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CAMILA DE FÁTIMA CARVALHO BRITO
PAPEL DA CICLOOXIGENASE-1 NO CHOQUE ENDOTÓXICO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Imunologia do Instituto
de Ciências Biomédicas da Universidade de
São Paulo, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
São Paulo 2017
CAMILA DE FÁTIMA CARVALHO BRITO
PAPEL DA CICLOOXIGENASE-1 NO CHOQUE ENDOTÓXICO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Imunologia do Instituto
de Ciências Biomédicas da Universidade de
São Paulo, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
Área de concentração: Imunologia
Orientador: Prof. Dr. Alexandre A. Steiner
Versão original
São Paulo 2017
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
___________________________________________________________________
Candidato (a): Camila de Fátima Carvalho Brito
Título da Dissertação: Papel da ciclooxigenase-1 no choque endotóxico
Orientador: Prof. Dr. Alexandre A. Steiner
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em
sessão pública realizada a .............../.............../..............., considerou
( ) Aprovado (a) ( ) Reprovado (a)
Examinador (a): Assinatura: .....................................................................................
Nome: ............................................................................................
Instituição:......................................................................................
Examinador (a): Assinatura: .....................................................................................
Nome: ............................................................................................
Instituição:......................................................................................
Examinador (a): Assinatura: .....................................................................................
Nome: ............................................................................................
Instituição:......................................................................................
Presidente: Assinatura:......................................................................................
Nome: ............................................................................................
Instituição:......................................................................................
Ao meu Deus, que se preocupa com
todos os detalhes da minha vida e
porque sem Ele eu nada seria...
Dedico este trabalho aos meus pais, Carlos e Thate, pelo amor incondicional, pela
proteção sem limites e pela doação irrestrita. À vocês que são minhas referências e
meu sustento a todo momento, meus amores, minha eterna gratidão!
AGRADECIMENTOS
À Deus, pelo dom da vida, pelo amor infinito e por ter me permitido concluir
mais essa etapa, sempre guiando meus passos, minhas escolhas e me mantendo
de pé diante das dificuldades
Minha eterna gratidão ao Professor Alexandre Steiner por todo apoio e
paciência, por ter acreditado em mim até quando eu mesma não acreditei. Por ter
me recebido de braços abertos em seu laboratório desde o primeiro contato que
fizemos, por ter me ajudado quando cheguei a São Paulo, pelas conversas nas
várias vezes que tentei desistir, por toda paciência quando cometia erros nos
experimentos e por enxergar potencial acadêmico em mim. Professor, o senhor foi
fundamental no meu crescimento pessoal e acadêmico, obrigada por ter me dado a
oportunidade e o suporte necessário para encarar e conseguir finalizar esse período
difícil, porém engrandecedor. Obrigada pelas palavras de incentivo, pelos
ensinamentos acadêmicos, pela preocupação com meu bem-estar. Muito obrigada!
Agradecer à minha família é pouco diante de tudo que fizeram por mim. Sou
grata pela família unida que tenho, pelo apoio dos meus pais, pelo amor, proteção,
dedicação e por estarem à postos sempre e a qualquer hora que eu precisar. Por
terem me ensinado que não importa o quão longe fisicamente estamos, mas sim o
quão unidos somos. Obrigada por me apoiarem a cada vez que decido sair da minha
zona de conforto e por fazerem das minhas decisões as suas, mesmo que isso seja
difícil. Obrigada por todo o suporte financeiro nestes anos, mas acima de tudo pelo
amor sem limites. Amo vocês para sempre!
Às minhas duas lindas irmãs, Alzira e Estella, por sempre fazerem de mim um
bom exemplo e por sempre serem as primeiras pessoas que torcem por mim.
Obrigada pelas conversas nos momentos de desânimo, por terem aberto mão de
qualquer conforto por mim nesse tempo em que estive em São Paulo, por serem as
amigas que sempre poderei contar. Obrigada pela confiança, amor e irmandade.
Amo vocês duas!
Ao paizinho, Francisco, e à mãezinha, Alzira (in memorian), porque mesmo
não sendo alfabetizados trabalharam duro e com dignidade pela educação dos
filhos, o que reflete também na minha educação. E obrigada também aos meus avós
paternos Olavo (in memorian) e Isabel.
Não poderia deixar de agradecer à todas as pessoas que estiveram comigo
nesse período, em especial à Elizabeth Flatow, que foi essencial desde a minha
chegada em São Paulo, que me ajudou tanto dentro do laboratório (me ensinou a
maioria das técnicas que eu precisava) como fora do laboratório (pela acolhida na
própria casa e pela amizade). Obrigada Beth por tudo e obrigada também ao Júnior
e até à Olívia. Agradeço às meninas do laboratório: Evilin Komegae (pela
colaboração no meu trabalho) e Monique Fonseca (pela alegria que anima o
laboratório), à Bianca e aos mais novos integrantes, Jady Tamaio (pela ajuda com
os RT-PCR) e Eduardo.
Sou infinitamente grata aos amigos e amigas que também me ajudaram a
ultrapassar as dificuldades e me proporcionaram bons momentos. À minha amiga
Íris Sousa, que esteve comigo desde o início, sempre disposta a ouvir minhas
reclamações, a acalmar meu coração, a aliviar meu desespero e a me ajudar a
continuar, agradeço a Deus pela tua amizade e espero que estejamos sempre
juntas. Agradeço também à minha amiga-irmã Leana Bruna, por sempre me mostrar
que amizades podem sim ser para sempre, pelos conselhos e por sempre torcer por
mim. Agradeço ainda ao meu amigo Antônio, por sempre acreditar em mim. Ao meu
amigo Mouzarllem, pelas palavras de conforto sempre que eu ligava desesperada,
obrigada meu bem por sempre ter me ouvido e aconselhado. Sou muito grata
também por esse período aqui em São Paulo, pois me proporcionou conhecer a
Nayane, uma pessoa iluminada e que quero ter sempre por perto. Obrigada Nayane,
por tudo que compartilhamos juntas, pelo ano que moramos juntas e que aliviou a
angústia dos dias difíceis, pelos conselhos, pela ajuda nos momentos difíceis, pelas
vezes que o pânico tomou conta de mim e tu estavas por perto (ou mais ou menos
por perto, mas veio imediatamente até mim). Obrigada pela amizade, pelos consolos
e pelos sorrisos. Obrigada também ao André Carvalho por ter compartilhado o dia a
dia comigo e ajudado sempre que foi preciso.
Agradeço também à tia Neusa e ao Mauricinho, que sempre estiveram à
postos para tudo que precisei aqui em São Paulo. Obrigada pelo apoio e carinho
sempre.
Agradeço ainda à todas as pessoas que me abriram as portas pra chegar até
aqui: ao meu orientador de Iniciação Científica Jand-Venes, que foi o primeiro a me
dar oportunidade de entrar na pesquisa, aos meus amigos do meu primeiro
laboratório de pesquisa LAFFEX e à Universidade Federal do Piauí, em especial a
todos que fizeram da Biomedicina um curso melhor e à todos os professores
responsáveis pela minha formação.
À minha banca de qualificação: Prof. Dr. Marcelo Muscará, Profa. Dra. Maria
Camila Almeida e Dr. Luciano Filgueiras, por todos os comentários e críticas que me
ajudaram a encontrar meus pontos fracos e estudar para superá-los.
Ao Prof. Dr. Norberto Lopes (FMRP-USP) pela colaboração nos experimentos
de lipidômica.
Aos professores e demais funcionários do departamento de Imunologia.
Obrigada à todos!
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
bolsa concedida.
“Que você cresça para ser justo
Que você cresça para ser verdadeiro
Que você sempre saiba a verdade
E veja as luzes ao seu redor
Que você seja sempre corajoso
Fique em pé e seja forte
Que suas mãos estejam sempre ocupadas
Que seus pés sejam sempre rápidos
Que você tenha uma base forte
Quando os ventos das mudanças voltarem
Que o seu coração seja sempre feliz
Que sua canção seja sempre cantada
Que você fique jovem para sempre”
Bob Dylan
RESUMO
Brito CFC. Papel da ciclooxigenase-1 no choque endotóxico. [dissertação (Mestrado em Imunologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 2017.
As ciclooxigenases têm um papel fundamental na patogênese da sepse, em especial
a isoforma COX-2. No entanto, apesar de o papel da isoforma “constitutiva” COX-1
ter sido negligenciado, evidências recentes indicam que esta isoforma participa em
respostas induzidas por altas doses de lipopolissacarídeo bacterano. Este trabalho
visou elucidar os mecanismos pelos quais a COX-1 participa da inflamação
sistêmica mais grave. Propomos que a fonte principal da COX-1 nesta condição é o
baço e testaremos se os prostanoides derivados dessa isoforma medeiam
alterações termometabólicas e cardiovasculares de modo dependente de citocinas.
Essa hipótese foi testada em ratos empregando o modelo de choque endotóxico.
Para avaliar os efeitos da COX-1 durante a inflamação sistêmica, utilizamos seu
inibidor seletivo (SC-560). O SC-560 atenuou a hipotermia, o hipometabolismo,
acidose metabólica e hipotensão induzidos por LPS (1000 µg/kg i.v.). Este efeito
atenuante teve duas fases: 30-60 min e 60-100 min. Em animais esplenectomizados,
a resposta atenuante do SC-560 na hipotermia, hipotensão e acidose metabólica foi
observada somente na primeira fase da resposta. Associado a esses resultados, o
SC-560 não alterou o nível plasmático das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 nas duas
fases da resposta. No entanto, diminuiu a expressão tecidual de IL-10 no baço e
observou-se uma tendência a aumento de IL-1β, mas não alterou o nível das
citocinas no fígado, diencéfalo e pulmão. Detectamos LTB4 no plasma, enquanto
PGE2, PGD2, PGF2, TXB2 e LTC4 foram detectados no baço. Nossos resultados
indicam que o mecanismo de ação da COX-1 no choque endotóxico tem duas fases
distintas: (i) na fase inicial da resposta a COX-1 envolvida não é proveniente do baço
e age de forma independente de citocinas; na fase tardia da resposta a COX-1
parece agir de forma dependente do baço e através da produção de prostanoides,
tais como PGE2 e PGD2 ou de leucotrienos, como LTC4, e esta ação pode depender
de efeitos locais de citocinas IL-10 e IL-1β.
.
Palavras-chave: COX-1. Inflamação Sistêmica. Hipotermia. Eicosanoides.
ABSTRACT
Brito CFC. The role of cyclooxygenase-1 during endotoxic shock. [Masters thesis (Immunology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 2016.
Cyclooxygenases play a key role in the pathogenesis of sepsis, especially the COX-2
isoform. However, although the role of the "constitutive" COX-1 isoform has been
neglected, recent evidence indicates that this isoform participates in responses
induced by high doses of bacterial lipopolysaccharide. This work aimed to elucidate
the mechanisms by which COX-1 participates in the most severe systemic
inflammation. We propose that the main source of COX-1 in this condition is the
spleen and we will test whether prostanoids derived from this isoform mediate
thermometabolic and cardiovascular changes in a cytokine-dependent manner. This
hypothesis was tested in rats employing the endotoxic shock model. To evaluate the
effects of COX-1 during systemic inflammation, we used its selective inhibitor (SC-
560). SC-560 attenuated hypothermia, hypometabolism, metabolic acidosis and
hypotension induced by LPS (1000 μg/kg i.v.). This attenuating effect had two
phases: 30-60 min and 60-100 min. In splenectomized animals, the attenuating
response of SC-560 to hypothermia, hypotension and metabolic acidosis was
observed only in the first phase of the response. Associated with these results, SC-
560 did not alter the plasma levels of cytokines TNF-α, IL-1β and IL-10 in the two
phases of the response. However, tissue expression of IL-10 in the spleen decreased
and IL-1β increased, but did not alter the level of cytokines in the liver, diencephalon
and lung. We detected LTB4 in plasma, while PGE2, PGD2, PGF2α, TXB2 and LTC4
were detected in the spleen. Our results indicate that the mechanism of action of
COX-1 in endotoxic shock has two distinct phases: (i) in the initial phase of the COX-
1 response involved it does not originate from the spleen and acts independently of
cytokines; (ii) in the late phase of the COX-1 response appears to act in a spleen
dependent manner and through the production of prostanoids, such as PGE2 and
PGD2 or of leukotrienes, such as LTC4, and this action may depend on local effects
of IL-10 and IL-1β cytokines.
Keywords: COX-1. Systemic Inflammation. Hypothermia. Eicosanoid
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Histórico do entendimento da patogênese da sepse. Figura 2 – Cascata de produção dos prostanoides a partir do AA e alguns efeitos principais desses prostanoides na inflamação sistêmica. Figura 3 – Contorno dos locais ativos das enzimas COX-1 e COX-2. São mostradas as superfícies acessíveis das isoformas com resíduos de aminoácidos circundantes importantes. Figura 4 – Possível envolvimento da isoforma COX-1 na promoção da hipotermia durante o choque endotóxico. Figura 5 – Representação esquemática do cronograma do experimento para avaliação dos efeitos da SC560 sobre as respostas termorregulatórias, metabólicas e cardiovaculares em animais submetidos ao modelo de inflamação sistêmica induzida por LPS. Figura 6 – Representação do modelo experimental onde o animal recebendo salina ou leptina s.c. é desafiado com LPS i.v. de maneira não estressante a uma temperatura ambiente controlada. As cubas experimentais ficam sobre um receptor de sinal telemétrico. Figura 7 – Tempo de coagulação dos grupos veículo e SC-560 como índice de inibição da COX-1. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 8 – Efeitos do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta termometabólica em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 9 – Efeitos do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta de acidose metabólica em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 10 – Efeitos do SC-560 (5 mg/kg i.p.) sobre os parâmetros cardiovasculares pressão sistólica e pressão diastólica, em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 11 – Efeitos do SC-560 (5 mg/kg i.p.) sobre os parâmetros cardiovasculares frequência cardíaca e contratilidade ventricular, em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 12 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. em combinação com o propranolol sobre a FC e a dPdt em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura
ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 13 - Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. em combinação com o propranolol sobre a Tc e o consumo de O2 em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 14 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. em combinação com o propranolol sobre a resposta cardiovascular em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 15 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta termorregulatória de animais não tratados e tratados com propranolol injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. Figura 16 – Efeitos da esplenectomia na resposta termorregulatória em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 17 – Efeitos da esplenectomia na pressão arterial média em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 18 – Efeitos do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta termometabólica em animais esplenectomizados injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 19 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta termorregulatória de animais com e sem esplenectomia injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. Figura 20 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta cardiovascular em animais esplenectomizados injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05. Figura 21 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta cardiovascular de animais com e sem esplenectomia injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. Figura 22 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta metabólica em animais esplenectomizados injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05.
Figura 23 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a acidose metabólica em animais com e sem esplenectomia injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. Figura 24 – Expressão do mRNA das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 dosado em amostras de fígado coletados 80 min depois da administração intravenosa de LPS (1000 µg/kg) de animais pré-tratados com o SC-560 ou seu veículo a uma Ta de 22 °C. Figura 25 – Expressão do mRNA das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 dosado em amostras de pulmão coletados 80 min depois da administração intravenosa de LPS (1000 µg/kg) de animais pré-tratados com o SC-560 ou seu veículo a uma Ta de 22 °C. Figura 26 – Expressão do mRNA das citocinas TNF-α, IL-1 e IL-10 dosado em amostras de diencéfalo coletadas 80 min depois da administração intravenosa de LPS (1000 µg/kg) de animais pré-tratados com o SC-560 ou seu veículo a uma Ta de 22 °C. Figura 27 – Expressão do mRNA das citocinas TNF-α, IL-1 e IL-10 dosado em amostras de baço coletados 80 min depois da administração intravenosa de LPS (1000 µg/kg) de animais pré-tratados com o SC-560 ou seu veículo a uma Ta de 22 °C.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Critérios diagnósticos para SIRS e sepse Tabela 2 – Sumário de prostanoides e seus efeitos fisiológicos nos principais sistemas e órgãos. Tabela 3 – Visão clássica das principais diferenças entre COX-1 e COX-2. Tabela 4 - Concentrações plasmáticas de TNF-α (A) e IL-1β (B) nos tempos de 30 e 80 min após a injeção de LPS. Tabela 5 - Concentrações plasmáticas (0,1 – 50 ng/mL) de eicosanoides nos tempos de 30 e 80 min após a injeção de LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. *P <0,05.
Tabela 6 - Concentrações de eicosanoides no baço (0,1 – 50 ng/mL) nos tempos de 30 e 80 min após a injeção de LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. *P <0,05. Tabela 7 - Concentrações de eicosanoides no cérebro (0,1 – 50 ng/mL) nos tempos de 30 e 80 min após a injeção de LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. *P <0,05.
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – Ácido Araquidônico
AINEs – Anti-inflamatório Não-Esteroidais
ANOVA – Análise de Variância
APA – Amplitude do Pulso de Pressão
bpm – batimentos por minuto
BHT – Butylated Hydroxytoluene
COXs – ciclooxigenases
COX-1 – ciclooxigenase-1
COX-2 – ciclooxigenase-2
COX-3 – ciclooxigenase-3
CYP – Citocromo p450
COXIBEs – Selective Cyclooxygenase 2 Inhibitors
DAMPs – Padrão Molecular Associado a Danos
DMH – Hipotálamo Dorsomedial
DC – Débito Cardíaco
dPdt máx – Contratilidade Ventricular máxima
E. coli – Escherichia coli
ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FC – Frequência Cardíaca
H-PGDS – Hematopoietic Prostaglandin D Synthase
IL-1β – Interleucina 1 beta
IL-6 – Interleucina 6
IL-10 – Interleucina 10
i.c.v – intracerebroventricular
i.v – intravenoso
i.p – intraperitoneal
LPS – lipopolissacarídeo
LTs – Leucotrienos
LOX – Lipooxigenase
L-PGDS – Lipocalin-type prostaglandin D2 synthase
LC-MS – Cromatografia Líquida com detecção por Espectrometria de Massas
LTB4 – Leucotrieno B4
mPGES-1 – PGE-1 sintase microssomal
mmHg – milímetro de mercúrio
NLRC4 – Ice-protease activating factor
NS-398 – inibidor da COX-2
O2 – Oxigênio
PA – Pressão Arterial
PGs – Prostaglandinas
PAMPs – Padrão Molecular Associado a Patógenos
PLA2 – Fosfolipase A2
PGG2 – Prostaglandina G2
PGH2 – Prostaglandina H2
PGE2 – Prostaglandina E2
PGD2 – Prostaglandina D2
PGF2α – Prostaglandina F2α
PGI2 – Prostaglandina I2
PGDS – Sintase PGD
PAM – Pressão Arterial Média
RRPs – Receptores de Reconhecimento de Padrões
mRNA – RNA mensageiro
RVS – Resistência Vascular Sistêmica
RER – Respiratory Exchange Ratio
SNC – Sistema Nervoso Central
SIRS – Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica
SC-560 – inibidor seletivo COX-1
SC-236 – inibidor seletivo COX-2
s.c. – subcutâneo
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ................................................................ 21
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................23
2.1 SIRS, SEPSE E CHOQUE SÉPTICO: CONCEITOS E EPIDEMIOLOGIA ................................ 23
2.2 SEPSE: PATOGÊNESE E TERAPIA ............................................................................ 25
2.3 MEDIADORES INFLAMATÓRIOS NA SEPSE: PAPEL DAS CITOCINAS E EICOSANOIDES ...... 27
2.4 BIOQUÍMICA DAS CICLOOXIGENASES .......................................................................... 32
2.5 CICLOOXIGENASES...................................................................................................33
2.6 CICLOOXIGENASES NA INFLAMAÇÃO SISTÊMICA: PARTICIPAÇÃO DA COX-1 .................... 35
2.7 HIPOTERMIA NA SEPSE: CONCEITOS E MECANISMOS.....................................................38
2.8 ALTERAÇÕES CARDIOVASCULARES...........................................................................42
2.9 ACIDOSE NA SEPSE..................................................................................................44
3 OBJETIVOS ................................................................................................... 47
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………………...……….47
4. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 48
4.1 APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA ........................................................................... 48
4.2 ALOJAMENTO DOS ANIMAIS E EUTANÁSIA.....................................................................48
4.3 PREPARAÇÃO CIRÚRGICA PARA INSERÇÃO DE CATETER VENOSO E SENSOR DE
TELEMETRIA PARA TEMPERATURA, PRESSÃO ARTERIAL E ATIVIDADE EM RATOS ................ 48
4.4 ESPLENECTOMIA......................................................................................................49
4.5 CUIDADOS PÓS-CIRÚRGICOS ................................................................................... 50
4.6 SISTEMA EXPERIMENTAL – INDUÇÃO DA INFLAMAÇÃO SISTÊMICA ............................... 50
4.7 FÁRMACOS ............................................................................................................ 51
4.8 MEDIDAS FISIOLÓGICAS ........................................................................................... 52
4.9 TESTE DA COAGULAÇÃO ........................................................................................... 53
4.10 COLETA DE SANGUE E ÓRGÃOS ................................................................................ 54
4.11 DOSAGEM DE CITOCINAS ........................................................................................ 54
4.12 RT-PCR ............................................................................................................. 55
4.13 DOSAGEM DE PROSTANOIDES..................................................................................57
4.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................... 57
5 RESULTADOS ................................................................................................ 59
5.1 MEDIDA DA ATIVIDADE FUNCIONAL DA COX-1 NOS EXPERIMENTOS FISIOLÓGICOS ..... 59
5.2 EFEITO DO INIBIDOR DA COX-1 NA RESPOSTA TERMOMETABÓLICA ............................ 60
5.3 EFEITO DO INIBIDOR DA COX-1 NA RESPOSTA CARDIOVASCULAR .............................. 63
5.4 EFEITO DA ESPLENECTOMIA COM E SEM A INIBIÇÃO DA COX-1 NAS RESPOSTAS
FISIOLÓGICAS DURANTE O CHOQUE ENDOTÓXIVO............................................................ 73
5.5 EFEITO DA INIBIÇÃO DA COX-1 SOBRE O PERFIL DE CITOCINAS CIRCULANTES ............ 82
5.6 EFEITO DA INIBIÇÃO DA COX-1 SOBRE O PERFIL DE CITOCINAS ÓRGÃO-ESPECÍFICAS .. 83
5.7 EFEITO DA INIBIÇÃO DE COX-1 SOBRE O PERFIL DE MEDIADORES LIPÍDICOS ............... 86
6 DISCUSSÃO .................................................................................................. 90
7 CONCLUSÃO……………………………………………………………………...103
REFERÊNCIAS ........................................................................................ …104
21
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A inflamação sistêmica decorrente de infecção (sepse) é uma das principais
causas de morte em pacientes hospitalizados (1-3). Apesar dos avanços científicos
e tecnológicos da medicina atualmente, como o desenvolvimento de terapias anti-
inflamatórias e antibacteriana, a incidência de sepse continua aumentando (4),
tornando evidente que a luta contra a sepse possa ser altamente dependente dos
próprios mecanismos de defesa do organismo.
