Investeşte în oameni ! Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013 Axa prioritară „Educatia si formarea profesională în sprijinul cresterii economice si dezvoltării societătii bazate pe cunoastere” Domeniul major de intervenţie 1.5 „Programe doctorale si post-doctorale în sprijinul cercetării”

Titlul proiectului: „Burse doctorale pentru cresterea competitivitatii in domeniul medical si farmaceutic” Numărul de identificare al contractului: POSDRU/88/1.5/S/58965 Beneficiar : Universitatea de Mdicina si Farmacie „Gr. T. Popa” Iasi Partener : Universitatea de Medicina si Farmacie „Iuliu Hatieganu” Cluj Napoca

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

“GRIGORE T. POPA” IAȘI

FACULTATEA DE FARMACIE

CORELAȚII ÎNTRE APORTUL ALIMENTAR DE METALE

TOXICE (CADMIU ȘI PLUMB) ȘI NIVELUL ACESTORA ÎN

LICHIDELE BIOLOGICE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC

PROF. DR. Rodica CUCIUREANU

DOCTORAND

Constantin CIOBANU

IAȘI 2013

Comisia de doctorat are următoarea componență:

PREȘEDINTE: Decan Prof. Univ. Dr. Monica Hăncianu

Universitatea de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași

CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC: Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu

Universitatea de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași

REFERENȚI OFICIALI:

Prof. Univ. Dr. Doina Miere

Universitatea de Medicină și Farmacie “Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca

Prof. Univ. Dr. Liliana Foia

Universitatea de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași

Conf. Univ. Dr. Ana Corina Ioniță

Universitatea de Medicină și Farmacie “Carol Davila” București

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT

Pagina

Introducere 1

Justificarea alegerii temei de doctorat 2

Obiective 3

PARTEA GENERALĂ 4

CAPITOLUL I. PLUMBUL ȘI CADMIUL ȊN ELEMENTELE DE MEDIU 4

I.1. Cadmiul și plumbul poluanți ai alimentelor 4

I.1.1 Plumbul 5

I.1.2 Cadmiul 8

I.2. Gradul de poluare al alimentelor cu plumb și cadmiu 10

I.3. Legislația privind conținutul de cadmiu și plumb în alimente 16

I.4. Estimarea aportului de cadmiu și plumb prin aport alimentar 18

I.5. Farmacocinetica și toxicitatea plumbului și a cadmiului 22

I.5.1. Cadmiul 22

I.5.1.1. Cadmiul - farmacocinetică 22

I.5.1.2. Efectele cadmiului asupra țesutului osos 26

I.5.1.3. Cadmiul și stresul oxidativ 26

I.5.1.4. Cadmiul – element cancerigen 29

I.5.2. Plumbul 30

I.5.2.1. Farmacocinetica și toxicitatea plumbului la nivel celular 31

I.5.2.2. Neurotoxicitatea plumbului 32

I.5.2.3. Influența plumbului asupra sistemului hematopoietic 34

I.5.2.4. Plumbul – agent cancerigen 34

I.5.2.5. Toxicitatea plumbului în perioada de gestație 35

I.5.2.6. Implicarea plumbului în producerea stresului oxidativ 35

I.5.2.7. Rolul plumbului și stresul oxidativ în apariția hipertensiunii arteriale 37

I.5.2.8. Efectul antioxidanților asupra toxicității plumbului 37

II.6. Metode de analiză 38

II.6.1. Mineralizarea probei 38

II.6.1.1. Calcinarea 39

II.6.1.2. Mineralizarea umedă 39

II.6.2. Spectrometria de absorbție atomică 39

II.6.3. Spectrometria de emisie atomică cu plasmă cuplată inductiv și

spectrometria de masă cu plasmă cuplată inductiv 40

II.6.4. Spectrometria de fluerescență cu raze X (XRFS) 41

PARTEA PERSONALĂ 42

CAPITOLUL II. EVALUAREA UNOR PARAMETRI DE PERFORMANȚĂ

PENTRU METODA SPECTROMETRIEI DE ABSORBȚIE ATOMICĂ CU

IONIZARE ÎN FLACĂRĂ

42

II.1. Evaluarea unor parametri de performanță pentru metoda spectrometriei de

absorbție atomica cu atomizare in flacără (SAAF) 42

II.1.1. Liniaritate 42

II.1.2. Procentul de recuperare 43

II.1.3. Repetabilitatea 43

II.1.4. Limita de detecție şi limita de cuantificare 44

II.2. Determinarea concentrațiilor de cadmiu și plumb din produse alimentare din

zona Moldovei prin spectrometrie de absorbție atomică cu ionizare în flacără 44

II.2.1. Introducere 44

II.2.2. Material şi metodă 45

II.2.2.1. Prelevarea probelor 45

II.2.2.2. Reactivi 45

II.2.2.3. Aparatură 45

II.2.2.4. Pregătirea probelor 46

II.2.2.5. Analiza statistică 46

II.2.3. Rezultate 47

II.2.4. Discuții 54

II.2.5. Concluzii 59

CAPITOLUL III. DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CADMIU ȘI PLUMB

DIN PRODUSE ALIMENTARE PRIN SPECTROMETRIE DE ABSORBȚIE

ATOMICĂ CU ATOMIZARE ELECTROTERMICĂ

60

III.1. Validarea unei metode spectrometrie de absorbție atomică cu atomizare

electrotermică (SAAET) 60

III.1.1. Protocol de validare 60

III.1.1.1. Sinopsis 60

III.1.1.2. Materiale și metoda analitică – prezentare 60

III.1.2. Procedura de validare 64

III.1.2.1. Liniaritate 64

III.1.2.2. Precizia 64

III.1.2.3. Acuratețea 64

III.1.2.4. Procentul de recuperare 65

III.1.2.5. Limita de detecție și limitele de cuantificare 65

III.1.3. Raport de validare 65

III.1.3.1. Sinopsis 65

III.1.3.2. Liniaritatea 65

III.1.3.3. Precizia 66

III.1.3.4. Acuratețea (exactitatea) 68

III.1.3.5. Procentul de recuperare 69

III.1.3.6. Limita de detecție și limita de cuantificare 69

III.1.4. Concluzii 69

III.2. Determinarea conținutului de cadmiu și plumb din produse alimentare prin

spectrometrie de absorbție atomică cu atomizare electrotermică 69

III.2.1. Introducere 69

III.2.2. Material și metodă 70

III.2.2.1. Prelevarea probelor 70

III.2.2.2. Aparatură 70

III.2.2.3. Prepararea probelor 71

III.2.2.4. Analiza statistică 71

III.2.3. Rezultate 71

III.2.4. Discuții 78

III.2.5. Concluzii 81

CAPITOLUL IV. ESTIMAREA APORTULUI ALIMENTAR DE CADMIU ȘI

PLUMB LA POPULAȚIA GENERELĂ 83

IV.1. Introducere 83

IV.2. Material și metodă 84

IV.3. Rezultate 85

IV.4. Discuții 91

IV.5. Concluzii 95

CAPITOLUL V. CORELAȚII ÎNTRECONȚINUTUL DE CADMIU ȘI PLUMB DIN

SOL ȘI NIVELUL ACESTORA ÎN PLANTELE DE CULTURĂ (PORUMB) 96

V.1. Introducere 96

V.2. Material și metodă 96

V.2.1. Prelevarea și prelucrarea probelor de sol și de porumb 96

V.2.2. Determinarea unor parametri fizico – chimici ai solurilor 97

V.3. Rezultate 98

V.4. Discuții 105

V.5. Concluzii 108

CAPITOL VI. EVALUAREA TOXICITAȚII CUMULATIVE A CADMIULUI ȘI

PLUMBULUI LA ȘOBOLANI 109

VI.1. Introducere 109

VI.2. Material și metode 110

VI.3. Rezultate 111

VI.4. Discuții 130

VI.5. Concluzii 133

CAPITOLUL VII. CORELAȚII ÎNTRE APORTUL ALIMENTAR DE CADMIU ȘI

PLUMB ȘI NIVELUL ACESTORA ÎN LICHIDE BIOLOGICE (SÂNGE) LA

ȘOBOLANI

134

VII.1. Introducere 134

VII.2. Material și metode 134

VII.3. Rezultate 135

VII.4. Discuții 147

VII.5. Concluzii 150

CAPITOLUL VIII. CONCLUZII GENERALE 151

Bibliografie 153

Prezenta teză de doctorat este ilustrată prin 139 figuri, 44 tabele, și 386 referințe bibliografice. Rezumatul include un număr limitat din totalul acestora, menținând numerotarea din teză.

Cercetările realizate în cadrul studiilor doctorale au putut fi realizate și datorită statutului de bursier în cadrul proiectului „Burse doctorale pentru cresterea competitivitatii in domeniul medical si farmaceutic” POSDRU/88/1.5/S.58965, pe care l-am avut în perioada 2009-2013. Formarea mea ca cercetător, inițiată în cadrul Universității de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa“ Iași, Facultatea de Farmacie, disciplina Chimia mediului și alimentului a fost completată prin stagiul de mobilitate transnațională realizat la Université de Franche-Comté, Faculté de Medicine – Pharmacié, Département de Physiologie et Pharmacologie,

France.

Sincere mulțumiri pentru întreaga contribuție la formarea mea profesională:

D-nei Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu

Universitatea de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași.

D-ului Prof. Dr. Alain Berthelot Université de Franche-Comté, Faculté de Medicine – Pharmacié, Département de

Physiologie et Pharmacologie, France.

D-nei Dr. Sylvie Devaux Université de Franche-Comté, Faculté de Medicine – Pharmacié, Département de

Physiologie et Pharmacologie, France.

1

INTRODUCERE

Cantitatea de ioni metalici ingerată de om este strâns legată de obiceiurile

sale alimentare şi bineînţeles de conţinutul în metale toxice al alimentelor.

Concentraţiile de ioni metalci din produsele alimentare depind de caracteristicile

solului (pH-ul, conţinutul de materie organică etc) care pot afecta

biodisponibilitatea elementelor (Wasserman, 1998).

Consumul de alimente a fost identificat ca fiind principala cale de expunere

la aceste metale toxice, reprezentând mai mult de 90%, în comparaţie cu alte căi de

expunere cum ar fi inhalarea şi contactul cu pielea. Prin urmare, acumularea

acestor două metale în mediul înconjurător reprezintă o problemă strigentă din

cauza aspectelor legate de siguranţa alimentară şi potenţialele riscuri pentru

sănătatea populaţiei (Zheng et al., 2007).

Poluarea produselor alimentare cu metale grele devine o problemă inevitabilă a zilelor noatre. Poluarea aerului, solului şi a apelor cu metale cum ar fi

cadmiul şi plumbul în alimente, contribuie la apariţia unor efecte nocive asupra

elementelor mediului înconjurător (floră şi faună). Apariţia componentelor

ecosistemului poluate cu aceste metale toxice rezultă din creşterea industrială

rapidă, progresele obţinute în industria chimică, sau din diferite activităţi umane.

Toţi aceşti factori au dus la răspândirea metalelor toxice în mediu şi în consecinţă

la afectarea stării de sănătate a populaţiei prin ingestia de alimente contaminate cu

elemente nocive (Zukowska et al., 2008). Metalele îşi pot schimba forma chimică,

dar nu pot fi îndepărtate sau distruse, ceea ce înseamnă că sunt persistente în mediu

şi pot fi bioacumulate în organismul plantelor şi animalelor. Din acest motiv,

evaluarea riscurilor ce rezultă în urma expunerii la metale toxice reprezintă o problemă importantă pentru protejarea sănătăţii publice (Nadal et al., 2008).

Plumbul şi cadmiul nu sunt cunoscute doar pentru potenţialul toxic direct pe

care îl prezintă ci şi pentru faptul că interferă cu metabolismul unor metale

esenţiale.

2

Justificarea alegerii temei de doctorat

Proiectul propus pentru realizarea tezei de doctorat are ca temă studiul

corelaţiei dintre aportul alimentar de metale toxice (plumb şi cadmiu) şi nivelul

acestora în lichidele biologice la animalele de laborator.

În ciuda faptului că în ultimele decenii au fost luate numeroase măsuri de

prevenire a intoxicaţiilor cu aceste metale toxice, riscul de contaminare cu plumb

sau cadmiu reprezintă înca o problemă stringentă de sănătate publică deoarece

aceste metale prezintă o toxicitate ridicată chiar şi la concentraţii mici. Un alt

motiv pentru care studiul acestor ioni metalici reprezintă încă o prioritate, este dat

de faptul că diferenţa dintre concentraţiile maxime admise de legislaţia sanitară şi concentraţiile la care apar efecte toxice este foarte mică.

