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CAPÍTULO 10 BIOSEPARACIONES

Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

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Page 1: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

CAPÍTULO 10

BIOSEPARACIONES

Page 2: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

BIOSEPARACIONES

Remoción de insolubles

Aislamiento primario

Purificación

Acabado

Page 3: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Introducción

Las operaciones que comprenden los

procesos biotecnológicos se dividen en

operaciones previas (“upstream”) y

operaciones posteriores o bioseparaciones

(“downstream”).

La bioseparación comprende todos los

tratamientos que requiere el caldo de cultivo

para la obtención de producto deseado con

la purificación deseada.

Page 4: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES
Page 5: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES
Page 6: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Evolución de los bioprocesos

Se reconocen tres generaciones

Las grandes diferencias estriban en

– El uso o no de células recombinantes

– La concentración al inicio de la bioseparación

– La concentración al final de la bioseparación

– Las técnicas de bioseparación utilizadas

Page 7: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Características de los procesos biotecnológicos

Característica Generación

Primera Segunda Tercera

Período - 1975 1975 - 1985 -

Tipo de células No

recombinantes Recombinantes Recombinantes

Fortaleza de las

células Alta Alta Baja

Conocimiento

de propiedades

básicas

Alto Bajo Bajo

Conocimiento

tecnológico Alto Bajo Bajo

Page 8: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Características de los procesos biotecnológicos

Característica Generación

Primera Segunda Tercera

Producto tipo Antibióticos

Aminoácidos Insulina humana

Factor VIII

tPA

Localización Intra y

Extracelular Intracelular Intracelular

Tamaño Intermedio Macromoléculas Macromoléculas

Actividad al

secretarse Si No No

Pureza deseada Alta Muy alta Muy alta

Similitud con

contaminantes Baja Alta Alta

Valor Bajo Alto Alto

Page 9: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tarea

Qué son el factor VIII de la sangre y el

agente trombolítico activador del

plasminógeno tisular (tPA)?

Page 10: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

El rendimiento y las etapas

Las operaciones de bioseparación deben

seleccionarse con el fin de que el costo sea

mínimo.

Se busca que el rendimiento por paso sea

alto y que el número de pasos sea mínimo

para que el rendimiento global sea alto.

Page 11: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Rendimiento contra número de pasos

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10

Número de pasos

% d

e r

en

dim

ien

to

30%

95%

90%

80% 60%

Page 12: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Remoción de insolubles y ruptura celular

Los principales insolubles que se consideran son

células enteras, restos celulares y cuerpos de

inclusión.

La selección de los equipos depende de la célula, la

disponibilidad del equipo, la eficiencia y el costo.

Las operaciones típicas son la filtración (hongos

filamentosos) y la centrifugación (levaduras,

bacterias y células de mamíferos).

Cuando el producto de interés es intracelular es

necesario romper a las células.

Page 13: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Filtración

La filtración es la separación de un sólido de

un fluido por acción de un medio filtrante y

un gradiente de presión.

En los procesos biotecnológicos se utilizan

tres tipos de mecanismos de filtración.

– Filtración de lecho profundo

– Filtración con formación de torta (convencional)

– Filtración por membranas (micro y ultrafiltración)

Page 14: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES
Page 15: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Fundamentos

La filtración convencional forma parte de un

conjunto de operaciones llamadas

Bioseparaciones Sólido-Líquido (BSL).

Los fundamentos se centran en:

– La filtración como parte de los sistemas de BSL

– El pretratamiento de caldos biológicos

– La teoría de filtración convencional

Page 16: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

La filtración como parte de los sistemas de BSL

Un proceso de

separación sólido-

líquido consta

generalmente de una

o más etapas entre

las que se destacan:

Page 17: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Operaciones en los procesos de BSL

En general todos los sistemas mecánicos de

BSL están basados en dos principios que

dan origen a las operaciones de:

– Sedimentación

– Filtración

Page 18: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Sedimentación

En el proceso de sedimentación la

separación se basa en una diferencia de

densidad entre la fase sólida y la fase

líquida. Entre mayor sea esta diferencia la

separación es más fácil. Cuando esto no

ocurre, la diferencia puede ser aumentada

aparentemente aplicando una fuerza

centrífuga o incrementando la densidad de la

partícula mediante coagulación y floculación.

Page 19: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Filtración

En la filtración la separación se logra

utilizando un medio físico que no permite el

paso de sólidos a través del cual el fluido se

hace pasar por medio de un gradiente de

presión.

Page 20: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Pretratamiento de caldos para BSL

Las propiedades de los caldos sujetos a BSL pueden ser mejoradas por medio de pretratamientos físicos, químicos o biológicos con el objeto de facilitar estas operaciones.

– Pretratamiento térmico

– Coagulación y floculación

– Uso de ayudas-filtro

Page 21: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Pretratamiento térmico

El calentamiento de caldos permite reducir su viscosidad, su volumen y romper estructuras gelatinosas que dificultan las operaciones posteriores. En el caso de caldos con células recombinantes esta operación es obligada por cuestiones de seguridad ambiental. Esta operación es de uso limitado cuando se manejan productos termolábiles.

Page 22: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Coagulación y floculación

Debido a que los caldos biológicos presentan partículas muy pequeñas (0.5 a 100 m), los pretratamientos para incrementar el tamaño de partícula facilitan su manejo.

