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OBIETTIVI Negli ultimi anni le coppie in cui uno o entrambi i partnersono affetti da patologie infettive quali HIV, HCV o HBV, sisono rivolte sempre più spesso alla procreazione medical-mente assistita. Il loro desiderio di genitorialità è identico aquello di qualsiasi altra coppia; inoltre, il miglioramento dellaqualità e della aspettativa di vita, insieme con la maggior ef-ficacia delle terapie farmacologiche, ha fatto sì che questecoppie trovassero nella procreazione medicalmente assistitaun valido strumento per la realizzazione di tale desiderio.Tale situazione può riguardare sia coppie per le quali sia stataeffettuata una diagnosi di infertilità, sia coppie potenzial-mente fertili che si rivolgono appositamente ad un centro diinfertilità al fine di eliminare il rischio di contagio. Essendo in-fatti queste infezioni virali sessualmente trasmissibili con ele-vato rischio anche per il feto, costituiscono una causa ostativaalla riproduzione consentendo pertanto alle coppie in cui unoo entrambi i partner sono affetti da patologie infettive di ac-cedere alle tecniche di riproduzione medicalmente assistita.Il centro di procreazione medicalmente assistita che decide ditrattare coppie positive o sierodiscordanti deve predisporreun sistema di gestione e controllo interno, atto a garantire lasicurezza per le coppie non infette trattate nel medesimo cen-tro, per le coppie positive o sierodiscordanti stesse, per l’even-tuale nascituro e per gli operatori.

CAPITOLO 9TRATTAMENTO DELLE COPPIE POSITIVE O SIERODISCORDANTI ALLO SCREENING

VIROLOGICO

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INDICE

• Procedura generale• Esami diagnostici• Impianto e organizzazione del laboratorio

nella gestione del materiale infetto• Gestione pratica del trattamento delle coppie

positive o sierodiscordanti• Trattamento dell’uomo infetto• Trattamento della donna infetta• Crioconservazione del materiale infetto• Pulizia e sanificazione• Riferimenti bibliografici

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IDENTIFICAZIONE DEI PAZIENTI ETRACCIABILITÀ NEL LABORATORIO

PRIMA DEL TRATTAMENTO

• Scrivere Procedure Operative specifiche e aggiornarle periodicamente• Predisporre percorsi separati (spazialmente o temporalmente) per la gestione dei

materiali e delle cellule potenzialmente infettive• Verificare la validità esami sierologici di Anti-HIV-1,2, HBsAg, Anti-HBc, Anti-HCV Ab

ed eventualmente l’HTLV-I, malaria, Zika... per i pazienti esposti alle zone a rischio:validità di 90 giorni per il primo tentativo e di 180 giorni dal secondo in poi

• Predisporre almeno una banca di quarantena per conservare temporaneamente ilmateriale sottoposto a trattamento e in attesa del referto

• Se possibile, vaccinare per l’epatite B il personale così come il partner di unsoggetto infetto da HBV

DURANTE IL TRATTAMENTO

DOPO IL TRATTAMENTO

• Limitare l’accesso del personale autorizzato ed adeguatamente istruito aquello strettamente necessario per l’effettuazione del trattamento

• Indossare i Dispositivi Individuali di Protezione• Prevedere il maggior impiego possibile di materiale monouso• Lavorare in modo pulito, contaminando meno strumentazione possibile e

pulendo immediatamente eventuali stravasi accidentali• Utilizzare incubatori differenti opportunamente segnalati e ben identificati

per le diverse patologie • Utilizzare banche separate per ogni patologia opportunamente segnalate e

ben identificate per la crioconservazione dei gameti e degli embrioniottenuti

• Eliminare tutti i rifiuti negli appositi contenitori per lo smaltimento di rifiuti sanitaripericolosi a rischio infettivo (prestare particolare attenzione al materiale pungente etagliente)

• Pulire e sanificare tutta la strumentazione, le attrezzature e gli ambienti utilizzati per iltrattamento di materiali e cellule potenzialmente infetti