A patogênese desta síndrome envolve uma ativação aguda de células do
sistema imune, tais como neutrófilos e macrófagos. Os macrófagos, particularmente,
secretam mediadores solúveis tais como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α),
interleucina 1β (IL-1β) e interleucina 6 (IL-6) que, por sua vez, agem no sistema
nervoso central (SNC) e perifericamente culminando em alterações na fisiologia da
temperatura corporal (Tc), taxa metabólica, pressão arterial (PA) e frequência
cardíaca. A febre é a manifestação mais comum da sepse (90% dos pacientes) (5) e
é entendida como uma estratégia de defesa do organismo em resposta a infecção,
entretanto, a queda da pressão arterial e a virada de febre para hipotermia
caracterizam os casos mais graves de sepse (6).
Na patogênese da sepse, além das citocinas, os mediadores lipídicos
derivados do ácido araquidônico por ação das enzimas ciclooxigenases (COXs),
dentre eles as prostaglandinas (PGs), têm recebido atenção significativa ao longo
dos anos por seus papéis na mediação das respostas inflamatórias (7). O foco das
investigações tem estado nas prostaglandinas derivadas da isoforma induzível da
ciclooxigenase, a COX-2, por ser caracteristicamente expressa por células
envolvidas em processos inflamatórios (8). Até pouco tempo atrás, acreditava-se
que a COX-1, isoforma constitutiva, não estivesse envolvida na inflamação (9). No
entanto, dados recentes apontam que a COX-1 pode ser tão ou mais importante que
a COX-2 nos casos mais graves de inflamação sistêmica (10).
O foco deste trabalho é avançar mecanísticamente preenchendo as lacunas
do conhecimento acerca da participação da COX-1 na inflamação sistêmica grave
empregando o modelo de choque endotóxico, o qual a administração intravenosa de
preparações de lipopolissacarídeo bacteriano em animais de laboratório é
22
comumente utilizada para induzir respostas termometabólicas e cardiovasculares
associadas com inflamação sistêmica.
23
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 SIRS, Sepse e Choque séptico: Conceitos e epidemiologia
A Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS) é um estado
inflamatório sistêmico manifestado por pelo menos dois dos seguintes critérios: (i)
temperatura corporal ˃ 38 °C ou ˂ 36 °C; frequência cardíaca ˃ 90 batimentos/min;
(iii) taxa respiratória ˃ 20 respirações/min ou PaCO2 ˃ 32 mmHg e (iv) contagem de
leucócitos ˃ 12.000 ou ˂ 4.000 células/mm3 no sangue ou ˃10% as formas imaturas
(11).
O conceito de SIRS foi introduzido em 1992 pelo “American College of Chest
Physicians” e pela “Society of Critical Care Medicine” e, rapidamente, tornou-se
referência na diagnose da sepse. Mais recentemente, tal conceito vem recebendo
críticas por ser pouco discriminativo, uma vez que os critérios da SIRS são
geralmente atendidos frente a uma gripe ou uma pneumonia mais forte. Uma nova
definição foi apresentada em 2015 no “Third International Consensus Definitions for
Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3)”. Trata-se de um novo consenso internacional
sobre critérios diagnósticos para sepse e choque séptico. Ele foi desenvolvido
pela “Society of Critical Care Medicine” e a “European Society of Intensive Care
Medicine”, justificadas pela necessidade de uma melhor definição baseada nos
avanços para melhorar os critérios diagnósticos da sepse (12). Na nova definição, o
uso da palavra sepse seria restrito aos pacientes já com disfunção orgânica. No
entanto, a Sepsis-3 apresentou problemas quanto a sua aceitação, uma vez que tal
conceito prejudica o diagnóstico precoce já que, de acordo com o consenso, a sepse
somente ocorre quando há disfunção de órgãos causada por uma resposta
desregulada do hospedeiro a uma infecção, excluindo o conceito de sepse sem
disfunção de órgão. Em virtude disso, existe risco de desvalorização dos critérios de
SIRS como parte da estratégia de triagem para suspeição precoce da presença de
infecção. Uma parte do esforço atual no combate à síndrome baseia-se no
diagnóstico precoce. Os pacientes devem ser reconhecidos em fase precoce e não
somente quando a disfunção já estiver instalada. Por conta dessa limitação, a
definição de SIRS cunhada em 1992 continua sendo amplamente utilizada, sendo a
sepse definida como uma síndrome caracterizada por sintomas e sinais da SIRS
24
secundária a um processo infeccioso e quando ocorrem manifestações de disfunção
de órgãos resultantes de alterações na microcirculação caracteriza-se a sepse
grave (13). Por sua vez, o choque séptico foi definido como a sepse acompanhada
por hipotensão que é refratária à administração de fluidos cristaloides (11, 14, 15)
(Tabela 1).
Tabela 1 – Critérios diagnósticos para SIRS e sepse
Adaptado de Dellinger et al. e Angus e van der Poll. Abreviações: SIRS, síndrome da resposta inflamatória sistêmica; Tc, temperatura corporal; bpm, batimentos por minuto; PaO2, pressão arterial de oxigênio; FiO2, fração inspirada de oxigênio; SD, desvio padrão.
SIRS
Parâmetros gerais
Febre (Tc > 38,3 ºC) Hipotermia (Tc < 36,0 ºC) Taquicardia (> 90 bpm em adultos) Taquipnéia Confusão mental Edema (> 20 mL/kg e, 24 h) Hiperglicemia na ausência de diabetes Hemograma Leucocitose (> 12.000 leucócitos/ mm3) Leucopenia (< 4.000 leucócitos/mm3) Excesso de formas imaturas (> 10%) Marcadores inflamatórios séricos Proteína C reativa (> 2 SD acima do normal) Procalcitonina (> 2 SD acima do normal)
Sepse
SIRS associada à infecção Infecção suspeita ou documentada
Sepse grave
Sepse com um ou mais dos seguintes: Lactato sérico acima do normal Oligúria (< 0,5 mL/h por mais de 2 h) Disfunção pulmonar (PaO2/FiO2 < 250 mmHg) Creatinina sérica > 2 mg/dL Bilirrubina sérica > 2 mg/dL Trombocitopenia (> 100.00 plaquetas/µL) Parálise intestinal Coagulopatia
Choque séptico
Sepse com hipotensão refratária a cristaloides Pressão sistólica < 90 mmHg Pressão média < 70 mmHg Queda de pressão > 40 mmHg em adultos
25
A sepse e o choque séptico têm sido reconhecidos cada vez mais como
sérios problemas clínicos responsáveis por morbidade e mortalidade substanciais
(16). Nos Estados Unidos, admissões por sepse têm ultrapassado as admissões por
infarto do miocárdio e acidente vascular encefálico. A taxa de incidência de sepse é
de até 535 casos por 100.000 pessoas/ano e está aumentando. A mortalidade intra-
hospitalar permanece alta entre 25%-30% (17). Os custos hospitalares associados à
sepse são altíssimos: mais de US$ 16 bilhões por ano nos EUA (18, 19). Esses
gastos têm íntima relação com a gravidade e o tempo de internação. Apesar disso, a
taxa de mortalidade permanece estagnada entre 30 e 40%, podendo chegar a 70%
em subpopulações com casos mais graves de sepse (18, 20).
Por sua vez, no Brasil, a sepse é a síndrome geradora de maiores custos
aos setores de saúde públicos e privados do país, e a média da incidência de sepse
nas UTIs brasileiras é de 57 por 1000 pacientes/dia, sendo a taxa de mortalidade de
pacientes com sepse, sepse grave e choque séptico de 33,9%, 46,9% e 52,2%,
respectivamente (21).
2.2 Sepse: patogênese e terapia
A resposta inflamatória é um processo fisiológico que protege o organismo
contra infecções e participa do reparo tecidual após uma injúria traumática (22). Os
mesmos mecanismos que normalmente protegem os indivíduos das infecções e que
eliminam os agentes estranhos também são capazes de provocar lesão tecidual,
especialmente quando a resposta inflamatória é prolongada e exacerbada.
A sepse tem como agentes etiológicos uma diversidade de vírus, bactérias e
fungos, porém, a grande maioria dos casos de sepse está associada a infecções
bacterianas, sendo que cerca de 60% dos casos identificaram bactérias gram-
negativas como os principais agentes, embora bactérias gram-positivas também
sejam descritas (20, 23). Correspondentemente, o agente mais empregado para a
indução de inflamação sistêmica em animais experimentais tem sido o LPS, uma
endotoxina que compõe a parede celular de bactérias Gram-negativas (24) e sua
administração intravenosa deu origem ao modelo de choque endotóxico.
É bem estabelecido que na patogênese da sepse ocorre uma ativação aguda
e sistêmica de respostas imunes devido à liberação de níveis muito elevados de
padrões moleculares associados a patógenos e a danos (PAMPs e DAMPs,
26
respectivamente), que leva a uma ativação intensa de células imunes através da
interação dos padrões moleculares com os Receptores de Reconhecimento de
Padrões (RRPs) presentes nas células (25). Como resultado, a sepse é associada a
uma forte resposta inflamatória que é essencial para o combate da infecção, porém
a intensidade da inflamação provoca efeitos colaterais ao organismo (26).
A patogênese da sepse foi inicialmente entendida, na década de 1980, como
sendo dependente da ação direta de toxinas microbianas sobre os tecidos do
hospedeiro. No entanto, essa ideia perdeu força frente à ideia de que a grande vilã
na sepse é a resposta inflamatória do próprio hospedeiro (Figura 1). Essa mudança
de concepção provavelmente teve início quando observações do grupo de Cerami et
al. (27) foram feitas, em que foi relatado que macrófagos ativados in vitro
secretavam um fator solúvel que era capaz de matar até mesmo camundongos
resistentes ao LPS. Dentre esses fatores encontrava-se o TNF-α que foi descrito
como um potente indutor de choque circulatório em animais experimentais (28).
Essas observações levaram ao desenvolvimento de terapias com uso de anti-
inflamatórios na sepse, no entanto, os estudos clínicos em que esses agentes foram
testados nos pacientes sépticos falharam (29). Diante desses fatos, surgiu outro
conceito com relação à patogênese da sepse, no qual o agente infeccioso com suas
toxinas passou a ser visto como algo tão importante quanto à resposta inflamatória
(Figura 1). De fato, muitos trabalhos têm demonstrado que enquanto a resposta
inflamatória é responsável pela mortalidade em modelos de SIRS asséptica, o
bloqueio da resposta inflamatória em modelos de SIRS séptica compromete o
controle da infecção (30-32).
27
Figura 1 – Histórico do entendimento da patogênese da sepse. A flexa com
ponta indica estimulação ou consequência. A “flecha” sem ponta denota eliminação. Adaptado de Steiner, AA 2015.
Em vista dessas dificuldades, a terapia moderna da sepse vai se limitando à
manutenção das funções cardiovasculares e respiratórias por meio de expansão
volêmica, administração de simpaticomiméticos e ventilação mecânica (11) (33).
Nesse contexto, se torna cada vez mais importante realizar investigações
mecanísticas acerca da patogênese da sepse, tanto do ponto de vista da resposta
inflamatória do hospedeiro ao agente infeccioso e suas toxinas, como da ação
nociva dos micro-organismos ao hospedeiro.
2.3 Mediadores inflamatórios na sepse: citocinas e eicosanoides
A descoberta de que mediadores inflamatórios - não só micro-organismos
invasores - estão envolvidos na patogênese da sepse, abriu um novo caminho para
a investigação de mecanismos patológicos da inflamação. Durante a infecção, a
detecção do micro-organismo invasor ou de produtos liberados desses patógenos,
como uma endotoxina, e a montagem de uma resposta imune vigorosa são
28
mediadas por uma cascata de mediadores inflamatórios, incluindo uma vasta gama
de citocinas e mediadores lipídicos (26).
O agente invasor e seus componentes desencadeiam uma resposta
inflamatória através da estimulação e ativação de células imunes e células
endoteliais que liberam uma variedade de mediadores solúveis. A magnitude desse
processo é regulada por fatores pró- e anti-inflamatórios. Em uma resposta
fisiológica do organismo, os mecanismos de amplificação da inflamação, tais como a
ação das citocinas TNF-α e a IL-1β e os mediadores de origem lipídica como as
PGs, tromboxanos (TXs) e leucotrienos, que estimulam uma intensa resposta
celular, são necessários para a eliminação do micro-organismo e, uma vez que a
infecção é combatida, fatores anti-inflamatórios, tais como as Interleucina 10 (IL-10),
Fator Transformador de Crescimento β (TGF-β) e os mediadores lipídicos lipoxinas,
resolvinas e protectinas têm um papel benéfico e eficiente na contenção dessa
resposta, atuando na fase de resolução. Entretanto, em si tratando de uma condição
patológica como é o caso da sepse, os mecanismos amplificadores da resposta
inflamatória não são tão finamente regulados, causando danos ao organismo, como
instabilidade hemodinâmica e distúrbios metabólicos (34, 35).
Dentre os mediadores liberados durante uma resposta inflamatória intensa
secundária a uma infecção, os mediadores lipídicos têm um papel de destaque. Os
eicosanoides são lipídeos sinalizadores bioativos derivados a partir do AA por ação
das enzimas Ciclooxigenases (COXs), Lipoxigenase (LOX) e Citocromo P450 que
regulam um conjunto diversificado de processos homeostáticos e inflamatórios
associados a numerosas doenças (36). Esses eicosanoides constituem uma rede
complexa de eventos fisiopatológicos, ao serem derivados de diferentes vias, que
podem apresentar atividade pró ou anti-inflamatória com papel fisiológico importante
(37). Neste trabalho, a via das ciclooxigenases é o nosso foco de investigação e,
portanto, a revisão se concentrará nesta via.
As enzimas ciclooxigenases têm um papel fisiológico importante na produção
de prostanoides, que incluem as PGs e os TXs, que são uma classe de compostos
com ações fisiológicas e patológicas produzidas por todos os tecidos dos mamíferos
(36). Essas enzimas catalisam as primeiras etapas na biossíntese dos prostanoides
a partir do substrato AA.
29
A biossíntese de prostanoides envolve a oxidação e subsequente
isomerização do AA derivado da membrana fosfolipíica via três reações enzimáticas
sequenciais. A etapa inicial desta via metabólica é a liberação do AA induzida por
estímulo (endotoxina, por exemplo) a partir da membrana fosfolipídica pela enzima
fosfolipase A2 (PLA2). O AA liberado é sequencialmente metabolizado à
prostaglandina G2 (PGG2) e então à PGH2 pelas enzimas ciclooxigenases 1 ou 2.
PGH2 é então convertida a vários prostanoides bioativos (TXA2, PGE2, PGD2, PGF2
e PGI2) pelos respectivos prostanoides sintases terminais, que têm diferentes
estruturas e exibem distribuições tecido e célula específicos (38). Ambas isoformas
da ciclooxigenase catalisam duas reações e possuem duas diferentes atividades. A
primeira reação catalisa a adição da molécula de oxigênio ao AA convertendo-o ao
endoperóxido intermediário PGG2, constituindo sua atividade “ciclooxigenase”. A
segunda reação catalisa a conversão de PGG2 em PGH2, constituindo sua atividade
“peroxidase” (39) (Figura 2).
Figura 2 – Cascata de produção dos prostanoides a partir do AA e alguns efeitos principais
desses prostanoides na inflamação sistêmica.
Existem duas isoformas de COXs bem conhecidas, a COX-1 e a COX-2, que
determinam diferentes funções fisiológicas no organismo. A COX-1 foi isolada em
1976 a partir da vesícula seminal de carneiros e é denominada isoforma constitutiva
30
da COX por apresentar funções fisiológicas, desempenhando uma função
“housekeeping” para sintetizar prostaglandinas que regulam atividade celular normal
do organismo. Sua ativação leva, por exemplo, à produção de mediadores com
ações anti-trombogênica (40), citoprotetora da mucosa gástrica (41) e de agregação
plaquetária que evita eventos hemorrágicos (42).
A isoforma COX-2, identificada quase 20 anos depois da COX-1 (43, 44), é
conhecida como sendo uma enzima induzida que está envolvida primariamente com
processos inflamatórios. O nível de COX-2 normalmente é muito baixo nas células,
mas é fortemente controlado por um número de fatores que incluem citocinas,
mensageiros intracelulares e pela disponibilidade de substrato. Assim, a síntese
aumentada de prostaglandina é alcançada na inflamação devido à up-regulação de
COX-2 por estímulos inflamatórios (45).
Alguns cientistas especulam ao longo dos anos, a possibilidade da existência
de uma terceira isoforma de COX (46-48). A inibição de uma enzima de COX distinta
pelo acetaminofeno (fraco inibidor de COX-1 e COX-2) foi postulada pela primeira
vez em 1972 (49), e poderia representar um mecanismo central primário pelo qual
acetaminofeno e possivelmente outros analgésicos diminuem a dor e a febre, sem
apresentar propriedades anti-inflamatórias efetivas. Em 2002, foi descoberta uma
variante da enzima de COX (46), que foi denominada COX-3, apesar de derivar do
mesmo gene que a COX-1. Esta variante de COX-1 foi descoberta no cérebro de
cães quando duas formas de RNA mensageiro (mRNA) para COX-1 foram
encontradas e a forma variante foi atribuída a um clone do gene da COX-1 com
splicing alternativo. Por conta do fato de ser derivada do mesmo gene da COX-1 e
das poucas evidências científicas dos efeitos dessa variante no organismo, a “COX-
3” foi vista como uma teoria sem evidência experimental e, por isso, alguns
comentários sugerem que esta nova variante de COX é melhor descrita como uma
COX-1b, ao invés de COX-3 (48).
O perfil de síntese de eicosanoides difere de um tipo celular para outro.
