Calibración Interlaboratorio - mapama.gob.es€¦ · corrido en una cámara de electroforesis y visualizado en un transiluminador ultravioleta. Calibración Interlaboratorio HERPEMOL

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTÁNDAR

Calibración Interlaboratorio

Proyecto HERPEMOL Caracterización de la situación sanitaria del litoral español relativa a la infección por virus herpes en moluscos bivalvos y evaluación del impacto de la enfermedad. JACUMAR PN 2011-2013


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Índice

1. Introducción 3

2. Objetivos 6

2.1. Objetivo general 6

2.2. Objetivos específicos 6

3. Generalidades de las técnicas 7

3.1. Técnica histológica 7

3.2. Técnica molecular 7

4. Equipos e instrumentos 10

5. Materiales y reactivos 11

6. Material proporcionado por el CIMA 12

7. Preparación de las muestras 13

7.1. Análisis Histológico 12

7.2. Análisis Molecular 15

7.2.1. Condiciones previas de trabajo 15

7.2.2. Extracción de ADN de muestras. 15

7.2.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) y ensayo de restricción (RFLPs) empleando los cebadores C2-C6 y los reactivos comunes para todos los laboratorios participantes.

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7.2.4. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6 y los reactivos habituales de cada laboratorio participante.

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7.2.5. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos comunes para todos los laboratorios participantes.

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7.2.6. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos habituales de cada laboratorio participante.

19

8. Análisis de resultados. 21

8.1. Interpretación histológica. 21

8.2. Interpretación molecular. 21

8.2.1. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6. 21

8.2.2. PCR empleando los cebadores HerpF -HerpR 21

9. Hoja de Resultados 22

10. Bibliografía citada 23


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1. Introducción

En las últimas décadas, según datos de la Organización Mundial de Sanidad

Animal (OIE), la producción mundial de moluscos se ha visto seriamente afectada por

numerosas enfermedades,. Debido al severo impacto que producen en el desarrollo

socioeconómico en muchos países, algunas de estas enfermedades se han convertido

en una seria restricción primaria para el desarrollo y sostenibilidad del cultivo de

moluscos. Actualmente, se considera que la principal causa asociada a los brotes de

enfermedades y epizootias es la transferencia de agentes infecciosos a través del

transporte de moluscos vivos. La dinámica de libre comercio y el legítimo deseo de los

países de buscar nuevas alternativas para la producción de alimento y de desarrollo

socioeconómico, hacen que se pasen por alto factores sanitarios esenciales que, de

no considerarse en su justo contexto, pueden hacer fracasar los cultivos de moluscos

(Cáceres-Martínez y Vásquez-Yeomans, 2008).

Las infecciones de origen vírico en moluscos se empezaron a estudiar a partir de

los años 60 del siglo pasado, aunque su interés se ha incrementado notablemente con

el desarrollo de la acuicultura. El primer caso de infección por un virus tipo-herpes en

moluscos bivalvos fue registrado por Farley y col. (1972) en Crassostrea virginica. Desde

entonces se han notificado numerosos casos de infecciones por virus,

presumiblemente pertenecientes a la familia Herpesviridae, en diferentes especies de

bivalvos en todo el mundo; entre ellas podemos citar Crassostrea gigas (Hine et al.,

1992), C. angulata (Arzul et al., 2001a), C. rivularis (Arzul et al., 2001a), Ostrea edulis

(Nicolas et al., 1992), O. angasi (Hine y Thorne 1997), Tiostrea chilensis (Hine et al., 1998),

Ruditapes decussatus (Renault and Arzul, 2001), R. philippinarum (Renault, et al 2001a),

y Pecten maximus (Arzul et al., 2001b). También cabe destacar el reciente registro de

mortalidades masivas de semilla de ostra plana O. edulis asociadas a infecciones por

virus herpes en Galicia (Villalba y col. 2010). La mayoría de estas notificaciones están

relacionadas con mortandades elevadas de larvas y juveniles, siendo la población

adulta aparentemente menos sensible a la infección (Arzul et al., 2002; Renault y

Novoa, 2004).

