CAPITULO 6

CRECIMIENTO MICROBIANO

INTRODUCCION CRECIMIENTO MICROBIANO

Es el aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo.

No se refiere al crecimiento de un único microorganismo (ciclo celular), sino al demográfico de una población.

Se toma como base el crecimiento de bacterias, el estudio puede servir también para entender el crecimiento de levaduras y hongos.

El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha población.

Ciclo celular : proceso de desarrollo de una bacteria aislada.

División celular: fisión binaria

Gemación, ej. levaduras

REQUERIMIENTOS FISICOS

Temperatura pH Actividad de Agua Presión Osmótica

REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Temperatura• Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento

adecuada. • temperatura mínima por debajo de la que no hay crecimiento; a

temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que la velocidad es máxima. Por encima de esta temperatura óptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.

• El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura.

• La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la velocidad de crecimiento por la reducción de la velocidad de reacción y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular.

Efecto de la temperatura sobre la velocidad del crecimiento y las consecuencias moleculares para la célula

• La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de las proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas.

Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular se enlentece y las células paran de crecer; aunque no tienen porqué morir. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular rápidamente y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente la temperatura.

Esto permite esterilizar por calor y no por frío. Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de

crecimiento mínima, máxima y óptima.

• Sicrófilos - rango: < -5 ª 20°C, óptimo < 15oC– organismos marinos, algas: Chlamydomonas nivalis (nieve

rosada), bacterias: Pseudomonas, Flavobacterium– membrana contiene alto % de ácidos grasos insaturados

• Sicrótrofos o Sicrófilos facultativos- rango: 0-35°C, óptimo 20-30oC– Pseudomonas - crecen en el refrigerador

• Mesófilos - rango: 15-45° C, óptimo: 30-40°C– la mayoría de los microorganismos (del suelo, aguas, patógenos)

• Termófilos - rango: 40-70°C, óptimo de 55-65oC – membrana contiene alto % de ácidos grasos saturados– enzimas estables al calor– Bacillus stearothermophilus, organismos de compostaje

• Hipertermófilos - rango: 80-113°C, óptimo > 90oC – Pyrococcus, Pyrodictium (aguas termales)

• PHEsun parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos; cada tipo de microorganismo sólo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente.

• El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica. El pH interno en la mayoría de los microorganismo está en el rango de 6.0 a 7.0.

• Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, también,distintos. Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalófilos que toleran pH=10.0

• Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo.

• La bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos competidores. Así, por ejemplo, las bacterias lácticas que producen grandes cantidades de ácido láctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las bacterias competidoras mueren y las lácticas se convierten en la población dominante.

• La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta (fórmico, acético, láctico) por ciertas bacterias.

• La acción bactericida de estos ácidos orgánicos de cadena corta es más potente que la debida únicamente a la bajada del pH que producen. Esto es, los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias por sí mismos.

Neutrófilo: pH óptimo 7 - Ej.: bacterias patógenas humanas.

Acidófilo: pH óptimo 7 - Ej.: muchas de las archeobacterias y hongos.Basófilo: pH óptimo 7 - Suelos y aguas ricas en carbonatos

Clasificación de los microorganismos según su pH óptimo

Los microorganismos requieren agua para su crecimiento, además para obtener nutrientes de ésta. Una presión osmótica alta causa pérdida de agua y plasmólisis de la célula, por lo que se utiliza este fenómeno para conservar los alimentos ya sea añadiendo sal o azúcar, lo que previene el crecimiento bacterial. Sin embargo algunas bacterias se han adaptado a altas concentraciones de sal, a éstas se les conoce como halófilos extremos. Por otro lado, los halófilos facultativos no requieren una alta concentración de sal, pero pueden crecer hasta una concentración de 2%. Otras bacterias pueden tolerar hasta un 15% de sal.

Presión Osmótica

Actividad de agua:• Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión

de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor del agua pura (P0). El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la humedad relativa (HR).

• El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente.

• Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua demasiado baja, su crecimiento se detiene.

• • Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la

muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prácticamente ilimitada

• La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer.

• Los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los siguientes:

bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw >0.80.• Los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de

agua mucho menor de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias.

• En función de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halófilos y xerófilos según toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente.

• Xerófilos: microorganismos que crecen en condiciones de sequedad o con una Aw inferior a 0.85.

• La reducción de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. La utilización de almíbares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano.

Efecto de la concentración de Sodio en el crecimiento de microorganismos con diferentes halotolerancias. La concentración óptima de sal para los microorganismos marinos tal como V. fischeri es del 3%; para los halófilos extremos es de 15-30%, dependiendo del organismo.

REQUERIMIENTOS QUIMICOS

CarbonoNitrógenoAzufreFosforoOligoelementosOxígeno

Carbóno (C) todos los organismos requieren C para sintetizar los componentes celulares.

Nitrógeno, azufre.y fósforo. Estos elementos se requieren para la síntesis de DNA, RNA, proteínas y ATP. Las bacterias pueden obtener nitrógeno (N) ya sea fijándolo directamente de la atmósfera, como por ejemplo el género bacteriano Rhizobium. También pueden obtener este elemento de compuestos inorgánicos que contengan N como nitritos, nitratos, sales de amonio o amino ácidos. Las bacterias pueden obtener azufre de iones de sulfato, sulfito de hidrógeno y amino ácidos con azufre. El fósforo es esencial para la síntesis de ácidos nucleicos y membranas celulares. Una fuente para obtener fósforo son los iones de fosfato y el ATP. Elementos trazas. Otros elementos como hierro, cobre, molibdeno y zinc son requeridos por los microorganismos en pequeñas cantidades. Usualmente tienen función de cofactores. Oxígeno No todos los microorganismos necesitan 02, sin embargo, muchas formas de vida requieren oxígeno para llevar a cabo respiración aeróbica. Los microorganismos que utilizan oxígeno molecular son llamados aeróbicos. Estos se clasifican en aeróbicos obligados que son los que requieren oxígenos molecular para vivir, y los aeróbicos facultativos los cuales utilizan el oxígeno molecular cuando está presente, pero en su ausencia continúan su crecimiento por la vía de fermentación o respiración anaeróbica, un ejemplo es Escherichia coli. Por otro lado tenemos los anaeróbico obligados que necesitan ausencia de oxígeno molecular para crecer y donde este generalmente es tóxico, un ejemplo es el género Clostridium. Estos microorganismos obtienen el átomo de oxígeno molecular del agua. También se observan microorganismos anaeróbicos aerotolerantes los cuales no utilizan el oxígenos molecular para su crecimiento, pero pueden tolerarlo. Los microaerofílicos sólo pueden crecer en concentraciones de oxígeno molecular menor a las encontradas en el aire.

Macronutrientes

Fuente de carbono

- CO2 - Compuestos

orgánicos

Carbohidratos, azúcares, proteínas, aminoácidos, lípidos, ácidos grasos, glicerol

Fuente de nitrógeno

- Inorgánica - Orgánica

NH4, NO3-, N2

Proteínas, peptonas, aa, bases púricas y pirimídicas, urea

Fuente de fósforo

- Inorgánica - Orgánica

Fosfatos Esteres del ácido fosfórico

Fuente de azufre

- Inorgánica - Orgánica

Sulfuros y sulfatos Aminoácidos sulfurados, vitaminas

Tipos nutricionales Fuente deenergía

Fuente deC

Ejemplos

Fotoautótrofos Luz CO2

Cianobacterias,bacteriaspúrpuras yverdes

Fotoheterótrofos LuzCompuestosorgánicos

Algunasbacteriaspúrpuras yverdes

Quimioautótrofos olitótrofos

Compuestosinorgánicosej.: H2, NH3,NO2

-, H2S

CO2

AlgunasEubacterias ymuchas Archaea

Quimioheterótrofoso heterótrofos

Compuestosorgánicos

Compuestosorgánicos

La mayoríaEubacterias,algunas Archaea

Metabolismo en procariotas

Luz Compuestos Inorgánicos

Compuestos Orgánicos

CO2

Compuestos orgánicos Heterótrofo

Autótrofo

Energía

Carbono

Fuente

Fotótrofo Quimiolitótrofo Quimioorganótrofo

Fotoautótrofo Autoquimiolitótrofo

Fotoheterótrofo (pocos)

Mixótrofo (algunos) Quimioorganótrofo

Oxigeno

• Clasificación de los microorganismos según el efecto del oxígeno:• Aerobios

– obligados: requieren oxígeno (21% o más)– Ej. Bacillus, hongos, etc.

• microaerofílicos: lo requieren pero a niveles menores que el atmosférico (5-10%)

• Ej. Azospirillum• Anaerobios

– facultativos: no requieren oxígeno, pero el desarrollo es mejor con oxígeno.

– Ej. Levaduras, E. coli – aerotolerantes: no son sensibles al oxígeno (crecen en ausencia

o presencia de oxígeno). – Ej. Enterococcus faecalis, Sreptococcus spp. – obligados: no toleran el oxígeno, muere en su presencia

• Ej. Methanobacterium, Clostridium

RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENOEN TIOGLICOLATO

• Tubo # 1: Aerobio estricto• Tubo # 2: Anaerobio facultativo• Tubo # 3: Anaerobio aerotolerante ( Microaerofílico )• Tubo # 4: Anaerobio estricto

FACTORES ORGANICOS DE CRECIMIENTO

•Estos son compuestos orgánicos esenciales que el organismo no puede sintetizar.

• Se incluyen las vitaminas, los amino ácidos, las purinas y las pirimidinas.

Cultivo de microorganismos

Medios de cultivo :- Químicamente definidos- Complejos

Tipos de cultivo:- en medio sólido- en medios líquidos

Un medio de cultivo incluye:- Fuente de Energía- Macronutrientes esenciales- Micronutrientes esenciales- Factores de crecimiento.

MEDIOS DE CULTIVO

CULTIVO MICROBIANO. Es el desarrollo activo de microorganismos en medios adecuados (medios de cultivo).