Plumbul şi cadmiul sunt metale omniprezente cunoscute ca poluanţi

deosebit de periculoşi pentru mediul înconjurator prin remanenţa de lungă durată în

sol, dar şi pentru organismul uman sau animal, datorită toxicitaţii ridicate şi

potenţialului de a afecta iremediabil ţesutul renal, ţesutul hepatic şi sistemul

nervos. În literatura de specialitate sunt numeroase semnalări privind consecinţele

prezenţei plumbului şi cadmiului ca poluanţi în toate elementele de mediu, dar mai

ales în produsele alimentare. Foarte recent, Gollenberg et al. (2010) au sugerat

existenţa unei corelaţii directe între aportul excesiv de cadmiu prin consumul

alimentelor puternic impurificate şi dezvoltarea caracterelor sexuale secundare

(valorile hormonilor reproductivi şi instalarea pubertăţii) (Gollenberg et al., 2010). De asemenea, consumul de alimente care aduc concentraţii toxice de plumb şi

cadmiu conduce la insuficienţă renală, dereglarea valorilor normale ale tensiunii

arteriale, osteoporoză, hematotoxicitate, anemii, epuizarea rezervelor unor

microelemente esenţiale pentru dezvoltarea normală a organismului (Se, Zn, Fe, Ca

etc).

În schimb, corelaţiile între poluarea alimentelor şi consecinţele consumului

de alimente având concentraţii crescute de ioni metalici prezenţi ca poluanţi asupra

sănătăţii consumatorilor nu au fost studiate unitar. Toxicitatea cronică a unora

dintre ionii metalici poluanţi, mai ales pentru cadmiu şi plumb şi, mai recent

acţiunea cancerigenă la nivel renal şi hepatic sunt motive întemeiate pentru a

aprofunda aceste cercetări. Este bine cunoscut faptul că o creştere a aportului

alimentar de cadmiu poate provoca tulburari funcţionale în special în rândul tinerilor (Krejpcio et al., 1999). Studiile pe modele animale au demonstrat că atât

plumbul dar şi cadmiul provoacă leziuni la nivelul diferitor ţesuturi şi organe şi

modifică valorile unor parametri biochimici. Astfel, în urma unui examen

histopatologic a unor probe de rinichi, prelevate de la şobolanii ce au fost expuşi la

cadmiu, s-a observat fragmentarea parţială a celulelor renale cu eliberarea

nucleelor în lumenul tubular, iar citoplasma celulelor tubulare prezenta formă

granulară. Practic în întreaga regiune a cortexului renal, au fost evidenţiate edeme,

3

întreruperea membranelor celulelor epiteliale şi prezenţa masei micro-granulate

acidofile (Brzoska et al., 2003). De asemenea, în cazul şoarecilor expuşi la plumb,

examenul histopatologic efectuat pe probe de ficat a evidenţiat congestia vaselor de

sange, degenerarea hidropică, iar la nivelul parenchimului hepatic şi a cortexului

renal au fost observate zone necozate pline de limfocite (Hashem şi El-Sharkawy,

2009).

Prin urmare este nevoie de monitorizarea continuă a nivelului de plumb şi

cadmiu în alimente şi în mediu dar mai ales la nivelul populaţiilor sensibile (copii,

femei însarcinate, vârstnici etc).

Obiectivele tezei de doctorat

Validarea unei metode analitice de determinare a cadmiului şi a plumbului

din produse alimentare: o metodă spectrometrică de absorbţie atomică cu

atomizare electrotermică

Aplicarea a două două metode analitice (spectrometrie de absorbţie atomică

cu atomizare electrotermică şi cu flacără) la determinarea concentraţiile de

cadmiu şi plumb din produse alimentare pentru evaluarea gradului de

poluare cu cele două metale toxice a alimentelor din zona Moldovei

Estimarea aportului de plumb şi cadmiu prin consum de alimente la

populaţia generală

Stabilirea unor corelaţii între conţinutul de cadmiu şi plumb în sol şi nivelul

acestora în plantele de cultură (porumb).

Evaluarea toxicităţii cumulative a cadmiului şi plumbului adminitrate

simultan la şobolani

Corelaţii între aportul alimentar de cadmiu şi plumb şi nivelul acestora în lichide biologice (sânge) la şobolani

4

CONTRIBUŢII PERSONALE

Capitolul II. EVALUAREA UNOR PARAMETRI DE PERFORMANŢĂ

PENTRU METODA SPECTROMETRIEI DE ABSORBŢIE ATOMICĂ CU

IONIZARE ÎN FLACĂRĂ

Parametrii de performanţă evaluaţi au fost: liniaritatea, gradul de

recuperare, repetabilitatea, limită de detecţie, limită de cuantificare. Tabelul 2.I

prezintă condiţiile de operare a spectrometrului de absorbţie atomică cu flacără.

Tabel 2.I

Condiţii de operare a spectrometrului de absorbţie atomică cu flacără

Metalul analizat Cd Pb

Lungime de undă (nm) 228.8018 217.0005

Lungimea fantei flăcarii

(mm)

100 100

Flacără Acetilenă- aer Acetilenă- aer

Debit amestec gaze (L/h) 50 65

II.1.1. Liniaritate

Răspunsul analitic a fost liniar pe domeniul de concentraţii 0,01 – 0,2 mg/L

pentru plumb şi 0,01 – 0,2 mg/L pentru cadmiu , coeficienţii de regresie fiind 0.9983 în cazul plumbului (fig. 2.1) şi 0.9987 în cazul cadmiului (fig. 2.2).

Fig. 2.1 – Curba de calibrare pentru plumb

5

Fig. 2.2 – Curba de calibrare pentru cadmiu

II.1.2. Procentul de recuperare

Pentru evaluarea gradului de recuperare a cadmiului şi a plumbului din

produsele alimentare, au fost fortificate o serie de probe cu soluţii de concentraţii

cunoscute. Gradul de recuperare înregistrat a fost > 85% în cazul plumbului şi >

90% pentru cadmiu.

II.1.3. Repetabilitatea

Repetabilitatea metodei a fost studiată pe baza a 11 determinări efectuate de

către acelaşi operator cu păstrarea aceloraşi condiţii experimentale. Deviaţiile

standard relative au fost 3.98% pentru plumb şi 1.73% pentru cadmiu.

II.1.4. Limita de detecţie şi limita de cuantificare

Limita de detecţie a fost calculată după formula: LD = 3 x SD / pantă

SD – deviaţia standard a 11 citiri blank (0.00010254 pentru Pb)

(0.00009950 pentru Cd) pantă – panta curbei de calibrare (0.07008 pentru Pb)

(0.49906 pentru Cd)

Limita de cuantificare : LQ = 10 x SD / pantă

Limitele de detecţie au fost calculate pentru probe cu masa de 25 grame şi o

diluţie finală de 25 ml.

6

II.2. Determinarea concentraţiilor de cadmiu şi plumb din produse alimentare

din zona Moldovei prin spectrometrie de absorbţie atomica cu ionizare in

flacără

II.2.2. Material şi metodă

II.2.2.1. Prelevarea probelor

Concentraţiile de cadmiu şi plumb au fost determinate dintr-un total de 373

de probe ce acoperă 72 de produse alimentare achiziţionate din supermarket-urile

şi pieţele din zona Moldovei. Produsele alimentare au fost colectate în perioada

2009 – 2011. Plumbul a fost identificat în 87.66% din probe iar cadmiul în 88.74%.

Pentru fiecare produs alimentar au fost prelevate între 3 şi 10 probe din locaţii

diferite, iar pentru fiecare proba au fost recoltate câte 3 subprobe, care ulterior au

fost omogenizate în vederea analizei.

II.2.2.2. Reactivi

Toţi reactivii utilizaţi pentru efectuarea analizelor au fost de puritate

analitică: acid azotic 65%, apă purificată. Pentru realizarea curbei de calibrare au fost folosite diluţii ale unor soluţii standard de plumb (1 mg/ml), respectiv de

cadmiu (1 mg/ml) furnizate de Inorganic Ventures, Spania.

II.2.2.3. Aparatură

Pentru a determina nivelurile de plumb şi cadmiu din produse alimentare s-a

folosit metoda spectrometriei de absorbţie atomică cu atomizare în flacără. A fost

utilizat un spectrometru de absorbţie atomică cu flacără: ContrAA 300 HR-CS

AAS (High Resolution Continuum Source Atomic Absorbtion Spectrometry)

(Analytic Jena, Germania). Aparatul are ca sursă de radiaţie continuă o lampă de

xenon cu arc scurt şi prezintă o gamă de lungimi de undă cuprinse între 190 nm şi 900nm. Parametrii intrumentali au fost optimizati în concordanţă cu recomandările

producătorului (tabel 2.I). Pentru mineralizarea uscată a probelor de alimente s-o

utilizat un cuptor de calcinare (Nabertherm, Germania).

II.2.2.4. Pregătirea probelor

Au fost luate în lucru aproximativ 20 – 30 de grame din subprobele

omogenizate şi au fost lăsate peste noapte la o temperatură de 105 ºC după care au

fost supuse mineralizării uscate la o temperatură de 450 ºC folosind un cuptorul de

7

calcinare. Pentru a evita o posibilă contaminare cu plumb şi cadmiu, sticlăria a fost

lăsată peste noapte într-o solutie de HNO3 10% iar înainte de utilizare a fost clătită

cu apă purificată.

II.2.2.5. Analiza statistică

Analiza statistică a rezultatelor a fost efectuată cu ajutorul programului

Microsoft Excel 2007. Valorile finale au fost exprimate ca medie aritmetică ±

deviaţia standard a mediei.

II.2.3. Rezultate

Distribuţia probelor analizate în funcţie de natura acestora este prezentată în

figurile 2.4 (plumb) şi 2.5 (cadmiu).

Fig. 2.4 Distribuţia probelor analizate Fig. 2.5 Distribuţia probelor analizate în funcţie de natura acestora (plumb) în funcţie de natura acestora (cadmiu)

Figurile 2.12 - 2.14 prezintă concentraţiile comparative ale plumbului şi

cadmiului în produsele de origine vegetală, animală şi în dulciuri.

Fig. 2.12 Concentraţiile comparative de plumb şi cadmiu în unele produse de origine vegetală

8

Fig. 2.13 Concentraţiile comparative de plumb şi cadmiu în unele produse de origine

animală

Fig. 2.14 Concentraţiile comparative de plumb şi cadmiu în unele produse alimentare

dulci

II.2.4. Discuţii

Riscul asociat cu expunerea la metalele toxice prezente în produsele alimentare a impus actualizarea reglemetărilor legislaţiei cu privire la siguranţa

alimentului. Avansul tehnologic înregistrat în domeniul producţiei şi procesării

alimentelor a crescut şansele de poluare ale acestora cu diverşi poluanţi de mediu,

cum ar fi plumbul şi cadmiul. Conţinutul acestor metale toxice determinat în

produsele analizate variază în funcţie de numeroşi factori: natura produsului

alimentar, zona geografică, perioada anului în care a fost cultivat sau preparat,

posibilitatea poluării produsului alimentar în timpul prelucrarii, depozitării sau

transportului (Caggiano et al., 2005).

9

În cazul plumbului, un număr de 46 de probe (12%) au prezentat

concentraţii sub limita de detecţie a metodei. Majoritatea probelor analizate (204

probe – 55%) au fost de origine vegetală, restul fiind reprezentate de probe de

origine animală (79 probe – 21%) şi dulciuri (44 probe – 12%). În ceea ce priveşte

cadmiul, 42 de probe (11%) au fost negative, 218 probe (59%) au fost de natură

vegetală, 79 probe au fost de origine animală (21%) şi 34 de probe (9%) dulciuri.

Astfel, concentraţiile de plumbul au fost sub limita de cuantificare în cazul a 32 de

probe (14%) pentru alimentele de origine vegetală, 14 probe (15 %) în cazul

alimentelor de origine animală, iar pentru dulciuri, toate concentraţiile de plumb din probele analizate au fost cuantificabile. Cadmiul nu a fost evidenţiat în 18

probe (8%) de origine vegetală, 14 probe (15%) de origine animală şi 10 probe

(23%) de dulciuri întrucât aceste probe au prezentat valori sub limita de

cuantificare. În studiul efectuat de noi, concentraţiile cadmiului şi plumbului determinate

se încadrează în limitele maxime admise de autorităţile europene (Regulamentul nr. 1881/2006, 2006).