El desarrollo de un método para purificar partículas virales tipo-herpes a partir

de tejido fresco de larvas de C. gigas infectadas, facilitó la extracción del ADN viral y

la caracterización parcial de su genoma (Le Deuff and Renault, 1999). La posterior

secuenciación completa del genoma (GenBank Nº AY509253) reveló una baja

relación con otros herpesvirus. El virus aislado a partir de larvas de C. gigas infectadas

se clasificó formalmente como un miembro de los Herpesviridae, y se bautizó con el

nombre de “Ostreid Herpesvirus 1” (OsHV-1) (Minson et al. 2000). A lo largo de los años


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2008 y 2009 se observaron en Francia mortalidades anómalas que han ido en aumento

y parecen afectar a casi todo el litoral. Estas mortalidades también se detectaron en el

verano del 2008 y 2009 en Irlanda y en el verano del 2009 en las Islas Anglonormandas.

Dado que las mortalidades parecían asociadas a los movimientos comerciales de los

ostiones C. gigas procedentes de Francia, las autoridades competentes de estos

Estados miembro y de las Islas Anglonormandas adoptaron medidas de confinamiento,

evitando los desplazamientos de los ostiones a partir de las zonas afectadas, con el fin

de controlar la situación generada por la enfermedad. Estas mortalidades parecen

estar relacionadas con la presencia de un nuevo genotipo recombinante de virus

herpes, denominado OsHV-1 µvar. Asociado a estas mortalidades también se han

descrito varias especies de vibrios y múltiples factores ambientales. Actualmente, el

virus herpes de los ostreidos tipo 1 µvar, recibe la consideración de enfermedad

emergente por la OIE. En Marzo de 2010, la Comisión Europea aprobó el Reglamento

175/2010 “por el que se aplica la Directiva 2006/88/CE del Consejo en lo referente a las

medidas de lucha contra el aumento de la mortalidad de los ostiones de la especie

Crassostrea gigas en relación con la detección del herpesvirus de los ostreidos tipo 1

µvar (OsHV-1 µvar)”. Dicha Normativa dejo de estar vigente en Abril de 2011.

El diagnóstico de la infección por virus herpes se ha realizado tradicionalmente

mediante microscopía óptica, como una primera aproximación, seguido de un estudio

de microscopía electrónica de transmisión para completar el diagnóstico (Hine and

Thorne 1997). Estos métodos presentan varias limitaciones, ya que requieren un

elevado tiempo de dedicación, no son válidos para realizar estudios epidemiológicos y

tienen una baja sensibilidad. Debido a estas limitaciones, se desarrollaron otros

métodos basados en técnicas inmunohistoquímicas y genómicas. Actualmente los más

empleados son los métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa

(PCR) que permite la detección del ADN viral (Renault et al. 2000a; Renault y Arzul

2001a; Batista y col. 2005). La PCR se considera una herramienta adecuada para el

diagnóstico de las infecciones por OsHV-1, debido a su especificidad, alta sensibilidad

en comparación con otros métodos, fácil procesado de las muestras, disponibilidad de

reactivos, eficiencia del tiempo empleado y coste. Sin embargo, dado que la PCR sólo

detecta ácidos nucleicos virales como técnica confirmatoria se debe emplear la

histología, la hibridación in situ o tests de reconocimiento antigénico, especialmente

ante nuevos registros geográficos u hospedador. En aquellas regiones endémicas, el

diagnóstico por PCR se considera suficiente para diagnosticar la presencia de OsHV-1

(Batista et al. 2007).

La pérdida de estandarización en los protocolos a desarrollar así como en su

interpretación es uno de los principales impedimentos para la implantación de


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métodos de diagnóstico efectivos, siendo la reproducibilidad entre los laboratorios un

factor crítico. El procedimiento a ensayar no solo se basa en realizar una prueba

diagnóstica, sino también en reproducir la misma sensibilidad, discernir falsas

interpretaciones y mejorar los procedimientos para controlar la posible contaminación.

Esta pérdida de reproducibilidad es más pronunciada con las técnicas moleculares

debido a la sensibilidad de los reactivos, la complejidad de los equipos y la necesidad

de personal bien formado. Por ello, la validación basada sobre un criterio

consensuado es un prerrequisito para la adopción con éxito de la metodología

diagnóstica. Para realizar una correcta intercalibración de la metodología es

necesario replicar varios grupos de ensayo, tanto para el manejo de las herramientas

moleculares como para el diagnóstico histológico.


