CALOGÊNESE E OXIDAÇÃO EM CÉLULAS DE Eucalyptus grandis Hill ex Maiden

Desiane Amaral de Deus - Mestranda do Curso de Pós-graduação em Ciências Ambientais e Florestais – Instituto de Florestas/IF – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro/UFRRJ – Rod. BR-465, km 07 – 23890-000 – Seropédica, RJ – deiseflora@bol.com.br. Hulda Rocha e Silva - hhulda@hotmail.com. M.S. Em Ciências Ambientais e Florestais pela Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. UFRRJ. Heber dos Santos Abreu - abreu@ufrrj.br. Professor, Departamento de Produtos Florestais/DPF - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro/UFRRJ. Natália Dias de Souza – natdias@hotmail.com. Doutoranda do Curso de Pós-graduação em Ciências Ambientais e Florestais – Instituto de Florestas/IF – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro/UFRRJ.

RESUMO

Este trabalho objetivou a avaliação da influência dos reguladores de crescimento, cinetina (KIN) e ácido 2,4 – diclorofenoxiacético (2,4-D) no desenvolvimento, oxidação, e friabilidade de calos clonais de Eucalyptus grandis Hill ex Maiden. Os calos foram induzidos em meio de cultura Murashige & Skoog (MS) contendo 2,4-D (1; 2,5; 5; 10 e 20 µM) e cinetina (0; 0,5; 1; 2,5 e 5 µM), em 25 combinações diferentes. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com 5 (cinco) repetições, sendo cada unidade experimental constituída por 5 (cinco) frascos contendo três segmentos clonais cada. Os resultados foram estatisticamente avaliados e indicaram que concentrações altas de 2,4 – D induziram a formação de calos maiores, parcialmente oxidados, pouco friáveis e uma percentagem de calos rizogênicos. Concentrações mais elevadas de cinetina em relação ao ácido 2,4 – diclorofenoxiacético também induziram formação de calos oxidados e pouco friáveis. Os protocolos testados com concentrações iguais de cinetina e ácido 2,4 – D apresentaram os melhores resultados, com calos menos desenvolvidos que os protocolos testados com elevadas concentrações de ácido 2,4 – D; Entretanto, os calos desenvolvidos nestes protocolos apresentaram-se mais friáveis e menos oxidados; características consideradas ideais para experimentos de cultura de calos. Palavras – chave: calo, cinetina, ácido 2,4 – diclorofenoxiacético, friabilidade.

CALOGÊNESE AND OXIDATION IN CELLS grandis DE Eucalyptus former Hill Maiden

ABSTRACT

This work objectified the evaluation of the influence of the growth regulators, cinetina (2,4 KIN) and acid - diclorofenoxiacético (2,4-D) in the development, oxidation, and friabilidade of grandis clonais calluses of Eucalyptus former Hill Maiden. The calluses had been induced in way of Murashige culture & Skoog (MS) I contend 2,4-D (1; 2,5; 5; 10 and 20 µM) and cinetina (0; 0,5; 1; 2,5 and 5

µM), in 25 different combinations. The used experimental delineation entirely was casualizado with 5 (five) repetitions, having been each experimental unit consisting by 5 (five) bottles contends three clonais segments each. The results estatisticamente had been evaluated and had indicated that high concentrations of 2,4 - D had induced the formation of bigger calluses, partially oxidated, little friáveis and a percentage of rizogênicos calluses. Raised concentrations more of cinetina in relation to acid the 2, 4 - diclorofenoxiacético they had also induced formation of friáveis oxidated calluses and little. The protocols tested with equal concentrations of acid cinetina and - D had presented the best ones resulted, with developed calluses less than the protocols tested with raised 2,4 concentrations of acid 2,4 - D; However, the calluses developed in these protocols had been presented less friáveis and oxidated; characteristics considered ideal for experiments of culture of calluses. Words - key: callus, cinetina, acid 2,4 - diclorofenoxiacético, friabilidade.