• Toda célula viva para su mantenimiento y reproducción requiere consumir nutrientes que le permitan realizar los procesos metabólicos necesarios para su supervivencia.

MEDIO DE CULTIVO• Son una mezcla de nutrientes que en

concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos.

• Pueden ser: de laboratorio, industriales

Usos

• En laboratorio.• Desarrollo de m.o (reproducción)• Conservar m.o• Aislar m.o.• En la industria.• Producción de biomasa.• Producción de metabolitos

Requisitos de los medios

• 1. Ser nutritivos. contener los componentes necesarios a los requerimientos del m.o de interés

• 2. pH adecuado. La mayoría requiere pHs neutros, pero algunos no, como Thiobacillus ferroxidans pH=2.0

• 3. Ser estéril. para garantizar sólo el desarrollo del ó los m.o de interés

COMPOSICION

• Deben contener los componentes necesarios para formar las nuevas células por ejem:

• Bacterias• Levaduras• Hongos• Algas• Protozoarios

COMPOSICION

• Los hongos requieren una fuente orgánica a la que se acompaña de antibióticos para evitar la presencia de bacterias.

• El cultivo de microalgas requiere sales minerales suplementadas con vitaminas. También suelen añadirse antibióticos para evitar la contaminación bacteriana.

• Para el cultivo de protozoos, que crecen difícilmente en medios sólidos, se requieren medios líquidos enriquecidos con otros microorganismos

CLASIFICACION. MEDIOS DE LABORATORIO • Los medios de cultivo se pueden clasificar según diversos

criterios:Por la naturaleza de sus constituyentes:• Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias

complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas con minerales y otras sustancias.

• Ejm. Extracto de levadura, agar-papa, extracto de maíz.• En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades

exactas presentes de cada uno de ellos.• Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una

composición química definida cualitativa y cuantitativamente. • Se adquieren de laboratorios proveedores.• Generalmente se usan en trabajos de investigación.

Clasificación De acuerdo al uso del medio de cultivo:• Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el

crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. • Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo.

Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.

• Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.

• Estos medios se enriquecen añadiendo sustancias que inhiban el crecimiento de la flora no deseada.

• Un buen ejemplo sería el medio TCBS (tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa), especial para aislamiento de especies del género Vibrio, en el que la sustancia inhibitoria son las sales biliares

• Medios diferenciales: contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos.

• No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos

Clasificación • Por la consistencia del medio.• medios líquidos son utilizados para la promoción del crecimiento. Ejm.

caldo lactosado para coliformes, caldos nutritivos,etc. • El crecimiento se evidencia por la turbidez del tubo, si se trata de una

prueba bioquímica, además de la turbidez se observa un viraje del indicador e inclusive en algunos casos (campanas de Durham) producción de gas.----Ejm: caldo MRVP (peptona de caseína, dextrosa, fosfato di potásico, agua) para investigar la ruta de degradación de la glucosa.

• medios semisólidos ( agar al 0.7%)donde la finalidad principal es poner de manifiesto la movilidad de la bacteria en este caso la siembra se realiza con un asa recta, por picadura y se observa si la bacteria presenta turbidez móvil en el tubo y si no solo se ve el crecimiento a lo largo de la picadura.----Ejplo. Agar SIM. agarMIA, agar PCA.medios sólidos. también son utilizados como pruebas bioquímicas, donde el crecimiento se observa en la superficie o pico de flauta (si es un tubo), si se trata de una placa (la siembra puede ser masiva o estría cruzada), es comúnmente utilizada para la obtención de colonias aisladas del microorganismo de interés.

• Existen diferentes tipos de estos medios, diferenciales, selectivos, nutritivos, etc.

Medios solidos

Nutrientes: compuestos químicos necesarios para formar las macromoléculas.

Nutrición microbiana

- Macronutrientes: se precisan en grandes cantidades:C, N, P, S, K, Mg, Ca, Na

- Micronutrientes: en menores cantidades o en cantidades trazas.

No todos se requieren en iguales cantidades y distintos procariotas requieren algunos más específicos.

• Nos centraremos en los organismos heterótrofos.

• Carbono - puede obtenerse de:

compuestos orgánicos carbonados (heterótrofos)CO2 (autótrofos)

- C es el 50% del peso seco. - Requerido para proteínas, lípidos y azúcares.

Macronutrientes

• Nitrógeno - es 12% del peso seco. - En la naturaleza esta en forma:

- orgánica (menor parte): compuestos orgánicos nitrogenados.- inorgánica: amoníaco (NH3), nitratos (NO3

-) o N2.

• Se utiliza para amino acidos y ácidos nucleicos.• La mayoría de los procariotas usan amoníaco, y algunas nitratos.• El N2 gaseoso puede ser usado por las bacterias fijadoras de N2.

• S (azufre) - se necesita en algunos amino ácidos y vitaminas. - Disponible mayormente como S inorgánico:

sulfatos (SO4=) o sulfuros (HS-).

- Algunas bacterias degradan proteínas.

Macronutrientes

• Fósforo P- El fósforo se encuentra como ion fosfato (PO4

-3) en fosfatos orgánicos o inorgánicos. - Se utiliza en ácidos nucleicos y fosfolípidos.

• Magnesio- estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos.- importante para la actividad de enzimas

• Potasio (K) - es necesario en algunas enzimas.

• Calcio (Ca), importante para algunos en membranas y endosporas.• Sodio (Na) necesario para organismos marinos.

Macronutrientes

• El hierro (Fe) fundamental en respiración (citocromos y proteinas Fe-S)

- en condiciones anaeróbicas: hierro en estado de oxidación +2 (ferroso) es soluble.

- en condiciones aeróbicas: en estado de oxidación +3 (férrico)forma minerales insolubles.

Sideróforos: son agentes quelantes producidos por procariotas, que solubilizan el hierro de los minerales y lo transportan dentro de la célula.

Fuente: Brock

Micronutrientes Son metales. Muchos tienen función estructural en enzimas.

Factores de crecimiento:

• Compuestos orgánicos que se requieren en pequeñas cantidades.• Ej. vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas.• Muchos microorganismos son capaces de sintetizarlos, otros no.

COMPONENTES DE LOS MEDIOS

• Fuente de carbono• Fuente de nitrógeno• Micro nutrientes• Suplementos• Colorantes e indicadores

1. Fuentes de carbono1. Carbohidratos.• Monosacáridos. • Dextrosa. Presente en jugos de frutas. Hidrólisis de lactosa, sacarosa, almidón.• Oligosacáridos.• Lactosa (suero de leche)• Sacarosa.• Dextrina.• Polisacáridos.• Almidón• agar2. alcoholes.• Glicerol.• Etanol• Metanol

3 Lípidos.

4 hidrocarburos

2. Fuentes de nitrógeno

• Nitratos• Sales de amonio• Hidrolizados. Peptonas. Digeridos, extractos.

Fuentes de nitrógeno

• 1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas) son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas

fuentes proteicas como carne de diferentes órganos y animales, pescado, caseína, gelatina, harina de soja, algodón, girasol, etc..

Mediante ajuste de la relación enzima-sustrato y variando tiempo de hidrólisis es posible variar el tamaño de la cadena de polipéptidos.

• 2) Extracto de carne, que se obtiene por extracción acuosa y concentración posterior variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extracción y temperatura de la misma.

Fuentes de N

• 3) Extracto de levadura, puede ser obtenida mediante autólisis o plasmólisis de la levadura, es básicamente una mezcla de aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en H2 O y carbohidratos.

• 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada

• 5) "Cornsteep", el agua de maceración de la industria del maíz tiene mucha importancia por su utilización como componente esencial de los medios para la producción de varios antibióticos y enzimas.

• Deben considerarse los costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompañar a las distintas materias primas utilizadas.

3. Micronutrientes

• Según la cantidad pueden ser:• Macronutrientes. En cantidades de gr/l. C, O2, H2, N2, P, S, K,

Na, Ca, Mg• Micronutrientes.oligoelementos, en mg/l o µg/l• Son activadores enzimaticos. Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Co, B.• Se usan sales como: NaCl, KH2PO4, NH4(SO4), MnSO4,

ZnSO4, CaCl2• El Na en altas concentraciones inhibe el crecimiento de

algunos m.o y favorece a otros. Ejplo. Agar manitol salado (7.5% de ClNa) se usa para el crecimiento de staphilococcus.

• Agar streptococcus KF (6.5% ClNa) para crecimiento de streptococcus

4. Suplementos

A. inhibidores.

• Antibióticos. Como penicilina, estreptomicina, cloranfenicol (amplio espectro).

• Ejm. Agar saboraoud-glucosa. Contiene cloranfenicol.• Fungicidas: fungizona, amphotericina (mohos y levaduras).• Metales pesados.• Ejmplo. Agar sulfito-bismuto. Contiene Bi y colorante verde

brillante e inhiben a bacterias Gram (+) y mayoría de Gram (-), excepto a salmonella.

• Compuestos orgánicos inhibidores.• Agar salmonella-shigella. Contiene altas concentraciones de

sales biliares y citrato de sodio que inhibe a las Gram (+) y mayoría de gram(-) incluyendo a las coliformes, excepto salmonella y shigella.

Suplementos

• B. factores de crecimiento.• Compuestos orgánicos que se suministran en

bajas concentraciones.• No son sintetizados por los m.o que se desea

favorecer, pero son necesarios para su desarrollo.

• Vitaminas, aminoácidos, ácidos grasos.