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2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general:

El objetivo de esta línea de trabajo se centra en unificar los criterios

diagnósticos y validar, entre los grupos de investigación implicados, las pruebas

diagnósticas (histología y PCR), con el fin de que los resultados de evaluación de la

situación sanitaria (línea de trabajo 3) sean armoniosos y coherentes a nivel nacional.

2.2. Objetivos específicos:

(1) Establecer los criterios comunes para el diagnóstico histológico.

(2) Establecer procedimientos debidamente pormenorizados para una extracción

correcta del ADN, mediante los kits comerciales actualmente disponibles en el

mercado.

(3) Establecer el procedimiento de PCR mediante la descripción de los protocolos

utilizados para el diagnóstico del OsHV-1 y su variante OsHV-1 µvar.

(4) Establecer el procedimiento de RFLPs para el diagnóstico del OsHV-1 y su variante

OsHV-1 µvar.

(5) Validar la sensibilidad y reproducibilidad de los resultados de PCR-RFLPs empleando

los reactivos que se usan habitualmente en cada uno de los laboratorios

participantes.

(6) Validar la sensibilidad y reproducibilidad de los resultados de PCR empleando una

nueva pareja de cebadores (HerpF/R) diseñados durante el desarrollo del

proyecto.


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3. GENERALIDADES DE LAS TÉCNICAS

3.1 Técnica Histológica.

Denominamos proceso histológico a una serie de métodos y técnicas utilizados

para poder estudiar las características morfológicas y moleculares de los tejidos. El

proceso histológico comienza con la obtención del tejido objeto de estudio. Las

muestras son habitualmente fijadas con unas soluciones líquidas (fijadores), que

mantienen durante el procesado posterior del tejido las estructuras celulares y

moleculares en sus posiciones iniciales.

Normalmente, tras la fijación se procede a incluir el tejido para posteriormente

obtener secciones. Cuanto más delgada queramos que sea nuestra sección más

tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con

sustancias líquidas que posteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán

consistentes (ceras). Los medios de inclusión son normalmente no hidrosolubles como

la parafina, por lo que tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes

orgánicos liposolubles y posteriormente añadir el medio de inclusión.

Tras la inclusión se procede a cortar los tejidos. Existen diferentes aparatos de

corte que permiten conseguir secciones ultrafinas (del orden de nanómetros),

semifinas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm) y gruesos (mayores a 10 µm).

Estas secciones hay que procesarlas para poder observarlas. Normalmente las

secciones se tiñen con colorantes que son hidrosolubles, por lo que hay que eliminar el

medio de inclusión para que los colorantes pueden unirse al tejido. Los tejidos

procesados se observan con los microscopios.

3.2. Técnica Molecular

La técnica de la Reacción en cadena de la Polimerasa, consiste básicamente

en la amplificación de un segmento específico del genoma del virus. Este segmento

específico, como se menciona, debe ser seleccionado como único y característico

para cada tipo de microorganismo que se quiera diagnosticar, de esta manera,

estaremos trabajando con una técnica que contará con una alta sensibilidad y

especificidad para el diagnóstico de una enfermedad.

Una vez identificada esta región o segmento a amplificar, se deben diseñar los

partidores o en inglés primers, que establecerán el marco de acción de esta

amplificación, el desarrollo de este diseño es importantísimo y fundamental para la

obtención de un resultado apropiado.


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El resto de los reactivos que requiere la reacción, consisten básicamente en un

buffer o solución tamponada, presencia de sales de Magnesio, dinucleótidos de los 4

tipos: Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) y Timina (T), agua y la enzima Polimerasa.

La reacción en sí, consiste en tres etapas, desnaturalización de la hebra,

anillamiento con los partidores e hibridización, estas tres etapas ocurren en varios ciclos

(usualmente entre 30 y 40) en tres distintas temperaturas, para este efecto se emplean

equipos que se denominan termocicladores.

Una vez finalizada la reacción, se debe visualizar o detectar si se amplificó el

segmento deseado, esto, en el caso que se trate de PCR convencional, el producto

de la reacción de PCR es sacado del termociclador, cargado en un gel de agarosa,

corrido en una cámara de electroforesis y visualizado en un transiluminador

ultravioleta.

En biología molecular, el término polimorfismos en la longitud de los fragmentos

de restricción o RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a

secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por

las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que

varían entre individuos. Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones

de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN. Lo que permite diferenciar

entre diferentes individuos de una población, entre cepas o variantes de la misma

especie o entre diferentes especies.