Dentre as células envolvidas na resposta imune, os macrófagos são importantes
produtores de eicosanoides (50), sendo capazes de sintetizar PGs e TXs. In vitro,
muitos estímulos, tais como cálcio ionóforo, zimozan, citocinas e endotoxinas,
aumentam a produção de eicosanoides. Os mastócitos também são capazes de
produzir eicosanoides, tais como PGD2, responsável por muitos efeitos
31
fisiopatológicos em condições como a asma (51). As plaquetas são ótimas
produtoras de tromboxanos, bem como as células endoteliais e do músculo liso
vascular produzem prostanoides com efeitos vasodilatadores e vasoconstritores.
Esses mediadores lipídicos podem iniciar, amplificar ou atenuar respostas
inflamatórias e influenciar a magnitude, duração e a natureza da resposta imune
subsequente (36).
Em geral, durante processos inflamatórios, os eicosanoides estão presentes e
atuam como moléculas próinflamatórias, quimioatraentes, fatores agregadores de
plaquetas, agentes de contração do músculo liso e modificadores da permeabilidade
vascular. As prostaglandinas atuam como mediadores próinflamatórios e anti-
inflamatórios dependendo do contexto, que é devido em parte aos diferentes
receptores com diferentes vias de transdução de sinais. Funcionalmente, as enzimas
COX-1 e COX-2 exibem propriedades fisiopatológicas associadas com diversas
manifestações nos sistemas cardiovascular, renal, pulmonar, cutânea, reprodutor e
sobre o Sistema Nervoso Central (SNC) (36). Esses prostanoides desempenham
papéis significantes em todos os principais sistemas do corpo (Tabela 2) (39).
Tabela 2 – Sumário de prostanoides e seus efeitos fisiológicos nos principais sistemas e
órgãos.
Sistema Mediador (es) Maior sítio Efeitos Primário (s) de síntese - Cardiovascular - Renal - Gastrointestinal - Hematológico - Respiratório - Reprodutivo - Neurológico
PGI2
TXA2
PGI2
PGE2
PGE2
PGI2
TXA2
PGI2
PGE2
PGF2α
PGE2
Célula endotelial Plaquetas Córtex renal Medula renal Mucosa gástrica Célula endotelial Plaquetas Célula endotelial Vesícula seminal Membrana fetal/ útero Área pré-ótica
Vasodilatação Vasoconstrição Vasodilatação Excreção de sal e água Citoproteção Vasodilatação Agregação plaquetária Vasodilatação Ereção, ejaculação, transporte de esperma Parto/menstruação, fertilização Febre, hiperalgesia
Adaptado de Miller, S. B, 2006.
32
2.4 Bioquímica das ciclooxigenases
A isoforma COX-1 apresenta 17 aminoácidos na porção terminal, enquanto a
COX-2 apresenta 18 aminoácidos na porção carboxi-terminal. Embora sejam muito
semelhantes na estrutura protéica, essas enzimas são codificadas por genes
diferentes. A COX-1 e a COX-2 têm aproximadamente 60% de homologia genética e
seus genes estão localizados nos cromossomos 9 e 1, respectivamente. O sítio ativo
da COX-2 é mais largo aproximadamente 27%. O sítio de ligação da COX-1
apresenta na posição 523 da cadeia protéica uma molécula de isoleucina, ao passo
que a COX-2 tem uma pequena molécula de valina (52). Essa mudança torna o sítio
de ligação da COX-2 mais largo e mais acessível (53) e esta diferença estrutural
explica a seletividade dos fármacos inibidores seletivos de COX-2 (coxibes), pois em
geral são fármacos de maior volume molecular (Figura 3).
Figura 3 – Contorno dos locais ativos das enzimas COX-1 e COX-2. São mostradas as superfícies acessíveis das isoformas com resíduos de aminoácidos circundantes
importantes. Simmons, D. L. et al.
33
Tem sido mostrado que a COX-1 está localizada no retículo endoplasmático e
membrana perinuclear, enquanto a COX-2 reside predominantemente no envelope
perinuclear: esta diferença pode influenciar a disponibilidade do AA liberado por
diferentes enzimas PLA2 para cada COX (38). É geralmente aceito que certas
enzimas PLA2 podem acoplar mais favoravelmente com uma isoforma de COX do
que com a outra. Por exemplo, PLA2 citosólica colocaliza com a COX-1, mas não
com a COX-2, no aparelho de Golgi de células epiteliais ativadas in vitro (54).
Portanto, a ativação de PLA2 citosólica pode dirigir o AA preferencialmente para
COX-1 do que para COX-2. Os mecanismos downstream a partir das COX
determinam quais prostanoides bioativos são formados (55).
Estudos recentes (56, 57) demonstraram que PGE-1 sintase microssomal
(mPGES-1) é a enzima responsável pela conversão de PGH2 em PGE2 febrigênica.
Esta enzima é funcional e preferencialmente acoplada com a COX-2 ao invés da
COX-1, presumivelmente porque tanto a COX-2 e mPGES-1 são principalmente
compartimentalizadas no envelope perinuclear (58). A up-regulação transcricional
maciça de mPGES-1 ocorre no decurso da febre induzida por LPS (56). As sintases
terminais envolvidas na hipotermia, uma manifestação clínica observada nos casos
mais graves de inflamação sistêmica e um parâmetro avaliado neste trabalho,
continuam a ser identificadas, mas, dada a capacidade de PGD2 para causar
hipotermia, pelo menos de acordo com alguns relatos (59), é razoável suspeitar que
uma sintase PGD (PGDS) possa estar envolvida. Enquanto a produção de PGD2
induzida por LPS no tecido neural parece ser dependente de COX-2 e L-PGDS (60),
a produção inicial de PGD2 por macrófagos e mastócitos ativados parece depender
da COX-1 e H-PGDS (61).
2.5 Ciclooxigenases
Como descrito anteriormente, cada isoforma de COX é codificada por um
gene. O gene da COX-1 exibe as características de um gene expresso
constitutivamente, um gene housekeeping. O gene da COX-2, por outro lado, é
expresso principalmente em resposta a vários fatores próinflamatórios, hormônios,
fatores de crescimento e oncogenes, e é inibido por glicocorticoides (39, 62).
Baseado no padrão da expressão do gene das isoformas de COXs, uma distinção
34
generalizada entre uma “isoforma constitutiva” e “fisiológica” (COX-1) e uma
“isoforma induzida” e “patológica” (COX-2) foi postulada, sendo a COX-1 uma
enzima expressa em muitos tecidos em condições basais e responsável pela
produção de prostanoides com funções fisiológicas e protetoras, ao passo que a
COX-2 foi considerada como sendo indetectável em muitos tecidos normais, mas
induzida durante várias condições inflamatórias, muitas delas patológicas (39)
(Tabela 3). Baseado nisto, a maioria dos estudos tem enfatizado o papel da COX-2
na patogênese de várias doenças inflamatórias e autoimunes (63).
Tabela 3 – Visão clássica das principais diferenças entre COX-1 e COX-2.
COX-1 COX-2
- Gene constitutivo localizado no cromossomo 9 humano; - RNA mensageiro estável; -Localização subcelular: retículo endoplasmático e membrana perinuclear; - Tamanho do sítio ativo: pequeno; - Enzima com propriedades fisiológicas;
- Gene induzível localizado no cromossomo 1 humano; - RNA mensageiro rapidamente degradável; - Localização subcelular: envelope perinuclear; - Tamanho do sítio ativo: largo; - Enzima com presente em processos inflamatórios/patológicos.
Essa divisão entre as funções biológicas das enzimas COX-1 e COX-2, como
isoforma fisiológica e patológica, respectivamente, acarretou em muitos estudos cujo
foco eram os prostanoides derivados da COX-2, em virtude das muitas ações
terapêuticas relacionadas a doenças inflamatórias, o que culminou no
desenvolvimento dos inibidores seletivos de COX-2, drogas disponíveis em muitos
países (63). De fato, existem inúmeras evidências da participação da COX-2 em
processos inflamatórios, demonstrado em várias condições experimentais (64), bem
como por ser uma enzima responsável pela síntese de mediadores envolvidos em
sinais de inflamação (65), por exemplo, na resposta febril, cujo PGE2 derivado da
COX-2 é o mediador chave (66), além de estar envolvida em patologias que incluem
35
doenças com fundo inflamatório, como artrite reumatoide (67). Ademais, é bem
estabelecida na inflamação sistêmica, em que estudos pioneiros demonstraram a
participação da COX-2 em modelos de sepse e choque endotóxico (68), como sendo
uma enzima de importância considerável para a indução de sinais inflamatórios
relevantes durante a sepse, como respostas termorregulatórias e hemodinâmicas,
participando, por exemplo, do desenvolvimento da falência circulatória em modelo
de choque endotóxico (69).
2.6 Ciclooxigenases na inflamação sistêmica: participação da COX-1
Uma vez que o foco das investigações tinha estado, sobretudo, nas
prostaglandinas derivadas da isoforma induzível COX-2, por ser caracteristicamente
expressa por células envolvidas em processos inflamatórios (8), como citado
anteriormente, acreditava-se, até então, que a COX-1 não estivesse envolvida na
inflamação e desempenhasse apenas um papel fisiológico (9). Entretanto, mais
recentemente, estudos in vivo têm chamado atenção para esse protótipo de divisão
de funções entre COX-1 e COX-2, demonstrando participação da COX-2 na
fisiologia renal e gástrica e contribuições da COX-1 para estados inflamatórios (70,
71). Dusan Stajer et al. (72), por exemplo, questionaram a distribuição das
ciclooxigenases em tecidos saudáveis e indicaram que ambas as isoformas estão
presentes em muitos tecidos humanos normais e ambas também são up-reguladas
em várias condições patológicas. Mais recentemente, Steiner et al. (10),
demonstraram em um trabalho pioneiro que a COX-1 é a isoforma requerida para o
desenvolvimento de hipotermia e hipotensão durante o choque endotóxico.
Nessa perspectiva, investigações recentes têm destacado o papel da enzima
COX-1 em processos inflamatórios (71) (10), contrário ao seu papel de enzima
fisiológica. Essa evidência foi demonstrada em um estudo inicial de Langenbach et
al. (73), que compararam as respostas inflamatórias de camundongos deficientes
para a COX-1 e COX-2. Nesse estudo eles usaram AA para induzir o edema na
orelha de camundongos como uma medida do processo inflamatório. Nos animais
deficientes para COX-1, mas não para a COX-2, o edema induzido por AA foi 70%
menor, quando comparado ao grupo de animais controles. Estes achados indicam
36
que a inflamação aguda em resposta ao AA resulta primariamente da síntese de
PGs via COX-1.
Na mesma linha de raciocínio, um estudo recente (74) evidenciou a
participação da COX-1 em modelo de mortalidade por endotoxemia. Eles
monitoraram a sobrevivência de camundongos tratados com o inibidor da COX-1
(SC-560) e que foram desafiados com um primer [poly (I:C)] seguido da
administração de LPS (100 ng/kg). Foi demonstrado que o inibidor da COX-1, neste
modelo, resgatou os camundongos da letalidade induzida por LPS.
Interessantemente, Moltke et al. (75) demonstraram que a ativação do
inflamassoma resulta, dentro de minutos, em uma tempestade de eicosanoides e
que camundongos deficientes em COX-1 são resistentes a estes rápidos efeitos
patológicos de ativação do inflamassoma sistêmico pelo produto resultante da fusão
da flagelina de Legionella pneumophila com um fator letal de Bacillus anthracis
(FlaTox). Demonstraram que macrófagos peritoneiais residentes são as células
produtoras de eicosanoides em resposta à ativação do inflamassoma e através de
um experimento de lipidômica por cromatografia líquida com detecção por
espectrometria de massas (LC-MS) detectaram a produção de vários eicosanoides
(TXA2, PGD2, PGE2, 12-HETE, 15-HETE, LTB4) 30 minutos após estímulo dessas
células com FlaTox. Neste modelo, eles sugerem que a ativação da caspase-1
dependente do inflamassoma NLRC4 (ICE-protease activating fator) desencadeia
produção letal de eicosanoides via COX-1.
Ainda nesse sentido de que a COX-1 participa de processos inflamatórios, um
resultado inesperado foi encontrado em um estudo do nosso grupo (10)
demonstrando que um inibidor seletivo da COX-1, o SC-560, não afetou a febre
induzida por uma dose baixa ou alta de LPS (10 e 1000 µg/kg) a uma temperatura
ambiente (Ta) de 30 ºC, mas atenuou de forma significativa a hipotermia induzida
pela dose alta de LPS a uma Ta de 22 ºC (10). O SC-560 também atenuou a
hipotensão induzida pela alta dose do LPS. O fato de que a hipotermia e a
hipotensão estão associadas aos casos mais graves de sepse juntamente com o
achado de que o inibidor seletivo da COX-1 atenuou essas duas respostas induzidas
pela alta dose de LPS, levanta uma questão em relação ao papel biológico das
isoformas de COX na sepse e, portanto, sugere a participação da COX-1 na
inflamação sistêmica.
37
Esse mesmo estudo também (10) mostrou que, no momento mais inicial das
respostas hipotérmica e hipotensiva, a atividade da COX-1 permanece inalterada no
fígado, nos rins, nos pulmões e no cérebro, porém, está aumentada no baço. No
entanto, estes resultados são indiretos no que se refere ao envolvimento da COX-1
esplênica no desenvolvimento de hipotermia em vez de febre. Até o momento, não
há descrição do efeito da esplenectomia sobre o componente hipotérmico da
resposta inflamatória sistêmica. No entanto, um estudo (76) demonstrou que um
extrato de baço rico em mediadores lipídicos (que pode incluir os produtos da COX-
1) é capaz de atenuar a febre em ratos esplenectomizados, mas nesses estudos não
se demonstrou que o mesmo extrato seja capaz de promover hipotermia. Esta
limitação, no entanto, abre caminho para investigar se a COX-1 esplênica é a
isoforma que participa das alterações termorregulatórias e hemodinâmicas que
ocorrem no choque endotóxico e por qual mecanismo esta enzima atua para o
desenvolvimento dessas respostas, tais como qual (is) mediador (es) lipídico (s) é
produzido (s) de modo dependente de COX-1 e como este (s) mediador (es) atua
(m).
Uma visão clássica e limitante do entendimento da dinâmica de processos
inflamatórios é classificar os mediadores inflamatórios em ordem temporal e
hierárquica, como ordenar as citocinas como um dos primeiros mediadores a serem
produzidos em processos inflamatórios e, a partir delas, a síntese de outros
mediadores, classificados como secundários (por exemplo, os mediadores lipídicos),
serem estimulados. Entretanto, alguns estudos têm questionado esse conceito e
demonstrado que outros mediadores, como os mediadores lipídicos, também têm
um papel regulatório sobre a produção de citocinas e participam de respostas
inflamatórias iniciais.
A primeira evidência de que prostaglandinas participavam do controle da
produção de citocinas surgiu com estudos sobre a Síndrome de Reye, um grupo
heterogêneo de desordens causadas por agentes tóxicos, metabólicos e infecciosos,
em que o uso de aspirina é considerado potencialmente perigoso. Em um estudo
inicial foi observado que culturas de linfócitos esplênicos de ratos tratados com
aspirina apresentavam um efeito hiperproliferativo e que esse efeito foi revertido
quando adicionava-se PGE2 (77). Um estudo subsequente mostrou que o TNF-α tem
efeitos tóxicos e metabólicos nesta síndrome e que níveis aumentados de TNF-α
38
são liberados por macrófagos tratados com drogas anti-inflamatórias não esteroidais
(AINES), tais como aspirina (78). Juntos, esses resultados sugerem um papel
inibitório de prostaglandinas sobre a produção de citocinas, como já demonstrado
em outros trabalhos em que PGE2 produzida via COX-2 inibe a síntese de TNF-α em
macrófagos, além de apresentar efeitos inibitórios sobre a liberação de TNF-α e IL-
12 por esplenócitos e células T (79). Alguns trabalhos também mostraram que 15-
desoxi-D12,14PGJ2 (15d-PGJ2), metabólito da PGD2, tem um efeito inibitório na
expressão de citocinas pró-inflamatórias produzidas por monócitos e macrófagos
ativados (80-82).
Apesar das evidências apresentadas sobre a participação da COX-1 em
modelos de inflamação, ainda são poucos os estudos que tratam da relação entre a
isoforma COX-1 e que estudem os mecanismos de ação de seus mediadores
derivados com o desenvolvimento de respostas fisiológicas características de
choque séptico e, portanto, este trabalho visa investigar os mecanismos pelos quais
a COX-1 atua no desenvolvimento de hipotermia e hipotensão no choque
endotóxico.
2.7 Hipotermia na sepse: conceitos e mecanismos
A capacidade do organismo em regular a temperatura corporal (Tc) é
essencial para a homeostase. A febre, por exemplo, é uma resposta de fase aguda
não-específica de defesa do hospedeiro e é um sintoma comum de infeção e
inflamação sistêmica, sendo associada com melhora da sobrevivência e redução na
duração da doença em infecções (83), além de já ser bem estabelecida a relação
entre a febre e a potencialização do sistema imune (84-87), o que faz da febre uma
resposta fisiológica benéfica e relevante à proteção do organismo. Por outro lado,
quando prolongada pode ser prejudicial à saúde do hospedeiro, uma vez que
elevada Tc pode produzir desidratação, sobrecarga cardiorrespiratória e balanço
nutritivo negativo (88, 89).
Em 1971, Vane et al. (90) encontrou que drogas anti-inflamatórias não
esteroidais bloqueiam a febre por inibir a síntese de PGs, e desde então tem sido
aceito que a febre é mediada por PGs, especificamente por PGE2. A ativação da
síntese de PGE2 envolve a up-regulação transcricional da COX-2 (55, 91). Várias
39
linhas de evidência indicam que a COX-2, mais que a COX-1, tem um papel
importante na biossíntese de PGE2 durante a febre. Um estudo mostrou que um
inibidor específico da COX-2 (NS398) bloqueou a febre bem como a elevação da
PGE2 no cérebro em resposta a injeção intraperitoneal de LPS. Outro trabalho
demonstrou que camundongos deficientes do gene da COX-2, ao contrário de
camundongos deficientes no gene da COX-1, não desenvolveram febre à injeção
sistêmica de LPS (92).
Apesar de a febre ser um sintoma característico de sepse, estudos clínicos
iniciais reportaram que cerca de 9-21% de pacientes sépticos, principalmente
aqueles com sepse grave e choque séptico, apresentam hipotermia (Tc < 35,5 ºC),
outra alteração termorregulatória da sepse. Entretanto, essa porcentagem se referia
à observação dos pacientes no momento da admissão, enquanto um estudo do
nosso laboratório (93) reportou 31,2% de pacientes apresentando algum episódio de
hipotermia não somente no tempo de diagnóstico da sepse, mas durante toda a
internação.
O que se sabe é que a febre prevalece sobre a hipotermia quando a
inflamação sistêmica é menos grave. Por outro lado, os 31,2% dos pacientes
sépticos que desenvolvem hipotermia apresentam quadros de inflamação
sistêmica mais grave. Em vista dessas evidências e tendo em vista o papel
imunológico da febre na sepse, o argumento proposto é que a febre seria uma
resposta benéfica, enquanto a hipotermia seria maléfica e o desenvolvimento de
hipotermia em vez de febre implicaria que a hipotermia estaria piorando o quadro
séptico.
No entanto, estudos em animais experimentais mostraram que a hipotermia é
uma estratégia de conservação de energia (94), e pode ter um valor adaptativo
quando a inflamação sistêmica é grave o suficiente para comprometer a perfusão
tecidual (95) ou quando as reservas de energia são ameaçadas pelo custo
energético da febre (96).
No sentindo de quebrar o paradigma de que a hipotermia estaria piorando a
sepse, Liu et al. (97) demonstraram que o desenvolvimento de hipotermia em vez de
febre ocorre naturalmente e está associado a uma redução na taxa de mortalidade,
além de suprimir a endotoxemia em ratos injetados com E. coli, uma vez que a
infiltração neutrofílica no pulmão foi suprimida nos animais que desenvolveram
40
hipotermia durante o choque séptico. Estes efeitos potencialmente benéficos vieram
com custos, pois nos animais do grupo hipotérmico houve aumento da carga
bacteriana no fígado. Além disso, as respostas hipotensivas ao LPS ou E. coli foram
exageradas nos ratos do grupo hipotérmico. Este exagero, no entanto, ocorreu
independentemente de alterações nas citocinas inflamatórias e prostaglandinas.
Apesar dos possíveis custos, o desenvolvimento de hipotermia diminuiu a disfunção
dos órgãos abdominais e reduziu as taxas de mortalidade global nos modelos de E.
coli e LPS, demonstrando que a virada de febre para hipotermia na sepse pode
retratar uma estratégia fisiológica para lidar com as exigências competitivas que
surgem nos casos mais graves da síndrome, portanto, questionando o real papel da
hipotermia durante a sepse.
