ASPECTOS MOLECULARES Y CELULARES DE LA ACCIÓN DEL CALCIO EN LAS PLANTAS Laboratory of Plant Molecular Biology and physiology Department of Horticulture and Landscape Architecture, Washington State University, Pullman, WA 99164-6414 B.W. Poovaiah (HostScience, Vol. 23(2), Abril 1988) El calcio es conocido por ser un mensajero secundario en muchos de los procesos de desarrollo animal, pero es recientemente que se conoce la evidencia de que el calcio es un importante mensajero intracelular en las plantas (9, 15, 22, 32-35, 41). El nivel de concentración de calcio libre en el citoplasma es extremadamente bajo, y está influenciado por señales extracelulares como la luz, gravedad y las hormonas. Investigaciones de nuestro laboratorio indican que el calcio y su unión proteica, la calmodulina, juegan un importante papel en el acoplamiento estímulo-respuesta, regulando actividades enzimáticas, especialmente a través de la fosforilación proteica (33, 34, 48). Tanto en estudios de fosforilación proteica in vivo como in vitro, han revelado los cambios dependientes del Ca en varios tejidos vegetales (18, 37, 39, 49, 50). También se ha observado la influencia en varios procesos fisiológicos como la elongación celular, abscisión, senescencia y tuberización por alteración de los niveles de Ca intra y extracelulares (33). Otros ejemplos de procesos mediados por Ca en plantas son los siguientes: a) división celular, b) geotropismo, flujo protoplásmico, d) control estomatal, e) movimiento cloroplasto, f) secreción, g) cambios hormona-dependientes, h) activación enzimática y i) fosforilación proteica (9, 33). El calcio es esencial para mantener la integridad de las membranas y las paredes celulares (8, 11, 14, 20, 26). En plantas, la mayor porción del Ca está presente en el apoplasto, primeramente complejado con mezclas de paredes celulares y membranas plasmáticas (8, 11, 23-25, 30, 44). El efecto cimentante se debe primeramente a los pectatos de Ca de la lámina media. El Ca es esencial para mantener la estructura de la pared celular, especialmente en frutos y vegetales que son almacenados por períodos prolongados (30). Los tratamientos precosecha de Ca son efectivos para mejorar la calidad global y vencer los desórdenes fisiológicos como bitter-pit en manzanas, blossom-en-rot en tomates, tip-burn en lechuga, corazón hueco y centro marrón en patatas (23,

30). Sumergir o infiltrar en postcosecha, a vacío o presión con solución de Ca también es efectiva para mejorar la calidad de almacenamiento en manzanas (30, 31). CALCIO EXTRACELULAR Concentraciones de 1 a 5 mM Ca2+ son conocidas que existen en la región de la pared celular. Estas concentraciones son esenciales para proteger la membrana plasmática y para mantener la integridad estructural de la pared celular. Se conoce que el calcio retrasa la senescencia en manzanas, resultando una fruta más firme (17, 23, 30, 31). Durante la maduración y la senescencia ocurre la disolución de la lámina media, resultando una separación celular. Los frutos tratados con calcio, los cuales permanecen muy firmes durante el almacenaje, tienen una lámina media densamente manchada y la adhesión célula-célula incrementada. Para estudiar el efecto del calcio en la firmeza del fruto y en los cambios en la ultraestructura de la pared celular, se han realizado infiltraciones de Ca en postcosecha. El calcio protege la lámina media de la rotura normal asociada con la senescencia. Además de la firmeza de frutos, las manzanas tratadas con Ca poseen una menor permeabilidad de membrana y contienen más clorofila y ácido ascróbico que los frutos no tratados. La evolución en la respiración de CO2 y la producción de etileno, las cuales son normalmente altas en frutos senescentes, son menores en frutos tratados con calcio (17, 31). Estos resultados sugieren que algunos procesos bioquímicos relacionados con la senescencia en manzanas se retrasan por el calcio (21, 23, 30). Los mecanismos involucrados en estos cambios no se comprenden claramente. CALCIO INTRACELULAR El ion Calcio libre es considerado ahora como un regulador mayor de numerosos procesos biológicos y fisiológicos en las plantas (9, 22, 33, 41). En los 5 años pasados, se ha acumulado una larga lista de evidencias que nos permiten proponer una hipótesis de trabajo para el modo de acción del calcio. Estas etapas hipotéticas:

a) la concentración de Ca libre citoplasmático es <1µM y bajo control metabólico;

b) la concentración de Ca citoplasmático puede ser regulada por varias señales extra o intracelulares como son la luz, gravedad, y las hormonas;

c) el Ca citoplasmático esta unido a la calmodulina, activándola. En este estado de activación, los enzimas pueden unir el complejo calcio-calmodulina guiándolo a responder. Los compartimientos mayores de la célula donde los mayores niveles de calcio podrían ser almacenado incluye orgánulos tales como el retículo endoplasmático, mitocondria, cloroplastos y las vacuolas (Fig. 2).