Se debe tener bastante precaución cuando se trabaja con material genético,

con el fin de evitar la presencia de inhibidores de ARN o ADN, principalmente enzimas

que destruyen ácidos nucleicos, es por esta razón que se trabajan con materiales libres

Desnaturalización 95°C

Anillamiento 50-60ºC

Extensión 75ºC

Primer Ciclo

2do Ciclo


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de ARN-ADNasas. Se deben cambiar de guantes con frecuencia y se deben tener

algunos equipos de uso exclusivo para cada etapa, es decir, para la extracción,

amplificación y etapa de post-amplificación (en el caso de la PCR convencional).


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4. EQUIPOS E INSTRUMENTOS

- Uso general

� Cámara de Flujo Laminar Clase II, con luz germicida UV.

� Nevera (2ºC - 6ºC).

� dos juegos completos de pipetas (2 µl, 20 µl, 200 µl y 1 000 µl); el primero para la extracción del ADN y el segundo para la preparación de la mezcla de RCP.

- Extracción de ADN

� Microcentrifuga.

� Vortexer.

� Baño de agua o placa caliente a 56ºC.

� Espectrofotómetro ADN/ARN o nanodrop.

- PCR

� Termociclador

- Electroforesis de agarosa

� Horno microondas o incubador-agitador

� balanza

� un sistema de electroforesis horizontal

� un dispositivo de UV para la lectura de los geles de agarosa

� un sistema de documentación de imágenes


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5. MATERIALES Y REACTIVOS

- Uso general

� Puntas de micropipeta con filtro de diversos calibres.

� Guantes sin talco, ADN/ARNasa Free.

� Tubos eppendorf de 1,5 ml y de 0,5 ml ADN/ARNasa free.

- Extracción de ADN

� Kit de extracción de ADN: QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN).

� Etanol (96-100%), grado Biología Molecular.

� PBS (Phosphate-buffered saline).

- PCR de calibración

� Agua destilada estéril RNAase free, grado Biología Molecular.

� Cebadores (10µm)

� Dideoxinucleótidos dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix (20 mM) (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec)

� Taq ADN polimerasa (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec).

� Tampón 10 X (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec).

� MgCl 2 (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec) (25 mM)

- Electroforesis de agarosa

� 50 X TAE (puede comprarse listo para usar):

Tris base (40 mM): 242 g

Ácido acético glacial (40 mM): 57,1 ml

Na2EDTA.2H2O (1 mM): 18,61 g

dH2O para 1 litro

Ajustar al pH 8

� Agarosa

� Bromuro de etidio (0,5 µg/ml)

� Colorante azul para carga:

Azul de bromofenol 0,25 %

Xileno cianol FF 0,25 %

Sacarosa 40 %

Mantener a 4 °C.

� Marcador de peso molecular: bandas a intervalos regulares de 100 a 1000 pb.


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6. MATERIAL PROPORCIONADO POR EL CIMA.

� Preparaciones histológicas. Etiquetadas del 1 al 60.

� Tejido en etanol al 96%. Etiquetados del 1 al 60.

� Alícuota de primers HerpF/R (10 micromolar).

� Plásmido control positivo con el fragmento C2-C6 de OsHV-1 µvar.

� Plásmido control positivo con el fragmento HerpF/R de OsHV-1 µvar.

� Plásmido control positivo con el fragmento HerpF/R de OsHV-1.


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7. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

El Laboratorio de Patología del Centro de Investigacións Mariñas (CIMA) ha sido

el centro receptor de las ostras (Crassostrea gigas) control e infectadas por virus herpes

que se van a emplear en la prueba de intercalibración. También es el laboratorio

encargado de realizar las preparaciones histológicas que se van a distribuir en la

prueba, así como de conservar tejido de ostra para el análisis molecular. Con esta

finalidad, la vianda de cada ostra se separó de la concha, y se dividió en dos

fragmentos, uno para diagnóstico molecular y otro para histología. De esta forma, de

cada preparación histológica disponemos de su réplica en el análisis molecular. A su

vez, el fragmento de vianda destinada a la extracción de ADN, se dividió en tres

porciones y cada una de ellas se conservó en tubos individuales con etanol 99%.