Já é bem estabelecido que a Tc é regulada tanto por meios autonômicos
quanto comportamentais. Sabe-se que o desenvolvimento da febre é dependente do
sistema nervoso central, mais especificamente da área pré-óptica (98). Quanto ao
desenvolvimento de hipotermia, Almeida et al. (6) demonstraram que a resposta
hipotérmica também pode ter um componente central. Neste estudo, a inflamação
sistêmica foi induzida por injeção intravenosa de LPS em uma dose baixa, que induz
a febre, e uma dose alta capaz de induzir choque e hipotermia, para avaliar o efeito
de lesões em estruturas hipotalâmicas no comportamento termorregulatório dos
animais. A região do núcleo dorsomedial (DMH) lesado, inibiu o comportamento de
preferência pelo frio e o desenvolvimento da hipotermia, mas não afetou a febre.
Estas evidências sugerem, portanto, que ambas as respostas termorregulatórias
evoluíram paralelamente e não uma dependendo da outra.
Em contraste com os mecanismos imune-neurais febrigênicos já bem
conhecidos, os mecanismos imunes-neurais que desencadeiam o desenvolvimento
da hipotermia ainda são pouco esclarecidos. O que se sabe até então, é que o
mediador inflamatório TNF-α parece ser relevante para o desenvolvimento dessa
resposta, tanto no modelo de endotoxemia como no modelo de sepse induzida por
ligação cecal e perfuração. Um estudo demonstrou que (89) enquanto baixas doses
de TNF-α causam febre, doses intermediárias a altas causam hipotermia. Além
disso, outro estudo (99) demonstrou que camundongos nocautes para receptor de
TNF-α desenvolviam febre e uma hipotermia mínima durante a sepse, demonstrando
um possível papel do TNF-α como um mediador criogênico ou antipirético endógeno.
41
Diante desses fatos, pode ser que a hipotermia seja decorrente de uma amplificação
pró-inflamatória e não de uma ativação de mecanismos antipiréticos endógenos.
Como exemplo, tem-se que substâncias anti-inflamatórias como os glicocorticoides
limitam não só o desenvolvimento de febre, mas também o desenvolvimento de
hipotermia frente à inflamação sistêmica (100, 101).
Outro ponto relevante a ser mencionado é a participação de prostanoides em
respostas termorregulatórias. Como mencionado anteriormente sobre o papel chave
da PGE2 produzida via COX-2 na indução da febre, já existem algumas poucas
evidências do papel de mediadores lipídicos na promoção da hipotermia. Em um
trabalho ainda não publicado, mas apresentado em forma de resumo, foram
avaliadas as propriedades termorregulatórias dos prostanoides primários e de
alguns de seus produtos, todos administrados intravenosamente ligados à albumina.
A PGD2 e a PGI2 apresentaram atividade criogênica, porém, a hipotermia induzida
pela PGD2 foi a mais pronunciada e consistente. A propriedade criogênica da PGD2
foi inicialmente descrita por Ueno et al. (59) e, desde então, foi reproduzida algumas
vezes, inclusive em um estudo do nosso laboratório no qual a PGD2 foi administrada
intracerebroventricular (i.c.v) (102). Com base nessas evidências e no fato de que a
COX-1 participa do desenvolvimento da hipotermia em ratos enquanto encontra-se
notavelmente ativada no baço (10) durante o choque endotóxico, neste trabalho uma
das propostas é investigar se a COX-1 esplênica é a que medeia a resposta
hipotérmica e por meio de qual ou quais prostaglandinas atua no desenvolvimento
dessa resposta durante o choque endotóxico (Figura 4).
42
Figura 4 – Possível envolvimento da isoforma COX-1 na promoção da hipotermia durante o
choque endotóxico. Hipotetizamos que a produção inicial de PGD2 por macrófagos e mastócitos esplênicos ativados pode depender da COX-1 e esta prostaglandina atuar no
desenvolvimento da hipotermia. A flexa sem ponta detona inibição.
2.8 Alterações cardiovasculares na sepse
Uma das principais complicações na sepse é o choque séptico, um estado de
hipotensão refratária à administração endovenosa de fluidos cristaloides (11, 15). O
choque séptico inicia-se tipicamente por uma redução na pressão venosa central
consequente ao extravasamento de fluido para os tecidos, alteração que resulta em
quedas no débito cardíaco (DC) e na pressão arterial (PA) (103-105). Porém,
mediante a reposição agressiva de volume, o choque séptico em adultos geralmente
passa para um perfil hiperdinâmico, perfil em que a hipotensão se deve a uma baixa
resistência vascular sistêmica (RVS), enquanto o DC está normalizado ou
aumentado (106) (103).
O modelo mais estudado para avaliações hemodinâmicas no choque séptico
experimental é o modelo de choque endotóxico. Como na clínica, a hipotensão
nesse modelo reflete um estado hipovolêmico e hipodinâmico (DC baixo e
aumentada RVS) (107-109), porém, mediante a suplementação agressiva de volume
com fluidos cristaloides ou coloides, passa para um estado hiperdinâmico (DC
43
aumentado e RVS diminuída) (110-112). Nesse modelo, a hipotensão é derivada da
diminuição do DC e não da vasodilatação.
Vários estudos indicam a participação do TNF-α em alterações
hemodinânimas durante a sepse. O TNF-α leva a diminuição no débito cardíaco,
hipotensão e diminuída fração de ejeção como ocorre no choque séptico ou
endotóxico. Embora outras citocinas sejam implicadas no desenvolvimento da
síndrome do choque séptico, o TNF-α é um fator bem conhecido por iniciar sequelas
no complexo metabólico, hemodinâmico e patológico do choque séptico (113).
Os eicosanoides, tais como as PGs e TXs, também participam das alterações
circulatórias que ocorrem durante o choque séptico (114). Níveis elevados de PGI2
foram relatados em pacientes com choque séptico e em animais tratados com LPS.
Uma vez que a PGI2 é um potente vasodilatador, pode-se supor que este
prostanoide possa estar envolvido no desenvolvimento de choque séptico. Recentes
evidências sugerem que a isoforma COX-2 é a principal enzima responsável pelo
aumento da produção de PGI2 em células do músculo liso vascular. Com base nisto,
tem sido demonstrado que a inibição da COX-2 atenua a queda da pressão arterial
ou melhora a disfunção endotelial vascular em animais endotoxêmicos (69). Por
outro lado, um estudo demonstrou o papel de outro prostanoide com potente
atividade vasoconstritora, o TXA2, no desenvolvimento de injúria aguda renal. Sabe-
se que o tônus vascular renal tem importante papel no controle da pressão
sanguínea sistêmica e, portanto, alterações renais desencadeiam mudanças
hemodinâmicas na sepse. Foi sugerido que tal injúria renal acontece provavelmente
devido a um aumento na resistência arteriolar aferente, causado pelo efeito
vasoconstritor do TXA2 e que a formação desse mediador lipídico é dependente da
atividade da isoforma COX-1 (115). Ademais, muitos estudos já demonstraram a
participação de outros prostanoides, como PGE2 e PGI2 como potentes
vasodilatadores e, como consequência, essas prostaglandinas vasoativas
contribuem para o desenvolvimento de hipotensão durante o choque (116).
O choque circulatório também merece atenção por causa de sua associação
com hipotermia na endotoxemia experimental (97) (117, 118) bem como em casos
clínicos de sepse (118). De acordo com dados da literatura, embora a hipotermia e
hipotensão sejam temporariamente associadas e podem até ser acionados pelas
mesmas populações de células em órgãos periféricos, deve-se salientar que os seus
44
mecanismos podem não ser idênticos. Isto é evidente a partir da observação no
estudo de Steiner et al. (10) em que, embora tenham encontrado efeitos opostos da
inibição de COX-1 e COX-2 na hipotermia induzida por LPS em ratos, ambos os
fármacos inibidores (SC-560 e SC-236) atenuaram a hipotensão induzida por LPS.
O fato da inibição de COX-2 pelo SC-236 aumentar a hipotermia enquanto bloqueia
a hipotensão é de interesse, uma vez que torna mais forte a evidência que sugere
que a hipotermia não é uma consequência da hipoperfusão associada à hipotensão.
Os resultados desse estudo são também a primeira demonstração de que ambas
isoformas de COX são necessárias para o desenvolvimento da resposta hipotensora
em resposta ao LPS, mas já havia estudos mostrando que a COX-2 é necessária
para o desenvolvimento de hipotensão induzida pelo LPS (119, 120).
2.9 Acidose metabólica na sepse
A acidose metabólica é um processo patológico caracterizado por um
aumento na concentração de ácido no líquido extracelular. Normalmente, os
produtos de dissociação e de ionização estão em equilíbrio, como mostra a reação
1.
(Reação 1) H2 + HCO3- CO2 + H2O (Reação de Hasselbalch)
O metabolismo de gorduras e carboidratos origina CO2 e H2O. Ao observar a
reação de Hasselbalch, percebe-se que se o CO2 não fosse eliminado, a reação se
dirigiria no sentido de produção do ácido carbônico (HCO3-), que se dissociaria e
aumentaria a quantidade de H+ no organismo, resultando em acidose (Reação 2)
(121).
O real significado da acidose metabólica nos pacientes com sepse grave e
choque séptico ainda é incerto (122), mas a presença da acidose metabólica é
relacionada a maior mortalidade dos pacientes (123). Embora se reconheça que a
acidose ocorre em pacientes sépticos e pode até mesmo prever um resultado clínico
(124), a patogênese da acidose em estados inflamatórios é pouco entendida. Na
sepse clínica, a acidose tem muitas causas sobrepostas, que incluem não somente
a liberação metabólica de H+, mas também a administração de soluções eletrolíticas
bem como distúrbios respiratório e renal (124) (125). Experimentalmente, a
45
produção metabólica de H+ pode ser estudada na ausência de outros fatores
externos durante a fase inicial do choque endotóxico hipodinâmico, como é o caso
deste trabalho, em que usamos as medidas da produção de CO2 (VCO2) pelo
consumo de O2 (VO2) para obter o quociente de troca respiratória (RER), um índice
de troca respiratória utilizado como um correlato de acidose metabólica no choque
endotóxico, como indicado na fórmula abaixo:
(Reação 2) H2 + HCO3- CO2 + H2O, onde:
VCO2
VO2
É geralmente aceito que a acidose na fase inicial do choque endotóxico
resulta da produção anaeróbica de ácido láctico por tecidos hipoperfundidos (em
hipóxia), mas esta ideia tem sido contestada (126-128). Um estudo recente do nosso
laboratório propôs que a elevação na produção de H+ no choque endotóxico resulta
de alterações metabólicas não relacionadas ao metabolismo anaeróbico (129). A
partir dessa perspectiva, é importante salientar que o consumo de O2 do corpo
inteiro é conhecido por cair junto com a Tc interna no início do curso do choque
endotóxico em ratos não anestesiados. Recentemente, Corrigan et al. (108) mostrou
que, pelo menos em ratos, a resposta hipotérmica e hipometabólica ocorre quando
nem a entrega de O2 nem a função mitocondrial são prejudicadas a ponto de
comprometer o metabolismo aeróbico. Esse estudo revelou ainda que a queda no
consumo de oxigênio (VO2) ocorre preventivamente e em sincronia com a queda na
entrega de O2, assim prevenindo hipóxia tecidual. Nosso grupo investigou então, se
a produção de H+ poderia ser causada pela regulação negativa do VO2 e Tc que
ocorrem no choque endotóxico. Esta possibilidade foi rejeitada pelo fato de que a
acidose permaneceu inalterada quando a resposta hipotérmica e hipometabólica foi
permitida ou prevenida pela exposição a diferentes ambientes térmicos. Por último,
mas não menos importante, este estudo mostrou que a produção de H+ no choque
endotóxico é mais pronunciada quando a glicose, e não o lactato, é o substrato
predominante que alimenta o metabolismo aeróbio. Coletivamente, esses achados
RER (acidose metabólica)
46
indicam que o excesso de produção de H+ em ratos não anestesiados com choque
endotóxico resulta de uma ativação fásica da glicólise que ocorre
independentemente das alterações fisiológicas na oxidação mitocondrial e Tc.
Tendo em vista o complexo processo fisiológico e a necessidade de estudos
pormenorizados para condições de choque endotóxico implicando na participação
da enzima COX-1, nosso trabalho se propôs averiguar a influência desta enzima na
resposta inflamatória sistêmica grave por meio de avaliações dos componentes
termorregulatório, metabólico e cardiovascular, utilizando o modelo de choque
endotóxico em ratos.
47
3. OBJETIVOS
O objetivo do nosso trabalho foi investigar os mecanismos de participação da
isoforma COX-1 na inflamação sistêmica grave, como no caso de choque
endotóxico. Propomos que a fonte dessa COX-1 que participa do choque endotóxico
é o baço, e que o (s) prostanoide (s) derivado (s) dessa isoforma medeiam as
respostas termometabólicas e cardiovasculares de modo dependente de citocinas.
3.1 Objetivos Específicos
3.1.1. Estudar o efeito do inibidor seletivo da COX-1, em combinação com a
esplenectomia, sobre os seguintes parâmetros das respostas fisiológicas:
temperatura corporal (Tc), pressão arterial média (PAM), pressão sistólica (PS),
pressão diastólica (PD), frequência cardíaca (FC), contratilidade do miocárdio (dP/dt
max), consumo de O2 (VO2) e quociente de troca respiratória (RER), durante o
choque endotóxico.
3.1.2. Verificar se a inibição seletiva da enzima COX-1 reduz a produção de
citocinas na circulação de animais injetados com LPS. As citocinas de interesse
incluem TNF-α, IL-1β e IL-10.
3.1.3. Testar como a inibição da enzima COX-1 afeta a produção de prostanoides
produzidos no baço, no cérebro e na circulação de animais injetados com LPS. Além
das prostaglandinas, também investigar se a inibição da COX-1 altera o nível de
leucotrienos.
48
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Aprovação no Comitê de Ética
A pesquisa foi realizada no âmbito do protocolo número 015, folha 029, livro
03 aprovado pelo Comité de Ética do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo (São Paulo, Brasil). Todos os procedimentos estavam
em conformidade com as resoluções do Conselho Nacional para o Controle de
Experimentação Animal (CONCEA) e o Guia dos EUA para o Cuidado e Uso de
Animais de Laboratório (2011).
4.2 Alojamento dos animais e eutanásia
Foram utilizados ratos Wistar machos (peso médio 300 g) provenientes do
Biotério Central do Instituto de Ciências Biomédicas. Os animais foram
acondicionados em caixas com maravalha (2 ou 3 animais/caixa) com água e ração
disponível em sala com temperatura média de 26 °C e ciclo de claro/escuro
(12:12h). Após o procedimento cirúrgico até o final do experimento, cada rato ficou
em caixa individual. Todos os animais foram manuseados diariamente. Cada rato foi
sacrificado com uma superdose de tiopental sódico (100 mg/kg, i.v) imediatamente
após o fim dos experimentos.
4.3 Preparação cirúrgica para inserção de cateter venoso e sensor de telemetria para temperatura, pressão arterial e atividade em ratos
Sete dias antes do experimento (Figura 5), os ratos receberam implante de
um cateter intravenoso para administração de LPS. Os animais foram anestesiados
por sistema a gás contendo 5% de isoflurano em 1 L/min de oxigênio e mantidos em
mesa cirúrgica com temperatura controlada e anestésico (2-2,5% de isoflurano em 1
L/min de oxigênio). No início da cirurgia receberam o antibiótico Enrofloxacina (5
mg/kg s.c.) e o anti-inflamatório analgésico Cetoprofeno (5 mg/kg s.c.) ao final do
procedimento. Uma incisão longitudinal foi feita na região ventral esquerda do
pescoço. A veia jugular foi exposta para implantação de cateter de poliuretano (BPU-
T30, Instech Solomon, Plymouth, PA, EUA) até a veia cava superior. O cateter foi
49
fixado por meio de suturas à veia jugular e exteriorizado pela nuca e preenchido por
solução de glicerol heparinizado 500 U/mL (lock solution) para evitar coagulação
sanguínea e entupimento.
No mesmo procedimento, foi inserido um sensor de telemetria necessário
para o monitoramento da Tc, pressão arterial e atividade locomotora (modelo
TL11M2C50-PT, Data Sciences International, St. Paul, MN, EUA). Para isso, uma
laparotomia foi realizada e os músculos da cavidade abdominal separados. A parte
abdominal da artéria aorta foi exposta, e o fluxo sanguíneo foi interrompido
temporariamente (< 90 segundos) para implantação do cateter do sensor. Após
implantação, utilizamos adesivo tissular (Histoacryl, B Braun Surgical, Rubí,
Espanha) para selar a artéria. O fluxo sanguíneo foi, então, restabelecido. A cápsula
do sensor foi suturada à porção ventral da cavidade abdominal e o abdome fechado
por sutura em camadas (músculo e pele).
Os animais ficaram em câmara com temperatura ajustada para 27 ºC para
recuperação da cirurgia por 24 horas.
Figura 5 – Representação esquemática do cronograma do experimento para avaliação dos efeitos da SC560 sobre as respostas termorregulatórias, metabólicas e cardiovaculares em animais submetidos ao modelo de
inflamação sistêmica induzida por LPS.
4.4 Esplenectomia
Para a remoção do baço, uma incisão lateral de 3 cm subcostal foi feita no
lado esquerdo. Esta abordagem facilita a remoção do omento maior do quadrante
superior esquerdo e deixa o estômago deslocado para longe do baço. O baço foi
levantado suavemente, pelo seu polo inferior com auxílio de uma pinça sem corte. O
50
ligamento gastroesplênico foi deprimido, os ligamentos frenocólico e esplenocólico
foram dissecados e todos os vasos foram ligados por sutura. O baço foi, então,
removido da cavidade abdominal. No mesmo procedimento, esses animais foram
implantados com um cateter venoso e um sensor telemétrico como descrito na
sessão 3.4 (preparação cirúrgica).
4.5 Cuidados pós-cirúrgicos
Os animais receberam o antibiótico Enrofloxacina (5 mg/kg s.c.) e o anti-
inflamatório analgésico Cetoprofeno (5 mg/kg s.c.) no primeiro dia pós-cirurgia. O
cateter de poliuretano foi lavado com solução salina e preenchido novamente com
solução de glicerol heparinizado 500 U/mL nos primeiro e sexto dias pós-cirurgia.
4.6 Sistema experimental – Indução da inflamação sistêmica
Às 7 horas do dia do experimento, aos cateteres intravenosos dos animais
saindo pela nuca foram conectados a extensões de polietileno (BPE-T50, Instech
Solomon, Plymouth, PA, EUA) de 0,1 mL e 0,3 mL preenchidas de solução salina
0,9% e conectadas a uma seringa de 1 mL. Em cada animal foi vestido uma jaqueta
contendo uma mola de metal (CIH105 Covance Infusion Harness, Instech Solomon,
Plymouth, PA, EUA) para proteger o cateter de mordidas. A extensão menor do
cateter saindo pela mola foi conectada à parte inferior do swivel (Instech Solomon,
Plymouth, PA, EUA) preso a um braço móvel conectado às cubas experimentais. A
extensão maior saiu da parte superior do swivel para o exterior da câmara. Cada
cuba experimental contendo um animal foi colocada sobre um receptor de sinal de
frequência de rádio dentro da câmara climática (Environmental Growth Chambers,
Chagrin Falls, OH, EUA). A temperatura ambiente foi ajustada para 22 °C (Figura 6).
51
Figura 6 – Representação do modelo experimental onde o animal recebe SC-560 ou seu veículo i.p. e é desafiado com LPS i.v. de maneira não estressante a uma
temperatura ambiente controlada. As cubas experimentais ficam sobre um receptor de sinal telemétrico.
4.7 Fármacos
Para indução da inflamação sistêmica utilizamos lipopolissacarídeo de
Escherichia coli cepa 055:B5 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). O LPS foi diluído
em salina estéril numa concentração de 5 mg/mL e congelado a -80ºC dias antes do
experimento. No dia do experimento, foi descongelado, ressuspenso em salina
estéril até a concentração de 1000 µg/mL (dose de 1 mL/kg) e mantido a
temperatura ambiente até o momento de injeção. O LPS foi administrado pelas
extensões dos cateteres “em bolo” seguida de 0,6 mL de solução salina.