Las partículas coloidales (tamaño en el rango de una micra) no sedimentan fácilmente debido a que por acción de las cargas superficiales forman suspensiones muy estables llamadas soles.

Page 23: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Coagulación

Las soles pueden ser alteradas por medio de agentes químicos. En el proceso de coagulación se emplean electrolitos simples que neutralizan las cargas repulsivas superficiales de las células o partículas, lo que genera fuerzas de atracción que permiten formar partículas más grandes y densas.

Se utilizan derivados de iones polivalentes positivos como fierro, aluminio y calcio.

Page 24: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Floculación

En el proceso de floculación se utilizan sustancias químicas sintéticas de alto peso molecular llamadas polielectrolitos. Estos producen un efecto combinado ya que actúan neutralizando las cargas superficiales y provocan su atrapamiento por medio de las redes que forman.

Se utilizan derivados de la poliacrilamida, polietilenimina y la poliamina.

Page 25: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Mecanismo de floculación

Page 26: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Uso de ayudas-filtro

Estas sustancias se adicionan al caldo de filtración y/o se utilizan como precubierta del filtro. Los AF actúan como adsorbentes de las partículas coloidales mejorando el tamaño de partícula y mejorando la incompresibilidad y permeabilidad de los sólidos de tal manera que se facilite su filtración.

Los AF más utilizados son las tierras de diatomeas y las perlitas.

Page 27: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Teoría de la filtración

La teoría de filtración convencional se deriva

de los estudios de mecánica de fluidos en

medios porosos. La ecuación que describe el

movimiento de fluidos newtonianos a través

de medios porosos fue formulada en 1856

por el geólogo francés D’arcy.

Page 28: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Concepto de filtración

Page 29: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Teoría de la filtración

La aplicación de esta ecuación al caso particular

donde se desprecian los efectos gravitacionales

(lechos cortos) puede ser descrita como:

l

Pkv

Donde:

v es la velocidad superficial del líquido (flujo volumétrico por área de

filtración)

k es la constante de permeabilidad del lecho

P es la caída de presión a través del lecho

l es la profundidad del lecho

Es la viscosidad del fluido

Page 30: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Teoría de filtración

La velocidad de filtrado puede ser descrita en

términos del volumen de filtrado y el área de filtración

como:

dt

dV

Av

1

Combinando ecuaciones y expresando la relación l/k

como una resistencia R:

R

P

dt

dV

A

1

Page 31: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Teoría de filtración

La resistencia puede expresarse como la suma de

dos resistencias en serie:

mt RR

PA

dt

dV

Esta ecuación aplica a soluciones diluidas en régimen

laminar

Page 32: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tarea

Investigar sobre equipos de filtración

Page 33: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Centrifugación

La separación de sustancias de diferente densidad mediante movimiento giratorio se conoce como centrifugación.

La centrifugación es una de las principales operaciones utilizada para la separación de células de caldos biológicos, especialmente cuando los caldos no son fácilmente filtrables.

Cuando se utiliza la centrifugación la diferencia entre la densidad de los sólidos y el caldo, se incrementa por la acción de las fuerzas centrífugas que se generan por las altas velocidades de rotación de los equipos.

Page 34: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Fundamentos de la centrifugación

El estudio de las BSL por centrifugación está basado

en la teoría de la sedimentación.

La teoría de la sedimentación está basada en la Ley

de Stokes que establece los aspectos básicos del

movimiento de un sólido en un líquido cuando existe

un gradiente de densidad. Los fundamentos se

centran en:

– La Ley de Stokes

– La sedimentación por acción de la gravedad

– La sedimentación por acción de la fuerza centrífuga

– El factor G

Page 35: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

La ley de Stokes

La velocidad de sedimentación de una

partícula esférica en un medio continuo para

Reynolds menores a 1 (región de resistencia

viscosa), está descrita por la ley de Stokes.

Se puede suponer que para las

suspensiones diluidas características de los

caldos biológicos esta ley es aplicable.

Page 36: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

La ley de Stokes

La ley de Stokes establece que cuando se

aplica una fuerza a una partícula en un

medio continuo ésta se acelera (F = ma),

hasta que alcanza una velocidad a la cual la

resistencia a su movimiento iguala a la

fuerza aplicada.

Page 37: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

La ley de Stokes

Las fuerzas que se oponen al movimiento de

partículas puede agruparse en la fuerza de

empuje (principio de Arquímedes) y la fuerza

de arrastre (resistencia de forma y fricción).

Entonces, en el equilibrio

Fuerza de aceleración = fuerza de flotación + fuerza de arrastre

Page 38: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

La ley de Stokes

Para el caso de partículas esféricas:

vdadad

p

Lppp3

66

33

Donde:

dp es el diámetro de la partícula

ρp es la densidad de la partícula

a es la aceleración

ρL es la densidad del fluido

μ es la viscosidad del fluido

v∞ es la velocidad terminal de la partícula

Page 39: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

La ley de Stokes

Resolviendo para la velocidad terminal:

18

2 adv

p

Se puede expresar la velocidad de

sedimentación de la partícula en dos casos

de interés:

– Sedimentación por acción de la gravedad

– Sedimentación por acción de la fuerza centrífuga

Page 40: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Sedimentación por acción de la gravedad

En varios procesos de BSL la fuerza

impulsora en la sedimentación es la

gravedad. La velocidad de sedimentación por

gravedad de una sustancia, proporciona

información básica necesaria para el diseño

de cualquiera de los procesos de

sedimentación.