Conţinutul mediu de plumb în produsele alimentare a variat între

concentraţii mai mici decât limita de cuantificare în produsele lactate (caşcaval,

lapte, brânză, smântână) şi ouă până la concentraţii ridicate de 0.132 mg/kg şi

0.122 mg/kg plumb în de patrunjel frunze (uscate), respectiv mărar, 0.137 mg/kg

plumb în spanac, 0.222 mg/kg plumb în rinichiul de vită şi 0.385 mg/kg în ficatul

de porc. Pentru cadmiu, concentraţiile au variat de la niveluri mici (sub limita de

cuantificare a metodei) în produse lactate şi ouă până la niveluri ridicate în ficatul

de porc (0.151 mg/kg) şi rinichiul de vită (0.450 mg/kg).

Un conţinut ridicat de plumb a fost determinat în seminţele decorticate de

Floarea soarelui cu o concentraţe medie de 0.393 mg/kg şi o valoare maximă de 1.264 mg/kg.

Comparativ cu un studiu efectuat în Turcia (Bakirdere et al., 2008), valorile

cadmiului şi plumbului obţinute de noi sunt mult mai mici pentru aceste fructe şi

legume. Aşadar, este putin probabil ca acestea sa fi fost cultivate într-o zonă

expusă poluării excesive cu aceste metale. Nivelurile de cadmiu şi plumb obţinute

au fost 0.02 mg/kg în roşii, 0.01 mg/kg în ardei gras, 0.05 mg/kg în pătrunjel

(produs uscat) pentru cadmiu şi 0.025 mg/kg în mere, 0.025 mg/kg în struguri,

0.092 mg/kg în roşii, 0.023 în ardei gras şi 0.132 mg/kg în pătrunjel (produs uscat)

pentru plumb.

Numeroase studii au arătat că nivelurile de cadmiu în preparartele pe bază de

rinichi şi ficat de vită sau porc, uneori pot să depăşească limita maximă admisă. De

exemplu, concentraţiile de cadmiu (0.049 mg/kg) şi plumb (0.116 mg/kg) din leber obţinute în cadrul studiului nostru sunt mai mari comparativ cu valorile altor

preparate din carne. Acest lucru se datorează probabil faptului că la prepararea

leberului se utilizează cantităţi mari de organe (rinichi, ficat etc). Cu toate acestea

aportul zilnic de cadmiu şi plumb prin consumul acestor preparate este mic

deoarece viscerele sunt utilizate destul de rar în alimentaţie (Lopez Alonso et al.,

10

2002). Populaţia care depăşeşte limita aportului alimentar de cadmiu stabilită de

OMS este populaţia Groenlandei, ţara în care ficatul de focă reprezintă principala

sursă de cadmiu (Johansen et al., 2000).

În ceea ce priveşte concentraţiile medii de cadmiu şi plumb în conservele de

peşte, acestea au prezentat valori cuprinse între 0.09 mg/kg şi 0.093 mg/kg pentru

plumb şi 0.026 mg/kg - 0.029 mg/kg pentru cadmiu. Pentru carnea de pasăre

valorile medii ale plumbului şi cadmiului au fost 0.068 mg/kg, respectiv 0.013

mg/kg.

Conform recomandărilor Comisiei Uniunii Europene, concentraţiile de plumb şi cadmiu din carnea de peşte destinată consumului populaţiei nu trebuie să

depăşească 0.3 mg/kg şi respectiv 0.1 mg/kg, iar în cazul cărnii de pasăre 0.1

mg/kg şi respectiv 0.05 mg/kg (Regulamentul nr. 1881/2006, 2006). Valorile celor

două metale toxice obţinute în urma acestui studiu sunt sub limita maximă admisă

de autorităţile europene atât pentru carnea de pasăre cât şi pentru peşte, deşi

aceasta din urmă, în cazul plumbului este apropiată de limita superioara impusă.

Concentraţiile de plumb din carnea de peşte de obicei reflectă nivelurile de metal

din mediul în care aceştia trăiesc (sedimente, ape, hrană)(Alquezar et al., 2006).

Numeroase studii referitoare la dulciuri prezintă valori mult mai mari decât

cele obţinute de noi. Aşadar concentraţiile determinate de noi (ciocolată de casă –

0.058 mg/kg plumb şi 0.034 mg/kg cadmiu, ciocolată cu alune – 0.0062 mg/kg

plumb şi 0.017 mg/kg cadmiu, bomboane cu aromă de vişine – 0.050 mg/kg plumb şi 0.009 mg/ kg cadmiu) sunt mai mici decât majoritatea datelor prezentate în

literatura de specialitate.

Produsele alimentare analizate prezintă concentraţii de plumb şi cadmiu

sub limitele maxime admise de autorităţile europene aşadar consumul unor cantităţi

moderate ale acestor produse alimentare nu reprezintă un risc pentru sănătatea

consumatorului.

11

Capitolul III. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE CADMIU ŞI PLUMB

DIN PRODUSE ALIMENTARE PRIN SPECTROMETRIE DE ABSORBŢIE

ATOMICĂ CU ATOMIZARE ELECTROTERMICĂ

III.1. Validarea unei metode spectrometrie de absorbţie atomică cu atomizare

electrotermică (SAAET)

III.1.1.1. Sinopsis

Metoda de validare şi procedura de analiză a produselor alimentare a fost

realizată în conformitate cu ghidurile de validare pentru metode analitice ale FDA (Food and Drug Administration, SUA) şi AOAC International (Association of

Official Analytical Chemists).

Parametri de performanţă ai metodei analitice care vor fi evaluaţi:

Liniaritate

Precizie (repetabilitate şi precizie intermediară)

Acurateţe (exactitate)

Procent de recuperare

Limită de detecţie

Limită de cuantificare

Prepararea probelor

Se ia în lucru o masă de probă cuprinsă între 1 şi 3 grame produs proaspăt

(pentru laptele proaspăt se iau în lucru 5 ml). Probele se ametecă cu soluţie de acid

azotic : apă ultrapură. Ulterior amestecul se încalzeşte în tuburi de polipropilenă la

o temperatură de 100 ᵒC utilizând sistemul de digestie umedă DigiPREP. Se

adăugă peroxid de higrogen 30% după care se menţin la 100 ᵒC. Soluţiile

mineralizate se filtrează şi se aduc la un volum constant cu apă ultrapură. Un

volum de 2 ml din soluţia finală se introduce într-un flacon de autosampler, în

vederea analizei.

Condiţii de lucru SAAET Parametrii intrumentali ai spectrometrului de absorbţie atomică cu cuptor de

grafit sunt prezentaţi în tabelul 3.V.

12

Tabel 3.V

Parametrii instrumentali ai aparatului HITACHI Z-9000

Corecţie de fond Efect Zeeman

Lungime de undă (nm)

Pb 283.3

Cd 228.8

Curent lampă (mA)

Pb 7.5

Cd 7.5

Cuptor grafit Pirolitic

Volum de probă injectat (µL) 10

Volum soluţie modificator de matrice injectat

(µL)

5

Temperatura de injectare (ᵒC) 70

Mod de calcul Înălţimea picului

III.1.3. Raport de validare

III.1.3.2. Liniaritatea

Răspunsul analitic a fost liniar pe domeniul de concentraţii 0 µg/L – 40 µg/L

pentru plumb şi 0 µg/L – 8 µg/L pentru cadmiu, coeficienţii de regresie fiind >

0.999 în cazul plumbului şi > 0.99 în cazul cadmiului.

III.1.5.3. Precizia (repetabilitatea şi precizia intermediară)

Repetabilitatea

Deviaţia standard relativă în cazul repetabilităţii pentru cele trei niveluri

testate a fost mai mică decât ± 15%.

Precizie intermediară

Deviaţia standard relativă a preciziei intermediare a fost mai mică de ± 15% .

III.1.3.4. Acurateţea (exactitatea)

Deviaţia standard relativă (DSR) a concentraţiei măsurate nu a depăşit ±

15% din concentraţia reală (tabel 3.XI).

III.1.3.5. Procentul de recuperare

Procentul de recuperare mediu a analiţilor a variat între 91.75% şi 96.16%

pentru plumb, iar pentru cadmiu a variat între 98.34% şi 100.5% .

13

III.1.3.6. Limita de detecţie şi limita de cuantificare

În cazul plumbului, limita de detecţie a fost de 10 µg/kg iar limita de

cuantificare 30 µg/kg. Pentru cadmiu, limita de detecţie a fost de 1 µg/kg iar limita

de cuantificare a fost de 3 µg/kg.

III.2. Determinarea conţinutului de cadmiu şi plumb din produse alimentare

prin spectrometrie de absorbţie atomică cu atomizare electrotermică

III.2.2. Material şi metodă

III.2.2.1. Prelevarea probelor

Concentraţiile de cadmiu şi plumb au fost analizate în 204 de probe ce

acoperă 30 de categorii de produse alimentare din zona Besancon (Franţa) şi 18

categorii de produse alimentare diferite din zona Moldovei (România). Produsele

alimentare au fost colectate în perioada martie - iunie 2012. Pentru fiecare produs alimentar au fost prelevate între 2 şi 8 probe din locaţii diferite, iar pentru fiecare

proba au fost recoltate câte 3 subprobe, care ulterior au fost omogenizate în

vederea analizei. Toate produsele alimentare achiziţionate, au fost păstrate în

ambalajele originale. În cazul alimentelor cărora nu a fost posibil acest lucru,

probele au fost păstrate în recipiente curate de polipropilenă. Toate probele au fost

depozitate la o temperatură de -18ᵒC până în ziua în care a fost realizată analiza

plumbului şi cadmiului. Părţile alimentelor care au fost lovite, putrezite sau

deteriorate mecanic, au fost eliminate şi numai părţile comestibile ale probelor au

fost utilizate pentru analiză. Pentru ca determinarea să fie mai precisă şi pentru a

imita condiţiile de ingestie, probele au fost tăiate în bucăţi mai mici. Prelevarea

probelor în vederea analizei celor două metale toxice a fost realizată conform legislaţiei în vigoare (Regulamentul nr. 333/2007, 2007).

III.2.2.2. Aparatură

Pentru determinarea conţinutului de plumb şi cadmiu a fost utilizată metoda

spectrometriei de absorbţie atomică cu atomizare electrotermică folosind un

spectrometru de absorbţie atomică dotat cu un cuptor de grafit: HITACHI Z-9000.

Aparatul are capacitatea de a determina până la patru elemente în acelasi timp.

Parametrii intrumentali au fost optimizati în concordanţă cu recomandările

producătorului (tabel 3.V).

III.2.2.3. Prepararea probelor

A fost luată în lucru o masă de probă cuprinsă între 1 şi 3 grame produs proaspăt (pentru laptele proaspăt au fost luaţi în lucru 5 ml). Probele au fost

mineralizate prin metoda digestiei umede. Pe parcursul efectuării analizelor au fost

14

preparate mai multe probe “blank” ce conţineau doar reactivii utilizaţi. Toate

materialele din plastic şi sticlă de laborator utilizate au fost ţinute într-o soluţie de

acid azotic 15% aproximativ 24 de ore şi apoi au fost clătite cu apă ultrapură şi

ulterior uscate într-o atmosferă fără posibili poluanţi, cu scopul de a evita o

posibilă contaminare. Probele au fost analizate în duplicat.

III.2.3. Rezultate

Fig. 3.4 Distribuţia probele analizate Fig. 3.5 Distribuţia probele analizate

(Franţa) (România)

Figurile 3.4 şi 3.5 prezintă distribuţia cadmiului şi a plumbului în probele analizate în Franţa, respectiv România.

Concentraţiile de cadmiu şi de plumb din alimentele provenite din Franţa şi

din România sunt prezentate comparativ în figurile 3.6 - 3.9.

Fig. 3.6 Concentraţiile (mg/kg produs prospăt) comparative ale plumbului din produse de

origine vegetală din Franţa şi România

15

Fig. 3.7 Concentraţiile comparative (mg/kg produs prospăt) ale plumbului din produse de

origine animală din Franţa şi România

Fig. 3.8 Concentraţiile comparative (mg/kg produs proaspăt) ale cadmiului din produse de

origine vegetală din Franţa şi România

16

Fig. 3.9 Concentraţiile comparative (mg/kg produs prospăt) ale cadmiului din produse de

origine animală din Franţa şi România

III.2.4. Discuţii

În Franţa 23% din probele analizate au fost de origine vegetală şi 77% au

fost de origine animală. În România 34% din probele analizate au fost de origine

vegetală iar 66% au fost de origine animală.