Suplementos

C. colorantes e indicadores.• Indicadores de reacción, indicadores de potencial oxido-

reductor, indicadores selectivos.• Indicadores de la reacción del medio.• Verde malaquita:• pH muy ácido: amarillo• pH =2 : verde• pH = 11.5: azúl• pH = 14: incoloro• Rojo-fenol.• pH = 7.8: azúl• pH =7.8: púrpura.• pH = 7.4: rojo• oH = 7.0: naranja• pH =6.5: amarillo.• Para indicar producción de acidos; láctico, cítrico, acético

Suplementos

• Indicadores del potencial de oxido-reducción.• Azul de metileno:• Medio oxidante: azul• Medio reductor: incoloro• Indicadores selectivos.• Verde malaquita, cristal violeta: inhiben bacterias gram(+)• Colorantes básicos: inhiben bacterias.• Ejplo. Agar Mc-Conkey. Contiene sales biliares y cristal violeta

que inhibe a las gram(+)• Agar EMB. Para determinación de coliformes fecales. Contiene

eosina y azul de metileno que inhiben gram(+) y facilita el desarrollo de enterobacterias.

PREPARACION

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio:• a partir de cada uno de sus constituyentes básicos o • por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente

(medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados

porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.

Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:• Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica

y fisicoquímica adecuada.• Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua

destilada o desmineralizada.• Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su

esterilización.• Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.• Cuidados : rehidratación, estado del material, esterilización,

almacenamiento.

MEDIOS DE CULTIVO

PREPARACION

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio:• a partir de cada uno de sus constituyentes básicos o • por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente

(medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados

porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.

Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:• Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica

y fisicoquímica adecuada.• Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua

destilada o desmineralizada.• Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su

esterilización.• Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.• Cuidados : rehidratación, estado del material, esterilización,

almacenamiento.

Preparación • 1. Rehidratación: El agua debe ser destilada o desionizada• Los agares se añaden sobre el agua a temperatura ambiente, se dejan

embeber unos minutos, se agita enérgicamente y se calienta el conjunto a 98-100 ºC durante el mínimo tiempo necesario para que, agitando y volteando secuencialmente, la disolución sea total (homogeneidad y transparencia al trasluz, excepto en algunos medios opacos).

• En los medios con azúcares (glucosa, lactosa...) un excesivo calentamiento lleva a caramelización, detectada por un oscurecimiento del color del medio.

• Los medios agarizados cuyo pH es inferior a 5 son muy delicados porque la acidez sumada al calor hidroliza las moléculas de agar, haciéndose el medio friable y quebradizo. En tal caso puede añadirse agar-agar fundido (15-20g/l) para restablecer las condiciones de dureza necesarias, pero no se debe recalentar el conjunto.

• La homogeneidad de la disolución deberá ser total, no admitiéndose el menor grumo ni heterogeneidad

Preparación • 2. Secado de las placas.• Para obtener colonias bien aisladas resulta fundamental

sembrar sobre placas cuya superficie no esté húmeda. • Para ello, se pone la placa boca abajo (con el medio

colgando), se coloca la tapa de la placa abajo, se abre la placa y se coloca la parte de arriba, con el medio colgando, apoyada sobre la tapa, todo ello sobre papel secante, preferiblemente estéril, esperando unos minutos hasta que la superficie del medio deje de mostrar agua condensada.

• Todo medio preparado debe almacenarse en la más completa oscuridad, para evitar la formación de peróxidos bacteriostáticos o bactericidas.

Preparación • 3- Esterilización-----La esterilización en autoclave se hará siempre en

volúmenes inferiores o iguales a 1 litro, pues de lo contrario los tiempos de autoclavado estándares no son válidos porque el calor de esterilización no penetra hasta el centro del recipiente.

• Se controlará siempre el correcto funcionamiento del autoclave (no es lo mismo 15' a 121 ºC que 14'a 121 ºC, por ejemplo).

• El excesivo calor durante el autoclavado y la posterior lentitud (o excesiva rapidez) en el enfriamiento son las principales causas de alteraciones en la calidad del medio final.

• Los medios con componentes grasos deben enfriarse en agitación para evitar la formación de grumos.

• Los medios fluidos, con poca proporción de agar, debe enfriarse muy suavemente y mantenerse por encima de 10 ºC para que el agar no forme nubes opalescentes que podrían confundirse con una falsa contaminación.

• Los medios con azúcares se esterilizan mejor por debajo de 118 ºC (116 ºC, 30', por ejemplo), para evitar la caramelización, que se detecta por oscurecimiento del medio y olor a azúcar tostada.

• El resto de medios en general se esteriliza a 121 ºC durante 15 minutos.

Preparación • 4. Almacenamiento de medios deshidratados• Los medios deshidratados almacenados bajo condiciones óptimas

tienen una caducidad media de 3 a 5 años desde su fabricación. • Una vez abierto el bote no deben usarse después de 6 meses, de

ahí la importancia de registrar en el bote su fecha de apertura y de utilizar envases de 100 gramos en todos los medios de uso infrecuente.

• Los medios deshidratados deben permanecer en un armario cerrado, lejos de toda fuente de luz, humedad o calor (lámparas, autoclaves, estufas).

• Conviene un lugar fresco, pero no un refrigerador, porque condensaría agua.

• No almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.

• Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o decoloren.

• Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8C, a menos que el medio requiera alguna condición diferente.

Ejms. Medio: Algas Clorofíceas

• Conjunto de nutrientes NPK y oligoelementos en solución acuosa estéril necesarios para provocar "Blooms algales".

• Se añade a razón de 5 ml por litro final de medio base (Agar Algas, caldo Algas), antes o después de la esterilización (para evitar precipitados, en el caldo se añade después de esterilizar éste por filtración).

Medio complejo para organismos heterótrofos

Nutrientes Cantidad

Agua 1L

Peptona 5g

Extracto de levadura 3g

NaCl 8g

Medio Sólido

Agar 15g

Medio Complejo para el Crecimiento de Bacterias Fastidiosas

Componente Cantidad Función del componente

Extracto de Carne 1.5 g Fuente de vitaminas y

otros factores de crecimiento

extracto de Levadura 3.0 g Fuente de vitaminas y

otros factores de crecimiento

Peptona 6.0 g Fuente de aminoácidos,

N, S, y P

Glucosa 1.0 g Fuente de C y energía

Agar 15.0 g Agente de solidificación

Inerte

Agua 1000 ml pH 6.6

Agar McConkey: • Medio diferencial para detección, aislamiento y enumeración de bacterias

coliformes y patógenas intestinales. • Acción diferencial. Los microorganismos capaces de fermentar lactosa

producen una caída de pH, junto con una absorción del colorante, apareciendo en la colonia el color rojo, las colonias de microorganismos que no fermentan la lactosa permanecen incoloras.

• Composición por Litro:Peptona de gelatina- 17gPeptona de caseína- 1.5gPeptona de carne - 1.5gLactosa- 10gSales Biliares- 1.5gCloruro Sódico- 5gRojo Neutro- 0.03gCristal Violeta- 0.001gAgar- 13.5gpH 7.1+- 0.2

Agar Nutritivo

• Medio para fines generales que promueve el crecimiento de la mayoría de los microorganismos poco exigentes.

• Composición por Litro:• Extracto de Carne de buey- 3g• Peptona trípsica de gelatina- 5g• Agar- 15g• Cloruro sódico y glucosa- 5 g• Agua destilada hasta 1000 ml

Agar Papa Dextrosa:

• Medio para el cultivo y enumeración de levaduras y mohos a partir de alimentos y otros materiales. Los hidratos de carbono y la infusión de papa favorecen el crecimiento de levaduras y hongos, en tanto que por el bajo rango de pH, la flora acompañante se reduce significativamente.

• Composición por Litro: • Agar -15g• Dextrosa - 20g• Infusión papa - 4g

Agar Sabouraud

• Medio para la detección y aislamiento de hongos. • Para que ocurra el crecimiento selectivo de hongos

sobre bacterias en la muestra depende tan solo de la reacción ácida (pH 5.6).

• Composición por Litro: • Digestivo pancreático de caseína- 5g• Peptona de tejido digestivo -5 g• Dextrosa -40g• Agar- 15g

Preparación de Agares, en laboratorio

• Agar McConkey …. 50 g/l• Agar nutritivo ……. 20 g/l• Agar LIA …………. 32 g/l• Agar TSI …………. 65 g/l• Agar EMB ………. 36 g/l

MEDIOS INDUSTRIALES• La preparación de medios para el desarrollo

de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.

• Se usan siempre medios complejos• Es conveniente considerar:

– diseño – formulación y – optimización de los mismos.

1. Diseño del medio

• tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar.

• Tener en cuenta todos los aspectos relacionados a:– los requerimientos nutricionales del microorganismo.– y algunos específicos del proceso – la disponibilidad real de los componentes y– consideraciones sobre las materias primas.

• Otros aspectos importantes son:• Los procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de

fermentación y • El conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan

la formación de algunos productos.

Requerimientos nutricionales• Están determinados por• Tipo de metabolismo celular:• autotrófico, como las algas y algunas bacterias, • heterotróficos que necesitan compuestos orgánicos como fuente

de carbono. • condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. En la ausencia

del 0 2 , el N03 o S04 son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias.

• Las bacterias metanogénicas son auxótrofos anaerobios que utilizan H2 para reducir el C02 a CH4 para obtener energía.

• las fuentes de nitrógeno que pueden ser de naturaleza inorgánica u orgánica.

• P y el S son suministrados en forma de P04 H y S04 (o aminoácidos azufrados).

• El fósforo se incorpora en ácidos nucleicos, y polímeros celulares. • El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos azufrados, y

además se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes.

Requerimientos nutricionales

• K y Mg son también esenciales. Una parte importante del primero está unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del RNA de las células, como la velocidad de crecimiento.

• micronutrientes se distinguen 2 categorías: • a) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento

como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y • b) los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr,

Ni, As, Se, Mo, Sn.• Factores de crecimiento comprenden ciertos aminoácidos y

vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, ácido pantotético, niacina, etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular.

• Otros factores de crecimiento son las purinas, poliamidas, putrescinas.

• Considerar también: Otros requerimientos y biodisponibilidad de nutrientes,

Otros agregados • Son nutrientes requeridos por los microorganismos de

manera específica según el proceso considerado.• Los precursores que constituye la base de una molécula

que debe ser sintetizada por el microorganismo, como el ácido fenil acético para la penicilina.