18

2 gdv

p

g

Page 41: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Sedimentación centrífuga

En las separaciones centrífugas sólido-

líquido la velocidad de sedimentación es

mayor que en la sedimentación por gravedad

debido a que al girar los equipos producen

una mayor aceleración de las partículas.

18

22 rdv

p

Page 42: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Implicaciones de la ley de Stokes

El diámetro aparente de las bacterias es del orden de diez veces menor que el de las levaduras, por lo que su velocidad de sedimentación es 100 veces menor (dp

2).

Las células contienen más del 70% de agua por lo que su densidad es semejante a la de los caldos lo que ocasiona que Δρ sea pequeña.

Algunos caldos biológicos son muy viscosos propiedad que dificulta la sedimentación.

La velocidad de sedimentación en un equipo centrífugo puede incrementarse si se aumenta la velocidad de rotación o la distancia de sedimentación.

Page 43: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tarea

Integrar la ecuación que describe la separación

centrífuga diferencial.

18

22 rd

dt

drv

p

Estimar el tiempo de sedimentación relativo de una

partícula celular de 5 μm de diámetro (núcleo) con

respecto al de una partícula de 1 μm de diámetro

(mitocondria), suponiendo que tienen la misma

densidad y están sujetos al mismo campo centrífugo

de acuerdo a la siguiente figura:

Page 44: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tarea

Page 45: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tarea

La centrífuga de la figura anterior va a ser utilizada para separar levaduras con 10 μm de diámetro y 1.05 g/cm3 de densidad. Las propiedades del caldo se pueden suponer iguales a las del agua. La distancia del eje de giro a la superficie del líquido en los tubos es R1 = 3 cm y la longitud del tubo es de 10 cm. La centrífuga gira a 400 rpm. Estimar el tiempo para lograr una sedimentación completa de las levaduras en suspensión.

Page 46: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Factor G

En la caracterización y escalamiento de

centrífugas frecuentemente se emplea el

factor G, que es una medida relativa de la

velocidad de sedimentación de una partícula

en un campo centrífugo con respecto a su

velocidad de sedimentación en el campo

gravitacional.

g

rG

2

Page 47: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tarea

Investigar sobre equipos de centrifugación

Page 48: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Rompimiento de células

Cuando el producto de interés es

intracelular, una vez realizada la cosecha de

células, se hace necesario romper a las

células para la liberación del producto de

interés.

La técnica de rompimiento celular determina

el tamaño de los desechos resultantes y la

influencia que estos tendrán en las

operaciones que se utilicen para su

separación.

Page 49: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Productos que requieren de una ruptura celular

Tipo de producto Ejemplos

Proteínas recombinantes Insulina, proteína A,

proteína G

Enzimas l-asparaginasa, invertasa,

glucocinasa

Vacunas Tetanos, meningitis

Otros DNA, mitocondrias,

esporas, toxinas

Page 50: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Fundamentos

La recuperación de productos intracelulares requiere

del conocimiento de la estructura de las capas

externas que protegen a las células: la membrana y

la pared celular.

Requiere además del conocimiento de los sistemas

que permiten a ciertas células secretar los productos

de interés.

Los métodos más severos involucran el rompimiento

de la célula. Los menos severos alteran la

permeabilidad de la cubierta celular facilitando la

salida del producto de interés.

Page 51: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Estructura de la pared celular

Las paredes celulares de las bacterias son rígidas y porosas debido a que poseen una elevada presión osmótica interna y a que frecuentemente se hallan expuestas a diferentes condiciones ambientales externas.

Las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas poseen un esqueleto peptidoglucano rígido, cuya unidad básica es el disacárido constituido por N-acetil-D-glucosamina y el ácido C-acetilmurámico.

Page 52: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Estructura de la pared celular

En las células Gram-positivas la capa de

peptidoglucano es mucho más gruesa que

en las células Gram-negativas.

Los esfuerzos deben estar encaminados a

romper el esqueleto de peptidoglucano ya

sea atacando a los péptidos o a los enlaces

glucosídicos que mantienen la estructura.

Page 53: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Métodos de rompimiento celular

Método Técnica Principio Ejemplos

Químicos

Choque osmótico Ruptura osmótica de

membrana Ruptura de glóbulos rojos

Disolución lipídica Desestabilización de la pared

celular por solventes orgánicos

Rompimiento de

levaduras por tolueno

Digestión enzimática Digestión de la pared celular M. lysodeikticus tratados

con lisozima

Tratamiento alcalino Solubilización de membrana

por saponificación de lípidos

Mecánicos

Molido en molino de

perlas

Las células son prensadas

entre perlas de vidrio

Tratamiento de

suspensiones celulares a

gran escala

Homogeneización Las células se rompen al pasar

por un orificio pequeño

Tratamiento de

suspensiones celulares a

gran escala

Page 54: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Choque osmótico

Se fundamenta en el fenómeno de ósmosis.

Page 55: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Choque osmótico

El rompimiento celular por choque osmótico

consiste en la carga de un volumen dado de

células dentro de agua pura. La célula se

expande debido a que contiene solutos que

ocasionan un flujo osmótico hacia su interior.

Esta expansión puede conducir a su lisis o

rompimiento. La factibilidad de este método

depende de la resistencia mecánica de las

células de interés.

Page 56: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Disolución lipídica

La extracción por solventes ha sido usada

para la disolución selectiva de ciertos

componentes celulares.