Concentraţia plumbului în Franţa a variat între niveluri mici (0.005 mg/kg) în kiwi, struguri albi, făină de porumb, muştar, căpşune, ouă de găină, (0.009

mg/kg) în pâine neagră, salată verde, conservă de ton, şuncă de porc şi niveluri mai

ridicate în pâine prăjită (0.023 mg/kg), frunzele de pătrunjel uscat (0.05 mg/kg) şi

0.279 mg/kg în ceaiul negru. Valorile cadmiului în probele analizate au variat de

asemenea de la concentraţii foarte mici de 0.0005 mg/kg în produsele lactate

(caşcaval, lapte de vacă), legume (ardei gras roşu, roşii, conservă de fasole verde),

în fructe (kiwi, căpşune, portocale, mere), ouă de gaină şi concentraţii mai mari de

cadmiu în cartofi, pâine prăjită, sfeclă roşie, pâine albă (0.003 mg/kg), conservă de

ton (0.012 mg/kg), muştar (0.013 mg/kg), frunze de pătrunjel uscat (0.053 mg/kg).

În România, nivelurile de plumb în probele analizate a variat între valori mici

de 0.005 mg/kg în portocale, kiwi, 0.010 mg/kg în mere şi concentraţii mai mari în

salam (0.029 mg/kg), pâine prăjită (0.038 mg/kg) şi 0.094 mg/kg în ceaiul negru. În ceea ce priveşte conţinutul de cadmiu în produsele alimentare analizate, au fost

obţinute valori mici de cadmiu în caşcaval, conservă de fasole verde, portocale,

banane (0.0005 mg/kg), 0.001 mg/kg în pâine albă, cârnaţi, rădăcină de ţelină,

morcov, kiwi, făină de porumb, 0.003 mg/kg în cartofi, 0.004 mg/kg în pâine

prăjită şi concentraţii mai mari de cadmiu în conservă de sardine în sos tomat

(0.014 mg/kg), ceai negru (0.0165 mg/kg) şi 0.021 mg/kg în conserva de ton.

17

Atât în cazul produselor de origine vegetală cât şi în cazul produselor de

origine animală s-au obţinut valori ale concentraţiilor de plumb mai mari pentru

alimentele din România în comparaţie cu cele din Franţa.

Nivelurile de cadmiu în unele produsele alimentare analizate au prezentat

valori mai mari în cazul alimentelor de origine vegetală din România comparativ

cu cele din Franţa. Excepţie face pâinea albă, în cazul căreia valoarea obţinută

pentru produsul din Franţa (0.003 mg/kg) este mai mare decât valoarea pentru

produsul din România (0.001 mg/kg). De asemenea, în cazul morcovilor, făinii de

porumb, a merelor, a conservelor de fasole verde şi portocalelor s-au obţinut valori asemănătoare pentru produsele din ambele ţări.

Concentraţiile de cadmiu în unele alimente de origine animală (conserva de ton

şi conserva de sardine în sos tomat) au prezentat valori mai mari în cazul

produselor din România în comparaţie cu cele din Franţa. În cazul probelor de

salam analizate se observă că pentru produsele cumpărate din Franţa s-au obţinut

valori mai mari pentru cadmiu comparativ cu produsele de pe piaţa din România.

Nivelurile de metale toxice în alimentele analizate au variat foarte mult,

concentraţiile de cadmiu fiind cele mai scăzute iar cele de plumb cele mai ridicate,

atât la produsele alimentare din Franţa cât şi la cele din România. Exceptie face

tonul conservă, unde concentraţiile de cadmiu determinate au fost mai mari decât

cele de plumb pentru produsele din ambele ţări.

Factorii care afectează concentraţiile de plumb şi cadmiu din alimente sunt reprezentaţi de natura alimentelor, metodele de procesare, condiţionare şi

depozitare. Concentraţiile obţinute de noi pentru alimentele din Franţa sunt

comparabile cu datele prezentate de alte studii. Astfel, într-un un studiu efectuat în

Franţa - 1st French Total Diet Study (FTDS 1) de către Leblanc et al. (2005b) s-au

obţinut valori mai mari ale plumbului decât ale cadmiului din alimente. În

comparaţie cu FTDS 1, concentraţiile de cadmiu şi plumb obţinute de noi în urma

analizei produselor alimentare din România sunt uşor mai mari sau egale (Leblanc

et al., 2005b). Nivelurile de cadmiu în probele de ciocolată din Franţa analizate de

noi au fost mici (0.0005 mg/kg) dar similare cu valorile găsite de Leblanc et al.

(2005). În ceea ce priveşte plumbul, concentraţiile acestui metal în probele

analizate de noi sunt mai mici decât cele găsite în FTDS 1. Limita maximă admisă a plumbului si cadmiului în peşte conform legislaţiei

europene este de 0.2 mg/kg si respectiv 0.1 mg/kg (Regulamentul nr. 78/ 2005,

2005). Aliajul care este utilizat pentru lipirea conservelor reprezintă o sursă de

contaminare cu plumb în timpul procesului de ambalare. Mai mult, se ştie că s-au

găsit diverse tipuri de peşte care a fost poluat cu acest metal. Prin urmare,

monitorizarea concentraţiei de plumb în conservele de peşte este importantă pentru

sănătatea umană (Voegborlo et al., 1999). În cadrul studiului efectuat de noi,

nivelurile de plumb în conserva de ton (0.009 mg/kg), conserva de sardine în sos

tomat (0.015 mg/kg) din Franţa şi conserva de ton din România (0.017 mg/kg) sunt

18

mai mici decât cele observate în FTDS 1. De asemenea concentraţiile observate de

noi au fost mai mici decât cele prezentate de Khansari et al. (2005), care au

raportat valori ale plumbului în conserva de ton de 0.0162 mg/kg – 0.0726 mg/kg

cu o medie de 0.0366 mg/kg.

19

CAPITOLUL IV. ESTIMAREA APORTULUI ALIMENTAR DE CADMIU

ŞI PLUMB LA POPULAŢIA GENERELĂ

IV.2. Material şi metodă

Expunerea la cadmiu şi la plumb prin aport alimentar a populaţiei din Franţa şi

România a fost evaluată calculând concentraţiile celor două metale toxice din

consumul zilnic de alimente pentru un adult. Pentru acest lucru a fost utilizată ca

valoare de referinţă necesarul energetic zilnic pentru bărbaţi (2605 kcal) şi pentru

femei (2079 kcal) (SACN, 2012).

IV.3. Rezultate

Estimările (pentru România şi Franţa) sunt raportate separat pentru bărbaţi

şi pentru femei, în funcţie de necesarul energetic zilnic. Pentru Franţa, în dieta

vegetaliană, aportul alimentar în cazul bărbaţilor a fost de 0.0179 mg/zi iar la femei

0.0127 mg/zi pentru plumb şi de 0.00421 mg/zi (bărbaţi), 0.00308 mg/kg (femei)

pentru cadmiu. În dieta vegetariană, pentru plumb s-a constat un aport alimentar de

0.0128 mg/zi pentru bărbaţi şi 0.0088 mg/zi pentru femei, iar pentru cadmiu

0.00277 mg/zi la bărbaţi şi 0.00249 mg/zi la femei. În dieta convenţională, aportul

alimentar de plumb a fost de 0.0220 mg/zi pentru bărbaţi şi 0.0162 mg/zi pentru

femei, iar pentru cadmiu au fost constatate valori ale aportului alimentar de

0.00703 mg/zi la bărbaţi şi 0.00630 mg/zi la femei. Pentru România, în dieta

vegetaliană, aportul alimentar în cazul bărbaţilor a fost de 0.0408 mg/zi iar la femei 0.0281 mg/zi pentru plumb şi de 0.00383 mg/zi la bărbaţi, 0.00283 mg/zi la femei

pentru cadmiu. În dieta vegetariană, pentru plumb a fost înregistrată o valoare a

aportului alimentar de 0.0321 mg/zi la bărbaţi şi 0.0243 mg/zi la femei, iar pentru

cadmiu, 0.00301 mg/zi la bărbaţi şi 0.00229 mg/zi la femei. În cazul dietei

convenţionale, s-a constat un aport alimentar de plumb de 0.0405 mg/zi la bărbaţi

şi 0.0314 mg/zi la femei, iar pentru cadmiu 0.00752 mg/zi la bărbaţi şi 0.00567

mg/zi pentru femei. Aportul alimentar de cadmiu pentru un adult este de 0.00667

mg/zi în Franţa şi 0.00660 mg/zi în Romînia, iar în cazul plumbului aportul

alimentar pentru un adult este de 0.0191 mg/kg în Franţa şi 0.0360 mg/zi în

România.

Figura 4.1 şi figura 4.2 prezintă aportul alimentar mediu de plumb şi cadmiu la bărbaţi şi la femei pentru diferite tipuri de dietă în Franţa şi în România, iar în

figura 4.3 sunt ilustrate comparativ aporturile alimentare de plumb şi cadmiu în

cazul populaţiei generale din Franţa si din România.

20

Fig. 4.1. Aportul alimentar de plumb şi cadmiu la bărbaţi şi la femei pentru diferite tipuri de

dietă în Franţa

Fig. 4.2. Aportul alimentar de plumb şi cadmiu la bărbaţi şi la femei pentru diferite tipuri de

dietă în România

21

Fig. 4.3. Comparaţie între aportul alimentar de plumb şi cadmiu la bărbaţi şi la femei pentru diferite tipuri de dietă în Franţa şi

România

22

IV.4. Discuţii

Aportul de cadmiu şi plumb prin consumul de alimente depinde de

concentraţiile celor două metale toxice din alimente şi cantitatea de alimente

consumate. După cum se poate vedea din fig. 4.1, 4.2, aportul de cadmiu prin

consumul de produse alimentare din Franţa a fost estimat, în general, a fi sub

valorea toxicologică respectivă (0.058 mg/zi) atât în cazul dietei vegetaliene

(7.25% din DMTL pentru bărbaţi şi 5.31% pentru femei), vegetariene (4.77% din

DMTL la bărbaţi şi 4.29% la femei) şi convenţionale (12.12% din DMTL pentru

bărbaţi şi 10.86% la femei). De asemenea în cazul aportului alimentar de plumb,

valorile obţinute de noi se situează sub VR (valoarea de referinţă) pentru efecte neftologice (0.044 mg/zi pentru un adult de 70 kg), efecte cardiovasculare (0.105

mg/zi) sau pentru efecte de natură neurologică (0.035 mg/zi pentru o femeie de 70

kg) în cazul femeilor care alăptează. Astfel, în dieta vegetaliană, aportul de plumb

este de 40.68% din VR la bărbaţi şi 28.86% la femei, pentru prevenirea efectelor

nefrologice, 17.04% din VR la bărbaţi şi 12.09% la femei pentru prevenirea

efectelor cardiovasculare, 36.28% din VR în cazul femfeilor care alăptează pentru

prevenirea efectelor neurologice. În dieta vegetariană, aportul de plumb a fost de

29.09% din VR la bărbaţi şi 20% la femei pentru prevenirea efectelor nefrologice,

12.19% din VR pentru bărbaţi şi 8.38% la femei pentru prevenirea efectelor

cardiovasculare, 25.14% din VR în cazul femfeilor care alăptează pentru

prevenirea efectelor neurologice. În dieta convenţională, aportul de plumb a fost de 50% din VR la bărbaţi şi 36.81% la femei pentru prevenirea efectelor nefrologice,

20.95% din VR pentru bărbaţi şi 15.42% la femei pentru prevenirea efectelor

cardiovasculare, 46.28% din VR în cazul femeilor care alăptează pentru prevenirea

efectelor neurologice.

Valorile aportului alimentar de cadmiu pentru populaţia din România,

prezentate în fig 4.1 – 4.2, sunt de asemenea mult mai mici decât valoarea de

referinţă stabilită de autorităţile europene în cazul tuturor tipurilor de meniuri:

vegetalian (6.60% din DMTL pentru bărbaţi şi 4.88% pentru femei), vegetariene

(5.19% din DMTL la bărbaţi şi 3.94% la femei) şi convenţionale (12.96% din

DMTL pentru bărbaţi şi 9.77% la femei). În schimb, pentru plumb, aportul

alimentar în cazul dietei vegetaliene (0.0408 mg/zi)(92.72% din VR) şi a dietei

convenţionale (0.0405 mg/zi)(92.04% din VR) la bărbaţi este foarte apropiat ca valoare de limita de referinţă pentru efecte nefrologice (0.044 mg/zi). De asemenea

valoarea aportului alimentar pentru femei în cazul dietei convenţionale (0.0315

mg/zi)(90% din VR) este apropiată de valoarea de referinţă pentru efecte

neurologice (0.035 mg/zi). În dieta vegetaliană, aportul de plumb a fost de 63.86%

la femei, pentru prevenirea efectelor nefrologice, 30.57% din VR la bărbaţi şi

12.09% la femei pentru prevenirea efectelor cardiovasculare, 80.85% din VR în

23

cazul femeilor care alăptează pentru prevenirea efectelor neurologice. În dieta

vegetariană, aportul de plumb a fost de 68.4% din VR la bărbaţi şi 55.22% la femei

pentru prevenirea efectelor nefrologice, 30.57% din VR pentru bărbaţi şi 21.8% la

femei pentru prevenirea efectelor cardiovasculare, 69.42% din VR în cazul

femfeilor care alăptează pentru prevenirea efectelor neurologice. În dieta

convenţională, aportul de plumb a fost de 71.36% la femei pentru prevenirea

efectelor nefrologice, 68.57% din VR pentru bărbaţi şi 29.90% la femei pentru

prevenirea efectelor cardiovasculare.