• El sulfato, en el proceso de fermentación alcohólica, que favorece la formación de glicerol.

• La producción de ácido cítrico debe considerar la influencia negativa que para el proceso tiene un exceso de hierro en su composición; por lo tanto dicho medio debe diseñarse de manera tal que su preparación (a partir de diversas materias primas) considere una eliminación total del hierro y posterior agregado del mismo en cantidades controladas.

Costo• El costo de los nutrientes representa del 10 al 60% del

costo total de los productos obtenidos por fermentación.• Las materias primas más importantes corresponden a

fuentes de carbono y de nitrógeno.• Las fuentes de carbono pueden ser: • 1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa,

sacarosa, lactosa, almidón, dextrina; • 2) Alcoholes como el glicerol y manitol; y • 3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.• Son muy importantes también por su disponibilidad y

costo reducido otras materias primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc

2. Formulación

• Tiene que ver con los aspectos cuantitativos del medio, es decir debe establecer las concentraciones de cada componente.

• Una primera aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composición de biomasa del microorganismo a ser empleado.

• Es decir, que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa debemos proveer las distintas fuentes que aseguren como mínimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados.

• Una composición elemental y típica de la biomasa es (% peso seco): Carbono, 46-48; Nitrógeno, 7-12; Fósforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%.

3. Optimización • Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la

optimización de los medios de cultivo. • Entre ellas podemos mencionar las siguientes: • 1) No existencia de información respecto a coeficientes de

rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo determinado.

• 2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de microelementos y factores de crecimiento.

• 3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento.

• 4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formación del producto.

• 5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.• La metodología más elemental consiste en realizar experimentos,

en los cuales se varía la concentración del componente a ensayar manteniéndose constante las concentraciones de los demás ingredientes.

Optimización • Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que hace

falta una gran cantidad de trabajo preliminar ya que el operador no conoce de antemano que nutriente es el limitante del crecimiento.

• Cuando son varios los posibles nutrientes limitantes el método resulta poco práctico.

• Por otra parte puede ocurrir que la respuesta obtenida al variar la concentración de un componente referida de los niveles de los otros, se produzca interacción entre componentes.

• Se puede mejorar mucho la optimización en batch empleando técnicas estadísticas.

• Utilizando cultivos continuos es posible obtener un cultivo limitado por un sólo factor o sustrato a lo largo de todo el experimento, pudiéndose conocer por lo tanto el efecto que su variación ejerce sobre el cultivo al mantenerse los demás componentes constantes.

4. Cuidados en la esterilización • Existen datos, en bibliografía, de cálculo de tiempo de mantenimiento para la

esterilización de 45,000 lt. de medio (con un valor de No = 2 x 10 7 esp/ml) que demuestra que son necesarios solamente 8.8 min como tiempo de mantenimiento a 120 °C.

• Debe tenerse en cuenta que estas consideraciones son válidas para el cálculo del tiempo de esterilización mínimo, a 120 °C, en fermentadores industriales del volumen considerado.

• Lo que es importante en este caso es el tipo de recipiente, su geometría y el volumen de medio a esterilizar.

• El tiempo de esterilización (o sea el tiempo de mantenimiento a 120 °C) requerido por ejemplo para tubos de ensayo de 18 x 50 mm es de 12-14 min y para tubos de 38 x 200 mm, de 15-20 min. Erlenmeyers de 2000 ml requieren de 30-35 min mientras que si son de 125 ml el tiempo es de 12-14 min.

• En cambio un frasco pyrex cuadrado de 1000 ml requiere 30-35 min y una botella de suero de 9000 ml 50-55 min.

• Estos tiempos aseguran la eliminación de esporos bacterianos de las especies más resistentes

4. Cuidados en la esterilizaciónEs fundamental, además de esterilizar correctamente los medios, conservar al máximo la calidad nutriente de los mismos.

• Los medios de fermentación utilizados en la industria son casi siempre complejos y a menudo con sólidos en suspensión, de manera tal que los cambios que se producen durante la esterilización pueden ser importantes….A veces puede haber modificaciones beneficiosas o perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilización.

• La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes de un medio, durante la esterilización por calor, dependerá no solamente de la naturaleza de los componentes sino también de la temperatura, duración del calentamiento, pH del medio, y de la agitación.

• Un ejemplo típico de interacción es la reacción de Maillard que tiene lugar entre los grupos carbonilos de los azúcares con los grupos amino de proteínas, aminoácidos, etc. …Se forman así productos de condensación con lo cual se inactivan significativas cantidades de carbohidratos y nitrógeno amínico.

• Por ese motivo es necesario que los carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos nitrogenados orgánicos.

• Las sales de NH4 + se deben autoclavar a pH 7 o menor, si no el amonio se volatiliza

4. Cuidados en la esterilización• En medios químicamente definidos se puede observar pérdida

importante de magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por precipitación de sales poco solubles como MgNH 4PO4 , MgKP04 y MgNaP04.

• Es importante por lo tanto autoclavar las sales de calcio y magnesio aparte de los fosfatos.

• Los aminoácidos y factores de crecimiento son muy lábiles al calor. Entre los aminoácidos, el triptofano, glutamina, asparagina, y entre las vitaminas hidrosolubles, la tiamina, riboflavina y piridoxina son las más susceptibles de sufrir descomposición.

• En todos estos casos es aconsejable disolverlas separadamente en pequeños volúmenes de H2 O y luego esterilizarlas por filtración.

• En la misma forma que la inactivación de microorganismos puede ser considerada una reacción cinética de primer orden, también la destrucción de algunos compuestos sensibles al calor puede ser tratada en la misma forma.

Caso aplicativo: Cultivo de Levaduras• En las primeras épocas se utilizaba la levadura obtenida de la fabricación de

cerveza primero y de las destilerías después, hasta que finalmente se establecieron las plantas de producción de levadura durante el siglo 19.

• La primera planta de producción comenzó a operar en Holanda en 1780 con el llamado proceso Dutch que era anaerobio y que tenía sólo rendimiento del 4 al 6% con respecto a la materia prima usada.

• Posteriormente se mejoró el rendimiento, que pasó a ser del 12-22% con el proceso Vienna, también conducido sin aire, en 1846.

• Con la introducción de la aireación en el proceso de producción, que tiene lugar en 1879, se aumentan considerablemente los rendimientos, que pasan a ser del 50 al 60% del teórico.

• La última etapa importante de modificación de la tecnología tiene lugar con la alimentación controlada de azúcar a los mostos en fermentación, cambio introducido por un científico danés, Sak, y un alemán, Hayduck, en 1919.

• Con melazas de remolacha o de caña pueden alcanzarse rendimientos cercanos al 100% del teórico.

• Actualmente se está tratando de encontrar otras fuentes de materias primas alternativas a las melazas, como el suero de leche hidrolizado

CULTIVO DE LEVADURAS• La producción mundial de levadura prensada (27-30% de materia

seca) es considerable

• Consumo anual per cápita de levadura prensada (27-30% de materia seca) está en el rango de 1.5 a 2.1 Kg para los países europeos, mientras que en países de Sud América como Chile es de 1 Kg y en Argentina 0.6 Kg.

• Cepas y medios de mantenimiento empleados

• Inicialmente fue la levadura de cerveza, el Saccharomyces uvarum, S.carlsbergensis, el empleado con fines de panificación.

• Se han ensayado también muchas otras cepas, no sólo del mismo género sino también las pertenecientes a distintas especies de Candida, Hansenula y Zygosaccharomyces, aunque ninguna de ellas demostró poseer ventajas sobre el Saccharomyces cerevisiae.

Requerimientos nutricionales de Levaduras

• Fuentes de carbono y energía que puedan emplear la Saccharomyces cerevisiae figuran en primer lugar la glucosa y la sacarosa, aunque también pueden emplearse fructuosa, galactosa, maltosa y suero hidrolizado, ya que la levadura de cerveza no puede asimilar lactosa.

• El nitrógeno asimilable debe administrarse en forma de amoníaco, urea o sales de amonio, aunque también se pueden emplear mezclas de aminoácidos. Ni el nitrato ni el nitrito pueden ser asimilados.

• Los macroelementos indispensables son el fósforo que se emplea comúnmente en forma de ácido fosfórico y el Mg como sulfato de magnesio, que también provee S.

• Son también necesarios el Ca, Fe, Cu y Zn como elementos menores.

• Por ejemplo, se ha establecido que S. cerevisiae requiere 200 ug de Zn, 75 ug de Fe y 12-15 ug de Cu por litro de medio para crecimiento óptimo.

Requerimientos nutricionales de Levaduras

• Un requerimiento esencial está constituido por las vitaminas del grupo B como biotina, ácido pantoténico, inositol, tiamina, pyridoxina y niacina.

• Se ha estimado que los requerimientos de la biotina son de 100 ug de biotina por 100 g de azúcar suministrados para el crecimiento de la levadura.

• El ácido pantoténico, que es un componente de la coenzima A, es también requerido por muchas especies, mientras pocas especies requieren inositol.

• Con respecto a la tiamina se ha demostrado que aumenta la actividad fermentativa de la levadura.

Medio de producción de Levaduras

• La materia prima elemental de elección es la melaza de remolacha o de caña o ambas en conjunto, cuando se las dispone.

• Los aspectos fundamentales a considerar son la disponibilidad y la composición de la melaza incluyendo la presencia de inhibidores o substancias extrañas que pueden contener.

• La sacarosa es el azúcar predominante en ambas melazas. La materia orgánica no azúcares en la melaza de caña está compuesta fundamentalmente por gomas solubles y ácidos orgánicos sobre todo aconítico y compuestos nitrogenados.

• En el caso de la melaza de remolacha los no azúcares están constituidos por un mayor porcentaje de compuestos nitrogenados como betaína y ácido glutámico y algunos ácidos orgánicos como láctico, málico, acético y oxálico.

• En las cenizas predomina en ambas melazas el K, teniendo mayor porcentaje de fósforo la melaza de caña que la de remolacha.