• Registrare tutte le operazioni effettuate sugli appositi registri

PROCEDURA GENERALEIl laboratorio di procreazione medicalmente assistita chetratta coppie positive o sierodiscordanti deve assicurare requi-siti di sicurezza e tracciabilità particolari e mettere a puntoprocedure operative specifiche. Tali procedure devono essereopportunamente scritte ed inserite nel Manuale Operativo edevono essere sottoposte a revisione periodica.In particolare, devono essere stabiliti percorsi e modalità ditrattamento e conservazione dei materiali infetti diversi e se-parati da quelli previsti per le coppie negative. Tali percorsi ri-guardano sia la gestione della coppia sia quella dei campioni,e devono coinvolgere anche i materiali, la strumentazione ele attrezzature che vengono utilizzate. La separazione dei per-corsi può essere sia di tipo spaziale, utilizzando laboratori odaree del laboratorio differenti, o di tipo temporale, program-mando il trattamento delle coppie positive o sierodiscordantiin momenti diversi dai pazienti negativi. Questo può essererealizzato mettendo le sessioni di lavoro come ultime dellagiornata o concentrandole in periodi particolari dell’anno, ap-positamente dedicate ai soli pazienti positivi. Ovviamente inqualsiasi caso alla fine di ogni singolo trattamento dovrà es-sere predisposta una pulizia straordinaria della strumenta-zione e delle attrezzature utilizzate.

ESAMI DIAGNOSTICI

Tutte le coppie in procinto di iniziare un ciclo di pro-creazione medicalmente assistita devono obbliga-toriamente effettuare i seguenti test biologici:

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Anti-HIV-1,2, HBsAg, Anti-HBc, Anti-HCV Ab (DLG-16-2010, all. III, par.2.2). In caso di positività diHBcAb devono essere eseguiti ulteriori test per

definire il rischio relativo a HBV (Tab. 1).In aggiunta, deve essere effettuato anche il test perl’HTLV-I per pazienti che vivono o sono originari di areegeografiche con alta diffusione di tale virus, o che hannopartner o genitori provenienti da tali aree (DLG-16-2010,all. III, par.2.4). I campioni di sangue vanno prelevati nonoltre 90 giorni prima dell’inizio del trattamento e ripetutiogni sei mesi durante il trattamento (Conferenza Stato Re-gioni del 12-03-12, sezione C, par. 1.1).

Si specifica che la prescrizione e la valutazione della sierologiaè esclusivamente di competenza medica e non del personalebiologico e del laboratorio. Ad ogni modo si ritiene utile in-serire nel presente capitolo una cartina riportante la diffu-sione nel mondo del virus HTLV-I (Fig.1) e una tabella perl’interpretazione dei marcatori del virus HBV (Fig. 2), a titolopuramente informativo.

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Fig. 1.Diffusione nel mondo del virus HTLV-1.

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Tabella1. L’interpretazione dei marcatori del virus HBV.

Interpretazione dei marcatori del virus HBV

HBsAg HBcA HBcAb HbsAb HBV- Diagnosi Rischio b(IgM) (IgG) Anti-HBs DNA contagio

+ - - - - Infezione SI recente (fase iniziale)

+ - - - + Infezione (fase SI tardiva)

+ + + - + Infezione attiva (+/- epatite) SI

- + - - + Infezione in SI risoluzione (+/- epatite)

- + + - +/- Infezione in SI risoluzione (+/- epatite)

- +/- + + - Guarigione NO iniziale

- - + + - Pregressa NO infezione

- - + - - Pregressa NO infezione + - + - + Infezione SI cronica + - + - +/- Portatore SI inattivo (HBV- DNA<100.000 copie/ml)

- - +/- +/- + Infezione occulta SI

- - - + - Vaccinazione NO

IMPIANTO E ORGANIZZAZIONE DEL LABORATORIO NELLA GESTIONE

DEL MATERIALE INFETTOSebbene la normativa vigente non richieda spazi separati perla gestione del materiale infetto, è necessario verificare la cor-retta idoneità e sicurezza degli spazi e della strumentazione.

È consigliabile che il laboratorio sia equipag-giato con strumentazione e attrezzature speci-fiche per il trattamento e la manipolazione del

materiale infetto. �È quindi opportuno utilizzare strumentidedicati e utilizzare materiali monouso in tutte le fasi dilavoro che lo consentono.