Rezultatele studiului efectuat de noi arată că aportul alimentar de plumb este cu

mult mai mare decât cel de cadmiu în toate tipurile de dietă din Franţa şi din

România, atât în cazul bărbaţilor cât şi în cazul femeilor (fig. 4.1, fig. 4.2). Totodată, expunerea prin aport alimentar la cele două metale în rândul femeilor

este mai mică decât la bărbaţi datorită necesarului energetic zilnic mai mic. Atât în

Franţa cât şi în România, cel mai mic aport alimentar al cadmiului şi plumbului se

întâlneşte în cazul dietei vegetariene, urmată de dieta vegetaliană, iar cel mai mare

aport al celor două metale este în dieta convenţională. Excepţie face doar plumbul,

în cazul bărbaţilor din România, care are valori asemănătoare pentru dieta

vegetaliană şi convenţională.

În figura 4.3 sunt prezentate comparativ aporturile alimentare ale

plumbului şi cadmiului la populaţiile din Franţa şi România. Asfel, se poate

observa că în cazul dietei vegetaliene, populaţia franceză este mai puţin expusă la

plumb decât populaţia din România (aport dublu faţă de Framţa). În schimb, locuitorii Franţei au un aport alimentar mai mare de cadmiu comparativ cu cei din

România. În ceea ce priveşte dieta vegetariană, aportul alimentar de cadmiu şi

plumb este mai mic în Franţa decât în România, excepţie făcând doar femeile din

Franţa care au un aport alimentar de cadmiu mai mare decât cele din România. În

cazul dietei convenţionale, se poate observa că valoarea aportului alimentar de

plumb la populaţia din România este aproape dublu faţă de cel din Franţa, în

schimb, aportul de cadmiu în rândul femeilor din Franţa este mai mare decât a

celor din România.

În urma studiului efectuat de noi, s-a estimat că populaţia Franţei are un

aport alimentar de cadmiu de 0.00667 mg/zi pentru un adult, iar în cazul României

este de 0.0066 mg/zi. Aportul alimentar estimat de noi a fost comparat cu datele

disponibile în literatura de specialitate.

24

CAPITOL V. CORELAŢII ÎNTRE CONŢINUTUL DE CADMIU ŞI PLUMB

DIN SOL ŞI CONCENTRAŢIILE ACESTORA ÎN PLANTELE DE

CULTURĂ (PORUMB)

V.2. Material şi metode

V.2.1. Prelevarea şi prelucrarea probelor de sol şi de porumb

Au fost prelevate un număr de 80 de probe de sol şi 80 de porumb (Zea

Mays) din 27 de locaţii diferite din regiunea de nord-est a României (judeţele Iaşi, Suceava, Neamţ şi Bacău) la sfârşitul lunii august 2012. Pentru fiecare din cele 27

de locaţii au fost prelevate câte 3 probe (excepţie făcând doar comuna Drăgăşeni,

jud. Neamţ în cazul căreia au fost prelevate doar 2 probe). Fiecare probă a fost

prelevată de la minim 10 metri de şosea, iar distanţa dintre cele 3 probe dintr-o

locaţie a fost cuprinsă între 50 metri şi 1000 metri. Probele de sol au fost prelevate

de la o adâncime cuprinsă între 10 şi 20 de centimetri, iar masa unei probe a fost de

aproximativ 1000 grame. În cazul porumbului a fost prelevat minim 1 stiulete de

porumb din planta cultivată pe solul respectiv.

Toţi reactivii utilizati pentru determinarea plumbului şi cadmiului au fost

de puritate analitică, fiind achiziţionaţi de la firma Merk, Germania. Pe întreaga

perioadă a analizelor a fost utilizată apă bidistilată. În vederea determinării concentraţiilor de cadmiu şi plumb din probele de

sol şi porumb, a fost utilizată metoda mineralizării umede (amestec acid azotic şi

acid percloric). Nivelurile de cadmiu şi plumb din sol şi din porumb au fost

determinate prin spectrometrie de absorbţie atomică cu flacără

V.2.2. Determinarea unor parametri fizico – chimici ai solurilor

Parametrii fizico-chimici ai solului investigaţi în această lucrare au fost:

pH-ul, potenţialul redox (Eh Volţi), conductibilitatea electrică (CE), rH-ul şi

conţinutul total de săruri solubile (TSS).

Determinarea pH-lui (pH(H2O)). pH-ul a fost determinat prin metoda potenţiometrică (Bloom, 2000;

Bulgariu et al., 2005; Pansu şi Gautheyrou, 2006).

Determinarea potenţialului redox (Eh; Volţi).

Potenţialul redox a fost determinat prin metoda directă (Bloom, 2000;

Pansu şi Gautheyrou, 2006).

25

Determinarea conductibilităţii electrice (CE; S/cm). Determinarea conductibilităţii electrice s-a realizat prin metoda

conductometrică, în extract apos (Bloom, 2000; Pansu şi Gautheyrou, 2006).

Estimarea rH-lui.

rH-ul a fost calculat din datele experimentale pH(H2O) şi Eh cu

următoarea relaţie (Bulgariu et al, 2012):

029,0

.058,0 )( 2OHh pHErH

.

Estimarea conţinutului total de săruri solubile (TSS; mg / kg sol).

Pentru conversia măsurătorilor de conductibilitate electrică (CE) în valori

de concentraţie a sărurilor solubile (TSS) s-a utilizat următoarea ecuaţie

semiemipirică de dependenţă TSS = f(CE) (Shirokova et al, 2000; Pansu et

Gautheyrou, 2006):

56,1

]/[]/[

cmSCEkgmgTSS

V.3. Rezultate

În figurile 5.1 şi 5.2 sunt ilustrate corelaţiile dintre conţinutul de cadmiu/plumb din sol şi nivelul acestora în plantele de cultură (porumb), iar

figurile 5.3 – 5.6 prezintă frecvenţa concentraţiilor de plumb respectiv cadmiu în

sol şi în porumb.

Fig. 5.1. Corelaţia dintre conţinutul de cadmiu din sol şi nivelul acestuia în porumb

26

Fig. 5.2. Corelaţia dintre conţinutul de plumb din sol şi nivelul acestuia în porumb

Fig. 5.3. Frecvenţa concentraţiilor de plumb în sol

Fig. 5.4. Frecvenţa concentraţiilor de plumb în porumb

27

Fig. 5.5. Frecvenţa concentraţiilor de cadmiu în sol

Fig. 5.6. Frecvenţa concentraţiilor de cadmiu în porumb

V.4. Discuţii

În urma studiului efectuat de noi s-a observat că valorile cadmiului şi

plumbului au variat considerabil atât în cazul solurilor cât şi în cazul porumbului în

funcţie de zonă. Astfel, concentraţiile plumbului în sol s-au situat între 5.62 mg/kg

şi 23.74 mg/kg. În funcţie de zona de prelevare, cele mai mici concentraţii de

plumb în sol au fost observate în judeţul Neamţ în localitatea Timişeşti (6.08 ±

0.18 mg/kg), Români (6.9 ± 0.73 mg/kg), Bălţăteşti (7.35 ± 1.51 mg/kg), Costişa

(7.41 ± 0.89 mg/kg), Răuceşti (7.47 ± 1.5 mg/kg), iar cele mai mari în judeţul Iaşi la Moţca (19.94 ± 1.13 mg/kg), în judeţul Bacău la Buhuşi (20.68 ± 1.73 mg/kg),

în judeţil Neamţ la Roznov (22.59 ± 0.55 mg/kg) şi Brusturi (23.14 ± 0.57 mg/kg).

În ceea ce priveşte cadmiul nivelurile în sol au variat între 0.59 mg/kg şi 1.71

mg/kg. Cele mai mici concentraţii medii observate în sol s-au întâlnit în cazul

28

judeţului Suceava la Boroaia (0.64 ± 0.06 mg/kg), în judeţul Bacău la Buhuşi (0.69

± 0.1 mg/kg), în judeţul Neamţ la Timişeşti (0.74 ± 0.04 mg/kg), Barticeşti (0.81 ±

0.04 mg/kg) şi la Bălţăteşti (0.86 ± 0.07 mg/kg). Cele mai ridicate niveluri de

cadmiu în soluri au fost observate în judeţul Iaşi la Moţca (1.35 ± 0.1 mg/kg),

judeţul Bacău la Balcani (1.3 ± 0.05 mg/kg) şi în judeţul Neamţ la Brusturi (1.29 ±

0.02 mg/kg) şi Roznov (1.64 ± 0.06 mg/kg).

Cele mai frecvente concentraţii de plumb în sol au fost cele cuprinse în

intervalul 7 mg/kg şi 11 mg/kg.

Concentraţiile cadmiului în sol au avut o distribuţie aproximativ gaussiană (fig.

5.5) deviată uşor spre dreapta. Cele mai frecvente niveluri de cadmiu în sol au fost

cele cuprinse între 0.9 mg/kg şi 1.2 mg/kg. Concentraţiile de plumb în boabele de porumb s-au situat între 0.074 mg/kg şi

0.546 mg/kg. Cele mai mici concentraţii medii au fost observate în judeţul Neamţ

în localităţile Răuceşti (0.085 ± 0.009 mg/kg), Timişeşti (0.087 ± 0.001 mg/kg),

Drăgăneşti (0.095 ± 0.02 mg/kg) şi Costişa (0.109 ± 0.004 mg/kg), iar cele mai

mari în judeţul Bacău la Balcani (0.436 ± 0.009 mg/kg), Buhuşi (0.48 ± 0.025

mg/kg), în judeţul Neamţ la Brusturi (0.479 ± 0.03 mg/kg) şi în judeţul Iaşi la

Moţca (0.488 ± 0.07 mg/kg). Pentru cadmiu, valorile s-au situat între 0.056 mg/kg

şi 0.131 mg/kg. Cele mai mici concentraţii în boabele de porumb au fost observate

în judeţul Suceava la Boroaia (0.06 ± 0.004 mg/kg), în judeţul Bacău la Buhuşi

(0.07 ± 0.001 mg/kg) şi ăn judeţul Neamţ la Timişeşti (0.064 ± 0.006 mg/kg),

Bălţăteşti (0.07 ± 0.001 mg/kg) şi la Şoimăreşti (0.07 ± 0.001 mg/kg). În urma determinărilor efectuate de noi au fost obţinute corelaţii puternic directe între

concentraţiile de cadmiu în sol şi în porumb (coeficientul de corelaţie Pearson, r=

0.9102) şi pentru plumb (r= 0.9191). De asemenea coeficienţii de regresie (r2) au

fost 0.844 (fig. 5.2) în cazul plumbului şi 0.828 pentru cadmiu (fig. 5.1).

Distribuţia concentraţiilor de cadmiu în boabele de porumb a fost de asemenea de

tip gaussian (fig. 5.6), frecvenţa cea mai mare întâlnindu-se în intervalul 0.07

mg/kg şi 0.12 mg/kg. În cazul plumbului, frecvenţa cea mai mare au avut-o probele

a căror concentraţii au fost cuprinse între 0.1 mg/kg şi 0.25 mg/kg (fig. 5.4).

29

CAPITOL VI . EVALUAREA TOXICITAŢII CUMULATIVE A

CADMIULUI ŞI PLUMBULUI LA ŞOBOLANI

VI.2. Material şi metode

Au fost utilizaţi 36 de şobolani masculi rasa Wistar cu masa corporalǎ

iniţialǎ cuprinsǎ între 250 şi 400 g (Institutul Cantacuzino Bucureşti). Înainte de

inceperea experimentului, şobolanii au fost aclimatizaţi timp de 10 zile. În timpul

aclimatizării şi al perioadei experimentale şobolanii au primit hrană standard şi

apă, ad libitum. Condiţiile ambientale au fost relativ constante, temperatura fiind de 18-25º C. După aclimatizare şobolanii au fost alocaţi aleatoriu în unul dintre

cele 6 loturi (n=6), au fost cântǎriţi şi marcaţi. Toate datele legate de marcaje şi

greutatea (masa) fiecǎrui animal au fost consemnate, pe întreg parcursul

experimentului.