• Es interesante comparar el contenido de las vitaminas de ambas melazas por la importancia que tienen estos compuestos en la producción de levadura.

• Como puede verse el contenido de biotina es superior en la melaza de caña y el de pantotenato de Ca en la remolacha.

• La melaza de remolacha tiene mayor cantidad de compuestos nitrogenados asimilables.

• Es por ello que los fabricantes prefieren, si tienen disponibilidad suficiente, utilizar mezclas de ambas melazas.

Medio de producción de Levaduras• Con respecto a componentes extraños (que pueden afectar el

rendimiento) se han detectado en las melazas algunos pesticidas en el caso de melazas de caña como lindane, aldrin, heptaclor, dieldrin, etc. en cantidades variables desde trazas hasta 0.21 mgKg 1 en el caso del lindane en melazas de cañas de Honolulu.

• Las melazas se utilizan generalmente diluídas al 50%. • Como los compuestos coloidales de la melaza de caña pueden

causar problemas en varias etapas del proceso de fermentación, el mosto es casi siempre clarificado. La clarificación puede hacerse antes o después de la esterilización, que se realiza en la última etapa por inyección de vapor directa, a la presión atmosférica en la mayor parte de los casos.

• La clarificación se realiza fundamentalmente con la ayuda de centrífugas intermitentes.

• Se han mencionado como ventajas de utilizar mostos clarificados que la levadura es más fácil para prensar y secar y que además, la clarificación probablemente facilita la transferencia de O2 y reduce la formación de espuma.

Medio de producción de Levaduras• La melaza es deficiente en algunos macroelementos como

N, P, S, Mg, y también Zn en la mayoría de los casos, por lo cual es necesario su agregado a los mostos.

• La cantidad de nitrógeno y fósforo a ser agregado depende de las prácticas comerciales.

• El nitrógeno puede representar entre el 6.5 y el 10% de la levadura seca y el P expresado como P 2O5 varía entre 1.5 y 3.5%.

• Ambos valores, sobre todo el contenido de nitrógeno, está relacionado con el poder fermentativo y la estabilidad de la levadura en el almacenamiento.

• El nitrógeno que se suministra generalmente como agua amoniacal y el P como ácido fosfórico, son alimentados durante el proceso de acuerdo a programas de alimentación que dependen de las prácticas comerciales.

Medio de producción de Levaduras

• El Mg, S, y Zn son incorporados en forma de sulfatos • El MgS04 se suele incorporar a razón de 1 g de la sal

heptahidratada y el Zn en una proporción de 10 mg del sulfato tetrahidratado por Kg de melaza a fermentar.

• Si se utiliza melaza de remolacha es indispensable agregar biotina

• Es a menudo indispensable agregar tiamina y ácido pantoténico

COMPOSICIÓN DE LA MELAZA DE CAÑA Y REMOLACHA

Separación, lavado y empaquetado de Levaduras• Al final de la etapa de producción comercial las células de levaduras son

separadas por centrifugación y lavadas en una o más etapas.• Las operaciones de lavado son realizadas para reducir los sólidos no debidos a

levaduras que pueden dificultar la filtración y oscurecer el color de la levadura prensada.

• La eficiencia del sistema de lavado está determinada por la concentración de los sólidos de levadura, la cantidad del agua usada y el contenido de sólidos del agua de dilución que tiene importancia cuando el agua de lavado se utiliza en contracorriente a la crema de levadura.

• El proceso de separación produce una crema de levadura ligeramente coloreada conteniendo hasta 22% de sólidos debidos a células y prácticamente libres de otros materiales.

• La crema es almacenada en tanque agitados a 2-4 °C con ajuste de pH a 2.5-3.5.

• Como la mayor parte de la levadura se vende como levadura prensada conteniendo entre 27 y 30% de materia seca, es necesario realizar una etapa de deshidratación de la crema (que contiene un 18-22% de sólido) hasta esos valores, lo que se efectúa con filtros prensas o filtros rotatorios.

• Finalmente la levadura es extrudida en forma de panes de peso variable según las exigencias del mercado, que son envueltos en papel celofán o en otro tipo adecuado de papel

Separación, lavado y empaquetado de Levaduras

• Otra forma de terminar el proceso de producción es someter la crema de levadura a un filtrado y extrudido para producir partículas de 0.5 a 2 mm que son secadas en equipos de lecho fluidizado, lo que da origen a las llamadas levaduras secas activas o levaduras instantáneas con bajo contenido de humedad, que se envasan al vacío o en atmósfera de nitrógeno y que pueden conservarse por períodos prolongados a temperatura ambiente.

Control de calidad• La levadura prensada producida por el proceso descrito debe cumplir con las

exigencias impuestas al cual está destinada, o sea para la panificación.• La función fundamental que debe cumplir es levar las masas preparadas con

harina y conservar esas cualidades durante un tiempo adecuado.• Existen diversas técnicas de control que se utilizan para verificar la calidad de

la levadura comercial. • Todas se basan en la preparación de una masa con harina, agua y sal, además

de levadura. • En algunos casos se mide el tiempo en minutos que tarda en levar una masa

preparada en una mezcladora en condiciones estandarizadas, que es colocada en un molde a temperatura de 30 C tomando como referencia un tope que esta conectado a una alarma que suena cuando es alcanzado por la masa

Proceso de Produccion

Escalas:

120 Kg intermedio

240 Kg stock

2500 kg pitch

15000 a 100000 kg final

Procesos posteriores a la producción de Levaduras

Centrifugación- Secado (por filtración, hasta 30 % de sólidos) - Mezclado (con agregado de emulsificantes y aceites vegetales)- Extrusión- Envasado- Conservación en frió

• Levadura seca activa• Se somete a un proceso de secado en túnel con aire

caliente forzado luego de la extrusión durante un periodo total de 6 horas.

• Se envasa a vació o en ambiente de nitrógeno. El agregado de antioxidantes y surfactantes no iónicos permiten aumentar su estabilidad.

MEDIOS Y METODOS PARA CULTIVOS ANAEROBIOSPara conseguir una recuperación óptima de bacterias anaerobias es fundamental elegir correctamente los medios de cultivo primarios. La mayoría de estas bacterias requieren para su crecimiento vitamina K1 y hemina. Para su aislamiento e identificación presuntiva se aconseja utilizar una combinación de medios enriquecidos no selectivos, selectivos y diferenciales, entre los que se incluyen:

- Un medio de agar sangre para anaerobios como agar Brucella o agar Schaedler con un 5% de sangre de carnero, a los que se añaden vitamina K1 (1 µg/ml) y hemina (5 µg/ml). En estos medios crecen tanto las bacterias anaerobias facultativas como las anaerobias obligadas.

MEDIOS Y METODOS PARA CULTIVOS ANAEROBIOS

•Agar con yema de huevo (AYE). Cuando se sospecha la presencia de clostridios, para detectar la producción de lipasa y/o lecitinasa. ..Un agar selectivo para Clostridium difficile, cuando se investigue la presencia de esta especie, como agar fructosa-cicloserina-cefoxitina (CCFA) o agar yema de huevo-cicloserina-cefoxitina (CCEY).

• Como medio líquido de enriquecimiento o de mantenimiento se recomienda usar caldo de tioglicolato sin indicador, suplementado con vitamina K1 (200 µl) y hemina (20 µl).Este medio se utiliza para recuperar las bacterias anaerobias en caso de que falle la anaerobiosis en la incubación de los cultivos primarios, haya una inhibición del crecimiento debido a antibióticos o a otros factores, o bien cuando las bacterias se encuentran en cantidades muy pequeñas.

MEDIOS Y METODOS PARA CULTIVOS ANAEROBIOSSistemas de incubación en anaerobiosis. Su elección viene determinada por el coste, número de cultivos y limitaciones de espacio.

Los más comunes son las cámaras, jarras o cajas y bolsas de anaerobiosis. Con independencia del sistema utilizado es importante monitorizar el ambiente anaerobio con una tira indicadora de azul de metileno o de resarzurina, y la temperatura de incubación.

Existen diferentes modelos de cámaras para anaerobios, en las que se consigue una atmósfera anaerobia mediante una mezcla de gases que contiene 5% de H2, 5-10% de CO2 y 85-90% de N2.

Poseen un sistema de intercambio que consiste en un compartimento rígido con una puerta interior y otra exterior.

MEDIOS Y METODOS PARA CULTIVOS ANAEROBIOS Las jarras son recipientes cilíndricos, de metal o de plástico rígido, que deben cerrarse herméticamente y en los que la atmósfera anaerobia se obtiene entre 1 y 2 horas después de introducir unos sobres (GasPak®, Becton Dickinson) en los que, al añadir H2O se libera H2 y CO2El H2 se combina con el oxígeno existente formando agua gracias a la presencia de un catalizador.

Actualmente existen sistemas en los que no hace falta añadir H2O o introducir el catalizador (Anaerogen®, Oxoid).

Mediante una técnica automatizada, Anoxomat®, también se puede lograr una atmósfera anaerobia en las jarras.

Como ya se ha señalado debe introducirse un indicador de oxígeno, que suelen ser tiras de papel con azul de metileno, que se decoloran al desaparecer la presencia del oxígeno.

•tubos con medio de cultivo llenos por completo.•medios con sustancias que reaccionan con el oxígeno y lo excluyen.•dispositivo especial (cámara anaeróbica)•cajas o tubos incubados en recipientes con granos germinados (cebada, centeno)

Cultivos en anaerobiosis

OBTENCION DE CULTIVOS PUROS 1. Siembra en superficie. Extensión y estría.

2. Vertido en placa. Mezclando los microorganismos con agar fundido a 44ºC, y se echa luego sobre la placa. Los microorganismos crecen en la superficie y dentro

3. Técnicas de enriquecimiento. Aplicar el elemento adecuado (por ejemplo benzoato) al tubo de ensayo, se aíslan microorganismos que no se aíslan con los métodos anteriores y que están en pequeñas cantidades (como pueden ser aquellos que sólo usan benzoato). Se debe realizar varias veces para asegurarnos que tenemos un cultivo puro. (Otros ejemplos: elevada temperatura para termófilos; calentamiento a 80ºC para esporulados y termófilos.)