En la técnica de disolución lipídica se añade

a la suspensión celular un volumen de

tolueno. El tolueno es absorbido dentro de

los lípidos de la pared celular, lo que

produce la expansión de la pared y ruptura

de ésta. El contenido celular es liberado.

Page 57: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Digestión enzimática

La digestión enzimática consiste en el empleo de

enzimas que atacan la pared y provocan el

rompimiento celular

Una de las enzimas más utilizada es la lisozima.

Esta enzima rompe el enlace entre el ácido N-

acetilmurámico y la N-acetil glucosamina de la capa

de peptidoglucano provocando el rompimiento de la

pared y de la célula misma. A pH’s menores a 5 las

células no se rompen aún cuando ya no tenga pared

celular, por lo que se deben buscar condiciones de

solubilidad favorable del protoplasma.

Page 58: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Métodos mecánicos

Las técnicas empleadas a gran escala son:

– La molienda húmeda en molinos de perlas

agitados a alta velocidad

– La homogenización a alta presión

La desintegración celular no es una tarea

fácil si se considera la alta resistencia

mecánica de las paredes celulares y el

tamaño tan pequeño de los microorganismos

(1-10 μm).

Page 59: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tarea

Investigar como funcionan los molinos de

perlas a alta velocidad y los

homogenizadores a alta presión en el

rompimiento celular.

Page 60: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Métodos de permeabilización

Los métodos de permeabilización consisten

en alterar la estructura de la pared y la

membrana celular para facilitar la difusión

del producto hacia el exterior de la célula.

Para esto se utilizan solventes como tolueno

al 5%, detergentes aniónicos, catiónicos o no

iónicos, agentes caotrópicos como guanidina

y urea y agentes quelantes como el EDTA.

Page 61: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Comparación conceptual entre permeabilización y rompimiento

Page 62: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Estructuras químicas de agentes solubilizadores

Page 63: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Métodos de permeabilización

La base de una solubilización efectiva radica

en la estructura del detergente o agente

solubilizante. Estas estructuras tienen una

porción hidrofílica (generalmente iónica) y

una parte hidrofóbica (generalmente un

radical orgánico). Esta estructura permite

interactuar con el agua y con un lípido.

Page 64: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Aislamiento primario

Las técnicas más utilizadas son la extracción

y la adsorción. Estas técnicas permiten

concentrar los productos diluidos de los

caldos biológicos que son obtenidos en la

etapa de separación de sólidos.

Estas técnicas no son muy selectivas

Page 65: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Extracción

La extracción líquido-líquido es una

operación que permite la recuperación de un

soluto de una solución mediante su mezcla

con un solvente.

El solvente de extracción debe ser insoluble

o soluble en grado limitado en la solución

que se va a extraer y el soluto debe

presentar una elevada afinidad por el

solvente de extracción.

Page 66: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Extracción

La extracción líquido-líquido se realiza

básicamente en dos pasos:

– Mezcla íntima del solvente de extracción con la

solución a procesar

– Separación de la mezcla en dos fases líquidas

inmiscibles

Page 67: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Fundamentos

La operación de extracción implica el uso de tres tipos de sustancias cuando menos: el soluto de interés y los componentes puros de cada una de las dos fases.

En base a lo anterior, los fundamentos se centran en: – Tipos de sistemas de extracción líquido-líquido

– Química de la extracción

– Selección del solvente

– Sistemas de dos fases acuosas inmiscibles

Page 68: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tipos de sistemas de extracción líquido-líquido

Los sistemas de extracción presentan

diferente grado de complejidad de acuerdo a:

– Las fases pueden ser completa o parcialmente

inmiscibles.

– La presencia de otros solutos diferentes al soluto

de interés.

– La naturaleza de las fases, siendo lo tradicional

manejar una fase acuosa y una fase orgánica.

Otros sistemas emplean dos fases acuosas

inmiscibles.

Page 69: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Química de la extracción líquido-líquido

Cuando un soluto es repartido entre dos

fases E y R formando soluciones diluidas, al

alcanzarse el equilibrio los potenciales

químicos del soluto en ambas fases son

iguales:

ER

El potencial químico está dado por:

ER ATEATR lnRlnR 00

Page 70: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Química de la extracción líquido-líquido

Si las soluciones son diluidas

Definiendo el coeficiente de partición

xTEyTR lnRlnR 00

y

xK p

Definiendo el coeficiente de partición

T

ERK p

Rln

00

Page 71: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Propiedades del coeficiente de partición

El coeficiente se define sólo en un punto de equilibrio

El coeficiente varía con el nivel de concentración de equilibrio

Para sistemas diluidos el coeficiente puede considerarse constante e igual a la constante de equilibrio

El coeficiente es constante a un temperatura dada, independientemente de la concentración o presión global del sistema

Un valor alto del coeficiente indica que en el equilibrio la concentración de soluto en el extracto es mayor que en el refinado

Los valores del coeficiente se determinan experimentalmente

Page 72: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Coeficientes de partición

Compuesto Soluto Solvente Kp Observaciones

Aminoácidos

Glicina

Lisina

Ac. Glutámico

n-butanol/agua

n-butanol/agua

n-butanol/agua

0.01

0.20

0.07

25 °C

Antibióticos

Celesticetina

Eritromicina

Novobiocina

Penicilina F

Penicilina K

n-butanol/agua

Amil acetato/agua

Butil acetato/agua

Amil acetato/agua

Amil acetato/agua

110.00

120.00

100.00

0.01

32.00

0.06

12.00

0.10

a pH 7.0

a pH 10.5

a pH 4.0

a pH 6.0

a pH 4.0

a pH 6.0

Proteínas

Glucosa

isomerasa

Catalasa

PEG 1550/fosfato de

potasio

PEG/dextrano crudo

3.0

3.0

Page 73: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el solvente

Lo primero que puede hacerse para mejorar

un sistema de extracción es cambiar el

solvente de extracción por uno cuyo potencial

químico estándar esté más próximo a μ0(R).