Nel caso in cui ciò non fosse possibile, bisogna predisporre unaprocedura di pulizia e decontaminazione appropriata e vali-data, che garantisca la disinfezione dopo l’uso.Nello specifico è consigliabile utilizzare: Materiale di consumo e piccola strumentazione: si racco-manda di utilizzare sempre se possibile materiale monouso estrumentazione dedicata. Ove questo non sia possibile, è beneidentificare in modo chiaro la strumentazione necessaria, chedeve comunque essere ridotta al minimo e pulita e sanificata,seguendo l’apposita procedura, dopo ogni suo impiego. Incaso di separazione temporale dei trattamenti, è consigliabileidentificare in modo chiaro le aree in cui verranno trattati icampioni infetti, che dovranno essere comunque il più limi-tate possibile e devono essere pulite e sanificate dopo ogniutilizzo. È fortemente sconsigliato l’uso di materiale tagliente

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e pungente (aghi, siringhe, vetro, ecc.) per ridurre al minimoil rischio di contagio degli operatori. Ove indispensabile, si raccomanda di utilizzare questo tipo dimateriale con estrema cautela eliminandolo immediatamentedopo l’uso negli appositi contenitori per lo smaltimento di ri-fiuti sanitari pericolosi a rischio infettivo taglienti e pungenti.Cappa: nel caso in cui sia il partner maschile ad essere infetto,si raccomanda l’utilizzo di cappa a flusso laminare verticale diclasse II che permette di garantire protezione sia all’operatoresia al campione trattato. La cappa deve essere utilizzata perla valutazione, la preparazione e la manipolazione di sperma-tozoi infetti. Nel caso in cui sia la partner femminile ad essereinfetta, essendo necessario introdurre sotto cappa uno stereo-microscopio per la manipolazione di ovociti ed embrioni, laclasse II non potrebbe comunque più essere garantita, per-tanto è sufficiente l’impiego di una cappa a flusso laminareverticale. In entrambi i casi, deve essere garantito il grado Adell’aria, come previsto dalla normativa vigente.Incubatori dedicati per la coltura embrionale.

All’interno dello stesso incubatore, deve esseretrattata una sola patologia per volta.

Lo stesso, dopo opportuna sanificazione e pu-lizia, può essere riutilizzato per un’altra pato-logia o per coppie sieronegative. È inoltre

necessario che gli incubatori destinati al trattamentodelle coppie positive o sierodiscordanti siano opportuna-mente segnalati e ben identificati quando vengono utiliz-zati per questo tipo di trattamenti.

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Il numero di incubatori da dedicare alle coppie positive o sie-rodiscordanti deve essere stabilito anche sulla base del nu-mero di cicli previsti e deve tenere conto della possibilità diavere due o più patologie in combinazione tra loro. È consigliabile l’impiego di incubatori provvisti di ciclo di ste-rilizzazione.4. Centrifuga dedicata al materiale seminale positivo.

È consigliabile disporre di una seconda centri-fuga per il trattamento del seminale infetto.Qualora non fosse possibile, è consigliabile de-

stinare alloggiamenti separati in cui gestire le diverse pa-tologie. È buona norma procedere comunque con lasani ficazione della centrifuga dopo ogni utilizzo, con le ap-posite procedure di pulizia.

5. Stereo-microscopio e postazione per la micromanipolazionededicati, se possibile.

In alternativa, prevedere la pulizia e sanifica-zione del piano di lavoro dopo ogni uso.

6. Micropipette e pipettatori dedicati o, dove possibile, mo-nouso.

7. È obbligatorio l’impiego di banche separateper lo stoccaggio in azoto liquido di gameti edembrioni (DLG-16-2010, all. III, par.2.2 e Confe-

renza Stato Regioni del 12-03-12, sezione B, par. 6.2).

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Per escludere quindi il rischio di trasmissione di infezione tracampioni conservati.

È necessario dotarsi di banche separate e dedi-cate per ciascuna patologia trattata. È inoltrenecessario avere almeno una banca di quaran-

tena per conservare temporaneamente il materiale sotto-posto a trattamento e in attesa del referto.

È consigliabile quando possibile impiegare di-spositivi di stoccaggio ad alta sicurezza per lacrioconservazione di gameti ed embrioni.