4. Dilución seriada. Sólo aíslo el microorganismo más abundante. (Lister con Streptococcus lactis hace diluciones, cada dilución la siembra en 20 tubos, cuando de un dilución dólo crece el 5% la probabilidad de que en ese tubo crezca 1 aólo tipo de microorganismo es del 4.8%, así estamos seguros de que sólo existe un tipo de microorganismo).

OBTENCION DE CULTIVOS PUROS5. Micromanipulador: aislamos una sola célula utilizando este aparato.

6. Aislamiento de microorganismos anaerobios. Micromanipulados. Obtenemos los organismos anaerobios por una adición de agar a 44ºC, mezclamos y tapamos con parafina (aceite estéril). Eliminamos el O2 con agentes reductores (tioglicolato, añadimos un colorante REDOX para ver cuando se ha reducido), con una vela que consuma el oxígeno, usamos la jarra de anaerobios (sistema que produce CO2 + H2 y un catalizador que consume O2). Cuanto más sensibles son más precauciones tenemos que tomar. PARAFINA

CARACTERIZACIÓN DE CULTIVOS PUROS•Las colonias deben ser iguales en forma, tamaño y color.

• Que no existan formas inhibidas.

• Al microscopio deben tener un aspecto común.

• Tiene que tener iguales propiedades tintoriales.

• Deben ser bioquímicamente y fisiológicamente iguales.

Una regla importante es no coger nunca de la primera colonia.

Criterio Metodología de ejemplo

Observación Macroscópica Observación de colonias(formas, pigmentos, etc.)

Observación Microscópica Tinciones (Gram)(formas, agrupación)(esporas, cápsula, flagelos, etc.)

Metabolismo Baterías bioquímicas(uso de sustratos

[fermentación])(producción de metabolitos secundarios)

Otras propiedades Resistencia a antibióticos(antibiograma, MIC, etc.)

Taxonomía Bacteriana Convencional. Identificación de especies

Morfología macroscópica. Colonia Bacteriana

S. aureus

S. aureus

S. aureus

S. aureus

Colonias de S. aureus

CONSERVACION DE CULTIVOS BACTERIANOSMANTENIMIENTO

1.- Debemos transferir periódicamente, ya que los tubos de agar se secan, se evapora el agua.

2.- Se debe cubrir con parafina, con lo cual la transferencia se puede hacer más tarde, disminuye el metabolismo y tardan en envejecer.

3.- Se disminuye la temperatura, congelamos las células. Para proteger las células y que no se formen cristales que las dañen se usa el glicerol 4.- La liofilización es la sublimación a alto vacío de las muestras congeladas con rapidez.

FORMAS DE CRECIMIENTO. CULTIVOS

• Según la periodicidad del proceso la fermentación puede ser continua, semicontinua o intermitente.

CRECIMIENTO MICROBIANO

Fermentación intermitente• Conocida también como fermentación por lotes o fermentación Batch,

se refiere al crecimiento de células en un sistema cerrado, en el cual una vez cargada la masa inicial del medio, esta no es alterada por adiciones o retiros posteriores de nutrientes hasta que culmina la fermentación.

• Una consecuencia lógica de este proceso es que en él varían el pH, temperatura y la concentración de nutrientes con el tiempo, lo cual da lugar a una conducta cíclica en el crecimiento celular, conocido como ciclo de crecimiento.

• Ciclo de crecimiento microbiano. Cuando un medio de cultivo es inoculado con un cultivo semilla (inóculo), los microorganismos toman selectivamente los nutrientes del medio y los convierten en biomasa y productos metabólicos, produciéndose el crecimiento celular.

• Sin embargo, ese crecimiento no es lineal y en los cultivos batch sigue un patrón conocido como ciclo de crecimiento microbiano, el cual puede ser dividido en etapas o fases de crecimiento. tales fases son;

• a) fase de acostumbramiento, b) fase de aceleración, c) fase exponencial, d) fase de desaceleración, e) fase estacionaria y f) fase de muerte

CURVA DE CRECIMIENTO

Crecimiento microbiano en medio líquido

Crecimiento en cultivo cerrado (batch)

• Fase lag - las células se adaptan al nuevo ambiente, aun no se dividen • Fase exponencial (log) - velocidad máxima de crecimiento bajo condiciones

particulares, tiempo de generación mínimo

• Fase estacionaria - sin crecimiento neto, vc=0 ó estadísticamente = 0 cuando: vc=vm (vel. crecimiento es igual a la de muerte)

– nutrientes limitantes, pero suficientes para mantener actividad– acumulación de desechos, inhibición del crecimiento

• Fase de muerte - velocidad de muerte celular > velocidad de división celular

Luego de la adición de bacterias al medio líquido fresco se observa la siguiente cinética de crecimiento

Desventajas de la fermentación intermitente.• La mayor ventaja de los procesos de fermentación Batch es su

sencillez.

• presenta grandes desventajas ; alto requerimiento de mano de obra, y demasiados tiempos muertos.

• En toda fermentación batch existen tiempos muertos o periodos inútiles, tales son; la fase de adaptación y la fase de decaimiento durante el desarrollo celular, y el periodo de descarga y renovación de la carga del reactor para un nuevo batch.

• Las fases de adaptación y decaimiento en el desarrollo microbiano son exclusivas de los procesos batch y son debidos, como se explicó anteriormente, al proceso de readaptación de la maquinaria enzimática por parte de los microorganismos, así como al agotamiento del sustrato al final del proceso.

Fermentación semicontinua• Las desventajas indicadas que afectan la eficiencia de los

procesos batch pueden ser subsanadas atacando sus causas, así por ejemplo se puede evitar la presencia de las fases de adaptación y de decaimiento, si periódicamente:

• se extrae medio agotado y se repone con medio de cultivo fresco.– manteniendo la concentración de sustrato lo suficientemente alta como

para que no haya falta de disponibilidad. – manteniendo la concentración del producto lo suficientemente baja como

para que no sobrepase los límites tolerables por los microorganismos,– Asimismo si se desea evitar la formación de productos

secundarios se puede hacer las adiciones de medio de cultivo nuevo siempre antes de alcanzar la fase estacionaria, con lo cual se mantendrá el cultivo permanentemente en la fase de desarrollo exponencial en la cual se sintetizan sólo productos asociados al crecimiento

Proceso semicontinuo• Los parámetros de mayor importancia son el volumen y el tiempo

de adición, los cuales serán calculados de modo que el cultivo se mantenga siempre en la fase logarítmica de crecimiento.

• Si el volumen extraído es muy grande puede diluirse tanto el medio que la masa microbiana puede volver a la fase de acostumbramiento, y si el volumen extraído es muy pequeño para igual tiempo el cultivo puede agotarse y pasar a la fase estacionaria.

• Si el tiempo de renovación es muy grande el cultivo puede alcanzar a la fase estacionaria y si es muy pequeño el cultivo puede regresar a la fase de acostumbramiento.

• El proceso se maneja de modo que una vez alcanzada la concentración X’ de células en la fase exponencial, se extrae un volumen del medio exhausto igual a:

• V= ( X’ - Xo) d• Luego se agrega igual cantidad de medio de cultivo nuevo,

diluyendo el producto y las células hasta un valor X’o.

EXPRESION MATEMATICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Parametros Cinéticos

Tiempos de generación en bacterias

CINÉTICA DE CRECIMIENTO• Como mínimo un modelo de proceso microbiano debe

tener: balances de materia de la biomasa activa y del sustrato primario que limita la tasa de crecimiento de la biomasa.

• En La mayoría de los casos el sustrato limitador es el donante de electrones.

• Debido a la naturaleza auto catalítica del crecimiento microbiano, es lógico suponer que la concentración de microorganismos influye en la velocidad con que aumenta la población., rx

rx=μX

Velocidad específica de crecimiento

• Para un tipo de microorganismo dado depende principalmente:– La composición y concentración del medio de cultivo. – Presencia de inhibidores – Temperatura y pH

x = concentración de microorganismos g/1t = tiempo, hμ = velocidad específica de crecimiento h-1

Parámetros estequiométricos• Durante el crecimiento microbiano se produce un proceso de

reducción de la concentración de sustrato, y de incremento en la concentración del producto.

• La relación entre estas variables darán una idea clara de la economía y la eficiencia del proceso.

• Se puede establecer una relación estequiométrica entre estas variables a través de los siguientes parámetros: balance de materiales para el sustrato, coeficientes de crecimiento, y coeficiente de mantenimiento.

• Balance del consumo de sustrato. El sustrato es utilizado por las células como fuente de energía y como materia prima para la síntesis de macromoléculas constitutivas necesarias para el crecimiento celular,

• por tanto en un tiempo cualquiera, el consumo de sustrato (ΔS) estará dado por:

• S = S asimilado + S convertido + S energía de + S energía en biomasa en producto crecimiento de

manteni- miento

Coeficiente de rendimiento biomasa-sustrato

• Está dado por la relación entre la variación de la biomasa y la variación del sustrato, según la expresión.

• Yx/s= -X/S• En un cultivo intermitente existe diferencia entre el coeficiente de crecimiento

aparente y el coeficiente de crecimiento verdadero, • coeficiente de crecimiento aparente se debe a la variación de biomasa y

sustrato al final del proceso. • coeficiente de crecimiento verdadero es una medida instantánea de

tales variaciones. • Para organismos aerobios que crecen en un medio de glucosa se

tiene que los Yx/s típicos son: – para levaduras y bacterias varía entre 0.4 y 0.6 g/g, – en condiciones anaerobias el valor de Yx/s es substancialmente menor.

• Para substratos mas o menos reductores, el valor del coeficiente cambiará. Así, si el sustrato es el metano, y los m.o. son bacterias el Yx/s tendrá valores entre 0.6 y 1.0 g/g

Coeficiente de Rendimiento biomasa-oxígeno.