Puesto que la termodinámica no puede

realizar esto con seguridad se utiliza un

enfoque aproximado que utiliza parámetros de

solubilidad en el cálculo de coeficientes de

partición.

Page 74: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el solvente

El coeficiente de partición puede ser expresado como:

A

EAERARp

TV

VVK

Rln

22

Donde:

Vi son los volúmenes molares parciales del solvente pesado, R, el solvente ligero, E, y el soluto A.

δi son los parámetros de solubilidad correspondientes.

Page 75: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Parámetros de solubilidad

Solvente δ (cal1/2 cm-3/2)

Amilacetato 8.0

Disulfuro de carbono 10.0

Tetracloruro de carbono 8.6

Cloroformo 9.2

Ciclohexano 8.2

Tolueno 8.9

Agua 9.4

Page 76: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el soluto

Cuando no es factible cambiar el solvente es

necesario ver la posibilidad de realizar

cambios en el soluto. Estos cambios deben

ser de carácter reversible.

– Cambios en el soluto por pares de iones

– Cambios en el soluto por pH

Page 77: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el soluto por pares de iones

Los cambios en el soluto dependen del

comportamiento iónico que éste pueda tener.

Si el soluto tiene comportamiento iónico y es

posible encontrar un material que permita

suprimir esta ionicidad sin alterar el soluto,

entonces la unión del soluto a este material

permitirá aumentar la solubilidad del soluto

en el solvente de extracción.

Page 78: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el soluto por pares de iones

Los cambios a solutos empleando

contraiones se basan en el hecho de que un

soluto que es iónico en agua, formará un

par-ión sin carga neta en un solvente

orgánico.

Page 79: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el soluto por pares de iones

Si de una solución acuosa de cloruro de tetrabutilamonio se extrae el catión utilizando cloroformo, se tiene

3.1

aguaen

cloroformoen

494

494

HCN

HCNK p

Si se agrega acetato de sodio a la solución acuosa y se realiza de nuevo la extracción, se encuentra

132

aguaen

cloroformoen

494

494

HCN

HCNK p

Page 80: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el soluto por pares de iones

Puede observarse que en el primer caso se

extrae una solución diluida de par-ión de

N(C4H9)4+Cl – y que en el segundo caso se

obtiene una solución más concentrada de

par-ión de CH3COO – N(C4H9)4+.

El empleo de pares iónicos requiere de la

selección de contraiones solubles en la fase

no polar. Este tipo de sustancias se conoce

como sales grasas.

Page 81: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Contraiones típicos

Ion Estructura química Observaciones

Acetato CH3COO- Simple, poco soluble en

solventes orgánicos

Butirato CH3(CH2)2COO- Más soluble en solventes

orgánicos que el acetato

Tetrabutilamonio (C4H9)4N+ Sólido

Hexadecil-tributilamonio CH3(CH2)15(C4H9)3N+ Puede formar micelas

Perfluor-octanato CF3(CF2)6COO- Puede permanecer iónico

en solventes orgánicos

Dodecanato CH3(CH2)10COO- Puede formar micelas

Linolato CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=(CH2)7COO- Puede formar cristales

líquidos

Tetrafenil-boruro B(C6H5)4- Puede degradarse en

varios solventes

Page 82: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el soluto por pH

Algunos productos como las proteínas o los

aminoácidos son sensibles a cambios en el

pH por lo que el conocimiento de las

propiedades ácido-base es sumamente

importante.

Muchos de los solutos que se desean aislar

son ácidos o bases débiles por lo que su

extracción puede ser afectada por cambios

en el pH.

Page 83: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el soluto por pH

Un ácido débil puede ionizarse parcialmente en

agua y no ionizarse significativamente en un

solvente orgánico.

El ácido débil RCOOH, en solución acuosa, se

disocia de la siguiente manera:

HCOOCOOH RR

Su constante de disociación es

R

RRa

COOH

HCOOK

R

R

Page 84: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el soluto por pH

Cuando este ácido débil se distribuye en dos fases,

una orgánica, E, y una acuosa, R, el coeficiente de

partición aparente se expresa como

Combinando ecuaciones

Ra

ip

H

K

KK

1

RR

Ep

COOCOOH

COOHK

RR

R

Page 85: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el soluto por pH

El Ki es el coeficiente de partición intrínseco y se

define como

Puesto que pKa = - log Ka

a

p

i pKpHK

K

1log10

R

Ei

COOH

COOHK

R

R

Page 86: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cambios en el soluto por pH

Para una base débil: pHpKK

Kb

p

i

1log10

Los cambios en el coeficiente de partición pueden ser usados

también para seleccionar el pH al que debe extraerse

preferentemente un soluto determinado. Para dos solutos A y B

la selectividad de la separación está dada por β, donde:

H

AK

H

BK

BK

AK

a

a

i

i

1

1

Page 87: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tarea

Se dice que una variación de una unidad positiva entre el pH y el pKa provoca que poco más del 90% de las moléculas se encuentren en la forma ionizada. Por el contrario una variación de una unidad negativa entre el pH y el pKa provoca que poco más de 90% de las moléculas se encuentren en la forma molecular.