GESTIONE PRATICA DEL TRATTAMENTODI COPPIE INFETTE

O SIERODISCORDANTIIl laboratorio di procreazione medicalmente assistita che in-tende trattare pazienti affetti o positivi per patologie virali,ha il compito di mettere in atto procedure di sicurezza internespecifiche e accurate al fine di garantire la sicurezza non solodei pazienti con infettivologia negativa ma anche del perso-nale e delle stesse coppie infette. È necessario che il centro diprocreazione medicalmente assistita che tratta materiale in-fetto predisponga consensi informati specifici per i diversi trat-tamenti, che devono essere illustrati e fatti firmare dal medicoresponsabile del trattamento. Le coppie infette o sierodiscor-danti devono essere adeguatamente ed esaustivamente infor-mate dei possibili rischi ai quali potrebbero andare incontro,riguardanti sia il partner sano della coppia stessa sia il possi-bile nascituro.

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A tal fine, è consigliato che una coppia sierodi-scordante esegua, prima di intraprendere unpercorso di procreazione medicalmente assi-

stita, una visita da un medico infettivologo che rilasci unadichiarazione sulle condizioni di salute del/dei pazienti in-fetti e una specifica consulenza infettivologica. Tale con-sulenza è fortemente raccomandata qualora la positivitàdovesse riguardare la partner femminile al fine di metterein atto tutte le terapie possibili per ridurre la viremia etutelare l’eventuale gravidanza.

Le coppie devono essere informate circa i rischi di trasmissioneverticale del virus e delle particolari procedure da effettuarein caso di parto (soprattutto in caso di donne positive). De-vono inoltre essere informate anche del rischio di contamina-zione orizzontale del partner sano. L’infettivologo inoltrevaluterà lo stato di salute dei pazienti, prescrivendo gli esamie le eventuali terapie necessarie, e rilascerà una consulenzascritta in cui indicherà il momento più opportuno per iniziareil trattamento di procreazione medicalmente assistita. Primadi iniziare il trattamento, le coppie infette o sierodiscordantidovranno sottoporsi agli esami clinici di laboratorio necessari.Premesso che tutti i campioni dovrebbero essere trattati comepotenzialmente infetti, è comunque raccomandabile, al finedi ridurre il rischio di cross-contaminazione tra campioni bio-logici, che il materiale infetto che entra in laboratorio ri-manga sempre confinato negli spazi appositamente dedicati.È buona norma evitare stravasi o schizzi di fluidi potenzial-mente infetti (sperma e suoi derivati, fluido follicolare), nelcaso in cui ciò dovesse accadere si rende necessario pulire

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prontamente ed accuratamente le superfici contaminate inmodo da evitare la dispersione del virus e possibili contami-nazioni. Al termine delle procedure di manipolazione dei cam-pioni bisogna pulire accuratamente tutte le superfici e glistrumenti utilizzati seguendo la corretta procedura di puliziae sanificazione. Tutto il materiale monouso utilizzato deve es-sere eliminato immediatamente dopo l’uso. Inoltre, è indi-spensabile prestare la massima attenzione alla correttaeliminazione dei fluidi di scarto prodotti dalla pulizia e dallacoltura dei gameti e degli embrioni infetti: questi vanno chiusiin apposite provette per evitare la dispersione aerea ed elimi-nati con i rifiuti a rischio biologico.

Al fine di garantire la massima sicurezza per glioperatori, è bene che questi si proteggano ade-guatamente durante tutte le operazioni di mani-

polazione del materiale biologico infetto o potenzialmenteinfetto, utilizzando propriamente i dispositivi di protezioneindividuale (DPI), che devono essere forniti dalla strutturapresso la quale si lavora.

Questi sono costituiti da: guanti monouso, abbigliamento mo-nouso da indossare sopra il normale abbigliamento da labo-ratorio, occhiali o visiera di protezione (prestando attenzioneche sia presente anche la protezione laterale degli occhi) emascherina. Tutti i DPI vanno regolarmente manutenuti e con-trollati, seguendo le specifiche istruzioni date dal fornitore.

Inoltre, è buona prassi che tutti gli operatori delcentro, così come il partner di un soggetto in-fetto da HBV, siano vaccinati per l’epatite B.