RESUME

Cette étude visait à évaluer l'influence des régulateurs de croissance, kinétine (KIN) et l'acide 2,4 - dichlorophénoxyacétique (2,4-D) dans le développement, l'oxydation et la friabilité des callosités de clonale Eucalyptus grandis Hill ex Maiden. Calli ont été induite in vitro Murashige et Skoog (MS) contenant du 2,4-D (1, 2,5, 5, 10 et 20 µ m) et kinétine (0, 0,5, 1, 2,5 et 5 µ m), dans 25 différentes combinaisons. Le modèle expérimental était complètement aléatoire avec cinq (5) les répétitions, chaque unité expérimentale se compose de cinq (5) bouteilles contenant trois segments chaque clonale. Les résultats ont été évalués statistiquement et a indiqué que des concentrations élevées de 2,4 - D induite la formation de callosités plus large, partiellement oxydé, friable et une faible pourcentage de callosités rizogênicos. Kinétine des concentrations plus élevées par rapport à l'acide 2,4 - dichlorophénoxyacétique également induit la formation de callosités oxydé et peu friables. Les protocoles testés avec la même concentration d'acide et kinétine 2,4 - D avait les meilleurs résultats, avec moins développés que les callosités des protocoles testés avec des concentrations élevées d'acide 2,4 - D; Pendant ce temps, les callosités développés dans ces protocoles sont de plus en plus friables et moins oxydés, caractéristiques considéré idéal pour les expériences de la culture de callosités. Mots - clés: maïs, kinétine, acide 2,4 - dichlorophénoxyacétique, friabilité.

INTRODUÇÃO

Muitas das pesquisas com Eucalyptus spp têm sido auxiliadas por uma

técnica denominada cultura de tecidos. A cultura de tecidos in vitro permite avaliar os efeitos fisiológicos dos nutrientes, os hormônios vegetais e outros constituintes químicos (GALLO & CROCOMO, 1995) no desenvolvimento das plantas. O crescimento e o padrão de desenvolvimento da maior parte dos cultivos “in vitro” estão diretamente relacionados com a composição do meio e a concentração dos reguladores de crescimento presentes no meio (CORDEIRO et al, 2004). Entretanto, é importante destacar que, para cada tipo de célula, há a necessidade de se empregar um meio de cultura específico, que contenha, adequadamente, os nutrientes e agentes indutores necessários ao desenvolvimento das células (COSTA, 2006).

Para o estabelecimento de um eficiente controle no crescimento e na diferenciação das culturas “in vitro”, é necessário um adequado balanço entre os reguladores de crescimento, auxinas e citocinas. Normalmente, a concentração

de auxina é inferior a da citocinina, mantendo o balanço auxina/citocinina menor que um (PIERIK, 1990). Quando o nível de auxina em relação ao de citocinina é alto, ocorre a formação de raízes. Na situação oposta, ocorre a formação de brotos e quando as proporções são aproximadamente iguais, uma massa de calo (calogênese) é produzida (TAKAHASHI, 2002; KRIKORIAN, 1995). Almeida et al (2007), estudando a eficiência da auxina (ANA) no enraizamento de miniestacas de clones de Eucalyptus cloeziana, observou que não houve influência significativa no enraizamento das miniestacas da maioria dos clones estudados. Gomes et al (2004) constataram em suas pesquisas com Cocos nucifera L. que concentrações elevadas de 2,4-D inibiram a indução de calos in vitro. Eeuwens (1978) verificou em seus experimentos com explantes de tecido de inflorescência, que reguladores de crescimento, tais como o 2,4-D (2,4-diclorofenoxiacético) e ANA (ácido naftaleno acético), estimularam o crescimento dos tecidos apenas em baixas concentrações e que sua presença em altas concentrações causou a morte dos tecidos. As citocininas são básicas para métodos de cultura de tecidos e são extremamente importantes para a biotecnologia (CARVALHO et al, 2006). De acordo com Taiz e Zeigar (2004), as citocininas induzem a divisão celular em calos na presença de auxina, promovendo a formação de gemas ou raízes a partir de calos em cultura, entre outros. Grattapaglia e Machado (1998), ressaltam que as citocininas 6- benzilaminopurina (BAP) e cinetina (KIN) sempre são muito eficazes em promover a multiplicação in vitro.