Compruebe esta afirmación utilizando la ecuación de Henderson-Hasselbach.

Page 88: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Valores de pKa para solutos biológicos

Compuesto pK1 pK2 pK3

Ácido acético 4.76

H3PO4 2.14

Leucina 2.36 (COOH) 9.6 (αNH3+)

Histidina 1.82 (COOH) 9.17 (αNH3+) 6.0 (grupo R)

Lisina 2.18 (COOH) 8.95 (αNH3+) 10.53 (grupo R)

Gly-Gly 3.06 (COOH) 8.13 (αNH3+)

Gly-Asp 2.81 (COOH) 8.60 (αNH3+) 4.45 (grupo R)

Cefalosporina 3.9 5.3 10.5

Lincomicina 7.6

Penicilamina 1.8

Page 89: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tarea

En el sistema agua-amilacetato la penicilina

K y la penicilina F tienen valores de Ki de

215 y 131, respectivamente. Sus pKa’s son

de 2.77 y 3.51.

Si se desea recuperar penicilina F,

determinar cómo se alcanza mayor pureza

de producto: si se extrae a pH 3.0 o a pH

4.0.

Page 90: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Selección del solvente

Se toman en cuenta las siguientes consideraciones: – Selectividad. Para cuando se requiere concentrar con cierto

grado de purificación.

– Coeficiente de partición. Mientras mayor sea menor será la cantidad de solvente a utilizar.

– Grado de solubilidad. Mientras más insoluble sea en la alimentación, la extracción será más fácil.

– Facilidad de recuperación (reutilización).

– Densidad. Mientras mayor sea la diferencia de densidad mayor será la separación de fases.

– Tensión superficial. Una tensión superficial alta favorece la coalescencia.

– Estabilidad del soluto. El solvente no debe cambiar al soluto.

– Otras. Inocuo, esterilizable, no-inflamable, barato y disponible.

Page 91: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tarea

Investigar la solubilidad de diferentes

solventes orgánicos en agua (solventes

inmiscibles con el agua) así como su

densidad.

Page 92: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Extracción en dos fases acuosas inmiscibles

Cuando se opera con sistemas biológicos hay un número limitado de solventes que pueden ser usados en los procesos de extracción ya que algunas moléculas de interés como las proteínas, pueden ser desnaturalizadas por los solventes orgánicos.

La extracción en dos fases acuosas inmiscibles permite preservar la actividad de las biomoléculas.

Page 93: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Extracción en dos fases acuosas inmiscibles

En general los sistemas de dos fases

acuosas se pueden clasificar en dos tipos:

– Los sistemas polímero-polímero

– Los sistemas polímero-sal

Page 94: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Extracción en dos fases acuosas inmiscibles

Los sistemas de dos fases acuosas inmiscibles

polímero-polímero se forman cuando dos

polímeros como el polietilen-glicol (PEG) y el

dextrano (un carbohidrato) se mezclan en

presencia de agua.

En el caso de los sistemas polímero-sal, el

sistema se forma por la mezcla en agua de un

polímero y una sal como el fosfato de potasio.

El hecho común es que ambas fases son acuosas

y el contenido de agua varía entre 85 y 99%.

Page 95: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Extracción en dos fases acuosas inmiscibles

Los sistemas de dos fases se caracterizan

por presentar una baja tensión superficial en

el rango de 0.0001 a 0.1 dina/cm.

Esta baja tensión superficial y el hecho de

que las fases sean acuosas proporciona un

medio ambiente que permite que las

biomoléculas y partículas celulares puedan

repartirse entre las fases conservando su

actividad.

Page 96: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Extracción en dos fases acuosas inmiscibles

La extracción con dos fases acuosas de enzimas y proteínas es atractiva debido a que:

– El escalamiento es sencillo (no hay variación del coeficiente de partición con la escala).

– La transferencia de masa es alta y el equilibrio se alcanza con poca energía de mezclado.

– Se puede realizar en forma continua.

– Los polímeros le confieren estabilidad a las proteínas.

– La separación puede ser selectiva y rápida

– La separación puede efectuarse a temperatura ambiente.

– Es más económica que otros procesos.

Page 97: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Adsorción

La adsorción es una de las operaciones más

utilizadas en la etapa de concentración de

caldos acuosos diluidos. Mediante la

adsorción, las moléculas de un soluto se

concentran en una superficie sólida por la

acción de fuerzas intermoleculares entre el

soluto y el sólido. Debido a la naturaleza de

estas fuerzas el fenómeno es fácilmente

reversible.

Page 98: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Etapas de la adsorción

Page 99: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Fundamentos

Las operaciones de adsorción son utilizadas en

la recuperación de productos biotecnológicos

como aminoácidos, antibióticos, vitaminas y

enzimas.

