
L300P
AQUI HAY MUCHA MAS HELICE PREEXISTENTE
AL COMPLEJOLAS MUTACIONES LA
DESESTABILIZAN
EJEMPLO: ESTUDIO DE CONTENIDO DE ESTRUCTURA SECUNDARIA MEDIANTE
DESPLAZAMIENTOS QUÍMICOS SECUNDARIOS