Para avaliar o efeito da isoforma COX-1 utilizamos seu inibidor seletivo, o SC-
560. O SC-560 foi dissolvido em etanol e propileno glicol (40%-60%) a uma
concentração final de 5 mg/mL. Esta solução foi dividida em alíquotas armazenadas
a -80 ºC até o dia do experimento. A dose de SC-560 administrada via
intraperitoneal foi de 5 mg/kg. A esta dose in vivo o SC-560 inibe ao máximo a COX-
1, sem afetar a COX-2 (130). Os animais do grupo controle receberam o veículo
52
etanol e propileno glicol na mesma proporção. A administração do SC-560 e do
veículo foi feita uma hora e meia antes da injeção de LPS, a fim de evitar estresse
causado pela injeção intraperitoneal antes da administração de LPS.
Para verificar se o efeito do SC-560 sobre a resposta termorregulatória é
devido à simpatoexcitação cardíaca seletiva utilizamos o beta-bloqueador
Propranolol. O propranolol foi dissolvido em salina a uma concentração final de 10
mg/kg, dose de ataque que foi administrada por via intravenosa. Após a dose de
ataque (10 mg/kg), os animais foram infundidos intravenosamente com o propranolol
a uma velocidade de 0,1 mL/h em uma concentração de 5 mg/kg em um volume de
1 mL.
4.8 Medidas fisiológicas
A temperatura corporal, atividade locomotora e pressão arterial foram
monitoradas telemetricamente através do sinal emitido pelo sensor implantado na
cavidade abdominal e recebido pelo receptor de sinal sob as cubas experimentais
ligados ao software de aquisição da Data Sciences International. Os dados foram
adquiridos em modo contínuo e posteriormente processados pelo Ponemah. Às
mesmas cubas foi ligado o sistema de medição de taxa metabólica. Um índice da
produção metabólica de calor baseado na produção de dióxido de carbono e
consumo de oxigênio foi medido. A produção de CO2 (V̇CO2) e o consumo de O2
(V̇O2) foram medidos por respirometria em sistema aberto usando o equipamento da
Sable Systems (Las Vegas, NV, USA). A cuba experimental foi feita de acrílico e tem
um volume de 5 litros. O furo na tampa serviu para entrada de ar; conectores de
mangueira nas laterais da cuba servem para a saída de ar. O ar é removido pelos
conectores laterais a uma taxa de ~1,700 mL/min (111) com a ajuda de uma bomba
ajustável acoplada a um controlador de fluxo de massa (unidade SSA). O ar foi
desumidificado por uma coluna de Drierite antes de entrar na bomba. O ar de saída
da cuba contendo o rato (ar expirado) e o da caixa vazia (ar inspirado) foram
medidos sequencialmente em intervalos de 5 minutos e analisados para a fração de
O2 e CO2, com a ajuda de um canal multiplex e um analisador FOXBOX. As saídas
analógicas do controlador de fluxo de massa (dados de fluxo de ar) e do analisador
de gás foram convertidas para o digital pela interface de aquisição de dados UI-2 e
53
adquirida em um computador usando o software Expedata. Nestas condições
experimentais, a fração de O2 do rato dentro da cuba não caiu abaixo de 19,5%,
enquanto a fração de CO2 não caiu abaixo de 0,4%.
Os dados da telemetria e respirometria foram coletados desde o início do
experimento até 240 minutos pós-injeção.
Parâmetros derivados
V̇CO2 e V̇O2 (em ml/kg/min) foram calculados a partir das frações de gás no
ar inspirado (FiCO2 ou FiO2) e o ar expirado (FeCO2 ou FeO2), tendo em conta o
fluxo de ar (Q, em ml/min) e a massa corporal do animal (MC, em kg ). As equações
1 e 2 foram utilizadas para contabilizar os volumes desiguais de CO2 e O2 . VCO2 foi
dividido por VO2 para obter o quociente de troca respiratória (RER), índice de troca
respiratória utilizado como um correlato de acidose metabólica no choque
endotóxico.
V̇CO2 = Q̇ [(FeCO2 FiCO2) + FiCO2 (FiO2 FeO2)] / (1 + FiCO2) / MC (eq. 1)
VO2 = Q̇ [(FiO2 FeO2) + FiO2 (FiCO2 FeCO2)] / (1 FiO2) / MC (eq. 2)
4.9 Teste da Coagulação
O Tempo de Coagulação (TC) mede o tempo necessário para que o sangue
coagule “in vitro”. Esse teste da coagulação foi pensado baseado em dados da
literatura demonstrando que a formação de TXA2 derivado de plaquetas é um
fenômeno estabelecidamente mediado por COX-1 e não por COX-2 (115). Desse
modo, esse teste foi uma medida indireta do índice de inibição da COX-1 pelo SC-
560.
Após cada experimento, os animais foram anestesiados com 20 µL de
tiopental sódico (100 mg/mL i.v) e uma gota de sangue foi coletada da cauda do
animal. A gota de sangue de aproximadamente 5 mm foi colocada em uma lâmina
de vidro e imediatamente foi marcado o tempo inicial. Com uma agulha de calibre 26
G foram feitos movimentos no sangue para observar a formação do fio do coágulo,
momento de marcação final do tempo. O TC normal pode variar de 1 a 4 minutos.
54
4.10 Coleta de sangue e órgãos
Para verificar o efeito da inibição da COX-1 em resposta ao estímulo de
produção de mediadores inflamatórios induzidos por LPS, coletamos sangue para
obtenção de plasma e coletamos os seguintes órgãos: baço, fígado, pulmão e
cérebro. Trinta e oitenta minutos após injeção de LPS 1000 µg/kg i.v., os animais
foram anestesiados com 50 µL de tiopental sódico (100 mg/mL i.v) e o sangue foi
coletado pela veia cava inferior em tubos contendo heparina sódica 30 UI,
indometacina 50 µM e BHT 0,005% para cada mL de sangue. Os tubos foram
centrifugados (10 minutos, 4000 rpm, 4 °C) e o plasma congelado a -80 °C.
Após a coleta de sangue pela veia cava inferior, o coração do rato foi exposto
e o ventrículo esquerdo foi acessado com uma agulha acoplada ao cateter que foi
inserida até a artéria aorta. No átrio direito foi feito um corte. Todo o animal foi
perfundido pela artéria aorta com aproximadamente 200 mL de solução salina,
indometacina 50 µM e BHT 0,005% a 4 °C por 5 minutos. Imediatamente após
perfusão, os órgãos foram removidos, imersos em nitrogênio líquido e congelados
no freezer a -80 °C.
4.11 Dosagem de citocinas
O plasma coletado trinta e oitenta minutos após a injeção de LPS foi
descongelado a 4 °C e utilizado para a detecção das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10
através de ensaio imunoenzimático (ELISA sandwich) padronizado. Para isto, o
anticorpo de captura (1º Ac) foi diluído em PBS, plaqueado 100 µL/poço e incubado
overnight à temperatura ambiente. O excesso de anticorpo foi removido através de
lavagem com PBS Tween (PBST) 3 vezes. No sentido de evitar ligações
inespecíficas, o bloqueio da placa foi feito com PBS 1% BSA (300 µL/poço) e
incubação por 1 hora à temperatura ambiente. As amostras ou a curva padrão
diluída seriadamente (100 µL/poço) foi adicionada após lavagens com PBST e
incubadas por 2 horas à temperatura ambiente. O anticorpo de detecção (2º Ac) foi
adicionado e após 2 horas de incubação e lavagens com PBST a Streptoavidina –
HRP foi adicionada por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. A adição da
55
solução substrato permite uma reação colorimétrica capaz de ser detectada em
espectrofotômetro a 450 nm.
4.12 RT- PCR
A quantificação dos níveis de mRNA das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 foi
feita por PCR em tempo real. Órgãos como baço, fígado, pulmão e cérebro foram
coletados no tempo de 80 min pós-LPS (como descrito acima). Em adição às
amostras de ratos tratados com veículo e SC-560 seguidos da injeção de LPS,
amostras de ratos não tratados foram coletadas e usadas como referência para
calcular valores de expressão relativa.
Extração do RNA
O RNA total foi isolado dos tecidos usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Adiciona-se 1 mL do reagente para a homogeneização. A seguir, adiciona-se 200 μL
de clorofórmio para separação das fases, agita-se no vortex por 15 segundos e
incuba à temperatura ambiente durante 2 a 3 minutos. Os eppendorfs são então
centrifugados a 12.000 G durante 15 minutos à temperatura de 4 °C. Após este
procedimento se obtém a separação do RNA, DNA e das proteínas. Após a
centrifugação, formam-se 3 camadas, uma sedimentada, uma interfase e uma fase
aquosa superior incolor. O RNA permanece exclusivamente na fase superior
aquosa. Transferir a fase aquosa superior com cuidado, sem perturbar a interfase no
tubo fresco. O RNA é então separado em novo eppendorf adicionando 500 μL de
álcool isopropílico para precipitar o RNA. Incubar as amostras a 15 a 30 °C durante
10 minutos e centrifugar não mais do que 12.000 G durante 10 minutos a 4 °C. O
precipitado de RNA, muitas vezes invisíveis antes da centrifugação, forma um
sedimento, no lado e no fundo do tubo. Lava-se o pellet de RNA uma vez com etanol
a 75%, adicionando 1 mL de etanol 75%. Misturar as amostras no vórtex e
centrifugar não mais do que 7.500 G durante 5 minutos a 4 °C. Remover o
sobrenadante e deixar secar na bancada, por aproximadamente 15 min. Após a
secagem, dissolve-se o RNA em 100 μL de água ultrapura (RNAse/DNAse free). A
quantificação do RNA foi feita em NanoDrop 1000 (Thermo Scientific).
56
Preparação do cDNA
Utiliza-se um volume da amostra suficiente para 2000 ng de RNA. Adiciona-se
1 μL de DNAse/RNAse free (uma endonuclease não-específica que degrada fita
simples e dupla de DNA e cromatina), 2,5 μL de DNAse buffer e completa a solução
com água ultrapura para um volume final de 25 μL. Em seguida, incubar esta
solução em termociclador a 37 °C por 10 minutos. Logo após esse passo, tirar a
amostra do termociclador e incubar no gelo por 5 minutos. Depois, adicionar 2 μL de
Oligo dT e voltar para o termociclador por 65 °C por 10 minutos. Enquanto está
incubando, fazer o MIX quantidade por amostra: 10 μL de dNTP [100mM de dATP,
dTTP, dCTP, dGTP], 10 μL de MMLV Buffer, 1 μL de BSA a 20 μg/mL e 2 μL da
enzima MMLV (Promega Corporation). Após esta incubação, retirar as amostras do
termociclador e incubar no gelo por 5 minutos. Em seguida, adicionar 23 μL do MIX
por amostra à solução e incubar por 1 hora a 37 °C e na sequência por 65 °C por 10
min e deixar a 4 °C até retirar a reação do termociclador.
PCR em tempo Real
O cDNA obtido foi quantificado por RT-PCR quantitativo. SYBR Green PCR
Master (Applied Biosystems) foi usado para quantificar a expressão dos genes de
interesse de acordo com as instruções do fabricante. Adiciona-se à 1 μL do cDNA, 5
μL do SYBR Mix, 0,5 μL do primer (500 nM) e 3,5 μL da água ultrapura, com o
volume final de 10 μL. As amostras foram feitas em duplicata para cada primer. A
partir desse momento, a reação é levada ao termociclador Applied Biosystems
7900HT Real-Time PCR System®.
Os primers usados foram: para TNF 5’-GTCTTTGAGATCCATGCCATTG-3’
(foward) e 3’-ACTAGACTCACACTCCCAGA-5’ (reverse); para IL-1β 5’-
GAAGTCAAGACCAAAGTGG- 3’ (foward) e 3’ –TGAAGTCAACTAGTCCCG- 5’
(reverse); para IL-10 5’-TAAGGGTTACTTGGGTTGCC-3’ (foward) e 3’-
TATCCAGAGGGTCTTCAGC-5’ (reverse); GAPDH (gene housekeeping) 5’-
ACCACAGTCCATGCCATCAC -3’ (foward) 3’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-5’
(reverse); para β-actina (gene housekeeping) 5’-CGAGTCCGCGTCCACCCGCGA-3’
(forward) e 3’-GACGACGAGCGCAGCGATATC-5’ (reverse).
57
A expressão relativa do mRNA foi calculada pela diferença entre o cycle
threshold (Ct) do gene alvo e o Ct do gene referência: ΔCt = (Ct gene alvo – Ct gene
referência). A expressão diferencial (fold change) foi calculada pela fórmula 2 -ΔΔCT
(131).
4.13 Dosagem de prostanoides
As amostras de baço e cérebro foram homogeneizadas em solução de
metanol 50 µM indometacina e 0,005% BHT. O tecido ainda congelado foi colocado
em um tubo falcon contendo 4 mL da solução metanol-indometacina-BHT. Em
seguida, cada amostra foi sonicada individualmente e o sonicador foi lavado com
H2O milli-Q e metanol entre uma amostra e outra. Após sonicadas, as amostras
foram centrifugadas (10 min, rotação máxima, 4 ºC), o sobrenadante foi transferido
para um novo tubo e nitrogênio em gás foi usado para secar as amostras. Os tubos
foram então congelados no freezer – 80 ºC. O plasma também foi coletado trinta e
oitenta minutos após a injeção de LPS para a dosagem de prostanoides. As
concentrações de PGE2, PGI2, PGD2, e PGF2 e tromboxanos (TXB2) no plasma e
das amostras dos tecidos previamente processadas, serão determinadas por
cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massas (LC-MS) em
colaboração com o Prof. Dr. Norberto P. Lopes, Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP (FCFRP-USP), um método que é superior a
imunoensaios para prostaglandinas e leucotrienos (132, 133) e que tem sido
utilizado com sucesso em nossos experimentos (97, 134). Algumas prostaglandinas
e tromboxanos, entretanto, não são mensurados diretamente em detrimento de sua
instabilidade, mas por seus produtos estáveis, tais como 13,14-dihydro-15-keto
PGE2 para PGE2, 15-deoxy-12,14-PGJ2 para PGD2, 13,14-dihydro-15-keto PGF2
para PGF2 e 11-dehydro-TXB2 para TXB2, LTC4, N-acetyl-LTE4, LTB4.
4.14 Análise Estatística
A análise estatística foi feita com auxílio do programa Statistica Advanced 8.0
(StatSoft, Tulsa, EUA). ANOVA para medidas repetidas de um ou mais parâmetros
foi empregada para comparar medidas consecutivas da Tc, da pressão arterial,
58
frequência cardíaca, contratilidade ventricular e respirometria. A ANOVA foi
acompanhada pelo teste post-hoc de tipo Fisher Least Significant Difference. Tc, PS,
PD, HR, dP/dtmax, VO2 e RER foram expressos como alterações (Δ) a partir dos
valores iniciais correspondentes (média durante o período de 1 h que antecedeu a
injeção de LPS). Submeteram-se os resultados dos níveis de citocinas, eicosanoides
e teste da coagulação entre os grupos à análise estatística por meio do test t e
ANOVA One-Way e os resultados são apresentados como média ± desvio padrão.
Consideram-se diferenças significativas quando P < 0,05.
59
5. RESULTADOS
5.1 Medida da atividade funcional da COX-1 nos experimentos fisiológicos
Inicialmente, para que pudéssemos ter certeza da atividade funcional do SC-
560 (inibidor da COX-1), realizamos um teste de coagulação após cada experimento
de indução de endotoxemia destinado a estudar o efeito do SC-560 nas medidas
fisiológicas. Esse teste foi pensado baseado em dados da literatura demonstrando
que a formação de TXA2 (prostanoide responsável pela agregação plaquetária)
derivado de plaquetas é um fenômeno estabelecidamente mediado por COX-1 e não
por COX-2. Desse modo, esse teste da coagulação foi uma medida indireta do
índice de inibição da COX-1 pelo SC-560.
Ao final de cada experimento das medidas fisiológicas, fizemos coleta de
sangue da cauda dos animais do grupo veículo e do grupo SC-560 para medir o
tempo de coagulação de cada grupo. O resultado obtido mostra que o sangue dos
animais tratados com o SC-560 demorava mais a coagular quando comparado ao
grupo controle (Figura 7), confirmando a inibição da COX-1 pelo SC-560.
Figura 7 – Tempo de coagulação dos grupos veículo e SC-560
como índice de inibição da COX-1. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05.
60
5.2 Efeito do inibidor da COX-1 na resposta termometabólica
Inicialmente, nós estudamos o efeito do inibidor da COX-1 (SC-560) ou seu
veículo na resposta termometabólica de ratos injetados com uma alta dose de LPS.
Um estudo prévio (10) demonstrou que a injeção de SC-560 seguido de salina ao
invés do LPS não causa alteração na resposta termorregulatória, da mesma forma
que a administração do SC-560 sozinha não altera a resposta térmica. Baseado
nessas evidências, utilizamos apenas dois grupos neste estudo, o grupo de animais
tratados com SC-560 e o grupo de animais tratados com seu veículo, ambos
seguidos da injeção de LPS.
A temperatura basal dos animais nos dois grupos variou entre 37,0 ºC e 37,5
ºC (Figura 8). Na Ta de 22 ºC a hipotermia foi a resposta prevalecente ao LPS nos
animais do grupo veículo. Conforme esperado, o SC-560 (5 mg/kg, i.p.) atenuou a
hipotermia significativamente (p < 0,001) nesta dose de LPS (1000 µg/kg i.v.). A
resposta hipotérmica dos animais pré-tratados com o veículo foi caracterizada por
uma queda proeminente (aproximadamente no tempo de 30 min pós-LPS) atingindo
queda máxima por volta dos 90 min pós-LPS. A resposta hipotérmica dos animais
pré-tratados com o SC-560 apresentou menor magnitude, sendo caracterizada por
uma leve queda na Tc que teve um início mais demorado (aproximadamente no
tempo de 50 min pós-LPS) comparado à queda na Tc dos animais do grupo veículo
atingindo queda máxima por volta dos 80 min pós-LPS.
Com relação ao parâmetro metabólico, a medida do basal no consumo de
oxigênio (VO2) entre os dois grupos foi em média 18,77 mL/kg/min (Figura 8). A
injeção de LPS (1000 µg/kg i.v.) nos ratos pré-tratados com o veículo provocou uma
diminuição (6 mL/kg/min) no consumo de O2 que atingiu queda máxima 70 min pós-
LPS. Essa resposta foi caracterizada por duas quedas: uma queda inicial (40-60 min
pós-LPS) e uma queda tardia (170-240 min pós- LPS). Essa queda no consumo O2
vista nos animais do grupo veículo foi estatisticamente atenuada (p < 0,001) nos
animais pré-tratados com o SC-560 e também atingiu queda máxima 70 min pós-
LPS, com o mesmo padrão de duas fases de queda, no entanto, atenuadas.
61
Figura 8 – Efeitos do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta
termometabólica em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada
grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05.
62
A razão entre a produção de CO2 e o consumo de O2 (RER) tipicamente
reflete o quociente de troca respiratória (135), ou seja, a estequiometria de CO2
produzido a O2 consumido pela oxidação metabólica de glicose (quociente de 1,0)
em comparação com os ácidos graxos (quociente de 0,7), e é utilizado como um
correlato de acidose no choque endotóxico. O quociente de troca respiratória teve o
valor basal entre os grupos em média de 0,894 (Figura 9). A injeção de LPS nos
ratos pré-tratados com o veículo provocou um aumento em dois tempos da resposta:
um aumento inicial (10-40 min pós-LPS) e um aumento mais pronunciado e tardio
(80-140 min pós-LPS), atingindo o pico da resposta 90 min pós-LPS. O pré-
tratamento com SC-560 atenuou o aumento no RER com o pico da resposta aos 70
min pós-LPS.
Figura 9 – Efeitos do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta de acidose metabólica em
animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05.
63
5.3 Efeito do inibidor da COX-1 na resposta cardiovascular
Uma vez que a resposta hipotérmica tem sido associada com a hipotensão,
nós estudamos o efeito do SC-560 sobre as alterações em parâmetros
cardiovasculares durante o choque endotóxico. Avaliamos o efeito do SC-560 sobre
as seguintes respostas fisiológicas: Pressão Sistólica (PS), Pressão Diastólica
(PD), Frequência Cardíaca (FC) e Contratilidade do miocárdio (dP/dt max).