Por lo anterior es necesario conocer los

fundamentos de la adsorción que se centran en:

– Los tipos de adsorción según el tipo de interacción

– Los tipos de adsorbentes

– Las relaciones de equilibrio

– La cinética de adsorción

Page 100: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tipos de adsorción según el tipo de interacción soluto-adsorbente

De acuerdo al tipo de interacción del soluto

con el adsorbente, se distinguen cuatro tipos

básicos de adsorción:

– Física

– Iónica

– Hidrofóbica

– Por afinidad

Page 101: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tipos de adsorción

Page 102: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tipos de adsorbentes

En el caso de la adsorción física, el

adsorbente más utilizado es el carbón

activado y menor grado la silica gel. También

se utilizan resinas sintéticas derivadas del

estireno-divinilbenceno para la adsorción de

solutos no polares a partir de solventes

polares. Las resinas basadas en ésteres

acrílicos remueven solutos polares de

solventes no polares.

Page 103: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tipos de adsorbentes

Los adsorbentes más utilizados para

intercambio iónico son sintéticos. Estos

adsorbentes están formados por matrices de

polímero unidos lateralmente. A la matriz se le

unen grupos funcionales que le dan la

capacidad de intercambio iónico.

Estos adsorbentes también son derivados del

estireno-divinilbenceno. También se utilizan

matrices de celulosa activada.

Page 104: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tipos de adsorbentes

En la adsorción por afinidad el adsorbente

consta de dos partes, el soporte o matriz y el

ligando. El ligando se une a la matriz por

medio de un brazo que evita impedimentos

estéricos.

Las matrices utilizadas son fabricadas de

celulosa, celulosa modificada, poliacrilamida,

dextrano y agarosa.

Page 105: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Relaciones de equilibrio

El análisis de los procesos de adsorción requiere

de datos de equilibrio que se expresan

normalmente como isotermas de adsorción. Las

isotermas son parte esencial para modelar la

adsorción y por lo tanto para el diseño, cálculo de

eficiencias y costos. Las isotermas nos permiten

estimar el grado de purificación que puede ser

alcanzado, la cantidad de adsorbente requerido y

la sensibilidad del proceso respecto a la

concentración del producto.

Page 106: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Isotermas de adsorción más comunes

Page 107: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Isoterma de Freundlich

La isoterma de Freundlich se describe por la ecuación exponencial:

nKyq

Donde

q es la cantidad de soluto adsorbida por cantidad de adsorbente, y es la concentración de soluto en la solución, n es una constante adimensional y K es una constante cuyas unidades dependen de n.

Tanto K como n se determinan experimentalmente.

Page 108: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Isoterma lineal

La isoterma lineal se describe por la siguiente ecuación :

Kyq

Donde

q es la cantidad de soluto adsorbida por cantidad de adsorbente, y es la concentración de soluto en la solución y K es una constante de proporcionalidad que se determina experimentalmente.

Page 109: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Isoterma tipo Langmuir

La isoterma tipo Langmuir se describe por la siguiente ecuación :

yK

yqq

d

o

Donde

qo es la capacidad máxima del adsorbente y Kd es la constante de desorción

Ambas constantes, qo y Kd, se determinan experimentalmente

Page 110: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Tarea

Los datos de equilibrio de la adsorción de albúmina de

suero bovino en Q-sefarosa se presentan en la tabla

y mg/ml q mg/ml

0.05 30.00

0.10 43.70

0.20 56.53

1.00 73.85

2.00 76.81

4.00 78.37

Encontrar la expresión matemática

de la isoterma que mejor ajusta los

datos

Page 111: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cinética de la adsorción

El estudio de las isotermas de adsorción nos permite determinar el grado de separación que puede ser logrado y la sensibilidad del proceso con respecto a la concentración del soluto. Sin embargo, para el desarrollo del modelo de la adsorción es necesario poder establecer la velocidad de adsorción (mediante el empleo de coeficientes de transferencia de masa) o el tiempo necesario para alcanzar una cierta separación.

Page 112: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Cinética de la adsorción

La velocidad efectiva de la adsorción

depende tanto de las condiciones de

operación (flujo, temperatura, composición y

presión), como de la configuración del

sistema (intermitente, columna, etc.) y del

tamaño del equipo. El estudio de estos

efectos se divide en dos conceptos:

– Los mecanismos de transporte (físicos y químicos)

– Los efectos de mezclado

Page 113: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Mecanismos de transporte

En los procesos de adsorción se utilizan

materiales porosos que ofrecen una gran área

por unidad de volumen.

Las resistencias al movimiento del soluto en

adsorbentes porosos son:

– Resistencia de la película que rodea al adsorbente

– Resistencia a la difusión en el seno del adsorbente

– Resistencia a la difusión dentro del poro

– Resistencia a la reacción en la superficie

Page 114: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Resistencias en la adsorción

Page 115: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Control de la resistencia en la película

Cuando la resistencia de la película es

mucho mayor que la del poro o la de la

reacción de superficie, la velocidad de

adsorción está controlada por el flujo de

soluto a través de la película que rodea al

adsorbente. En este caso la expresión de

velocidad de adsorción puede expresarse

como:

*yyakR L

Page 116: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Control de la resistencia en la película

Donde: – kL es el coeficiente de transferencia de masa

– a es el área del adsorbente por unidad de volumen de lecho

– y es la concentración de soluto en el seno del líquido

– y* es la concentración de soluto en el líquido en equilibrio con la concentración de soluto en el adsorbente

– R es la velocidad de adsorción referida al volumen del lecho

*yyakR L

Page 117: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Control de la resistencia en la película

La resistencia de la película por si misma

rara vez controla la rapidez de la

transferencia de masa, excepto en los casos

en que la partícula de adsorbente es

pequeña y la difusividad en el poro es

grande.