7.1. Análisis Histológico.

A continuación se detalla el protocolo de preparación de las muestras

histológicas realizado en el laboratorio de Patología del Centro de Investigacións

Mariñas (CIMA).

- Fijación.

Separar un fragmento de vianda, éste se coloca en una cajita perforada

(cassette), convenientemente rotulada. El cassette con el fragmento de vianda se

introduce en disolución de Davidson (disolución de fijación) durante 24h a 4ºC.

Transcurrido este periodo, se lava con agua bajo el grifo durante unos 10 min. En caso

de que se prefiera conservar el fragmento de vianda durante un tiempo indefinido

antes de la inclusión en parafina, el cassette con el fragmento se mantiene en etanol

de 70º.

Solución de Davidson (Shaw y Battle 1957)

Glicerina 400 mL

Formaldehído 40% 300 mL

Etanol de 96º 1200 mL

Agua de mar filtrada 1200 mL

Se puede preparar una solución con los compuestos señalados arriba y

mantenerla por tiempo indefinido. Justo antes de la utilización del fijador hay que

mezclar 1 parte de ácido acético glacial con 9 partes de la solución anterior.


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- Inclusión, formación de bloques de parafina y obtención de cortes histológicos.

Para la inclusión en parafina y posterior formación de bloques se procede

siguiendo los pasos de la tabla insertada a continuación, utilizando un procesador

automático LEICA TP 1020. Posteriormente, utilizando una consola Tissue Tek (Miles

Scientific), se forma un bloque de parafina con un molde metálico, del cual se

obtienen cortes de 5 µm de espesor con un micrótomo de rotación. Estos cortes

primero se depositan en un baño de flotación con agua a 40oC para que se estiren y a

continuación se recogen sobre un portaobjetos que se deja secar en estufa a 40º C

para su posterior tinción.

↓ Etanol de 80o 1h Etanol absoluto 1h

Etanol de 96o 2h Xileno y etanol absoluto (1:1) 1h

Etanol de 96o 1h Xileno 1h

Etanol de 96o 1h Xileno 1h

Etanol absoluto 2h Parafina y xileno (1:1) 3h a 65oC

Etanol absoluto 2h→ Parafina (con vacío) 3h a 65oC

- Tinción hematoxilina de Harris-eosina (adaptado de Howard et al. 2004) utilizando

teñidor automático LEICA AUTOSTAINER XL.

Desparafinar Xileno 5 min

Xileno 10 seg

Hidratar Etanol absoluto 6 seg

Etanol absoluto 6 seg

Etanol de 96o 6 seg

Etanol de 70o 6 seg

Etanol de 50o 6 seg

Agua destilada 2 min

Tinción Hematoxilina de Harris 8 min

Lavar Agua bajo el grifo 5 min

Diferenciar Etanol ácido (0,04% HCl en etanol de 70o) 3 min

Lavar Agua bajo el grifo 5 min

Azular

NaHCO3, una cucharada en 250 mL de agua destilada

30 seg

Etanol de 96o 3 min

Contratinción Eosina amarilla 15 seg

Diferenciar Etanol de 96o 6 seg

Etanol de 96o 6 seg

Deshidratar Etanol absoluto 6 seg

Etanol absoluto 6 seg


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Aclarar Xileno 6 seg

Xileno 15 min

Montar Histomount (Montador automático LEICA CV5030)

7.2. Análisis Molecular

7.2.1. Condiciones de trabajo previas.

Antes de comenzar con las extracciones, se deben colocar pipetas “limpias”,

gradillas, puntas, etc. en una cámara de bioseguridad que se haya limpiado

previamente. La exposición a la luz ultravioleta germicida, por varias horas o por toda

la noche puede ser beneficiosa para la degradación de ADN contaminante de las

pipetas y otros equipos.

El manipulador debe llevar bata de laboratorio y guantes durante todas las

fases que se describen a continuación. Preferiblemente, la bata y los guantes deben

cambiarse tras cada paso principal: Extracción de ADN, preparación de la mezcla de

PCR, distribución de las muestras, amplificación y transferencia al gel.

Se recomienda llevar a cabo estas fases en diferentes salas. En particular, la

amplificación y la transferencia al gel/la electroforesis deberían efectuarse en una sala

separada de la extracción del ADN, la preparación de la mezcla de PCR y la

distribución del ADN.