O valor basal da pressão sistólica entre os dois grupos foi em média de 124,5
mmHg (Figura 10). A injeção de LPS (1000 µg/kg i.v.) nos ratos pré-tratados com o
veículo provocou uma diminuição (25 mmHg) na pressão sistólica. A pressão
sistólica atingiu queda máxima em 70 min após a injeção de LPS. Nos animais pré-
tratados com o SC-560, a queda na pressão sistólica também foi atenuada (p <
0,001), sendo caracterizada por um aumento (15 mmHg) 30 min pós-LPS seguida
de uma diminuição (5 mmHg comparado ao valor basal inicial) que teve sua queda
máxima aos 70 min pós-LPS assim como nos animais do grupo veículo.
O valor basal da pressão diastólica entre os dois grupos foi em média de
101,37 mmHg (Figura 10). A injeção de LPS (1000 µg/kg i.v.) nos ratos pré-tratados
com o veículo provocou uma diminuição (30 mmHg) na pressão diastólica. A
pressão diastólica atingiu a queda máxima em 70 min após a injeção de LPS. Nos
animais pré-tratados com o SC-560, a queda na pressão diastólica foi atenuada (p <
0,001) no tempo de 30 minutos pós-injeção de LPS, sendo caracterizada por um
aumento (20 mmHg) inicial seguido de uma diminuição (10 mmHg comparado ao
valor basal inicial) que teve sua queda máxima aos 70 min pós-LPS assim como nos
animais do grupo veículo.
64
Figura 10 – Efeitos do SC-560 (5 mg/kg i.p.) sobre os parâmetros cardiovasculares pressão sistólica e pressão diastólica, em animais
injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P <
0,05.
65
A FC também foi alterada após a injeção de LPS (Figura 11). Seu valor médio
basal entre os grupos foi de 387,13 bpm. A injeção de LPS causou um aumento na
FC (taquicardia) (70 bpm) dos animais pré-tratados com o veículo e teve sua queda
máxima cerca de 120 min pós-LPS. Já a taquicardia nos animais pré-tratados com o
SC-560 foi mais pronunciada (100 bpm) e mais inicial (50 min pós-LPS). Não houve
diferença estatística na resposta dos dois grupos, embora tenha sido observada uma
tendência (p = 0,07).
O valor basal da contratilidade ventricular (dPdt máx) nos dois grupos foi em
média de 1394,17 mmHg/s (Figura 11). A injeção de LPS nos ratos pré-tratados
com o veículo causou uma elevação (500 mmHg/s) na dPdt máx com a queda
máxima aproximadamente 80 min pós-LPS. Nos animais pré-tratados com o SC-
560 a dPdt máx teve um aumento maior de 1000 mmHg/s, também com queda
máxima aproximadamente aos 80 min pós-LPS.
66
Figura 11 – Efeitos do SC-560 (5 mg/kg i.p.) sobre os parâmetros
cardiovasculares frequência cardíaca e contratilidade ventricular, em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O
número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05.
67
Em virtude do padrão de resposta observado nos parâmetros
cardiovasculares apresentados acima, um resultado interessante visto no aumento
da frequência cardíaca e da contratilidade ventricular dos animais pré-tratados com
SC-560 injetados com LPS nos levou a realizar um experimento para determinar se
o aumento na FC e na contratilidade ventricular (dPdt máx) podem aumentar a Tc
dos animais e, como consequência, atenuar a hipotermia, uma vez que o aumento
na FC e na contratilidade ventricular reflete trabalho cardíaco e aumento do custo
metabólico do coração, com consequente geração de calor (136). Para testar essa
hipótese, bloqueamos a simpatoexcitação cardíaca utilizando o beta-bloqueador
propranolol, a fim de testar se a resposta hipotérmica atenuada pelo SC-560
desaparece nos animais em que a COX-1 é inibida e que não desenvolvem
taquicardia.
Inicialmente, o nosso resultado mostrou que o propranolol bloqueou a
taquicardia tanto no grupo pré-tratado com veículo quanto no pré-tratado com SC-
560 (Figura 12). Ambos os grupos apresentaram uma queda inicial proeminente da
frequência cardíaca logo após a injeção de LPS. Nos animais que receberam o
veículo, a queda inicial na FC foi mais pronunciada (100 bpm) e a resposta
bradicárdica permaneceu, não retornando ao valor basal. Nos animais em que a
COX-1 foi bloqueada, o propranolol também causou uma queda inicial pronunciada
(80 bpm) e bloqueou a FC inibindo, assim, a taquicardia (Figura 12). O propranolol
também bloqueou o aumento na dPdt, sobretudo no grupo dos animais tratados com
o SC-560 (p< 0,001) (Figura 12).
68
Figura 12 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. em combinação com o propranolol sobre a FC e a dPdt em animais injetados com LPS 1000
μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05.
69
Com relação à resposta termorregulatória, os animais pré-tratados com o
veículo que receberam propranolol (5 mg/kg/h i.v) e foram desafiados com LPS
(1000 µg/kg i.v.) apresentaram uma hipotermia considerável, conforme esperado.
Esta resposta hipotérmica foi caracterizada por uma queda proeminente logo após a
injeção de LPS atingindo queda máxima por volta dos 110 min pós-LPS. O pré-
tratamento com SC-560 continuou atenuando significativamente a resposta
hipotérmica (p< 0,001) mesmo combinado ao bloqueio da taquicardia pelo
propranolol, sendo caracterizada por uma leve queda na Tc que teve um início logo
após o desafio com LPS, comparado à queda proeminente na Tc dos animais do
grupo veículo (Figura 13).
O consumo de O2, como esperado, caiu nos animais pré-tratados com o
veículo que receberam o propranolol logo após a injeção de LPS e atingiu a queda
máxima 80 min pós-LPS. A queda no VO2 vista nos animais do grupo veículo foi
estatisticamente atenuada (p < 0,035) nos animais pré-tratados com o SC-560 que
receberam o propranolol.
70
Figura 13 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. em combinação com o propranolol sobre a Tc e o consumo de O2 em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais
em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05.
71
No que diz respeito à dinâmica cardiovascular, a injeção de LPS nos animais
do grupo veículo pré-tratados com propranolol provocou uma diminuição da pressão
sistólica (20 mmHg) e pressão diastólica (25 mmHg). Nos animais pré-tratados com
o SC-560 que receberam propranolol, a queda na pressão sistólica e pressão
diastólica foi atenuada significativamente (p <0,001) em resposta à injeção de LPS
quando comparada aos animais do grupo veículo (Figura 14).
Figura 14 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. em combinação com o propranolol sobre a
resposta cardiovascular em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses.
*P < 0,05.
72
Com o intuito de melhor visualizar se o bloqueio da simpatoexcitação cardíaca
pelo propranolol alterou o efeito atenuante do SC-560 sobre a Tc dos animais,
fizemos a seguinte análise: subtraímos valor do ΔTc dos animais pré-tratados com o
SC-560 pela média do ΔTc dos animais pré-tratados com o veículo (ΔTc SC-560 –
média ΔTc Veículo), e comparamos o resultado entre os animais que não receberam
propranolol e nos animais que receberam o propranolol. Conforme apresentado na
figura 15, na ausência do propranolol, o SC-560 apresenta uma atividade anti-
hipotérmica na fase inicial (30 – 60 min) e na fase tardia (60 – 100 min) da resposta,
da mesma forma, na presença do propranolol, a atividade anti-hipotérmica do SC-
560 persistiu e continuou presente nas duas fases da resposta.
Figura 15 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta termorregulatória de
animais não tratados e tratados com propranolol injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C.
73
5.4 Efeito da esplenectomia com e sem inibição da COX-1 nas respostas fisiológicas durante o choque endotóxico
Nosso próximo objetivo foi avaliar se a COX-1 que participa da inflamação
sistêmica grave é a que se encontra no baço.
Primeiro avaliamos se a ausência do baço por si só, sem pré-tratamento
dos animais com o SC-560, seria capaz de atenuar a hipotermia induzida por LPS.
Como demonstrado na figura 16, a Tc basal dos animais nos dois grupos variou
entre 36,9 ºC e 37,4 ºC. Nos animais não esplenectomizados a hipotermia foi
caracterizada por uma queda proeminente (aproximadamente no tempo de 30 min
pós-LPS) atingindo queda máxima por volta dos 90 min pós-LPS, enquanto que nos
animais esplenectomizados a resposta hipotérmica apresentou uma menor
magnitude, caracterizada por uma queda atenuada na temperatura quando
comparada à resposta hipotérmica dos animais com baço, e sua queda máxima foi
aproximadamente aos 80 minutos pós-LPS. A fase final da resposta nos animais
sem o baço, entretanto, não retornou ao valor da Tc basal (p <0,001).
Figura 16 – Efeitos da esplenectomia na resposta termorregulatória em animais
injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05.
74
Com relação à pressão arterial, a ausência do baço por si só, sem pré-
tratamento dos animais com o SC-560, foi capaz de atenuar a hipotensão induzida
por LPS (p < 0,001), como demonstrado na figura 17. O valor basal da PAM entre
os dois grupos foi em média de 112,65 mmHg. A injeção de LPS (1000 µg/kg i.v.)
nos animais não esplenectomizados provocou uma diminuição acentuada (35
mmHg) na pressão arterial média. A PAM atingiu a queda máxima em 70 min após a
injeção de LPS. Nos animais esplenectomizados, a hipotensão induzida pelo LPS
foi atenuada (p < 0,001) com sua diminuição máxima em 70 min pós-LPS.
Figura 17 – Efeitos da esplenectomia na pressão arterial média em animais injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em
cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05.
75
Em seguida, fizemos experimento de esplenectomia combinado com o
bloqueio sistêmico da COX-1, para avaliarmos se o efeito atenuante do SC-560
persiste ou não sobre as respostas termometabólica e cardiovascular na ausência
do baço e, desse modo, investigarmos de forma mais direta se a COX-1 esplênica é
a isoforma responsável pelas alterações fisiológicas durante o choque endotóxico
previamente apresentadas.
Nossos resultados mostraram que nos animais esplenectomizados pré-
tratados com o veículo a hipotermia prevaleceu iniciando 30 min pós-LPS. Por sua
vez, os animais esplenectomizados pré-tratados com o SC-560 também
desenvolveram hipotermia, no entanto, a queda na Tc foi mais tardia com um início
mais demorado (aproximadamente no tempo de 50 min pós-LPS) quando
comparado aos animais do grupo veículo (aproximadamente 30 min pós-LPS),
indicando uma possível atenuação da COX-1 pelo SC-560 nesta fase inicial. Nesses
dois grupos de animais esplenectomizados, a magnitude da resposta hipotérmica foi
semelhante no tempo entre 80-90 min pós-LPS, sugerindo que na ausência do baço
o SC-560 não atenuou a hipotermia nessa fase mais avançada da resposta (Figura
18).
Com relação ao parâmetro metabólico, a injeção de LPS (1000 µg/kg i.v.) nos
animais pré-tratados com o veículo provocou uma diminuição (5 mL/kg/min) no
consumo de O2 que atingiu a queda máxima 70 min pós-LPS e essa diminuição no
consumo teve início logo após a injeção do LPS. Nos animais que receberam o SC-
560 também houve diminuição no consumo de O2 (5 mL/kg i.v), no entanto, essa
diminuição teve início somente 35 min após a injeção de LPS com queda máxima de
75 min pós-LPS (p < 0,001) (Figura 18).
76
Figura 18 – Efeitos do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta
termometabólica em animais esplenectomizados injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de
animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05.
77
Para melhor visualizar como a esplenectomia afetou a resposta atenuante do
SC-560, assim como fizemos para a figura 15, calculamos a diferença entre o valor
do ΔTc dos animais que receberam o SC-560 pela média do ΔTc dos animais pré-
tratados com o veículo (ΔTc SC-560 – média ΔTc Veículo) e comparamos o
resultado entre os animais sem esplenectomia e nos animais que sofreram
esplenectomia.
Utilizando o parâmetro de Tc, analisamos o efeito do SC-560 nos animais
sem e com esplenectomia. Notamos que na presença do baço, o SC-560
apresenta uma atividade anti-hipotérmica na fase inicial (30 – 60 min) e na fase
tardia (60 – 100 min) da resposta, sendo essa atividade mais proeminente na fase
tardia, enquanto que, na ausência do baço, a atividade anti-hipotérmica do SC-560
está presente apenas na fase inicial da resposta (30 – 60 min), desaparecendo na
fase final (60 – 100 min) (p < 0,001) (Figura 19).
Figura 19 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta termorregulatória de animais
com e sem esplenectomia injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C.
78
O efeito atenuante do SC-560 sobre a hipotensão foi eliminado quando os
animais foram esplenectomizados, pois não houve diferença estatística entre os
animais pré-tratados com SC-560 ou seu veículo para a pressão sistólica e
diastólica. No entanto, o aumento inicial da pressão arterial logo após a injeção de
LPS persistiu nos animais que receberam o SC-560 (Figura 20).
Figura 20 – Efeitos do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta
cardiovascular em animais esplenectomizados injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre
parênteses. *P < 0,05.
79
Quando analisamos o efeito atenuante do SC-560 na presença ou ausência
da esplenectomia avaliando a resposta hipotensiva (ΔPAM SC-560 – média ΔPAM
Veículo), com a mesma abordagem empregada nas figuras 15 e 18, notamos que
na presença do baço, o SC-560 apresenta uma atividade anti-hipotensiva na fase
inicial e tardia da resposta, sendo essa atividade mais proeminente na fase inicial
(30 min), enquanto que, na ausência do baço, a atividade anti-hipotensiva do SC-
560 está presente na fase inicial da resposta (30 min), mas logo em seguida
apresenta uma resposta pró-hipotensiva no início da fase mais tardia (60 – 120 min)
(p < 0,001), retornando no final da resposta com um padrão anti-hipotensivo (Figura
21).
Figura 11 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta cardiovascular de animais
com e sem esplenectomia injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C.
80
Referente ao parâmetro que indica acidose metabólica (RER), a injeção de
LPS nos ratos esplenectomizados pré-tratados com o veículo provocou um aumento
no RER com queda máxima em 75 min pós-LPS (Figura 22). Nos animais tratados
com o SC-560 na ausência do baço, não houve atenuação da acidose, mas sim um
aumento no quociente respiratório, sendo esse aumento mais tardio (110 min pós-
LPS) (p<0,001).
Figura 22 – Efeitos do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a resposta metabólica em animais
esplenectomizados injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. O número de animais em cada grupo é apresentado entre parênteses. *P < 0,05.
81
Também analisamos o efeito do SC-560 com relação à resposta de acidose
metabólica, empregando a mesma abordagem das figuras 15, 18 e 21, no qual
calculamos a diferença entre o valor do ΔRER dos animais que receberam o SC-560
e dos animais que receberam o veículo (ΔRER SC-560 – média ΔRER Veículo), e
comparamos o resultado entre os animais sem esplenectomia e nos animais que
sofreram esplenectomia. Conforme mostra a figura 23, na presença do baço (sem
esplenectomia), o SC-560 apresenta uma atividade anti-acidose na fase inicial e
tardia da resposta, enquanto que, na ausência do baço (com esplenectomia), a
atividade anti-acidose do SC-560 está presente na fase inicial da resposta (30 min),
em menor magnitude comparada ao grupo na presença do baço, mas logo em
seguida a resposta anti-acidose desaparece e o SC-560 apresenta uma resposta
pró-acidose na fase mais tardia (60 – 120 min) do choque endotóxico (p < 0,001).
Figura 23 – Efeito do SC-560 5 mg/kg i.p. sobre a acidose metabólica em animais com e
sem esplenectomia injetados com LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C.
82
5.5 Efeito da inibição da COX-1 sobre o perfil de citocinas circulantes
Tendo demonstrado a participação da COX-1 nas alterações
termometabólicas e cardiovasculares durante o choque endotóxico, o próximo passo
foi investigar por quais mecanismos a COX-1 atua na indução das alterações
fisiológicas. Sabendo-se da importância das citocinas em condições inflamatórias, as
citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 foram quantificadas por ELISA em amostra de sangue
de animais pré-tratados com SC-560 ou seu veículo desafiados com LPS. Baseado
no início do tempo da fase inicial (30-60 min) de atenuação da hipotermia e da
hipotensão promovidas pelo SC-560, o período de coleta de sangue foi definido.
Trinta minutos após injeção de LPS 1000 µg/kg i.v. na Ta 22 °C, o sangue dos
animais recebendo o SC-560 ou seu veículo, foi coletado para determinação de
mediadores solúveis no plasma. O nível de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α
e IL-1β, e anti-inflamatória, como IL-10, na primeira fase foi indetectável, em ambos
os grupos. Decidimos então avaliar os mediadores inflamatórios no plasma baseado
no início de tempo da segunda fase da resposta (60-100 min), por isso, o sangue
dos animais foi coletado 80 minutos pós-LPS. O nível das citocinas plasmáticas
TNF-α e IL-1β foi detectável, embora não tenha sido encontrada diferença estatística
entre os grupos veículo e SC-560 (Tabela 4).
Tabela 4 – Concentrações plasmáticas de TNF-α (A) e IL-1β (B) nos tempos de 30 e 80 min
após a injeção de LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. *P <0,05.
A) TNF-α (ng/mL)
Tempo Pré-tratamento
Veículo N SC-560 N
30 min
N.D
N = 5
N.D
N = 4
80 min
2.42 ± 0.37
N = 7
1.87 ± 0.17
N = 7
83
B) IL-1β (ng/mL)
Tempo (87) Pré-tratamento
Veículo N SC-560 N
30 min
N.D
N = 8
N.D
N = 7
80 min
0.34 ± 0.04
N = 6
0.28 ± 0.02
N = 6
5.6 Efeito da inibição da COX-1 sobre o perfil de citocinas órgão-específicas.
Uma vez que não encontramos diferença significativa nos níveis de citocinas
plasmáticas na fase mais avançada da resposta, decidimos investigar o nível de
expressão dessas citocinas nos tecidos por RT-PCR em tempo real. Os órgãos
(fígado, pulmão, diencéfalo e baço) foram coletados no tempo de 80 min pós-LPS.
A expressão do mRNA das citocinas TNF-α , IL-1β e IL-10 (relativa à média
dos genes housekeeping GAPDH e β-actina) não diferiu (P = 0,80, P = 0,97 e P =
0,90, respectivamente) no fígado dos animais pré-tratados com SC-560 ou seu
veículo injetados com LPS (Figura 23) e a expressão das citocinas foi aumentada
no fígado.
Da mesma forma, a expressão das mesmas citocinas não diferiu (P = 0,79, P
= 0,91 e P = 0,42, respectivamente) no pulmão dos animais pré-tratados com o SC-
560 ou seu veículo desafiados com LPS (Figura 24), sendo observada uma maior
expressão da citocina IL-1β.
No diencéfalo, a expressão das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 também não
diferiu (P = 0,77, P = 0,11 e P = 0,39, respectivamente) entre os animais tratados
com SC-560 ou seu veículo, apesar de ter sido observada maior expressão da
citocina IL-1β quando comparada às outras citocinas (Figura 25).
No baço, a expressão da citocina TNF-α não diferiu (P = 0,19) entre os
animais do grupo SC-560 ou veículo que receberam LPS. No entanto, notamos uma
tendência para um aumento na expressão da citocina IL-1β (P = 0,06) nos animais
pré-tratados com SC-560 e a expressão da citocina IL-10 foi significativamente
84
diminuída (P = 0,03) nos animais pré-tratados com o SC-560 (Figura 26). De modo
interessante, comparando o baço com o fígado e o pulmão, notamos que no baço a
expressão das citocinas foi menor, mas foi nele que houve alteração no nível de
expressão das citocinas entre os dois grupos.
Figura 24 – Expressão do mRNA das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 dosado em amostras de fígado
coletados 80 min depois da administração intravenosa de LPS (1000 µg/kg) de animais pré-tratados com o SC-560 ou seu veículo a uma Ta de 22 °C.
Figura 25 – Expressão do mRNA das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 dosado em amostras de
pulmão coletados 80 min depois da administração intravenosa de LPS (1000 µg/kg) de animais pré-tratados com o SC-560 ou seu veículo a uma Ta de 22 °C.
85
Figura 26 – Expressão do mRNA das citocinas TNF-α, IL-1 e IL-10 dosado em amostras de
diencéfalo coletadas 80 min depois da administração intravenosa de LPS (1000 µg/kg) de animais pré-tratados com o SC-560 ou seu veículo a uma Ta de 22 °C.
Figura 27 – Expressão do mRNA das citocinas TNF-α, IL-1 e IL-10 dosado em amostras de baço
coletados 80 min depois da administração intravenosa de LPS (1000 µg/kg) de animais pré-tratados com o SC-560 ou seu veículo a uma Ta de 22 °C.