La distribución intracelular del Ca juega un papel crítico en el funcionamiento celular. Cantidades excesivas de Ca2+ libre en el citoplasma son perjudiciales para la célula (9, 33). A niveles altos, el Ca2+ reacciona con fosfato inorgánico para formar un precipitado insoluble. Además, si las concentraciones de Ca2+ citosólico fueran permitidas para alcanzar los niveles milimolares presentes en la región de la pared celular, el metabolismo energético basado en el fosfato sería inhibido seriamente. Las plantas han desarrollado un mecanismo para eliminar el exceso de Calcio del citoplasma y mantener la concentración de Ca2+ libre en un rango submicromolar. Este mecanismo requiere un bombeo activo de Calcio fuera del citoplasma. En contraste con el nivel intracelular de calcio libre, el cual es submicromolar, la concentración del catión divalente, muy parecido al Mg2+, está en un rango milimolar. A pesar de esta alta concentración de Mg2+ en el citoplasma, los procesos celulares con frecuencia disparan una selectividad mayor por el calcio. Esto sugiere que el calcio actúa como un mensajero secundario en la respuesta de los tejidos vegetales a las señales externas (9, 15, 32-35, 41). Para comprender el papel preciso del Ca en estos procesos, uno debe ser capaz de medir exactamente los cambios de la concentración del calcio libre citoplasmático. El descubrimiento de los indicadores fluorescentes de calcio tales como quin-2 y fura-2, han hecho posible monitorizar las concentraciones de calcio libre (45, 47, 51). Estos materiales trabajan muy bien en células animales. Sin embargo, en células vegetales existen muchos obstáculos para conseguirlo antes que los cambios rápidos y transitorios en el Ca2+ libre sean determinados exactamente. Se conoce que un aumento de 10-veces en la concentración del mensajero (Ca) es necesaria para alterar el estado de una proteína control tal como la calmodulina.

CALMODULINA La calmodulina es una proteína calcio-modulada que ha sido aislada y caracterizada a partir de una gran variedad de tejidos animales y vegetales y está en cantidades ubicuas en eucariotas (1, 5). Las propiedades físicas y bioquímicas de las calmodulinas aisladas de una variedad de fuentes son similares. Esta similitud sugiere un papel fundamental para la calmodulina en los procesos de mediación del Ca-dependiente tanto en plantas como en células animales (1, 5, 9, 15, 22, 33, 35, 41). Hasta el descubrimiento de los enzimas dependientes de Ca y calmodulina (1, 15, 18, 19, 41, 48) existe un interés creciente en el estudio del papel del calcio como un mensajero celular en las plantas. Siempre que existe un incremento transitorio en la concentración de Ca2+ citoplasmático, el Ca2+ se une a la calmodulina, por tanto activándola. El complejo calcio-calmodulina después se une al enzima, por último dirigiéndolo a la respuesta (Fig. 3). FOSFORILACIÓN PROTEICA MEDIADA POR CALCIO En los últimos años, el mayor interés ha sido dirigido a la modificación post-traductora de las proteínas (46) por una fosforilación proteica regulada por calcio en plantas y animales (6, 37, 48-50). El papel de las proteínas kinasas en la fosforilación y las fosfatasas en la desfosforilación ha sido demostrado tanto en animales como en plantas (6, 33). La fosforilación proteica reversible ofrece una única ventaja en la regulación celular, ya que un enzima activado después de la fosforilación por una proteína kinasa puede ser inactivado como un resultado de la desfosforilación por una fosfatasa. Cuando la concentración de calcio intracelular aumenta en respuesta a estímulos externos, las proteínas kinasas dependientes de calcio y calmodulina son activadas, resultando la fosforilación proteica. Extractos de varios tejidos vegetales han demostrado la fosforilación dependiente de calcio y calmodulina de las proteínas (1, 18, 19, 35, 38, 48, 50). Un ejemplo de la fosforilación dependiente de Ca en coleoptilos de avena a niveles micromolares de calcio libre se muestra en la Fig.4. PAPEL DEL CALCIO EN LA ACCIÓN HORMONAL EN PLANTAS Estudios previos de Poovaiah y Leopold (26-29) y Leopold et al. (12) han demostrado que el calcio tiene efectos modificadores fuertes en las funciones de cada cinco de las hormonas vegetales conocidas, en