Page 118: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Control de la resistencia en la película

Para sistemas de adsorción en columnas, kL

generalmente se puede correlacionar con

una expresión de la forma:

baCC ScReSh 21

AB

pL

D

dkSh

L

pLdv

Re

ABL

L

D

Sc

Page 119: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Control de la difusión del soluto en el seno del adsorbente

La difusión en la fase sólida del soluto una

vez que ha pasado del seno del líquido a la

fase sólida, se presenta en algunos sólidos

homogéneos permeables como la resinas de

intercambio iónico o en adsorbentes porosos

impregnados con líquido. Considerando una

geometría esférica uniforme el balance de

soluto en la partícula está dado por:

r

q

rr

qD

t

qs

22

2

Page 120: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Control de la difusión del soluto en el seno del adsorbente

Donde:

– Ds es la difusividad efectiva del soluto en la fase

sólida

– r es la coordenada radial al interior de la partícula

– q es la concentración de soluto en la fase sólida

r

q

rr

qD

t

qs

22

2

Page 121: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Control de la difusión del soluto en el seno del adsorbente

Las condiciones frontera son:

r

q

rr

qD

t

qs

22

2

aRr

sr

qaDR

0

0

rr

q

Page 122: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Control de la difusión del soluto en la fase líquida al interior de los poros

Cuando la velocidad de adsorción está

controlada por la difusión del soluto al

interior de los poros de la partícula de

adsorbente, hasta el sitio de adsorción, el

balance de soluto al interior de la partícula

está dado por la expresión:

t

q

r

y

rr

yD

t

yp

1

22

2

Page 123: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Control de la reacción de superficie

Generalmente la reacción de adsorción en la superficie

del adsorbente es mucho más rápida que los otros

mecanismos y rara vez es el mecanismo controlante.

Dos expresiones utilizadas para sistemas de

intercambio iónico son:

– Cinética reversible de primer orden

– Cinética reversible de segundo orden

qkykR 21

qkqqykR o 21

Page 124: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Efectos de mezclado

La velocidad de adsorción efectiva también

puede disminuir por efectos de un mezclado

imperfecto. Esta situación es característica

de columnas largas donde se presentan

irregularidades en el flujo (canalamiento) o

en el mezclado (espacios muertos, difusión

molecular o dispersión axial).

Page 125: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Efectos de mezclado

Uno de los modelos más utilizados para

describir la desviación del comportamiento

ideal del flujo al interior de columnas, es el

modelo de flujo tapón con dispersión, donde

los efectos de la dispersión axial debida a

remolinos y a la difusión molecular, se

agrupan en el concepto del coeficiente

efectivo de dispersión axial.

Page 126: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Modelo de flujo tapón con dispersión

Page 127: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Resistencias combinadas

En la elaboración de un modelo cinético se puede suponer que una resistencia a la transferencia de masa es la controlante, lo cual simplifica la solución matemática del modelo de adsorción. Sin embargo en algunos sistemas, la cinética de adsorción puede ser descrita en forma más adecuada utilizando un modelo donde la combinación de resistencias (por ejemplo película y poro) describen en forma más precisa la cinética,

Page 128: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Resistencias combinadas

Surge entonces el coeficiente global de

transferencia de masa y solo basta fijar si las

resistencia están relacionadas en serie o en

paralelo. Por ejemplo, si se consideran que las

resistencias de película y poro están actuando

en serie se tiene:

pLo kkK

111

Page 129: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Adsorción en lecho fijo

La adsorción en lecho fijo es la operación más

empleada a escala industrial para la concentración de

caldos. Este tipo de operación se efectúa en columnas

empacadas con adsorbente. Por la parte superior de la

columna se alimenta la solución que contiene al soluto

de interés. Durante su paso por la columna el soluto es

adsorbido en el lecho y la solución agotada es obtenida

en el fondo de la misma. Una vez que la concentración

de soluto a la salida alcanza cierta concentración, se

interrumpe la operación y se recupera el soluto

concentrado.

Page 130: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Adsorción en lecho fijo

En la descripción de la adsorción en columna

se utilizan gráficas de la variación de la

concentración de soluto a la salida de la

columna con el tiempo. Estas gráficas son

llamadas curvas de rompimiento.

La forma de esta curva depende del tipo de

equilibrio del sistema y de los mecanismos de

transporte involucrados.

Page 131: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES
Page 132: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Teoría cinética

Los modelos de columnas de adsorción que

se enmarcan dentro de la teoría cinética se

desarrollan mediante la combinación de

balances de masa, relaciones de equilibrio,

relaciones de transferencia de masa entre

las fases y las condiciones iniciales y de

frontera del sistema.

Page 133: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Balance de soluto en el volumen de una columna de adsorción

Page 134: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Balance de soluto en la fase líquida

Velocidad de acumulación de soluto en la

fase líquida = velocidad de entrada de soluto

por convección – velocidad de salida de

soluto por convección + velocidad de entrada

de soluto por dispersión – velocidad de

salida de soluto por dispersión – velocidad

de adsorción de soluto por el sólido.

Page 135: Capitulo 10. BIOSEPARACIONES

Balances de soluto en las fases líquida y sólida

En un sistema isotérmico y despreciando los

efectos radiales este balance puede ser

escrito como:

Rdz

dyv

z

yE

t

y

2

2

El balance de masa del soluto sobre el

adsorbente se puede expresar como:

Rt

q

1