86
5.7 Efeito da inibição da COX-1 sobre o perfil de mediadores lipídicos.
A fim de avaliarmos o perfil de mediadores lipídicos produzido durante a
inflamação sistêmica grave em condições de bloqueio sistêmico da COX-1, dosamos
as concentrações dos mediadores lipídicos por cromatografia líquida com detecção
por espectrometria de massas (LC-MS), baseado no início do tempo da fase inicial
(30-60 min) e da fase final (60-100 min) de atenuação da hipotermia e da hipotensão
mediadas pelo SC-560, o período de coleta dos órgãos foi definido. Esses
resultados de lipidômica são preliminares, pois o método ainda precisa de
otimização, no entanto, dos analitos detectados obtivemos resultados que parecem
promissores para guiar análises futuras até que o método esteja aperfeiçoado.
Nossos resultados preliminares mostram que houve detecção do metabólito
da PGD2 Tetranor-PGDM (TPGDM) no plasma nos dois tempos após a injeção de
LPS. Esse metabólito teve sua concentração diminuída no tempo de 80 min pós-LPS
quando comparado ao tempo de 30 min pós-LPS. Além disso, nos animais pré-
tratados com o SC-560 a concentração desse metabólito foi significativamente
reduzida nos tempos de 30 e 80 min pós-LPS (Tabela 5). O metabólito da
prostaciclina, 6-ceto prostaglandin F1 (KPGF1), foi detectado apenas nos animais
do grupo SC-560 no tempo de 30 min pós-LPS, mas no tempo de 80 min pós-LPS.
Interessantemente, o mediador lipídico LTB4 foi detectado em altas concentrações
que estoraram o limite máximo da dosagem, nos dois tempos pós-LPS e no plasma
de animais tratados com SC-560 ou seu veículo. Os outros metabólitos e
mediadores não foram detectados no plasma nos dois tempos, como apresentado
na tabela 5.
Tabela 5 – Concentrações plasmáticas (0,1 – 50 ng/mL) de eicosanoides nos tempos de 30 e
80 min após a injeção de LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. *P <0,05.
Eicosanoides 30 min pós-LPS 80 min pós-LPS
Veículo SC-560 Veículo SC-560
TPGDM
8.23 ± 1.44
(8)
0.94 ± 0.26*
(6)
5.21 ± 1.22
(6)
0.85 ± 0.29*
(8)
PGJ2
nd (8)
nd (7)
nd (8)
nd (7)
87
PGD2
nd (8)
nd (7)
nd (6)
nd (8)
KPGF1
nd (8)
3.96 ± 0.73
(4)
nd (6)
nd (8)
DKPGF2
nd (8)
nd (7)
nd (6)
nd (8)
PGF2
nd (8)
nd (7)
nd (6)
nd (8)
DKPGE2
nd (8)
nd (7)
nd (6)
nd (8)
PGE2
nd (8)
nd (7)
nd (6)
nd (8)
DTXB2
nd (8)
nd (7)
nd (6)
nd (8)
TXB2
nd (8)
nd (7)
nd (6)
nd (8)
LTB4
>50 ng/mL (8)
>50 ng/mL (7)
>50 ng/mL
(6)
>50 ng/mL (8)
LTC4
nd (8)
nd (7)
nd (6)
nd (8)
No baço, nossos resultados mostram que houve detecção do metabólito
estável da PGD2, o 15-deoxi-delta12,14-prostaglandina J2 ( PGJ2), nos animais
do grupo veículo nos dois tempos de 30 e 80 min pós-LPS, com aumento na sua
concentração no tempo de 80 min. Por sua vez, nos animais do grupo SC-560 esse
metabólito não foi detectado. A PGD2 foi detectada em concentrações altas que
ultrapassaram o limite de detecção do método, nos dois grupos e nos dois tempos.
O metabólito da prostaciclina, 6-ceto prostaglandin F1 (KPGF1), foi detectado
apenas no baço dos animais do grupo veículo nos dois tempos, mas não foi
detectado no baço dos animais do grupo SC-560. O metabólito da PGF2α, 13,14-
dihidro-15-ceto prostaglandina F2 (DKPGF2), e a própria PGF2α foram detectadas
apenas no baço dos animais pré-tratados com veículo, mas não no baço dos
animais do grupo SC-560, com uma diminuição nas suas concentrações no tempo
de 80 min pós-LPS quando comparado ao veículo. A PGE2 também foi detectada em
concentrações altas que ultrapasaram o limite de detecção, nos dois grupos e nos
dois tempos. O TXB2 foi detectado apenas no baço dos animais do grupo veículo
nos dois tempos e sua concentração foi diminuída no tempo de 80 min pós-LPS.
88
Inesperadamente, o LTC4 foi detectado nos animais pré-tratados com veículo 30 min
pós-LPS e teve sua concentração reduzida significativamente (p = 0,048) no baço de
animais do grupo SC-560. Já no tempo de 80 min, o LTC4 foi detectado em uma
menor concentração no baço dos animais do grupo veículo comparado ao tempo de
30 min pós-LPS e não foi detectado nos animais do grupo SC-560 nessa fase mais
tardia da resposta (Tabela 6).
Tabela 6 – Concentrações de eicosanoides no baço (0,1 – 50 ng/mL) nos tempos de 30 e
80 min após a injeção de LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. *P <0,05.
Eicosanoides 30 min pós-LPS 80 min pós-LPS
Veículo SC-560 Veículo SC-560
TPGDM
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
PGJ2
119.96 ± 31.10
(6)
nd (7)
167.81 ± 79.18
(6)
nd (8)
PGD2
>50 ng/mL (8)
>50 ng/mL (8)
>50 ng/mL (8)
>50 ng/mL (8)
KPGF1
18.6 ± 5.34 (7)
nd (8)
23.72 ± 4.83 (7)
nd (8)
DKPGF2
3.05 ± 1.15 (4)
nd (8)
2.2 ± 1.59 (4)
nd (8)
PGF2
26.38 ± 9.80 (5)
nd (8)
14.91 ± 4.46 (6)
nd (8)
DKPGE2
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
PGE2
>50 ng/mL (8)
>50 ng/mL (8)
>50 ng/mL (8)
>50 ng/mL (8)
DTXB2
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
TXB2
383.03 ± 115.43
(8)
nd (8)
189.55 ± 51.49
(8)
nd (8)
LTB4
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
LTC4
107,65 ± 38,91
(6)
25.88 ± 8.64*
(6)
18.08 ± 6.28 (5)
nd (8)
89
No cérebro, os resultados mostram que apenas o metabólito da PGD2,
Tetranor-PGDM (TPGDM), a PGF2α e o LTC4 foram detectados nos dois tempos e
no cérebro dos animais pré-tratados com o SC-560 e seu veículo, sem diferença
estatística entre os grupos na concentração desses mediadores (Tabela 7).
Tabela 7 – Concentrações de eicosanoides no cérebro (0,1 – 50 ng/mL) nos tempos de 30 e
80 min após a injeção de LPS 1000 μg/kg i.v. na temperatura ambiente de 22 °C. *P <0,05.
Eicosanoides 30 min pós-LPS 80 min pós-LPS
Veículo SC-560 Veículo SC-560
TPGDM
2.55 ± 0.42 (8)
2.37 ± 0.40
(8)
2.02 ± 0.27
(8)
1.8 ± 0.42 (8)
PGJ2
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
PGD2
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
KPGF1
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
DKPGF2
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
PGF2
6.35 ± 0.91 (6)
nd (8)
3.77 ± 2.63
(4)
1.23 ± 0.41 (28)
DKPGE2
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
PGE2
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
DTXB2
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
TXB2
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
LTB2
nd (8)
nd (8)
nd (8)
nd (8)
LTC
11.97 ± 1.83
(8)
11.21 ± 2.69
(7)
12.4 ± 3.68
(8)
12.88 ± 2.48 (8)
90
6. DISCUSSÃO
O presente estudo foi realizado para desvendar os mecanismos de ação da
enzima COX-1 durante a inflamação sistêmica grave.
A dose do SC-560 usada neste trabalho foi selecionada a partir de estudos
prévios demonstrando que o mesmo apresenta potencial de inibição de
prostaglandinas constitutivas (74, 137, 138). A seletividade para o SC-560 tem sido
previamente estabelecida (139-141) e, de acordo com esses estudos, parece
improvável que o SC-560 esteja inibindo ambas as isoformas da COX na dose
utilizada em nosso trabalho (5 mg/kg).
Para ter certeza da atividade funcional do SC-560, nós realizamos um teste
de coagulação após cada experimento de indução de endotoxemia destinado a
estudar o efeito do SC-560 nas medidas fisiológicas. A COX-1 é considerada uma
enzima chave para a geração de prostanoides envolvidos na agregação plaquetária
(142, 143). Esse teste foi embasado em um estudo (115) que demonstrou que a
formação de TXA2 derivado de plaquetas é dependente da COX-1, mas não de
COX-2. Uma vez que o TXA2 é um prostanoide responsável, dentre outras funções,
pela agregação plaquetária (115), o teste da coagulação foi uma medida indireta do
índice de inibição da COX-1 pelo SC-560. Nossos resultados confirmam que o SC-
560 bloqueou a COX-1 sistemicamente e foi eficaz durante o período pós-LPS, pois
a inibição foi até o final do experimento (7 horas pós-injeção de LPS), uma vez que
nos animais que receberam o SC-560 o sangue demorou mais a coagular. Este
resultado reafirma o bloqueio farmacológico da COX-1 na dose empregada no
presente estudo.
Resultados relacionados ao objetivo 3.1.1.:
Primeiro, nós avaliamos o efeito do SC-560, inibidor da COX-1, na resposta
termometabólica ao LPS. Com relação à Tc dos animais, o SC-560
consistentemente bloqueou a hipotermia em resposta ao LPS, assim indicando que
a COX-1 é requerida para o desenvolvimento dessa resposta.
Dados consistentes demonstram que a COX-2 desempenha um papel crítico
na gênese da febre por catalisar a conversão de ácido araquidônico em
prostaglandina PGH2, o precursor imediato de PGE2 febrigênica (144) (55). Tanto a
91
febre clínica (145) como todas as fases da febre experimental induzida por LPS (66)
(146, 147) são pensados ser mediadas pela COX-2, a isoforma induzível, e não pela
COX-1, isoforma predominantemente constitutiva. Um envolvimento da COX na
hipotermia induzida por LPS também foi sugerido (59, 148, 149). No entanto,
estudos das isoformas da COX envolvidos na hipotermia induzida por LPS tiveram
resultados contraditórios. Dogan et al. (150) e Akarsu et al. (151) relataram uma
supressão da hipotermia induzida por LPS usando um inibidor preferencial (valeril-
salicilato) ou seletivo (SC-560) da COX-1 em ratos, sugerindo, portanto, que esta
resposta é mediada por COX-1. Entretanto, Zhang et al. (147) relataram o efeito
oposto, que o SC-560 aumenta a hipotermia em ratos, sugerindo, assim, que os
produtos da COX-1 inibem a hipotermia induzida por LPS na mesma espécie. Zhang
et al. (147) também relataram uma outra observação que aparentemente contradiz
os presentes resultados, isto é, que o SC-560 além de aumentar pode ter
prolongado a hipotermia induzida por LPS. Deve-se considerar, no entanto, que
Zhang et al. (147) utilizou uma dose baixa de LPS, o que resultou em apenas uma
diminuição mínima na Tc (0,5 °C) em ambos os ratos tratados e não tratados com o
SC-560. No presente estudo, usamos uma dose mais elevada de LPS e os
experimentos foram executados num ambiente térmico rigorosamente controlado
que nos permitiu produzir uma resposta hipotérmica mais forte (1,5 °C) facilitando
estudar os efeitos sobre a resposta hipotérmica com mais qualidade.
Este efeito atenuante do SC-560 na hipotermia observado no presente
trabalho, já tinha sido demonstrado previamente em um estudo do nosso laboratório
no qual o SC-560 não afetou a febre induzida por uma dose baixa ou alta de LPS
(10 e 1000ug/kg) a uma temperatura ambiente (Ta) de 30 ºC, mas atenuou de forma
significativa a hipotermia induzida pela dose alta de LPS a uma Ta de 22 ºC (10),
assegurando, portanto, confiabilidade aos nossos resultados.
Nosso estudo foi pioneiro em investigar a relação entre a isoforma COX-1 e
alterações em respostas metabólicas durante o choque endotóxico, demonstrando
que o SC-560 atenuou o hipometabolismo e a acidose metabólica assim como
atenuou a hipotermia, uma vez que a atenuação da queda no consumo de O2 e a
atenuação no RER foi condizente com a atenuação na queda da temperatura
corporal. Como o hipometabolismo precede a hipotermia, ele pode ser o mecanismo
efetor que causa a diminuição da temperatura corporal durante a endotoxemia.
92
Nesse sentido, um estudo do nosso laboratório (108) investigou se a inibição da
termogênese vista durante o choque endotóxico é uma resposta regulada. O estudo
revelou que um agonista adrenérgico beta 3 (CL316,243) conhecido por ativar a
produção metabólica de calor foi efetivo em aumentar a utilização de oxigênio em
ratos desafiados com LPS, bem como nos animais saudáveis, assim indicando que
nem a entrega de oxigênio nem a função mitocondrial foram prejudicadas a ponto de
comprometer diretamente o metabolismo aeróbico, evidenciando, portanto, que a
capacidade termogênica é mantida e a termogênese é regulada durante a
endotoxemia. No mesmo estudo também foi demonstrado que a hipotermia não é
consequência da hipóxia, mas pode ser resultado de propriedades intrínsecas do
sistema imune-neural. Diante disso, a inibição da hipotermia, hipometabolismo e
acidose metabólica pelo SC-560 é um resultado relevante, uma vez que mediadores
dependentes da COX-1 possam estar por trás dessas alterações vistas na resposta
termometabólica durante a inflamação sistêmica grave.
O SC-560, além de atenuar a hipotermia e o hipometabolismo induzidos por
LPS, também atenuou a hipotensão, demonstrando que os produtos da COX-1 são
necessários para o desenvolvimento da hipotensão durante o choque endotóxico,
como também já havia sido demonstrado por nosso grupo (10). Apenas um estudo
(119) foi contraditório aos nossos resultados, uma vez que demonstrou que a COX-1
não estava envolvida com a resposta hipotensiva ao LPS. Entretanto, uma limitação
desse estudo que deve ser considerada é o fato de que os experimentos foram
realizados em ratos anestesiados que receberam ressuscitação fluídica. Sob estas
condições, os ratos respondem a doses elevadas de LPS com um desenvolvimento
lento e progressivo na queda da pressão sanguínea (119, 120). O presente estudo
foi realizado em ratos não anestesiados que não receberam ressuscitação com
fluidos, condição em que os animais respondem a altas doses de LPS com uma
queda rápida da pressão arterial que corresponde ao tempo de desenvolvimento da
hipotermia (80-90 min pós-LPS).
Os nossos resultados do efeito do SC-560 na dinâmica cardiovascular não
foram os primeiros a demonstrar que a isoforma COX-1 é requerida para o
desenvolvimento da hipotensão ao LPS, contudo, foi o primeiro a dissecar
componentes cardiovasculares importantes que interferem com a pressão arterial,
como pressão diastólica (PD), pressão sistólica (PS), frequência cardíaca (FC) e
93
contratilidade ventricular (dPdt máx) durante o choque endotóxico enquanto
estudando o papel da COX-1 nestas respostas. Interessantemente, nas respostas
cardiovasculares, o SC-560 causou um aumento considerável na pressão arterial
antes da queda induzida por LPS e no tempo correspondente ao início de atenuação
da hipotermia (30 min pós-LPS). Embora a hipotermia e a hipotensão sejam
temporariamente associadas deve-se salientar que os seus mecanismos podem não
ser idênticos (10).
O resultado no painel cardiovascular chamou nossa atenção devido ao
aumento na pressão arterial logo após 30 min da injeção do LPS dos ratos que
receberam o SC-560. Este aumento foi associado ao aumento na frequência
cardíaca e aumento na contratilidade ventricular (dP/dt máx). O pico de aumento da
FC correspondeu à atenuação da hipotensão nos animais pré-tratados com o SC-
560. Em virtude do padrão de resposta cardiovascular visto nos nossos resultados e
sabendo-se que prostanoides derivados da COX-1 podem atuar no sistema nervoso
simpático que controla algumas atividades cardíacas (152) como a frequência
cardíaca, pensamos em um mecanismo de ação da COX-1 sobre parâmetros
cardiovasculares que pode alterar a resposta termorregulatória durante o
choque. Supomos que o inibidor da COX-1, o SC-560, atuando diretamente sobre a
COX-1 envolvida na regulação simpática do coração poderia aumentar a FC e,
consequentemente, atenuar a hipotensão e indiretamente a hipotermia, uma vez que
o trabalho cardíaco sabidamente contribui para a produção de calor (136) e este
calor poderia então amenizar a queda na temperatura corporal. O objetivo desta
hipótese foi determinar se a resposta hipotérmica atenuada pelo SC-560 desaparece
nos animais tratados com SC-560 e que não desenvolvem taquicardia pelo bloqueio
da simpatoexcitação cardíaca causado pelo propranolol.
O propranolol, primeiro antagonista de receptores beta-adrenérgicos usado
clinicamente, foi descoberto em 1964 e introduzido na prática clínica para tratamento
de doenças cardiovasculares, como na hipertensão (153). Neste trabalho, a dose
utilizada foi escolhida com base em estudos mostrando que o propranolol tem uma
afinidade 100 vezes menor para os receptores adrenérgicos β3 presentes em
adipócitos do que para receptores adrenérgicos presentes no coração (154), o que
nos confere mais segurança de que a dose utilizada não estaria estimulando
aumento no VO2. Como já bem estabelecido na literatura, vimos que o propranolol
94
causa diminuição na FC (155), e este efeito foi observado tanto nos ratos pré-
tratados com SC-560 ou seu veículo. No entanto, a administração de propranolol
não apresentou efeitos significativos sobre a pressão sistólica, diastólica e VO2
nesses animais, isto é, a dose de propranolol usada não causou queda considerável
na pressão arterial ou no VO2, e o efeito atenuante do SC-560 sobre a hipotensão e
hipometabolismo persistiu. Além do mais, o pré-tratamento com o propranolol
bloqueou completamente a resposta taquicárdica ao SC-560, evitando o aumento da
FC visto nos animais em que a COX-1 é inibida, no entanto, o efeito atenuante do
SC-560 sobre a hipotermia persistiu mesmo com o bloqueio da taquicardia durante o
choque endotóxico. Com este resultado, refutamos a hipótese de que o aumento da
FC causado pelo bloqueio da COX-1 seria o responsável pela produção de calor que
estaria levando à atenuação da resposta hipotérmica.
Como um dos nossos objetivos era investigar se a COX-1 que participa da
inflamação sistêmica grave é proveniente do baço, realizamos experimentos de
esplenectomia para ver se o efeito atenuante do SC-560 sobre a hipotermia,
hipometabolismo, hipotensão e acidose metabólica persistia ou não na ausência do
baço. Inicialmente, nos questionamos se somente a ausência do baço, sem o
bloqueio da COX-1 pelo SC-560, seria suficiente para atenuar a hipotermia e
hipotensão durante o choque endotóxico. Notamos que somente a ausência do
baço, sem pré-tratamento com SC-560, é suficiente para atenuar a hipotermia
sem, no entanto, eliminá-la, sugerindo que a COX-1 esplênica é requerida, pelo
menos em parte, para o desenvolvimento dessa resposta. Da mesma forma,
somente a ausência do baço é suficiente para atenuar a hipotensão induzida pelo
LPS, o que também sugere que a COX-1 esplênica tem um papel importante no
desenvolvimento da hipotensão durante o choque endotóxico.
Sabendo-se então da contribuição do baço para o desenvolvimento das
alterações fisiológicas estudadas, fomos avaliar de forma mais direta se a COX-1
envolvida na inflamação sistêmica é a esplênica. Um importante achado do presente
estudo foi que na ausência do baço o efeito atenuante do SC-560 na hipotermia
causada pelo desafio com LPS é eliminado, mas somente na fase avançada da
resposta (60-100 min pós-LPS). Já havia sido demonstrado pelo nosso laboratório
(10) que durante as respostas hipotérmica e hipotensiva induzidas por LPS, a
atividade da COX-1 não estava alterada no fígado, nos rins, nos pulmões e no
95
cérebro, porém, estava aumentada no baço e esse resultado prévio nos levou a
investigar a participação do da COX-1 esplênica nessa resposta. O aumento da
atividade dessa isoforma no baço corrobora com nossos resultados, uma vez que,
no momento em que a COX-1 presente no baço é eliminada pela esplenectomia, o
efeito atenuante do SC-560 sobre a resposta termorregulatória deixa de existir, mas
isso ocorre somente na fase final da resposta.