7.2.2. Extracción de ADN de muestras (método QIAamp® DNA Mini Kit, QIAGEN).

La extracción del ADN se efectuará utilizando el kit QIAamp® DNA Mini Kit

(QIAGEN) siguiendo las instrucciones del protocolo de ensayo con tejidos, en el

siguiente orden:

(1) Poner entre 10 y 50 mg de tejidos en un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml, y

añadir 180 µl de tampón ATL.

(2) Añadir 20 µl de proteinasa K, mezclar con agitador vortex e incubar a 56 °C hasta

que el tejido quede completamente lisado (hasta el día siguiente). Agitar con

vortex ocasionalmente durante la incubación para dispersar la muestra.

Centrifugar brevemente el tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para retirar las

gotas de la tapa.


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(3) Añadir 200 µl de tampón AL a la muestra, mezclar con agitador vortex con

sacudidas durante 15 s e incubar a 70 °C durante 10 minutos. Centrifugar

brevemente el tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para retirar las gotas de la

tapa.

(4) Añadir 200 µl de etanol (96-100 %) a la muestra y mezclar con agitador vortex con

sacudidas durante 15 s. Centrifugar brevemente el tubo de microcentrifugación

de 1,5 ml para retirar las gotas de la tapa.

(5) Aplicar cuidadosamente la mezcla del paso 4 a la columna QIAamp (en un tubo

de recogida de 2 ml) sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a 10.000

rpm durante 1 min. Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de

recogida limpio de 2 ml (suministrado en el kit) y desechar el tubo que contiene

el filtrado.

(6) Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y añadir 500 µl de

tampón AW1 sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a 10.000 rpm

durante 1 min. Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de

recogida limpio de 2 ml (suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida

que contiene el filtrado.

(7) Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y añadir 500 µl de

tampón AW2 sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a toda velocidad

(14.000 rpm) durante 3 min.

(8) (Optativo) Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de recogida

nuevo de 2 ml (no suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida que

contiene el filtrado. Centrifugar a toda velocidad (14.000 rpm) durante 1 min.

(9) Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de microcentrifugación

limpio de 1,5 ml (no suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida que

contiene el filtrado. Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y

añadir 100 µl de agua destilada. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y

centrifugar a 10.000 rpm durante 1 min.

(10) Controlar la calidad y la eficacia de la extracción [por ejemplo, midiendo la DO

(260 nm) bajo el espectrofotómetro o tras la electroforesis en gel de agarosa].

(11) Preparar la dilución de las muestras para tener una concentración final de ADN

de 50-100 ng/µl.

(12) Las soluciones de ADN se guardan a 4 °C hasta que se efectúen los análisis por

PCR.


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7.2.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) y ensayo de restricción (RFLPs)

empleando los cebadores C2-C6 y reactivos comunes para todos los laboratorios

participantes.

- Mezcla de reacción.

(1) Descongelar el vial, mezclar y dejar en hielo.

(2) A 25 µl de Gold Star Mix, añadir 0,01 nmoles de primers, 100 ng de ADN molde y

enrasar con H2O a un volumen final de 50 µl.

Tabla 1. Mezcla de reacción para la PCR.

Volumen por tubo

2X PCR MIx 25µl

MgCl2 (25 mM) 2µl

C2 (10 µM) 1 µl

C6 (10 µM) 1 µl

ADN -

dH2O Enrasar a 50µl

- Controles. Se emplearán dos tipos de controles:

(1) Controles negativos. Se añadirá a la mezcla de reacción (49 µl) 1 µl de dH2O.

Tienen por objeto detectar una posible contaminación reactiva del entorno de

trabajo. Debería incluirse un control negativo por cada diez muestras o después de

cada lote de muestras. ES L 52/8 Diario Oficial de la Unión Europea 3.3.2010.

(2) Controles positivos consistirán en ADN plasmídico que contiene la región objetivo

del genoma C2-C6 del OsHV-1. Su objetivo es comprobar la eficacia de la PCR.

Debe incluirse un control positivo por cada análisis por PCR.

- Amplificación. El protocolo de amplificación se detalla a continuación:

� Desnaturalización inicial: 2 min a 94 °C.

� 35 ciclos:

� desnaturalización 1 min a 94 °,

� amplificación 1 min a 58 °,

� elongación 1 min a 72 °C

� Elongación final: 5 min a 72 °C.