algunas instancias amplificando la respuesta hormonal y en otras suprimiéndola. Recientemente, el papel del calcio en la mediación del efecto citokinina fue estudiado para “depleting Ca” de discos de hoja de maíz por un pretratamiento de EGTA y después transfiriendo los discos a un medio que contiene citokinina con o sin calcio. Después del pretratamiento de EGTA, la citokinina no es muy efectiva en retrasar la pérdida de la proteína, un parámetro clave de la senescencia (Fig.5). El efecto de la citokinina es restaurado, sin embargo, por la adición de Ca. Este efecto sugiere que la respuesta a la citokinina es mediada por el calcio. Investigaciones previas por Saunders y Hepler (42) han mostrado que el ionóforo de Ca A23187 podría imitar el efecto de la citokinina en la formación de brotes de Funaria. Sus resultados indican que la pareja estímulo-respuesta involucra un flujo de Ca dentro del citoplasma. Los antagonistas de la calmodulina inhiben la elongación inducida por auxina en maíz y el coleóptilos de avena, sugiriendo la involucración del calcio y la calmodulina en la elongación inducida por auxina (36). Evidencias recientes indican que los cambios regulados por auxina y dependientes de calmodulina en la fosforilación proteica (39), los cuales enfatizan más el significado global del control hormonal del calcio y de la calmodulina en plantas. La tuberización en patata ha sido también mostrada por estar influenciada por el Ca. (2). El ácido abcísico (ABA) es conocido por inducir el cierre estomatal (13). Estudios recientes muestran una interacción sinérgica entre el Ca2+ y el ABA en prevención de la apertura estomatal (10). Estos resultados son consistentes con la hipótesis que el ABA aumenta la permeabilidad de la célula guardia al Ca2+. El calcio por tanto podría operar como un mensajero secundario para regular los flujos iónicos que determinan la apertura de la célula guarda. PAPEL DE LOS FOSFOINOSITOLES-DERIVADOS EN EL SISTEMA MENSAJERO CÁLCICO En los últimos años, se ha prestado una gran atención al movimiento de los fosfoinositoles-derivados en la membrana. El diagrama esquemático mostrado en la Fig. 6 ilustra el movimiento de los fosfoinositidos y la movilización del calcio guiando a la respuesta celular. Como se indica en este modelo, el estímulo primario tales como hormonas, luz y gravedad interactúa con el receptor. Esta interacción resulta en la activación de la fosfolipasa C y la adhesión de los lípidos

fosfatidilinositol-4,5-bifosfato de la membrana en diacilglicerol y trifosfato inositol (3, 33, 34). Después el inositol trifosfato libera Ca del retículo endoplasmático (7, 40). Esta liberación de Ca puede activar los enzimas dependientes de calmodulina, tales como proteína kinasa C, finalmente guiando a la fosforilación proteica y a la respuesta celular (3, 16, 33, 34). La presencia de fosfoinositoles-derivados ha sido mostrada en tejidos vegetales (4), y las evidencias recientes sugieren que algunas similitudes existen en la ruta de la fosforilación en plantas y animales (33, 34). La movilización del calcio inducido por inositol trifosfato de la fracción microsomal ha sido observada en nuestro laboratorio (40) y en otros (7). La proteína kinasa C ha sido recientemente publicada en plantas (43). También tenemos la evidencia para mostrar la involucración de los fosfoinositoles-derivados en la promoción de la fosforilación de proteínas solubles (33). Se necesita mayor información para clarificar el significado de esta ruta en plantas. CONCLUSIÓN El mecanismo de la acción del Ca está justo comenzando a comprenderse a nivel molecular. Un dramático despliegue de información durante los pasados 5 años sugiere que el Ca no es solo un micronutriente, también tiene un control metabólico mayor y un control del desarrollo en plantas. Una comprensión detallada de los procesos bioquímicos mediados por calcio y calmodulina ayudarían a entender los procesos involucrados en el crecimiento y desarrollo de la planta. Aunque los procesos bioquímicos mediados por calcio y calmodulina así como el movimiento de los fosfoinositoles-derivados ha sido estudiado mejor en sistemas animales, tales estudios están comenzando en plantas. Sin embargo, la regulación de los procesos de crecimiento de la planta por Ca apunta a un papel de mensajero secundario para el calcio, similar al ya conocido en los sistemas animales. La necesidad en la investigación en plantas es la información a nivel molecular de cómo el transporte de Ca desde las membranas, orgánulos, y pared celular está controlado y cuales son los sucesos iniciales que desencadenan los procesos bioquímicos que dependen de los cambios de la concentración de calcio citoplasmático.

Necesitamos técnicas perfeccionadas para medir precisamente los cambios transitorios en los niveles de calcio libre citoplasmático. La evidencia acumulada sugiere un papel mayor para el calcio en la función celular y en la traducción de las señales en plantas.

FIGURAS INCLUIDAS EN EL TEXTO

LITERATURA CITADA EN EL TEXTO