Plumbul (Pb+2), cadmiul (Cd+2) şi seleniul (Se+4) au fost administrate prin

intermediul apei de bǎut, sub formǎ de acetat de plumb trihidrat (Chemical

Company - România, p.a.), clorurǎ de cadmiu hemipentahidrat (Chemical

Company - România, p.a.), selenit de sodiu (Sigma Aldrich, p.a.). Sǎrurile au fost

dizolvate în apǎ distilatǎ, apa de bǎut din dozatoare fiind schimbatǎ zilnic. Volumul

de apǎ consumat de şobolanii corespunzând fiecǎrui lot în decurs de 24 de ore a

fost măsurat şi notat în vederea calculării conţinutului de metal ingerat.

Experimentul s-a desfǎşurat pe parcursul a 56 de zile, animalele fiind cântǎrite la intervale de 7 zile. Aportul zilnic aproximativ (raportat la kg corp)

pentru fiecare element (Pb, Cd, Se) a fost calculat pe baza volumului de apǎ

consumat în decurs de 24 de ore de fiecare lot de şobolani, a masei totale a

şobolanilor dintr-un lot şi a concentraţiilor elementelor de interes din apa de bǎut.

Loturile de studiu şi concentraţiile elementelor de interes în apa de bǎut au

fost:

30

- Control (Apă distilată);

- Se (Se+4

- 0,2 mg/l);

- Cd (Cd+2 - 150 mg/l);

- Pb (Pb+2 - 300 mg/l);

- Cd+Pb (Cd+2 - 150 mg/l + Pb+2 - 300 mg/l);

- Cd+Pb+Se (Cd+2 - 150 mg/l + Pb+2 - 300 mg/l + Se+4 - 0,2 mg/l).

Animalele au fost sacrificate dupǎ 56 de zile. Pentru anestezie, şobolanii au

fost injectaţi i.p cu ketaminǎ, în dozǎ de 100 mg/kg corp (Ketamine 10 %, sol. inj.

uz veterinar – Kepro V.B., Olanda). Sângele a fost recoltat în vacutainere (pentru

biochimie şi pentru hematologie) prin puncţie cardiacǎ, în vederea determinǎrii

parametrilor biochimici şi hematologici. Pentru obţinerea serului, sângele din vacutainerele pentru biochimie a fost

centrifugat dupǎ coagulare timp de cinci minute la 3500 rotaţii/minut. Serul obţinut

a fost transferat în tuburi tip Eppendorf, tuburile fiind menţinute la -33ᵒ C pânǎ în

momentul determinǎrii parametrilor biochimici. Valorile obţinute au fost prelucrate

statistic utilizând Microsoft Excel 2007 şi OriginPro 8.5.1. Valorile au fost

exprimate ca media ± eroarea standard a mediei.

VI.3. Rezultate

În funcţie de volumul de apă consumat a fost calculat aportul mediu de

elemente pe parcursul celor 56 de zile raportat la kg corp (tabel 6.I). Au fost evaluate efectele cadmiului, plumbului, cadmiu + plumb şi cadmiu + plumb +

seleniu asupra unor parametri hematologici şi biochimici.

Tabel 6.I

Aportul mediu de elemente pe parcursul celor 56 de zile raportat la kg corp (media

± SEM)

Lotul Cd (mg/ kg corp ± SEM*)

Pb (mg/ kg corp ± SEM*)

Se (mg/ kg corp ± SEM*)

Control

Se+4 15.48 ± 0.42

Cd+2 10.48 ± 0.41

Pb+2 25.34 ± 0.68

Cd+2+ Pb+2 8.80 ± 0.35 17.60 ± 0.70

Cd+2+Pb+2+Se+4 7.28 ± 0.24 14.56 ± 0.48 9.71 ± 0.32

SEM – Eroarea standard a mediei

31

Control Se Cd Pb Cd + Pb Cd + Pb + Se

0.0

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

5.0

5.2

5.4

5.6

WB

C (

* 1

0³/

µL)

Control Se Cd Pb Cd + Pb Cd + Pb + Se

0.0

8

8.1

8.2

8.3

8.4

8.5

8.6

8.7

8.8

8.9

9

9.1

9.2

9.3

9.4

RB

C (

*10

6/µ

L)

Fig 6.3 Numarul leucocitelor

Fig 6.4 Numărul eritrocitelor

Control Se Cd Pb Cd + Pb Cd + Pb + Se

0.0

13.2

13.5

13.8

14.1

14.4

14.7

15.0

15.3

15.6

15.9

16.2

Hg

b

(g/d

L)

Control Se Cd Pb Cd + Pb Cd + Pb + Se

0.0

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

125

130

135

ALT

(U

I/L)

Fig. 6.5 Concentraţia hemoglobinei

Fig. 6.10 Alanin aminotransferaza

32

Control Se Cd Pb Cd + Pb Cd + Pb + Se

0.0

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

AS

T (

UI/

L)

Control Se Cd Pb Cd + Pb Cd + Pb + Se

0.00

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

Bilirubin

a T

ota

la (

mm

ol/L)

Fig. 6.11 Aspartataminotransferaza

Fig. 6.12 Bilirubina totală

Control Se Cd Pb Cd + Pb Cd + Pb + Se

0.000

0.03

0.04

0.05

0.06

Bilirubin

a d

irecta

(m

g/d

L)

Fig. 6.13 Bilirubina directă

33

Fig. 6.31 Lotul Cd – Cord. Zone distrofice

(săgeată îngroşată), miocite fragmantate,

intens acidofile, hemoragii (săgeată

subţire). Col HE x200

Fig. 6.38 Lotul Cd –Rinichi.

Modificări degenerative ale

nefrocitelor, tubi uriniferi chistici cu

celule necrozate în lumen (săgeată subţire), zone de necroză (săgeată

îngroşată). Col HE x100

Fig. 6.43 Lotul Pb – Ficat cu mici vacuole

de lipide intracitoplasmatic (săgeată

subţire). Col HE x400

Fig. 6.47 Lotul Pb – Rinichi.

Hemoragii in zona corticală (săgeţi),

tubi uriniferi contorţi proximali cu

epiteliu lipsit de marginea în perie.

Col HE x100

34

Fig. 6.58 Lotul Cd + Pb – Ficat, degenerare hidropică pronunţată

(săgeată subţire). Hepatocite cu nuclei

picnotici (săgeată îngroşată). Col HE

x200

Fig. 6.60 Lotul Cd + Pb –Rinichi, celule intens acidofile cu nuclei picnotici

(săgeată subţire) ce alterneză cu epiteliu

degenerat al tubilor contorţi proximali

(săgeată îngroşată). Col HE x200

Fig. 6.64 Lotul Cd + Pb + Se – Ficat,

venula centrolobulară uşor ectaziată

(săgeată), cordoane de hepatocite

dispuse radiar ce prezintă semne de

degenerare hidropică medie. Col HE

x100

Fig. 6.63 Lotul Cd + Pb + Se – Rinichi,

nefrocite acidofile care alternează cu

unele ce prezintă degenerare hidropică

dar şi celule implicate în regenerare cu

nuclei bogaţi în cromatina dispersată.

Col HE x200

35

VI.4. Discuţii

Scăderea numărului leucocitelor este direct legată fie de reducerea

producţiei lor în centrul germinativ la nivelul organelor limfoide sau de liza

crescută a acestora în contexul prezenţei plumbului în organism (Suradkar et al.,

2009). De asemenea se poate observa că numărul globulelor albe a scăzut

semnificativ la loturile ce au primit seleniu si respectiv cadmiu, aceste rezultate

fiind susţinute şi de alţi cercetători (ATSDR, 2008). Şobolanii din lotul ce au

primit cadmiu şi plumb nu prezintă nici o diferenţă comparativ cu şobolanii din

lotul martor, pe când în cazul celor din lotul ce au primit Cd + Pb + Se, numărul

leucocitelor este mai mic (fig. 6.3). În urma studiului efectuat de noi nu se observă diferenţe semnificative între

loturile cu Pb sau Cd şi lotul martor, în schimb în cazul şobolanilor cărora li s-a

administrat Cd + Pb numărul globulelor roşii este uşor mai scăzut decât in cazul

celor care au primit doar apă distilată. De asemenea, la şobolanii care au primit Se

+ Cd + Pb numărul eritrocitelor este mai ridicat decât la şobolanii care au primit

numai Cd + Pb (fig. 6.4). Rezultatele indică faptul că seleniul are un efect

antagonist în ceea ce priveşte toxicitatea cumulativă a plumbului şi a cadmiului.

Aceste modificări pot fi datorate unei perioade scurte a timpului de expunere (56

de zile) sau unei doze de cadmiu/plumb prea mică folosită în experiment.

Metalele toxice interferă cu acţiunea compuşilor esenţiali, aşadar creşterea

disponibilităţii micronutrienţilor esenţiali pot reduce toxicitatea acestor metalelor toxice. De asemenea, micronutrienţii pot îmbunătăţi răspunsul organismului expus

la cadmiu şi plumb, prin modificarea metabolismului lor (Peranza et al., 1998).

Referitor la concentraţia hemoglobinei (fig. 6.5) în sânge se pot observa

aceleaşi modificări ca în cazul eritrocitelor. Şobolanii ce au primit cadmiu sau

plumb nu prezintă diferenţe semnificative ale hemoglobinei faţă de cei care au

primit apă distilată (lotul martor), în schimb lotul cu Pb + Cd a înregistrat o usoară

scădere. Din nou, la şobolanii cărora li s-a administrat Cd + Pb + Se valoarea

hemoglobinei este crescută atât faţă de cei din lotul martor cât şi din lotul tratat cu

Pb + Cd. Este dovedit faptul că seleniul are un posibil efect protector asupra

inhibării de către plumb a succin dehidrogenazei şi acetilcolinesterazei la şobolan

(Nehru et al., 1994).

Pentru evaluarea integrităţii celulelor hepatice prin măsurarea indirectă a permeabilităţii membranei hepatocitare au fost determinate activităţile enzimatice

ale alaninaminotransferazei (ALT) (fig. 6.10) , aspartataminotransferazei (AST)

(fig. 6.11), lactat-dehidrogenazei (LDH), fosfatazei alcaline.

Pentru investigarea activităţii hepatice au fost determinate nivelurile serice

ale bilirubinei totale, bilirubinei directe, colesterolului total, trigliceridelor,

proteinelor serice totale şi albuminei. Aceste rezultate pentru evaluarea funcţiei

36

hepatice (AST, ALT, bilirubină) demonstrează deteriorarea celulelor hepatice în

cazul şobolanilor expuşi unei surse de cadmiu, plumb sau cadmiu + plumb. Aceste

rezultate sunt în concordanţă cu cele obţinute de Shalan et al. (2005).

Se poate observa o creştere a valorilor transaminazelor la şobolanii din

toate loturile (Se, Cd, Pb Cd + Pb, Cd + Pb + Se) comparativ cu lotul martor (fig.

6.10, fig. 6.11). Cea mai mare creştere s-a înregistrat în cazul sobolanilor din lotul

ce au primit cadmiu şi cadmiu + plumb.

Activităţile crescute ale aspartataminotransferazei şi

alaninaminotransferazei probabil sunt datorate permeabilităţii crescute a

membranei microzomale a celulei hepatice precum şi de sinteza de radicali liberi

(Ibrahim et al., 2012). Creşterea valorii bilirubinei totale (fig. 6.12) după ingestia de cadmiu şi plumb se poate datora inducerii hem oxigenazei.

Catabolismul hemului din diverse hemoproteine este realizat la nivelul

fracţiunilor microzomale ale celulelor de către un sistem enzimatic complex, iar

hem oxigenaza este enzima cheie ce converteşte hemul la bilirubină (Seddik et al.,

2010). Aceştia au raportat că bilirubina formată la nivelul diferitor ţesuturi este

transportată până la ficat sub forma unui complex.

În mod normal bilirubina este conjugată cu un compus al acidului

glucuronic la nivelul reticolului endoplasmatic neted din ficat, dar în cazul

intoxicaţiei cu plumb sau cadmiu această conjugare este inactivată. Acest lucru

poate fi datorat peroxidării lipidelor din membrana reticolului endoplasmatic neted.