• Esta dado por la relación de la biomasa producida y el consumo de oxígeno del medio.

• Yx/o2= -X/O2• El valor de Yx/o2 para bacterias y levaduras aerobias

que crecen en un medio de glucosa es de 0.9 a 1.4 g/g, al igual que en el caso del Yx/s, un cambio en el sustrato ocasionará variaciones en el valor de este coeficiente, así los mismos microorganismos en las mismas condiciones, pero en un medio con metano como sustrato tendrán un Yx/o2 de alrededor de 0.2 g/g.

Coeficiente de formación de producto (qr), o Yp/s.• Está dado por la relación.• Yp/s = - P/S• Este valor también puede variar según el producto y la forma

como se producen.• Los productos microbianos pueden ser clasificados en tres

grandes categorías: productos asociados al crecimiento, productos no asociados, y productos asociados mixtos.

• Los productos asociados al crecimiento son producidos simultáneamente al crecimiento microbiano, en este caso la relación específica de formación de producto es proporcional a la tasa específica de crecimiento (µ). Esto sucede durante la formación de productos del metabolismo primario, pero sólo en la fase de crecimiento exponencial.

• La producción de una enzima constitutiva es un ejemplo típico de un crecimiento asociado.

Coeficientes para m.o aerobios

Organismo SustratoYx/s Yx/o2

g/g g/mol g/g-C g/g

Enterobacteraerógenes Maltosa 0.46 149.2 1.03 1.50

Manitol 0.52 95.2 1.32 1.18

Fructosa 0.42 76.1 1.05 1.46

Glucosa 0.40 72.7 1.01 1.11

Candida utilis Glucosa 0.51 91.8 1.28 1.32

Penicillium chrysogenum glucosa 0.43 77.4 1.08 1.35

Pseudomonas fluorescens glucosa 0.38 68.4 0.95 0.85

Rhodopseudomonas spheroides glucosa 0.45 81.0 1.12 1.46

Saccharomyces cerevisiae Glucosa 0.50 90.0 1.25 0.97

Enterobacter aerógenes Ribosa 0.35 53.2 0.88 0.98

Succinato 0.25 29.7 0.62 0.62

Glycerol 0.45 41.8 1.16 0.97

Lactato 0.18 16.6 0.46 0.37

Piruvato 0.20 17.9 0.49 0.48

Acetato 0.18 10.5 0.43 0.31

Coeficientes para m.o aerobios

Organismo Sustrato Yx/s Yx/o2

g/g g/mol g/g g/mol

Cándida utilis Acetato 0.36 21.0 0.90 0.70

Pseudomonas fluorescens Acetato 0.28 16.8 0.70 0.46

Cándida utilis Etanol 0.68 31.2 1.30 0.61

Pseudomonas fluorescens Etanol 0.49 22.5 0.93 0.42

Klesbiella sp. Metanol 0.38 12.2 1.01 0.56

Metylomonas sp. Metanol 0.48 15.4 1.28 0.53

Pseudomonas sp. Metanol 0.41 13.1 1.09 0.44

Metyloccocus sp. Metano 1.01 16.2 1.34 0.29

Pseudomonas sp. Metano 0.80 12.8 1.06 0.20

Metanol 0.60 9.60 0.80 0.19

Pseudomonas metánica Metano 0.56 9.00 0.75 0.17

e. Coeficiente de mantenimiento (m).

• Se le usa para describir la relación de sustrato usado para el mantenimiento celular.

MODELOS CINETICOS

Modelos no estructurados. Son modelos aproximados. Modelo de Monod, Modelo de Contois, Modelo de Mosser, Modelos estructurados. Estos modelos tienen una capacidad predictiva mucho mas grande y para ello tienen en cuenta las interacciones cinéticas entre los componentes celulares y los componentes del medio.

Modelo de Monod

S = Concentración del sustrato limitanteμm = Es la velocidad de crecimiento específica máximaKs = Constante de saturaciónEstá inversamente relacionada con la afinidad del microorganismo por el sustrato.Cuando S > > Ks, μ toma el valor de μm y rx sólo depende de x.En general Ks tiene valores muy bajos, del orden de los mgl-1 por tanto concentraciones relativamente bajos de S son suficientes para hacer que μ = μmáx.En promedio:Las bacterias poseen valores de μm cercanos a…… 0.9 h-1

Las levaduras…………………………………… 0.45 h-1

Los hongos filamentosos……………………… 0.25 h-1

Linearización del modelo

Modelo de Contois

La ecuación de Contois muestra una dependencia de la tasa específica de la reacción con respecto a la concentración de organismos activos presentes.

][SxK

S

sx

m

Ejemplo• Una cadena de microorganismos estuvo en un cultivo BATCH en

crecimiento, en sustrato de glucosa y los siguientes datos fueron obtenidos.

TIEMPO(h)

CONC. CELULAS (X)(g/l)

ln X CONC. GLUCOSA(g/l)

0 1.25 0.2231 100.00

9 2.45 0.8961 97.00

16 5.10 1.6292 90.40

23 10.50 2.3514 76.90

30 22.00 3.0910 48.10

34 33.00 3.4965 20.60

36 37.50 3.6243 9.38

40 41.00 3.7136 0.63

• a) Calcular la velocidad máxima de crecimiento.• b) Calcular la variación de sustrato• c) Cuál es la concentración celular máxima que podría esperarse si 150g de

glucosa fueron usados con la misma cantidad de inoculo.

t )(ht

Xln

Xln

Rpta. a)

tX

xy

mtg

ln

SustratoConcdeRangoCelularConcdeRango

sustratoSceluarX

y..

11.01636

1.5ln5.37ln hm

b) Rpta.

Calcular la variación de sustrato por el crecimiento celular.

sustratodegrcélulasdegry /40.010063.025.141

c) Rpta.

ltcélulasg

X

X

SYXX

25.60

)150(4.025.1

.

max

max

00max

Modelo logistico• Los modelos cinéticos descritos anteriormente

representan el comportamiento de los microorganismos pero sólo en la fase de crecimiento exponencial de un cultivo batch (donde es constante), pero si se quiere representar todo el proceso del cultivo batch, es necesario recurrir al modelo logístico.

• Este modelo es capaz de arrojar una curva sigmoidal, y se le obtiene combinando la ecuación de Monod con la expresión de la tasa de crecimiento y la ecuación de rendimiento biomasa-sustrato (Yx/s).

dX = m(Yx/s.So + Xo – X) . X dt (Ks.Yx/s + Yx/s.So +Xo-X)

Modelos estructurados.• Un problema importante al construir un modelo de este tipo es

decidir cuantos componentes celulares deben tomarse en cuenta. • Hay modelos que consideran dos componentes y otros que

consideran hasta cuarenta componentes. Un resultado aceptable se puede producir usando por lo menos 3 componentes celulares, sin embargo, mientras mas componentes se consideren el modelo será mas preciso, pero también mas complejo.

• En estos modelos es necesario considerar dos factores nuevos: las concentraciones intrínsecas, que se refieren a la cantidad de un componente por unidad de masa celular (Ci/X), y las concentraciones extrínsecas o cantidad de un componente por unidad de volumen del reactor.

d(Ci/X) = (1.dCi) - ( Ci. dX/dt) dt X.dt X. X

• donde: Ci, es la concentración de cada componente considerado.

• Cuando existe más de un substrato limitante se pueden usar otros modelos conocidos como modelos multiplicativos, modelos aditivos y modelos nominativos

• Son desarrollados con amplitud en el libro de Shuler-Kargi.

• El modelo aditivo toma la siguiente forma:• = W1. S1 + W2.S2 + ........... + Wn. Sn• max

• donde W1, W2, ..., Wn son funciones del peso, y sigue la cinética de Monod.

• Existen modelos desarrollados para cinéticas del crecimiento en presencia de inhibidores y para organismos filamentosos

MEDICION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

TECNICAS DE MEDICION• Diversos métodos de cuantificación celular Se pueden agrupar en dos grandes categorías:

– métodos directos y – los métodos indirectos.

• Los directos obtienen una medida directa de la masa celular.- que miden la densidad numérica de las células: técnicas de

conteo, - que miden la concentración de masa celular: peso celular, y

absorbancia de luz.• Los métodos indirectos miden la concentración de algún

componente celular (ADN, proteínas, etc) y establecen una relación entre tal compuesto y las células.

a. Conteo celular

• Se basan en contar directamente en un microscopio las células, determinando la masa celular por unidad de volumen, con ese fin se colocan muestras del cultivo adecuadamente diluidas en porta-objetos y se procede a contar las células en un microscopio.

• Para facilitar esta labor existen diversos accesorios que hacen menos tedioso el conteo: – Cámaras de Neubauer, – Cámara de Petroff-Hausser, – el hemocitómetro – los microscopios graduados como de Helber.

• En ellos se cuenta con rejillas calibradas, de modo que se pueda contar el número de células por cada uno de los cuadrantes de la rejilla, que luego se puede multiplicar por el total de cuadrantes, y por las veces que se diluyó la muestra para obtener la densidad celular.

Cámaras de recuento

• Identificación

• En las dos superficies laterales, sin trabajar, de la cámara de conteo están impresas las siguientes indicaciones:

• El sistema de la red de conteo • El nombre y la marca registrada del fabricante • La profundidad de la cámara en milímetros • La superficie del cuadrado más pequeño en mm2

Cámara de Neubauer

• Es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases.

• Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen.

• Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos lineas consecutivas de 0.25 mm.

• Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado.

• La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro

Cámara de Neubauer• El gran cuadrado en el centro está adicionalmente dividido en 5 cuadrados en grupos de 5 con una longitud lateral de 0,2 mm, respectivamente, y un contenido de superficie de 0,04 mm2. A su vez, los cuadrados de los grupos están subdivididos en 16 cuadrados pequeños de 0,0025 mm2 cada uno.

• Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será :

• concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)

• En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado.