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È necessario che solo il personale autorizzato ed adeguata-mente istruito si occupi della gestione del materiale infetto.In caso di contaminazione accidentale del personale con ma-teriale infetto, è bene rivolgersi immediatamente ad un infet-tivologo ed avviare le adeguate procedure di profilassi. �Infine è raccomandato che sia installato vicino al laboratorioun lavaocchi per consentire il lavaggio veloce in caso di con-tatto accidentale delle mucose con gli agenti infettivi.Il trattamento di coppie infette o sierodiscordanti può essereeffettuato in un centro di PMA, purché il laboratorio sia ingrado di garantire adeguati parametri di sicurezza comequelli descritti nel presente capitolo.Si riporta a titolo informativo, una rappresentazione schema-tica riassuntiva sulla gestione generale dei pazienti infetti (Fig.2), specificando che la decisione di iniziare o meno un datociclo di trattamento è di esclusiva competenza medica.

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Fig. 2.Gestione dei pazienti infetti.

TRATTAMENTO DELL’UOMO INFETTOIl contenitore del liquido seminale viene posizionato sotto lacappa dedicata e, dopo liquefazione, viene valutato per i clas-sici parametri seminali. Il campione viene quindi sottoposto altrattamento di preparazione mediante gradiente di densitàseguito da un successivo swim-up (preferibile) o lavaggio (aseconda delle caratteristiche di base del liquido seminale) interreno di coltura idoneo per gli spermatozoi mediante cen-trifugazione (spermwashing). Al termine di tale procedura sivaluta la concentrazione del campione, si diluisce con unaquantità adeguata di terreno di lavaggio e si separa un’ali-quota che viene inviata al laboratorio per la valutazione dellapresenza del virus mediante tecnica di PCR. La restante partedel campione viene addizionata con il crioprotettore e con-gelata. È consigliabile effettuare il congelamento in supportichiusi e sigillati (cryovials o paillettes ad alta sicurezza). Il semecongelato viene quindi posizionato in un bidone di quaran-tena predisposto ed ad uso esclusivo del campione in esamein attesa del referto di laboratorio. Se il referto certificherà la negatività del campione, lo stessoverrà spostato dalla quarantena alla banca predisposta per iliquidi seminali negativi, in attesa del suo utilizzo. Se il referto certificherà la positività del campione, il campioneverrà spostato dalla quarantena alla banca predisposta per iliquidi seminali positivi per la patologia in esame e la bancadi quarantena sanificata e decontaminata prima di un qual-siasi successivo utilizzo. Tale operazione di pulizia può essereaffidata ad una ditta specifica, che rilascerà un certificato, op-pure fatta direttamente dal personale di laboratorio secondole procedure operative scritte. È opportuno sottolineare che

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nella banca di quarantena può essere contenuto un solo cam-pione per volta in attesa di referto, per evitare la cross-conta-minazione qualora solo uno dei due risultasse positivo.

TRATTAMENTO DELLA DONNA INFETTAIl prelievo ovocitario viene eseguito secondo la normale pro-cedura chirurgica.

È fortemente consigliato programmare l’inter-vento in coda all’attività clinica della giornata.

Le provette vengono portate direttamente sotto la cappa pre-disposta. È consigliabile che la cappa sia foderata utilizzandotelini sterili monouso, lasciando scoperta solo la luce dello ste-reomicroscopio. I complessi cumulo-ovocita recuperati vengono lavati sequen-zialmente per almeno due volte in terreno specifico e posizio-nati nell’incubatore dedicato. Tutte le procedure di manipolazione devono essere effettuatesotto cappa specifica, inclusa quella di decumulazione edeventuale crioconservazione. Anche in questo caso è preferi-bile, ove possibile, effettuare la crioconservazione di ovocitied embrioni in sistemi chiusi. La ICSI andrà effettuata sulla stazione di micromanipolazionepredisposta, avendo molta cura a non ferirsi con gli aghi dainiezione. Nel caso di congelamento, i supporti con gli ovociti/embrionicongelati andranno posizionati nella banca preposta a se-conda della patologia virale in questione.