Bilirubina exercită un efect protector împotriva leziunilor provocate membranei celulare de către stresul oxidativ în urma expunerii la diferite metale toxice

(Noriega et al., 2003).

Cordul prezintă modificari caracterizate prin necroză focală şi acidofilia

sau hipereozinofilia unor fibre, dispariţia striaţiunilor acestora cu nuclei picnotici

precum şi numeroase zone hemoragice la nivelul miocardului (fig. 6.31). Figura

6.38 prezintă modificările degenerative ale ţesutului renal în cazul şobolanilor

expuşi la cadmiu. Figura 6.43 evidenţiază un halou perinuclear.

În ţesutul renal (fig. 6.47) se pot observa corpusculi Malpighi măriţi în

volum iar în tubii uriniferi apar nefrocite vacuolizate desprinse de membrana

bazală. În ţesutul hepatic (fig. 6.58) sunt evidenţiate hepatocitele normale care

alternează cu hepatocitele degenerate hidropic. În figura 6.60 sunt prezentaţi tubii

uriniferi care au un lumen mare, larg, ce alternează cu grupuri de celule ce au reacţie PAS pozitivă intensă. Ţesutul hepatic din figura 6.61 prezintă mici zone de

necroză. În figura 6.63 sunt prezentate celule acidofile, altele dgenerate desprinse

de membrana bazala situate în lumenul tubilor uriniferi şi nefrocitele modificate

implicate in procese de regenerare. Ţesutul hepatic din figura 6.64 prezintă

hepatocite normale care alternează cu hepatocite cu semne de degenerare

hidropica.

37

CAPITOL VII. CORELAŢII ÎNTRE APORTUL ALIMENTAR DE CADMIU

ŞI PLUMB ŞI NIVELUL ACESTORA ÎN LICHIDE BIOLOGICE (SÂNGE)

LA ŞOBOLANI

VII.2. Material şi metode

În cadrul studiului efectuat de noi, au fost utilizaţi 24 de şobolani masculi rasa Wistar cu masa corporalǎ iniţialǎ cuprinsǎ între 300 şi 450 g (Institutul

Cantacuzino Bucureşti). Pe parcursul aclimatizării precum şi al perioadei

experimentale, şobolanii au primit hrană standard (Institutul Cantacuzino

Bucureşti) şi apă, ad libitum. După aclimatizare şobolanii au fost alocaţi aleatoriu

în unul dintre cele 4 loturi (n=6), au fost cântǎriţi şi marcaţi. Toate datele legate de

marcaje şi greutatea (masa) fiecǎrui animal au fost consemnate, pe întreg parcursul

experimentului.

Plumbul (Pb+2) şi cadmiul (Cd+2) au fost administrate prin gavaj, sub formǎ

de acetat de plumb trihidrat şi clorurǎ de cadmiu hemipentahidrat. Sǎrurile au fost

dizolvate în apǎ distilatǎ şi administrate zilnic.

Experimentul s-a desfǎşurat pe parcursul a 14 de zile, animalele fiind cântǎrite zilnic.

Loturile de studiu şi concentraţiile elementelor de interes au fost:

- Control (Apă distilată);

- Cd (Cd+2 - 30 mg/l);

- Pb (Pb+2 - 100 mg/l);

- Cd+Pb (Cd+2

- 30 mg/l + Pb+2

- 100 mg/l);

Animalele au fost sacrificate dupǎ 14 de zile. Pentru anestezie, şobolanii au

fost injectaţi i.p cu ketaminǎ, în dozǎ de 100 mg/kg. Sângele a fost recoltat în

vacutainere (pentru biochimie) prin puncţie cardiacǎ, în vederea determinǎrii

parametrilor biochimici.

Pentru obţinerea serului, sângele din vacutainerele pentru biochimie a fost

centrifugat dupǎ coagulare timp de cinci minute la 3500 rotaţii/minut. Parametrii biochimici au fost determinaţi utilizând analizoarele automate de biochimie RX

Imola® şi Accent 200.

După sacrificarea animalelor, au fost prelevate probe de ficat, rinichi,

inimă, testicul, creier şi glandă suprarenală. Secţiunile de aproximativ 5 µm

grosime au fost colorate cu hematoxilină şi eozină Harris (H&E) în vederea

efectuării studiul histologic.

38

Concentraţiile sanvine de cadmiu şi plumb au fost determinate prin

spectrometrie de absorbţie atomică cu atomizare electrotermică (Avanta GBC,

Australia). Digestia umedă s-a realizat cu ajutorul unui sistem de digestie cu

microunde.

Valorile au fost exprimate ca media ± eroarea standard a mediei. Analiza

variaţiei seriilor de date a fost realizată folosind testul t-student.

VII.3. Rezultate

Fig. 7.1. Concentraţia cadmiului în sânge

(µg/L). Diferenţe statistic semnificative: * = p < 0.05 faţă de lotul control; □ = p <

0.005 faţă de lotul Cd; ∆ = p < 0.005 faţă de lotul Pb

Fig. 7.2. Concentraţia plumbului în sânge

(µg/L) Diferenţe statistic semnificative: * = p < 0.05 faţă de lotul control; □ = p < 0.05 faţă de lotul

Cd; o = p < 0.05 faţă de lotul Pb

39

Fig. 7.8. Proteine totale (mg/dL).

Diferenţe statistic semnificative: * = p

< 0.05 faţă de lotul control;

Fig. 7.11. Alanin aminotransferaza

(UI/L). Diferenţe statistic semnificative:

* = p < 0.05 faţă de lotul control

Fig. 7.12. Aspartataminotransferaza

(UI/L). Diferenţe statistic semnificative:

* = p < 0.05 faţă de lotul control;

Fig. 7.14. Fosfataza alcalină (UI/L).

Diferenţe statistic semnificative: * = p

< 0.05 faţă de lotul control; ∆ = p <

0.05 faţă de lotul Pb

40

Fig. 7.20. Grup experimental cadmiu:

rinichi. E – înlocuirea focală a parenchimului renal

cu mononucleare. Col HE x400

Fig. 7.20. Grup experimental cadmiu: rinichi.

F -Dilatarea chistică a unor tubi renali cu epiteliul renal necrozat în lumenul

tubilor (săgeată). Col HE x200

Fig. 7.21. Grup experimental plumb: rinichi

A - Cariomegalie şi citomegalie în unele celule ale epiteliului renal (săgeată) Col HE

x400.

Fig. 7.25. Grup experimental plumb + cadmiu: rinichi

A, B - capilare ectaziate (săgeată subţire), tubi contorţi proximali cu nefrocite

modificate, intens acidofile desprinse de membrana bazală (săgeată îngroşată), se pot

revedea in lumen. Col HE x200.

41

VII.4. Discuţii

Concentraţia sanvină de cadmiu obţinută de noi în cazul lotului căruia i s-

a administrat clorură de cadmiu a fost semnificativ mai mare decât în cazul lotului

martor (p < 0.05) sau a lotului ce a primit cadmiu + plumb (p < 0.005) . În ceea ce

priveşte şobolanii ce au primit clorură de cadmiu + acetat de plumb, aceştia au

prezentat de asemenea niveluri de cadmiu semificativ mai mari (p < 0.005) decât

cei care din lotul cărora li s-a administrat doar plumb. La animalele cărora le-a fost

administrat doar acetat de plumb au fost observate concentraţii sangvine de plumb

semnificativ mai mari (p < 0.05) decât la şobolanii din loturile martor, cadmiu şi

cadmiu + plumb. De asemenea, loturile control şi cadmiu au prezentat niveluri de plumb în sânge semnificativ mai mici decât şobolanii cărora li s-a administrat

acetat de plumb + clorură de cadmiu.

În studiul de faţă, a fost monitorizată funcţia hepatică întrucât ficatul joacă

un rol important în detoxifierea organismului şi protejarea acestuia faţă de acţiunea

nocivă a unor xenobiotice, printre care plumbul şi cadmiul (Bishayee et al., 1997).

În cazul activităţilor unor enzime serice (aspartataminotransferaza,

alaninaminotransferaza şi fosfataza alcalină) (fig. 7.11, 7.12 şi fig. 7.14) au fost

înregistrate modificări la şobolanii expuşi la aceste metale toxice. Astfel,

activitatea aspartataminotransferazei a crescut în mod semnificativ (p < 0.05) în

cazul şobolanilor din loturile cadmiu, plumb, plumb + cadmiu faţă de animalele

care au primit doar apă distilată. La fel, activitatea alaninaminotransferazei a crescut semnificativ (p < 0.05) în cazul şobolanilor din loturile tratate cu plumb şi

cadmiu, respectiv cadmiu faţă de lotul martor, iar la lotul căruia i-a fost administrat

doar acetat de plumb, valorile alaninaminotransferazei au scăzut uşor. Activitatea

fosfatazei alcaline a înregistrat o scădere semnificativă (p < 0.05) la şobolanii

trataţi cu plumb + cadmiu, respectiv cadmiu faţă de lotul martor. În grupul de

şobolani care au primit acetat de plumb, creşterea activităţii

aspartataminotransferazei poate fi atribuită efectului toxic al plumbului asupra

celulelor hepatice (ATSDR, 2007).

Conform rezultatelor obţinute de noi, nivelul seric al proteinelor totale a

scăzut la loturile care au primit plumb, respectiv cadmiu + plumb comparativ cu

lotul martor, şi este semnificativ mai mic în cazul şobolanilor din lotul tratat cu

cadmiu. Aceste rezultate sunt susţinute şi de studiile histopatologice ale ficatului. Ficatul are un rol esenţial în sinteza proteinelor plasmatice. De asemenea, celulele

Kupffer de la nivelul ţesutului hepatic sunt cunoscute pentru antigenitatea lor

întrucât acestea sunt implicate în procesul de fagocitoză.

La nivel macroscopic se observă mărirea în volum a rinichilor. Din punct

de vedere microscopic, s-a observat congestie şi înlocuirea focală a parenchimului

renal cu mononucleare (fig. 7.20 E). Balonizarea şi vacuolizarea epiteliului renalau

42

fost observate la nivelul tubilor contorţi şi dilatarea chistică a tubilor renali distali

şi colectori (fig. 7.20 F).

Examinarea histopatologică a rinichilor şobolanilor din grupul tratat cu

plumb a evidenţiat celulele epiteliale ale tubilor renali ce au prezentat cariomegalie

şi citomegalie (fig. 7.21 A).

43

CAPITOLUL VIII. CONCLUZII GENERALE În partea generală a lucrării a fost prezentată problematica prezenţei

metalelor toxice în alimente. S-au prezentat aspectele legale şi actele normative

eliberate de autorităţile europene care reglementează prezenţa acestor xenobiotice

în produsele alimentare.

De asemenea, sunt menţionate date din literatura de specialitate cu privire la

gradul de poluare al alimentelor cu plumb şi cu cadmiu precum şi principalele

metode analitice utilizate pentru determinarea celor două metale din alimente.

Datele prezentate au fost furnizate de publicaţiile cercetătorilor la nivel mondial

din domeniul securităţii alimentare şi nu numai. Au fost prezentate informaţii

referitoare la estimarea aportului alimentar de cadmiu şi plumb, date furnizate de organisme internaţionale cum sunt Organizaţia Mondială a Sănătăţii (WHO) şi

Autoritatea Europeană pentru Siguranţa Alimentară (EFSA).

În cadrul părţii personale am dezvoltat şi am validat o metodă

spectrometrică de absorbţie atomică cu atomizare electrotermică. Metoda utilizează

pentru atomizarea probei un cuptor de grafit încălzit electric. De asemenea, am

evaluat unii parametri de performanţă pentru o metodă spectrometrică de absorbţie

atomică cu atomizare în flacără cu scopul de a determina concentraţiile de cadmiu

şi plumb din alimente. Rezultatele obţinute de noi atestă faptul că pot fi utilizate cu

succes în determinarea concentraţiilor cadmiului şi plumbului din produse

alimentare.

Concentraţiile de cadmiu şi plumb determinate în produsele alimentare din România au prezentat valori mai ridicate decât cele din Franţa, probabil din cauza

solurilor, a apei de pe teritoriul ţării noastre care pot fi mai intens poluată cu aceste

metale toxice. Cu toate acestea, în produsele alimentare analizate nu au fost

înregistrate concentraţii de plumb sau cadmiu care să depăşească limitele maxime

admise impuse de autorităţile europene.