O presente trabalho tem como objetivo avaliar a interação dos reguladores de crescimento cinetina (KIN) e do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) na indução de calos de Eucalyptus grandis Hill ex Maiden e seus níveis de oxidação para que sejam posteriormente utilizados em estudos de formação de lignina.

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia da Madeira

do Departamento de Produtos Florestais do Instituto de Florestas da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ). As sementes para a produção dos explantes foram adquiridas junto ao IPEF/ESALQ/USP, coletadas no Talhão A11, A21 do IPEF na cidade de Anhembi, SP. Em capela de fluxo laminar, sementes de E. grandis foram desinfestadas em solução de hipoclorito de sódio 2,5% contendo 0,2 mL.L-1 de tween 20 e peróxido de hidrogênio 1%. Após a desinfestação as sementes foram inoculadas em meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) adicionado de 100 mg.L-1 de mio-inositol, 30 g.L-1 de sacarose e 7,0 g.L-1 de agar, e o pH do meio de cultura ajustado para 5,7. Após 21 dias da inoculação das sementes em fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 25+2°C, segmentos apicais foram isolados e inoculados em meio MS adicionado de 5,71 µM de ácido naftalenoacético (ANA) . Foram utilizados 10 recipiente com três explantes cada. Os explantes foram mantidos em ausência de luz à temperatura de 25+2°C, por 60 dias, sendo subculturado a cada duas semanas. Após esse período o calo mais desenvolvido foi repicado em fragmentos de 0,3 cm, para multiplicação dos explantes (clones), e redistribuídos em meio de cultura renovado; um fragmento por recipiente, permanecendo no escuro. Foram efetuadas mais três subculturas, espaçadas de duas semanas. A quarta subcultura consistiu da inoculação de três fragmentos clonais por recipiente contendo meio de cultura suplementado com diferentes concentrações de ácido 2,4-D (1,0; 2,5; 5,0; 10,0 e 20,0 µM) e cinetina (0; 0,5; 1,0; 2,5 e 5,0 µM). Os fragmentos clonais permaneceram em ausência de luz à

temperatura de 25+2°C, sendo subculturado periodicamente a cada duas semanas em meio de cultura renovado.

O delineamento estatístico utilizado foi inteiramente casualizado com 5 (cinco) repetições, sendo cada unidade experimental constituída por 5 (cinco) frascos contendo três segmentos clonais cada. Utilizou-se um esquema fatorial 5x5, sendo considerados como fatores, as concentrações do ácido 2,4 - diclorofenoxiacético (1; 2,5; 5; 10 e 20 µM) e cinetina (0; 0,5; 1; 2,5; 5 µM), perfazendo-se 25 tratamentos. As avaliações foram feitas após 60 dias de cultivo, considerando-se as seguintes variáveis: crescimento dos calos (cm), usando-se como parâmetro a maior distância longitudinal, intensidade de oxidação e características dos calos (presença de raiz). Para a variável intensidade de oxidação, utilizou-se uma escala de 1 a 5, onde: 1= ausência de oxidação; 3= calos parcialmente oxidados e 5= calos totalmente oxidados (FLORES et al, 2000). Para a variável características dos calos fez-se correlação entre os tratamentos que apresentaram raiz e as respectivas concentrações de cinetina e ácido 2,4 diclorofenoxiacético.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise de variância para as diferentes concentrações na interação ácido 2,4

– D e cinetina, mostrou uma diferença significativa para a variável crescimento de calos (Figura 1), no aspecto de friabilidade e oxidação dos calos de E. grandis e no aspecto características dos calos (presença de raiz) tratados nas diferentes concentrações dos reguladores de crescimento cinetina e 2,4 – D.

ab abab bbb

abababab ab

c

abab a a

b

ab

b b

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ababab

b

ab

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26Tratamentos

Tam

anho

dos

cal

os (c

m)