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- Electroforesis

(1) Pesar 1,5 g de agarosa, añadir 100 ml de 1X TAE y calentar hasta que se funda la

mezcla.

(2) Tras enfriar la solución, añadir bromuro de etidio (5 µl para 100 ml de gel de

agarosa) y poner la solución en un molde específico equipado con peines.

(3) Cuando el gel se polimeriza, se retiran los peines y el gel se dispone en un sistema

de electroforesis horizontal que contiene 1X TAE suficiente para cubrir el gel de

agarosa.

(4) Mezclar 10 µl de productos de PCR con 2 µl de colorante azul (6X) y disponer en las

ranuras.

(5) Reservar una ranura para el marcador de peso molecular (5 µl).

(6) Aplicar un voltaje de 5-10 V/cm entre 30 min y 1 hora hasta que el colorante azul

haya recorrido la distancia adecuada a través del gel.

(7) Observar el gel con luz UV y documentar.

- Ensayo de enzimas de restricción (RFLPs).

Para discriminar entre la infección por el herpesvirus OsHV-1 o su variante OsHV-

1 µvar, se realizará un ensayo de restricción con la enzima MfeI (NBE). Las reacciones

de restricción se realizarán en un volumen final de 50 µl conteniendo 1 µg de ADN, 5 µl

de tampón de la enzima y 1 U de la enzima de restricción MfeI. Las digestiones se

realizarán durante 1h a 37 ºC, seguido de una incubación de 10 min a 65 ºC para

inactivar la enzima. Para visualizar los patrones de restricción, 15 µl del ADN digerido se

mezclará con 1 µl de colorante azul para carga. Las condiciones de electroforesis

serán las indicadas en el apartado anterior.

7.2.4. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6 y los reactivos habituales de cada

laboratorio participante.

Los apartados relativos a controles, amplificación y electroforesis se

corresponden con lo descrito previamente en el apartado 7.2.3. El apartado de

mezcla de reacción queda sujeto a las condiciones de los reactivos que cada

laboratorio use de forma rutinaria. La enzima Taq polimerasa que se use definirá las

condiciones de concentración apropiadas para los dNTPs y los cebadores Sería

necesario tener en cuenta la concentración incrementada de MgCl2. Indicar lo mismo


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en el uso de la restrictasa en los RFLPs. Señalar que en la PCR cantidad de ADN molde

es 100 ng y en los RFLPs la cantidad de ADN molde es 1 µµµµg.

7.2.5. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos comunes para todos

los laboratorios participantes.

Los primers HerpF y HerpR se han diseñado con el objetivo de disponer de unos

primers de secuencia conocida que permitan la identificación inequívoca del virus

herpes OsHV-1 y a variante OsHV-1 µvar, evitando análisis complementarios como

RFLPs o secuenciación. La secuencia de estos primers es la siguiente:

HerpF: 5’- CCC CGG GGA AAA AGT ATA AA- 3’

HerpR: 5’- GTG ATG GCT TTG GTC AAG GT -3’

- Los apartados relativos a mezcla de reacción, control negativo y electroforesis se

corresponden con lo descrito previamente en el apartado 7.2.3.

- Como control positivo se empleará ADN plasmídico que contiene la región objetivo

del genoma HerpF y HerpR del OsHV-1. Su objetivo es comprobar la eficacia de la

PCR. Debe incluirse un control positivo por cada análisis por PCR.

- El protocolo de amplificación se detalla a continuación:

� Desnaturalización inicial: 2 min a 94 °C.

� 35 ciclos:

- desnaturalización 1 min a 94 °C,

- amplificación 1 min a 52 °C,

- elongación 1 min a 72 °C

� Elongación final: 5 min a 72 °C.

- Electroforesis. Se seguirá el protocolo descrito en el apartado 7.2.3, pero con la

siguiente modificación en el paso (1) del protocolo descrito.

(1) Pesar 3 g de agarosa, añadir 100 ml de 1X TAE y calentar hasta que se funda

la mezcla. Los geles se realizarán al 3%.

7.2.6. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos habituales de cada

laboratorio participante.


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Los apartados relativos a controles, amplificación y electroforesis se corresponden con

lo descrito previamente en el apartado 7.2.3. El apartado de mezcla de reacción

queda sujeto a lo descrito en el apartado 7.2.4. El empleo del control positivo, el

protocolo de amplificación y las condiciones de electroforesis se describen en el

apartado 7.2.5.