Nessa mesma linha de raciocínio, vimos que a resposta hipotensiva foi
atenuada nos animais esplenectomizados apenas na fase inicial, mas não na fase
mais avançada da resposta, assim sugerindo que o desenvolvimento da hipotensão
na fase mais avançada da resposta também parece depender da COX-1 esplênica,
uma vez que o efeito atenuante do SC-560 some quando o baço é removido.
Para melhor visualizarmos como a esplenectomia influencia o efeito
atenuante do SC-560, analisamos o padrão de resposta do efeito do SC-560 em
três alterações características de choque: hipotermia, hipotensão e acidose
metabólica, comparando tais respostas na ausência e na presença do baço. Nos
animais que não foram esplenectomizados, ou seja, na presença do baço, o efeito
atenuante do SC-560 foi observado em duas fases: uma fase inicial que ocorreu no
tempo de 30 a 60 min pós-LPS e uma fase final no tempo de 60 a 100 min pós-LPS.
Quando os animais são submetidos à esplenectomia, ou seja, na ausência do
baço, a hipotermia induzida por LPS foi atenuada, mas apenas na fase inicial da
resposta (30-60 min), indicando que o desenvolvimento da hipotermia parece ser
independente da COX-1 esplênica nessa fase, já que o efeito anti-hipotérmico do
SC-560 não foi eliminado mesmo com a remoção do baço. Entretanto, na fase mais
tardia da resposta (60-100 min pós-LPS), a hipotermia não foi atenuada pelo SC-560
e, portanto, a resposta de atenuação parece ser dependente da COX-1 presente no
baço.
Da mesma forma, o efeito atenuante do SC-560 sobre a resposta
hipotensiva ocorre na presença do baço nas duas fases da resposta, sendo mais
pronunciado na fase inicial. Por outro lado, na ausência do baço o efeito anti-
hipotensivo do SC-560 durante o choque endotóxico é eliminado na fase mais
avançada da resposta (60-100 min), mas permanece na fase mais inicial.
Também analisamos o efeito do SC-560 sobre a acidose metabólica e o
padrão de resposta foi semelhante ao visto para a Tc e PAM, no qual na presença
96
do baço, o efeito anti-acidose do SC-560 está presente nas duas fases da resposta,
enquanto na ausência do baço o efeito anti-acidose do SC-560 é eliminado na fase
mais avançada dando lugar ao efeito pró-acidose, mas permanece na fase mais
inicial.
Com isso, concluímos que, assim como para a hipotermia, a COX-1 esplênica
é requerida para o desenvolvimento da hipotensão e da acidose metabólica em
resposta ao LPS, uma vez que quando a COX-1 presente no baço é eliminada o
efeito atenuante do SC-560 sobre essas três respostas fisiológicas desaparece, pelo
menos na fase mais avançada da resposta. Desse modo, este resultado é, até o
momento, o único que demonstra de forma direta o efeito da esplenectomia sobre os
componentes hipotérmico, metabólico e hipotensivo na resposta inflamatória
sistêmica grave.
Até aqui, mostramos que a COX-1 é a isoforma requerida para o
desenvolvimento de hipotermia, hipometabolismo, hipotensão e acidose metabólica
durante o choque endotóxico. Além disso, nossos resultados mostraram que essas
alterações fisiológicas induzidas pelo LPS ocorrem com a participação da COX-1
esplênica, mas somente na fase mais avançada da resposta. Entretanto, nossos
dados mostraram que o desenvolvimento das alterações termometabólica e
cardiovascular na fase mais inicial também envolve a participação da COX-1,
embora esta não seja a isoforma proveniente do baço. Várias hipóteses podem ser
levantadas e uma delas é que a COX-1 atuante no tempo de 30-60 min pós-LPS
possa ser a isoforma presente nas plaquetas. Isso porque as plaquetas são
componentes críticos do sistema imune e são ativadas na inflamação sistêmica e
sepse, resultando em trombocitopenia (156-159). Estudos mostram que as
plaquetas regulam a inflamação e a sepse através de vários mecanismos, uma vez
que expressam o receptor TLR4, o qual o LPS reconhece. As plaquetas contribuem
para a inflamação por meio da liberação de citocinas e mediadores lipídicos quando
estimuladas. Ademais, a COX-1 é a isoforma dominante nas plaquetas (115). Com
isso, uma possibilidade é de que a COX-1 produzida no início da resposta
hipotérmica e hipotensiva durante o choque endotóxico seja proveniente das
plaquetas.
Outra suposição é que a fonte da COX-1 que participa das alterações mais
iniciais durante o choque endotóxico possa ser os mastócitos. Os mastócitos são
97
células importantes para a resposta inflamatória induzida por LPS. Uma vez
ativados, os mastócitos sintetizam e liberam mediadores incluindo aminas, citocinas
e mediadores lipídicos, muitos dos quais estão implicados na resposta
termorregulatória ao LPS e sabidamente pode ser uma importante fonte de citocinas
(160). Além do mais, sabe-se da contribuição dos mastócitos no desenvolvimento de
respostas alérgicas através da produção de PGD2, o principal metabólito da via das
ciclooxigenases liberado por mastócitos ativados que tem efeitos pró-inflamatórios
sendo relevante na fisiopatologia de doenças alérgicas tendo, portanto, um papel
demonstrado na produção de prostanoides (161). Os macrófagos também são um
tipo celular de interesse, uma vez que há relatos de que a hipotermia induzida por
LPS seja atenuada em ratos cujos macrófagos foram eliminados por lipossomas
carregados com diclorometileno (149) e os mastócitos são células
reconhecidamente produtoras de PGD2 (162). Uma perspectiva futura é o estudo in
vitro de macrófagos e mastócitos desafiados com LPS para identificar o possível
mediador derivado da isoforma COX-1 que participa da primeira fase da resposta
que ocorre de modo independente do baço no choque endotóxico.
Resultados relacionados ao Objetivo 3.1.2:
Dentre os possíveis mecanismos pelos quais a COX-1 esplênica poderia
participar no choque endotóxico, encontra-se a modulação da produção de citocinas.
Nossa proposta inicial é que os prostanoides derivados da COX-1 esplênica
medeiam as respostas termometabólica e cardiovascular durante o choque
endotóxico de modo dependente de citocinas, uma vez que tais mediadores são
essenciais para o desenvolvimento das alterações observadas em casos de
inflamação sistêmica (99). Para verificarmos esta hipótese, dosamos citocinas
próinflamatórias envolvidas na inflamação sistêmica, como TNF-α e IL-1β, além da
citocina anti-inflamatória IL-10, no plasma de animais que receberam SC-560 ou seu
veículo e induzimos o choque com LPS. Sabe-se que o TNF-α é uma citocina
essencial para o desenvolvimento das respostas hipotérmica e hipotensiva. O TNF-α
em altas concentrações medeia a hipotermia, enquanto que em baixas
concentrações medeia a febre (89, 163, 164). A IL-10, por sua vez, modula a síntese
de TNF-α e previne a letalidade no modelo de endotoxemia (165). No entanto,
nossos resultados demonstraram que a indução de hipotermia e hipotensão não
98
parece depender de prostanoides derivados da COX-1 modulando a produção de
citocinas, uma vez que na fase inicial da resposta hipotérmica e hipotensiva tais
citocinas não foram detectadas e, desse modo, a COX-1 que, na fase inicial não é
proveniente do baço, age independentemente de citocinas. Além disso, na fase mais
avançada da resposta, onde a COX-1 que participa da hipotermia e hipotensão é a
esplênica, os níveis de citocinas encontrados nessa fase não foram estatisticamente
diferentes entre os animais que receberam o SC-560 ou o veículo e, nesse caso, a
COX-1 esplênica estaria atuando de modo independente de citocinas.
Para ter certeza de que as citocinas não estariam atuando no choque
endotóxico através da modulação via COX-1, nós realizamos RT-PCR em tempo
real para verificar o nível de expressão de mRNA de tais citocinas nos tecidos 80
min pós-LPS, uma vez que é possível que as mesmas não estivessem presentes no
plasma, mas poderiam estar sendo sintetizadas nos tecidos. Neste experimento, nós
optamos por testar a expressão relativa do mRNA das citocinas usando dois genes
housekeeping (GAPDH e β-actina) e a análise da expressão do mRNA das citocinas
nos tecidos foi feita com base na média dos valores dos Ct dos dois genes
housekeeping.
Nossos resultados mostraram que o nível de expressão das citocinas TNF-α,
IL-1 e IL-10 aumentou consideravelmente nos órgãos dos animais desafiados com
LPS quando comparado aos animais não tratados com LPS, sobretudo no fígado e
pulmão, o que já é bem estabelecido na literatura o desafio com LPS estimular a
síntese de citocinas (166). No entanto, apesar do aumento na expressão dessas
citocinas ter sido observado durante o choque endotóxico, nossos resultados
mostraram que no tempo de 80 min pós-LPS não houve diferença estatística na
expressão dessas citocinas nos animais pré-tratados com SC-560 ou seu veículo
nos órgãos como fígado, pulmão e diencéfalo, no entanto, no baço houve uma
diminuição significativa na expressão do mRNA da citocina IL-10 nos animais em
que a COX-1 foi inibida sistemicamente pelo SC-560. Esse resultado é interessante
visto que de acordo com um estudo de Harden et al. (167), a IL-10 participa do
desenvolvimento de hipotermia e, dessa forma, neste trabalho, a atenuação da
hipotermia pela inibição da COX-1 possa ser explicada pela diminuída síntese de IL-
10 com potencial criogênico. Além do mais, notamos uma tendência à expressão
aumentada de IL-1β no baço dos animais em que a COX-1 foi bloqueada, o que
99
poderia indicar um aumento na sinalização febrigênica que, por sua vez, poderia
levar à atenuação da hipotermia.
Nossos resultados ainda não nos permitem saber com certeza se essa
modulação de citocinas no baço é relevante, no entanto, algumas especulações
podem ser feitas. Primeiro, a COX-1 esplênica poderia estar agindo unicamente
através da produção de eicosanoides e estes, por sua vez, atuando diretamente em
tecidos distantes, não necessariamente no baço, sem participação direta das
citocinas. Segundo, o efeito das citocinas encontradas na fase mais avançada da
resposta poderia ser seletivo (no próprio baço, por exemplo) levando às alterações
fisiológicas da inflamação sistêmica sem mudar os níveis circulantes das citocinas.
Mas como essa alteração seletiva poderia desencadear as alterações fisiológicas
sem que as citocinas caíssem na circulação? Uma possibilidade, pelo menos para
as alterações na Tc, seria através da comunicação neuroimune do baço com o
Sistema Nervoso Central. Sabe-se que alterações na Tc são reguladas pelo sistema
nervoso central. A existência de inervação aferente do baço foi questionada por um
tempo, embora os autores de um estudo usando traçado retrógrado fluorescente
tenham reconhecido que pode haver um pequeno número de fibras aferentes
inervando a região hilar do baço e/ou a vasculatura associada (168).
Funcionalmente, vários estudos demonstraram claramente que as fibras aferentes
transmitem informações sensoriais do baço (169-171). Além disso, a evidência para
a inervação aferente do baço foi agora demonstrada histologicamente (169) e por
medição eletrofisiológica direta (172). Sendo assim, uma hipótese seria que a COX-
1 esplênica module a produção de citocinas via prostanoides e estas citocinas,
através dos nervos aferentes esplênicos, são transportadas para a área preóptica
(área que regula a Tc) e desencadeie as alterações termorregulatórias observadas
durante o choque endotóxico.
Nossos resultados, portanto, indicam que os prostanoides derivados da COX-
1 esplênica podem agir na fase mais avançada da resposta através da estimulação
da citocina IL-10 (com potencial criogênico) e diminuição da síntese de IL-1β
(inibindo sinalização febrigênica) no baço que pode ter um papel na indução da
hipotermia, mas os prostanoides derivados da COX-1 não parecem agir através da
modulação das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 para indução de hipotermia,
hipometabolismo e hipotensão durante o choque na fase mais inicial, pois essas
100
alterações ocorreram independentemente de mudanças nos níveis circulantes
dessas citocinas. Este trabalho, no entanto, suscita uma mudança de paradigma no
que diz respeito à produção inicial de citocinas inflamatórias, tais como o TNF-α,
como sendo a liberação incipiente dessa citocina a responsável pelas alterações na
temperatura e nos componentes cardiovasculares (173) (164), uma vez que este
estudo mostrou que a atuação da COX-1 precede citocinas inflamatórias na primeira
fase da resposta hipotérmica, hipometabólica e hipotensiva durante o choque
endotóxico.
Resultados relacionados ao Objetivo 3.1.3:
O nosso foco é desvendar o mecanismo pelo qual a COX-1 leva ao
desenvolvimento de hipotermia, hipometabolismo, hipotensão e acidose metabólica
que estão associadas aos casos mais graves de inflamação sistêmica.
Na literatura, muitos estudos mostraram o papel do TNF-α na sepse como
sendo um mediador importante para o desenvolvimento de hipotermia e hipotensão,
no entanto, uma limitação de alguns desses trabalhos é a falta de uma investigação
mais detalhada do que acontece nas fases mais iniciais do desenvolvimento dessas
respostas na sepse, além do mais o modelo experimental utilizado pode interferir
com as alterações fisiológicas observadas. Alguns estudos mostraram que a injeção
de LPS aumenta a produção inicial de citocinas pró-inflamatórias com um pico entre
4 a 6 horas pós-LPS (174-176). No entanto, alguns modelos de endotoxemia
utilizados apresentam interferências tais como a indução de estresse por meio da
injeção intraperitoneal de LPS. Além do mais, esses estudos não mostram o que
acontece no momento mais inicial do desenvolvimento da inflamação. No nosso
modelo, a administração não estressante de LPS juntamente com a aquisição de
medidas fisiológicas basais e após o desenvolvimento da inflamação sistêmica, nos
permite obter dados mais detalhados e confiáveis, além de permitir observar o que
acontece nos primórdios da inicialização da inflamação sistêmica grave, como a
produção e participação de eicosanoides antes mesmo da produção e atuação das
citocinas no modelo de choque endotóxico.
Uma vez que no nosso trabalho a COX-1 parece não depender de citocinas,
pelo menos na fase mais inicial da resposta, uma possibilidade para explicar o
envolvimento da COX-1 no choque endotóxico é que o efeito do próprio prostanoide
101
derivado desta isoforma, sem a modulação da produção de citocinas, ocorra
possivelmente em tecidos distantes, não necessariamente no baço. No sangue, os
mediadores lipídicos, tais como as prostaglandinas, circulam predominantemente na
forma de complexos com seu carreador principal, a albumina. A ligação à albumina
normalmente aumenta a atividade biológica do mediador anfipático e também o
protege da rápida degradação enzimática (177). Tendo em vista o envolvimento
potencial de mediadores inflamatórios locais e sistêmicos no choque em resposta ao
LPS, uma hipótese é que as prostaglandinas derivadas da COX-1 ativada no baço
caem na circulação e, transportadas pela albumina, atuam em tecidos distantes de
modo independente de citocinas, podendo agir tanto ao nível dos vasos sanguíneos
(capilares, arteríolas ou vênulas), do coração e do Sistema Nervoso Central,
causando alterações termormetabólicas e cardiovasculares.
Os nossos resultados de lipidômica são preliminares, uma vez que muitos
analitos não foram detectados, pois o método ainda precisa de otimização,
entretanto, ainda assim, nos nossos resultados preliminares alguns dados são
interessantes, o que justificou a inclusão dos mesmos nesta dissertação. Notamos
no plasma que o LTB4 foi detectado em altas concentrações nos dois tempos da
resposta após injeção de LPS e já é bem estabelecido na literatura seus efeitos na
indução de processos inflamatórios por participar principalmente como um agente
quimiotáxico (178-180) e, assim, sua produção elevada pode contribuir para a
intensa resposta inflamatória. No baço, uma variedade maior de eicosanoides foi
detectada. PGE2 foi detectada em concentrações acima do limite de detecção, o que
se torna um interessante metabólito na indução das alterações fisiológicas que
ocorrem no choque endotóxico, uma vez que se sabe do seu papel como um
prostanoide vasodilatador (181) que em altas concentrações é capaz de agir nos
vasos sanguíneos contribuindo para o desenvolvimento da hipotensão. Além desse
prostanoide, o TXB2 que reconhecidamente participa da indução de alterações
cardiovasculares, como vasoconstrição e agregação plaquetária que, por sua vez,
contribuem com o desenvolvimento de trombose, coagulação intravascular
disseminada (CIVD), além de comprometimento renal (115), efeitos colaterais vistos
em casos de sepse, de forma interessante, foi significativamente reduzido no baço
dos animais tratados com o SC-560 nos dois tempos da resposta, mostrando que o
TXB2 é produzido via COX-1.
102
De modo interessante, a PGD2 não foi detectada no plasma, mas o seu
metabólito sim, enquanto que no baço a PGD2 foi detectada em altas concentrações
nos dois tempos da resposta e, embora essa alta concentração não nos tenha
permitido observar se houve diferença entre os grupos SC-560 ou seu veículo, a
detecção desse prostanoide nos permite inferir sua possível participação no
desenvolvimento de alterações vistas no choque endotóxico. Um mecanismo
sugerido é que a PGD2 derivada da COX-1 é um candidato potencial para a
indução da hipotermia pelo LPS, uma vez que induz a hipotermia quando injetada
em ratos tanto por via intracerebroventricular (59) ou por via intravenosa: como um
complexo de albumina ou como uma solução hidroalcoólica. Deve notar-se, no
entanto, que Krueger et al. (182) relataram que doses elevadas de PGD2 causam
febre em vez de hipotermia em coelhos; os mesmos autores sugeriram que os
efeitos da PGD2 na termorregulação (e o sono) podem ser espécies específicas.
Gao et al. (183) relataram que a PGD2 intracisternal não causa hipotermia em ratos
e, de fato, causou febre, possivelmente através da interferência com o transporte da
PGE2 febrigênica no cérebro. Nossos resultados preliminares não confirmam a
participação da PGD2 como sendo o prostanoide que leva ao desenvolvimento de
hipotermia, pois o método ainda precisa ser otimizado, no entanto, a elevada
concentração de PGD2 não descarta seu papel nessa resposta como tendo potencial
criogênico.
Outro resultado que nos chamou atenção foi a detecção do LTC4 no baço.
Sua concentração foi maior no tempo de 30 min pós-LPS nos animais do grupo
veículo e foi significativamente reduzido no baço dos animais em que a COX-1 foi
inibida nessa fase da resposta em que as alterações ocorrem de modo
independente da COX-1 esplênica. Já foi reportado que o LTC4 pode atuar como um
agente criogênico endógeno (184) e, portanto, pode também ser um candidato
importante para induzir hipotermia. O que não esperávamos era que a concentração
desse leucotrieno fosse ser diminuída com o tratamento pelo SC-560, uma vez que
a literatura mostra ser um inibidor seletivo para COX-1 (140), mas não existem
trabalhos que testem sua seletividade para outras vias do AA. Esse resultado
inesperado pode abrir caminhos para investigar se o SC-560, além de inibir a COX-
1, pode também interferir com outras vias como a do leucotrieno.
103
7. CONCLUSÃO
Nossos resultados identificaram um papel essencial da COX-1 na fase mais
inicial da inflamação sistêmica grave, uma vez que é a isoforma requerida para o
desenvolvimento da hipotermia, além de também participar da indução de
hipometabolismo, hipotensão e acidose metabólica durante o choque endotóxico.
Nossos resultados ainda indicam que o mecanismo de ação da COX-1 no
choque endotóxico apresenta duas fases distintas:
(i) na fase inicial da resposta a COX-1 envolvida não é proveniente do
baço e age de forma independente de citocinas;
(ii) na fase avançada da resposta a COX-1 parece agir de forma
dependente do baço e através da produção de prostanoides, tais
como PGE2 e PGD2 (consistentemente produzidas no baço), ou
redução de leucotrienos, como LTC4 (produzido no baço), e esta
ação pode depender de efeitos locais de citocinas IL-10 e IL-1β, mas
sem que haja alterações sistêmicas nos níveis dessas citocinas.
104
De acordo com: International Comittee of Medical Journal Editors. [Internet]. Uniform requirements for manuscript
submitted to biomedical journals. [2011 Jul 15]. Available from:
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