De asemenea, rezultatele obţinute de noi indică faptul că nu există nici un

motiv de îngrijorare cu privire la aportul alimentar a celor două metale toxice de

către populaţiile din Franţa şi din România. Cu toate acestea, se pare că trebuie

acordată o atenţie deosebită expunerii la plumb prin aport alimentar în cazul

adulţilor din România, deoarece acesta a fost foarte aproape de limita de referinţă

pentru prevenirea afecţiunilor nefrologice la adulţi.

Capitolul V prezintă concentraţiile de cadmiu şi plumb în sol şi nivelul acestora în plantele de cultură (porumb). Valorile au variat considerabil atât în

cazul solurilor cât şi în cazul porumbului în funcţie de zonă. De asemenea a fost

observată o corelaţie puternic directă între nivelurile de cadmiu şi plumb din sol şi

concentraţiile acestora în plantele de cultură (porumb).

Ultimele două capitole ale lucrării prezintă informaţii cu privire la

toxicitatea cumulativă a cadmiului şi plumbului precum şi efectul protector al

44

seleniului în intoxicaţia subacută cu plumb şi cadmiu. Rezultatele obţinute în urma

determinării unor parametri biochimici dar şi a examenului histopatologic au arătat

ca expunerea concomitentă la cadmiu şi plumb are un efect negativ mai pronunţat

asupra organismului şobolanilor, iar co-administrarea de seleniu poate reduce din

efectele nocive ale celor două metale toxice. În concluzie, rezultatele obţinute în cazul cercetărilor realizate confirmă

că metodele SAAF şi SAAET adaptate, respectiv validate de noi pot fi utilizate cu

succes pentru determinarea metalelor toxice (plumb şi cadmiu) din diferite

categorii de produse alimentare. Evaluarea gradului de poluare a alimentelor, a

solului şi a plantelor de cultură cu plumb şi cadmiu oferă o imagine în ansamblu

cu privire la expunerea la aceşti toxici. În plus, modificările hematologice, biochimice şi histopatologice observate în cadrul experimentelor pe şobolani

subliniază faptul că plumbul şi cadmiul reprezintă un pericol pentru sănătatea

umană.

45

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Alquezar R, Markich SJ, Booth DJ. Metal accumulation in the smooth toadfish, Tetractenos

glaber, in estuaries around Sydney, Australia. Environ Pollut 2006; 142 :123–131. ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry). Toxicological profile for

cadmium. Atlanta: Agency for Toxic Substances and Disease Registry, 2008. ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry). Toxicological profile for

lead. Atlanta: Agency for Toxic Substances and Disease Registry, 2007. Bakirdere S, Yaman M. Determination of lead, cadmium and copper in roadside soil and

plants in Elazig, Turkey. Environ Monit Assess 2008; 136(1-3): 401-410. Bishayee A, Banik S, Marimuthu P et al. Vanadium mediated suppression of diethylnit-

rosamine- induced chromosomal aberrations in rat hepatocytes and its correlation with induction of hepatic glutathione S- transferase. Int J Oncol 1997; 10: 413- 423.

Bloom PR. Soil pH and the pH buffering. In: M.Sumner (ed.) Handbook of soil science, Boca Raton, CRC Press 2000, B333-B352.

Brzoska MM, Kaminski M, Supernak-Bobko D et al. Changes in the structure and function of rats chronically exposed to cadmium. I. Biochemical and histopathological studies. Arch Toxicol 2003; 77(6): 344-352.

Caggiano R, Sabia S, D’Emilio M et al. Metal levels in fodder, milk, dairy products, and tissues sampled in ovine farms of Southern Italy. Environ Res 2005; 99(1):48-57.

Gollenberg AL, Hediger ML, Lee LA et al. Association between lead and cadmium and

reproductive hormones in peripubertal U.S. Girls. Environ Health Perspect 2010; 118(12):1782-1787.

Hashem MA, El-Sharkawy NI. Hemato-biochemical and immunotoxicological effects of low electromagnetic field and its interaction with lead acetate in mice. Iraqi J Vet Sci 2009; 23: 105-114.

Ibrahim NM, Eweis EA, el-Beltagi HS et al. Effect of lead acetate toxicity on experimental male albino rat. Asian Pac J Trop Biomed 2012; 2(1): 41-46.

Johansen P, Pars T, Bjerregaard P. Lead, cadmium, mercury and selenium intake by

Greenlanders from local marine food. Sci Total Environ 2000; 245 (1–3): 187–194. Khansari FE, Khansari, MG, Abdollahi M. Heavy metals content of canned tuna fish. Food

Chem 2005; 93: 293-296. Krejpcio Z, Olejnik D, Wojciak RW et al. Lead and cadmium content in daily food rations

of children and adolescents from Koper basin of Legnica region. Rocz Panstw Zakl Hig 1999; 50(4): 353–360.

Leblanc JC, Guerin T, Noel L. Dietary exposure estimates of 18 elements from the 1st French Total Diet Study. Food Addit Contam 2005b; 22: 624-641

Lopez Alonso M, Benedito JL, Miranda M et al. Contribution of cattle products to dietary

intake of trace and toxic elements in Galicia, Spain. Food Addit Contam 2002; 19(6): 533–541.

Nadal M, Ferre-Huguet N, Marti-Cid R et al. Exposure to metals through the consumption of fish and seafood by the population living near the Ebro river in Catalonia, Spain: health risks. Hum Ecol Risk Assess 2008; 14: 780 – 795.

Nehru B, IyerA. Effect of selenium on lead-induced neurotoxicity in different brain regions of adult rats. J Environ Pathol Toxicol Oncol 1994; 13(4): 265-268.

46

Noriega GO, Tomaro ML, del Batlle AM. Bilirubin is highly effective in preventing in vivo

delta-aminolevulinic acid-induced oxidative cell damage. Biochim Biophys Acta 2003; 1638(2): 173 – 178

Pansu M, Gautheyrou J. Handbook of Soil Analysis. Mineralogical, Organic and Inorganic Methods. Berlin, Heidelberg, Netherlands: Springer-Verlag.

Peraza MA, Ayala-Fierro F, Barber DS et al. Effects of micronutrients on metal toxicity. Environ Health Perspect 1998; 106: 203-216.

Regulamentul nr. 1881/2006 al comisiei din 19.12.2006 de stabilire a nivelurilor maxime pentru anumiţi contaminanţi din produsele alimentare. Jurnalul Oficial al Uniunii

Europene, L 364, 20.12.2006, 5-32. Regulamentul nr. 78/ 2005 al comisiei din 19.01.2005 de modificare a Regulamentului (CE)

nr. 466/2001 în ceea ce priveşte metalele grele. Jurnalul Oficial al Uniunii Europene, L 16/43, 20.01.2005.

SACN (Scientific Advisory Committee on Nutrition) 2011. Dietary reference values for energy. Londra, 2012. http://www.sacn.gov.uk/pdfs/sacn_dietary_reference_values_for_energy.pdf

Seddik L, Bah TM, Aoues A et al. Dried leaf extract protects against lead-induced neurotoxicity in wistar rats. Eur J Sci Res 2010; 42(1): 139-151.

Shalan MA, Mostafa MS, Hassouna MM et al. Amelioration of lead toxicity on rat liver with vitamin C and silymarin supplements. Toxicol 2005; 206: 1-15.

Shirokova Y, Forkutsa I, Sharafutdinova N. Use of electrical conductivity instead of soluble salts for soil salinity monitoring in Central Asia. Irrigation and Drainage Systems 2000; 14:199-205.

Voegborlo RB, El-Methnani AM, Abedin MZ. Mercury, cadmium and lead content of canned tuna fish. Food Chem 1999; 67: 341–345.

Wasserman MAM. Soil-to-plant transfer of 137Cs related to its geochemical partitioning in

oxisols of tropical areas. In: Wasserman JC, Silva-Filho EV, Villas-Boas R (eds.). Environmental geochemistry in the tropics. Berlin: Springer, 1998, 17-28

Zheng N, Wang Q, Zhang X et al. Population health risk due to dietary intake of heavy metals in the industrial area of Huludao city, China. Sci Total Environ 2007; 387(1-3): 96-104.

Zukowska J, Biziuk M. Methodological evaluation of method for dietary heavymetal intake. J Food Sci 2008; 73(2): 21-29.

47

LISTA LUCRĂRILOR ŞTIINŢIFICE PUBLICATE ÎN TIMPUL

STAGIULUI DOCTORAL

Articole publicate in extenso din tema tezei de doctorat:

1. Ciobanu C, Şlencu BG, Cuciureanu R. Estimation of dietary intake

of cadmium and lead through food consumption. Rev Med Chir Soc

Med Nat Iaşi 2012; 116(2): 617-623.(BDI, B+)

2. Ciobanu C, Şlencu BG, Cuciureanu R. FAAS determination of cadmium and lead content in foodstuffs from northeastern

romanian market. Studia Universitatis Vasile Goldis Seria Stiinţele

Vieţii (Life Sciences Series) 2013; 23(1): 33-38. (BDI, B+)

3. Ciobanu C, Şlencu BG, Ciobanu S, Cuciureanu R. Cadmium and

lead content in some foodstuffs from romanian market. Lucrări

ştiinţifice, Seria Medicină Veterinară 2013; 56: 207-214. (BDI, B+)

Alte articole publicate in extenso:

1. Şlencu BG, Solcan C, Ciobanu C, Avasilcǎi L, Cuciureanu R.

Dose-dependent subacute toxicity of sodium selenite in male

Wistar rats. Jokull 2013; 63(7):57-69. (ISI)

2. Şlencu BG, Ciobanu C, Cuciureanu R. Selenium content in

foodstuffs and its nutritional requirement for humans. Clujul

Medical 2012; 85(2):139-145. (BDI, B+)

3. Şlencu BG, Ciobanu C, Solcan C, Anton A, Ciobanu S,

Solcan G, Cuciureanu R. Effect of selenium supplementation

on serum iron, calcium and magnesium levels in rats exposed

to cadmium or lead. Lucrǎri Ştiinţifice - Seria Medicinǎ

Veterinarǎ 2013; 56:200-206. (BDI, B+)

4. Corciovă A, Vlase L, Ciobanu C, Turnea M. Development and

validation of an HPLC-DAD method for determination of

diosmin and hesperidin. Buletinul Institutului Politehnic din

Iaşi Universitatea „Gh. Asachi” – secţia Chimie şi Inginerie

chimică 2012; LVIII (LXII) (1):177-185. (BDI, B+)

48

5. Avasilcǎi L, Şlencu BG, Ciobanu C, Cuciureanu R. Effects of

sodium selenite administration during diethylnitrosamine

intoxication in rats. Studia Universitatis "Vasile Goldis", Life

Sciences Series 2011; 21(2):275-280. (BDI, B+)

Comunicǎri poster la manifestǎri ştiinţifice internaţionale:

1. Ciobanu C, Cuciureanu R. Cadmium and lead levels in foodstuffs from some supermarkets in Iaşi, Romania. 15th Panhellenic

Pharmaceutical Congress; Atena, Grecia, 13-15 Mai 2011 – CD.

Comunicǎri poster la manifestǎri ştiinţifice naţionale :

1. Ciobanu C, Cuciureanu R. Determinarea conţinutului de Cd şi Pb din unele produse alimentare din zona Gura Humorului. În:

Hǎncianu M, editor. 50 de ani de învǎţǎmânt universitar

farmaceutic la Iaşi; Iaşi, 6-8 octombrie 2011. Iaşi: Ed. “Gr. T.

Popa” UMF Iaşi, 86-89 – ISBN 978-606-544-073-9. 2. Şlencu BG, Avasilcǎi L, Ciobanu C, Cuciureanu R. Dose- and

dosing regimen- dependent effect of sodium selenite administration

on some biochemical and haematological parameters in rats. Timmedica International Congress and Exhibition – 4

th edition;

Timişoara, Romănia, 16-18 iunie 2011 – CD – ISBN 978-606-

8054-45-2. 3. Şlencu BG, Solcan C, Avasilcǎi L, Ciobanu C, Cuciureanu R.

Cercetǎri privind toxicitatea selenitului de sodium la şobolani.

Actualitǎţi şi perspective în cercetarea farmaceuticǎ; Craiova, 26-

28 septembrie 2012. Craiova: Sitech, 88-89 - ISBN 978-606-11-2833-4.

4. Avasilcǎi L, Şlencu BG, Morariu ID, Ciobanu C, Dranca E,

Cuciureanu R. Effect of diethylnitrosamine and sodium selenite administration on some biochemical and haematological

parameters in rats. Timmedica International Congress and

Exhibition – 4th edition; Timişoara, 16-18 iunie 2011 – CD – ISBN

978-606-8054-45-2

49