Figura 1: Médias dos tamanhos dos calos nos diferentes tratamentos. Médias com letras iguais na coluna não diferem entre si pelo teste de Kruskal-Wallis a 5%. Todos os tratamentos desenvolveram três calos por recipiente, exceto o tratamento em que a concentração de cinetina e ácido 2,4 – D foi de 0 µM (T 26), onde não ocorreu crescimento de calos, indicando a necessidade de suplementação do meio de cultura com reguladores do crescimento para o desenvolvimento de calo de Eucalyptus grandis Hill ex Maiden. Segundo Takahashi (2002) é necessária uma razão intermediária de auxina/citocinina para ocorrer proliferação celular desorganizada (calos). Os melhores resultados

para a variável crescimento de calos, foram obtidos com os protocolos, cujas concentrações eram: 20 µM de 2,4-D + 0 µM de cinetina (T21) e 10 µM de 2,4-D + 2,5 µM de cinetina (19); seguido das concentrações: 10 µM de 2,4-D + 0 µM de cinetina (T16), 10 µM de 2,4-D + 5 µM de cinetina (T20), 5 µM de 2,4-D + 5 µM de cinetina (T15), 5 µM de 2,4-D + 0 µM de cinetina (T11) e 20 µM de 2,4-D + 0,5 µM de cinetina (T22). Os calos desenvolvidos nesses tratamentos tiveram crescimento médio superior a 1,0 cm. Esses resultados estão de acordo com Liu et al (2008), que constatou em seus experimentos com Eremochoa ophiuroides Hack, a eficiência de altas concentrações de 2,4-D na indução de calos. Porém, Oliveira et al (2007) não observaram formação de calos em seus experimentos com Mimosa Caesalpineaefolia em presença de 2,4-D. Os resultados menos expressivos para a variável crescimento de calos, foram observados nas concentrações: 1 µm de 2,4-D + 5 µM de cinetina (T5), 20 µM de 2,4-D + 5 µM de cinetina (T25), 1 µM de 2,4-D + 2,5 µM de cinetina (T4), 2,5 µM de 2,4-D + 5 µM de cinetina (T10), 5 µM de 2,4-D +0,5 µm de cinetina (T2), 1 µM de 2,4-D +0,5µM de cinetina (T12), 20 µM de 2,4-D + 2,5 µM de cinetina (T24), (Figura 2).

Figura 2: Análise da variável crescimento de calo nos diferentes tratamentos. (A) calos desenvolvidos nas concentrações dos tratamentos: T 21, T 19 e T 5, respectivamente. (B) calo desenvolvido em presença deT15, e (C) calos formados em presença de T16. (D) calos desenvolvidos em presença de T 21 e T 5; verificam-se ambos os tratamentos com três calos desenvolvidos. (E) calo formado em condição de T 24 e (F) comparação dos tamanhos de calos formados em condição de T 5 e T 15.

Os resultados do presente trabalho discordam, em parte, com

Grattapaglia & Machado (1990) e Ammirato (1983), que descreveram que a indução da calogênese ocorre em meio com altas concentrações de auxinas; uma vez que os resultados demonstraram que mesmo em concentrações pequenas (1 µM), a auxina foi capaz de induzir a formação de calos. Os resultados comprovaram que o ácido 2,4 – D é um dos reguladores de crescimento mais eficazes na indução de calos (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1990; AMMIRATO, 1983). Em cultura de tecidos de Tabebuia caraíba, a formação de calos foi favorecida quando explantes foliares foram encubados em meio MS suplementado com 1,0 mg.L-1 de ácido 2,4 – D e 0,2 mg.L-1 de cinetina (LIMA & CAETANO, 2002), indicando que há uma resposta favorável ao

A B C

D E F

crescimento e desenvolvimentos de calo em concentrações superiores de auxina em relação às citocininas.