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8. ANÁLISIS DE RESULTADOS.

8.1. Interpretación histológica.

De acuerdo con Renault et al. (2000), el cambio histológico más destacado en

semilla de ostras (Crassostrea gigas y Ostrea edulis) como consecuencia de la

infección por OsHV-1es la presencia de núcleos anormales en el tejido conjuntivo,

principalmente en el manto, los palpos labiales y la glándula digestiva. La anormalidad

de los núcleos consiste en que hay células de tipo fibroblasto con núcleos de tamaño

mayor que el normal y en ellos la cromatina está depositada en la periferia; además,

en células ovoides que probablemente son hemocitos el núcleo está muy

condensado. La infección no está asociada con una reacción inflamatoria masiva y

no es frecuente detectar necrosis en las áreas con núcleos anormales.

Por tanto, debemos considerar como signo de la infección la presencia en el

tejido conjuntivo de núcleos grandes con cromatina formando un anillo (Fig. 1, en op.

cit.). Los núcleos muy condensados son menos orientativos, pues se trata de un signo

de apoptosis.

8.2. Interpretación molecular.

8.2.1. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6.

� PCR: En aquellos geles de agarosa al 1,5 % con resultado negativo de todos

los controles negativos y resultado positivo de todos los controles positivos,

la presencia de una banda de aproximadamente 700 pb es indicativo de

infección por OsHV-1 (710 pb) o OsHV-1 µµµµvar (696 pb).

� RFLPs: Tras el ensayo de restricción, la presencia en los geles de agarosa al

1,5 % de una banda de 710 pb es indicativo de infección por OsHv-1. La

presencia de dos bandas, una de 192 pb y otra de 504 pb es indicativo de

infección por OsHV-1 µµµµvar.

8.2.2. PCR empleando los cebadores HerpF y HerpR.

� PCR: En aquellos geles de agarosa al 3 % con resultado negativo de todos

los controles negativos y resultado positivo de todos los controles positivos,

la presencia de una banda de 173 pb es indicativo de infección por OsHV-1

y una banda de 157 pb es indicativo de infección por OsHV-1 µµµµvar.


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9. HOJA DE RESULTADOS

En cada una de las hojas de resultados se debe identificar el laboratorio que ha

realizado el ensayo de intercalibración, cubriendo para ello el apartado

“LABORATORIO”. Una vez finalizados los análisis, las tablas correctamente cubiertas con

los resultados se enviarán via e-mail a CETMAR.

Los resultados obtenidos en la prueba de intercalibración quedarán reflejados en

las tablas que se anexan, cubriéndolas de la forma que se indica en las siguientes

instrucciones:

RESULTADOS HISTOLÓGICOS

� Las preparaciones histológicas en las que se observen signos de infección por

herpesvirus se indicará en la tabla correspondiente con el signo + en la

columna “resultado”.

� La ausencia de signos de infección se indicará con el signo -.

� Cualquier otra particularidad digna de ser reseñada se indicará en la

columna de observaciones.

RESULTADOS MOLECULARES

� Los casos positivos de amplificación por PCR se indicará con el signo + en la

columna “PCR”.

� Los casos de amplificación negativos por PCR se indicarán con el signo - en

la columna “PCR”.

� La identificación positiva por RFLPs del virus herpes OsHV-1 o la variante OsHV-

1 µvar se indicará con el signo + en la columna de “RFLPs” que corresponda.

� La identificación negativa por RFLPs del virus herpes OsHV-1 o la variante

OsHV-1 µvar se indicará con el signo - en la columna de “RFLPs” que

corresponda.

� En la columna de observaciones se indicará aquellas muestras que siendo

positivas por PCR no pudieron ser analizadas por RFLPs, debido a la baja

concentración de ADN en el producto de PCR, señalándolo como “No

analizables”. Cualquier otra particularidad digna de ser reseñada se indicará

en la columna de observaciones.


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10. BIBLIOGRAFIA CITADA

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Documents

Calibración Interlaboratorio - mapama.gob.es€¦ · corrido en una cámara de electroforesis y visualizado en un transiluminador ultravioleta. Calibración Interlaboratorio HERPEMOL