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CRIOCONSERVAZIONE DEL MATERIALE INFETTO

In caso di trattamento di coppie infette o sie-rodiscordanti, dato il rischio di trasmissione diinfezione, è obbligatorio dotarsi di banche de-

dicate specifiche per la patologia infettiva. In particolare,i campioni dei soggetti positivi per HIV, HBV e HCV, devonoessere conservati in banche separate da quelle contenenticampioni negativi e da quelle dei campioni di cui mancauna documentazione certa di negatività. In aggiunta, ilCentro può disporre un tank di quarantena per eventualicampioni in attesa di referto.

È importante sottolineare che lo stoccaggio in azoto liquidoè l’unica situazione in cui grandi quantità di materiale biolo-gico proveniente da pazienti diversi sono mantenute insiemein un liquido comune.

Pertanto, sarebbe fortemente consigliato, ovepossibile, l’impiego di sistemi di crioconserva-zione sigillati ad alta sicurezza.

L’utilizzo di vapori di azoto per la crioconservazione è efficaceper crioconservazioni a breve termine e per i trasporti. Tutta-via, non si conoscono gli effetti su gameti ed embrioni dellacrioconservazione a lungo termine nei vapori di azoto. Inoltre,funghi e batteri sono stati descritti anche nella fase gassosa.Un’altra soluzione proposta è la filtrazione dell’azoto liquido,che è comunque una procedura complessa e di non sicura ef-ficacia. Infine, la sterilizzazione dell’azoto può essere impie-

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gata durante le procedure di congelamento e scongelamento(è stato riportato che tre risciacqui consecutivi in azoto sterilepossono eliminare funghi e batteri) ma è di difficile applica-zione per lo stoccaggio nella banche a lungo termine.Per quanto riguarda la movimentazione di campioni infetticongelati tra Centri di procreazione medicalmente assistita,va ricordato che devono essere rispettate tutte le norme pre-scritte per i campioni positivi e opportunamente descrittenell’apposito capitolo del presente manuale, tenendo pre-sente che è essenziale fornire tutta la documentazione siero-logica relativa al campione trasportato.

È inoltre fortemente consigliato l’utilizzo dicontenitori di trasporto monouso.

PULIZIA E SANIFICAZIONE

Tutta la strumentazione e i piani di lavoro impie-gati nel trattamento delle coppie positive o sie-rodiscordanti devono essere puliti e sanificati al

termine di ogni utilizzo e comunque alla fine di ogni ciclo ditrattamento, prima di poterli destinare ad un nuovo ciclo.

È fortemente consigliato che questo avvengaanche in quei laboratori in cui la strumentazione(cappe, incubatori, micromanipolatori, microsco -pi, centrifughe, ecc.) è interamente dedicata al

trattamento delle coppie infette, diversa da quella utilizzataper il trattamento dei pazienti negativi.

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È consigliabile utilizzare l’autoclave per steriliz-zare tutto il materiale e la strumentazione che loconsente (ad esempio ripiani e vaschette degli

incubatori, pinze per la manipolazione in azoto liquido).

Per effettuare la pulizia di materiali e strumenti non autocla-vabili, è possibile procedere passando prima con garze steriliimbevute di acqua sterile, quindi utilizzare soluzioni conte-nenti ammonio quaternario, etanolo o ipoclorito di sodio edinfine lasciando asciugare all’aria. Si aspettano quindi circa venti minuti prima di ricominciareuna nuova attività. Esistono in commercio diverse soluzioni già pronte all’uso,non tossiche per gli embrioni, che hanno effetto disinfettantesu batteri, funghi, e alcuni virus e che possono essere utilizzateseguendo le istruzioni di uso fornite con il prodotto stesso. È bene prestare attenzione nel pulire tutte le parti e gli inter-stizi di strumenti e piani di lavoro dove è stato eseguito il trat-tamento del materiale infetto. L’utilizzo di sistemi a raggi ultravioletti sembra non essere par-ticolarmente efficace per l’eliminazione di patogeni virali, inquanto hanno principalmente un’azione batteriostatica e nonhanno invece grande capacità di penetrazione dei materiali. Inoltre devono essere utilizzate con cautela e a distanza daglioperatori, essendo agenti mutageni e dannosi per gli occhi. �È necessario riportare la documentazione di avvenuta puliziae sanificazione di strumentazione e piani di lavoro in un ap-posito registro.

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