Cámara de Neubauer• Técnica de conteo•

El recuento presupone un conocimiento exacto de las líneas límite de las cámaras de conteo utilizadas. Éstas se pueden ver en la ilustración.

Para que las células, que están en o cerca de las líneas de limitación, no se cuenten dos veces o se sobrepasen en el conteo, hay que atenerse a determinadas reglas.

Se cuentan todas las células dentro de una zona de medición definida.

También se cuentan las células (marcadas en negro), que se apoyan o tocan en las 2 caras , p.ej. en la línea de medida izquierda y superior.

Esto también es válido para el tipo de la operación de conteo propiamente dicha, que debe efectuarse en forma de meandro.

Técnica de conteo

Cámara de Neubauer• Observaciones sobre el recuento•

a) En todos los conteos de cámaras, el diafragma del condensador en el microscopio deberá estar cerrado en gran parte.

b) La diferencia de las células contadas en los cuadrados grandes y en los cuadrados de grupos no podrá ser superior a 10 células.

c) En todos los conteos de células, han de realizarse dobles determinaciones. Después del recuento de la red de conteo superior, se recuenta como control también la red de conteo inferior. Ha de tenerse en cuenta que la cámara no esté resecada. Esto puede evitarse cuando la cámara inferior se llene justo poco antes del recuento y se recuente después del tiempo de sedimentación.

d) El valor medio de los conteos se aplica luego en una fórmula de cálculo o se multiplica por el factor correspondiente.

Cámara de Petroff-Hausser

b) Equipos automáticos de contaje celular• Existen nuevos instrumentos con contadores automáticos que por

ejemplo usan la alta resistencia eléctrica de las células para contarlas por pulsos de resistencia

• "Cell Coulter" de Beckman-Coulter• El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios

en la resistencia eléctrica que se producen cuando una partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio.

• Una pequeña abertura entre los electrodos es la zona sensible a través de la que pasan las partículas que se encuentran en suspensión.

• Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partícula.

• controlando la cantidad de la suspensión que circula a través del orificio es posible contar y medir el tamaño de las partículas.

• Es posible contar y medir varios miles de partículas por segundo, independientemente de su forma, color y densidad.

CONTADOR CELULAR

c.- Conteo en placas.• En los métodos anteriores se determina el número de células totales, pero

en muchos casos únicamente interesa contar células viables.• Se define como célula viable, aquella célula que es capaz de dividirse y

formar una progenie y la manera usual para realizar un recuento de células viables es determinando el número de células en la muestra, capaces de formar colonias sobre un medio de cultivo sólido (agar) y esto se conoce como recuento en placa.

• se puede hacer el conteo usando Placas Petri con un medio en agar-agar.• Se diluye varias veces la muestra líquida y luego se esparce sobre la

superficie sólida 0.1 ml. de la muestra, incubando hasta que transcurran unas 25 generaciones, luego de lo cual cada célula dará lugar a colonias, las cuales pueden ser observadas a simple vista y contadas como tales.

• Diseminación en placa (siembra en placa por extensión).- Se asume que cada colonia surgió de una simple célula, contando el número de colonias uno puede calcular el número de células viables en la muestra

• Este método tiene la desventaja de ser muy largo, pues suele requerir unas 24 horas de incubación, y exigir muy buenas técnicas de esterilización, además puede dar errores cuando se trata de células agregadas en cuyo caso una colonia no será necesariamente producida por una célula individual.

Medidas directas del crecimiento bacteriano.

1. Recuento de células totales. - Microscopia -2. Recuento de celulas viables. - Recuento de colonias -

Conteo en placas

Conteo en placas.• Se asume que cada colonia proviene de la división sucesiva de

una sola célula, conociendo el volumen sembrado y la dilución de la cual proviene y contando el número de colonias en la placa correspondiente se puede calcular el número de células viables en la muestra

• Debido a que es difícil saber si una sola bacteria dio origen a una colonia, se expresa usualmente el número de células viables como unidades formadoras de colonias (UFC).

• Para realizar el recuento se seleccionan las placas de la que contengan entre 25 y 250 colonias.

• A pesar de las deficiencias que pueda presentar la técnica del recuento en placas, se usa frecuentemente, y con resultados satisfactorios, para la estimación de las poblaciones bacterianas en la leche, agua, y otros productos.

• Es fácil de realizar y se adapta a la medición de poblaciones de cualquier densidad.

SIEMBRA POR EXTENSION Y VERTIDO EN PLACA

Recuento en filtro de nitrocelulosa

Placas petrifilm (3M)

Número mas probable (NMP)

utilizado para microrganismos que no crecen bien en medio sólido.

A) dilución a partir de un alto volumen de inóculo (ex. 10 mL)•

B) dilución a partir de un volumen medio de inóculo (ex. 1 mL)•

c) dilución a partir de un bajo volumen de inóculo (ex. 0,1 mL)•

d) contage de nº de tubos positivos•

e) estimativa de nº de células/mL de bactérias

Número mas probable (NMP)

10 mL de inóculo

1 mL de inóculo

0,1 mL de inóculo

6 tubos positivos (com crescimento bacteriano)

3 tubos positivos

1 tubos positivos

d. Peso seco.• método mas comúnmente usado para la determinación de la concentración

celular, y consiste en secar volúmenes conocidos de medio de cultivo con las células en crecimiento, hasta obtener un peso constante, expresando la concentración en g/l.

• Cuando se trata de células de levadura que pueden ser fácilmente centrifugadas se puede usar una centrífuga con velocidades de 4-6x103rpm con lo cual se logra obtener una masa húmeda de células, luego esta masa se lava y seca a 80ºC por 24 horas, para proceder a pesar en un portaobjetos debidamente destarado.

• Cuando se trata de células bacterianas difíciles de centrifugar se usan filtros de membranas (ultrafiltros) para obtener la masa celular húmeda, y luego se procede a secar, como en el caso anterior.

• Esta técnica sólo puede ser usada cuando el medio no contiene sólidos en suspensión como es el caso de: melazas, celulosa, o licor de maíz.

• Sin embargo, en estos casos se puede intentar corregir el peso final para considerar la fracción que corresponde a los sólidos del medio. Adicionalmente el método presenta la desventaja de requerir muestras muy grandes y de ser sumamente lentos.

e. Absorción de luz.• En esta técnica se aprovecha la particularidad de las células para desviar la

luz de una celda espectrofotométrica.

• Se puede usar un turbidímetro o un espectrofotómetro para medir la densidad óptica (OD) a 600- 700 nm de longitud de onda.

• En este caso las células se comportan como simples partículas en suspensión con capacidad para desviar y absorber la luz.

• En cualquier caso tal efecto sobre el haz incidente de luz será proporcional a la concentración de células presentes en el cultivo de acuerdo con la ley de Beer.

• Debe tenerse en cuenta para estos casos que existen algunos factores como; el tamaño, la forma y el color de las células que pueden variar la relación entre la absorbancia y el número de células, asimismo, si se usa un tinte para observar las células viables, el color afectará los resultados.

• Valores altos de OD (mayores a 0.3) afectarán la linealidad en la respuesta.

• Este método es apropiado para medios libres de partículas en suspensión.

Medidas indirectas del crecimiento bacteriano

• Turbidez. Es un método muy rápido y útil de medir el crecimiento bacteriano.

- fotómetro - - espectrofotómetro -

Esquema del proceso

d. Masa de un componente celular.• Cuando es difícil usar alguno de los métodos

anteriores se puede usar la medida de algún componente celular que sea parte constante del peso seco total de las células, entonces se cuantifica por algún método analítico, el componente escogido, con lo cual se tendrá una estimación indirecta de la biomasa presente.

• Tales componentes suelen ser: proteínas, nitrógeno, ADN, RNA, y ATP celulares, los cuales están presentes en cantidades mas o menos constantes por especie.

e. Efectos físicos.

• Se puede también medir la variación de algún factor externo por efecto del crecimiento celular, tales como; el calor generado por el crecimiento, o el oxígeno captado por el medio, y que deja un vacío medible. técnicas son rápidas y efectivas pero sólo son útiles para grandes

Fermentación en cultivo continuo• El cultivo continuo se refiere al crecimiento de células en un

sistema abierto, en el cual constantemente se suministra nuevo medio de cultivo al bioreactor, el cual se mantiene en una agitación constante, de modo que constantemente está ingresando medio con nutrientes frescos y se está retirando producto y células.

• Después de un cierto tiempo, el sistema alcanza un estado estable donde la concentración de células, productos y sustrato permanecen constantes.

• De esta forma los cultivos continuos proporcionan condiciones ambientales constantes para el crecimiento celular, y para la formación de productos y se pueden obtener productos de calidad uniforme

CULTIVO CONTINUO DE MICROORGANISMOS

Esquema de proceso continuoQUIMIOSTATO

Control por QUIMIOSTATO • en un tanque agitado que opera con dos elementos de control: la tasa de

flujo y la concentración de un nutriente limitante tal como la fuente carbonada o nitrogenada.

• Los demás nutrientes en el medio se encuentran en exceso y junto al nutriente esencial determinado como factor limitante son aportados al tanque continuamente desde un reservorio, al mismo tiempo que se saca del recipiente el exceso de organismos y de medio.

• En el quimiostato, la tasa de crecimiento se controla por la tasa de flujo o la tasa de dilución (velocidad a la que se bombea el medio en el tiempo), mientras que la densidad de la población está controlada por la concentración del nutriente limitante.

• Si la tasa de dilución se incrementa y la concentración de nutrientes es constante, la densidad de la población es constante y la tasa de crecimiento se elevará.

• Cuando el sistema está en equilibrio, el número de células (densidad de la población) y el estado nutricional permanecen constantes, a esto se le conoce como “estado estable” o “estado sostenido”.

Relación de la temperatura y velocidades de crecimiento de un psicrófilo, un mesófilo, un termófilo y dos hipertermófilos diferentes. En la gráfica se indican

las temperatura óptimas de esos organismos