Para as variáveis friabilidade e oxidação, níveis variados de oxidação foram observados nos calos provenientes de diferentes concentrações dos reguladores de crescimento, contrariando, em parte, Durand-Cresswell et al., (1982) que afirmam em suas pesquisas que cultivos mantidos em baixa intensidade luminosa apresentam-se menos oxidados. Os calos formados nos protocolos em que as concentrações de ácido 2,4 – D e cinetina eram iguais, apresentaram-se friáveis, de fácil desagregação e coloração predominante branca. Concentrações altas de ácido 2,4 – D induziram formação de calos parcialmente ou totalmente oxidados, com maior resistência a manipulação e menos friáveis, apesar de Ramachandra & Ravishankar (2002) citarem que elevados níveis desta auxina no meio diminui a formação de metabólitos secundários em algumas culturas. Giri et al (1993), no entanto, afirmam que a presença de ácido 2,4 – D no meio de cultura está associado a uma maior oxidação do tecido. Nos tratamentos onde a concentração de ácido 2,4 – D foi superior à concentração de cinetina foi observado maior número de calos totalmente oxidados, de coloração predominantemente escura e de difícil desagregação. Concentrações mais elevadas de cinetina em relação ao ácido 2,4 – D também induziram formação de calos oxidados e de difícil desagregação (Figura 3 e 4).

Figura 3: Análise da variável oxidação e friabilidade . (A) calo formado em presença de T 5. A coloração mais escura indica maior nível de oxidação e menor friabilidade. (B) calo formado em presença de T4. (C) calo formado em presença de T19. (D) calo formado em presença de T15.

A B

C D

y = 0,0255x2 - 0,5823x + 6,5R2 = 0,4484

0

1

2

3

4

5

6

00:00

00:00

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00:00

Relação 2,4-D / Cinetina

Nív

el d

e O

xida

ção

Figura 4: Análise do nível de oxidação dos calos de E. grandis. Nível de oxidação variando de 1 a 5, (1) calo não oxidado, (3) calo parcialmente oxidado e (5) calo totalmente oxidado. Pelos resultados analisados foi possível avaliar, ainda, que nos meios de cultura suplementados com elevadas concentrações de 2,4-D, uma percentagem de calos rizogênicos foi observada (Figura 5). Os Tratamentos T6 (2,5 µM.L-1 de 2,4-D + 0 µM.L-1 de cinetina), T8 (2,5 µM.L-1 de 2,4-D + 1 µM.L-1 de cinetina), T 16 (10 µM.L-1 de 2,4-D + 0 µM.L-1 de cinetina) e T 23 (20 µM.L-1 de 2,4-D + 1 µM.L-1 de cinetina) apresentaram raízes durante a calogênese. Este resultado está de acordo com Moura et al (2001), que verifiaram em suas pesquisas a eficiência da citocinina na indução de raízes.

y = -0,0714x2 + 1,1857x - 1,4R2 = 0,902

00,51

1,52

2,53

3,54

00:00 00:00 00:00 00:00 00:00 00:00 00:00 00:00 00:00Relação 2,4-D / Cinetina

Núm

ero

de c

alos

rizo

gêni

cos

Figura 5: Análise da característica presença de raiz.

20/0 10/0 5/0 2,5/0 1/0 20/0,5 20/1 10/1 20/2,5 5/1 10/2,5 2,5/1 1/0,5 1/1 2/5 1/2,5 1/5

0/0 1/1 2,5/1 2,5/0 10/0 20/1

O melhor resultado para a calogênese, em E. grandis foi observado nos tratamento com concentrações iguais de 2,4-D e cinetina (T3, T9, T15). Os calos desenvolvidos nesses tratamentos apresentaram-se bem desenvolvidos, friáveis, e menos oxidados. Segundo Ponchia & Gardiman (1993), o uso associado de uma citocinina e uma auxina pode levar a bons resultados de multiplicação. Para Carvalho et al (2006) a intensidade de calejamento e a textura do calo são os parâmetros que devem ser usados na escolha de um tratamento objetivando a organogênese em eucalipto.

CONCLUSÕES

Cinetina e Ácido 2,4 - diclorofenoxiacético são eficientes reguladores de crescimento para a formação e desenvolvimento de calos de Eucalyptus grandis; sendo a concentração de 1/1, a melhor concentração para a obtenção de calos friáveis e pouco oxidados para a espécie estudada.

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